DE69914309T2

DE69914309T2 - Tadg15: eine extrazelluläre serinprotease überexprimiert in brust- und eierstock-karzinomen

Info

Publication number: DE69914309T2
Application number: DE69914309T
Authority: DE
Inventors: J. Timothy O'BRIEN; Hirotoshi Tanimoto
Original assignee: University of Arkansas
Current assignee: University of Arkansas
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1999-02-18
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2019-02-19
Also published as: ATE258060T1; CA2324993A1; CA2324993C; EP1056466B1; AU2869299A; PT1056466E; WO1999042120A1; DE69914309D1; US5972616A; ES2215376T3; AU750932B2; EP1056466A4; EP1056466A1; DK1056466T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen die Gebiete der Zellbiologie und der Diagnose neoplastischer Erkrankungen. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung eine extrazelluläre Serinprotease, bezeichnet als Tumor-Antigen abgeleitetes Gen-15 (TAGD-15), das in Brust- und Eierstock-Karzinomen überexprimiert wird.
Beschreibung des Fachgebiets
Extrazelluläre Proteasen sind direkt mit Tumorwachstum, Verteilen von Tumorzellen und Invasion von Zielorganen in Zusammenhang gebracht worden. Die individuellen Protease-Klassen sind beteiligt an (1) der Verdauung des Stroma, welches das initiale Tumorgebiet umgibt, (2) der Verdauung der zellulären Adhäsionsmoleküle, wodurch die Dissoziation von Tumorzellen ermöglicht wird; und (3) der Invasion der Basalmembran, wodurch das Wachstum von Metastasen und die Aktivierung von Tumorwachstumsfaktoren als auch Angionese-Faktoren möglich wird, sie sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Im Stand der Technik stehen bisher keine wirksamen Mittel zum Durchmustern zum Identifizieren von in Karzinomen überexprimierten Proteasen zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses seit langem auf dem Fachgebiet bestehende Erfordernis.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Programm zum Durchmustern zum Identifizieren von in Karzinome überexprimierten Proteasen, indem PCR-Produkte untersucht werden, die mittels Differential Display in frühen Tumorstadien amplifiziert werden, und indem metastasierende Tumore mit denen des normalen Gewebe verglichen werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine DNA bereitgestellt, die ein TAGD-15 Protein kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) isolierter DNA, die ein TAGD-15 Protein kodiert; und (b) isolierter DNA, die sich von der isolierten DNA aus (a) in der Codonsequenz infolge der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet und die ein TAGD-15 Protein kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden ein Vektor, der die erfindungsgemäße DNA exprimieren kann und der für die Expression in einer rekombinanten Zelle angepasst ist, sowie regulatorische Elemente, die zur Expression der DNA in der Zelle notwendig sind, bereitgestellt.
In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit dem erfindungsgemäßen Vektor transfiziert ist, wobei der Vektor ein TAGD-15 Protein exprimiert.
In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen der Expression einer TAGD-15 mRNA bereitgestellt, umfassend die Schritte: (a) In-Kontakt-Bringen von mRNA, die von der Zelle erhalten wurde, mit der markierten Hybridisierungssonde; und (b) Nachweisen einer Hybridisierung der Sonde mit der mRNA.
Andere und weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung augenscheinlich, die der Offenbarung dienen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Damit die vorstehend erwähnten Merkmale, Vorteile und Gegenstände der vorliegenden Erfindung sowie andere verständlicher werden, wird die vorstehend kurz dargestellte Erfindung in Bezug zu bestimmten Ausführungsformen, die in den beigefügten Zeichnungen veranschaulicht werden, genauer beschrieben. Diese Zeichnungen sind ein Teil der Beschreibung. Es ist jedoch anzumerken, dass die beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen und nicht den Bereich der Erfindung einschränken.
1 zeigt einen Vergleich von PCR-Produkten, die von cDNA von normalem Gewebe und Brust-Karzinom abgeleitet sind, dargestellt durch Färben in einem Agarose-Gel.
2 zeigt einen Vergleich der katalytischen Serinprotease-Domäne von TAGD-15 (SEQ ID Nr. 14) mit Hepsin (Heps, SEQ ID Nr. 3), (Scce, SEQ ID Nr. 4), Trypsin (Try, SEQ ID Nr. 5), Chymotrypsin (Chymb, SEQ ID Nr. 6), Faktor 7 (Fac7, SEQ ID Nr. 7) und Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Tpa, SEQ ID Nr. 8). Die Sternchen kennzeichnen konservierte Aminosäuren der katalytischen Triade.
3 zeigt eine quantitative PCR-Analyse der Expression von TAGD-15.
4 zeigt das Verhältnis der Expression von TAGD-15 zur Expression von β-Tubulin in normalen Geweben, gering malignen potenziellen Tumoren (LMP) und Karzinomen.
5 zeigt die Expression von TAGD-15 in Tumor-Zelllinien, die sowohl von Eierstock- als auch Brust-Karzinomgeweben abgeleitet sind.
6 zeigt die Überexpression von TAGD-15 in anderen Karzinomgeweben.
7 zeigt die Northern Blots der Expression von TAGD-15 in Brust-Karzinomen, fötalen und normalen adulten Geweben.
8 zeigt ein Diagramm des TAGD-15-Transkripts und der Klone mit dem Ursprung ihrer Abstammung.
9 zeigt die Nukleotidsequenz der TAGD-15-cDNA (SEQ ID Nr. 1) und die Aminosäuresequenz des TAGD-15-Proteins (SEQ ID Nr. 2).
10 zeigt die Aminosäuresequenz der TAGD-15-Protease einschließlich der funktionellen Stellen und Domänen.
11 zeigt ein Strukturdiagramm des TAGD-15-Proteins einschließlich der funktionellen Domänen.
12 zeigt einen Vergleich der Nukleotidsequenzen zwischen TAGD-15 und humanen SNC-19 (GeneBank Zugangsnummer #U20428).
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen
Der hier verwendete Begriff „cDNA" soll die DNA-Kopie des mRNA-Transkripts eines Gens bezeichnen.
Der hier verwendete Begriff „abgeleitete Aminosäuresequenz" soll die Aminosäuresequenz bezeichnen, die durch Lesen der Triplet-Sequenz der Nukleotidbasen in der cDNA bestimmt wird.
Der hier verwendete Begriff „Durchmustern einer Library" soll das Verfahren der Verwendung einer markierten Sonde bezeichnen, das dazu dient, zu prüfen, ob es unter den geeigneten Bedingungen eine Sequenz gibt, die komplementär zu der in einer bestimmten DNA-Library vorhandenen Sonde ist. Zudem kann das „Durchmustern einer Library" mittels PCR durchgeführt werden.
Der hier verwendete Begriff „PCR" bezeichnet die Polymerasekettenreaktion, die Gegenstand sowohl der US-Patente 4683195 und Nr. 4683202 von Mullis als auch anderer auf dem Fachgebiet bekannter Verbesserungen ist.
Die TAGD-15 cDNA besteht aus 3147 Basenpaaren (SEQ ID Nr. 1) und sie kodiert ein aus 855 Aminosäuren bestehendes Protein (SEQ ID Nr. 2). Die Verfügbarkeit des TAGD-15-Gens öffnet den Weg für zahlreiche Untersuchungen, die zu verschiedenen Anwendungen führen können. Das TAGD-15-Gen kann beispielsweise als ein diagnostisches oder therapeutisches Ziel bei Eierstock-Karzinom oder anderen Karzinomen, einschließlich Brust, Prostata, Lunge und Kolon, verwendet werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können herkömmliche Verfahren der Molekularbiologie, Mikrobiologie sowie rekombinante DNA-Arbeitstechniken angewendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Verfahren werden in der Literatur ausführlich erklärt. Siehe z. B. Maniatis, Fritsch & Sambrook, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); „DNA Cloning: A Practical Approach," Bände I und II (D. N. Glover Hrsg. 1985); „Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait Hrsg. 1984); „Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. (1985)].; „Transcription and Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. (1984)]; „Animal Cell Culture" [R. I. Freshney Hrsg. (1986)]; „Immobilizes Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, „A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Daher sollten die nachfolgenden Begriffe, falls sie in der vorliegenden Erfindung erscheinen, die nachstehend erörterten Definitionen haben.
