DE69733491T2

DE69733491T2 - In Krebszellen überexprimiertes Genprodukt

Info

Publication number: DE69733491T2
Application number: DE69733491T
Authority: DE
Inventors: E. Russel KAUFMAN; A. Kimberly SLENTZ-KESLER
Original assignee: University of Durham; Duke University
Current assignee: University of Durham; Duke University
Priority date: 1996-11-22
Filing date: 1997-11-24
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2017-11-25
Also published as: US5912142A; EP0960128A4; EP0960128B1; WO1998022502A1; AU5455798A; EP0960128A1; ATE297409T1; DE69733491D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf ein mit Krebs in Beziehung stehendes Protein und auf eine Nucleinsäuresequenz, die dasselbe kodiert. Besonders bezieht sich die Erfindung auf ein in gewissen neoplastischen Zellen, einschließlich Brust- und Eierstockkrebszellen, überexprimiertes Protein, auf seine kodierende Sequenz und auf denselben basierenden Diagnose- und Behandlungsmethodologien.
HINTERGRUND
Brustkrebs stellt die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität in Frauen in Nordamerika dar (Harris et al., New Eng. J. Med., 327: 319, 390 und 473 (1992)). Es wird allgemein angenommen, dass diese Malignität von einem Vielschrittprozess stammt, der Mutationen in einer vergleichsweise geringen Anzahl von Genen, vielleicht 10 oder weniger, involviert. Diese Mutationen resultieren in signifikanten Änderungen in dem Wachstum und der Differenzierung von Brustgewebe, die ihm ermöglichen, unabhängig von normalen Zellkontrollen zu wachsen, zu metastasieren und der Immunüberwachung zu entkommen. Die genetische Heterogenität der meisten Brustkrebse legt nahe, dass sie aus einer Reihe von einleitenden Ereignissen herrühren und dass die Eigenschaften der einzelnen Krebsarten an dem Gesamtmuster genetischer Änderungen liegen, die sich anhäufen (Harris et al., New Eng. J. Med., 327: 319, 390 und 473 (1992)).
Die Genklassen, die in Brustkrebs involviert sind, sind jenen nicht unähnlich, die in einer Anzahl von anderen wohl charakterisierten Malignitäten gefunden werden, obwohl gewisse hochspezifisch für Brustkrebs sind. Besonders Mutationen in den Genen, die Rezeptoren kodieren, welche bei der Bindung an Östrogen und Progesteron involviert sind, sind besonders wichtig, da sie wahrscheinlich Brustzellen dazu bringen, zu proliferieren, während sie sie unansprechend auf die Antitumorwirkungen dieser Hormone bei fortgeschrittener Malignität machen. Zusätzlich sind Änderungen in den Genen, die Wachstumsfaktoren, andere Rezeptoren, Signaltransduktionsmoleküle und Transkriptionsfaktormoleküle kodieren, häufig involviert und haben Änderungen, die in die Entwicklung und das Fortschreiten von Brustkrebs involviert sind (King, Nature Genetics, 2: 125 (1992)). Die Charakterisierung der Art und Anzahl an Mutationen, die in einzelnen Brustkrebsen gesehen werden, ist bei der Klassifizierung der biologischen Eigenschaften einzelner Krebse und bei der Bestimmung der Prognose für einzelne Patienten nützlich. Zum Beispiel ist das erbB2/HER2/neu-Gen besonders wertvoll bei der Vorhersage der Prognose von sowohl Knoten positiven als auch Knoten negativen Patienten, basierend auf dem Amplifikationszustand des Gens (King, Science, 250: 1684 (1990)). Etliche zusätzliche Mitglieder dieser Familie wurden entdeckt, der Ligand für erbB2/HER2/neu bleibt jedoch unbekannt. Es wird erwartet, dass weitere Fortschritte bei Therapeutika durch die Entwicklung von Therapien erreicht werden, die fehlerhafte Wachstumssignalisierungswege unterbrechen oder die zellulären Wechselwirkungen von Brustkrebszellen mit nativem Stroma oder mit metastatischen Stellen beeinflussen.
Obwohl Onkogene wahrscheinlich sehr wichtig beim Brustkrebs sind, können Tumorsuppressorgene ebenfalls eine wichtige Rolle spielen. Gewisse dieser Gene, einschließlich p53 und Rb-1, sind für die normalen Mechanismen essenziell, die Zellzyklusereignisse kontrollieren, insbesondere jene Kontrollpunkte an der Grenze der unterschiedlichen Stadien des Zellzyklus (Hollstein et al., Science, 253: 49 (1991); Srivastava et al., Nature, 348: 747 (1990)).
1969 dokumentierten Li und Fraumeni ein familiäres Krebssyndrom, das ein autosomaldominantes Expressionsmuster hatte (Li et al., Ann. Intern. Med., 71: 747 (1969)). Mitglieder dieser Familien hatten Sarkome, Brustkrebse, Gehirntumore, Leukämien, adrenokortikale Karzinome und andere Malignitäten. Familienuntersuchungen zeigten, dass das für das Syndrom verantwortliche Gen auf dem Chromosom 17 lokalisiert war und die Untersuchung des p53-Gens als ein Kandidatengen enthüllte, dass dieses Gen in fünf Familien mutiert war (Malsin et al., Science, 250: 1233 (1990)). In den letzten beiden Jahren wurden zwei Gene, die mit familiärem Brustkrebs verbunden sind, bezeichnet BRCA1 und BRCA2, isoliert und charakterisiert. BRCA1 befindet sich an 17q21 (Claus et al., Am. J. Epidemiology, 131: 961 (1990); Hall et al., Science, 250: 1684 (1990); Easton et al., Am. J. of Human Genetics, 52 (4): 678 (1993); Black et al., Am. J. of Human Genetics 52 (4): 702 (1993); Bowcock et al., Am. J. of Human Genetics, 52 (4): 718 (1993); Miki et al., Science, 266: 66 (1995)). Die Demonstration des Verlusts der Heterozygotie (LOH; loss of heterozygosity) an 17q25 definierte ein weiteres mögliches Tumorsuppressorgen (Lindblom et al., Human Genetics, 91: 6 (1993); Cornelis et al., Oncogene 8: 781 (1993); Theile et al., Oncogene, 10: 439 (1995)).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich wenigstens zum Teil auf ein neues Gen an 17q25, bezeichnet K12. K12 kodiert ein Produkt, das durch Krebszellen, z. B. Brust- und Eierstockkrebszellen, sezerniert wird. Das Gen wird in diesen Geweben in einem Spiegel exprimiert, der wenigstens 100-mal höher ist als jener irgendeines anderen malignen oder normalen untersuchten Gewebes. Die Entdeckung des K12-Gens macht neue Tumornachweis- und -behandlungsmethodologien möglich.
