DE60126592T2

DE60126592T2 - Verfahren, zusammensetzungen und kits zur identifizierung und überwachung von brustkrebs

Info

Publication number: DE60126592T2
Application number: DE60126592T
Authority: DE
Inventors: L. Raymond Bothell HOUGHTON; C. Davin Issaquah DILLON; Alan David Kingston MOLESH; Jiangchun Bellevue XU; Barbara Bainbridge Island ZEHENTNER; H. David Redmond PERSING
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 2000-04-03
Filing date: 2001-04-02
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2021-04-03
Also published as: EP1272668B1; DE60126592D1; WO2001075171B1; EP1272668A2; ES2281416T3; CA2404978A1; WO2001075171A2; ATE353974T1; WO2001075171A3; JP2004505611A; US20020009738A1; AU2001253079A1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Krebsdiagnose. Im Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, Zusammensetzungen und Kits zur Identifizierung von Krebs, wobei Oligonukleotidhybridisierung und/oder Amplifikation verwendet werden, um gleichzeitig zwei oder mehr gewebespezifische Polynukleotide in einer biologischen Probe nachzuweisen, die vermutlich Krebszellen enthält.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs ist nach wie vor überall auf der Welt ein bedeutendes Gesundheitsproblem. Das Versagen herkömmlicher Formen der Krebsbehandlung kann im Allgemeinen zum Teil einer verzögerten Diagnose der Erkrankung zugeschrieben werden. Obgleich im Bereich der Krebsdiagnose bedeutende Fortschritte gemacht wurden, ist der Bedarf an verbesserten Nachweismethoden, die eine frühzeitige, zuverlässige und sensible Bestimmung der Anwesenheit von Krebszellen ermöglichen, noch immer vorhanden.
Brustkrebs steht bei Frauen in den USA nach Lungenkrebs an zweiter Stelle der tödlichen Krebsarten, betrifft mehr als 180.000 Frauen pro Jahr und führt jährlich zu ungefähr 40.000 bis 50.000 Todesfällen. Für Frauen in Nordamerika liegt die Wahrscheinlichkeit, an Brustkrebs zu erkranken bei eins zu acht.
Der Umgang mit der Erkrankung beruht derzeit auf einer Kombination aus frühzeitiger Diagnose (mit routinemäßigen Brustscreeningverfahren) und einer aggressiven Behandlung, die eine oder mehrere Formen aus einer Vielzahl von Behandlungen wie Operation, Strahlentherapie, Chemotherapie und Hormontherapie umfassen kann. Der Verlauf der Behandlung für einen bestimmten Brustkrebs wird häufig auf Grundlage einer Vielzahl von Prognoseparametern ausgewählt, einschließlich der Analyse spezifischer Tumormarker. Siehe zum Beispiel Porter-Jordan et al., Breast Cancer 8: 73-100 (1994). Die Verwendung bewährter Marker führt dennoch häufig zu einem Ergebnis, das schwer zu interpretieren ist, und die hohe Sterblichkeitsrate, die bei Brustkrebspatienten beobachtet wird, deutet darauf hin, dass Verbesserungen der Diagnose der Erkrankung erforderlich sind.
Die neueste Einführung immunotherapeutischer Ansätze bei der Brustkrebsbehandlung, die auf Her2/neu abzielen, war eine wichtige Motivation, zusätzliche brustkrebsspezifische Gene als Ziele für therapeutische Antikörper und T-Zellen-Impfungen sowie für die Diagnose der Krankheit zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde Mammaglobin als eins der am meisten brustkrebsspezifischen Gene, die bis heute entdeckt wurden, identifiziert, da es in circa 70 % bis 80 % der Brustkrebse exprimiert ist. Aufgrund seiner hochgradig gewebespezifischen Verteilung wurde der Nachweis der Mammaglobin-Expression verwendet, um mikrometastatische Läsionen in Lymphknotengewebe zu identifizieren und, kürzlicher, um zirkulierende Brustkrebszellen im peripheren Blut von Brustkrebspatienten mit bekannten primären und metastatischen Läsionen nachzuweisen.
Mammaglobin ist ein Homolog eines Uteroglobins von Kaninchen und des Steroid bindenden Rattenproteins Untereinheit C3 und ein Protein mit geringem Molekulargewicht, das hochgradig glykosiliert ist. Watson et al., Cancer Res. 56: 860-5 (1996); Watson et al., Cancer Res. 59: 3028-3031 (1999); Watson et al.; Oncogene 16: 817-24 (1998). Im Gegensatz zu seinen Homologen wurde das Mammaglobin als brustkrebsspezifisch beschrieben, und eine Überexpression wurde in Brusttumorbiopsien (23 %), primären und metastatischen Brusttumoren (~75 %) beschrieben, mit Berichten über den Nachweis einer Mammaglobin-mRNA-Expression in 91 % der Lymphknoten von metastatischen Brustkrebspatienten. Leygue et al., J. Pathol. 189: 28-33 (1999) und Min et al., Cancer Res. 58: 4581-4584 (1998).
Da die Mammaglobin Genexpression kein universales Merkmal für Brustkrebs ist, kann der Nachweis dieses Gens allein für einen zuverlässigen Nachweis aller Brustkrebse unzureichend sein. In Anbetracht dessen werden auf dem Gebiet der Technik Methoden benötigt, die den Nachweis von zwei oder mehr brustkrebsspezifischen Genen anstellen, um die Sensibilität und Zuverlässigkeit des Nachweises von Mikrometastasen zum Beispiel in Lymphknoten und Knochenmark zu verbessern, und/oder um verankerungsunabhängige Zellen in der peripheren Zirkulation zu erkennen.
Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere verbundene Aufgaben, indem Verfahren bereitgestellt werden, die für die Identifikation gewebespezifischer Polynukleotide, insbesondere tumorspezifischer Polynukleotide, nützlich sind, sowie Verfahren, Zusammensetzungen und Kits zur Identifikation und Überwachung von Krebszellen bei Patienten, die von dieser Krankheit betroffen sind.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Brustkrebszellen bereitgestellt, umfassend die Schritte, dass:

(a) eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einem ersten Oligonukleotid in Verbindung gebracht wird, das mit einem ersten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mammaglobin und Lipophilin B;
(b) dass die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotid, das mit einer zweiten Polynukleotidsequenz hybridisiert, enthaltend eine GABAπ (B899P)-Polynukleotidsequenz, in Verbindung gebracht wird;
(c) die Menge an hybridisierten Oligonukleotiden der Schritte (a) und (b) in der biologischen Probe nachgewiesen wird; und
(d) die Menge an Polynukleotiden, die mit den Oligonukleotiden der Schritte (a) und (b) hybridisiert mit einem vorbestimmten Ausschlusswert verglichen wird, und daraus die An- oder Abwesenheit von Krebs bei einem Patienten bestimmt wird.

Vorzugsweise wird das erste Polynukleotid aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 und SEQ ID NO: 76 gezeigt, oder deren Komplement, ausgewählt, und das zweite Polynukleotid enthält dasjenige Polynukleotid, das in SEQ ID NO: 75 dargestellt ist, oder ein Komplement davon.
Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren ferner, dass

(e) die biologische Probe mit einem dritten Oligonukleotid, das mit einem dritten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird;
(f) die biologische Probe mit einem vierten Oligonukleotid, das mit einem vierten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird, und wobei Schritt (c) den Nachweis der Menge an hybridisiertem Oligonukleotid der Schritte (a), (b), (e) und (f) in der biologischen Probe umfasst.

Alternativ umfasst das Verfahren ferner, dass

(e) die biologische Probe mit einem dritten Oligonukleotid, das mit einem dritten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird;
(f) die biologische Probe mit einem vierten Oligonukleotid, das mit einem vierten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 11 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird;
(g) die biologische Probe mit einem fünften Oligonukleotid, das mit einem fünften Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, 15 und 17 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird;
(h) die biologische Probe mit einem sechsten Oligonukleotid, das mit einem sechsten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird;
(i) die biologische Probe mit einem siebten Oligonukleotid, das mit einem siebten Polynukleotid hybridisiert wie in SEQ ID NO: 30 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird;
(j) die biologische Probe mit einem achten Oligonukleotid, das mit einem achten Polynukleotid hybridisiert wie in SEQ ID NO: 32 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird; und
(k) die biologische Probe mit einem neunten Oligonukleotid, das mit einem neunten Polynukleotid hybridisiert wie in SEQ ID NO: 76 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird;

In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Brustkrebszellen bereitgestellt, umfassend die Schritte, dass

(a) eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einem ersten Oligonukleotidpaar in Kontakt gebracht wird, wobei das erste Paar ein erstes und ein zweites Oligonukleotid enthält, wobei das erste Oligonukleotid und das zweite Oligonukleotid mit einem ersten Polynukleotid beziehungsweise dem Komplement davon hybridisieren, wobei das erste Polynukleotid Mammaglobin oder Lipophilin B enthält;
(b) die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotidpaar in Kontakt gebracht wird, wobei das zweite Paar ein drittes Oligonukleotid und ein viertes Oligonukleotid enthält, wobei das dritte und vierte Oligonukleotid mit einem zweiten Polynukleotid beziehungsweise dem Komplement davon hybridisieren, wobei das zweite Polynukleotid GABAπ (B899P) enthält;
(c) das erste Polynukleotid und das zweite Polynukleotid amplifiziert werden; und
(d) das amplifizierte erste Polynukleotid und das amplifizierte zweite Polynukleotid nachgewiesen werden; wobei

Vorzugsweise wird das erste Polynukleotid aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 und SEQ ID NO: 76 gezeigt ausgewählt, wobei das zweite Polynukleotid das Polynukleotid wie in SEQ ID NO: 75 gezeigt, enthält. Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren ferner, dass die biologische Probe mit einem dritten Oligonukleotidpaar in Verbindung gebracht wird, wobei das dritte Paar einen Vorwärts-Primer und einen Rückwärts-Primer enthält, die mit einem dritten Polynukleotid beziehungsweise dem Komplement davon hybridisieren, wobei das dritte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt ausgewählt ist; wobei Schritt (d) ferner die Amplifikation des dritten Polynukleotids umfasst; und wobei Schritt (e) ferner den Nachweis des dritten Polynukleotids umfasst. Ferner vorzugsweise umfasst das Verfahren, dass die biologische Probe mit einem vierten Oligonukleotidpaar in Kontakt gebracht wird, wobei das vierte Paar einen Vorwärts-Primer und einen Rückwärts-Primer enthält, die mit einem vierten Polynukleotid beziehungsweise dem Komplement davon hybridisieren, wobei das vierte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt ausgewählt ist; wobei Schritt (d) ferner die Amplifikation des vierten Polynukleotids umfasst; und wobei Schritt (e) ferner den Nachweis des vierten Polynukleotids umfasst.
Stärker bevorzugt sind die Oligonukleotide aus der Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden wie in SEQ ID NOs: 33-38, 48-51 und 53-62 gezeigt, ausgewählt.
Vorteilhafterweise umfasst Schritt (e) einen Schritt, der aus einer Gruppe bestehend aus dem Nachweis einer radioaktiven Markierung und dem Nachweis eines Fluorophors ausgewählt ist.
Vorzugsweise sind die Oligonukleotide Intron überspannende Oligonukleotide.
Vorteilhafterweise sind die Intron überspannenden Oligonukleotide aus einer Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden wie in SEQ ID NOs: 36-44 und 48-62 gezeigt, ausgewählt.
Ferner vorzugsweise umfasst der Nachweis des amplifizierten ersten, zweiten, dritten und vierten Polynukleotids, dass das amplifizierte erste, zweite, dritte und vierte Polynukleotid mit einer markierten Oligonukleotidsonde in Kontakt gebracht wird, die unter mäßig stringenten Bedingungen mit einem ersten, zweiten, dritten oder vierten Polynukleotid hybridisiert. Vorzugsweise umfasst die markierte Oligonukleotidsonde einen nachweisbaren Anteil, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus radioaktiver Markierung und Fluorophor.
Vorzugsweise wird der Schritt zur Amplifikation durch eine Polynukleotid-Amplifikationsmethode erzielt, die aus der Gruppe bestehend aus Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), inverser PCR, RACE, Ligase-Kettenreaktion (LCR), Qbeta-Replicase, isothermer Amplifkation, Strand Displacement Amplification (SDA), rollender Kettenreaktion (RCR), der Reaktion cyclischer Sonden (CPR), transkriptionsbasierter Amplifikationssysteme (TAS), nukleinsäuresequenzbasierter Amplifikation (NASBA) und 3SR ausgewählt ist.
Vorzugsweise umfassen die Verfahren der vorliegenden Erfindung ferner einen Schritt zur Anreicherung von Krebszellen aus der biologischen Probe vor Hybridisierung des/der Oligonukleotidprimer(s). Ferner vorzugsweise wird der Schritt zur Anreicherung von Krebszellen aus der biologischen Proben durch Methoden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelleinfang und Zellabreicherung, erzielt. Vorteilhafterweise wird der Zelleinfang durch Immunocapture erzielt, wobei die Immunocapture die Schritte umfasst, dass

(a) ein Antikörper an der Oberfläche der Krebszellen absorbiert wird; und
(b) der auf den Krebszellen absorbierte Antikörper von dem Rest der biologischen Probe separiert wird. Vorzugsweise ist der Antikörper gegen ein Antigen gerichtet, das aus der Gruppe bestehend aus CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD24, CD25, CD29, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD66B, CD66e, HLA-DR, IgE und TCRaQ ausgewählt ist, oder ist gegen ein Brusttumorantigen gerichtet.

Ferner vorzugsweise ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
Vorteilhafterweise ist der Antikörper mit einer magnetischen Kugel konjugiert oder als tetramerer Antikörperkomplex formuliert.
Vorzugsweise wird die Zellabreicherung durch ein Verfahren erzielt, umfassend die Schritte, dass

(a) rote und weiße Zellen quervernetzen, und
(b) die quervernetzten roten und weißen Zellen von dem Rest der biologischen Probe fraktioniert werden.

Vorteilhafterweise ist die biologische Probe in den Verfahren der vorliegenden Erfindung aus einer Gruppe bestehend aus Blut, Serum, Lymphknoten, Knochenmark, Sputum, Urin und Tumorbiopsieproben ausgewählt. Vorzugsweise ist die biologische Probe aus der Gruppe bestehend aus Blut, einem Lymphknoten und Knochenmark ausgewählt. Vorzugsweise ist der Lymphknoten ferner ein Indikatorlymphknoten.
Ferner vorzugsweise umfasst in den Verfahren der vorliegenden Erfindung der Schritt zum Nachweis einen Schritt zur Fraktionierung.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zum Nachweis von Brustkrebszellen in einer biologischen Probe eines Patienten bereitgestellt, enthaltend

(a) ein erstes Oligonukleotid; und
(b) ein zweites Oligonukleotid;

Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung ferner ein drittes und viertes Oligonukleotid, wobei das dritte und vierte Oligonukleotid mit einem dritten Polynukleotid oder dem Komplement davon beziehungsweise einem vierten Polynukleotid oder dem Komplement davon hybridisieren; wobei das dritte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt ausgewählt ist; und wobei das vierte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt ausgewählt ist.
Ferner vorzugsweise sind die Oligonukleotide aus einer Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden wie in SEQ ID NOs: 33-44, 48-62 und 72 offenbart ausgewählt.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zum Nachweis von Brustkrebszellen in einer biologischen Probe eines Patienten bereitgestellt, enthaltend:

(a) ein erstes Oligonukleotidpaar; und
(b) ein zweites Oligonukleotidpaar;

Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung ferner ein drittes Oligonukleotidpaar und ein viertes Oligonukleotidpaar, wobei das dritte Oligonukleotidpaar und das vierte Oligonukleotidpaar mit einem dritten Polynukleotid oder dem Komplement davon beziehungsweise einem vierten Polynukleotid oder dem Komplement davon hybridisieren; wobei das dritte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt ausgewählt ist; und wobei das vierte Polynukleotid aus einer Grup pe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt ausgewählt ist.
Vorteilhafterweise sind die Oligonukleotide aus einer Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden wie in SEQ ID NOs: 33-44, 48-62 und 72 offenbart ausgewählt.
Darüber hinaus wird ein Kit zum Nachweis von Brustkrebs, enthaltend die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, bereitgestellt.
Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zum Identifizieren eines oder mehrerer gewebespezifischen/r Polynukleotids/e bereit, wobei die Verfahren die Schritte umfassen, dass (a) eine genetische Subtraktion durchgeführt wird, um ein Pool von Polynukleotiden aus einem relevanten Gewebe zu identifizieren; (b) eine DNA-Microarray-Analyse durchgeführt wird, um eine erste Teilmenge aus dem Pool von relevanten Polynukleotiden zu identifizieren, wobei jedes Polynukleotidelement aus der ersten Teilmenge in dem relevanten Gewebe wenigstens doppelt überexprimiert ist, verglichen mit einem Kontrollgewebe; und (c) eine quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse der Polynukleotide aus der ersten Teilmenge durchgeführt wird, um eine zweite Teilmenge von Polynukleotiden zu identifizieren, die wenigstens doppelt überexprimiert sind, verglichen mit dem Kontrollgewebe. Bevorzugte genetische Subtraktionen sind aus der Gruppe bestehend aus Differential Display und cDNA-Subtraktion ausgewählt und werden nachfolgend ausführlicher beschrieben.
Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynukleotiden bereit, die konkordante und/oder komplementäre gewebespezifische Expressionsprofile in einem relevanten Gewebe zeigen. Solche Verfahren umfassen die Schritte, dass (a) eine Expressionsanalyse durchgeführt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNA-Microarray und quantitativer PCR, um ein erstes Polynukleotid zu identifizieren, das in einem relevanten Gewebe wenigstens doppelt überexprimiert ist, verglichen mit einem Kontrollgewebe; und (b) eine Expressionsanalyse durchgeführt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNA-Microarray und quantitativer PCR, um ein erstes Polynukleotid zu identifizieren, das in einem relevanten Gewebe wenigstens doppelt überexprimiert ist, verglichen mit einem Kontrollgewebe.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung stellen Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Krebszellen in einem Patienten bereit. Solche Verfahren umfassen die Schritte, dass (a) eine biologische Probe von dem Patienten erhalten wird; (b) die biologische Probe mit einem ersten Oligonukleotidpaar in Verbindung gebracht wird, wobei die Elemente des ersten Oligonukleotidpaars unter mäßig stringenten Bedingungen mit einem ersten Polynukleotid beziehungsweise dem Komplement davon hybridisieren; (c) die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotidpaar in Verbindung gebracht wird, wobei die Elemente des zweiten Oligonukleotidpaars unter mäßig stringenten Bedingungen mit einem zweiten Polynukleotid beziehungsweise dem Komplement davon hybridisieren, und wobei das erste Polynukleotid in der Nukleotidsequenz nicht mit dem zweiten Polynukleotid in Bezug gebracht wird; (d) das erste Polynukleotid und das zweite Polynukleotid amplifizieren; und (e) das amplifizierte erste Polynukleotid und das amplifizierte zweite Polynukleotid nachgewiesen werden, wobei die Anwesenheit des amplifizierten ersten Polynukleotids oder des amplifizierten zweiten Polynukleotids auf die Anwesenheit von Krebszellen in dem Patienten hindeutet.
In einigen Ausführungsformen kann dem Nachweis des amplifizierten ersten und/oder zweiten Polynukleotids ein Schritt zur Fraktionierung vorausgehen, wie beispielsweise Gelelektrophorese. Alternativ oder zusätzlich kann der Nachweis des amplifizierten ersten und/oder zweiten Polynukleotids durch Hybridisieren einer markierten Oligonukleotidsonde, die unter mäßig stringenten Bedingungen mit dem ersten oder zweiten Polynukleotid spezifisch hybridisiert, erzielt werden. Oligonukleotidmarkierung kann durch Inkorporieren eines radioaktiv markierten Nukleotids oder durch Inkorporieren einer fluoreszierenden Markierung erzielt werden.
In einigen bevorzugten Ausführungsformen können die Zellen eines spezifischen Gewebes vor dem Schritt zum Nachweis aus der biologischen Probe angereichert werden. Die Anreicherung kann durch Methoden erzielt werden, die aus der Gruppe bestehend aus Zelleinfang und Zellabreicherung ausgewählt sind. Beispielhafte Zelleinfangverfahren beinhalten Immunocapture und umfassen die Schritte, dass (a) ein Antikörper an einer gewebespezifischen Zelloberfläche auf Zellen der biologischen Probe absorbiert wird; (b) der auf den gewebespezifischen Zellen absorbierte Antikörper von dem Rest der biologischen Probe sepa riert wird. Eine beispielhafte Zellabreicherung kann durch Quervernetzen roter und weißer Zellen, gefolgt von einem späteren Schritt zur Fraktionierung zum Entfernen der quervernetzten Zellen, erzielt werden.
Alternative Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung stellen Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebs bei einem Patienten bereit, umfassend die Schritte, dass (a) eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einem Oligonukleotid in Verbindung gebracht wird, das mit einem Polynukleotid hybridisiert, das ein Brusttumorprotein verschlüsselt; (b) in der Probe ein Gehalt eines Polynukleotids nachgewiesen wird (wie beispielsweise mRNA), das mit dem Oligonukleotid hybridisiert; und (c) der Gehalt an Polynukleotid, das mit dem Oligonukleotid hybridisiert mit einem vorbestimmten Ausschlusswert verglichen wird und daraus die Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebs bei dem Patienten bestimmt wird. In einigen Ausführungsformen wird die Menge an mRNA mittels einer Polymerase-Kettenreaktion nachgewiesen, wobei zum Beispiel wenigstens ein Oligonukleotidprimer verwendet wird, der mit einem Polynukleotid, oder mit einem Komplement eines solchen Polynukleotids, hybridisiert, das ein Polypeptid wie voranstehend dargestellt, verschlüsselt. In anderen Ausführungsformen wird die Menge an mRNA mit einer Hybridisierungstechnik nachgewiesen, die eine Oligonukleotidsonde verwendet, die mit einem Polynukleotid, oder mit einem Komplement eines solchen Polynukleotids, hybridisiert, das ein Polypeptid wie voranstehend dargestellt, verschlüsselt.
In verbundenen Aspekten werden Verfahren zum Überwachen des Fortschreitens eines Krebses bei einem Patienten offenbart, umfassend die Schritte, dass (a) eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einem Oligonukleotid in Verbindung gebracht wird, das mit einem Polynukleotid hybridisiert, das ein Brusttumorprotein verschlüsselt; (b) in der Probe eine Menge von Polynukleotid nachgewiesen wird, das mit dem Oligonukleotid hybridisiert; (c) die Schritte (a) und (b) wiederholt werden, wobei eine biologische Probe verwendet wird, die zu einem späteren Zeitpunkt von einem Patienten erhalten wird; und (d) die Menge an Polynukleotid, die in Schritt (c) nachgewiesen wurde mit der Menge, die in Schritt (b) nachgewiesen wurde, verglichen wird und daraus der Fortschritt des Krebses bei dem Patienten überwacht wird.
Einige Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung setzen voraus, dass der Schritt zur Amplifikation des ersten Polynukleotids und des zweiten Polynukleotids durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzielt wird.
In einigen Ausführungsformen können die nachzuweisenden Krebszellen aus einer Gruppe, bestehend aus Prostatakrebs, Brustkrebs, Kolonkrebs, Eierstockkrebs, Lungenkrebs, Kopf-Hals-Krebs, Lymphadenom, Leukämie, Melanom, Leberkrebs, Magenkrebs, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Bauspeicheldrüsenkrebs und Gebärmutterschleimhautkrebs ausgewählt sein. Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung setzen voraus, dass die biologische Probe aus der Gruppe bestehend aus Blut, einem Lymphknoten und Knochenmark ausgewählt ist. Der Lymphknoten kann ein Indikatorlymphknoten sein.
In einigen spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung wird vorausgesetzt, dass das erste Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Mammaglobin, Lipophilin B, GABAπ (B899P), B726P, B511S, B533S, B305D und B311D ausgewählt ist. Andere Ausführungsformen setzen voraus, dass das zweite Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Mammaglobin, Lipophilin B, GABAπ (B899P), B726P, B511S, B533S, B305D und B311D ausgewählt ist.
Wechselnde Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebs bei einem Patienten bereit, umfassend die Schritte, dass (a) eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einem ersten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mammaglobin und Lipophilin B, in Verbindung gebracht wird; (b) die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotid, das mit einer Polynukleotidsequenz hybridisiert, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus GABAπ (B899P), in Verbindung gebracht wird; (c) in der Probe eine Menge an Polynukleotid nachgewiesen wird, das mit wenigstens einem der Oligonukleotide hybridisiert; und (d) die Menge an Polynukleotid, die mit dem Oligonukleotid hybridisiert, mit einem vorbestimmten Ausschlusswert verglichen wird und daraus die Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebs bei dem Patienten bestimmt wird.
In Übereinstimmung mit einigen Ausführungsformen können die Oligonukleotide aus den hier Offenbarten wie in SEQ ID NOs: 33-72 gezeigt ausgewählt werden.
Durch andere Ausführungsformen wird die Menge an Polynukleotid, das mit dem Oligonukleotid hybridisiert mittels einer Polymerase-Kettenreaktion bestimmt. Alternativ kann die Menge an Polynukleotid, das mit dem Oligonukleotid hybridisiert mittels eines Hybridisierungstests bestimmt werden.
Noch andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebszellen in einem Patienten bereit, umfassend die Schritte, dass (a) eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einem ersten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polynukleotid wie in SEQ ID NO: 73 und SEQ ID NO: 74 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird; (b) die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert wie in SEQ ID NO: 75 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird; (c) die biologische Probe mit einem dritten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polynukleotid wie in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird; (d) die biologische Probe mit einem vierten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polynukleotid wie in SEQ ID NO: 11 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird; (e) die biologische Probe mit einem fünften Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polynukleotid wie in SEQ ID NO: 13, 15 und 17 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird; (f) die biologische Probe mit einem sechsten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polynukleotid wie in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird; (g) die biologische Probe mit einem siebten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert wie in SEQ ID NO: 30 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird; (h) die biologische Probe mit einem achten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert wie in SEQ ID NO: 32 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird; (i) die biologische Probe mit einem neunten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert wie in SEQ ID NO: 76 gezeigt, oder einem Komplement davon, in Verbindung gebracht wird; (j) in der Probe ein hybridisiertes Oligonukleotid aus einem der Schritte (a) bis (i) nachgewiesen wird; und (j) die Menge an Polynukleotid, das mit dem Oligonukleotid hybridisiert mit einem vorbestimmten Ausschlusswert verglichen wird, wobei die Anwesenheit eines hybridisierten Oligonukleotids in einem der Schritte (a) bis (i) über dem vorbestimmten Ausschlusswert auf die Anwesenheit von Krebszellen in der biologischen Probe des Patienten hindeutet.
Andere verbundene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebszellen in einem Patienten bereit, umfassend die Schritte, dass (a) eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einem ersten Oligonukleotid und einem zweiten Oligonukleotid in Verbindung gebracht wird, wobei das erste und das zweite Oligonukleotid unter mäßig stringenten Bedingungen mit einem ersten und einem zweiten Polynukleotid hybridisieren, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 76, und wobei das erste Polynukleotid strukturell nicht in Beziehung gebracht wird mit dem zweiten Polynukleotid; (b) in der Probe das erste und zweite hybridisierte Oligonukleotid nachgewiesen werden; und (c) die Menge an Polynukleotid, das mit dem Oligonukleotid hybridisiert mit einem vorbestimmten Ausschlusswert verglichen wird, wobei die Anwesenheit eines hybridisierten ersten Oligonukleotids oder eines hybridisierten zweiten Oligonukleotids über dem vorbestimmten Ausschlusswert auf die Anwesenheit von Krebszellen in der biologischen Probe des Patienten hindeutet.
Andere verbundene Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung stellen Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebszellen in einem Patienten bereit, umfassend die Schritte, dass (a) eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einem ersten Oligonukleotid und einem zweiten Oligonukleotid in Verbindung gebracht wird, wobei das erste und das zweite Oligonukleotid unter mäßig stringenten Bedingungen mit einem ersten und einem zweiten Polynukleotid hybridisieren und beides gewebespezifische Polynukleotide des nachzuweisenden Krebses sind, und wobei das erste Polynukleotid strukturell nicht in Beziehung gebracht wird mit dem zweiten Polynukleotid; (b) in der Probe das erste und zweite hybridisierte Oligonukleotid nachgewiesen werden; und (c) die Menge an Polynukleotid, das mit dem Oligonukleotid hybridisiert, mit einem vorbestimmten Ausschlusswert verglichen wird, wobei die Anwesenheit eines hybridisierten ersten Oligonukleotids oder eines hybridisierten zweiten Oligonukleotids über dem vorbestimmten Ausschlusswert auf die Anwesenheit von Krebszellen in der biologischen Probe des Patienten hindeutet.
In anderen verbundenen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ferner Zusammensetzungen bereit, die für die hier offenbarten Verfahren nützlich sind. Beispielhafte Zusammensetzungen umfassen zwei oder mehr Oligonukleotidprimerpaare, wobei jedes spezifisch mit einem unterschiedlichen Polynukleotid hybridisiert. Beispielhafte Oligonukleotidprimer, die für die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden hier durch SEQ ID NOs: 33-71 offenbart. Beispielhafte Polynukleotide, die für die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden in SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 76 offenbart.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus Kits bereit, die zum Durchführen von Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Beispielhafte Kits umfassen Oligonukleotidprimerpaare, wobei jedes spezifisch mit einem unterschiedlichen Polynukleotid hybridisiert. In einigen Ausführungsformen können Kits in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung darüber hinaus eine Nukleinsäurepolymerase und geeignete Puffer umfassen. Beispielhafte Oligonukleotidprimer, die für die Kits der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden hier durch SEQ ID NOs: 33-71 offenbart. Beispielhafte Polynukleotide, die für die Kits der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden in SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 76 offenbart.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden mit Bezug auf die nachfolgende ausführliche Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen verständlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND SEQUENZBEZEICHNER
1 zeigt die mRNA-Expressionsprofile für B311D, B533S und B726P wie mit quantitativer PCR (Taqman^TM) bestimmt. Abkürzungen: B.T.: Brusttumor; B.M.: Knochenmark; B.R.: Brustreduktion.
2 zeigt die Beziehung der B533S-Expression zu dem pathologischen Stadium des Tumors. Gewebe aus normaler Brust (8), gutartigen Brusterkrankungen (3) und Brusttumorstadium I (5), -stadium II (6), -stadium III (7), -stadium IV (3) und Metastasen (1 Lymphknoten und 3 Pleuraerguss) wurden mit Echtzeit-PCR getestet. Die Daten werden als Kopien/ng β-Actin für jede untersuchte Gruppe dargestellt, und die Linie ist die berechnete Trendlinie.
3A und 3B zeigen die Genkomplementation des B305D C-Form, B726P, GABAπ und Mammaglobins in Metastasen beziehungsweise Primärtumoren. Der Ausschlusswert für die Gene betrug 6,57; 1,65; 4,58 und 3,56 Kopien/ng β-Actin basierend auf dem Mittelwert der negativen normalen Gewebe plus 3 Standardabweichungen.
4 zeigt die vollständige cDNA-Sequenz für Mammaglobin.
5 zeigt die bestimmte cDNA-Sequenz des offenen Leserahmens, die ein Mammaglobin rekombinantes Polypeptid verschlüsselt, exprimiert in E. coli.
6 zeigt eine vollständige cDNA-Sequenz für GABAπ.
7 zeigt die mRNA-Expressionsniveaus für Mammaglobin, GABAπ, B305D (C-Form) und B726P in Brusttumor- und normalen Proben, die mit Echtzeit-PCR und dem SYBR-Nachweissystem bestimmt werden. Abkürzungen: BT: Brusttumor; BR: Brustreduktion; A. PBMC: aktivierte Molekularzellen des peripheren Blutes; R PBMC: verbleibende PBMC; T. Gland: Schilddrüse; S. Cord: Rückenmark; A. Gland: Adrenaldrüse; B. Marrow: Knochenmark; S. Muscle: Skelettmuskel.
8 ist ein Säulendiagramm, das einen Vergleich zwischen dem Lipophilin B allein und dem LipophilinB-B899P-B305D-C-B726 Multiplex-Test, die an einer Reihe von Brustkrebsproben untersucht wurden, zeigt. Abkürzungen: BT: Brusttumor; BR: Brustreduktion; SCID: schwerer kombinierter Immundefekt.
9 ist ein Kolloid, das die einzige Bandlänge von vier Amplifikationsprodukten relevanter Tumorgene (Mammaglobin, B305D, B899P, B726P) zeigt, die in einem Multiplex-Echtzeit-PCR-Test untersucht wurden.
10 zeigt einen Vergleich eines Multiplex-Tests, wobei Intron-Exon-Grenzen überspannende Primer (untere Reihe) verwendet wurden und solche, die nicht optimierte Primer verwenden (obere Reihe), um Brustkrebszellen in einer Reihe von Lymphknotengewebe nachzuweisen.