Die hier beschriebenen Aminosäuren liegen bevorzugt in der isomeren „L"-Form vor. Reste in der isomeren „D"-Form können jedoch jede L-Aminosäure ersetzen, so lange die erwünschte funktionelle Eigenschaft der Immunglobulin-Bindung durch das Polypeptid erhalten bleibt. NH₂ bezeichnet die am aminoterminalen Ende des Polypeptids vorhandene freie Aminosäure. COOH bezeichnet die am carboxyterminalen Ende des Polypeptids vorhandene freie Carboxylgruppe. In Übereinstimmung mit der herkömmlichen Nomenklatur für Polypetide, J. Biol. Chem., 243: 3552–59 (1969), sind die Abkürzungen für Aminosäurereste in der nachfolgenden Tabelle dargestellt:
TABELLE ZUR ÜBEREINSTIMMUNG
Es sollte erwähnt werden, dass alle Sequenzen der Aminosäurereste hier durch Formeln dargestellt werden, deren linke und rechte Orientierung mit der herkömmlichen Richtung vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende übereinstimmt. Des weiteren sollte erwähnt werden, dass ein Gedankenstrich am Anfang oder Ende einer Sequenz eines Aminosäurerestes ein Peptid kennzeichnet, das an eine weitere Sequenz einer oder mehrerer Aminosäurereste gebunden ist. Die vorstehende Tabelle dient der Korrelation des drei-Buchstaben-Codes und des ein-Buch staben-Codes, die beide abwechselnd in der vorliegenden Erfindung verwendet sein können.
Ein „Replikon" ist ein beliebiges genetisches Element (z. B. Plasmid, Chromosom, Virus), das in vivo als eine autonome Einheit der DNA-Replikation dient, d. h. es ist zur Replikation in der Lage, die unter seiner eigenen Kontrolle steht.
Ein „Vektor" ist ein Replikon wie ein Plasmid, ein Phage oder ein Cosmid, an das ein weiteres DNA-Segment gebunden sein kann, sodass die Replikation auf das gebundene Segment übertragen wird.
„DNA-Molekül" bezeichnet die polymere Form von Desoxyribonukleotiden (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin), die entweder in einzelsträngiger Form oder als eine doppelsträngige Helix vorliegen. Dieser Begriff bezieht sich nur auf die primäre und sekundäre Struktur des Moleküls, es wird damit nicht auf bestimmte tertiäre Formen eingeschränkt. Somit schließt dieser Begriff doppelsträngige DNA ein, die unter anderem in linearen DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen nachgewiesen wurde. In Übereinstimmung mit den herkömmlichen Standards wird für die Sequenz der erfindungsgemäßen Struktur nur die 5'- zu 3'-Richtung entlang des nicht-transkribierten DNA-Strangs angegeben (d. h., der Strang der Sequenzhomologie zur mRNA aufweist).
„Ursprung der Replikation" bezeichnet jene DNA-Sequenzen, die an der DNA-Synthese beteiligt sind.
Eine DNA „kodierende Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die in vivo in ein Polypetid transkribiert und translatiert wird, wenn sie sich unter der Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen befindet. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Start-Codon an dem 5'-(amino)terminalen Ende und ein Translationsstop-Codon an dem 3'-(carboxy)terminalen Ende bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, genome DNA-Sequenzen von eukaryotischer (d. h. Säugetier) DNA, und sogar synthetische DNA-Sequenzen einschließen, ohne auf diese beschränkt zu sein. Ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsabbruch-Sequenz befinden sich üblicherweise 3' zu der kodierenden Sequenz.
Die Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen sind DNA regulatorische Sequenzen, wie Promotor, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Terminatoren und ähnliche, welche die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle sicherstellen.
Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA regulatorische Region, die zur Bindung einer RNA-Polymerase in einer Zelle und zum Initiieren der Transkription einer sich stromaufwärts befindenden (3'-Richtung) kodierenden Sequenz fähig ist. Um die vorliegende Erfindung genauer zu beschreiben, sollte erwähnt werden, dass die Promotorsequenz an ihrem 3'-Ende durch die Transkriptionsinitiationsstelle gebunden ist, und dass sie sich stromabwärts (5'-Richtung) erstreckt, wobei sie die minimale Anzahl an Basen oder Elementen einschließt, die zum Initiieren einer nachweisbaren Transkription notwendig sind. Innerhalb der Promotorsequenz befinden sich sowohl eine Transkriptionsinitiationsstelle als auch Protein-Bindungsdomänen (Consensussequenzen), die für die Bindung von mRNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren enthalten häufig, jedoch nicht immer, „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen. Prokaryotische. Promotoren enthalten zusätzlich zu den –10 und –35 Consensussequenzen Shine-Dalgarno-Sequenzen.
Eine „Expressionskontrollsequenz" ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription und Translation einer weiteren DNA-Sequenz kontrolliert und reguliert. Eine kodierende Sequenz befindet sich „unter der Kontrolle" von Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, die anschließend in das Protein translatiert wird, das durch die kodierende Sequenz kodiert wird.
Nahe der kodierenden Sequenz kann eine „Signalsequenz" eingeschlossen sein. Diese Sequenz kodiert ein Signalpeptid, N-terminal zu dem Polypeptid, das mit der Wirtszelle kommuniziert, um das Polypeptid in Richtung der Zelloberfläche zu lenken oder damit die Sekretion des Polypeptids in das Medium erfolgt, und dieses Signalpeptid wird durch die Wirtszelle ausgeschleust, bevor das Protein die Zelle verlässt. Es kann festgestellt werden, dass Signalsequenzen mit einer Vielzahl nativer Proteine von Prokaryoten oder Eukaryoten assoziiert sind.
Der Begriff „Oligonukleotid", der in Bezug auf die erfindungsgemäße Sonde verwendet wird, ist als ein Molekül definiert, das zwei oder mehrere Ribonukleotide, vorzugsweise mehr als drei, umfasst. Seine genaue Größe ist von vielen Faktoren abhängig, die wiederum von der letztendlichen Funktion und der Verwendung des Oligonukleotids abhängen.
Der Begriff „Primer" bezeichnet ein Oligonukleotid, das entweder natürlich vorkommt, wie in einer gereinigten Restriktionsverdauungslösung, oder das synthetisch hergestellt wird, und das in der Lage ist, die Synthese auszulösen, wenn es unter Bedingungen vorliegt, in denen die Synthese eines Primer-Extensionsprodukts induziert wird, das komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, d. h. in Anwesenheit von Nukleotiden und einem induzierenden Mittel, wie einer DNA-Polymerase und bei einer geeigneten Temperatur und geeignetem pH-Wert. Der Primer kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und er muss ausreichend lang sein, um die Synthese des erwünschten Extensionsprodukts in Anwesenheit des induzierenden Mittels voranzutreiben. Die genaue Länge des Primers ist von vielen Faktoren abhängig, einschließlich der Temperatur, der Quelle des Primers und des angewendeten Verfahrens. Für diagnostische Anwendungen enthält der Oligonukleotid-Primer, z. B. in Abhängigkeit von der Komplexizität der Zielsequenz typischerweise 15–25 oder mehr Nukleotide, obwohl er weniger Nukleotide enthalten kann.
Die hier verwendeten Primer werden dahingehend ausgewählt, dass sie komplementär zu verschiedenen Strängen einer besonderen DNA-Zielsequenz sind. Das bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, damit sie an die entsprechenden Stränge hybridisieren können. Daher muss die Primersequenz nicht die genaue Sequenz des Templats widerspiegeln. Ein nicht-komplementäres Nukleotid-Fragment kann beispielsweise an das 5'-Ende des Primers gebunden sein, wobei die verbleibende Primersequenz komplementär zu dem Strang ist. Alternativ können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen in den Primer eingefügt sein, unter der Voraussetzung, dass die Primersequenz ausreichend komplementär zu der Sequenz ist oder dass sie damit hybridisiert und dabei das Templat für die Synthese des Extensionsprodukts bildet.