ZIELE UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein allgemeines Ziel der Erfindung, ein neues, mit Krebs in Beziehung stehendes Protein und eine dasselbe kodierende Nucleinsäuresequenz bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit neoplastischer Zellen, einschließlich Brust- und Eierstockkrebszellen in einer biologischen Probe bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine Behandlung für einen neoplastischen Zustand in einem Säuger bereitzustellen, der einer solchen Behandlung bedarf.
Es ist noch ein anderes Ziel der Erfindung, ein Verfahren zum Screening von Verbindungen bereitzustellen, für ihre Fähigkeit, an das K12-Genprodukt zu binden oder seine Aktivität zu ändern.
In einer Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine isolierte Nucleinsäure, die ein Säuger-K12-Protein kodiert, welches die in 2 (SEQ ID Nr. 2) gezeigte Sequenz hat oder eine Sequenz hat, welche an das Komplement der Sequenz der 2 (SEQ ID Nr. 2) bei 55°C in 3 × Kochsalz/Natriumcitrat (SSC), enthaltend 0,1% SDS, hybridisiert und welche daran gebunden bleibt, wenn sie dem Waschen bei 55°C mit 1 × SSC, enthaltend 0,1% SDS, ausgesetzt wird; einen Teil der Sequenz der 2 (SEQ ID Nr. 2) von wenigstens 15 aufeinander folgenden Basen hat; oder das Komplement dieser Nucleinsäure oder des Teils hat. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein rekombinantes Molekül, umfassend solch eine Nucleinsäure und einen Vektor, und auf eine Wirtszelle, die dasselbe umfasst. Zusätzlich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung des K12-Proteins oder einen Teil davon mit wenigstens 5 Aminosäuren, umfassend das Kultivieren der oben beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, so dass die Nucleinsäure exprimiert wird und das K12-Protein oder ein Teil davon dadurch produziert wird.
In einer weiteren Ausführung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Gegensinnkonstrukt, das einen Vektor und eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die das K12-Protein oder einen Teil davon kodiert, und das in einer Gegensinnrichtung im Verhältnis zur Richtung der Transkription orientiert ist, für die Verwendung bei der Behandlung eines neoplastischen oder prä-neoplastischen Zustandes.
In noch einer anderen Ausführung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Screening einer Testverbindung hinsichtlich ihrer Fähigkeit, an das K12-Protein zu binden oder die Wachstumsstimulationsaktivität des K12-Proteins zu ändern. Das Verfahren umfasst das Vergleichen der K12-Proteinaktivität unter Verwendung einer Kultur aus Zellen, die für die Wachstumsstimulationswirkungen des K12-Proteins empfänglich sind, in der Anwesenheit oder Abwesenheit der Testverbindung. Eine Reduktion in dem Wachstum der Zellen in der Anwesenheit der Testverbindung ist für eine inhibitorische Aktivität auf das K12-Protein der Testverbindung anzeigend und eine Zunahme in dem Wachstum der Zellen ist für eine aktivierende Aktivität auf die K12-Zellen der Testverbindung anzeigend.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 vorhergesagte Aminosäuresequenz des menschlichen K12-Genprodukts, abgeleitet aus der menschlichen K12-cDNS-Sequenz. Die unterstrichene Region ist die vorhergesagte membranüberspannende Domäne.
2 menschliche K12-cDNS-Sequenz. k12-Promotor (1-195) und cDNS (196-2180).
3A–D K12-Expression.
4 Western-Blot, der mit Antiserum gegen K12 sondiert worden ist. Konzentrierte Medien aus K562-Zellen, die transfiziert worden sind mit: 1) leerem Vektor, 2) K12 + 7aa-Flag, 3) K12 mit C-Terminus-Addition, 4) K12 voller Länge und 5) ZR75-1-Zellen (nicht transfiziert) und 6) Molekulargewichtsstandard (der kleinste ist 32 kDa). Lösliche Proteinextrakte aus K562-Zellen wurden transfiziert mit: 7) leerem Vektor, 8) K12 + 7aa-Flag, 9) K12 voller Länge und 10) ZR75-1-Zellen (nicht transfiziert).
5 subzelluläre Lokalisierung von K12 auf Golgi. Dieselbe Ansicht der ZR75-1-Zellen, die auf Objektträgern wachsen gelassen wurden, mit Aceton fixiert und doppelt gefärbt worden sind mit: A, polyklonaler Anti-K12-Antikörper, antigen-gereinigt, gefolgt von FITC-konjugiertem, sekundärem Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper aus Ziegen, und B, rhodamin-konjugiertes Weizenkeim-Agglutinin (ein immunchemischer Marker für Golgi-Körperchen).
6 Immunoperoxidasefärbung normalen Brustgewebes, A, und von Kolloid-Brustkarzinom, B, mit monoklonalem Antikörper 7C3 gegen K12. C ist eine an den Isotypen angepasste P3-Kontrolle. Dunkelbraune Färbung spiegelt monoklonale Antikörperbindung an das K12-Antigen wieder.
