JPH11502404A

JPH11502404A - 細胞表面発現分子および形質転換関連遺伝子に特異的なｄｎａプローブおよび免疫学的試薬の開発

Info

Publication number: JPH11502404A
Application number: JP8521785A
Authority: JP
Inventors: フィッシャー、ポール・ビー; シェン、ロークエン
Original assignee: Columbia University of New York
Current assignee: Columbia University of New York
Priority date: 1995-01-11
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 1999-03-02
Also published as: US20050250206A1; US6811972B1; EP0804458A1; US5851764A; EP0804458A4; WO1996021671A1; AU4751196A; CA2209941A1; AU709056B2; US20050163709A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、一つの細胞タイプの表面に発現するが他の細胞タイプには発現しないような、細胞表面に発現するタンパクに対して特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を製造するための方法を提供する。本発明はまた、細胞表面に発現されたタンパクに対して特異的に結合できる抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株を製造する方法を提供する。本発明は、新生物ヒト細胞に関連した腫瘍関連抗原を特異的に認識し、これに結合できるハイブリドーマ細胞株を製造する方法を提供する。本発明はまた、新生物ヒト細胞に関連した細胞表面高原をコードするＤＮＡを製造する方法を提供する。本発明は更に、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１をの配列を有する単離された哺乳類核酸分子を提供する。本発明はまた、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の配列を有する単離された哺乳類核酸分子を提供する。本発明はまた、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−２の配列を有する単離された哺乳類核酸分子を提供する。最後に、本発明は、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の配列を有する単離された哺乳類核酸分子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞表面発現分子および形質転換関連遺伝子に特異的なＤＮＡプローブおよび免疫学的試薬の開発本明細書に開示される発明は、米国保健社会福祉省からのＮＩＨ助成金ＣＡ３５６７５およびＣＡ４３２０８の下に政府の支援により行われた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。〔発明の背景〕本出願を通して、種々の参照文献がカッコ内に引用される。これらの刊行物の開示は全体として、本発明が属する当該分野の技術の現状を十分に記載するために、本明細書の一部をなす参照として本願に組み込まれる。これらの参照文献の完全な書誌事項は、各実験項の最後に記載される。細胞表面分子に対して特異的なモノクローナル抗体を開発するための典型的な方法では、無傷の細胞かまたは目的の標的細胞から得られる細胞膜調製物のいずれかをマウスに繰り返し注入する。注入後、マウス脾臓細胞を取り出し、この細胞をミエローマ細胞に融合させる［（１〜３）に総説］。この方法により、細胞表面増殖因子受容体および腫瘍関連抗原を含む潜在的に重要な多くの表面発現分子と反応するモノクローナル抗体が産生された。しかしこの方法は、一般的には不十分であり、適切なモノクローナル抗体の産生のためには多数のハイブリドーマのスクリーニングを必要とする［（１〜６）に総説］。ＤＮＡトランスフェクション法は、ヒト遺伝子を、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞のような異種細胞に導入するために使用されてきた［（７〜１０）に総説］。ＮＩＨ３Ｔ３細胞がＤＮＡトランスフェクションのレシピエントとして使用されるとき、この方法は、大部分（約８５％）のヒト腫瘍またはヒト腫瘍細胞株からの、優性に作用する（dominant-acting）形質転換性遺伝子または腫瘍誘導性遺伝子を同定することには成功していない（７〜１０）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用する多くの研究において、優性に作用する癌遺伝子が同定されるときでさえ、これは、しばしばｒａｓ癌遺伝子ファミリーのメンバーまたは修飾された細胞性遺伝子であった（７〜１０）。最近開発されたクローン化ラット胚繊維芽細胞株のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で検出されない推定される新規な癌遺伝子を同定するのに有用であることが判った（１１）。ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞株からの高分子量ＤＮＡおよび選択可能なネオマイシン耐性遺伝子（ｐＳＶ２ｎｅｏ）によりＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６を同時トランスフェクションし、次にＧ４１８に対する耐性について選択し、そしてヌードマウスに注入すると、腫瘍が形成された（１１）。