Der Begriff „Restriktionsendonuklease" und „Restriktionsenzyme" bezeichnet Enzyme, die jeweils doppelsträngige DNA an oder nahe einer spezifischen Nukleotidsequenz schneiden.
Eine Zelle ist durch exogene oder heterologe DNA „transformiert" worden, wenn eine derartige DNA in die Zelle eingeführt worden ist. Die transformierende DNA kann in das Genom der Zelle integriert werden oder nicht (kovalent gebunden). In Prokaryoten, Hefe und Säugetierzellen kann die transformierende DNA beispielsweise auf einem episomalen Element, wie einem Plasmid, erhalten bleiben. Im Hinblick auf eukaryotische Zellen ist eine stabil transformierte Zelle, eine Zelle, in der die transformierende DNA in ein Chromosom integriert worden ist, sodass es durch Tochterzellen während der chromosomalen Replikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle veranschaulicht, Zelllinien oder Klone herzustellen, die eine Tochterzellpopulation umfassen, welche die transformierende DNA enthält. Ein „Klon" ist eine Zellpopulation, abgeleitet von einer einzelnen Zelle oder durch Mitose vererbt. Eine „Zelllinie" ist ein Klon einer primären Zelle, die über viele Generation zu einem stabilen in vitro-Wachstum fähig ist.
Zwei DNA-Sequenzen sind „im Wesentlichen homolog", wenn sich mindestens etwa 75% (vorzugsweise mindestens etwa 80% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90% oder 95%) der Nukleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen paaren. Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können identifiziert werden, indem die Sequenzen unter Verwendung von herkömmlicher, in Sequenz-Datenbanken verfügbarer Software oder in einem Southern-Hybridisierungs-Versuch unter beispielsweise für dieses bestimmte System definierten strengen Bedingungen miteinander verglichen werden. Die Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt. Siehe z. B. Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Bd. I & II supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Eine „heterologe" Region des DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA-Segment innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, dass es in der Natur nicht mit dem größeren Molekül assoziiert ist. Wenn die heterologe Region ein Säugetier-Gen kodiert, wird das Gen somit üblicherweise durch DNA flankiert, die die genome Säugetier-DNA in dem Genom des Organismus, von der sie abstammt, nicht flankiert. In einem weiteren Beispiel ist die kodierende Sequenz ein Konstrukt, in dem die kodierende Sequenz selbst nicht in der Natur nachgewiesen wird (z. B. eine cDNA, in der die kodierende genome Sequenz Introns oder synthetische Sequenzen mit Codons aufweist, die sich von denen des nativen Gens unterscheiden). Allele Variationen oder natürlich vorkommende Mutationsereignisse führen nicht zu einem Anstieg an den hier definierten heterologen DNA-Regionen.
Die am häufigsten für diese Untersuchungen verwendeten Markierungen sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, die fluoreszieren, wenn sie ultraviolettem Licht ausgesetzt werden, und andere. Eine Vielzahl fluoreszierender Materialien sind bekannt und können als Markierungen verwendet werden. Diese schließen beispielsweise Fluorescein, Rhodamin, Auramin, Texas-Rot, AMCA-Blau und Lucifer-Gelb ein. Ein besonderes nachzuweisendes Material ist ein Anti-Kaninchen-Antikörper, der in Ziegen erzeugt und durch Isothiocyanat mit Fluorescein konjugiert wird.
Proteine können auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert sein. Die radioaktive Markierung kann durch ein beliebiges, derzeit verfügbares Zählverfahren nachgewiesen werden. Die bevorzugten Isotope können ausgewählt sein aus ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I und ¹⁸⁶Re.
Enzym-Markierungen sind ähnlich geeignet und sie können durch jedes gegenwärtig angewendete kolorimetrische, spektrophotometrische, fluorspektrophotometrische, amperometrische oder gasometrische Verfahren nachgewiesen werden. Das Enzym ist an ein ausgewähltes Teilchen durch Umsetzung mit Brückenmolekülen, wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und ähnlichem, konjugiert. Viele Enzyme, die in diesen Verfahren verwendet können, sind bekannt und können verwendet werden.
Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase. Die US-Patente 3654090, Nr. 3850752 und Nr. 4016043 nehmen in ihren Beispielen Bezug auf verschiedene Markierungsmaterialien und -verfahren.
Ein besonderes auf dem Fachgebiet entwickeltes und angewendetes Assay-System ist als Rezeptor-Assay bekannt. In einem Rezeptor-Assay wird das zu untersuchende Material in geeigneter Weise markiert und anschließend mit bestimmten zellulären Testkolonien in einer Menge an beiden mit der Markierung beimpft, wonach Bindungsstudien durchgeführt werden, um zu bestimmen, in welchem Ausmaß das markierte Material an die Zellrezeptoren bindet. Auf diese Weise können Affinitätsunterschiede zwischen Materialien ermittelt werden.
Ein auf dem Fachgebiet geeignetes Assay ist als ein „cis/trans"-Assay bekannt. Kurz dargestellt verwendet dieses Assay zwei genetische Konstrukte, von denen eines typischerweise ein Plasmid ist, das kontinuierlich einen bestimmten interessierenden Rezeptor exprimiert, wenn es in eine geeignete Zelllinie transfiziert wurde, und das zweite ist ein Plasmid, das einen Reporter, wie Luciferase, unter der Kontrolle eines Rezeptor/Liganden-Komplexes exprimiert. Wenn es somit beispielsweise erwünscht ist, eine Verbindung als einen Liganden für einen bestimmten Rezeptor zu bewerten, könnte eines der Plasmide ein Konstrukt sein, das zur Expression des Rezeptors in der ausgewählten Zelllinie führt, während das zweite Plasmid einen Promotor besitzen könnte, der mit dem Luciferase-Gen verbunden ist, in dem das auf den besonderen Rezeptor ansprechende Element inseriert ist. Wenn die zu testende Verbindung ein Agonist für den Rezeptor ist, bildet der Ligand einen Komplex mit dem Rezeptor und initiiert die Transkription des Luciferase-Gens. Anschließend wird die entstehende Chemilumineszenz photometrisch gemessen und es werden Dosis-Reaktions-Kurven erhalten und mit denen bekannter Liganden verglichen. Die vorstehende Methodologie ist genauer in US-Patent 4981784 beschrieben.
Der hier verwendet Begriff „Wirt" schließt nicht nur Prokaryoten, sondern auch Eukaryoten, wie Hefe, Pflanzen und tierische Zellen, ein. Ein rekombinantes DNA-Molekül oder Gen, das ein erfindungsgemäßes humanes TAGD-15 Protein kodiert, kann verwendet werden, um einen Wirt unter Anwendung jedes dem Fachmann bekannten Standardverfahrens zu transformieren. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines Vektors, der kodierende Sequenzen für das Gen enthält, das ein erfindungsgemäßes humanes TAGD-15-Protein für die Transformation eines Prokaryoten kodiert. Prokaryotische Wirte können E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Eukaryotische Wirte schließen Hefen, wie Pichia pastoris, Säugetierzellen und Insektenzellen, ein.
Im Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotorsequenzen enthalten, welche die effiziente Transkription des eingefügten DNA-Fragments erleichtern, in Verbindung mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, Promotor(en), Terminator(en) sowie spezifische Gene, die in der Lage sind, die phänotypische Selektion in transformierten Zellen bereitzustellen. Die transformierten Wirte können zum Erreichen des optimalen Zellwachstums gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Mitteln fermentiert und kultiviert werden.
Die vorliegende Erfindung schließt eine im Wesentlichen reine DNA ein, die ein TAGD-15-Protein kodiert, sowie einen Strang, mit dem die DNA unter strengen Bedingungen an eine Sonde, die eine Sequenz von mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID Nr. 1 enthält, hybridisiert. Das durch die erfindungsgemäße DNA kodierte Protein kann eine Sequenzidentität von mindestens 80% (vorzugsweise 85%, bevorzugter 90%, am meisten bevorzugt 95%) mit den in 10 (SEQ ID Nr. 2) aufgeführten Aminosäuren aufweisen. Bevorzugter schließt die DNA die kodierende Sequenz der Nukleotide der 9 (SEQ ID Nr. 1) oder einer degenerierten Variante einer derartigen Sequenz ein.