7 Wachstumskurven für K562-Zellen, die in Konditionierungsmedien wachsen gelassen worden sind, von: KDcmK + (v), K562-Zellen, die K12 in die Medien sezernieren, oder KdcmD + (^®), K562-Zellen, die mit einem leeren Vektor transfizieri worden sind und kein nachweisbares K12 in Medien produzieren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Säuger-K12-Genprodukt und auf dasselbe kodierende Nucleinsäuresequenz. Das K12-Genprodukt wird in gewissen Krebszellen, einschließlich Brust- und Eierstockkrebszellen, überexprimiert und stellt deshalb einen nützlichen Marker für Krebs bei Zytopathologie bereit. Da das K12-Protein durch gewisse Krebse (einschließlich Brust- und Eierstockkrebse) sezerniert wird, kann seine Anwesenheit z. B. in Serum verwendet werden bei dem Detektieren der Anwesenheit von neoplastischen Zellen und/oder dem Überwachen des Tumorfortschreitens in einem Säuger. Die Identifikation von K12 als ein mit Krebs in Beziehung stehendes Gen macht neue Verfahren der Krebsbehandlung möglich, zusätzlich zu neuen Ansätzen für die Tumordetektion.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf eine Nucleinsäuresequenz, die ein K12-Protein, genauer ein Säuger-K12-Protein, noch genauer menschliches K12-Protein, oder einen Teil jener Kodierungssequenz kodiert. Die Erfindung bezieht sich weiter auf das kodierte Protein, Polypeptid oder Peptid. Der Begriff "Teil", wie er hierin verwendet wird und wie er auf Nucleinsäuresequenzen angewandt wird, bezieht sich auf Fragmente mit wenigstens 15 Basen, bevorzugt wenigstens 30 Basen, bevorzugter wenigstens 150 Basen und am bevorzugtesten wenigstes 300 oder 500 Basen. So wie er auf Protein angewandt wird, bezieht sich der Begriff "Teil" auf Peptide und Polypeptide mit wenigstens 5 Aminosäuren, bevorzugt wenigstens 10 Aminosäuren, bevorzugter wenigstens 50 Aminosäuren und am bevorzugtesten wenigstens 100 oder 240 Aminosäuren. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf rekombinante Moleküle, umfassend die obigen Nucleinsäuresequenzen, und auf Wirtszellen, die damit transformiert worden sind. Zusätzlich bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Herstellung des Proteins, des Polypeptids oder Peptids, das in der Nucleinsäuresequenz kodiert wird, durch Kultivieren der transformierten Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zum Screening von Verbindungen für die Fähigkeit, an das K12-Genprodukt zu binden oder seine Aktivität zu ändern. Testverbindungen können für solche Fähigkeiten gescreent werden, z. B. unter Verwendung von Standardzellkulturwachstumstests und Standardbindungstests. Zusätzlich bezieht sich die Erfindung auf Krebsnachweis- und -behandlungsmethodologien, basierend auf dem K12-Protein und seiner kodierenden Sequenz.
K12-Protein, Kodierungssequenz, Verfahren zur Produktion und Anti-K12-Antikörper
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Nucleotidsequenzen, die die Aminosäuresequenz des Säuger-K12-Proteins kodieren, besonders das menschliche K12-Protein, oder Teile davon, wie oben definiert (z. B. den extrazellulären Teil, die Aminosäuren 1 bis 140). Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Nucleotidsequenzen, die die in 1 wiedergegebene Aminosäuresequenz oder Teile davon, wie oben definiert, kodieren (die in 2 wiedergegebene DNS-Sequenz ist nur ein Beispiel). Ferner schließen Nucleotidsequenzen, auf welche sich die Erfindung bezieht, jene ein, die im Wesentlichen dasselbe Protein kodieren, wie in 1 gezeigt, z. B. Inter- und Intraspeziesvariationen davon, ebenso wie funktionelle Äquivalente der in 1 gezeigten Sequenz. Die Erfindung bezieht sich ferner auf Nucleotidsequenzen, die im Wesentlichen identisch sind mit der in 2 gezeigten Sequenz. Eine "im Wesentlichen identische" Sequenz ist eine, deren Komplement mit der Nucleinsäuresequenz der 2 bei 55°C in 3 × Salzlösung/Natriumcitrat (SSC), enthaltend 0,1% SDS, hybridisiert und die gebunden bleibt, wenn sie Waschen bei 55°C mit 1 × SSC, enthaltend 0,1% SDS, ausgesetzt wird (Bemerkung: 20 × SSC = 3 M Natriumchlorid/0,3 M Natriumcitrat). Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Nucleinsäuren, die zu jenen oben beschriebenen komplementär sind.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein rekombinantes Molekül, umfassend eine wie oben beschriebene Nucleinsäuresequenz, und auf eine damit transformierte Wirtszelle. Unter Verwendung von im Stand der Technik wohl bekannten Standardmethodologien kann ein rekombinantes Molekül, umfassend einen Vektor und eine das K12-Protein kodierende Nucleotidsequenz, oder ein wie oben definierter Teil davon, konstruiert werden. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Vektoren schließen Plasmid- und virale Vektoren ein. Plasmidvektoren, in die eine das K12-Protein kodierende Nucleinsäuresequenz oder ein Teil davon kloniert werden kann, schließen alle Vektoren ein, die mit der Transformation in eine ausgewählte Wirtszelle kompatibel sind. Solche Vektoren schließen SV.NEO und CMV.NEO (z. B. pcDNS und PC1-neo) ein. Die Nucleo tidsequenz der Erfindung kann in dem Vektor, der an regulatorische Elemente, z. B. einen Promotor, operabel gekoppelt ist, anwesend sein. Geeignete Promotoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf CMV-, SV40- und starke Fettkörperproteinpromotoren.
Wie oben angedeutet, kann das rekombinante Molekül der Erfindung so konstruiert werden, dass es für das Transformieren einer Wirtszelle geeignet ist. Geeignete Wirtszellen schließen Prokaryontenzellen, wie Bakterien, niedrige Eukaryontenzellen, wie Hefe, und höhere Eukaryontenzellen, wie Säugerzellen und Insektenzellen, ein. Das rekombinante Molekül der Erfindung kann von Fachleuten in geeignete Wirtszellen unter Verwendung einer Vielzahl bekannter Verfahren eingeführt werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung von K12-Protein oder von Teilen davon, wie oben definiert. Das Verfahren umfasst das Kultivieren der oben beschriebenen transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, so dass die kodierende Sequenz exprimiert wird und das Protein dadurch produziert wird.
Die Nucleinsäuresequenz(en) der Erfindung kann (können) in Übereinstimmung mit Standardprotokollen verwendet werden als Sonden und Primer. Als solche können Teile der K12-Gensequenz verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf das Säuger-K12-Protein, genauer auf das menschliche K12-Protein, das im Wesentlichen frei ist von Proteinen, mit denen es normalerweise assoziiert ist, oder auf Teile davon, wie oben definiert. Die Proteine, Polypeptide und Peptide der Erfindung können rekombinant unter Verwendung der Nucleinsäuresequenz, wie oben beschrieben, produziert werden oder chemisch unter Verwendung bekannter Verfahren. Das Protein der Erfindung kann alleine oder als ein Fusionsprodukt produziert werden, z. B. mit einem Protein wie Betagalactosidase. Solche Fusionsprodukte können rekombinant hergestellt werden. Zum Beispiel kann die kodierende Sequenz der Erfindung (z. B. die das Säuger-K12-Protein kodierende Sequenz) im Leseraster mit der Sequenz kloniert werden, die ein anderes Protein (wie Betagalactosidase) kodiert, und das Fusionsprodukt kann in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden.