対照的に、同じＤＮＡ源をＮＩＨ３Ｔ３細胞で使用すると、ネオマイシン耐性（Ｇ４１８）で同時トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞を注入したヌードマウスでは腫瘍は発生しなかった（１１）。出願人らは、免疫学的遮蔽手段と組合せたＤＮＡトランスフェクション法が、遺伝子的に改変した細胞で発現する細胞表面分子と反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを、効率よく作成するのに使用できるかどうかを調べるために本実験を行った。出願人らは、表面エピトープ遮蔽（surface-epitope masking）（ＳＥＭ）と呼ばれるこの方法の実現可能性を証明する。出願人らは、典型的な多剤耐性（ＭＤＲ）細胞およびヒト前立腺癌細胞に局在する表面エピトープと反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するするために、ＤＮＡトランスフェクションおよびＳＥＭ法を使用した。これらの結果は、ＳＥＭと組合せたＤＮＡトランスフェクションが、既知および未知の両方の遺伝子にコードされる表面発現分子と反応することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成するのに使用できることを示す。〔発明の概要〕本発明は、１つの細胞タイプの表面に発現するが他の細胞には発現しない、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供し、この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを発現しない細胞タイプに対する抗血清を作成し；ｂ）作成した抗血清により、細胞表面発現タンパクを発現する別の細胞タイプをコーティングし；ｃ）この抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入し；ｄ）得られた宿主をスクリーニングして、コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定し；ｅ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出し；ｆ）こうして取り出した脾臓からハイブリドーマを調製し；そしてｇ）細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をそこから回収することを含んでなるものである。本発明は、１つの細胞タイプの表面に発現するが他の細胞には発現しない、細胞表面発現タンパクに結合できるタンパクをコードするＤＮＡを単離する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを発現しない細胞タイプに対する抗血清を作成し；ｂ）作成した抗血清により、細胞表面発現タンパクを発現する別の細胞タイプをコーティングし；ｃ）この抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入し；ｄ）得られた宿主をスクリーニングして、コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定し；ｅ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出し；ｆ）取り出した脾臓からＢリンパ球を単離し；ｇ）形質細胞からＤＮＡを調製して、異なるクローンを含有する組合せファージｃＤＮＡライブラリーを作成し；そしてｈ）ライブラリー中のクローンを、工程（ｂ）からのコーティングした細胞と接触させることを含んでなり、コーティングした細胞とクローンとの結合は、クローンにより発現するタンパクが、細胞表面発現タンパクに結合できることを示す。本発明は、１つの細胞タイプの表面に発現するが他の細胞には発現しない、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを発現しない細胞タイプに対する抗血清を作成し；ｂ）作成した抗血清により、細胞表面発現タンパクを発現する別の細胞タイプをコーティングし；ｃ）この抗血清でコーティングした細胞を、刺激して抗体を産生させることが可能な適切な免疫応答性細胞と接触させ；ｄ）ハイブリドーマを作成するために免疫応答性細胞を調製し；そしてｅ）コーティングした細胞と反応性のある抗体を産生するハイブリドーマを単離し、こうして細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製することを含んでなる。本発明は、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを通常発現しない細胞に対する抗血清を作成し；ｂ）細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子を細胞中に導入して、細胞表面発現タンパクを発現させ；ｃ）細胞表面発現タンパクを発現する細胞を選択し；ｄ）工程ａで作成した抗血清により、選択した細胞をコーティングし；ｅ）抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入し；ｆ）得られた宿主をスクリーニングして、コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定し；ｇ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出し；ｈ）こうして取り出した脾臓からハイブリドーマを調製し；そしてｉ）細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をここから調製することを含む。