Die Sonde, mit der die erfindungsgemäße DNA hybridisiert, besteht vorzugsweise aus einer Sequenz von mindestens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, bevorzugter 40 Nukleotiden, sogar mehr als 50 Nukleotiden, und am meisten bevorzugt 100 Nukleotiden oder mehr (bis zu 100) der kodierenden Sequenz der in 9 aufgeführten Nukleotide (SEQ ID Nr. 1) oder dem Komplement davon. Eine derartige Sonde ist zum Nachweisen der Expression von TAGD-15 in einer humanen Zelle durch ein Verfahren geeignet, einschließend die Schritte von (a) In-Kontakt-Bringen von mRNA, die von der Zelle erhalten wurde, mit der markierten Hybridisierungssonde; und (b) Nachweisen einer Hybridisierung der Sonde mit der mRNA.
Die vorliegende Erfindung schließt auch eine im Wesentlichen reine DNA ein, enthaltend eine Sequenz von mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden (vorzugsweise 20, bevorzugter 30, noch bevorzugter 50, und am meisten bevorzugt alle) aus der Region der Nukleotide 1 bis 3147 der 9 (SEQ ID Nr. 1).
Unter „sehr strenge Bedingungen" ist zu verstehen, dass die DNA-Hybridisierung und die Waschbedingungen durch eine ho he Temperatur und eine geringe Salzkonzentration charakterisiert sind, wie z. B. Waschbedingungen von 65°C bei einer Salzkonzentration von annähernd 0,1 × SSC, oder einem funktionellen Äquivalent davon. Sehr strenge Bedingungen können beispielsweise eine Hybridisierung bei etwa 42°C in Anwesenheit von etwa 50% Formamid; einen ersten Waschschritt bei etwa 65°C mit etwa 2 × SSC, enthaltend 1% SDS; gefolgt von einem zweiten Waschschritt bei etwa 65°C mit etwa 0,1 × SSC einschließen.
„Im Wesentlichen reine DNA" bedeutet eine DNA, die nicht Teil eines Milieus ist, in der die DNA natürlich vorkommt, infolge der Abtrennung (teilweise oder vollständige Reinigung) von einigen oder allen Molekülen dieses Milieus, oder infolge von Veränderungen der Sequenzen, welche die erfindungsgemäße DNA flankieren. Dieser Begriff schließt daher beispielsweise eine rekombinante DNA ein, die in einen Vektor, in ein(en) autonom replizierendes/n Plasmid oder Virus, oder in die genome DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten eingefügt ist; oder die unabhängig von anderen Sequenzen als ein getrenntes Molekül existiert (z. B. eine cDNA oder ein genomes oder cDNA-Fragment, erzeugt durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder eine Restriktionsendonukleaseverdauung). Auch eingeschlossen ist eine rekombinante DNA, die Teil eines Hybrid-Gens ist, das eine zusätzliche Polypetidsequenz, wie z. B. ein Fusionsprotein, kodiert. Auch eingeschlossen ist eine DNA, die einen Teil der in 9 (SEQ ID Nr. 1) aufgeführten Nukleotide einschließt, die eine alternative Splice-Variante von TAGD-15 kodiert.
Die DNA kann mindestens etwa 70% Sequenzidentität zu der kodierenden Sequenz der in 9 aufgeführten Nukleotide (SEQ ID Nr. 1), bevorzugter mindestens 75% (z. B. mindestens 80%); und am meisten bevorzugt mindestens 90% aufweisen. Die Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine direkte Funktion der Zahl der Paarungen oder identischen Positionen. Wenn eine Position einer Subeinheit in beiden der zwei Sequenzen durch die gleiche monomere Subeinheit besetzt ist, z. B. wenn eine festgelegte Position in jeder der beiden DNA-Moleküle durch ein Adenin besetzt ist, dann sind sie bezüglich dieser Position identisch. Wenn beispielsweise 7 Positionen in einer Sequenz mit einer Länge von 10 Nukleotiden zu den korrespondierenden Positionen in einer zweiten 10 Nukleotide langen Sequenz identisch sind, dann besteht zwischen den zwei Sequenzen 70% Sequenzidentität. Die Länge der Vergleichssequenzen beträgt im Allgemeinen mindestens 50 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 60 Nukleotide, bevorzugter mindestens 75 Nukleotide, am meisten bevorzugt mindestens 100 Nukleotide. Sequenzidentität wird typischerweise unter Verwendung von Sequenzanalyse-Software gemessen (z. B. das Sequenzanalyse-Software-Paket von Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705).
Die vorliegende Erfindung umfasst einen Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein humanes TAGD-15 Protein kodiert und der Vektor ist zur Replikation in einem Wirt fähig, der in einer funktionsfähigen Verbindung: a) einen Replikationsursprung; b) einen Promotor; und c) eine DNA-Sequenz, die das genannte Protein kodiert, umfasst. Vorzugsweise enthält der erfindungsgemäße Vektor einen Teil einer in SEQ ID Nr. 1 dargestellten DNA-Sequenz. Ein „Vektor" kann als replizierbares Nukleinsäure-Konstrukt definiert werden, wie z. B. ein Plasmid oder eine virale Nukleinsäure. Vektoren können verwendet werden, um TAGD-15-Protein kodierende Nukleinsäure zu amplifizieren und/oder zu exprimieren. Ein Expressionsvektor ist ein replizierbares Konstrukt, in dem eine, ein Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz in funktionsfähiger Weise mit einer geeigneten Kontrollsequenz verbunden ist, die zur wirksamen Expression des Polypetids in einer Zelle fähig sind. Die Notwendigkeit für derartige Kontrollsequenzen kann in Abhängigkeit von der ausgewählten Zelle und dem gewählten Transformationsverfahren variieren. Im Allgemeinen schließen Kontrollsequenzen einen transkriptionalen Promotor und/oder Enhancer, geeignete ribosomale mRNA-Bindungsstellen und Sequenzen ein, die den Transkriptions- und Translationsabbruch kontrollieren. Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, können verwendet werden, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der geeignete Transkriptions- und Translationskontrollsignale enthält. Siehe z. B. die in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg.), Cold Spring Harbor Press, N.Y. beschriebenen Verfahren. Ein Gen und seine Transkriptionskontrollsequenzen sind in „funktionsfähiger Weise verbunden", wenn die Transkriptionskontrollsequenzen die Transkription des Gens wirksam kontrollieren. Erfindungsgemäße Vektoren schließen Plasmidvektoren und virale Vektoren ein, sie sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Bevorzugte erfindungsgemäße virale Vektoren sind diejenigen, die von Retroviren, Adenoviren, Adreno-assoziierten Viren, dem SV40-Virus oder Herpes-Viren abgeleitet sind.
Ein „im Wesentlichen reines Protein" ist ein Protein, das von mindestens einigen derjenigen Bestandteile abgetrennt ist, die es natürlichen begleiten. Typischerweise ist das Protein im Wesentlichen rein, wenn es wenigsten zu 60 Gew.-% frei von Proteinen und anderen natürlich vorkommenden organischen Molekülen ist, mit denen es in vivo natürlich assoziiert ist. Vorzugsweise beträgt die Reinheit der Präparation mindestens 75 Gew.-%, bevorzugter mindestens 90 Gew.-%, und am meisten bevorzugt mindestens 99 Gew.-%. Ein im Wesentlichen reines TADG-15-Protein kann beispielsweise durch Extraktion aus einer natürlichen Quelle; durch Expression einer rekombinanten Nukleinsäure, die ein TAGD-15-Protein kodiert; oder durch chemische Synthese des Proteins erhalten werden. Die Reinheit kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren gemessen werden, z. B. durch Säulenchromatografie, wie der Immunaffinitätschromatografie unter Verwendung eines für TAGD-15 spezifischen Antikörpers, durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese oder durch HPLC-Analyse. Ein Protein ist im Wesentlichen frei von natürlich assoziierten Bestandteilen, wenn es von mindestens einigen dieser Verunreinigungen abgetrennt ist, die es in seinem natürlichen Zustand begleiten. Ein Protein, das in einem zellulären System chemisch synthetisiert oder erzeugt wird, welches sich von der Zelle unterscheidet, aus der es natürlicherweise abstammt, ist somit entsprechend der Definition im Wesentlichen frei von seinen natürlich assoziierten Bestandteilen. Demgemäß schließen im Wesentlichen reine Proteine eukaryotische Proteine ein, die in E. coli, anderen Prokaryoten oder jedem anderen Organismus, in dem sie nicht natürlich vorkommen, synthetisiert werden.