Die Proteine, Polypeptide und Peptide der Erfindung können als Antigene verwendet werden, um für K12 spezifische Antikörper zu erzeugen. Verfahren zur Antikörpererzeugung sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe auch Beispiel V). Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper sind im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen, ebenso wie es Bindungsfragmente davon sind. Der monoklonale Antikörper 7C3 ist bevorzugt. Ein Fachmann wird schätzen, dass solche Antikörper verwendet werden können, um selektiv das K12-Protein und Teile davon zu identifizieren und zu isolieren. Zusätzlich können die Antikörper in vivo oder in vitro verwendet werden, um die Aktivität (z. B. die Wachstumsstimulationsaktivität) des K12-Proteins zu hemmen.
Verbindungsscreenings
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Verfahren zur Verwendung der Proteine der Erfindung (z. B. rekombinant produziertes K12-Protein), um Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zu screenen, an K12 zu binden oder seine Aktivität zu ändern (z. B. Inhibierung) und folglich Verbindungen zu identifizieren, die z. B. als K12-Proteinagonisten oder -antagonisten dienen können. In einem Screeningtest wird das K12-Protein oder ein Teil davon mit Zellen inkubiert, die für die Wachstumsstimulationsaktivität des K12-Proteins empfänglich sind, in der Anwesenheit und Abwesenheit einer Verbindung, deren Potenzial zur Änderung der K12-Aktivität oder deren Bindungspotenzial untersucht werden soll. Das Wachstum der Zellen wird dann bestimmt. Eine Reduktion im Zellwachstum in der Testprobe zeigt an, dass die Testverbindung an das K12-Protein bindet und es dadurch inaktiviert oder anderweitig die K12-Proteinaktivität inhibiert.
Transgene Tiere (z. B. Nager), die das K12-Gen z. B. in Brustdrüsen- oder Eierstockgewebe überexprimieren, können verwendet werden, um Verbindungen in vivo hinsichtlich der Fähigkeit zu screenen, die Entwicklung von Tumoren zu inhibieren, welche aus der K12-Überexpression resultieren, oder solche Tumoren zu behandeln, wenn sie sich einmal entwickelt haben. Transgene Tiere, die Mammatumoren mit einem gesteigerten invasiven oder malignen Potenzial haben, können verwendet werden, um Verbindungen, einschließlich Antikörpern oder Peptiden, zu screenen, hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Wirkung von K12 zu inhibieren. Solche Tiere können z. B., wie in Beispiel 8 beschrieben, produziert werden.
Screeningvorgänge, wie jene oben beschriebenen, sind nützlich für die Identifizierung von Mitteln für ihre potenzielle Verwendung in pharmakologischen Interventionsstrategien in solchen Bereichen, wie der Brust- oder Eierstockkrebsbehandlung.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend als aktives Mittel die Proteine, Peptide, Nucleinsäuren oder Antikörper der Erfindung. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Zusammensetzungen, die als aktives Mittel Verbindungen umfassen, die unter Verwendung der oben beschriebenen Screeningprotokolle selektiert worden sind. Solche Zusammensetzungen schließen das aktive Mittel in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger ein. Die Menge des aktiven Mittels in der Zusammensetzung kann mit dem Mittel, dem Patienten und der erstrebten Wirkung variieren. Ähnlich wird das Dosierungsregime in Abhängigkeit von der Zusammensetzung und der zu behandelnden Erkrankung/Störung variieren.
Detektion/Diagnose:
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf Verfahren zum Nachweisen/Diagnostizieren eines neoplastischen oder prä-neoplastischen Zustands in einem Säuger (z. B. einem Menschen). Beispiele von Zuständen, die in Übereinstimmung mit diesem Verfahren detektiert/diagnostiziert werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Ovartumoren, Mammatumoren und Prostatakrebsen.
Ein Detektions-/Diagnoseverfahren umfasst: (a) das Gewinnen einer biologischen Probe aus einem Säuger (z. B. einem Menschen), (b) das Detektieren der Anwesenheit des K12-Proteins in der Probe und (c) das Vergleichen der Menge des vorhandenen Produktes mit jener in einer Kontrollprobe. In Übereinstimmung mit diesem Verfahren zeigt die Anwe senheit erhöhter Spiegel des K12-Genprodukts in der Probe an, dass das Subjekt einen neoplastischen oder prä-neoplastischen Zustand hat.
Biologische Proben, die für die Verwendung bei diesem Verfahren geeignet sind, schließen biologische Flüssigkeiten, wie Serum, Plasma, Pleuraergüsse, Urin und CSF ein. Da das K12-Produkt ein sezerniertes Protein ist, sind Plasma- und/oder Serumproben bevorzugt. Gewebeproben (z. B. Schnitte) können ebenfalls in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, einschließlich aus Biopsien gewonnenen Proben. Aus z. B. Gewebebiopsien abgeleitete Zellkulturen oder Zellextrakte können ebenfalls verwendet werden, wie es Cytospinzubereitungen aus Pleuraergüssen können.
Der Detektionsschritt des vorliegenden Verfahrens kann umfassen:

i) das Kontaktieren der biologischen Probe mit einer Verbindung (z. B. ein Protein), die einen Komplex mit dem K12-Genprodukt bildet, unter Bedingungen, so dass sich der Komplex bilden kann; und
ii) Bestimmen der Menge des gebildeten Komplexes und Vergleichen jener Menge mit einer Kontrollprobe. (Zum Beispiel, wenn die biologische Probe ein Pleuraerguss ist, können Kontrollen exsudative (z. B. Pneumonie) und nicht-exsudative (z. B. kongestive Herzinsuffizienz) Typen einschließen.)

Die Verbindung ist bevorzugt ein Bindungsprotein, z. B. ein Antikörper, polyklonal oder monoklonal, oder ein Antigenbindungsfragment davon. Der monoklonale Antikörper 7C3 ist bevorzugt (ein Hybridom, das den Antikörper 7C3 produziert, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, am 19. November 1996, unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags unter der Zugangsnummer ATCC HB-12238 hinterlegt).
Die Verbindung, die mit einem detektierbaren Marker (z. B. Fluorophor, Chromophor oder Isotop etc.) markiert sein kann. Wo geeignet, kann die Verbindung an einen festen Träger, wie eine Perle, Platte, Filter, Harz etc. angeheftet werden.