本発明は、細胞表面発現タンパクに結合できるタンパクをコードするＤＮＡを単離する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを通常発現しない細胞に対する抗血清を作成し；ｂ）細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子を細胞中に導入して、細胞表面発現タンパクを発現させ；ｃ）細胞表面発現タンパクを発現する細胞を選択し；ｄ）工程ａで作成した抗血清により、選択した細胞をコーティングし；ｅ）抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入し；ｆ）得られた宿主をスクリーニングして、コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定し；ｇ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出し；ｈ）取り出した脾臓からＢリンパ球を単離し；ｉ）Ｂリンパ球からＤＮＡを調製して、異なるクローンを含有する組合せファージｃＤＮＡライブラリーを作成し；そしてｊ）ライブラリー中のクローンを、工程（ｂ）からのコーティングした細胞と接触させることを含んでなるものであり、コーティングした細胞とクローンとの結合は、クローンにより発現するタンパクが細胞表面発現タンパクに結合できることを示す。本発明は、１つの細胞タイプの表面に発現するが他の細胞には発現しない、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する、この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを通常発現しない細胞に対する抗血清を作成し；ｂ）細胞表面発現タンパクを発現させるため、細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子を細胞中に導入し；ｃ）細胞表面発現タンパクを発現する細胞を選択し；ｄ）工程ａで作成した抗血清により、選択した細胞をコーティングし；ｅ）この抗血清でコーティングした細胞を、刺激して抗体を産生させることの可能な適切な免疫応答性細胞と接触させ；ｆ）ハイブリドーマを作成するために免疫応答性細胞を調製し；そしてｇ）コーティングした細胞と反応性のある抗体を産生するハイブリドーマを単離し、こうして細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製することを含んでなる。本発明は、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子および選択可能なまたは同定可能な性質をコードする第２のＤＮＡ分子を、樹立した細胞株に導入し；ｂ）選択可能なまたは同定可能な性質を発現するトランスフェクトされた細胞を選択し；ｃ）こうして選択したトランスフェクトされた細胞を回収し；ｄ）樹立した細胞株に対して作成した抗血清により、こうして回収した選択した細胞をコーティングし；ｅ）この抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入し；ｆ）得られた宿主をスクリーニングして、コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定し；ｇ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出し；ｈ）こうして取り出した脾臓からハイブリドーマを調製し；そしてｉ）細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をここから回収することを含んでなる。本発明は、細胞表面発現タンパクに結合できるタンパクをコードするＤＮＡを単離する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子および選択可能なまたは同定可能な性質をコードする第２のＤＮＡ分子を、樹立した細胞株に導入し；ｂ）選択可能なまたは同定可能な性質を発現するトランスフェクトされた細胞を選択し；ｃ）こうして選択したトランスフェクトされた細胞を回収し；ｄ）樹立した細胞株に対して作成した抗血清により、こうして回収した選択した細胞をコーティングし；ｅ）抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入し；ｆ）得られた宿主をスクリーニングして、コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定し；ｇ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出し；ｈ）取り出した脾臓からＢリンパ球を単離し；ｉ）Ｂリンパ球からＤＮＡを調製して、異なるクローンを含有する組合せファージｃＤＮＡライブラリーを作成すし；そしてｊ）ライブラリー中のクローンを、工程（ｂ）からのコーティングした細胞と接触させることを含んでなり、コーティングした細胞とクローンとの結合は、クローンにより発現するタンパクが、細胞表面発現タンパクに結合できることを示している。本発明は、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子および選択可能なまたは同定可能な性質をコードする第２のＤＮＡ分子を、樹立した細胞株に導入し；ｂ）選択可能なまたは同定可能な性質を発現するトランスフェクトされた細胞を選択し；ｃ）こうして選択したトランスフェクトされた細胞を回収し；ｄ）樹立した細胞株に対して作成した抗血清により、こうして回収した選択した細胞をコーティングし；ｅ）抗血清でコーティングした細胞を、刺激して抗体を産生させることの可能な適切な免疫応答性細胞と接触させ；ｆ）ハイブリドーマを作成するために免疫応答性細胞を調製し；そしてｇ）工程（ｄ）のコーティングした細胞と反応性のある抗体を産生するハイブリドーマを単離し、こうして細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製することを含んでなる。