SEQ ID NO: 1 ist die bestimmte cDNA-Sequenz für eine erste Spleißvariante des B305D Isoform A.
SEQ ID NO: 2 ist die Aminosäurensequenz, die durch die Sequenz aus SEQ ID NO: 1 verschlüsselt ist.
SEQ ID NO: 3 ist die bestimmte cDNA-Sequenz für eine zweite Spleißvariante des B305D Isoform A.
SEQ ID NO: 4 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz aus SEQ ID NO: 3 verschlüsselt ist.
SEQ ID NO: 5-7 sind die bestimmten cDNA-Sequenzen für drei Spleißvarianten des B305D Isoform C.
SEQ ID NO: 8-10 sind die Aminosäuresequenzen, die jeweils durch die Sequenz aus SEQ ID NO: 5-7 verschlüsselt sind.
SEQ ID NO: 11 ist die bestimmte cDNA-Sequenz für B311D.
SEQ ID NO: 12 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz aus SEQ ID NO: 11 verschlüsselt ist.
SEQ ID NO: 13 ist die bestimmte cDNA-Sequenz einer ersten Spleißvariante des B726P.
SEQ ID NO: 14 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz aus SEQ ID NO: 13 verschlüsselt ist.
SEQ ID NO: 15 ist die bestimmte cDNA-Sequenz einer zweiten Spleißvariante des B726P.
SEQ ID NO: 16 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz aus SEQ ID NO: 15 verschlüsselt ist.
SEQ ID NO: 17 ist die bestimmte cDNA-Sequenz einer dritten Spleißvariante des B726P.
SEQ ID NO: 18 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz aus SEQ ID NO: 17 verschlüsselt ist.
SEQ ID NO: 19-24 sind die bestimmten cDNA-Sequenzen weiterer Spleißvarianten des B726P.
SEQ ID NO: 25-29 sind die Aminosäuresequenzen, die jeweils durch SEQ ID NO: 19-24 verschlüsselt sind.
SEQ ID NO: 30 ist die bestimmte cDNA-Sequenz für B511S.
SEQ ID NO: 31 ist die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 30 verschlüsselt ist.
SEQ ID NO: 32 ist die bestimmte cDNA-Sequenz für B533S.
SEQ ID NO: 33 ist die DNA-Sequenz des Lipophilin B Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 34 ist die DNA-Sequenz des Lipophilin B Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 35 ist die DNA-Sequenz der Lipophilin B Sonde.
SEQ ID NO: 36 ist die DNA-Sequenz des GABA (B899P) Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 37 ist die DNA-Sequenz des GABA (B899P) Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 38 ist die DNA-Sequenz der GABA (B899P) Sonde.
SEQ ID NO: 39 ist die DNA-Sequenz des B305D (C-Form) Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 40 ist die DNA-Sequenz des B305D (C-Form) Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 41 ist die DNA-Sequenz der B305D (C-Form) Sonde.
SEQ ID NO: 42 ist die DNA-Sequenz des B726P Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 43 ist die DNA-Sequenz des B726P Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 44 ist die DNA-Sequenz der B726P Sonde.
SEQ ID NO: 45 ist die DNA-Sequenz des Actin Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 46 ist die DNA-Sequenz des Actin Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 47 ist die DNA-Sequenz der Actin Sonde.
SEQ ID NO: 48 ist die DNA-Sequenz des Mammaglobin Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 49 ist die DNA-Sequenz des Mammaglobin Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 50 ist die DNA-Sequenz der Mammaglobin Sonde.
SEQ ID NO: 51 ist die DNA-Sequenz eines zweiten GABA (B899P) Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 52 ist die DNA-Sequenz eines zweiten B726P Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 53 ist die DNA-Sequenz eines GABA B899P-INT Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 54 ist die DNA-Sequenz eines GABA B899P-INT Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 55 ist die DNA-Sequenz einer GABA B899P-INT Taqman-Sonde.
SEQ ID NO: 56 ist die DNA-Sequenz eines B305D-INT Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 57 ist die DNA-Sequenz eines B305D-INT Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 58 ist die DNA-Sequenz einer B305D-INT Taqman-Sonde
SEQ ID NO: 59 ist die DNA-Sequenz eines B726-INT Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 60 ist die DNA-Sequenz eines B726-INT Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 61 ist die DNA-Sequenz einer B726-INT Taqman-Sonde.
SEQ ID NO: 62 ist die DNA-Sequenz einer GABA B899P Taqman-Sonde.
SEQ ID NO: 63 ist die DNA-Sequenz eines B311D Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 64 ist die DNA-Sequenz eines B311D Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 65 ist die DNA-Sequenz einer B311D Taqman-Sonde.
SEQ ID NO: 66 ist die DNA-Sequenz eines B533S Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 67 ist die DNA-Sequenz eines B533S Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 68 ist die DNA-Sequenz einer B533S Taqman-Sonde.
SEQ ID NO: 69 ist die DNA-Sequenz eines B511S Vorwärts-Primers.
SEQ ID NO: 70 ist die DNA-Sequenz eines B511S Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 71 ist die DNA-Sequenz einer B511S Taqman-Sonde.
SEQ ID NO: 72 ist die DNA-Sequenz eines GABAπ Rückwärts-Primers.
SEQ ID NO: 73 ist die vollständige cDNA-Sequenz für Mammaglobin.
SEQ ID NO: 74 ist die bestimmte cDNA-Sequenz für den offenen Leserahmen, der ein Mammaglobin rekombinantes Polypeptid, exprimiert in E. coli verschlüsselt.
SEQ ID NO: 75 ist eine vollständige cDNA-Sequenz für GABAπ.
SEQ ID NO: 76 ist eine vollständige cDNA-Sequenz für Lipophilin B.
SEQ ID NO: 77 ist die Aminosäuresequenz, die durch die Sequenz aus SEQ ID NO: 76 verschlüsselt wird.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie voranstehend dargelegt richtet sich die vorliegende Erfindung im Allgemeinen an Verfahren, die für die Identifikation gewebespezifischer Polynukleotide geeignet sind und an Verfahren, Zusammensetzungen und Kits, die für die Diagnose und Überwachung von Brustkrebs geeignet sind.
Identifikation gewebespezifischer Polynukleotide
Einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen Verfahren, Zusammensetzungen und Kits zum Nachweisen von Brustkrebszellen in einer biologischen Probe bereit. Diese Verfahren umfassen den Schritt zum Nachweis eines oder mehrerer gewebespezifischer Polynukleotids/e aus einer biologischen Probe eines Patienten, wobei eine Überexpression der Polynukleotide auf die Anwesenheit von Krebszellen in der biologischen Probe des Patienten hindeutet. In Anbetracht dessen stellt die vorliegende Erfindung darüber hinaus Verfahren bereit, die für die Identifikation gewebespezifischer Polynukleotide geeignet sind. Die Bezeichnungen „gewebespezifische Polynukleotide" oder „tumorspezifische Polynukleotide" umfassen wie sie hier verwendet werden alle Polynukleotide, die wenigstens zweifach überexprimiert sind, verglichen mit einem oder mehreren Kontrollgewebe/n. Wie nachfolgend ausführlicher dargestellt, kann die Überexpression eines bestimmten Polynukleotids zum Beispiel durch Microarray- und/oder quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (Real-time^TM PCR)-Verfahren bewertet werden.
Beispielhafte Verfahren zum Nachweisen gewebespezifischer Polynukleotide können die Schritte umfassen, dass (a) eine genetische Substraktion durchgeführt wird, um ein Pool von Polynukleotiden aus einem relevanten Gewebe zu identifizieren; (b) eine DNA-Microarray-Analyse durchgeführt wird, um eine erste Teilmenge des Pools von relevanten Polynukleotiden zu identifizieren, wobei jedes Polynukleotidelement der ersten Teilmenge in dem relevanten Gewebe wenigstens doppelt überexprimiert ist, verglichen mit einem Kontrollgewebe; und (c) eine quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse der Polynukleotide in der ersten Teilmenge durchgeführt wird, um eine zweite Teilmenge von Polynukleotiden zu identifizieren, die wenigstens doppelt überexprimiert sind, verglichen mit dem Kontrollgewebe.
Polynukleotide im Allgemeinen
Wie hier verwendet bezieht sich die Bezeichnung „Polynukleotide" im Allgemeinen entweder auf DNA- oder RNA-Moleküle. Polynukleotide können auf natürliche Weise auftreten, wie sie normalerweise in einer biologischen Probe wie Blut, Serum, Lymphknoten, Knochenmark, Sputum, Urin und Tumorbiopsieproben gefunden werden. Alternativ können Polynukleotide synthetisch abgeleitet werden, zum Beispiel durch eine Nukleinsäure-Polymerisationsreaktion. Wie der geschulte Fachmann anerkennt, können Polynukleotide einzelsträngig (Codogen, Antisense) oder doppelsträngig sein und können DNA-(genomisch, cDNA oder synthetisch) oder RNA-Moleküle sein. RNA-Moleküle enthalten HnRNA-Moleküle, die Intronen enthalten und einem DNA-Molekül eins zu eins entsprechen, und mRNA-Moleküle, die keine Intronen enthalten. Zusätzliche codogene oder nicht-codogene Sequenzen können, müssen jedoch nicht, in einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung anwesend sein, und ein Polynukleotid kann, muss jedoch nicht, mit anderen Molekülen und/oder Trägermaterialien verbunden sein.
Polynukleotide können eine natürliche Sequenz (das heißt, eine endogene Sequenz, die ein Tumorprotein, wie beispielsweise ein Brusttumorprotein, oder einen Teil davon verschlüsselt) umfassen, oder können eine Variante oder ein biologisches oder antigenes funktionales Äquivalent einer solchen Sequenz umfassen. Polynukleotidvarianten können ein oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen und/oder Insertionen umfassen, wie nachfolgend ausführlich beschrieben wird. Die Bezeichnung „Variante" schließt darüber hinaus homologe Gene xenogener Herkunft ein.
Beim Vergleichen von Polynukleotid- oder Polypeptid-Sequenzen gelten zwei Sequenzen als „identisch", wenn die Sequenz der Nukleotide oder Aminosäuren in den beiden Sequenzen die gleiche ist, wenn diese, wie nachfolgend erläutert, zur maximalen Entsprechung ausgerichtet sind. Vergleiche zwischen zwei Sequenzen werden typischerweise durch Vergleiche der Sequenzen mittels eines Vergleichsfensters durchgeführt, um lokale Regionen sequenzieller Ähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein „Vergleichsfenster" wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Segment von wenigstens ungefähr 20 angrenzenden Positionen, in der Regel 30 bis ungefähr 75, 40 bis ungefähr 50, in denen eine Sequenz mit einer Referenzsequenz mit der gleichen Anzahl angrenzender Positionen verglichen wird, nachdem die beiden Sequenzen optimal ausgerichtet wurden.
Die optimale Ausrichtung von Sequenzen zu Vergleichszwecken kann mit dem Megaline-Programm der Lasergene Suite aus Bioinformatik-Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI) durchgeführt werden, das Standardparameter verwendet. Dieses Programm enthält diverse Ausrichtungsschemata, die in den folgenden Referenzwerken beschrieben werden: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins – Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (Hrsg.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Band 5, Beilage 3, S. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes S. 626-645 Methods in Enzymology Band 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D. G. und Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5: 151-153; Myers, E. W. und Muller W. (1988) CABIOS 4: 11-17; Robinson E. D. (1971) Comb. Theor 11: 105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Sneath, P. H. A. und Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy – the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W. J. und Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 80: 726-730.
Alternativ kann eine optimale Ausrichtung der Sequenzen zu Vergleichszwecken mit dem Local Identity Algorithm von Smith und Waterman (1981) Add APL. Math 2: 482, dem Identity Alignment Algorithm von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 433, durch die Suche nach Ähnlichkeitsverfahren von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 2444, mit computergesteuerter Implementierungen von Algorithmen (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Inspektion durchgeführt werden.
Ein bevorzugtes Beispiel für Algorithmen, die zur Bestimmung von prozentualer Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit geeignet sind, sind BLAST- und BLAST 2.0-Algorithmen, die in Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 beziehungsweise Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 beschrie ben werden. BLAST und BLAST 2.0 können verwendet werden, um zum Beispiel mit den hier beschriebenen Parametern die prozentuale Sequenzidentität für die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung zu bestimmen. Software zum Durchführen von BLAST-Analysen ist öffentlich erhältlich über das National Center for Biotechnology Information. In einem illustrierenden Beispiel können Kumulativwerte berechnet werden, wobei bei Nukleotidsequenzen die Parameter M (Reward Score für ein Paar passender Residuen; immer >0) und N (Penalty Score für nicht passende Residuen; immer <0) verwendet werden. Bei Aminosäuresequenzen kann zum Berechnen des Kumulativwertes eine Scoring Matrix verwendet werden. Eine Erweiterung der Word Hits in jede Richtung wird angehalten, wenn der kumulative Angleichungswert um die Menge X von seinem maximal erzielten Wert fällt, der Kumulativwert aufgrund der Akkumulation einer oder mehrerer negativ bewertender Residuenangleichung/en auf Null oder weniger sinkt, oder das Ende einer Sequenz erreicht wird. Die Parameter des BLAST-Algorithmus W, T und X bestimmen Sensibilität und Geschwindigkeit der Angleichung. Das BLASTN-Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Fehlerwert eine Wortlänge (W) von 11 und Erwartung (E) von 10, und die BLOSUM62 Scoring Matrix (siehe Henikoff und Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 10915) Angleichungen (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4 und einen Vergleich der beiden Stränge.
Vorzugsweise wird der „Prozentsatz der Sequenzidentität" durch Vergleich zweier optimal angeglichener Sequenzen über ein Vergleichsfenster von wenigstens 20 Positionen bestimmt, wobei der Teil der Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (das heißt Lücken) von 20 Prozent oder weniger umfassen kann, in der Regel 5 bis 15 Prozent oder 10 bis 12 Prozent, verglichen mit den Referenzsequenzen (die keine Additionen oder Deletionen umfassen) für die optimale Angleichung der beiden Sequenzen. Der Prozentsatz wird durch Bestimmen der Anzahl der Positionen, an denen die identischen Nukleinsäurebasen oder Aminosäureresiduen in beiden Sequenzen auftreten, berechnet, um die Anzahl der passenden Positionen zu erhalten, wobei die Anzahl der passenden Positionen durch die Gesamtanzahl der Positionen in der Referenzsequenz (das heißt der Fenstergröße) dividiert und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, um den Prozentsatz der Sequenzidentität zu erhalten.
Demzufolge schließt die vorliegende Erfindung Polynukleotid- und Polypeptidsequenzen ein, die eine substanzielle Identität mit den hier offenbarten Sequenzen haben, zum Beispiel diejenigen, die wenigstens 50 % Sequenzidentität umfassen, vorzugsweise wenigstens 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder mehr, wobei die Sequenzidentität mit einer Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz dieser Erfindung mit den hier beschriebenen Verfahren verglichen wird (zum Beispiel BLAST-Analyse unter Verwendung von Standardparametern wie voranstehend beschrieben). Ein geschulter Fachmann wird anerkennen, dass diese Werte in geeigneter Weise angepasst werden können, um die entsprechende Identität von Proteinen, die durch zwei Nukleotidsequenzen verschlüsselt sind, zu bestimmen, wobei Codondegeneration, Aminosäureähnlichkeit, die Positionierung des Leserahmens und Ähnliches berücksichtigt werden.
In zusätzlichen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung isolierte Polynukleotide und Polypeptide bereit, die verschiedene Längen benachbarter Ausdehnungen der Sequenz umfassen, die identisch oder komplementär mit einer oder mehreren der hier offenbarten Sequenzen ist. Zum Beispiel werden durch diese Erfindung Polynukleotide bereitgestellt, die wenigstens ungefähr 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 oder 1000 oder mehr benachbarte Nukleotide einer oder mehrerer hier offenbarten/r Sequenz/en umfassen, sowie alle Zwischenlängen dazwischen. Es wird ohne Weiteres verständlich, dass „Zwischenlänge" in diesem Zusammenhang jede Länge zwischen den genannten Werten bedeutet, wie beispielsweise 16, 17, 18, 19, et cetera; 21, 22, 23, et cetera; 30, 31, 32, et cetera, 50, 51, 52, 53, et cetera; 100, 101, 102, 103, et cetera; 150, 151, 152, 153, et cetera, hierin inbegriffen alle ganzen Zahlen von 200 bis 500 und 500 bis 1000 und dergleichen.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon können unabhängig von der Länge der Kodiersequenz selbst mit anderen DNA-Sequenzen kombiniert werden, wie beispielsweise Promotern, Polyadenylationssignalen, zusätzlichen Restriktionsenzymstellen, multiplen Klonierungsstellen oder Codiersegmenten und dergleichen, sodass ihre Gesamtlänge bedeutend variieren kann. Daher wird erwogen, dass ein Nukleinsäurefragment von fast jeder Länge verwendet werden kann, mit der Gesamtlänge, die vorzugsweise durch die Erleichterung der Vorbereitung und Verwendung in dem beabsichtigten rekombinierten DNA-Protokoll begrenzt wird. Zum Beispiel werden illustrierende DNA-Segmente mit Gesamtlängen von ungefähr 10.000, ungefähr 5000, ungefähr 3000, ungefähr 2000, ungefähr 1000, ungefähr 500, ungefähr 200, ungefähr 100, ungefähr 50 Basenpaaren in der Länge und dergleichen (einschließlich aller Zwischenlängen) als für viele Implementierungen dieser Erfindung nützlich erachtet.
In anderen Ausführungsformen richtet sich die vorliegende Erfindung an Polynukleotide, die unter mäßig stringenten Bedingungen mit einer hier bereitgestellten Polynukleotidsequenz oder einem Fragment davon, oder einer komplementären Sequenz davon, hybridisieren können. Hybridisierungstechniken sind auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt. Zum Zwecke der Illustration beinhalten geeignete mäßig stringente Bedingungen zum Testen der Hybridisierung eines Polynukleotids dieser Erfindung mit anderen Polynukleotiden das Vorwaschen in einer Lösung von 5 X SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH 0,8); das Hybridisieren bei 50 °C bis 65 °C, 5 X SSC, über Nacht, gefolgt von zweimaligem Waschen bei 65 °C für 20 Minuten mit jeweils 2X, 0,5X und 0,2X SSC, beinhaltend 0,1 % SDS.
Darüber hinaus wird von Personen mit normalen Erfahrungen auf dem Gebiet der Technik möglicherweise begrüßt, dass als ein Ergebnis der Degeneration des genetischen Codes viele Nukleotidsequenzen vorhanden sind, die ein Polypeptid wie hier beschrieben verschlüsseln. Einige dieser Polynukleotide haben eine minimale Homologie mit der Nukleotidsequenz eines natürlichen Gens. Nichtsdestotrotz werden Polynukleotide, die aufgrund von Unterschieden in der Codonverwendung variieren, durch die vorliegende Erfindung besonders betrachtet. Ferner sind Allele von den Genen, die die hier bereit gestellten Polynukleotidsequenzen umfassen, im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten. Allele sind endogene Gene, die als ein Ergebnis einer oder mehrerer Mutationen, wie beispielsweise Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Nukleotiden, verändert werden. Die daraus hervorgehende mRNA und das Protein können, müssen jedoch nicht, eine veränderte Struktur oder Funktion haben. Allele können mit Standardtechniken (wie beispielsweise Hybridisierung, Amplifikation und/oder Datenbanksequenzvergleich) identifiziert werden.
Microarray-Analyse
Polynukleotide, die in Übereinstimmung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen geeignet sind, können wie nachstehend ausführlicher beschrieben durch Screening eines Microarrays von cDNAs auf gewebe- und/oder tumorverbundene Expression (zum Beispiel Expression, die wenigstens zweimal größer in einem Tumor ist als in normalem Gewebe, wie unter Verwendung eines hier bereitgestellten repräsentativen Tests bestimmt) identifiziert werden. Solche Screens können zum Beispiel durchgeführt werden, indem ein Synteni Microarray (Palo Alto, CA) in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers (und im Wesentlichen wie von Schena et al., Proc, Natl. Acad Sci. USA 93: 10614-10619 (1996) und Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155 (1997) beschrieben) verwendet wird.
Microarray ist ein effektives Verfahren zum Bewerten einer großen Anzahl von Genen, aber aufgrund seiner begrenzten Sensibilität kann es die absolute Gewebeverteilung von Genen in geringer Menge nicht exakt bestimmen, oder kann den Grad der Überexpression von Genen in größerer Menge aufgrund der Signalsättigung unterschätzen. Für diese Gene, die durch Microarray-Expression-Profilierung eine Überexpression aufweisen, wurden weitere Analysen mit der quantitativen RT-PCR durchgeführt, basierend auf dem Taqman^TM-Sondennachweis, der eine größere dynamische Sensibilitätsspanne umfasst. Zu diesem Zweck wurden einige unterschiedliche Reihen von normalem und von Tumorgewebe, Fernmetastasen und Zelllinien verwendet.
Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können geeignete Polynukleotide ferner durch Verwendung einer quantitativen PCR-Methode wie beispielsweise der Echtzeit-PCR-Methode charakterisiert oder alternativ ursprünglich identifiziert werden. Mit dieser Methode können Gewebe- und/oder Tumorproben, wie zum Beispiel metastatische Tumorproben entlang der entsprechenden normalen Gewebeprobe und/oder eine Reihe nicht damit zusammenhängender normale Gewebeproben getestet werden.
Echtzeit-PCR (siehe Gibson et al., Genome Research 6: 995-1001, 1996; Heid et al., Genome Research 6: 986-994, 1996) ist eine Technik, die das Niveau der PCR-Produktakkumulierung während der Amplifikation misst. Diese Technik ermöglicht die quantitative Bewertung des mRNA-Gehalts in verschiedenen Proben. Kurz gesagt, mRNA wird aus Tumor- und normalem Gewebe extrahiert, und cDNA wird mit den Standardtechniken vorbereitet.
Echtzeit-PCR kann zum Beispiel entweder bei ABI 7700 Prismen oder an einem GeneAmp^®5700 Sequenznachweissystem (PE Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt werden. Das 7700 System verwendet einen Vorwärts- und einen Rückwärts-Primer in Kombination mit einer spezifischen Sonde mit einem 5' fluoreszierenden Reporterfarbstoff an einem Ende und einem 3' Quencherfarbstoff am anderen Ende (Taqman^TM). Wenn die Echtzeit-PCR unter Verwendung der Taq-DNA-Polymerase mit 5'-3' Nukleaseaktivität durchgeführt wird, wird die Sonde gespalten und beginnt zu fluoreszieren, wodurch die Reaktion durch einen Anstieg des Fluoreszierens überwacht werden kann (Echtzeit). Das 5700 System verwendet SYBR^® Green, einen fluoreszierenden Farbstoff, der nur doppelsträngige DNA bindet, und den gleichen Vorwärts- und Rückwärts-Primer wie das 7700 Instrument. Passende Primer und fluoreszierende Sonden können in Übereinstimmung mit dem Primer-Exprimierprogramm (PE Biosystems, Foster City, CA) gestaltet werden. Die optimale Konzentration der Primer und Sonden wird zunächst durch Personen mit gewöhnlicher Erfahrung auf dem Gebiet der Technik bestimmt. Kontroll-Primer (zum Beispiel β-Actin) und Sonden sind kommerziell zum Beispiel bei Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA) erhältlich.
Um die Menge der spezifischen RNA in einer Probe genau zu bestimmen, wird eine Standardkurve erzeugt, wobei ein Plasmid, das das relevante Gen enthält, verwendet wird. Standardkurven werden erzeugt, indem die Ct-Werte, die in der Echtzeit-PCR bestimmt werden, und die mit der ursprünglichen cDNA-Konzentration, die bei der Analyse verwendet wird, zusammenhängen, verwendet werden. Standardverdünnungen zwischen 10-10⁶ Kopien des relevanten Gens sind in der Regel ausreichend. Zusätzlich wird eine Standardkurve für die Kontrollsequenz erzeugt. Das ermöglicht die Standardisierung des ursprünglichen RNA-Gehalts einer Gewebeprobe bis zu der Kontrollmenge zu Vergleichszwecken.
In Übereinstimmung mit Voranstehendem und wie ferner nachfolgend beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung die illustrierenden brustgewebe- und/oder -tumorspezifischen Polynukleotide Mammaglobin, Lipophilin B, GABAπ(B899P), B726P, B511S, B533S, B305D und B311D bereit, die Sequenzen haben, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5-7, 11, 13, 15, 17, 19-24, 30, 32 und 73-76 gezeigt sind, illustrierende Polypeptide, die dadurch verschlüsselt sind und Aminosäuresequenzen haben, die in SEQ ID NO: 2, 4, 8-10, 12, 14, 16, 18, 25-29 und 31 und 77 gezeigt sind, und die in geeigneter Weise zum Nachweisen von Krebs, genauer gesagt von Brustkrebs, verwendet werden können.
Die hier offenbarten Verfahren ermöglichen darüber hinaus die Identifizierung zusätzlicher und/oder alternativer Polynukleotide, die für den Nachweis einer großen Bandbreite von Krebs geeignet sind, hierin inbegriffen, jedoch nicht darauf beschränkt, Prostatakrebs, Brustkrebs, Kolonkrebs, Eierstockkrebs, Lungenkrebs, Kopf-Hals-Krebs, Lymphadenom, Leukämie, Melanome, Leberkrebs, Magenkrebs, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Bauspeicheldrüsenkrebs und Gebärmutterschleimhautkrebs.
Methoden zum Nachweisen von Krebs
Im Allgemeinen können Krebszellen in einem Patienten auf Grundlage der Anwesenheit eines oder mehrerer Polynukleotids/e in Zellen einer biologischen Probe (zum Beispiel Blut, Lymphknoten, Knochenmark, Seren, Sputum, Urin und/oder Tumorbiopsien), die von einem Patienten erhalten wurde, nachgewiesen werden. Mit anderen Worten, solche Polynukleotide können als Marker verwendet werden, um auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebs, wie zum Beispiel Brustkrebs, hinzudeuten.
Wie hier ausführlicher dargestellt, erfüllt die vorliegende Erfindung diese und andere verbundene Aufgaben durch Bereitstellung von Methoden für den gleichzeitigen Nachweis von mehr als einem Polynukleotid, dessen Anwesenheit diagnostisch für die Anwesenheit von Krebszellen in einer biologischen Probe ist. Jede der verschiedenen Methoden zum Nachweisen von Krebs, die hier offenbart werden, haben den Schritt der Hybridisierung eines oder mehrerer Oligonukleotidprimer/s und/oder -sonde/n gemeinsam, wobei die Hybridisierung dessen beweiskräftig ist für die Anwesenheit eines tumor- und/oder gewebespezifischen Polynukleotids. In Abhängigkeit von der betrachteten präzisen Anwendung kann es vorgezogen werden, ein oder mehrere Intron überspannende/s Oligonukleotid/e zu verwenden, das/die gegenüber Polynukleotiden aus genomischer DNA wirkungslos ist/sind und, demzufolge, sind diese Oligonukleotide wirksam beim substanziellen Reduzieren und/oder Entfernen des Nachweises genomischer DNA in einer biologischen Probe.
Ferner werden hier Verfahren zur Verstärkung der Sensibilität dieser Nachweismethoden offenbart, indem die zu testenden biologischen Proben einem oder mehreren Zelleinfangs- oder Zellabreicherungsmethoden ausgesetzt werden.
Mittels einiger Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Anwesenheit von Krebszellen in einem Patienten durch Anwenden der folgenden Schritte bestimmt werden, nämlich dass: (a) eine biologische Probe des Patienten erhalten wird; (b) die biologische Probe mit einem ersten Oligonukleotid, das mit einem ersten Polynukleotid hybridisiert, in Verbindung gebracht wird, wobei das erste Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden, die in SEQ ID NO: 73 und SEQ ID NO: 74 gezeigt werden, ausgewählt ist; (c) die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotid, das mit einem zweiten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5-7, 11, 13, 15, 17, 19-24, 30, 32 und 75, in Verbindung gebracht wird; (d) in der Probe eine Menge an Polynukleotid nachgewiesen wird, das mit wenigstens einem Oligonukleotid hybridisiert; und (e) die Menge an Polynukleotid, das mit dem Oligonukleotid hybridisiert mit einem vorbestimmten Ausschlusswert verglichen wird und daraus die Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebs bei dem Patienten bestimmt wird.
Alternative Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen Verfahren bereit, mit denen die Anwesenheit von Krebszellen in einem Patienten durch Anwenden der Schritte bestimmt wird, nämlich dass (a) eine biologische Probe von einem Patienten erhalten wird; (b) die biologische Probe mit einem ersten Oligonukleotid, das mit einem ersten Polynukleotid hybridisiert, in Verbindung gebracht wird, wobei das erste Polynukleotid in SEQ ID NO: 76 gezeigt ist; (c) die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotid, das mit einem zweiten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 5-7, 11, 13, 15, 17, 19-24, 30, 32 und 75, in Verbindung gebracht wird; (d) die Menge an Polynukleotiden, die mit wenigstens einem der Oligonukleotide hybridisiert, in der Probe nachgewiesen wird; und (e) die Menge an Polynukleotid, das mit dem Oligonukleotid hybridisiert mit einem vorbestimmten Ausschlusswert verglichen wird und daraus die Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebs bei dem Patienten bestimmt wird.
Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebs bei einem Patienten bereit. Solche Verfahren umfassen die Schritte, dass (a) eine biologische Probe von einem Patienten erhalten wird; (b) die biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde mit einem ersten Oligonukleotid, das mit einer Polynukleotidsequenz hybridisiert, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO: 74 und SEQ ID NO: 76 gezeigt, in Verbindung gebracht wird; (c) die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid wie in SEQ ID NO: 75 gezeigt hybridisiert, in Verbindung gebracht wird; (d) die biologische Probe mit einem dritten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt, in Verbindung gebracht wird; (e) die biologische Probe mit einem vierten Oligonukleotid, das mit einem Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt, in Verbindung gebracht wird; (f) in der biologischen Probe eine Menge an Polynukleotid nachgewiesen wird, das mit wenigstens einem der Oligonukleotide hybridisiert; und (g) die Menge an Polynukleotid, das mit dem Oligonukleotid hybridisiert mit einem vorbestimmten Ausschlusswert verglichen wird und daraus die Anwesenheit oder Abwesenheit von Krebs bei dem Patienten nachgewiesen wird.
Um die Hybridisierung unter Testbedingungen zu ermöglichen, sollten Oligonukleotidprimer und -sonden eine Oligonukleotidsequenz umfassen, die wenigstens ungefähr 60 %, vorzugsweise wenigstens ungefähr 75 % und stärker bevorzugt wenigstens ungefähr 90 % Identität mit einem Teil eines Polynukleotids haben, das ein Brusttumorprotein verschlüsselt, das wenigstens 10 Nukleotide und vorzugsweise 20 Nukleotide lang ist. Vorzugsweise hybridisieren Oligonukleotidprimer mit einem Polynukleotid, das ein hier beschriebenes Polypeptid unter mäßig stringenten Bedingungen verschlüsselt, wie voranstehend definiert. Oligonukleotidprimer, die sinnvollerweise für hier beschriebenen Diagnoseverfahren verwendet werden können, sind vorzugsweise wenigstens 10 bis 40 Nukleotide lang. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Oligonukleotidprimer wenigstens 10 benachbarte Nukleotide, stärker bevorzugt wenigstens 15 benachbarte Nukleotide eines DNA-Moleküls, das eine Sequenz hat, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5-7, 11, 13, 15, 17, 19-24, 30, 32 und 73-76 angeführt wird. Techniken für beide, PCR-basierte Tests und Hybridisierungstests, sind auf dem Gebiet der Technik bekannt (siehe, zum Beispiel, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus amplifikationsbasierte Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Krebszellen bei einem Patienten bereit. Beispielhafte Verfahren umfassen die Schritte, dass (a) eine biologische Probe von einem Patienten erhalten wird; (b) die biologische Probe mit einem ersten Oligonukleotidpaar in Verbindung gebracht wird, wobei das erste Paar einen ersten Oligonukleotid und einen zweiten Oligonukleotid umfasst und das erste und das zweite Oligonukleotid mit einem ersten Polynukleotid beziehungsweise dem Komplement davon hybridisieren; (c) die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotidpaar in Verbindung gebracht wird, wobei das zweite Oligonukleotidpaar ein drittes Oligonukleotid und ein viertes Oligonukleotid umfasst und das dritte und das vierte Oligonukleotid mit einem zweiten Polynukleotid beziehungsweise dem Komplement davon hybridisieren, wobei das erste Polynukleotid in der Nukleotidsequenz nicht mit dem zweiten Polynukleotid in Verbindung gebracht wird; (d) das erste Polynukleotid und das zweite Polynukleotid amplifizieren; und (e) das amplifizierte erste Polynukleotid und das amplifizierte zweite Polynukleotid nachgewiesen werden, wobei die Anwesenheit des amplifizierten ersten Polynukleotids oder des amplifizierten zweiten Polynukleotids auf die Anwesenheit von Krebszellen in dem Patienten hindeutet.
Verfahren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind zum Identifizieren von Polynukleotiden geeignet, die aus einer großen Bandbreite von biologischen Proben wie beispielsweise Blut, Serum, Lymphknoten, Knochenmark, Sputum, Urin und Tumorbiopsieproben erhalten werden. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die biologische Probe entweder Blut, ein Lymphknoten oder Knochenmark. In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann der Lymphknoten ein Indikatorlymphknoten sein.