Die Bestimmung der Komplexbildung kann durch Kontaktieren des Komplexes mit einer weiteren Verbindung (z. B. einem Antikörper) bewirkt werden, die spezifisch an die erste Verbindung (oder den Komplex) bindet. Wie die erste Verbindung kann die weitere Verbindung an einen festen Träger angeheftet sein und/oder kann mit einem detektierbaren Marker markiert sein.
Die Identifikation erhöhter Spiegel an K12-Protein in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung macht die Identifikation von Subjekten (Patienten) möglich, die wahrscheinlich von einer adjuvanten Therapie Nutzen ziehen würden. Zum Beispiel kann eine biologische Probe aus einem Post-Primärtherapie-Subjekt (z. B. Subjekt, das sich der Chirurgie unterzogen hat) für die Anwesenheit zirkulierenden K12-Proteins gescreent werden, wobei die Anwesenheit erhöhter Spiegel des Proteins, bestimmt durch Studien normaler Populationen, für Resttumorgewebe anzeigend ist. Ähnlich kann Gewebe aus der Schnittstelle eines chirurgisch entfernen Tumors untersucht werden (z. B. durch Immunfluoreszenz), wobei die Anwesenheit erhöhter Spiegel des Produktes (im Verhältnis zu dem umgebenden Gewebe) für eine unvollständige Entfernung des Tumors anzeigend ist. Die Fähigkeit, solche Subjekte zu identifizieren, macht es möglich, die Therapie auf die Bedürfnisse des bestimmten Subjektes maßzuschneidern. Es können ebenfalls Subjekte überwacht werden, die eine nicht-chirurgische Therapie, z. B. Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie, durchmachen, wobei die Anwesenheit erhöhter Spiegel des K12-Proteins in Proben aus solchen Subjekten anzeigend ist für das Bedürfnis einer fortdauernden Behandlung. Die Tumorstadiumseinteilung der Erkrankung (z. B. für Zwecke der Optimierung von Behandlungsregimes) kann ebenfalls bewirkt werden, z. B. durch Lymphknotenbiopsie, z. B. mit einem für das K12-Protein spezifischen Antikörper.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Kit, der bei dem Nachweis des K12-Proteins verwendet werden kann. Der Kit kann eine Verbindung umfassen, die spezifisch das K12-Protein bindet (z. B. Bindungsproteine (z. B. Antikörper oder Bindungsfragmente davon (z. B. F(ab')₂-Fragmente))), die z. B. innerhalb eines Containermittels vorgelegt ist. Der Kit kann weiter Hilfsreagenzien umfassen, einschließlich Puffer und Ähnlichem.
Die hierin beschriebenen diagnostischen Methodologien sind sowohl auf Menschen als auch auf nicht-menschliche Säuger anwendbar.
Therapie:
Zu K12-mRNS komplementäre Gegensinnoligonucleotide können verwendet werden, um selektiv die Expression des Proteins zu vermindern oder abzuflachen. Genauer können Gegensinnkonstrukte oder Gegensinnoligonucleotide verwendet werden, um die Produktion von K12 in hochexprimierenden Krebszellen (z. B. Brust- oder Ovarzellen) zu inhibieren. Gegensinn-mRNS kann in Zielkrebszellen produziert werden durch Transfizieren eines Expressionsvektors mit der K12-Gensequenz oder einem Teil davon, orientiert in einer Gegensinnrichtung im Verhältnis zu der Richtung der Transkription. Geeignete Vektoren schließen Virusvektoren, einschließlich Retrovirusvektoren, ebenso wie nicht-virale Vektoren ein. Gewebespezifische Promotoren können verwendet werden (z. B. mammaspezifische Promotoren). Alternativ dazu können Gegensinnoligonucleotide direkt in Zielzellen eingeführt werden, um dasselbe Ziel zu erreichen. Oligonucleotide können selektiert/gestaltet werden, um das höchste Maß an Spezifität zu erreichen, und z. B., um an K12-mRNS an der Startstelle ATG zu binden.
Ein Fachmann wird aus dem Lesen dieser Offenbarung einsehen, dass monoklonale Antikörper für K12 oder seinen Rezeptor verwendet werden können, um die Wirkung von K12 zu hemmen und dadurch das Wachstum von Krebszellen zu kontrollieren. Dies kann durch Infusion von Antikörpern bewerkstelligt werden, die an K12 binden und seine Wirkung hemmen, oder von Antikörpern für den Rezeptor von K12.
Die hierin beschriebenen therapeutischen Methodologien sind sowohl auf Menschen als auch auf nicht-menschliche Säuger anwendbar.
Gewisse Aspekte der vorliegenden Erfindung werden detaillierter in den nicht beschränkenden Beispielen, die folgen, beschrieben.
BEISPIEL I
Identifikation und Isolierung von K12
Es wurde ein ungefähr 500 bp großes DNS-Fragment, das unmittelbar stromaufwärts der für CD7-HS1-DNase übersensitiven Stelle lokalisiert ist, wurde als eine Sonde gegen einen mRNS-Northern-Blot verwendet und es wurde ein 1,8 kb großes Transkript in der menschlichen Erythroleukämiezelllinie HEL detektiert. Diese 500bp-DNS-Sonde wurde dann verwendet, um eine cDNS-Bibliothek zu screenen, die aus der menschlichen Erythroleukämiezelllinie K562 gemacht worden ist, und nachfolgend wurden etliche Klone, die eine 1,8Kbp-DNS bilden, identifiziert, isoliert und als "K12" bezeichnet. Die Sequenz dieser cDNS, gezeigt in 2, zeigt einen einzelnen langen offenen Leserahmen von 786 bp, der sich in derselben 5'-zu-3'-Orientierung wie CD7 befindet (Schanberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 603 (1991)).