本発明は、新生物ヒト細胞に関連する腫瘍関連抗原を特異的に認識しかつこれに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供し、この方法は、ａ）ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０５８４）を、新生物ヒト細胞から単離したＤＮＡおよび選択可能なまたは同定可能な性質をコードするＤＮＡと同時トランスフェクションし；ｂ）選択可能なまたは同定可能な性質を発現するトランスフェクトされた細胞を選択し；ｃ）こうして選択したトランスフェクトされた細胞を回収し；ｄ）こうして回収したトランスフェクトされた細胞を、適切な第１のマウス宿主に注入し；ｅ）注入したトランスフェクトされた細胞を誘導して第１のマウス宿主において腫瘍を形成させるのに有効な時間、得られた第１のマウス宿主を維持し；ｆ）得られた腫瘍を第１のマウス宿主から単離し；ｇ）こうして単離した腫瘍から腫瘍細胞を取得し；ｈ）樹立した非ヒト非腫瘍形成性細胞株に対して作成した抗血清により、こうして得られた腫瘍細胞をコーティングし；ｉ）抗血清でコーティングした細胞を適切な第２の宿主に注入し；ｊ）得られた第２の宿主をスクリーニングして、新生物ヒト細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定し；ｋ）こうして同定した第２の宿主から脾臓を取り出し；ｌ）こうして取り出した脾臓からハイブリドーマを調製し；そしてｍ）細胞表面抗原を特異的に認識しかつこれに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をここから回収することを含んでなる。本発明は、新生物ヒト細胞に関連する細胞表面抗原をコードするＤＮＡを調製する方法を提供する。この方法は、ａ）ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞株を、新生物ヒト細胞から単離したＤＮＡおよび選択可能なまたは同定可能な性質をコードするＤＮＡと同時トランスフェクションし；ｂ）選択可能なまたは同定可能な性質を発現するトランスフェクトされた細胞を選択し；ｃ）こうして選択したトランスフェクトされた細胞を回収し；ｄ）こうして回収したトランスフェクトされた細胞を、適切な第１のマウス宿主に注入し；ｅ）注入したトランスフェクトされた細胞を誘導して第１のマウス宿主において腫瘍を形成させるのに有効な時間、得られた第１のマウス宿主を維持し；ｆ）得られた腫瘍を第１のマウス宿主から単離し；ｇ）こうして単離した腫瘍から腫瘍細胞を取得し；そしてｈ）こうして得られた腫瘍細胞から新生物ヒト細胞に関連する細胞表面抗原をコードするＤＮＡを回収することを含んでなる。本発明はさらに、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１（Prostate Carcinoma Tumor A ntigen Gene-1）の配列を有する単離した哺乳動物核酸分子を提供する。本発明はまた、前立腺癌誘導性遺伝子−１（Prostate Tumor Inducing Gene-1）の配列を有する単離した哺乳乳動物核酸分子を提供する。本発明は、前立腺癌誘導性遺伝子−２の配列を有する単離した哺乳動物核酸分子を提供する。最後に、本発明は、前立腺癌誘導性遺伝子−３の配列を有する単離した哺乳動物核酸分子を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１ＳＥＭ法のフローチャート。この方法は、抗−ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ポリクローナル抗体の産生が関与し、この抗体は、動物への注入の前に、トランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６のラットの抗原性エピトープをブロックするために使用される。この基本的方策により、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞上のトランスフェクトされた表面発現抗原と反応する免疫脾臓細胞を産生することができる。次に脾臓細胞を、ＮＳ１マウスミエローマ細胞と融合して、トランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞の細胞表面で発現される抗原に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生させる。図２ＳＥＭにより産生されるＭＤＲモノクローナル抗体で処理したＭＤＲＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞に対する反応性。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞にヒトＭＤＲ−１遺伝子によりトランスフェクトし、コルヒチンに対して耐性のＭＤＲクローンを単離した。ＳＥＭ法を使用して、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＡ１細胞では発現されるが、トランスフェクションされていない非ＭＤＲＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６親細胞では発現しない、ＭＤＲトランスポーターの表面エピトープと反応するモノクローナル抗体を分泌する独立のハイブリドーマ（ＭＤＲ２．３、ＭＤＲ３．０、ＭＤＲ８．１２およびＭＤＲ９．７）を作成した。