Zusätzlich zu den Proteinen, die im Wesentlichen Volllängen-Proteinen sind, schließt die vorliegende Erfindung auch Fragmente (z. B. antigene Fragmente) des TAGD-15-Proteins (SEQ ID Nr. 2) ein. Ein „Fragment" besteht, angewendet auf ein Polypeptid, üblicherweise aus mindestens 10 Resten, typischerweise aus mindestens 20 Resten und bevorzugter aus mindestens 30 (z. B. 50) Resten in der Länge, aber weniger als der gesamten intakten Sequenz. Fragmente des TAGD-15-Proteins können durch Verfahren erzeugt werden, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. durch enzymatische Verdauung von natürlich vorkommendem oder rekombinantem TAGD-15-Protein, durch rekombinante DNA-Arbeitstechniken unter Verwendung eines Expressionsvektors, der ein definiertes Fragment von TAGD-15 kodiert, oder durch chemische Synthese. Die Fähigkeit eines Kandidaten-Fragments, die Eigenschaften von TAGD-15 aufzuweisen (z. B. die Bindung an einen für TAGD-15 spezifischen Antikörper), kann durch die hier beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Gereinigtes TAGD-15 oder antigene Fragmente von TAGD-15 können verwendet werden, um neue Antikörper zu erzeugen oder vorhandene Antikörper zu testen (z. B. als Positivkontrollen in einem diagnostischem Assay), indem Standardverfahren angewendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Eingeschlossen in die vorliegende Erfindung sind polyklonale Antiseren, die durch Verwendung von TAGD-15 oder einem Fragment von TAGD-15 als das Immunogen in z. B. Kaninchen erzeugt wurden. Zur Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper werden Standardverfah ren angewendet, die dem Fachmann bekannt sind. Die durch dieses Verfahren erzeugten monoklonalen Antikörper können bezüglich ihrer Fähigkeit, rekombinante TAGD-15 cDNA-Klone zu identifizieren, und sie von bekannten cDNA-Klonen zu unterscheiden, durchgemustert werden.
Eingeschlossen in die vorliegende Erfindung sind des weiteren TAGD-15 Proteine, die mindestens teilweise durch gewisse Anteile von SEQ ID Nr. 2 kodiert werden, z. B. Produkte von alternativen mRNA-Splicing-Ereignissen oder alternativen Proteinentwicklungsergeignissen, oder in denen ein Abschnitt der TAGD-15-Sequenz deletiert worden ist. Das Fragment oder das intakte TAGD-15-Polypeptid kann kovalent an ein anderes Polypeptid gebunden sein, z. B. an eines, das als ein Marker, ein Ligand oder ein Mittel zur Erhöhung der Antigenizität wirkt.
Die vorliegende Erfindung schließt auch einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper ein, der spezifisch an TAGD-15 bindet. Die Erfindung umfasst nicht nur einen intakten monoklonalen Antikörper, sondern auch immunologisch wirksame Antikörper-Fragmente, z. B. ein Fab- oder (Fab)₂-Fragment; ein erzeugtes einzelkettiges Fv-Molekül; oder ein chimäres Molekül, z. B. einen Antikörper, der die Bindungsspezifität eines Antikörpers enthält, der z. B. von der Maus abstammt, sowie die verbleibenden Anteile eines anderen Antikörpers, der z. B. humanen Ursprungs ist.
In einer Ausführungsform kann der Antikörper oder ein Fragment davon an ein Toxin oder an eine nachweisbare Markierung gebunden sein, z. B. an eine radioaktive Markierung, nicht-radioaktive Isotopen-Markierungen, fluoreszierende Markierung, chemilumineszierende Markierung, paramagnetischen Markierung, Enzym-Markierung oder kolorimetrische Markierung. Beispiele für geeignete Toxine schließen Diphtherie-Toxin; Pseudomonas exotoxin A, Ricin und Cholera-Toxin ein. Beispiele für geeignete Enzym-Markierungen schließen Maleathydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, δ-5-Steroid-Isomerase, Alkoholdehydro genase, α-Glycerolphosphatdehydrogenase, Triosephosphat-Isomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholinesterase usw. ein. Beispiele für geeignete radioisotopische Markierungen schließen ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C usw. ein.
Paramagnetische Isotope zur Verwendung in der in vivo-Diagnostik können gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden. Es gibt zahlreiche Beispiele für Elemente, die für die Magnet-Resonanz-Bildgebung geeignet sind. Erörterungen bezüglich der in vivo-kernmagnetischen-Resonanz-Bildgebung siehe beispielsweise Schaefer et al., (1989) JACC 14, 472–480; Shreve et al., (1986) Magn. Reson. Med. 3, 336–340; Wolf, G. L., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93–95; Wesbey et al., (1984), Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145–155; Runge et al., (1984) Invest. Radiol. 19, 408–415. Beispiele für geeignete fluoreszierende Markierungen schließen eine Fluorescin-Markierung, eine Isothiocylat-Markierung, eine Rhodamin-Markierung, eine Phycoerythrin-Markierung, eine Phycocyanin-Markierung, eine Allophycocyanin-Markierung, eine Ophthaldehyd-Markierung, eine Fluorescamin-Markierung usw. ein. Beispiele für chemiluminesziernde Markierungen schließen eine Luminal-Markierung, eine Isoluminal-Markierung, eine aromatische Acridiniumester-Markierung, eine Imidazol-Markierung, eine Acridiuniumsalz-Markierung, eine Oxalatester-Markierung, eine Luciferin-Markierung, eine Luciferase-Markierung, eine Aequorin-Markierung usw. ein.
Dem Fachmann sind weitere geeignete Markierungen bekannt, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Die Bindung dieser Markierungen an Antikörper oder an Fragmente davon kann unter Verwendung von Standardverfahren erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. Typische Verfahren sind von Kennedy et al., (1976) Clin. Chem. Acta 70, 1–31; und Schurs et al., (1977) Clin. Chem. Acta 81, 1–40 beschrieben. Die im letzteren Hinweis erwähnten Kupp lungsverfahren sind das Glutaraldehyd-Verfahren, das Perjodat-Verfahren, das Dimaleimid-Verfahren, das m-Maleimidbenzyl-N-hydroxy-succinimidesterverfahren. Alle diese Verfahren sind durch diesen Hinweis in die vorliegende Erfindung aufgenommen.
Im Bereich der vorliegenden Erfindung liegt auch ein Verfahren zum Nachweisen von TAGD-15-Protein in einer biologischen Probe, welches die Schritte des In-Kontakt-Bringens der Probe mit dem markierten Antikörper, wie z. B. einem für TAGD-15 spezifischen, radioaktiv markierten Antikörper, und des Nachweisens der Bindung des Antikörpers an einen Bestandteil der Probe einschließt.
Wie erwähnt, liefert die vorliegende Erfindung zahlreiche Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten auf dem Gebiet der Diagnostik. Das TAGD-15-Protein ist beispielsweise zum Diagnostizieren von Krebs in verschiedenen Geweben geeignet, da dieses Protein in Tumorzellen hoch überexprimiert ist. Antikörper (oder Antigen-bindende Fragmente davon), die an ein für TAGD-15 spezifisches Epitop binden, sind für ein Verfahren zum Nachweisen von TAGD-15 Protein in einer biologischen Probe sowie zur Diagnostik von Krebs oder neoplastischen Transformationen geeignet. Dieses Verfahren schließt die Schritte des Erhaltens einer biologischen Probe (z. B. Zellen, Blut, Plasma, Gewebe usw.) von einem möglicherweise an Krebs erkrankten Patienten, das Inkontaktbringen der Probe mit einem für TAGD-15 spezifischen, markierten Antikörper (z. B. radioaktiv markierter Antikörper) und das Nachweisen von dem TAGD-15-Protein unter Anwendung herkömmlicher Immunassay-Verfahren, wie einem ELISA, ein. Die Antikörper-Bindung an die biologische Probe weist darauf hin, dass die Probe einen Bestandteil enthält, der spezifisch an ein Epitop innerhalb von TAGD-15 bindet.