BEISPIEL II
Expressionsmuster von K12
Um das Ausmaß der K12-Expression zu untersuchen, wurden Poly-A+- und Gesamt-RNS aus vielen verschiedenen menschlichen Zelllinien und Geweben durch Northern-Blots analysiert, die mit radioaktiv markierter K12-cDNS sondiert worden sind. Northern-Blots, die 3 bis 4 μg/Spur Poly-A-RNS enthalten, zeigen ein vollständiges Fehlen der K12-Expression in T-Zelllinien (Jurkat, Hut78, CEM) und B-Zelllinien (BL2, Ramos) ebenso wie in einer Megakaryocytenlinie (Meg-01). Ein mäßig niedriger Expressionsspiegel wurde in den Erythroleukämiezellen HEL und K562 (3A) gesehen und es ist nur nach einem sehr langen Aussetzen K12-mRNS in einer Kolonkarzinomlinie (HT29) und einer Cervixkarzinomlinie (HeLa) detektierbar. Es sind jedoch viel höhere Spiegel in einer Ovarkrebszelllinie (OVCA420) und einer Brustkrebszelllinie (SKBR3) ersichtlich (3B). Ein Northern-Blot, der 20 μg Gesamt-RNS/Spur für Brustkrebslinien nutzt, zeigt einen sehr hohen Spiegel an K12-RNS-Akkumulierung, insbesondere wenn er mit einer Spur an Poly-A+-RNS aus K562-Zellen verglichen wird (3D). Die erste Spur enthält RNS aus K562-Zellen, die K12 überexprimieren, da sie mit einem K12-Expressionsvektor transfiziert worden sind. Ein Poly-A+-Northern-Blot (3C) zeigt, dass K12 ebenfalls in vielen normalen menschlichen Geweben transkribiert wird. Dieser Blot zeigt die Expression in peripheren Blutleukozyten (PBL). Der höchste Expressionsspiegel findet sich in Granulozyten, aber Expression wird auch in Monozyten und in gewissen Lymphozyten durch FACS-Analyse von permeabilisierten Zellen mit dem 7C3-Antikörper gesehen.
BEISPIEL III
Analyse der Sequenz des primären Transkriptes
Die cDNS enthüllt einen offenen Leserahmen, der ein Produkt mit 248 Aminosäuren vorhersagt (1 und 2). Dies sagt ein letztlich unmodifiziertes Protein von 27 kD voraus, eine Größe, die durch In-vitro-Transkription/Translation von K12-RNS bestätigt wurde. Die Sequenz des Gens ist neu und BLAST-Analyse enthüllt kürzere Regionen (10–15 Aminosäuren) an Ähnlichkeit mit Mitgliedern der Immunglobulinsupergenfamilie. Die vorhergesagte Primärsequenz (1) zeigt zwei Regionen mit einer starken Hydrophobie, einschließlich einer 20 Aminosäuren langen Region in der Nähe der Mitte des Moleküls, in Einklang stehend mit einer membranüberspannenden Domäne, und einer Region an dem Aminoterminus, in Einklang stehend mit einer Signalsequenz. Der N-Terminus zeigt etliche mögliche Proteasespaltstellen als in der Nähe der Transmembrandomäne identifiziert.
BEISPIEL IV
Charakterisierung des Proteinprodukts
Es wurde ein GST-K12-Fusionsgen durch Klonieren der Basen 200-1092 der K12-cDNS in die Klonierungsstelle des PGEX2TK-GST-Fusionsvektors (Pharmacia) zubereitet. Ein 55 kDa großes GST-K12-Fusionsprotein wurde in Bakterien überexprimiert, teilweise gereinigt und in Kaninchen und Mäuse zur Herstellung von sowohl polyklonalen als auch monoklonalen Antiseren injiziert. Polyklonales Antiserum gegen K12 wurde verwendet für das Western-Blotting von ZR75-1-Proteinextrakten und ein Bandencluster wurde um 25 kDa herum enthüllt, was wahrscheinlich die Abspaltung des Signalpeptids, gefolgt von einer möglichen Modifikation des Proteins anzeigt. Viele Zelllinien enthüllen nicht ein detektierbares Protein, einschließlich K562, welche die RNS exprimierten, jedoch in viel niedrigeren Spiegeln als die Brustkrebslinien. K562-Zellen, die stabil transfiziert worden sind, um K12 zu überexprimieren, synthetisieren jedoch ein Proteinprodukt derselben Größe, wie es in Brustkrebslinien gesehen wird. K562, die mit dem Vektor alleine transfiziert worden sind, produzieren K12 nicht mit dem monoklonalen Antikörper durch Westernanalyse detektierbar (4).
Um die Lokalisierung von K12 innerhalb der Zelle zu bestimmen, wurden Brustkrebszellen in 100 mM Natriumcarbonat, pH 11,5, lysiert. Ein Western-Blot der resultierenden Pellet- und Überstandsfraktionen zeigt, dass K12 in dem Pellet mit anderen unlöslichen Membranproteinen gefunden wird, und weitere Untersuchungen zeigen, dass K12 in einer Detergenzlösung aus 1% Triton X-100 resolubilisiert werden kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich K12 wie ein integrales Membranprotein verhält. Immunhistolokatisierungsuntersuchungen, die sowohl Fluoreszenz- als Lichtmikroskopie verwenden, zeigten dass sich K12 in einem charakteristischen, um den Kern liegenden Muster akkumuliert, das allgemein verbunden ist mit einer Lokalisierung bei den Golgikörpern (5). FACS-Analyse vermochte es nicht, die Expression auf der Oberfläche der Zellen zu demonstrieren, wohingegen sie in permeabilisierten Zellen nachgewiesen werden konnte.
BEISPIEL V
Demonstration der Expression von K12 in Brust- und Ovarkrebsgeweben
Der monoklonale Anti-K12-Antikörper 7C3 wurde durch das Fusionieren von Milzzellen aus einer mit K12 immunisierten Maus mit einer unsterblichen B-Zelllinie hergestellt. Einzelne Zellhybride wurden hinsichtlich ihrer Reaktivität auf das K12-Protein gescreent und ein Klon, 7C3, wurde identifiziert und kloniert (Scearce und Eisenbarth, Production of monoclonal activities reacting with the cytoplasm and surface of differentiated cells. Methods in Enzymology, PH Conn (Hrsg.) Band 103: 459, Academic Press, 1983). Der mo noklonale Antikörper wurde bei der Immunfärbung von mit Aceton fixierten, normalen und malignen Brust- und Ovargeweben verwendet, die ausgewählt wurden wegen dem hohen Spiegel der Expression von K12 in Brustkrebslinien. Ein P3-Maus-Antikörper mit angepasstem Isotyp wurde als eine Negativkontrolle verwendet. Sämtliche Antikörper wurden mit Avidin konjugiert und das entwickelnde System war eine Biotin-Meerrettichperoxidase. Signifikante Färbung geschah nur mit dem 7C3-Antikörper. Normale Drüsenelemente zeigten mäßige Färbungsniveaus mit einer Akzentuierung an der Peripherie des Drüsengewebes (6). Stromagewebe zeigte ein niedriges Maß allgemeiner Färbung, die typisch ist für Moleküle in einer extrazellulären Örtlichkeit. Brustkrebse färbten mit einer höheren Intensität und Inseln maligner Zellen konnten nachgewiesen werden (6).