ＳＥＭで得られたモノクローナル抗体は、独立して得られた３つのＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ＭＤＲクローンであるＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＣ３、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＤ２およびＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＦ４との反応性についても試験した。試料は、ＦＡＣＳにより分析し、結果は、平均蛍光強度単位として表す。試験内変動(replication samples variation)は＜１０％であり、試験間変動(replication studies vatiation)は＜２０％であった。図３ＭＣＦ７およびＭＤＲＭＣＦ７細胞に対するヒト白血球抗原クラス１モノクローナル抗体、並びにＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＡ１細胞およびＳＥＭ法を使用して産生された、ＭＤＲモノクローナル抗体の反応性。ＭＣＦ７およびＭＣＦ７ＣＬ４細胞は、非ＭＤＲ細胞である。ＭＣＦ７ＣＬ４：ＭＤＲＩ、ＭＣＦ７ＣＬ４：ＭＤＲ II、およびＭＣＦ７ＣＬ４：ＭＤＲ IIIは、独立した３つのＭＤＲＭＣＦ７ＣＬ４サブクローンである。蛍光の基線は、無関係のアイソタイプが一致した抗体およびイソチオシアン酸フルオレセインに結合したヤギ抗マウスイムノグロブリンＧを使用して測定した。試料は、ＦＡＣＳにより分析し、結果は、平均蛍光強度単位として表す。試験内変動は＜１０％であり、試験間変動は＜２０％であった。図４トランスフェクションしていないＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６およびヒト前立腺癌細胞株に対する、ＳＥＭで得られたモノクローナル抗体の反応性。Ｐｒｏｌ．１、１．２、１．３、１．４および１．５は、抗ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ポリクローナル抗体でコーティングした、ＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６で免疫したマウスからの脾臓細胞である、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴを、ＮＳ１マウスミエローマ細胞と融合することにより作成した独立したハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である。分析した細胞は、親のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６−４ＮＭＴ（原発性ＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍由来トランスフェクション細胞）、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４−７ＮＭＴ（続発性ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍由来トランスフェクション細胞）、およびヒト前立腺癌細胞株のＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３であった。試料は、ＦＡＣＳにより分析し、結果は、平均蛍光強度単位として表す。試験内変動は＜１０％であり、試験間変動は＜１５％であった。図５ＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞、並びにＬＮＣａＰおよびＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞における、推定ヒト前立腺癌がコードするポリペプチドの発現。細胞株からの標識した細胞溶解物は、モノクローナル抗体Ｐｒｏ１．４により免疫沈降させた。分子量サイズマーカーは、図の左側に示される。実験の詳細は、材料と方法の項およびデュイゴウ（Duigou）ら（２０）に記載されている。図６ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６およびＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴｍＲＮＡの差別的表示（ＤＤ）。ＤＤは、材料と方法に示される配列を有する２４オリゴマー（５’−）および１４オリゴマー（３’−）を用いて行った。矢印は、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴからのｍＲＮＡにのみ現れるが、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞には現れないＰＴＩ−１バンドを示す。このＰＴＩ−１ＤＮＡ断片の長さは、２１４塩基対である。図７正常および腫瘍細胞株におけるＰＴＩ−１の発現。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴおよび種々の正常および腫瘍由来ヒト細胞株からのＲＮＡを、ナイロン膜に移して、［³²Ｐ］標識した２７９塩基対のＰＴＩ−１ＤＮＡ断片（プライマーＡとＬの間の、３１７〜５９６塩基対。図８）とプローブ結合させた。膜からこのプローブを除去して、［³²Ｐ］標識したＧＡＰＤＨ遺伝子と再度プローブ結合させた。図８ＰＴＩ−１遺伝子のペプチドおよびＤＮＡ配列、並びにヒトＥＦ−１ α遺伝子との比較。（Ａ）ＰＴＩ−１のペプチドおよびＤＮＡ配列。ＰＴＩ−１遺伝子の５’−および３’−非翻訳領域は、小文字で表し、ＰＴＩ−１の読み取り枠は、大文字で表す。四角で囲んだアミノ酸は、単一塩基の突然変異（下線を付した塩基）により生じたＰＴＩ−１遺伝子の突然変異したアミノ酸である。５ ’−非翻訳領域の下線を付した配列は、図７および９で使用される、ＬおよびＡプライマーである。（Ｂ）ＥＦ−１αとＰＴＩ−１とのペプチドの比較。