Es wird verständlich, dass die vorliegenden Verfahren zum Nachweis einer großen Bandbreite von Krebs verwendet werden können. Beispielhafte Krebse schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Prostatakrebs, Brustkrebs, Kolonkrebs, Eierstockkrebs, Lungenkrebs, Kopf-Hals-Krebs, Lymphadenom, Leukämie, Melanome, Leberkrebs, Magenkrebs, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Gebärmutterschleimhautkrebs.
Einige beispielhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen Verfahren bereit, wobei die nachzuweisenden Polynukleotide aus der Gruppe bestehend aus Mammaglobin, Lipophilin B, GABAπ (B899P), B726B, B511S, B533S, B305D und B311D ausgewählt sind. Alternativ und/oder zusätzlich können nachzuweisende Polynukleotide aus der Gruppe bestehend aus den in SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 76 gezeigten ausgewählt sein.
Geeignete beispielhafte Oligonukleotidsonden und/oder -primer, die in Übereinstimmung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden hier durch SEQ ID NOs: 33-35 und 63-72 offenbart. In einigen bevorzugten Ausführungsformen, die den Hintergrundnachweis der genomischen DNA ausklammern, können die Oligonukleotide Intron überspannende Oligonukleotide sein. Beispielhafte Intron überspannende Oligonukleotide, die für den Nachweis verschiedener Polynukleotide, die hier offenbart werden, geeignet sind, werden in SEQ ID NOs: 36-62 gezeigt.
In Abhängigkeit von der betrachteten präzisen Anwendung kann der Fachmann es vorziehen, die gewebe- und/oder tumorspezifischen Polynukleotide durch Nachweis einer radioaktiven Markierung oder Nachweisen eines Fluorophors nachzuweisen. Im Speziellen kann die Oligonukleotidsonde und/oder der -primer einen nachweisbaren Anteil umfassen, wie beispielsweise eine radioaktive Markierung und/oder ein Fluorophor.
Alternativ oder zusätzlich können die Verfahren der vorliegenden Erfindung darüber hinaus einen Schritt der Fraktionierung vor dem Nachweis der gewebe- und/oder tumorspezifischen Polynukleotide umfassen, wie zum Beispiel durch Gelelektropherese.
In anderen Ausführungsformen können die hier beschriebenen Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens von Krebs verwendet werden. Durch diese Ausführungsformen können die Tests wie sie zur Diagnose von Krebs bereitgestellt werden, über die Zeit durchgeführt und die Änderung des Gehalts an reaktivem/n Polypeptid/en oder Polynukleotid/en bewertet werden. Zum Beispiel können die Tests über einen Zeitraum von 6 Monaten bis 1 Jahr alle 24 bis 72 Stunden und nachfolgend wie erforderlich durchgeführt werden. Im Allgemeinen entwickelt sich ein Krebs bei Patienten, deren Gehalt an Polypeptid oder Polynukleotid nachgewiesen wird, über die Zeit fort. Im Gegensatz dazu entwickelt sich der Krebs nicht fort, wenn der Gehalt an reaktiven Polypeptiden oder Polynukleotiden entweder konstant bleibt oder über die Zeit sinkt.
Einige in vivo Diagnosetests können direkt am Tumor durchgeführt werden. Ein solcher Test beinhaltet, dass die Tumorzellen mit einem Bindemittel in Verbindung gebracht werden. Das gebundene Bindemittel kann dann direkt oder indirekt über eine Reportergruppe nachgewiesen werden. Solche Bindemittel können darüber hinaus in histologischen Anwendungen verwendet werden. Alternativ können für solche Anwendungen Polynukleotidsonden verwendet werden.
Wie oben dargelegt können, um die Sensibilität zu verbessern, zahlreiche Brusttumorproteinmarker in einer Probe getestet werden. Es wird verständlich, dass Bindemittel, die für verschiedene Proteine spezifisch sind und hier bereitgestellt werden, in einem Einzeltest kombiniert werden können. Ferner können zahlreiche Primer oder Sonden gleichzeitig verwendet werden. Die Auswahl von Tumorproteinmarkern kann auf Routineexperimenten basieren, um die Kombinationen, die zu einer optimalen Sensibilität führen, zu bestimmen. Zusätzlich oder alternativ können hier bereitgestellte Tests für Tumorproteine mit Tests für andere bekannte Tumorantigene kombiniert werden.
Zellanreicherung
In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung können Zelleinfangtechnologien vor dem Nachweis von Polynukleotiden verwendet werden, um die Sensibilität der verschiedenen hier offenbarten Nachweismethoden zu verbessern.
Beispielhafte Zellanreicherungsmethoden wenden immunomagnetische Kugeln an, die mit spezifischen monoklonalen Antikörpern an Oberflächenzellmarkern beschichtet sind, oder es können tetramerische Antikörperkomplexe verwendet werden, um Krebszellen in einer Probe zunächst anzureichern oder positiv auszuwählen. Verschiedene kommerziell erhältliche Kits können verwendet werden, einschließlich Dynabeads^® Epithelial Enrich (Dynal Biotech, Oslo, Norwegen), StemSep^TM (StemCell Technologies, Inc, Vancouver, BC) und RosetteSep (StemCell Technologies). Der geschulte Fachmann wird anerkennen, dass andere ohne Weiteres erhältliche Methoden und Kits ebenfalls in geeigneter Weise verwendet werden können, um die gewünschten Zellpopulationen anzureichern oder positiv auszuwählen.
Dynabeads^® Epithelial Enrich umfasst magnetische Kugeln, die mit mAbs spezifisch für zwei Glycoproteinmembranantigene beschichtet sind, die in normalen und neoplastischen Epithelgeweben exprimiert sind. Die beschichteten Kugeln können einer Probe hinzugefügt werden, und die Probe kann dann auf einen Magneten angewendet werden, wob die Zellen, die an die Kugeln gebunden sind, eingefangen werden. Die unerwünschten Zellen werden weggewaschen, und die magnetisch isolierten Zellen werden von den Kugeln eluiert und dann für weitere Analysen verwendet.
RosetteSep kann zum Anreichern von Zellen direkt aus einer Blutprobe verwendet werden und besteht aus einer Mischung aus tetramerischen Antikörpern, die auf eine Vielzahl unerwünschter Zellen abzielen und sie mit Glycophorin A an rote Blutkörperchen (RBC), die in der Probe anwesend sind, vernetzt und Rosetten bildet. Beim Zentrifugieren über Ficoll bilden die abgezielten Zellen mit den freien RBC Kügelchen.
Die Kombination der Antikörper in der Flüssigkeit entziehenden Mischung bestimmt, welche Zellen entfernt werden und folglich welche Zellen erhalten bleiben. Antikörper, die verfügbar sind, umfassen, sind jedoch nicht darauf be schränkt, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD24, CD25, CD29, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD66B, CD66e, HLA-DR, IgE und TCRaQ. Zusätzlich wird in der vorliegenden Erfindung betrachtet, dass mAbs spezifisch für Brusttumorantigene entwickelt und in einer ähnlichen Weise verwendet werden kann. Zum Beispiel kann mAbs, das mit tumorspezifischen Zelloberflächen-Antigenen bindet, mit magnetischen Kugeln konjugiert werden oder in einem tetramerischen Antikörperkomplex formuliert und verwendet werden, um metastatische Brusttumorzellen aus einer Probe anzureichern oder positiv auszuwählen.
Wenn eine Probe angereichert oder positiv ausgewählt wurde, können die Zellen weiter analysiert werden. Zum Beispiel können die Zellen aufgelöst und RNA isoliert werden. Die RNA kann dann einer RT-PCR Analyse unterzogen werden, die brusttumorspezifische Mulitplex-Primer in einem Echtzeit-PCR-Test wie hier beschrieben verwendet.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können Zell-Einfang-Technologien in Verbindung mit Echtzeit-PCR verwendet werden, um ein sensibleres Mittel zum Nachweis metastatischer Zellen, die Brusttumorantigene exprimieren, bereitzustellen. Der Nachweis von Brustkrebszellen in Knochenmarkproben, peripherem Blut und kleinen Nadelaspirationsproben ist für die Diagnose und Prognose bei Brustkrebspatienten wünschenswert.
Sonden und Primer
Wie oben dargestellt und hier ausführlicher beschrieben verwenden einige Verfahren, Zusammensetzungen und Kits in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zwei oder mehr Oligonukleotidprimer-Paare zum Nachweis von Krebs. Durch die Fähigkeit solcher Nukleinsäuresonden, spezifisch mit einer relevanten Sequenz zu hybridisieren, können sie für das Nachweisen der Anwesenheit komplementärer Sequenzen in einer biologischen Probe von Nutzen sein.
Alternativ können in anderen Ausführungsformen die Sonden und/oder Primer der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen mittels Nukleinsäurehybridisierung verwendet werden. So wird angenommen, dass Nukleinsäuresegmente, die einen Sequenzbereich von einer wenigstens ungefähr 15 Nukleotide langen benachbarten Sequenzen, die die gleiche Sequenz wie eine 15 Nukleotide lange Sequenz eines nachzuweisenden Polynukleotids hat oder komplementär dazu ist, besonders nützlich sind. Längere benachbarte identische oder komplementäre Sequenzen, zum Beispiel die von ungefähr 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 (einschließlich aller Zwischenlängen) und sogar vollständige Sequenzen, werden in einigen Ausführungsformen ebenfalls nützlich sein.
Oligonukleotidprimer mit Sequenzbereichen, die aus benachbarten Nukleotidausdehnungen von 10 bis 14, 15 bis 20, 30, 50 oder sogar 100 bis 200 Nukleotiden oder dergleichen bestehen (einschließlich der Zwischenlängen) und identisch mit oder komplementär zu einem nachzuweisenden Polynukleotid sind, werden besonders als Primer zur Verwendung in Amplifikationsreaktionen wie zum Beispiel der Polymerase-Kettenreaktion (PCR^TM) betrachtet. Auf diese Weise könnte ein Polynukleotid in diversen biologischen Proben wie beispielsweise Blut, Lymphknoten und Knochenmark analysiert werden.
Die Verwendung eines Primers mit einer Länge von ungefähr 15 bis 20 Nukleotiden ermöglicht die Bildung eines Duplexmoleküls, das sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle, die benachbarte komplementäre Sequenzen über Ausdehnungen von mehr als 15 Basen Länge haben, werden in der Regel bevorzugt, allerdings, um die Stabilität und die Selektivität des Hybrids zu steigern und dadurch die Qualität und den Grad der erhaltenen spezifischen Hybridmoleküle zu verbessern. Man wird es im Allgemeinen bevorzugen, Primer zu entwickeln, die genkomplementäre Ausdehnungen von 15 bis 25 benachbarten Nukleotiden haben, oder sogar länger sind, wo gewünscht.
Primer können aus irgendeinem Teil der nachzuweisenden Polynukleotide ausgewählt werden. Es ist lediglich erforderlich, die Sequenz zu prüfen, wie beispielsweise die beispielhaften Polynukleotide, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5-7, 11, 13, 15, 17, 19-24, 30, 32, 73-75 (beziehungsweise 3 bis 6) und SEQ ID NO: 76 (Lipophilin B) dargestellt werden, oder einen benachbarte Teil der Sequenz mit einer Länge von ungefähr 15 bis 25 Nukleotiden bis zur und einschließlich der vollständigen Länge der Sequenz, die als ein Primer verwendet werden soll. Die Wahl der Primersequenzen kann von verschiedenen Faktoren bestimmt werden. Zum Beispiel kann man Primer von bis in Richtung der Enden der gesamten Sequenz zu verwenden wollen. Die beispielhaften Primer, die hier offenbart werden, können gegebenenfalls wegen ihrer Fähigkeit, selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Ausdehnungen der gesamten relevanten Polynukleotide wie in SEQ ID NO: 1, 3, 5-7, 11, 13, 15, 17, 19-24, 30, 32, 73-75 (beziehungsweise 3 bis 6) und in SEQ ID NO: 76 (Lipophilin B) dargestellt, zu bilden, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Nukleotidsequenz verschiedener beispielhafter Oligonukleotidprimer und -sonden bereit, die in SEQ ID NOs: 33-71 dargestellt werden, und die verwendet werden können, wie hier ausführlicher und in Übereinstimmung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen von Krebs beschrieben wird.
Oligonukleotidprimer können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ohne Weiteres routinemäßig mit für den Fachmann allgemein erhältlichen Verfahren vorbereitet werden, einschließlich, zum Beispiel, direktem Synthetisieren der Primer mit chemischen Mitteln, wie es allgemein praktiziert wird, unter Verwendung eines automatischen Oligonukleotid-Synthesizers. In Abhängigkeit von der anvisierten Anwendung wird man typischerweise wünschen, variierende Hybridisierungsbedingungen anzuwenden, um variierende Grade der Selektivität der Sonde in Richtung der Zielsequenz zu erzielen. Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, wird man typischerweise wünschen, relativ stringente Bedingungen anzuwenden, um die Hybride zu bilden, zum Beispiel, wird man relativ niedrige Salz- und/oder Temperaturbedingungen auswählen, wie sie beispielsweise durch eine Salzkonzentration von ungefähr 0,02 M bis 0,15 M Salz bei Temperaturen von ungefähr 50 °C bis ungefähr 70 °C bereitgestellt werden. Solche selektiven Bedingungen tolerieren, wenn überhaupt, geringe Fehlanpassungen zwischen der Sonde und dem Templat- oder Zielstrang und wären besonders geeignet zum Isolieren verbundener Sequenzen.
Polynukleotid-Amplifikationstechniken
Jede der hier aufgeführten spezifischen Ausführungsformen zum Nachweis von Krebs hat den Nachweis eines gewebe- und/oder tumorspezifischen Polynukleotids mittels Hybridisierung einer oder mehrerer Oligonukleotidprimer/s und/oder Sonde/n gemeinsam. In Abhängigkeit von solchen Faktoren wie der relativen Anzahl der Krebszellen, die in der biologischen Probe anwesend sind und/oder dem Grad an Polynukleotidexpression in jeder Krebszelle, kann es bevorzugt werden, einen Schritt zur Amplifikation vor der Durchführung der Schritte zum Nachweis durchzuführen. Zum Beispiel können wenigstens zwei Oligonukleotidprimer in einem auf Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierenden Test verwendet werden, um einen Teil einer Brusttumor-cDNA, die aus einer biologischen Probe abgeleitet wird, zu amplifizieren, wobei wenigstens einer der Oligonukleotidprimer spezifisch für (das heißt er hybridisiert mit einem) ein Polynukleotid ist, das das Brusttumorprotein verschlüsselt. Die amplifizierte cDNA kann optional einem Schritt zur Fraktionierung unterzogen werden, wie beispielsweise der Gelelektropherese.
Eine Anzahl von Templat-abhängigen Verfahren ist verfügbar, um die relevanten Zielsequenzen, die in einer Probe anwesend sind, zu amplifizieren. Eins der am besten bekannten Amplifikationsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR^TM), die ausführlich in den Dokumenten US Patent Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 beschrieben wird, wobei jedes hier als Bezug in seiner Gesamtheit aufgenommen wird. Kurz gesagt, bei PCR^TM werden zwei Primer-Sequenzen vorbereitet, die komplementär zu den Bereichen an gegenüber liegenden komplementären Strängen der Ziel-Sequenz sind. Ein Übermaß an Deoxynukleosidtriphosphate wird einer Reaktionsmischung gemeinsam mit einer DNA-Polymerase (zum Beispiel Taq Polymerase) hinzugefügt. Wenn die Ziel-Sequenz in einer Probe anwesend ist, binden sich die Primer an das Ziel, und die Polymerase führt dazu, dass die Primer entlang der Ziel-Sequenz durch Hinzufügen von Nukleotiden ausgedehnt werden. Durch Erhöhen und Senken der Temperatur der Reaktionsmischung lösen sich die ausgedehnten Primer von dem Ziel, um Reaktionsprodukte zu bilden, überschüssige Primer binden an das Ziel und das Reaktionsprodukt, und der Prozess wird wiederholt. Vorzugsweise können Reverse-Transkriptase- und PCR^TM-Amplifikationsverfahren durchgeführt werden, um die Menge der amplifizierten mRNA zu bestimmen. Methoden der Polymerase-Kettenreaktion sind auf dem Gebiet der Technik gut bekannt.
Eine bevorzugte Methode der Polynukleotid-Amplifikation verwendet RT-PCR, wobei PRC in Verbindung mit Reverse-Transkriptase angewendet wird. Typischerweise wird RNA aus einer biologischen Probe wie beispielsweise Blut, Serum, Lymphknoten, Knochenmark, Sputum, Urin und Tumorbiopsieproben extrahiert und reverse transkribiert, um cDNA-Moleküle zu bilden. PCR Amplifikation, die wenigstens einen spezifischen Primer verwendet, erzeugt ein cDNA-Molekül, das beispielsweise durch Gelelektropherese separiert und visualisiert werden kann. Die Amplifikation kann an biologischen Proben durchgeführt werden, die einem Patienten und einer Person, die nicht an Krebs erkrankt ist, entnommen werden. Die Amplifikationsreaktion kann an verschiedenen Lösungen von cDNA durchgeführt werden, die zwei Größenordnungen überspannen. Ein zweifacher oder größerer Anstieg der Expression in verschiedenen Lösungen der Probe des Testpatienten, verglichen mit der gleichen Lösung einer nicht-kanzerogenen Probe wird typischerweise als positiv erachtet.
Zur Durchführung des Schrittes der Amplifikation kann jedes einer Reihe von kommerziell erhältlichen Kits verwendet werden. Eine solche Amplifikationstechnik ist inverse PCR (siehe Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186, 1988), die Restriktionsenzyme verwendet, um ein Fragment in dem bekannten Bereich des Gens zu erzeugen. Das Fragment wird dann durch intramolekulare Ligatur zirkularisiert und als Templat für PCR mit divergierenden Primern, die aus dem bekannten Bereich abgeleitet werden, verwendet. In einem alternativen Ansatz können die Sequenzen, die an eine Teilsequenz grenzen, durch Amplifikation mit einem Primer an eine Linker-Sequenz und einen für einen bekannten Bereich spezifischen Primer wiedergewonnen werden. Die amplifizierten Sequenzen werden typischerweise einer zweiten Amplifikationsrunde mit dem gleichen Linker-Primer und einem zweiten Primer, der für den bekannten Bereich spezifisch ist, unterzogen. Eine Variante dieses Verfahrens, die zwei Primer verwendet, die eine Ausdehnung in entgegen gesetzte Richtungen der bekannten Sequenz hervorrufen, wird in Dokument WO 96/38591 beschrieben. Eine andere derartige Technik ist bekannt als „schnelle Amplifikation der cDNA-Enden" oder RACE. Diese Technik beinhaltet die Verwendung eines internen Primers und eines externen Primers, die mit einem polyA-Bereich oder einer Vektorsequenz hybridisieren, um Sequenzen zu identifizieren, die 5' und 3' einer bekannten Sequenz sind. Zusätzliche Techniken umfassen Capture PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-19, 1991) und Walking PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19: 3055-60, 1991). Andere Verfahren, die Amplifikation verwenden, können darüber hinaus verwendet werden, um eine vollständige cDNA-Sequenz zu erhalten.
Ein weiteres Verfahren zur Amplifizierung ist die Ligase-Kettenreaktion (LCR), die in der Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung Nr. 320,308 offenbart wird (hier im Besonderen als Bezug in ihrer Gesamtheit eingebunden). Bei LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare vorbereitet, und in Anwesenheit der Ziel-Sequenz bindet jedes Paar an gegenüber liegende komplementäre Stränge des Ziels, sodass sie angrenzen können. In Anwesenheit einer Ligase verbinden sich die zwei Sondenpaare, um eine einzige Einheit zu bilden. Durch Temperaturkreisläufe wie bei der PCR^TM, lösen sich gebundene ligierte Einheiten von dem Ziel und dienen dann als „Ziel-Sequenzen" zum Litigieren der überschüssigen Sondenpaare. Die Veröffentlichung des US Patents Nr. 4,883,750, das hier als Bezug in seiner Gesamtheit eingebunden wird, beschreibt ein alternatives Amplifikationsverfahren zum Binden von Sondenpaaren an eine Ziel-Sequenz, das der LCR ähnlich ist.
Qbeta Replicase, beschrieben in der Veröffentlichung der PCT internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US87/00880, hier als Bezug in ihrer Gesamtheit eingebunden, kann darüber hinaus als noch ein anderes Amplifikationsverfahren für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird eine replikative Sequenz von RNA, das einen Bereich hat, der komplementär zu dem des Ziels ist, in Anwesenheit einer RNA-Polymerase einer Probe hinzugefügt. Die Polymerase kopiert die replikative Sequenz, die dann nachgewiesen werden kann.
Ein isothermes Amplifikationsverfahren, in dem Restriktionsendonukleasen und -ligasen verwendet werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen zu erzielen, die Nukleotide 5'-[α-thio]triphosphate in einem Strang eines Restriktionsortes haben (Walker et al., 1992, hier als Bezug in seiner Gesamtheit eingebunden), kann für die Amplifikation von Nukleinsäuren in der vorliegenden Erfindung ebenfalls nützlich sein.
Strand Displacement Amplification (SDA) ist ein anderes Verfahren zum Durchführen einer isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren, das mehrfache Runden des Strand Displacements und der Synthese, das heißt Nick-Translation, beinhaltet. Ein ähnliches Verfahren, das Repair Chain Reaction (RCR) genannt wird, ist ein anderes Amplifikationsverfahren, das für die vorliegende Erfindung nützlich sein kann und das Härten verschiedener Sonden durch einen Bereich, der als Ziel für die Amplifikation dient, beinhaltet, gefolgt von einer Reparaturreaktion, bei der nur zwei der vier Basen anwesend sind. Die anderen zwei Basen können als biotinilierte Derivate zum einfachen Nachweis zugefügt werden. Ein ähnlicher Ansatz wird bei SDA verwendet.
Sequenzen können darüber hinaus durch Verwenden einer Reaktion cyclischer Sonden (CPR) nachgewiesen werden. Bei der CPR hybridisiert eine Sonde mit einer 3' und 5' Sequenz einer nicht Ziel-DNA und eine interne oder „mittlere" Sequenz einer zielproteinspezifischen RNA mit DNA, die in einer Probe anwesend ist. Nach der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNaseH behandelt, und die Produkte der Sonde werden durch Erzeugen eines Signals, das nach Digestion ausgelöst wird, als distinkte Produkte identifiziert. Das ursprüngliche Templat wird mit einer anderen cyclischen Sonde gehärtet, und die Reaktion wird wiederholt. Demzufolge beinhaltet CPR das Amplifizieren eines Signals, das durch Hybridisieren einer Sonde mit einer zielgenspezifisch exprimierten Nukleinsäure erzeugt wird.
Noch andere Amplifikationsverfahren, die in den Dokumenten der Veröffentlichung der britischen Patentanmeldung Nr. 2 202 328 und der PCT internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US89/01025 beschrieben werden, können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In der früheren Anwendung werden „modifizierte" Primer in einer PCR ähnlichen, Templat- und enzymabhängigen Synthese verwendet. Die Primer können durch Kennzeichnen mit einem Einfanganteil (zum Beispiel Biotin) und/oder einem Nachweisanteil (zum Beispiel Enzym) modifiziert werden. Bei letzterer Anwendung wird ein Übermaß gekennzeichneter Sonden einer Probe hinzugefügt. In Anwesenheit einer Ziel-Sequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach der Spaltung wird die Ziel-Sequenz intakt freigeben, um durch die überschüssige Sonde gebunden zu werden. Die Spaltung der gekennzeichneten Sonde signalisiert die Anwesenheit der Ziel-Sequenz.
Andere Nukleinsäureamplifikationsverfahren beinhalten transkriptionsbasierte Amplifikationssysteme (TAS) (Kwoh et al., 1989; Veröffentlichung der internationalen PCT Patentanmeldung Nr. WO 88/10315), einschließlich nukleinsäuresequenzbasierter Amplifikation (NASBA) und 3SR In NASBA, und die Nukleinsäuren können durch Standard Phenol-/Chloroformextraktion, Wärmedenaturierung einer Probe, Behandlung mit Lysispuffern und Minispinsäulen zum Isolieren der DNA und RNA oder Guanidinchloridextraktion der RNA zum Amplifizieren vorbe reitet werden. Diese Amplifikationstechniken beinhalten das Härten eines Primers, der Sequenzen hat, die für die Ziel-Sequenz spezifisch sind. Nach der Polymerisation werden DNA/RNA-Hybride mit RNase H digeriert, während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut wärmedenaturiert werden. In jedem Fall wird die einsträngige DNA vollständig doppelsträngig durch Hinzufügen eines zweiten zielspezifischen Primers, gefolgt von Polymerisation. Die doppelsträngigen DNA-Moleküle werden dann durch Polymerase, wie beispielsweise T7 oder SP6, mehrfach transkribiert. In einer isothermen cyclischen Reaktion werden die RNAs reverse in DNA transkribiert und dann erneut mit einer Polymerase wie beispielsweise T7 oder SP6 transkribiert. Die resultierenden Produkte, gestutzt oder vollständig, deuten auf zielspezifische Sequenzen hin.
Die Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung Nr. 329,822, die hier als Bezug in ihrer Gesamtheit eingebunden wird, offenbart ein Nukleinsäureamplifikationsverfahren, das das cyclische Synthetisieren einsträngiger RNA („ssRNA"), ssDNA und doppelsträngiger DNA (dsDNA) beinhaltet, und das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die ssRNA ist ein erstes Templat für ein erstes Primer-Oligonukleotid, das durch Reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird dann von dem daraus hervorgehenden DNA: RNA Duplex durch Ribonuklease H (RNase N, eine RNase, die für RNA in einer Duplex mit entweder DNA oder RNA spezifisch ist) entfernt. Die daraus hervorgehende ssDNA ist ein zweites Templat für einen zweiten Primer, der ebenfalls die Sequenzen eines RNA Polymerase-Promoters beinhaltet (veranschaulicht durch T7 RNA Polymerase) 5' zu seiner Homologie an sein Templat. Dieser Primer wird dann durch DNA-Polymerase ausgedehnt (veranschaulicht durch das große „Klenow"-Fragment der E. coli DNA Polymerase I), woraus es als ein doppelsträngiges DNA („dsDNA")-Molekül hervorgeht, das eine Sequenz hat, die mit der der ursprünglichen RNA zwischen den Primern identisch ist und das zusätzlich an einem Ende eine Promoter-Sequenz hat. Diese Promoter-Sequenz kann von der geeigneten RNA-Polymerase verwendet werden, um viele RNA-Kopien der DNA zu erstellen. Diese Kopien können dann wieder in den Kreislauf eintreten, was zu einer sehr schnellen Amplifikation führt. Mit der geeigneten Wahl der Enzyme kann diese Amplifikation isotherm durchgeführt werden, ohne dass in jedem Zyklus Enzyme hinzugegeben werden. Aufgrund der zyklischen Natur dieses Prozesses, kann als Ausgangssequenz entweder die Form der DNA oder der RNA gewählt werden.
Die Veröffentlichung der internationalen PCT Patentanmeldung WO 89/06700 offenbart ein Nukleinsäuresequenz-Amplifikationsschema, das auf der Hybridisierung einer Promoter-/Primer-Sequenz mit einer einsträngigen Ziel-DNA („ssDNA") basiert, gefolgt von Transkription vieler RNA-Kopien der Sequenz. Dieses Schema ist nicht zyklisch, das heißt, neue Template werden nicht aus den daraus hervorgehenden RNA-Transkripten erstellt. Andere Applikationsverfahren beinhalten „RACE" (Frohman, 1990) und „einseitige PCR" (Ohara, 1989), die jenen mit Erfahrung auf dem Gebiet der Technik bekannt sind.
Zusammensetzungen und Kits zum Nachweisen von Krebs
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Kits zur Verwendung für eine der voranstehend beschriebenen Diagnosemethoden bereit. Solche Kits umfassen typischerweise zwei oder mehr Elemente, die erforderlich sind, um einen diagnostischen Test durchzuführen. Elemente können Verbindungen, Reagenzien, Gefäße und/oder Ausrüstung sein. Zum Beispiel kann ein Gefäß in einem Kit einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon enthalten, das sich spezifisch an ein Brusttumorprotein bindet. Solche Antikörper oder Fragmente können wie vorstehend beschrieben einem Trägermaterial beigefügt bereitgestellt werden. Ein oder mehrere zusätzliche Behälter können Elemente enthalten, wie beispielsweise Reagenzien oder Puffer, die beim Test verwendet werden. Solche Kits können darüber hinaus oder alternativ ein Nachweisreagens enthalten wie voranstehend beschrieben, das eine Reportergruppe enthält, die zum direkten oder indirekten Nachweisen der Antikörperbindung geeignet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus Kits bereit, die für die Durchführung von Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Beispielhafte Kits umfassen, Oligonukleotidprimer-Paare, wobei jedes von ihnen spezifisch mit einem distinkten Polynukleotid hybridisiert. In einigen Ausführungsformen können Kits in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung auch eine Nukleinsäurepolymerase und geeignete Puffer umfassen. Beispielhafte Oligonukleotidprimer, die für die Kits der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden hier durch SEQ ID NOs: 33-71 offenbart. Beispielhafte Polynukleotide, die für Kits der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden in SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 und Lipophilin B offenbart.
Alternativ kann ein Kit so gestaltet werden, dass es den Gehalt an mRNA nachweist, das ein Brusttumorprotein in einer biologischen Probe verschlüsselt. Solche Kits umfassen im Allgemeinen wenigstens eine/n Oligonukleotidsonde oder -primer, wie voranstehend beschrieben, die/der mit einem Polynukleotid hybridisiert, das ein Brusttumorprotein verschlüsselt. Solch ein Oligonukleotid kann zum Beispiel in einem PCR- oder einem Hybridisierungstest verwendet werden. Zusätzliche Elemente, die in solchen Kits anwesend sein können, beinhalten ein zweites Oligonukleotid und/oder ein diagnostisches Reagens oder einen Behälter, um den Nachweis eines Polynukleotids, das ein Brusttumorprotein verschlüsselt, zu erleichtern.
In anderen verbundenen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung ferner Zusammensetzungen bereit, die nützlich sind für die hier offenbarten Verfahren. Beispielhafte Zusammensetzungen umfassen zwei oder mehr Oligonukleotidprimerpaare, wobei jedes von ihnen spezifisch mit einem distinkten Polynukleotid hybridisiert. Beispielhafte Oligonukleotidprimer, die für Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden hier durch SEQ ID NOs: 33-71 offenbart. Beispielhafte Polynukleotide, die für die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden in SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 und Lipophilin B offenbart.
Die folgenden Beispiele besitzen einen illustrativen und keinen einschränkenden Charakter.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
DIFFERENTIAL DISPLAY
Dieses Beispiel offenbart die Verwendung von Differential Display zum Anreichern von Polynukleotiden, die in Bruttumorgeweben überexprimiert sind.
Differential Display wurde wie in der Literatur beschrieben (siehe zum Beispiel Liang, P. et al., Science 257: 967-971 (1993)) mit folgenden Änderungen durchgeführt: (a) PCR-Amplifikationsprodukte wurden auf silbernem Kolloid visualisiert, (b) genetisch passende Gewebepaare wurden verwendet, um polymorphe Variationen zu entfernen, (c) zwei verschiedene cDNA-Lösungen wurden als Templat verwendet, um Dilutionseffekte zu entfernen (siehe, Mou, E. et al., Ciochem Biophy Res Commun. 199: 564-569 (1994)).
BEISPIEL 2
VORBEREITUNG EINER CDNA-SUBTRAKTIONSBIBLIOTHEK
Dieses Beispiel offenbart die Vorbereitung einer Brusttumor cDNA-Subtraktionsbibliothek, die in brusttumorspezifischen Polynukleotiden angereichert ist.
CDNA Bibliothek-Subtraktion wurde wie beschrieben mit einigen Änderungen durchgeführt. Siehe, Nara, T. et al, Blood 84: 189-199 (1994). Die Brusttumorbibliothek (Tracer), die aus einem Pool von drei Brusttumoren erstellt wurde, wurde mit normalen Brustbibliotheken (Driver) subtrahiert, um brusttumorspezifische Gene zu identifizieren. Neuere Subtraktionen verwendeten 6 bis 10 normale Gewebe als Driver, um gemeinsame Gene wirksamer herauszusubtrahieren, mit einer Betonung auf wesentlichen Geweben gemeinsam mit einem „immunologischen" Gewebe (zum Beispiel, Milz, Lymphknoten oder PBMC), um bei der Entfernung der cDNAs, die aus der Lymphozyteninfiltration in Tumoren abgeleitet ist, zu unterstützen. Die brusttumorspezifische subtrahierte cDNA Bibliothek wurde wie folgt erzeugt. Die Driver cDNA Bibliothek wurde mit EcoRI, NotI und SfuI (SfuI härtet den Vektor) digeriert und mit einem DNA-Polymerase Klenow-Fragment gefüllt. Nach der Phenol-Chloroformextraktion und der Ethanol- Präzipitation wurde die DNA mit der Fotosonde Biotin gekennzeichnet und in H₂O aufgelöst. Die Tracer cDNA-Bibliothek wurde mit BamHI und Xhol digeriert, Phenol-Chloroform extrahiert, durch Chrom spin-400 Säulen geleitet, Ethanol präzipitiert und mit der Driver DNA zur Hybridisierung bei 68 °C für 20 Stunden [lange Hybridisierung (LH)] gemischt. Die Reaktionsmischung wurde dann einer Behandlung mit Streptavidin unterzogen, gefolgt von einer Phenol-Chloroform-Extraktion, insgesamt vier Mal. Die subtrahierte DNA wurde präzipitiert und erneut einer Hybridisierung bei 68 °C für 2 Stunden [kurze Hybridisierung (SH)] mit der Driver DNA unterzogen. Nach Entfernen der biotinilierten doppelsträngigen DNA wurde die subtrahierte cDNA an einer BamHI/Xhol-Stelle von Chloramphenicol resistenten pBCSK⁺ ligiert und durch Elektroporation in ElectroMax E. coli DH10B Zellen umgewandelt, um eine subtrahierte cDNA-Bibliothek zu erzeugen. Zum Klonen weniger reichlicher brusttumorspezifischer Gene wurde die cDNA-Bibliothekssubtraktion durch Subtrahieren der Tracer cDNA-Bibliothek mit der cDNA-Bibliothek plus reichlicher cDNAs aus primären Subtraktionen wiederholt. Das führte zu dem Flüssigkeitsentzug dieser reichlichen Sequenzen und zu dem Erzeugen von Subtraktionsbibliotheken, die weniger reichliche Sequenzen enthalten.
Um die subtrahierte cDNA-Bibliothek zu analysieren, wurde Plasmid DNA aus 100 bis 200 unabhängigen Klonen vorbereitet, die zufällig aus der subtrahierten Bibliothek genommen wurden und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert sind. Die bestimmte cDNA und erwarteten Aminosäuresequenzen für die isolierten cDNAs wurden mit den bekannten Sequenzen verglichen, wobei die neueste Genbank und humane EST Datenbanken verwendet wurden.