In Übereinstimmung mit herkömmlichen Northern-Hybridisierungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, kann in ähnlicher Weise ein Northern-Blot-Assay verwendet werden, um die relativen Mengen an TAGD-15-mRNA in einer Zelle oder in Gewebe zu ermitteln, die von einem Patienten erhalten wurden, der möglicherweise an Krebs erkrankt ist. Dieses Northern-Assay verwendet eine Hybridisierungssonde, z. B. radioakiv markierte TAGD-15-cDNA, die entweder die einzelsträngige Volllängen-DNA mit einer Sequenz, die komplementär zu SEQ ID Nr. 1 (9) ist, oder ein Fragment dieser DNA-Sequenz mit mindestens 20 (vorzugsweise mindestens 30, bevorzugter mindestens 50, und am meisten bevorzugt mindestens 100) aufeinanderfolgenden Nukleotiden enthält. Die DNA-Hybridisierungssonde kann durch jedes der vielen verschiedenen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, markiert sein.
Antikörper gegen das TAGD-15-Protein können in einem Immunoassay verwendet werden, um erhöhte Expressionsspiegel an TAGD-15-Protein in Geweben nachzuweisen, in denen möglicherweise eine neoplastische Transformation erfolgt ist. Mit den Northern-Blot-Assays und -Analysen kann der gleiche Nutzen erreicht werden.
Die vorliegende Erfindung ist auf eine DNA gerichtet, die ein TAGD-15-Protein kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) isolierter DNA, die ein TAGD-15-Protein kodiert; und (b) isolierter DNA, die sich von der isolierten DNA aus (a) bezüglich der Codonsequenz infolge der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, und die ein TAGD-15-Protein kodiert. Vorzugsweise hat die DNA die in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Sequenz. Bevorzugter kodiert die DNA ein TAGD-15-Protein mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Sequenz.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf einen Vektor gerichtet, der in der Lage ist, die erfindungsgemäße DNA zu exprimieren, angepasst an die Expression in einer rekombinanten Zelle sowie regulatorische Elemente, die für die Expression der DNA in der Zelle erforderlich sind. Vorzugsweise enthält der Vektor DNA, die ein TAGD-15-Protein mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf eine Wirtszelle gerichtet, die mit dem vorstehend beschriebenen Vektor transfiziert ist, wobei der Vektor ein TAGD-15-Protein exprimiert. Veranschaulichungen für Wirtszellen schließen Bakterienzellen, Säugetierzellen und Insektenzellen ein.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein isoliertes und gereinigtes TAGD-15-Protein gerichtet, das durch eine DNA kodiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) isolierter DNA, die ein TAGD-15 Protein kodiert; und (b) isolierter DNA, die sich von der isolierten DNA aus (a) bezüglich der Codonsequenz infolge der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, und die ein TAGD-15-Protein kodiert. Vorzugsweise hat das isolierte und gereinigte TAGD-15-Protein aus Anspruch 9 die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zum Nachweisen der Expression des Proteins aus Anspruch 1 gerichtet, umfassend die Schritte: (a) In-Kontakt-Bringen von mRNA, die von der Zelle erhalten wurde, mit der markierten Hybridisierungssonde; und (b) Nachweisen einer Hybridisierung der Sonde mit der mRNA.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung verschiedener Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sie schränken die vorliegende Erfindung in keiner Weise ein.
Beispiel 1
Gewebesammlung und -lagerung
Nach der Hysterektomie oder der bilateralen Salpingo-Oophorektomie eines Patienten oder der operativen Entfernung von neoplastischen Gewebe werden die Proben erfasst und auf Eis gelagert. Die Proben wurden anschließend dem Pathologen zum Isolieren und Identifizieren von spezifischen Gewebeproben übergeben. Abschließend wurden die Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren, in das Laborprotokoll eingetragen und bei –80°C gelagert. Zusätzliche Proben wurden häufig von Cooperative Human Tissue Network (CHTN) erhalten. Diese Proben wurden von CHTN präpariert und uns auf Trockeneis geliefert. Nach der Ankunft wurden diese Proben, in das Laborprotokoll eingetragen und bei –80°C gelagert.
Beispiel 2
Isolieren von mRNA und Synthese von cDNA
41 Eierstock-Tumore (10 gering maligne potenzielle Tumore und 31 Karzinome) und 10 normale Eierstöcke wurden aus Operationsproben erhalten und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die humanen Eierstock-Karzinom-Zelllinien SW 626 und Caov 3, die humanen Brust-Karzinom-Zelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-435S, und die vom humanen zervikalen Gebärmutter-Karzinom abgeleitete Zelllinie Hela wurden von American Type Culture Collection (Rockville, MD) bezogen. Die Zellen wurden bis zur Subkonfluenz in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, suspendiert mit 10% (v/v) fötalem Rinderserum und Antibiotika, kultiviert.
Das Isolieren von Messenger-RNA (mRNA) wurde unter Verwendung des Mini RiboSep^TM Ultra mRNA-Isolierungskits von Becton Dickinson (Kat. #30034) entsprechend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Dies war ein auf Oligo(dT)-Chromatografie basierendes System für das Isolieren von mRNA. Die Menge an gewonnener mRNA wurde durch UV-Spektrophotometrie quantifiziert.
DNA, komplementär bezüglich des ersten Strangs (cDNA), wurde unter Verwendung von 5,0 mg mRNA und entweder einem zufälligen Hexamer oder Oligo(dT)-Primern mittels eines Erst-Strang-Synthese-Kits von Clontech (Kat. #K1402-1) entsprechend den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Die Reinheit der cDNA wurde durch PCR unter Anwendung von Primern durchgeführt, die für das p53-Gen spezifisch sind. Diese Primer umspannen ein Intron derart, dass reine cDNA von cDNA unterschieden werden kann, die mit genomer DNA verunreinigt ist.
Beispiel 3
PCR-Reaktionen
Die mRNA-Überexpression von TAGD-15 wurde unter Anwendung einer quantitativen PCR bestimmt. Die nachfolgenden Oligonukleotid-Primer wurden verwendet für: TAGD-15, vorwärts 5'-ATGACAGAGGATTCAGGTAG-3' (SEQ ID Nr. 10) und rückwärts 5'-GAAGGTGAAGTCATTGAAGA-3' (SEQ ID Nr. 11); und β-Tubilin, vorwärts 5'-TGCATTGACAACGAGGC-3' (SEQ ID Nr. 12) und rückwärts CTGTCTTGACATTGTTG-3' (SEQ ID Nr. 13). β-Tubulin diente als eine interne Kontrolle. Die Reaktion wurden folgendermaßen durchgeführt: aus 50 ng mRNA erzeugter Erst-Strang cDNA wird als Templat in Anwesenheit von 1,0 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs, 0,025 U Taq-Polymerase/ml Reaktionslösung und 1 × Puffer mit Enzym verwendet. Zudem müssen die Primer der PCR-Reaktion zugesetzt werden. Degenerierte Primer, die eine Vielzahl von cDNAs amplifizieren können, werden mit einer Endkonzentration von jeweils 2,0 mM verwendet, wohingegen die Primer, die spezifische cDNA amplifizieren, bis zu einer Endkonzentration von jeweils 0,2 mM zugesetzt werden.