ＥＦ− １αのペプチドは、（Ｅ）に示し、ＰＴＩ−１のペプチドは、（Ｐ）に示す。ＥＦ−１αの下線を付した領域（６７アミノ酸）は、ＰＴＩ−１遺伝子では欠失しているアミノ酸を示す。太字（^＊がついている）は、ＰＴＩ−１ペプチドの突然変異したアミノ酸を示す。（Ｃ）ＥＦ−１αとＰＴＩ−１の間のアミノ酸、コドンおよびヌクレオチドの違い。６つの単一塩基突然変異が、ＰＴＩ−１遺伝子の特定のアミノ酸の変化を引き起こしている。アミノ酸のカラムで、カッコ内の数字は、ペプチド中のアミノ酸の位置を意味し、コドンは、特定のアミノ酸をコードする３つのヌクレオチドの配列を意味する。特定のヌクレオチドの変化も示される。図９細胞株、並びに正常な前立腺、ＢＰＨおよび前立腺癌の組織試料における、ＰＴＩ−１、ＰＳＡおよびＧＡＰＤＨ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析。ＰＴＩ− １のＲＴ−ＰＣＲは、２０オリゴマーの対からなる２つのプライマーを使用している：配列５’−ＧＡＧＴＣＴＧＡＡＴＡＧＧＧＣＧＡＣＴＴ−３’（センス方向）を有するプライマーＬ；および配列５’−ＡＧＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＡＧＡＴＧＣＣ−３’を有するプライマーＡ（アンチセンス方向）（両方とも図８で下線を付した）。ＰＳＡのＲＴ−ＰＣＲは、プライマー（Ａ）５’−ＡＧＡＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＧＴＣ−３’および（Ｂ）５’−ＣＡＣＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＡＣＴＴＣ−３’を使用している。ＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲは、配列（Ｉ）（５’−ＴＣＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧ−３’）およびＰ（II）（５’−ＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡ−３’）を有するプライマーの対を使用している。ＰＣＲ増幅産物は、ナイロン膜にブロットして、各々ＰＴＩ−１、ＰＳＡまたはＧＡＰＤＨの［³²Ｐ］標識した２７９塩基対のＤＮＡ断片とプローブ結合させた。図１０ＰＴＩ−１遺伝子のインビトロ翻訳。レーンＣＡＴは、陽性対照として使用したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｍｒ＝２４kDa）のインビトロ翻訳である。レーンＰＴＩ−１は、ＰＴＩ−１遺伝子の翻訳産物を含有する。インビトロ翻訳産物のサイズを測定するために、レインボー（Rainbow）タンパク標準物質（アマーシャムライフサイエンス（Amersham Life Science））を使用した。図１１異なる癌遺伝子により形質転換したＣＲＥＦにおけるＰＴＩ−１の発現。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６；ＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされたヌードマウスの腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞（ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ）；ＬＮＣａＰ；５型アデノウイルスの変異体により形質転換したＣＲＥＦ細胞（ＣＲＥＦＨ５ｈｒ１／Ａ２）；デキサメタゾンで誘導可能な（マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター）野生５型アデノウイルス形質転換性Ｅ１Ａ遺伝子により形質転換したＣＲＥＦ細胞（ＣＲＥＦ／ＭＭＴＶ−Ａｄ５Ｅ１Ａ）で、ＤＥＸの非存在（−ＤＥＸ）で正常細胞表現型、ＤＥＸの存在（＋ＤＥＸ）でＡｄ５Ｅ１Ａが発現し、細胞が形質転換する；Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子により形質転換したＣＲＥＦ細胞（ＣＲＥＦ−ｒａｓ）；ｖ−ｓｒｃ癌遺伝子により形質転換したＣＲＥＦ細胞（ＣＲＥＦ−ｓｒｃ）；および腫瘍形成性ヒトパピローマウイルス５１型により形質転換したＣＲＥＦ細胞（ＣＲＥＦ−ＨＰＶ −５１）から単離したＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション分析。ブロットは、³²Ｐ標識したＰＴＩ−１遺伝子プローブによりプローブによる調査を行い、次にこのプローブを除去し、³²Ｐ標識したＧＡＰＤＨ遺伝子プローブを用いて再度プローブ結合させた。図１２ヒト癌の新鮮凍結切片に対する表面エピトープ遮蔽（ＳＥＭ）法により調製したＢｒ−ｃａｒ（乳癌）モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の反応性。切片は、転移性黒色腫（Ａ）、小細胞性肺癌（Ｂ）および乳癌（ＣおよびＤ）の患者から調製した。反応性は、ヒト乳癌細胞株Ｔ４７ＤからのＤＮＡによりトランスフェクトされたヌードマウス腫瘍由来のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞であるＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：Ｔ４７ＤＮＭＴにより、ＳＥＭ法を使用して調製したＭＡｂによる免疫組織化学法を使用して測定した。反応性は、２つのヒト乳癌切片化患者試料にのみ明らかである。。図１３ＰＴＩ−２の核酸配列。図１４ＰＴＩ−３の核酸配列。図１５ＰＣＴＡ−１の核酸配列。図１６分泌されたＰＣＴＡ−１および細胞内ＰＣＴＡ−１の、免疫蛍光染色および免疫沈降分析。生存細胞は、ＭｏＡｂＰｒｏ１．５と共にインキュベートし、蛍光顕微鏡法により分析した（Ａ、Ｂ、Ｃ）。