BEISPIEL 3
PCR-SUBTRAKTION
Dieses Beispiel offenbart die PCR-Subtraktion zum Anreichern brusttumorspezifischer Polynukleotide.
Die PCR-Subtraktion wurde im Wesentlichen wie in der Literatur beschrieben durchgeführt. Siehe Diatchenko, L. et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 6025-6030 (1996) und Yang, G. P. et al., Nucleic acids Res. 27: 1517-23 (1999). Kurz gesagt, diese Art der Subtraktion funktioniert durch Ligieren von zwei verschiede nen Adaptern mit unterschiedlichen Aliquoten einer restriktionsenzymdigestierten Tester (Brusttumor) cDNA-Probe, gefolgt von dem Mischen des Testers separat mit einem überschüssigen Driver (ohne Adapter). Diese erste Hybridisierung führt aufgrund der zweitrangigen Kinetik der Hybridisierung zu einer Normalisierung von einsträngiger testerspezifischer cDNA. Diese separaten Hybridisierungsreaktionen wurden dann ohne Denaturierung gemischt, und eine zweite Hybridisierung wurde durchgeführt, die Ziel-Moleküle herstellte; doppelsträngige cDNA-Fragmente, die beide verschiedene Adapter enthalten. Es wurden zwei Runden PCR durchgeführt, was zu der exponentiellen Amplifikation der Moleküle der Zielpopulation führt (normalisierte testerspezifische cDNAs), während andere Fragmente entweder unamplifiziert oder nur auf lineare Weise amplifiziert wurden. Die durchgeführten Subtraktionen beinhalteten einen Pool Brusttumore, der mit einem Pool normaler Brust subtrahiert wurde und einen Pool Brusttumore, der mit einem Pool normalen Gewebes einschließlich PBMC, Gehirn, Bauchspeicheldrüse, Leber, Dünndarm, Magen, Herz und Niere subtrahiert wurde.
Vor der cDNA-Synthese wurde RNA mit DNase I (Ambion) in Anwesenheit von RNasin (Promega Biotech, Madison, WI) behandelt, um eine DNA-Kontaminierung zu entfernen. Die cDNA zur Verwendung in Echtzeit-PCR Gewebereihen wurde mit 25 μl Oligo dT (Boehringer-Mannheim) Primer mit Superscript II Reverse Transkriptase (Gibco BRL, Bethesda, MD) durchgeführt.
BEISPIEL 4
NACHWEIS VON BRUSTKREBS MIT BRUSTSPEZIFISCHEN ANTIGENEN
Die Isolierung und Charakterisierung der brustspezifischen Antigene B511S und B533S wird in US Patentanmeldung 09/346,327 beschrieben, die am 2. Juli 1999 eingereicht wurde, und deren Offenbarung hiermit als Bezug in ihrer Gesamtheit eingebunden wird. Die bestimmte cDNA-Sequenz für B511S wird in SEQ ID NO: 30 bereitgestellt, wobei die entsprechende Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 31 bereitgestellt wird. Die bestimmte cDNA-Sequenz für B533S wird in SEQ ID NO: 32 bereitgestellt. Die Isolierung und Charakterisierung des brustspezifischen Antigens B726P wird in den US Patentanmeldungen 09/285,480, eingereicht am 2. April 1999, und 09/433,826, eingereicht am 3. November 1999, beschrieben.
Die bestimmten cDNA-Sequenzen für Spleißvarianten von B726P werden in SEQ ID NO: 13, 15, 17 und 19-24 bereitgestellt, wobei die entsprechenden Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 14, 16, 18 und 25-29 bereitgestellt werden.
Die Isolierung und Charakterisierung des brustspezifischen Antigens B305D Formen A und C wurde in US Patentanmeldung 09/429,755, eingereicht am 28. Oktober 1999, beschrieben. Die bestimmten cDNA-Sequenzen für B305D Isoformen A und C werden in SEQ ID NO: 1, 3 und 5-7 bereitgestellt, wobei die entsprechenden Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 2, 4 und 8-10 bereitgestellt werden.
Die Isolierung und Charakterisierung des brustspezifischen Antigens B311D wurde in US Patentanmeldung 09/289,198, eingereicht am 9. April 1999, beschrieben.
Die bestimmte cDNA-Sequenz für B311D wird in SEQ ID NO: 11 bereitgestellt, wobei die entsprechende Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 12 bereitgestellt wird.
Die cDNA-Sequenzen für Mammaglobin werden in den 4 und 5 bereitgestellt, wobei die cDNA-Sequenzen für GABAπ in 6 bereitgestellt beziehungsweise in SEQ ID NOs: 73-75 offenbart werden.
Die Isolierung und Charakterisierung des brustspezifischen Antigens Lipophilin B wurde in US Patentanmeldung 09/780,842, eingereicht am B. Februar 2001, beschrieben. Die bestimmte cDNA-Sequenz für Lipophilin B wird in SEQ ID NO: 76 bereitgestellt, wobei die entsprechende Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 77 bereitgestellt wird. Die Nukleotidsequenzen verschiedener Sequenzvarianten von Lipophilin B werden darüber hinaus in der 09/780,842 Anmeldung beschrieben.
BEISPIEL 5
MICROARRAY-ANALYSE
Dieses Beispiel offenbart die Verwendung von Microarray-Analysen zum Identifizieren von Polynukleotiden, die in Brusttumorgewebeproben wenigstens doppelt überexprimiert sind, verglichen mit normalen Brustgewebeproben.
Die mRNA-Expression der relevanten Polynukleotide wurde wie folgt durchgeführt. Die cDNA für verschiedene Gene wurde wie voranstehend beschrieben vorbereitet und auf einen Glas-Objektträger gegeben (Incyte, Palo Alto, CA). Die aufgetragene cDNA wurde dann mit einer 1:1-Mischung aus Cy3 oder Cy2 fluoreszierend gekennzeichneter Erststrang-cDNA hybridisiert, die aus einer polyA+RNA aus Brusttumoren, normaler Brust und normalen Geweben und anderen Tumoren wie bei Shalon, D. et al., Genome Res. 6: 639-45 (1996) beschrieben, erhalten wurde. Typischerweise wurde Cy3 (Sonde 1) an die cDNAs aus Brusttumoren und Cy5 (Sonde 2) an normalem Brustgewebe oder anderem normalem Gewebe befestigt. Beide Sonden konnten mit den immobilisierten genspezifischen cDNAs auf dem Chip konkurrieren, wurden gewaschen, dann auf die Fluoreszenzintensität der einzelnen Cy3 und Cy5-Fluoreszenzen gescannt, um das Ausmaß der Hybridisierung zu bestimmen. Die Daten wurden mit GEMTOOLS Software (Incyte, Palo Alto, CA) analysiert, was es ermöglichte, die Überexpressionsmuster der Brusttumore mit normalem Gewebe durch das Verhältnis von Cy3/Cy5 zu vergleichen. Die Fluoreszenzintensität wurde darüber hinaus in Bezug gebracht zu dem Expressionsgrad der einzelnen Gene.
DNA-Microarray-Analysen wurden primär als ein Screening Tool zum Bestimmen der Gewebe-/Tumorspezifizität der cDNAs verwendet, die aus dem Differential Display, der cDNA-Bibliothek und den PCR-Subtraktionen erhalten wurden, vor einer strikteren Analyse durch quantitative RT-PCR, Northern Blot und Immunohistochemie. Microarray-Analysen wurden auf zwei Microchips durchgeführt. Insgesamt wurden 3603 subtrahierte cDNAs und 197 Differential Display Templates bewertet, um 40 Kandidaten für weitere Analysen mit quantitativer PCR zu identifizieren. Aus diesen Kandidaten wurden auf Grundlage günstiger Gewebespezifizitätsprofile einige gewählt, einschließlich B305D, B311D, B726P, B511S und B533S, die die Überexpressionsprofile bei Brusttumoren und/oder normalem Brust- gegenüber normalem Gewebe angeben. Es war offensichtlich, dass die Expression dieser Gene einen hohen Grad an Spezifizität für Brusttumore und/oder Brustgewebe zeigte. Zusätzlich haben diese Gene in vielen Fällen komplementäre Expressionsprofile.
Die beiden bekannten brustspezifischen Gene, Mammaglobin und γ-Aminobuttersäure Typ A Rezeptor π Untereinheit (GABAπ) wurden ebenfalls einer Microarray-Analyse unterzogen. Die mRNA-Expression von Mammaglobin wurde bereits als hochreguliert bei der Proliferation von Brustgeweben, einschließlich Brusttumoren, beschrieben. Siehe (Watson, et al., Cancer Res., 56: 860-5 (1996); Watson et al., Cancer Res., 59: 3028-3031 (1999); Watson et al., Oncogene. 16: 817-24 (1998)).
Die GABAπ mRNA Gehalte waren bei Brusttumoren überexprimiert. Frühere Studien haben ihre Überexpression in Uterus und bis zu einem gewissen Grad in Prostata und Lunge gezeigt (Hedblom et al., J Biol. Chem. 272: 15346-15350 (1997)), aber keine frühere Studie hat auf erhöhte Gehalte bei Brusttumoren hingedeutet.
BEISPIEL 6
QUANTITATIVE ECHTZEIT-PCR-ANALYSE
Dieses Beispiel offenbart die Verwendung quantitativer Echtzeit-PCR zum Bestätigen der Identifikation von Polynukleotiden mittels Microarray, die in Brusttumorgewebeproben im Vergleich zu normalen Brustgewebeproben wenigstens doppelt überexprimiert sind.
Die Tumor- und/oder Gewebespezifizität der Polynukleotide, die mittels Microarray-Analyse, die hier in Beispiel 5 offenbart wird, identifiziert wurden, wurden durch die quantitativen PCR-Analysen bestätigt. Brustmetastasen, Brusttumore, gutartige Brusterkrankungen und normales Brustgewebe wurde gemeinsam mit anderem normalen Gewebe und Tumoren in einer quantitativen (Echtzeit)-PCR untersucht. Diese wurde entweder auf dem ABI 7700 Prisma oder einem GeneAmp^® 5700 Sequenznachweissystem (PE Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Das 7700 System verwendet einen Vorwärts- und einen Rückwärts-Primer in Kombination mit einer spezifischen Sonde, die so gestaltet ist, dass sie die Sequenz zwischen dem Vorwärts- und dem Rückwärts-Primer härtet. Diese Sonde wurde an dem 5' Ende mit einem fluoreszierenden Reporterfarbstoff und mit einem Quencherfarbstoff an dem anderen 3' Ende konjugiert (Taqman^TM). Während der PCR härtete die Taq DNA-Polymerase mit ihrer 5'-3' Nukleaseaktivität die Sonde, die zu fluoreszieren begann, wodurch die Reaktion durch einen Anstieg der Fluoreszenz (Echtzeit) überwacht werden konnte. Holland et al. Proc Natl Acad Sci USA 88: 7276-7280 (1991). Das 5700 System verwendet SYBR^® Green, einen fluoreszierenden Farbstoff, der nur doppelsträngige DNA bindet (Schneeberger et al., PCR Methods Appl. 4: 234-8 (1995)), und einige Vorwärts- und Rückwärts-Primer wie das 7700 Instrument. Eine Sonde wurde nicht benötigt. Passende Primer und fluoreszierende Sonden wurden für jedes Gen in Übereinstimmung mit dem Primer Express Programm (PE Biosystems, Foster City, CA) gestaltet.
Tabelle 1
Die Konzentrationen, die in der quantitativen PCR für die Vorwärts-Primer für Mammaglobin, GABAπ, B305D C-Form, B311D, B511S, B533S und B726P verwendet wurden, waren 900, 900, 300, 900, 900, 300 beziehungsweise 300 nM. Für die Rückwärts-Primer waren sie 300, 900, 900, 900, 300, 900 beziehungsweise 900 nM. So hergestellte Primer und Sonden wurden im universalen thermischen Cycling Program der Echtzeit-PCR verwendet. Sie wurden mit dem Checkerboard-Ansatz titriert, um die optimalen Konzentrationen zu bestimmen. Ein Pool von cDNA aus Ziel-Tumoren wurde für diesen Optimierungsprozess verwendet. Die Reaktion wurde in 25 μl Volumen durchgeführt. Die finale Son denkonzentration betrug in allen Fällen 160 nM. dATP, dCTP und dGTP betrugen 0,2 mM und dUTP 0,4 mM. Amplitaq gold und Amperase UNG (PE Biosystems, Foster City, CA) wurden bei 0,625 Einheiten und 0,25 Einheiten pro Reaktion verwendet. MgCl₂ lag bei einer finalen Konzentration von 5 mM. Restmengen von Glycerol, Gelatine und Tween 20 (Sigma Chem Co, St. Louis, MO) wurden zur Stabilisierung der Reaktion hinzugefügt. Jede Reaktion enthielt 2 μl aufgelöstes Templat. Die wie voranstehend beschrieben vorbereitete cDNA aus RT Reaktionen wurde 1:10 für das relevante Gen und 1:100 für Q-Actin aufgelöst. Primer und Sonden für Q-Actin (PE Biosystems, Foster City, CA) wurden in ähnlicher Weise verwendet, um die Anwesenheit von Q-Actin in den Proben zu bestimmen. In den Fällen des SYBR^® Green Tests beinhaltete die Reaktionsmischung (25 μl) 2,5 μl SYBR Green Puffer, 2 μl cDNA Templat und jeweils 2,5 μl Vorwärts- und Rückwärts-Primer für das relevante Gen. Diese Mischung beinhaltete darüber hinaus 3 mM MgCl₂, 0,25 Einheiten AmpErase UNG, 0,625 Einheiten Amplitaq gold, 0,08 % Glycerol, 0,05 % Gelatine, 0,0001 % Tween 20 und 1 mM dNTP Mischung. In beiden Formaten wurden 40 Zyklen Amplifikation durchgeführt.
Zum Bestimmen der Menge spezifischer cDNA (und somit ursprüngliche mRNA) in der Probe wurde eine Standardkurve für jeden Lauf erzeugt, wobei das Plasmid, das das relevante Gen enthält, verwendet wurde. Standardkurven wurden unter Verwendung der in der Echtzeit-PCR bestimmten Ct-Werte erzeugt, die sich auf die ursprüngliche cDNA-Konzentration, die in dem Test verwendet wurde, bezog. Zu diesem Zweck wurden Standardauflösungen zwischen 20-2 × 10⁶ Kopien des relevanten Gens verwendet. Zusätzlich wurde eine Standardkurve zwischen 200 fg bis 2000 pg für das Housekeeping-Gen Q-Actin erzeugt, um eine Normalisierung auf eine konstante Menge β-Actin zu ermöglichen. Dies ermöglichte die Bewertung der Überexpressionsniveaus, die bei jedem Gen beobachtet wurden.
Die Gene B311D, B533S und B726P wurden wie voranstehend beschrieben in quantitativer PCR an zwei verschiedenen Reihen bewertet, bestehend aus (a) Brusttumor, normaler Brust und normalem Gewebe; und (b) Brusttumormetastasen (hauptsächlich Lymphknoten), wobei die in Tabelle 1 gezeigten Primer und Sonden verwendet wurden. Die Daten für Reihe (a) werden für alle drei Gene in 1 dargestellt. Die drei Gene zeigten identische Expressionsprofile des Brustgewebes. Dennoch war der relative Grad der Genexpression in jedem Fall sehr unterschiedlich. B311D war im Allgemeinen geringer exprimiert als B533S und beide geringer als B726P, aber alle drei waren auf Brustgewebe beschränkt. Die quantitative PCR bestätigte demzufolge, dass es zwischen normalem Brustgewebe und Brusttumoren bei allen drei Genen eine unterschiedliche Expression gab, und dass ungefähr 50 % der Brusttumore diese Gene überexprimierten. Beim Testen an einer Reihe von Fernmetastasen, die aus den Brustkrebsen abgeleitet wurden, reagierten alle drei Gene mit 14/21 Metastasen und wiesen ähnliche Profile auf. Alle drei Gene zeigten darüber hinaus steigende Expressionsgrade als eine Funktion des pathologischen Stadiums des Tumors, wie in 2 für B533S dargestellt.
Mammaglobin ist ein Homolog eines Uteroglobins von Kaninchen und des Steroid bindenden Rattenproteins Untereinheit C3 und ist ein Protein mit geringem Molekulargewicht, das hochgradig glykosiliert ist. Im Gegensatz zu seinen Homologen wurde Mammaglobin als brustspezifisch beschrieben und die Überexpression wurde bei Brusttumorbiopsien (23 %) und primären und metastatischen Brusttumoren (~75 %) mit Berichten über den Nachweis einer Mammaglobin mRNA-Expression in 91 % der Lymphknoten von metastatischen Brustkrebspatienten beschrieben. Dennoch zeigten striktere Analysen der Mammaglobin Genexpression durch Microarray und quantitative PCR wie voranstehend beschrieben (Reihen (a) und (b) und eine Reihe anderer Tumore und normalen Gewebes und zusätzlicher Brusttumore), eine Expression aus signifikantem Niveau in der Haut und der Speicheldrüse mit deutlich geringeren Graden in Speiseröhre und Luftröhre, wie in Tabelle 2 unten dargestellt.
Tabelle 2
Das brustspezifische Gen B511S, reagierte, obgleich es ein anderes Reaktivitätsprofil bei Brusttumoren und normalem Brustgewebe auf Mammaglobin hat, mit der gleichen Teilmenge normalen Gewebes wie Mammaglobin. B511S der PSORT-Analyse weist einen ORF von 90 aa auf und ist ein abgesondertes Protein, wie es bei Mammaglobin der Fall ist. B511S hat keinen Nachweis einer transmembranösen Domäne, kann aber eine spaltbare Signalsequenz verbergen. Mammaglobin wies 14/24 fernmetastatische Brusttumore, 31/42 Brusttumore nach und wies eine zehnfache Überexpression bei Tumoren und Metastasen auf, verglichen mit normalem Brustgewebe. Es gab wenigstens eine 300 fache Überexpression in normalem Brustgewebe gegenüber anderen getesteten negativen normalen Geweben und Tumoren, die im Wesentlichen keine Mammaglobin-Expression aufwiesen. B511S wies 32/42 Brusttumore und 14/24 Fernmetastasen nach, wobei eine Kombination aus B511S mit Mammaglobin voraussichtlich 38/42 Brusttumore und 17/24 metastatische Läsionen nachweisen würde (Tabelle 2 oben). Der quantitative Expressionsgehalt von B511S und Mammaglobin lag in ähnlichen Bereichen, in Übereinstimmung mit den Microarray-Profilen, die für diese beiden Gene beobachtet wurden. Andere Gene, die einen Mammaglobinzusatz aufwiesen, werden in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
B305D erwies sich als hochgradig überexprimiert in Brusttumoren, Prostatatumoren, normalem Prostatagewebe und Hoden verglichen mit normalen Geweben, einschließlich normalem Brustgewebe. Unterschiedliche Spleißvarianten von B305D wurden identifiziert, wobei Form A und C die am stärksten reichlichen waren, jedoch haben alle getesteten ähnliche Gewebeprofile in der quantitativen PCR. Die A und C-Formen beinhalten ORFs von 320 beziehungsweise 385 aa. B305D wird von PSORT vorhergesagt als ein Typ II Membranprotein, das eine Reihe von Ankyrin-Repeats beinhaltet. Ein bekanntes Gen, das sich als mit B305D in Brusttumoren komplementär erwies, war GABAπ. Dieses Gen gehört zur GABA_A-Rezeptoren-Familie und verschlüsselt ein Protein, das eine Aminosäurenhomologie von 30 % bis 40 % mit anderen Familienmitgliedern hat und erwies sich in der Northern-Blot-Analyse als mit geringem Gehalt überexprimiert in Lunge, Thymus und Prostata und als hochgradig überexprimiert im Uterus. Seine Expression im Brustgewebe wurde zuvor nicht beschrieben. Das steht im Gegensatz zu anderen GABA_A-Rezeptoren, die eine bemerkenswerte Expression in neuronalem Gewebe aufweisen. Das Gewebe-Expressionsprofiling dieses Gens zeigte, das es in Brusttumoren in einer umgekehrten Beziehung zu dem B305D-Gen überexprimiert war (Tabelle 3). GABAπ wies 15/25 Tumore und 6/21 Metastasen nach, einschließlich 4 Tumoren und 5 Metastasen, die das Mammaglobin ausgelassen hatte. Im Gegensatz dazu wies B305D 13/25 Brusttumore und 8/21 Metastasen nach, ebenfalls einschließlich 3 Tumoren und 2 Metastasen, die das Mammaglobin ausgelassen hatte. Eine Kombination nur aus B305D und GABAπ würde voraussichtlich 22/25 Brusttumore und 14/21 Metastasen nachweisen. Die Kombination aus B305D und GABAπ mit Mammaglobin beim Nachweis von Brustmetastasen wird in Tabelle 3 oben und in den 3A und 3B dargestellt. Diese Kombination wies 20/21 Brustmetastasen und 25/25 Brusttumoren nach, die in derselben Reihe für alle drei Gene bewertet wurden. Die eine Brustmetastase, die für diese drei Gene negativ war, war stark positiv für B726P (3A und 3B).
Um die Anwesenheit zirkulierender Tumorzellen zu bewerten, wurde ein Immunocapture (Zelleinfang)-Verfahren angewendet, um erst vor der RT-PCR-Analyse auf Epithelzellen anzureichern. Zu diesem Zweck wurden immunomagnetische Polystyrenkugeln verwendet, die mit spezifischen monoklonalen Antikörpern an zwei Glykoproteinen auf der Oberfläche der Epithelzellen beschichtet sind. Eine solche Anreicherungsprozedur steigerte die Nachweissensibilität (100 fach), verglichen mit der direkten Isolierung von Poly A⁺RNA wie in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4
Mammaglobinpositive Zellen (MB415) wurden mit verschiedenen Konzentrationen in Vollblut versetzt und dann entweder mittels Epithelzellanreicherung oder direkter Isolierung von Blut extrahiert. Bei Verwendung der Anreicherungsprozeduren war Mammaglobin mRNA zu einem wesentlich geringeren Grad nachweisbar als bei der direkten Isolierung. Vollblutproben von Patienten mit metastatischem Brustkrebs wurden anschließend mit den immunomagnetischen Kugeln behandelt. Poly A⁺ RNA wurde dann isoliert, cDNA vorbereitet und in einer quantitativen PCR mit zwei genspezifischen Primern (Tabelle 1) und einer fluoreszierenden Sonde (Taqman^TM) durchlaufen. Wie bei Brustkrebsgeweben beobachtet, trat eine Komplementierung beim Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen, die aus den Brustkrebsen abgeleitet waren, auf. Wieder wies Mammaglobin PCR zirkulierende Tumorzellen zu einem hohen Prozentsatz der Blutproben von metastatischen Brustkrebspatienten (20/32) auf, obgleich auf geringem Niveau, verglichen mit den normalen Blutproben (Tabelle 5), jedoch steigerten einige der anderen bis zum heutigen Tage getesteten Gene diese Quote weiter. Dies schließt B726P, B305D, B311D, B533S und GABAπ ein. Das Nachweisniveau von Mammaglobin in Blutproben von metastatischen Brustkrebspatienten ist höher als zuvor beschrieben (62 % vs. 49 %), obwohl kleinere Blutvolumina getestet wurden, möglicherweise aufgrund der Verwendung epithelmarkerspzifischer Anreicherung in unserer Studie. Eine Kombination aller getesteten Gene gibt 27/32 Proben als positiv für ein oder mehrere dieser Gene an.
Tabelle 5
In weiteren Studien wurden mammaglobin-, GABAπ-, B305D (C-Form)- und B726P-spezifische Primer und spezifische Taqman-Sonden in unterschiedlichen Kombinationen verwendet, um ihr kombiniertes mRNA-Expressionsprofil in Brustmetastasen (B. Met)- und Brusttumor (B. Tumore)-Proben unter Verwendung von Echtzeit-PCR zu analysieren. Die Vorwärts- und Rückwärts-Primer und -Sonden, die für Mammaglobin, B305D (C-Form) und B726P verwendet wurden, werden in Tabelle 1 dargestellt. Die Vorwärts-Primer und -Sonden, die für GABAπ verwendet wurden, werden in Tabelle 1 dargestellt, wobei die Rückwärts-Primer wie folgt sind: TTCAAATATAAGTGAAGAAAAAATTAGTAGATCAA (SEQ ID NO: 51). Wie unten in Tabelle 6 dargestellt, wies eine Kombination aus Mammaglobin, GABAπ, B305D (C-Form) und B726P 22/22 Brusttumorproben nach, mit einem Anstieg der Expression in 5 Proben (angegeben ++),
Tabelle 6
Der Anstieg der Botschaftersignale durch Hinzufügen spezifischer Primer wurde ferner in einem Plattenexperiment gezeigt, wobei die vier Tumorproben B. Met 316A, B. Met 317A, B. Tumor 81 D und B. Tumor 209A verwendet wurden.
Die Expression einer Kombination aus Mammaglobin, GABAπ, B305D (C-Form) und B726P in einer Reihe von Brusttumor- und normalen Gewebeproben wurde ebenfalls nachgewiesen, wobei Echtzeit-PCR mit einem SYBR Green Nachweissystem verwendet wurde, anstelle des Taqman-Sonden-Ansatzes. Die Ergebnisse, die mit diesem System erhalten wurden, werden in 7 dargestellt.
BEISPIEL 7
QUANTITATIVE PCR IN PERIPHEREM BLUT VON BRUSTKREBSPATIENTEN
Die bekannten Gene, die in dieser Studie bewertet wurden, waren Mammaglobin und γ-Aminobuttersäure Typ A Rezeptor π Untereinheit (GABAπ). Um neue Gene zu identifizieren, die in Brustkrebs überexprimiert sind, haben wir eine verbesserte Version der Differential Displays RT-PCR (DDPCR)-Technik (Liang et al., Science 257: 967-971 (1993); Mou et al., Biochem Biophy Res Commun. 199: 564-569 (1994)), cDNA-Bibliotheksextraktionsverfahren (Hara et al., Blood 84: 189-199 (1994)) und PCR-Subtraktion (Diatchenko et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93: 6025-6030 (1996); Yang et al., Nucleic Acids Res. 27: 1517-23 (1999)) verwendet.
Differential Display führte zu der Wiedergewinnung von zwei DNA-Fragmenten, die als B305D und B311D bezeichnet werden (Houghton et al., Cancer Res. 40: Abstract #217, 32-33 (1999)). B511S und B533S sind zwei cDNA-Fragmente, die mit dem cDNA-Bibliothektssubtraktionsansatz (Manuskript in Arbeit) isoliert werden, wobei das B726P cDNA-Fragment aus PCR-Subtraktion abgeleitet wurde (Jiang et al., Proceedings of the Amer Assoc Cancer Res. 40: Abstract #216, 32 (1999); Xu et al., Proceedings of the Amer Assoc Cancer Res. 40: Abstract #2115, 319 (1999); und Molesh et al., Proceedings of Amer Assoc Cancer Res. 41: Abstract #4330, 681 (2000)).
Drei der neuen Gene, B311D, B533S und B726P wiesen in einer quantitativen PCR-Analyse identische Brustgewebs-Expressionsprofile auf. Diese Gene wurden in der quantitativen PCR an zwei verschiedenen Reihen bewertet, bestehend aus (a) Brusttumor, normaler Brust und normalem Gewebe und (b) einer Reihe von Brusttumormetastasen (hauptsächlich Lymphknoten). Die verwendeten Primer und Proben werden in Tabelle 1 dargestellt. Die Daten für Reihe (a) werden für alle drei Gene in 2 dargestellt. Insgesamt sind die Expressionsprofile vergleichbar und in der gleichen Reihenfolge, jedoch unterscheiden sich die Expressionsgrade deutlich voneinander. B311D wurde im Allgemeinen mit geringeren Graden exprimiert als B533S und beide geringer als B726P, aber alle drei waren auf Brustgewebe beschränkt. Alle drei Sequenzen wurden für eine Suche in der Genbank Datenbank verwendet. Beide B311D und B533S-Sequenzen enthalten verschiedene repetitive Sequenzen, und ein ORF wurde für keine von beiden identifiziert. B726P ist ein neues Gen, wobei mRNA Spleißen zu verschiedenen unterschiedlichen vermeintlichen ORFs führt.
Die quantitative PCR bestätigte, dass es zwischen normalem Brustgewebe und Brusttumoren eine unterschiedliche mRNA-Expression gibt, wobei ungefähr 50 % der Brusttumore diese Gene überexprimierte. Beim Testen einer Reihe von Fernmetastasen, die aus Brustkrebsen abgeleitet waren, reagierten alle drei Gene mit 14/21 Metastasen und wiesen ähnliche Profile auf (Daten nicht angegeben). Interessanterweise identifizierten alle drei Gene beim Test an einer Prostatakrebsreihe 3/24 Prostatatumoren, aber mit deutlich geringeren Expressionsniveaus als bei der Brust. Diese Gruppe von Genen wies steigende Expressionsniveaus als eine Funktion des pathologischen Stadiums des Tumors wie für B533S dargestellt, auf.
Eine striktere Analyse des Mammaglobin-Gens mit Microarray und quantitativer PCR ergab eine Expression eines signifikanten Niveaus an Haut und Speicheldrüse und deutlich geringere Niveaus in Speiseröhre und Luftröhre. B511S hatte ein leicht anderes Reaktivitätsprofil auf Brusttumore und normales Brustgewebe, verglichen mit Mammaglobin, reagierte aber mit einer ähnlichen Teilmenge nor malen Gewebes als Mammaglobin. Mammaglobin wies 14/24 fernmetastatischen Brusttumoren, 31/42 Brusttumoren auf und zeigte eine zehnfache Überexpression in Tumoren und Metastasen gegenüber normalem Brustgewebe. Es gab wenigstens eine dreihundertfache Überexpression von Mammaglobin in normalem Brustgewebe gegenüber anderen getesteten negativen normalen Geweben und Tumoren. B511S wies 33/42 Brusttumore und 14/24 Fernmetastasen nach. Eine Kombination aus B511S und Mammaglobin würde voraussichtlich 38/42 Brusttumore und 17/24 metastatische Läsionen nachweisen. Das quantitative Expressionsniveau von B511S und Mammaglobin lag ebenfalls in ähnlichen Bereichen in Übereinstimmung mit den Microarray-Profilen, die für diese beiden Gene beobachtet wurden.
Einige Gene komplementierten das Mammaglobin-Expressionsprofil, das heißt sie zeigten, dass sie in Tumorzellen exprimierten, wo Mammaglobin nicht exprimierte. B305D war hochgradig überexprimiert in Brusttumoren, Prostatatumoren, normalem Prostatagewebe und Hoden, verglichen mit normalen Geweben einschließlich normalen Brustgewebes. Unterschiedliche Spleißvarianten von B305D wurden identifiziert, wobei die Formen A und C die am reichlichsten waren. Alle getesteten Formen hatten ähnliche Gewebeprofile bei der quantitativen PCR. Die A und C-Formen enthalten ORFs von 320 beziehungsweise 385 aa. Ein bekanntes Gen, das sich in Brusttumoren als komplementär mit B305D erwies, war GABAπ. Dieses Gewebe-Expressionsprofil steht in Kontrast zu anderen GABA_A-Rezeptoren, die typischerweise eine bemerkenswerte Expression in neuronalen Geweben haben. Eine zusätzliche Beobachtung war, dass das Gewebe-Expressionsprofiling dieses Gens zeigte, dass es in Brusttumoren überexprimiert ist, und zwar in umgekehrter Beziehung zu dem B305D-Gen (Tabelle 3). GABAπ wies 15/25 Tumore und 6/21 Metastasen nach, einschließlich 4 Tumoren und 5 Metastasen, die das Mammaglobin ausgelassen hatte. Im Gegensatz dazu wies B305D 13/25 Tumore und 8/21 Metastasen nach, erneut einschließlich 3 Tumoren und 2 Metastasen, die Mammaglobin ausgelassen hatte. Eine Kombination nur aus B305D und GABAπ würde voraussichtlich 22/25 Brusttumore und 14/21 Metastasen nachweisen. Diese Kombination wies 20/21 Brustmetastasen sowie 25/25 Brusttumore nach, die in derselben Reihe für alle drei Gene bewertet wurden. Die eine Brustmetastase, die negativ für diese drei Gene war, war stark positiv für B726P.
Die Verwendung der Microarray-Analyse gefolgt von der quantitativen PCR stellte Methoden bereit, um die Expression von Brustkrebsgenen sowohl in Brustgeweben (Tumor und normal) als auch in normalen Geweben exakt zu bestimmen und ihr diagnostisches und therapeutisches Potenzial zu bewerten. Fünf neue Gene und zwei bekannte Gene wurden mit diesen Techniken bewertet. Drei dieser Gene B311D, B533S und B726P, wiesen eine konkordante mRNA-Expression auf, und die Daten stehen insgesamt im Einklang mit der koordinierten Expression dieser drei Orte auf dem Niveau der Transkriptionskontrolle. Alle drei Gene wiesen unterschiedliche Expressionen in Brusttumoren gegenüber normalem Brustgewebe auf, und der Grad der Überexprimierung schien in Bezug zu stehen mit dem pathologischen Stadium des Tumors. In den Fällen von Mammaglobin wurde die Expression in anderen Geweben außer dem Brustgewebe gefunden. Expression trat auf in Haut, Speicheldrüse und zu einem geringeren Grad in der Luftröhre.
Die Expression von GABAπ in Brusttumoren war darüber hinaus eine neue Beobachtung. Während die Expression verschiedener Gene, die bei Mammaglobin beobachtete ergänzte, erhöhten insbesondere zwei Gene, B305D und GABAπ, die diagnostische Sensibilität des Mammaglobinnachweises. Eine Kombination aus diesen drei Genen wies 45/46 (97,8 %) bewertete Brusttumore und Metastasen nach. Der Einschluss von B726P ermöglichte den Nachweis aller 25 Brusttumore und 21 Fernmetastasen.
BEISPIEL 8
ANREICHERUNG ZIRKULIERENDER BRUSTKREBSZELLEN DURCH IMMUNOCAPTURE
Dieses Beispiel offenbart die verstärkte Sensibilität, die durch die Verwendung der Immunocapture Zell-Einfang-Methoden zum Anreichern zirkulierender Brustkrebszellen erreicht wird.
Um die Anwesenheit von zirkulierenden Tumorzellen zu bewerten, wurde ein Immunocapture-Verfahren angewendet, um zunächst vor der RT-PCR-Analyse auf Epithelzellen anzureichern. Epithelzellen wurden aus Blutproben mit einem immunomagnetischen Kugelseparationsverfahren (Dynal A. S, Oslo, Norwegen) angereichert, wobei magnetische Kugeln mit monoklonalen Antikörpern auf der Oberfläche humaner Epithelzellen beschichtet wurden, die für Glycopolypeptid-Antigene spezifisch sind. (Beispielhafte geeignete Zelloberflächen-Antigene werden zum Beispiel beschrieben bei Momburg, F. et al., Cancer Res., 41: 2883-91 (1997); Naume, B. et al., Journal of Hemotherapy, 6: 103-113 (1997); Naume B. et al., Int J Cancer. 78: 553-60 (1998); Martin, V. M. et al., Exp Hematol., 26: 252-64 (1998); Hildebrandt, M. et al., Exp Hematol. 25: 57-65 (1997); Eaton, M. C. Et al., Biotechniques 22: 100-5 (1997); Brandt, B. et al., Clin Exp Metastases 14: 399-408 (1996). Auf diese Weise isolierte Zellen wurden aufgelöst und die magnetischen Kugeln entfernt. Das Lysate wurde dann zur poly A⁺mRNA Isolierung verarbeitet, wobei magnetische, mit Oligo (dT)₂₅ beschichtete Kugeln (Dynabeads) verwendet wurden. Nach Waschen der Kugeln in dem Kit-Puffer wurden Kugel/polyA⁺RNA Proben schließlich in 10 mM Tris HCl pH8 gehängt und einer reversen Transkriptase unterzogen. Die RNA wurde dann einer Echtzeit-PCR unterzogen, die genspezifische Primer und -Sonden verwendete und unter Reaktionsbedingungen wie voranstehend ausgeführt. Der Q-Actin-Gehalt wurde darüber hinaus bestimmt und zur Normalisierung verwendet. Proben mit relevanten Genen Kopien/ng β-Actin größer als der Durchschnitt der normalen Proben + 3 Standardabweichungen, wurden als positiv betrachtet. Echtzeit-PCR an Blutproben wurde ausschließlich mit der Taqman^TM-Prozedur durchgeführt, aber auf 50 Zyklen ausgedehnt.
Die Mammaglobin mRNA, die Anreicherungsprozeduren verwendet, erwies sich als zu einem deutlich geringeren Grad nachweisbar als bei direkter Isolierung. Vollblutproben von Patienten mit metastatischem Brustkrebs wurden später mit den immunomagnetischen Kugeln behandelt, polyA⁺RNA wurde dann isoliert, cDNA erstellt und in quantitativer PCR durchlaufen, wobei zwei genspezifische Primer für Mammaglobin und eine fluoreszierende Sonde (Taqman^TM) verwendet wurden. Wie bei den Brustkrebsgeweben beobachtet, wurde auch beim Nachweis zirkulierender Tumorzellen, die aus Brustkrebsen abgeleitet wurden, eine Komplementation beobachtet. Erneut wies Mammaglobin PCR zirkulierende Tumorzellen zu einem hohen Prozentsatz in Blut nach, obgleich zu einem geringen Grad, bei metastatischem Brustkrebs (20/32), verglichen mit den normalen Blutproben. Einige der anderen bis zum heutigen Tage getesteten Gene könnten diese Nachweisquote weiter steigern. Dazu gehören B726P, B305D, B311D, B533S und GABAπ. Eine Kombination all dieser getesteten Gene ergibt, dass 27/32 Proben durch ein oder mehrere dieser Gene positiv waren.
BEISPIEL 9
MULTIPLEX-NACHWEIS VON BRUSTTUMOREN
Zusätzliche Multiplex Echtzeit-PCR-Tests wurden durchgeführt, um gleichzeitig die Expression von vier brustkrebsspezifischen Genen nachzuweisen: Lipophilin B, Gaba (B899P), B305D-C und B726P. Im Gegensatz zu Nachweisansätzen, die auf der Analyse der Expression einzelner brustspezifischer Gene basieren, konnte dieser Multiplex-Test alle getesteten Brusttumorproben nachweisen.
Dieser Multiplex-Test wurde gestaltet, um die Lipophilin B-Expression anstelle des Mammaglobins nachzuweisen. Aufgrund ihrer ähnlichen Expressionsprofile kann Lipophilin B Mammaglobin in diesem Multiplex-PCR-Test zum Nachweis von Brustkrebs ersetzen. Der Test wurde wie folgt durchgeführt: Lipophilin B-, B899P (Gaba)-, B305D- und B726P-spezifische Primer und spezifische Taqman-Sonden wurden verwendet, um ihr kombiniertes mRNA-Expressionsprofil in Brusttumoren zu analysieren. Die Primer und Sonden werden nachstehend dargestellt:

Lipophilin B: Vorwärts-Primer (SEQ ID NO.33): 5' TGCCCCTCCGGAAGCT. Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 34): 5' CGTTTCTGAAGGGACATCTGATC. Sonde (SEQ ID NO: 35) (FAM-5' – 3'-TAMRA): TTGCAGCCAAGTTAGGAGTGAAGAGATGCA.
GABA (B899P): Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 36): 5' AAGCCTCAGAGTCCTTCCAGTATG. Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 37): 5' TTCAAATATAAGTGAAGAAAAAATTAGTAGATCAA. Sonde (SEQ ID NO: 38) (FAM-5' – 3'-TAMRA): AATCCATTGTATCTTAGAACCGAGGGATTTGTTTAGA.
B305D (C-Form): Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 39): 5' AAAGCAGATGGTGGTTGAGGTT. Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 40): 5' CCTGAGACCAAATGGCTTCTTC. Sonde (SEQ ID NO: 41) (FAM-5' – 3'-TAMRA): ATTCCATGCCGGCT-GCTTCTTCTG.
B726P: Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 42): 5' TCTGGTTTTCTCATTCTTTATTCATTTATT. Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 43): 5' TGCCAAGGAGCGGATTATCT. Sonde (SEQ ID NO.44) (FAM-5' – 3'-TAMRA): CAACCACGT-GACAAACACTGGAATTACAGG.
Actin: Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 45): 5' ACTGGAACGGTGAAGGTGACA. Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 46): 5' CGGCCACATTGTGAACTTTG. Sonde (SEQ ID NO: 47): (FAM-5' – 3'-TAMRA): CAGTCGGTTGGAGCGAGCATC-CC