Nach der 3-minütigen initialen Denaturierung bei 95°C wurden 30 PCR-Zyklen in einem Gene Amp 2400 Thermocycler von Perkin-Elmer durchgeführt. Jeder Zyklus besteht aus 30 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 30 Sekunden Primer-Annealing bei der geeigneten Annealing-Temperatur und 30 Sekunden Extension bei 72°C. Der abschließende Zyklus bei 72°C erfolgt über 7 Minuten. Um sicherzustellen, dass die Reaktion erfolgreich war, wird eine Fraktion des Gemisches in einem 2% Agarose/TEA-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt (Endkonzentration 1 mg/ml). Die Annealing-Temperatur variiert entsprechend der in der PCR-Reaktion verwendeten Primer. Für Reaktionen mit degenerierten Primern wurde eine Annealing-Temperatur von 48°C verwendet. Die geeignete Annealing-Temperatur für die TAGD-15 und β-Tubulin spezifischen Primer beträgt 62°C.
Beispiel 4
T-Vektor Ligation und Transformationen
Die gereinigten PCR-Produkte wurden in das T-Vektor-Plasmid von Promega ligiert und die Ligationsprodukte wurden in kompetente JM109-Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers transformiert (Promega, Kat. #A3610). Die positiven Kolonien wurden für die Amplifikation kultiviert, die Plasmid-DNA mittels des Wizard^TM Miniprep DNA-Reinigungssystems (Promega, Kat. #A7500) isoliert und die Plasmide mit den Restriktionsenzymen ApaI und SacI verdaut, um die Größe des Inserts zu bestimmen. Plasmide mit Inserts, deren Größe(n) durch die vorstehend beschriebene Gel-Elektrophorese für die PCR-Produkt sichtbar gemacht wurde(n), wurden sequenziert.
Beispiel 5
DNA-Sequenzierung
Unter Verwendung eines Plasmid spezifischen Primers nahe der Klonierungsstelle wurden die Sequenzierungsreaktionen mittels PRISM^TM Ready Reaction Dye Deoxy^TM Terminatoren (Applied Biosystems, Kat. #401384) gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Reste der Farbstoff-Terminatoren wurden nach Abschluss der Sequenzierungsreaktion unter Verwendung einer Centri-Sep^TM Spin-Säule (Princeton Separation, Kat. #CS901) entfernt. Ein DNA-Sequenzierungssystem Modell 373A von Applied Biosystems stand zur Verfügung und wurde für die Sequenzierungsanalyse verwendet. Basierend auf der ermittelten Sequenz wurden Primer entworfen und synthetisiert, die das interessierende Gen spezifisch amplifizieren.
Beispiel 6
Northern-Blot-Analyse
10 μg mRNAs wurden entsprechend der Größe in einem 1% Formaldehyd-Agarose-Gel in 0,02 M MOPS, 0,05 M Natriumacetat (pH 7,0) und 0,001 M EDTA elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurden die mRNAs durch Kapillarwirkung in 20 × SSPE auf Hybobond-N (Amersham) geblottet. Die mRNAs wurden durch 2-stündiges Erwärmen auf 80°C auf die Membran fixiert. Zusätzliche Multiple-Tissue-Northern-Blots (MTN) wurden von CLONTECH Laboratories, Inc. bezogen. Die Blots schließen den Human MTN Blot (Kat. #7760-1), den Human MTN II Blot (Kat. #7759-1), den Human Fetal MTN II Blot (Kat. #7756-1 und den Human Gehirn MTN III Blot (Kat. #7750-1) ein. Die geeigneten Sonden wurden unter Verwendung des Prime-a-Gene-Markierungssystems von Promega (Kat. #U1100) radioaktiv markiert. Die Blots wurden gemäß dem ExpressHyp Hybridisierungsprotokoll von CLONTECH (Kat. #8015-1 oder 8015-2) sondiert und gestrippt.
Beispiel 7
Quantitative PCR
Die quantitative PCR wurde in einem Reaktionsgemisch, bestehend aus cDNA, abgeleitet von 50 ng mRNA, 5 pMol Sense- und Antisense-Primern für TAGD-15 und der internen Kontrolle β-Tubulin, 0, 2 mmol dTNPs, 0, 5 mCi [α-³²P] dCTP und 0, 625 U Taq-Polymerase in 1 × Puffer in einem Endvolumen von 25 ml durchgeführt. Dieses Gemisch wurde 1 Minute der Denaturierung bei 95°C unterzogen, gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung für 30 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden Annealing bei 62°C und 1 Minute Extension bei 72°C mit weiteren 7 Minuten Extension im letzten Zyklus. Das Produkt wurde in einem 2% Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und das Gel wurde unter Vakuum getrocknet und der Autoradiografie unterzogen. Die relative Radioaktivität jeder Bande wurde durch den PhosphoImager von Molecular Dynamics bestimmt.
Beispiel 8
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von Primern, die auf konservierte Gebiete der Serinproteasen-Familie gerichtet sind, um Mitglieder dieser Familie zu identifizieren, die in Karzinomen überexprimiert sind. In anderen Geweben wurden mehrere Gene identifiziert und kloniert, jedoch bislang keine, die mit Eierstock-Karzinomen assoziiert sind. Die vorliegende Erfindung beschreibt eine in Eierstock-Karzinomen identifizierte Protease. Dieses Gen wurde unter Verwendung von Primern für die konservierte Domäne identifiziert, welche die katalytische Domäne der konservierten Aminosäure Histidin umgibt und die stromaufwärts konservierte Aminosäure Serin, die annähernd 150 Aminosäuren in Richtung des carboxyterminlane Endes der Protease liegt.
Das Gen, das die neuartige erfindungsgemäße extrazelluläre Serinprotease kodiert, wurde aus einer Gruppe von Proteasen, die in Karzinomen überexprimiert sind, durch Subklonierung und Sequenzierung der geeigneten PCR-Produkte identifiziert. Ein Beispiel für eine derartige PCR-Reaktion ist in 1 dargestellt. Die Subklonierung und Sequenzierung individueller Banden aus einer derartigen Amplifikation liefern eine Grundlage für die Identifizierung der erfindungsgemäßen Protease.
Beispiel 9
Die für die katalytische Domäne von TAGD-15 ermittelte Sequenz ist in 2 dargestellt und sie stimmt mit der anderer Serinproteasen überein und enthält insbesondere konservierte Aminosäuren, die der katalytischen Domäne der Trypsinähnlichen Protease-Familie entsprechen. Es wurden spezifische, von dieser Sequenz abgeleitete Primer (20mers) verwendet.
Um die Expression des TAGD-15-Gens in Eierstock-Karzinomen zu bestimmen, wurde eine Reihe cDNAs untersucht, die von normalen Geweben und Tumoren abgeleitet sind. In einer Reihe von cDNAs, die aus normalen Geweben abgeleitet sind, war TAGD-15 im Vergleich zu den aus Karzinomen abgeleiteten cDNAs, unter Verwendung von β-Tubulin als interne Kontrolle für die PCR-Amplifikation, in allen untersuchten Karzinomen wesentlich überexprimiert und es wurde in normalem Epithelgewebe entweder nicht nachgewiesen oder in einem sehr geringen Grad nachgewiesen (3). Diese Bewertung wurde auf eine Standardreihe von etwa 40 Tumore ausgedehnt. Unter Verwendung dieser spezifischen Primer wurde auch die Expression dieses Gens in sowohl von Eierstock- als auch von Brust-Karzinom-Gewebe abgeleiteten Tumorzelllinien untersucht, wie in 5 dargestellt, und in anderen Tumorgewebe, wie in 6 dargestellt. Die Expression von TAGD-15 wurde auch in Karzinomen von Brust, Kolon, Prostata und Lunge beobachtet.
Unter Verwendung der spezifischen Sequenz für TAGD-15, die die gesamte Domäne der katalytischen Stelle abdeckt, als eine Sonde für die Northern-Blot-Analyse, wurden drei Northern Blots untersucht: einer, abgeleitet aus Eierstock-Geweben, sowohl aus normalem Gewebe als auch Tumorgewebe; einer aus fötalen Geweben; und einer aus adulten normalen Geweben. Wie in 7 dargestellt, wurden in allen Eierstock-Karzinomen TAGD-15 Transkripte beschrieben, sie waren jedoch in allen den nachfolgenden Gewebeproben nicht in nachweisbaren Spiegeln vorhanden: a) normaler Eierstock, b) fötale Leber und Hirn, c) adulte Milz, Thymus, Hoden, Eierstock und periphere Blut-Lymphozyten, d) skeletaler Muskel, Leber, Hirn oder Herz. Es wurde festgestellt, dass die Größe des Transkripts annähernd 3,2 kB betrug. Die Hybridisierung für die fötalen und adulten Blots war sachgerecht und erfolgte mit der gleichen Sonde wie bei Eierstock-Gewebe. Im Anschluss an diese Untersuchung wurde festgestellt, dass diese Blots andere nachweisbare mRNA-Transkripte enthielten.