細胞は、³⁵Ｓ−メチオニンで標識し、分泌されたＰＣＴＡ−１および細胞内ＰＣＴＡ−１レベルは、Ｐｒｏ１．５ＭｏＡｂによる免疫沈降により測定した（Ｄ）。図１７前立腺組織切片におけるＰＣＴＡ−１および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の免疫組織化学による検出。良性前立腺［ＰＣＴＡ−１（Ａ）、ＰＳＡ（Ｅ）］、前立腺上皮内癌（ＰＩＮ）［ＰＣＴＡ−１（Ｃ）、ＰＳＡ（Ｆ）］、および侵襲性前立腺癌［ＰＣＴＡ−１（ＣとＤ）、ＰＳＡ（ＧとＨ）］。元々の倍率：Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＨ＝２５０×；ＣおよびＧ＝１００×。図１８ＰＣＴＡ−１の予測アミノ酸配列、および他のガラクトース結合レクチン（ガレクチン（galectin））タンパクとのＰＣＴＡ−１の整合。予測アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に示される（Ａ）。ＰＣＴＡ−１と、ウナギ、ニワトリ、マウス、ラット、ウシからのＭｒ１４，０００およびＭｒ２９，０００〜３１，０００の配列を有するガレクチンおよびヒトガレクチンとの比較。^*、ＰＣＴＡ−１に独特なアミノ酸；＿、ＰＣＴＡ−１と、マウス−Ｌ３４、ヒトガレクチン−３−Ｌ２９およびヒト−Ｌ３１に共有されるアミノ酸；ｏ、ＰＣＴＡ−１と、異なる種からのＭｒ１４，０００およびＭｒ２９，０００〜３１，０００のガレクチンにより共有されるアミノ酸。図１９細胞株、並びに正常前立腺、ＢＰＨ、および前立腺癌の組織試料における、ＰＣＴＡ−１、ＰＳＡおよびＧＡＰＤＨ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。ＰＣＴＡ−１のＲＴ−ＰＣＲは、配列５’−ＡＡＧＣＴＧＡＣＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＣＡ−３’および５’−ＡＡＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＴ−３’を有する２つの２０量体を使用している。ＰＳＡのＲＴ−ＰＣＲは、２つのプライマーを使用している：プライマーＡ、５’−ＡＧＡＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＴＴＴＣＡＧＧＴＣ−３’；およびプライマーＢ、５’−ＣＡＣＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＡＣＴＴＣ−３’。ＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲは、配列５’− ＴＣＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧ−３’および５’−ＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡ−３’を有するプライマーの対を使用している。ＰＣＲ増幅産物は、ナイロン膜にブロットして、各々ＰＣＴＡ−１、ＰＳＡまたはＧＡＰＤＨの［³²Ｐ］標識したＤＮＡ断片とプローブ結合させた。〔発明の詳細な説明〕本出願を通して、特定のヌクレオチドを示すために、本明細書を通して下記の標準的な略語を使用する：Ｃ＝シトシンＡ＝アデノシンＴ＝チミジンＧ＝グアノシン本発明は、１つの細胞タイプの表面に発現するが他の細胞には発現しない、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを発現しない細胞タイプに対する抗血清を作成することと；ｂ）作成した抗血清により、細胞表面発現タンパクを発現する別の細胞タイプをコーティングすることと；ｃ）抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入することと；ｄ）コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定するために、得られた宿主をスクリーニングすることと；ｅ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出すことと；ｆ）こうして取り出した脾臓からハイブリドーマを調製することと；ｇ）細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をここから回収することとを具備している。本発明は、１つの細胞タイプの表面に発現するが他の細胞には発現しない、細胞表面発現タンパクに結合できるタンパクをコードするＤＮＡを単離する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを発現しない細胞タイプに対する抗血清を作成することと；ｂ）作成した抗血清により、細胞表面発現タンパクを発現する別の細胞タイプをコーティングすることと；ｃ）抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入することと；ｄ）コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定するために、得られた宿主をスクリーニングすることと；ｅ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出すことと；ｆ）取り出した脾臓からＢリンパ球を単離することと；ｇ）異なるクローンを含有する組合せファージｃＤＮＡライブラリーを作成するために、形質細胞からＤＮＡを調製することと：ｈ）ライブラリー中のクローンを、工程（ｂ）からのコーティングした細胞と接触させ、ここでのコーティングした細胞とクローンとの結合により、該クローンにより発現するタンパクが細胞表面発現タンパクに結合できることが示されることとを具備する。