Die Testbedingungen waren:
Taqman-Protokoll (7700 Perkin Elmer):

In 25 μl finalem Volumen: 1 × Puffer A, 5 mM MgCl, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dATP, 0.4 mM dUTP, 0,2 mM dGTP, 0,01 U/μl AmpErase UNG, 0,025 u/μl Taq-Gold, 8 % (v/v) Glycerol, 0,05 % (v/v) Gelatine, 0,01 % (v/v) Tween20, 4 pmol jeder genspezifischen Taqman-Sonde (Lipophilin B + Gaba + B305D + B726P), 100 nM von B726P-F + B726P-R, 300 nM von Gaba-R und 50 nM von Lipophilin B-F + Lipophilin B-R + B305D-R + Gaba-R, Templat cDNA (aus 0,02 μg polyA + RNA).

Die Lipophilin B-Expression wurde in 14 von 27 Brusttumorproben nachgewiesen.
Dennoch wies der Multiplex-Test für Lipophilin B, B899P, B305D-C und B726P ein Expressionssignal in 27 von 27 Tumoren mit einem Nachweisniveau von mehr als 10 mRNA Kopien/1000 pg Actin in der Mehrzahl der Proben und darüber 100 mRNA Kopien/1000 pg in 5 von den 27 getesteten Proben (8).
BEISPIEL 10
OPTIMIERUNG DES MULTIPLEX-NACHWEISES
Der voranstehend beschriebene Multiplex-Echtzeit-PCR-Test wurde verwendet, um die Expression von Mammaglobin (oder Lipophilin B), Gaba (B899P), B305D-C und B726P gleichzeitig nachzuweisen. In Übereinstimmung mit diesem Beispiel wurden Testbedingungen und Primer-Sequenzen optimiert, um eine paralle le Amplifikation von vier PCR-Produkten mit unterschiedlichen Längen zu erreichen. Positive Proben dieses Tests können ferner durch Gelelektropherese charakterisiert, und die/das exprimierte/n relevanten Gen/e kann/können in Übereinstimmung mit der/den nachgewiesenen Amplicongröße/n bestimmt werden.
Mammaglobin-(oder Lipophilin B), Gaba (B899P)-, B305D- und B726P-spezifische Primer und spezifische Taqman-Sonden wurden verwendet, um ihre Expression gleichzeitig nachzuweisen. Die Primer und Sonden, die in diesem Beispiel verwendet werden, werden nachstehend dargestellt:

Mammaglobin: Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 48): 5' TGCCATAGATGAATTGAAGGAATG. Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 49): 5' TGTCATATATTAATTGCATAAACACCTCA. Sonde (SEQ ID NO: 50) (FAM-5' – 3'-TAMRA): TCTTAACCAAACGGATGAAACTCTGAGCAATG.
GABA (B899P): Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 36): 5' AAGCCTCA-GAGTCCTTCCAGTATG. Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 51): 5' ATCATTGAAAATTCAAATATAAGTGAAG. Sonde (SEQ ID NO: 38) (FAM-5' – 3'-TAMRA): AATCCATTGTATCTTAGAACCGAGGGATTTGTTTAGA.
B305D (C-Form): Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 39): 5' AAAGCAGATGGTGGTTGAGGTT. Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 40): 5' CCTGAGACCAAATGGCTTCTTC. Sonde (SEQ ID NO: 41) (FAM-5' – 3'-TAMRA): ATTCCATGCCGGCT-GCTTCTTCTG.
B726P: Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 52): 5' GTAGTTGTGCATTGAAATAATTATCATTAT. Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 43): 5' TGCCAAGGAGCGGATTATCT. Sonde (SEQ ID NO: 44) (FAM-5' – 3'-TAMRA): CAACCACGT-GACAAACACTGGAATTACAGG.

Die Primer-Stellen und Testbedingungen wurden optimiert, um eine parallele Amplifikation von vier PCR-Produkten mit verschiedenen Größen zu erreichen.
Die Testbedingungen waren:
Taqman-Profokoll (7700 Perkin Elmer)

In 25 μl finalem Volumen: 1 × Puffer A, 5 mM MgCl, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dATP, 0,4 mM dUTP, 0,2 mM dGTP, 0,01 U/μl AmpErase UNG, 0,0375 U/μl TaqGold, 8 % (v/v) Glycerol, 0,05 % (v/v) Gelatine, 0,01 % (v/v) Tween20, 4 pmol jeder genspezifischen Taqman-Sonde (Mammaglobin + Gaba + B305D + B726P), 300 nM von Gaba-R + Gaba-F, 100 nM von Mammaglobin-F + R; B726P-F + R und 50 nM von B305D-F + R Templat cDNA (aus 0,02 μg polyA + RNA).