Durch die anfängliche Verwendung der katalytischen Domäne der Protease zum Sondieren von Hela cDNA und Eierstock-Tumor cDNA-Libraries wurde ein Klon erhalten, der das gesamte 3'-Ende des TAGD-15-Gens aus der Eierstock-Tumor-Library abdeckt. Durch das nachfolgende Durchmustern unter Verwendung des 5'-Endes der neu nachgewiesenen Klone wurden zwei weitere Klone identifiziert, die das 5'-Ende des TAGD-15-Gens aus der Hela-Library abdecken (8). Die vollständige Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1) wird in 9 gemeinsam mit der Translation des offenen Leserasters (SEQ ID Nr. 2) geliefert.
In der Nukleotidsequenz gibt es eine Kozak-Sequenz, die für Sequenzen typisch ist, die sich stromabwärts von der Translationsinitiationsstelle befinden. Es gibt auch eine Polyadenylierungssignalsequenz und einen polyadenylierten Schwanz. Das offene Leseraster besteht aus einer, aus 855 Aminosäuren bestehenden Sequenz (SEQ ID Nr. 2), die einen aminoterminalen cytoplasmatischen Schwanz aus den Aminosäuren 1–50 und eine aus annähernd 22 Aminosäuren bestehenden Transmembran-Domäne einschließt, gefolgt von einer extrazellulären Sequenz, der zwei sich wiederholende CUB-Einheiten vorangehen, die aus den Komplement-Subbestandteilen Clr und Cls identifiziert wurden. Diesen beiden sich wiederholenden Einheiten folgen vier sich wiederholende Domänen eines Klasse A-Motifs des LDL-Rezeptors und diesen vier Wiederholungen folgt das Protease-Enzym der Trypsin-Familie, die aus dem carboxyterminalen Ende des TAGD-15 Proteins besteht (11). Auch eine verständliche Darstellung der katalytischen Domäne des konservierten Histidins, der Asparaginsäure und der Serinreihe sowie eine Serie von konservierten Aminosäuren innerhalb der Serinprotease-Familie ist ausgewiesen (10).
Eine Suche in der GeneBank bezüglich ähnlicher, vorher identifizierter Sequenzen lieferte eine derartige Sequenz mit verhältnismäßig hoher Homologie zu einem Teil des TAGD-15-Gens. Die Ähnlichkeiten zwischen dem Teil von TAGD-15 von dem Nukleotid #182 bis 3139 und SNC-19 (SEQ ID Nr. 9; GeneBank Zugangsnummer #U20428) beträgt annähernd 97% (12). Es gibt jedoch wesentliche Unterschiede zwischen SNC-19 und TAGD-15, d. h. TAGD-15 hat ein offenes Leseraster von 855 Aminosäuren, wohingegen das längste offene Leseraster von SNC-19 nur 173 Aminosäuren beträgt. SNC-19 schließt weder eine korrekte Startstelle für die Initiation der Translation ein, noch den aminoterminalen Anteil des Proteins, der durch TAGD-15 kodiert wird. Außerdem schließt SNC-19 kein offenes Leseraster für eine funktionelle Serinprotease ein, da die His-, Asp- und Ser- Reste, die für die Funktion notwendig sind, in verschiedenen Leserastern kodiert werden.
TAGD-15 ist ein in Tumoren stark überexprimiertes Gen. Es wird in einer begrenzten Anzahl von normalen Geweben exprimiert, vorrangig in Geweben, die entweder an der Aufnahme oder Sekretion von Molekülen beteiligt sind, wie z. B. Kolon und Pankreas. TAGD-15 ist des weiteren neuartig bezüglich der Struktur der Domänen, indem es eine katalytische Protease-Domäne aufweist, die freigesetzt werden kann und die als ein diagnostisches Mittel verwendet werden kann und ein potenzielles Ziel für therapeutische Interventionen sein kann. TAGD-15 besitzt auch Liganden-Bindungsdomänen, die häufig mit Molekülen assoziiert sind, die Liganden von der äußeren Oberfläche der Zelle verinnerlichen oder aufnehmen können, so wie der LDL-Rezeptor unter Bildung des LDL-Cholesterin-Komplexes. Diese Domänen können an der Aufnahme spezifischer Liganden beteiligt sein und sie sind potenziell in der Lage, toxische Moleküle oder Gene an Tumorzellen abzugeben, die dieses Molekül an ihrer Oberfläche exprimieren. Es weist Merkmale auf, die denen des Hepsin-Serinprotease-Moleküls ähnlich sind, indem sie gleichfalls eine aminoterminale Transmembran-Domäne, mit der proteolytischen katalytischen Domäne, die sich in die extrazelluläre Matrix ausdehnt, aufweisen. Der Unterschied ist hier, dass TAGD-15 diese sich wiederholenden Liganden-Bindungsdomänen einschließt, die das Hepsin-Gen nicht hat. Zusätzlich zu der Verwendung dieses Gens als ein diagnostisches oder therapeutisches Ziel bei Gebärmutter-Karzinomen oder anderen Karzinomen, einschließlich Brust, Prostata, Lunge und Kolon, kann seine Liganden-Bindungsdomäne bezüglich der Aufnahme spezifischer Moleküle in Tumorzellen wertvoll sein.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Patente oder Veröffentlichungen sind an den Fachmann gerichtet, den die vorliegende Erfindung betrifft. Ein Fachmann wird schnell einschätzen können, dass die Erfindung an die Durchführung der Gegenstände, und die Gewinnung der Endprodukte und erwähnten Vorteile gut angepasst ist. Die vorliegenden Beispiele sowie die Verfahren, Verfahrensweisen, Behandlungen, Moleküle und spezifischen Verbindungen, die beschrieben sind, sind Veranschaulichungen der bevorzugten Ausführungsformen, sie sind beispielhaft und schränken den Bereich der Erfindung in keiner Weise ein. Dem Fachmann werden Änderungen und weitere Verwendungen deutlich, die vom Erfindungsgedanken umfasst sind, wie durch den Umfang der Ansprüche definiert.
Sequenz-Listing

Claims

Isolierte DNA, die ein TADG-15 Protein kodiert, wobei die genannte DNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) isolierter DNA, bestehend aus SEQ ID Nr. 1, und (b) isolierter DNA, die sich von der isolierten DNA aus (a) in der Codonsequenz infolge der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet und die ein TADG-15 Protein kodiert.
DNA nach Anspruch 1, wobei das genannte TADG-15 Protein aus der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Vektor, umfassend die DNA aus Anspruch 1 sowie regulatorische Elemente, die zur Expression der DNA in der Zelle notwendig sind.
Vektor nach Anspruch 3, wobei die genannte DNA ein TADG-15 Protein mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert.
Wirtszelle, die mit dem Vektor aus Anspruch 3 transfiziert ist, wobei der genannte Vektor ein TADG-15 Protein exprimiert.
Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei die genannte Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Säugetierzellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen.
Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei die genannte Bakterienzelle E. coli ist.
Isoliertes und gereinigtes TADG-15 Protein, das durch DNA kodiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) isolierter DNA, bestehend aus SEQ ID Nr. 1; und (b) isolierter DNA, die sich von isolierter DNA aus (a) in der Codonsequenz infolge der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet und die ein TADG-15 Protein kodiert.
Isoliertes und gereinigtes TADG-15 Protein nach Anspruch 8, wobei das genannte Protein aus der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Verfahren zum Nachweisen der Expression des Proteins nach Anspruch 8, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkontaktbringen von mRNA, die von der Zelle erhalten wurde, mit der markierten Hybridisierungssonde von der DNA aus Anspruch 1; und (b) Nachweisen einer Hybridisierung der Sonde mit der mRNA.