BEISPIEL VI
Nachweis, dass K12 ein sezerniertes Molekül ist
Wegen der Lokalisierung an den Golgi wurde die Hypothese ausgesprochen, dass das Molekül sezerniert sein könnte. Die Brustkrebszelllinien ZR751 und MDAR-MB231 wurden in Medien mit geringem Serum wachsen gelassen und der Überstand wurde gesammelt und aufkonzentriert. Proteinaliquoten konzentrierter Zellüberstände wurden dem Western-Blot unterzogen und wurden mit antigen-gereinigten, für polyklonale Antikörper reaktiven Agenzien K12 sondiert. Ein Molekül mit annähernd 20 kDa wurde identifiziert, mit etlichen Banden geringerer Intensität, jedoch geringfügig langsamerer Mobilität, was typisch ist für Moleküle, die glykosyliert und modifiziert sind (7).
Obwohl K562-Zellen K12 in niedrigen Spiegeln exprimieren, wurde kein sezerniertes Produkt identifiziert. Die in K562-Zellen transfizierte normale CMV-K12-cDNS produzierte das K12-Produkt in den Medien. Ein K12-Gen wurde mit einem inserierten 7-Aminosäuren-Flag produziert, das die Sekretion des Proteins verhinderte, obwohl es innerhalb der Zellen in hohen Spiegeln nachgewiesen werden konnte. Ähnlich sezernierten Zellen, die mit einem leeren Vektor transfiziert worden sind, K12 nicht in die Medien. Um die Detektion des sezernierten Produktes zu optimieren, wurden die transfizierien Zellen in Medien wachsen gelassen, die reduzierte Mengen Kälberserum enthielten. Die Reduktion des Serums in den Medien zeigte für alle drei Linien eine signifikante Reduktion in der Wachstumsrate oder dem Überleben für sämtliche der Linien, mit Ausnahme jener, die das K12-Produkt sezernieren. Diese Ergebnisse zeigen eine das Wachstum regulierende Rolle für das sezernierte Produkt.
Konditionierte Medien wurden durch Wachsenlassen transfizierter K562-Zellen in mit 0,5% fötalem Kälberserum ergänzten Medien für 2 Tage zubereitet. Mit CMV-K12 transfizierte Zellen sezernierten K12 in ihre Medien, wohingegen mit leerem Vektor transfizierte Zellen dies nicht taten. Die Wachstumsrate von in diesen Medien wachsen gelassenen K562-Zellen wurde bestimmt (7). Nur die konditionierten Medien von den K12 sezernierenden Zellen konnten das Wachstum von K562-Zellen in Medien mit einer niedrigen Serumkonzentration aufrechterhalten.
BEISPIEL VII
Expression und Charakterisierung des K12-Rezeptors
Zugängliche Daten zeigen an, dass K12 als ein Wachstumsfaktor funktioniert, der vom Brustdrüsengewebe und den Brustkrebszellen produziert wird. Zielzellen für K12 können durch Identifizieren der Verteilung von Rezeptoren von K12 und der Bindungseigenschaften bestimmt werden. Zu diesem Zweck kann ein rekombinantes K12-Immunglobulinfusionsprotein zubereitet werden (Wee et al., Cell Immunol., 158: 353 (1994)) und es kann eine Bestimmung gemacht werden im Hinblick auf die Zellen, an welche es bindet. K562-Erythroleukämiezellen können verwendet werden, da diese Zellen in den oben beschriebenen Studien mit den konditionierten Medien auf K12 ansprechend wachsen gelassen worden sind und es wahrscheinlich ist, dass sie einen Rezeptor für K12-Protein exprimieren. K562-Zellen können mit dem Fusionsprotein in entweder PBS oder DMEM (mit oder ohne 10 mM EDTA), enthaltend 2% BSA und NaN₃, inkubiert werden. Nach der Inkubation für 30 Minuten können die Zellen mit PBS, enthaltend 2% BSA, gewaschen werden und mit Fluorescein konjugiertes Anti-Mensch-Ziegen-IgG1 kann als ein sekundäres Reagens verwendet werden, um die Bindung in der FACS-Analyse auf einem FACStar-Durchflusscytometer, das in dem Durchflusscytometriehauptlabor (Flow Cytometry Laboratory) der Duke zugänglich ist, zu untersuchen. Spezifische Bindung kann durch die Verwendung von menschlichem IgG als ein Kontrollreagens bestimmt werden, um die unspezifische Bindung zu bestimmen. Die idealen Bindungsbedingungen in Bezug auf die Konzentration divalenter Ionen und Medienbedingungen können bestimmt werden und Bindungseigenschaften können bestimmt werden durch Scatchard-Analyse unter Verwendung eines mit ¹²¹I markierten K12-Ig-Fusionsmoleküls (Earp et al., Breast Cancer Research & Treatment, 35: 115 (1995)).
Der Rezeptor, der K12 bindet, kann charakterisiert werden, um zu bestimmen, ob er neu ist oder ob er ein zuvor charakterisierter Rezeptor ohne einen bekannten Liganden ist. Die Zelllinien, welche den höchsten Grad der Bindung durch K12 haben, können mit ¹²⁵I-Oberflächen markiert werden, wie beschrieben (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10242 (1992)), und können dann mit dem K12-Ig-Fusionsprotein für 2 Stunden in DME/5% FBS inkubiert werden. Nach dem Waschen mit kalter PBS kann das Fusionsprotein mit Zelloberflächenproteinen mit DTSSP oder anderen Quervernetzern, wie BASED, BS oder SAED, quervernetzt werden. Nach 60-minütiger Inkubation bei 4°C können die Zellen gewaschen und lysiert werden mit NP-40, PMS und TLCK (Patel et al., J. Exp. Med., 181: 1563 (1995)). Ig-Komplexe können dann mit Protein-A-Sepharose-Perlen aufgereinigt werden. Solubilisierte Komplexe können durch SDS-Gelelektrophorese und durch Autoradiographie untersucht werden. Diese Studien werden die Untereinheitszusammensetzung des Rezeptors bestimmen. Falls er ein Monomer ist, kann das kodierende Gen durch entweder genetische oder biochemische Verfahren kloniert werden. Falls der Rezeptor aus verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt ist, können die Untereinheiten biochemisch isoliert und die einzelnen Bestandteile charakterisiert werden. Falls der Rezeptor neu ist, kann das ihn kodierende Gen durch entweder biochemische Aufreinigung oder durch Expressionsklonieren kloniert werden.