PCR-Protokoll

50 ° für 2': x 1,95 ° für 10': X 1 und 95 ° für 15''/60 ° für 1'/68 ° für 1': x 50.

Da jeder Primer, der in einem Multiplex-Test eingestellt wird, zu einem Band einzigartiger Länge führt, können die Expressions-Signale der vier relevanten Gene individuell mittels Agarose-Gel-Analyse gemessen werden (siehe 9), oder das kombinierte Expressions-Signal für alle vier Gene kann in Echtzeit an einem ABI 7700 Prisma-Sequenz Nachweissystem (PE Biosystems, Foster City, CA) gemessen werden. Die Expression von Lipophilin B kann darüber hinaus anstelle von Mammaglobin nachgewiesen werden. Obgleich spezifische Primer hier beschreiben wurden, könnten andere Primer-Sequenzen, eine andere Primer- oder Sonden-Kennzeichnung und andere Nachweissysteme zum parallelen Nachweis eines Referenzgens mittels Echtzeit-PCR verwendet werden. Oder es könnte zum Beispiel ein SYBR Green Nachweissystem anstelle des Taqman-Sonden-Ansatzes verwendet werden.
BEISPIEL 11
GESTALTUNG UND VERWENDUNG DER GENOMISCHEN DNA-AUSSCHLIESSENDEN, INTRON-EXON GRENZE ÜBERSPANNENDEN PRIMER-PAARE FÜR BRUSTKREBS-MULTIPLEXTESTS
Der hier beschriebene Multiplex-Echtzeit-PCR-Test kann die Expression von Mammaglobin, Gaba (B899P), B305D-C und B726P gleichzeitig nachweisen. Die kombinierten Expressionsniveaus dieser Gene werden in Echtzeit an einem ABI 7700 Prisma-Sequenz Nachweissystem (PE Biosystems, Foster City, CA) gemessen. Individuell exprimierte Gene können darüber hinaus aufgrund verschiedener Amplicongrößen mittels Gelelektropherese identifiziert werden. Um diesen Test mit Proben, die als nicht DNase behandelten RNAs (zum Beispiel Lymphknoten cDNA) abgeleitet wurden, zu verwenden und eine DNase-Behandlung für kleine RNA-Proben (zum Beispiel von Blutproben, Tumor- und Lymphknotenaspiraten) zu vermeiden, wurden Intron überspannende Primer-Paare entwickelt, um die Amplifikation von genomischer DNA auszuschließen und demzufolge nicht spezifische und falsche positive Signale zu entfernen. Falsche positive Signale werden durch genomische DNA-Kontaminierung in cDNA-Proben hervorgerufen. Der hier beschriebene optimierte Multiplex-Test schließt die Amplifikation von genomischer DNA aus und ermöglicht einen spezifischen Nachweis einer Zielgen-Expression ohne die Notwendigkeit, zuvor eine DNase-Behandlung an den RNA-Proben durchzuführen. Darüber hinaus könnten das genomische Passende und der Ort der Intron-Exon-Grenze mit diesen Primer-Sets verifiziert werden.
Mammaglobin-, Gaba (B899P)-, B305D- und B726P-spezifische Primer und spezifische Taqman-Sonden wurden verwendet, um gleichzeitig ihre Expression nachzuweisen (7). Primer-Stellen wurden optimiert (Intron-Exon-Grenze überspannend), um ausschließlich cDNA nachzuweisen und genomische DNA von der Amplifikation auszuschließen. Die Identität des/r exprimierten Gens/e wurde durch Gelelektropherese bestimmt.
Tabelle 7
Primer-Stellen und Testbedingungen wurden optimiert, um eine parallele Amplifikation der vier PCR-Produkte zu erreichen. Die Test-Bedingungen waren wie folgt:
Taqman-Protokoll (7700 Perkin Elmer)

In 25 μl finalem Volumen: 1 × Puffer A, 5 mM MgCl, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dATP, 0,4 mM dUTP, 0,2 mM dGTP, 0,01 U/AmpErase UNG, 8 % (v/v) Glycerol, 0,05 % (v/v) Gelatine, 0,01 % (v/v) Tween20, 4 pmol jeder genspezifischen Taqman-Sonde (Mammaglobin + B899P-INT + B305D-INT + B726P-INT), 300 nM von B305DINT-F; B899P-INT-F, 100 nM von Mammaglobin-F + R; B726P-INT-F + R, 50 nM von B889P-INT-R; B305D-INT-R, Templat cDNA (aus 0,02 μg polyA + RNA).

PCR Zyklus-Bedingungen

1 Zyklus bei 50 °C für 2 Minuten, 1 Zyklus bei 95 °C für 10 Minuten, 50 Zyklen von 95 °C für 1 Minute und 68 °C für 1 Minute.

10 stellt einen Vergleich eines Multiplex-Tests mit Intron-Exon-Grenze überspannenden Primern (untere Reihe) mit einem Multiplex-Test mit nicht optimierten Primern (obere Reihe) dar, um Brustkrebszellen in einer Reihe von Lymphknotengewebe nachzuweisen. Dieses Experiment zeigt, dass eine Reduktion im Hintergrund von genomischer DNA-Kontmination in Proben erreicht wird, indem Intron-Exon überspannende Primer der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
BEISPIEL 12
MULTIPLEX-NACHWEIS VON METASTASIERTEN BRUSTTUMORZELLEN IN INDIKATORLYMPHKNOTENBIOPSIEPROBEN
Die Stadiumeinteilung von Lymphknoten ist zum Bestimmen geeigneter helfender Hormone und einer Chemotherapie wichtig. Im Gegensatz zu einer herkömmlichen Axilladissektion ist die Indikatorlymphknotenbiopsie ein weniger invasiver Ansatz zur Stadiumeinteilung einer minimalen Resterkrankung. Die Indikatorlymphknotenbiopsie (SLNB) hat das Potenzial, den Nachweis von Metasta sen zu verbessern und prognostische Werte bereitzustellen, um zu einer Therapie mit minimaler Sterblichkeit, die mit einer vollständigen Lymphknotendissektion verbunden ist, zu führen. SLNB setzt ein Mapping des einen oder von beiden Lymphknoten um, die primär den Tumor drainieren und demzufolge am ehesten metastatische Krankheiten verbergen (die Indikatorknoten). Routinemäßige pathologische Analysen der Lymphknoten führen zu einer hohen Fehlerrate: ein Drittel der Frauen mit pathologisch negativen Lymphknoten entwickeln rekurrente Erkrankungen [Bland: The Breast: Saunders 1991]. Eine sensiblere Nachweistechnik für Tumorzellen wäre RT-PCR, aber ihre Anwendung ist aufgrund des Mangels an einem einzigen spezifischen Marker eingeschränkt. Der voranstehend beschriebene Multimarker-Test erhöht die Wahrscheinlichkeit des Nachweises von Krebs durch die Population, ohne falsche Positivergebnisse aus normalen Lymphknoten zu erzeugen.
Wie voranstehend ausgeführt, drainieren lymphatische Afferente in einen einzelnen Knoten, den Indikatorknoten, bevor das Drainieren in das regionale lymphatische Becken auftritt. Indikatorlymphknoten werden mit Farbstoffen und/oder radioaktiv markiertem Kolloid, das in die Stelle der Primäläsion injiziert wird, lokalisiert, und eine Biopsie des Indikatorlymphknotens ermöglicht eine pathologische Untersuchung auf mikrometastatische Ablagerung, die Stadiumeinteilung der Achsel und kann demzufolge eine unnötige Axilladissektion vermeiden. Nodöse Mikrometastasen können mittels färbender (Haematoxylin oder Eosin) oder immunohistochemischer Analyse auf Cytokeratinproteine lokalisiert werden. Immunocytochemische Färbetechniken können häufig falsche Negativergebnisse hervorrufen, indem kleine metastatische Herde aufgrund einer ungeeigneten Sektion des Knotens ausgelassen werden. Immunohistochemie kann aufgrund der illegitimen Expression von Cytokertinen (Retikulumzellen) zu falschen Positivergebnissen oder zu falschen Negativergebnissen führen, wenn der Antikörper Ber-Ep4 verwendet wird, dessen entsprechendes Antigen nicht in allen Tumorzellen exprimiert wird.
Der hier beschriebene Multiplex-Test könnte eine sensibleres Nachweisinstrument für positive Indikatorlymphknoten bereitstellen. Darüber hinaus ist der Nachweis von Brustkrebszellen in Knochenmarkproben, in peripheren Blutproben und kleinen Nadelaspirationsproben wünschenswert für die Diagnose und Prognose von Brustkrebspatienten.
Zweiundzwanzig Lymphknotenproben zusätzlich zu 15 Proben, die bereits zuvor analysiert wurden und in 3A dargestellt werden, wurden mit dem hier beschriebenen Intron-Exon-Grenzen überspannenden Multiplex PCR-Test analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse wurden in Tabelle 8 zusammengefasst. Es wurden darüber hinaus siebenundzwanzig Primärtumore analysiert und die Ergebnisse in Tabelle 9 dargestellt. Zwanzig normale Lymphknotenproben, die mit diesem Test getestet wurden, waren alle negativ.
Tabelle 8
Tabelle 9
Aus Voranstehendem wird erkennbar, dass, obgleich besondere Ausführungsformen der Erfindung hier zu illustrativen Zwecken beschrieben wurden, zahlreiche Änderungen vorgenommen werden können, ohne über den Rahmen der Erfindung hinauszugehen. In Übereinstimmung damit ist die Erfindung außer durch die beigefügten Ansprüche nicht beschränkt.
SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Brustkrebszellen umfassend die Schritte, dass (a) eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einem ersten Oligonukleotid in Verbindung gebracht wird, das mit einem ersten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mammaglobin und Lipophilin B; (b) dass die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotid, das mit einer zweiten Polynukleotidsequenz hybridisiert, enthaltend eine GABAπ (B899P)-Polynukleotidsequenz, in Verbindung gebracht wird; (c) die Menge an hybridisierten Oligonukleotiden der Schritte (a) und (b) in der biologischen Probe nachgewiesen wird; und (d) die Menge an Polynukleotiden, die mit den Oligonukleotiden der Schritte (a) und (b) hybridisiert mit einem vorbestimmten Ausschlusswert verglichen wird, und daraus die An- oder Abwesenheit von Krebs bei einem Patienten bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Polynukleotid aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 und SEQ ID NO: 76 gezeigt, oder deren Komplement ausgewählt ist; und wobei das zweite Polynukleotid dasjenige Polynukleotid enthält, das in SEQ ID NO: 75 dargestellt ist, oder ein Komplement davon.
Verfahren nach Anspruch 2, ferner umfassend, dass (e) die biologische Probe mit einem dritten Oligonukleotid, das mit einem dritten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt, oder einem Komplement davon in Verbindung gebracht wird; (f) die biologische Probe mit einem vierten Oligonukleotid, das mit einem vierten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt, oder einem Komplement davon in Verbindung gebracht wird und wobei Schritt (c) den Nachweis der Menge an hybridisiertem Oligonukleotid der Schritte (a), (b), (e) und (f) in der biologischen Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2 ferner umfassend, dass (e) die biologische Probe mit einem dritten Oligonukleotid, das mit einem dritten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt, oder einem Komplement davon in Verbindung gebracht wird; (f) die biologische Probe mit einem vierten Oligonukleotid, das mit einem vierten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 11 gezeigt, oder einem Komplement davon in Verbindung gebracht wird; (g) die biologische Probe mit einem fünften Oligonukleotid, das mit einem fünften Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, 15 und 17 gezeigt, oder einem Komplement davon in Verbindung gebracht wird; (h) die biologische Probe mit einem sechsten Oligonukleotid, das mit einem sechsten Polynukleotid hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt, oder einem Komplement davon in Verbindung gebracht wird; (i) die biologische Probe mit einem siebten Oligonukleotid, das mit einem siebten Polynukleotid hybridisiert wie in SEQ ID NO: 30 gezeigt, oder einem Komplement davon in Verbindung gebracht wird; (j) die biologische Probe mit einem achten Oligonukleotid, das mit einem achten Polynukleotid hybridisiert wie in SEQ ID NO: 32 gezeigt, oder einem Komplement davon in Verbindung gebracht wird; und (k) die biologische Probe mit einem neunten Oligonukleotid, das mit einem neunten Polynukleotid hybridisiert wie in SEQ ID NO: 76 gezeigt, oder einem Komplement davon in Verbindung gebracht wird; wobei Schritt (c) den Nachweis der Menge an hybridisiertem Oligonukleotid der Schritte (a), (b), (e), (f), (g), (h), (i), (j) und (k) in der biologischen Probe umfasst.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Brustkrebszellen umfassend die Schritte, dass (a) eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde mit einem ersten Oligonukleotidpaar in Kontakt gebracht wird, wobei das erste Paar ein erstes und ein zweites Oligonukleotid enthält, wobei das erste Oligonukleotid und das zweite Oligonukleotid mit einem ersten Polynukleotid bzw. dem Komplement davon hybridisieren, wobei das erste Polynukleotid Mammaglobulin oder Lipophilin B enthält. (c) die biologische Probe mit einem zweiten Oligonukleotidpaar in Kontakt gebracht wird, wobei das zweite Paar ein drittes Oligonukleotid und ein viertes Oligonukleotid enthält, wobei das dritte und vierte Oligonukleotid mit einem zweiten Polynukleotid bzw. dem Komplement davon hybridisieren, wobei das zweite Polynukleotid GABAπ (B899P) enthält; (d) das erste Polynukleotid und das zweite Polynukleotid amplifiziert werden; und (e) das amplifizierte erste Polynukleotid und das amplifizierte zweite Polynukleotid nachgewiesen werden; wobei die Anwesenheit des amplifizierten ersten Polynukleotids oder des amplifizierten zweiten Polynukleotids auf die Anwesenheit von Brustkrebszellen im Patienten hindeutet.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das erste Polynukleotid aus der Gruppe, bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 und SEQ ID NO: 76 gezeigt ausgewählt ist und wobei das zweite Polynukleotid das Polynucleotid, wie in SEQ ID NO: 75 gezeigt, enthält.
Verfahren nach Anspruch 6 ferner umfassend, dass die biologische Probe mit einem dritten Oligonukleotidpaar in Verbindung gebracht wird, wobei das dritte Paar einen Vorwärts-Primer und einen Rückwärts-Primer enthält, die mit einem dritten Polynukleotid bzw. dem Komplement davon hybridisieren, wobei das dritte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt ausgewählt ist; wobei Schritt (d) ferner die Amplikation des dritten Polynukleotids umfasst; und wobei Schritt (e) ferner den Nachweis des dritten Polynukleotids umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7 umfassend, dass die biologische Probe mit einem vierten Oligonukleotidpaar in Kontakt gebracht wird, wobei das vierte Paar einen Vorwärts-Primer und einen Rückwärts-Primer enthält, die mit einem vierten Polynukleotid bzw. dem Komplement davon hybridisieren, wobei das vierte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt ausgewählt ist; wobei Schritt (d) ferner die Amplikation des vierten Polynukleotids umfasst; und wobei Schritt (e) ferner den Nachweis des vierten Polynukleotids umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die biologische Probe aus einer Gruppe bestehend aus Blut, Serum, Lymphknoten, Knochenmark, Sputum, Urin und Tumorbiopsieproben ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die biologische Probe aus einer Gruppe bestehend aus Blut, Lymphknoten und Knochenmark ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Lymphknoten ein Indikatorlymphknoten ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die Oligonukleotide aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden wie in SEQ ID NOs: 33-38, 48-51 und 53-62 gezeigt, ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der Schritt (e) einen Schritt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Nachweis einer radioaktiven Markierung und Nachweis eines Fluorophors, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Schritt zum Nachweis einen Schritt zur Fraktionierung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die Oligonukleotide Intron überspannende Oligonukleotide sind.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die intronüberspannenden Oligonukleotide aus einer Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden wie in SEQ ID Nos: 36-44 und 48-62 gezeigt ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der Nachweis des amplifizierten ersten, zweiten, dritten und vierten Polynukleotids umfasst, dass das amplifizierte erste, zweite, dritte und vierte Polynukleotid mit einer markierten Oligonukleotidsonde in Kontakt gebracht wird, die unter mäßig stringenten Bedingungen mit einem ersten, zweiten, dritten und vierten Polynukleotid hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die markierte Oligonukleotidsonde einen nachweisbaren Anteil, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus radioaktiver Markierung und Fluorophor, enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, ferner umfassend einen Schritt zur Anreicherung von Krebszellen aus der biologischen Probe vor Hybridisierung des/der Oligonukleotidprimer(s).
Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, wobei der Schritt zu Anreicherung von Krebszellen aus der biologischen Probe durch Methoden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelleinfang und Zellabreicherung, erzielt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Zelleinfang durch Immunocapture erzielt wird und die Immunocapture die Schritte umfasst, dass (a) ein Antikörper an der Oberfläche der Krebszellen absorbiert wird; und (b) der auf den Krebszellen absorbierte Antikörper von dem Rest der biologischen Probe separiert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Antikörper gegen ein Antigen gerichtet ist, das aus der Gruppe bestehend aus CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD24, CD25, CD29, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD66B, CD66e, HLA-DR, IgE und TCRαβ ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Antikörper gegen ein Brustkrebsantigen gerichtet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Antikörper mit einer magnetischen Kugel konjugiert ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Antikörper als tetramerer Antikörperkomplex formuliert ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Zellabreicherung durch eine Methode erzielt werden kann, umfassend die Schritte, dass (a) rote und weiße Zellen quervernetzen, und (b) die quervernetzten roten und weißen Zellen von dem Rest der biologischen Probe fraktioniert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der Schritt zur Amplikation durch eine Polynukleotid-Amplikationsmethode erzielt wird, die aus der Gruppe bestehend aus Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), inverser PCR, RACE, Ligase-Kettenreaktion (LCR), Qbeta-Replicase, isothermer Amplifikation, Strand Displacement Amplification (SDA), rollender Kettenreaktion (RCR), der Reaktion cyclischer Sonden (CPR), transkriptionsbasierter Amplifikationsysteme (TAS), nucleinsäuresequenzbasierter Amplifikation (NASBA) und 3SR ausgewählt ist.
Zusammensetzung zum Nachweis von Brustkrebszellen in einer biologischen Probe eines Patienten enthaltend: (a) ein erstes Oligonukleotid; und (b) ein zweites Oligonukleotid; wobei, das erste Oligonukleotid und das zweite Oligonukleotid mindestens 15 Nukleotide lang sind und spezifisch mit einem ersten Polynukleotid oder dem Komplement davon bzw. mit einem zweiten Polynukleotid oder dem Komplement davon hybridisieren; wobei das erste Polynukleotid aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 und SEQ ID NO: 76 ausgewählt ist; und wobei das zweite Polynukleotid das Polynukleotid wie in SEQ ID NO: 75 gezeigt enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 29 ferner umfassend ein drittes und ein viertes Oligonukleotid, wobei das dritte und vierte Oligonukleotid mit einem dritten Polynukleotid oder dem Komplement davon bzw. einem vierten Polynukleotid oder dem Komplement davon hybridisieren; wobei das dritte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt ausgewählt ist; und wobei das vierte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 30 oder 31, wobei die Oligonukleotide aus einer Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden wie in SEQ ID NOs: 33-44, 48-62 und 72 offenbart ausgewählt sind.
Zusammensetzung zum Nachweis von Brustkrebszellen in einer biologischen Probe eines Patienten enthaltend: (a) ein erstes Oligonukleotidpaar; und (b) ein zweites Oligonukleotidpaar; wobei, das erste Oligonukleotidpaar und das zweite Oligonukleotidpaar mindestens 10 Nukleotide lang sind und spezifisch mit einem ersten Polynukleotid oder dem Kom plement davon bzw. mit einem zweiten Polynukleotid oder dem Komplement davon hybridisieren; wobei das erste Polynukleotid aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 und SEQ ID NO: 76 ausgewählt ist; und wobei das zweite Polynukleotid das Polynukleotid wie in SEQ ID NO: 75 gezeigt, enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 32 ferner umfassend ein drittes Oligonukleotidpaar und ein viertes Oligonukleotidpaar, wobei das dritte Oligonukleotidpaar und das vierte Oligonukleotidpaar mit einem dritten Polynukleotid oder dem Komplement davon bzw. einem vierten Polynukleotid oder dem Komplement davon hybridisieren; wobei das dritte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 gezeigt ausgewählt ist; und wobei das vierte Polynukleotid aus einer Gruppe bestehend aus Polynukleotiden wie in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 24 gezeigt ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 32 oder 33, wobei die Oligonukleotide aus einer Gruppe bestehend aus Oligonukleotiden wie in SEQ ID NOs: 33-44, 48-62 und 72 offenbart ausgewählt sind.
Kit zum Nachweis von Brustkrebs, enthaltend die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 29 bis 34.