BEISPIEL VIII
Transgene Tiere, die K12 überexprimieren
Transgene Mäuse, die K12 in Brustgewebe überexprimieren, können wie folgt hergestellt werden. Das K12-Gen kann entweder an den für Mausbrust spezifischen Promotor für das saure Molkenprotein-(WAP-)Gen (Leroy et al., Genes, Chromosomes Cancer, 6: 156 (1993); Sandren et al., Cancer Res., 55: 3915 (1995)) oder den MMTV-Promotor (Berard et al., EMBO Journal, 13: 5570 (1994)) gekoppelt werden, um zwei unterschiedliche transgene Linien zu erzeugen (Schanberg et al., J. Immunol., 155: 2407 (1995)). Es kann eine zusätzliche Mauslinie hergestellt werden, die den WAP-Promotor und eine nicht sezernierende Variante (nicht sezernierende Varianten können durch die Insertion eines 9 Aminosäuren langen Flags in den Aminoterminus oder die Signalsequenz hergestellt werden) nutzt. Der WAP-Promotor erzeugt hohe Expressionsgrade in der laktierenden und schwangeren Brust von Mäusen und der MMTV-Promotor erzeugt ein breiteres Expressionsspektrum in unterschiedlichen Geweben und sehr hohe Expressionsgrade. Bei dem MMTV-Promotor ist es wahrscheinlicher, dass embryonale oder fötale Lethale erzeugt werden, er kann jedoch die Bestimmung der Wirkung der Überexpression von K12 auf unterschiedliche Gewebe während der Entwicklung erlauben. Muster und Spiegel der K12-Expression können bestimmt werden und die Brustgewebe können an Mauslinien während Schwangerschaft und Laktation untersucht werden. Brustgewebe können für die Anwesenheit von Atypien oder der Entwicklung von Malignität untersucht werden.
Sämtliche der oben zitierten Dokumente werden hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen.
Ein Fachmann wird aus dem Wesen dieser Offenbarung erkennen, dass verschiedene Änderungen in der Form und im Detail gemacht werden können, ohne von dem wahren Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

Isolierte Nukleinsäure, kodierend ein Säuger-K12-Protein, welches die in 2 gezeigte Sequenz (SEQ ID Nr. 2) oder eine Sequenz, die an das Komplement der Sequenz aus 2 (SEQ ID Nr. 2) bei 55°C in 3 × Kochsalz/Natriumcitrat (SSC), enthaltend 0,1% SDS, hybridisiert und gebunden bleibt, wenn sie einem Waschen bei 55°C mit 1 × SSC, enthaltend 0,1% SDS, unterworfen wird, einen Teil der Sequenz der 2 (SEQ ID Nr. 2) von mindestens 15 aufeinanderfolgenden Basen oder das Komplement der Nukleinsäure oder des Teils aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, worin das K12-Protein die in 1 (SEQ ID Nr. 1) dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, worin das Säuger-K12-Protein ein menschliches K12-Protein ist.
Rekombinantes Molekül, umfassend die Nukleinsäure nach einem der vorstehenden Ansprüche und einen Vektor.
Rekombinantes Molekül nach Anspruch 4, zusätzlich umfassend einen operativ mit der Nukleinsäuresequenz verbundenen Promoter.
Wirtszelle, umfassend das rekombinante Molekül nach Anspruch 4.
Verfahren zur Erzeugung eines K12-Proteins, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 6 unter solchen Bedingungen, dass die Nukleinsäure exprimiert und das K12-Protein dadurch erzeugt wird.
Isoliertes Säuger-K12-Protein oder Teil desselben mit mindestens fünf aufeinanderfolgenden Aminosäuren, kodiert von einer Nukleinsäure, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht.
Protein nach Anspruch 8, worin das Protein die in 1 (SEQ ID Nr. 1) gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Antikörper, spezifisch für das Protein oder den Teil desselben nach Anspruch 8 oder Anspruch 9.
Antikörper nach Anspruch 10, worin es sich bei dem Antikörper um 7C3 handelt, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC HB-12238.
In-Vitro-Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit von neoplastischen oder preneoplastischen Zellen in einem Säuger, umfassend das Sichten einer biologischen Probe aus dem Säuger auf erhöhte Level an K12-Protein, wie in Anspruch 8 oder 9 beansprucht, relativ zu einem in einer entsprechenden normalen biologischen Probe vorhandenen Level, worin dieser erhöhte Level die Anwesenheit neoplastischer oder preneoplastischer Zellen anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Probe ein biologisches Fluid oder eine Gewebsprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin das Sichten durch In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper oder bindenden Fragment desselben, der oder das einen Komplex mit dem K12-Protein unter solchen Bedingungen bildet, dass der Komplex gebildet werden kann, und Ermitteln der Menge an gebildetem Komplex bewirkt wird.
Kit zur Anwendung bei der Detektion von K12-Protein, wie in Anspruch 8 oder 9 beansprucht, umfassend einen Antikörper oder ein bindendes Fragment desselben, der oder das spezifisch an das K12-Protein bindet, angeordnet in einem Behältermittel.
Antisens-Konstrukt, das einen Vektor und eine Nukleinsäuresequenz, kodierend K12-Protein oder ein Teil desselben, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, enthält, orientiert in einer Antisens-Richtung relativ zur Transkriptionsrichtung zur Verwendung bei der Behandlung eines neoplastischen oder preneoplastischen Zustandes.
In-Vitro-Verfahren zum Sichten einer Verbindung auf ihre Fähigkeit, die wachstumsfördernde Aktivität des K12-Proteins zu modulieren, umfassend das Inkubieren von K12-Protein oder eines Teils desselben, wie in Anspruch 8 oder 9 beansprucht, mit Zellen, die gegenüber der wachstumsfördernden Aktivität von K12-Protein empfänglich sind, in Anwesenheit und Abwesenheit der Verbindung und Testen auf eine Änderung der Wachstumsrate der Zellen in Anwesenheit der Verbindung, wobei die Verringerung der Wachstumsrate der Zellen eine Verbindung anzeigt, die die wachstumsfördernde Aktivität moduliert.