本発明は、１つの細胞タイプの表面に発現するが他の細胞には発現しない、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを発現しない細胞タイプに対する抗血清を作成することと；ｂ）作成した抗血清により、細胞表面発現タンパクを発現する別の細胞タイプをコーティングすることと；ｃ）抗血清でコーティングした細胞を、刺激して抗体を産生させることの可能な適切な免疫応答性細胞と接触させることと；ｄ）ハイブリドーマを作成するために免疫応答性細胞を調製することと；ｅ）コーティングした細胞と反応性のある抗体を産生するハイブリドーマを単離し、これによって細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製することと具備する。本発明は、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを通常発現しない細胞に対する抗血清を作成することと；ｂ）細胞表面発現タンパクを発現させるため、細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子を細胞中に導入することと；ｃ）細胞表面発現タンパクを発現する細胞を選択することと；ｄ）工程ａで作成した抗血清により、選択した細胞をコーティングすることと；ｅ）抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入することと；ｆ）コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定するために、得られた宿主をスクリーニングすることと；ｇ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出すことと；ｈ）こうして取り出した脾臓からハイブリドーマを調製することと；ｉ）細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をここから調製することとを具備する。本発明は、細胞表面発現タンパクに結合できるタンパクをコードするＤＮＡを単離する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを通常発現しない細胞に対する抗血清を作成することと；ｂ）細胞表面発現タンパクを発現させるため、細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子を細胞中に導入することと；ｃ）細胞表面発現タンパクを発現する細胞を選択することと；ｄ）工程ａで作成した抗血清により、選択した細胞をコーティングすることと；ｅ）抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入することと；ｆ）コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定するために、得られた宿主をスクリーニングすることと；ｇ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出すことと；ｈ）取り出した脾臓からＢリンパ球を単離することと；ｉ）異なるクローンを含有する組合せファージｃＤＮＡライブラリーを作成するために、Ｂリンパ球からＤＮＡを調製することと；ｊ）ライブラリー中のクローンを、工程（ｂ）からのコーティングした細胞と接触させ、ここでコーティングした細胞とクローンとの結合により、該クローンにより発現するタンパクが細胞表面発現タンパクに結合でることが示されることとを具備する。本発明は、１つの細胞タイプの表面に発現するが他の細胞には発現しない、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクを通常発現しない細胞に対する抗血清を作成することと；ｂ）細胞表面発現タンパクを発現させるため、細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子を細胞中に導入することと；ｃ）細胞表面発現タンパクを発現する細胞を選択することと；ｄ）工程ａで作成した抗血清により、選択した細胞をコーティングすることと；ｅ）抗血清でコーティングした細胞を、刺激して抗体を産生させることの可能な適切な免疫応答性細胞と接触させることと；ｆ）ハイブリドーマを作成するために免疫応答性細胞を調製することと；ｇ）コーティングした細胞と反応性のある抗体を産生するハイブリドーマを単離し、これにより細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製することとを具備する。本発明は、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子および選択可能なまたは同定可能な性質をコードする第２のＤＮＡ分子を、樹立した細胞株に導入することと；ｂ）選択可能なまたは同定可能な性質を発現するトランスフェクトされた細胞を選択することと；ｃ）こうして選択したトランスフェクトされた細胞を回収することと；ｄ）こうして回収した選択した細胞を、樹立した細胞株に対して作成した抗血清でコーティングすることと；ｅ）抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入することと；ｔ）コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定するために、得られた宿主をスクリーニングすることと；ｇ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出すことと；ｈ）こうして取り出した脾臓からハイブリドーマを調製することと；ｉ）細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をここから回収することとを具備する。本発明は、細胞表面発現タンパクに結合できるタンパクをコードするＤＮＡを単離する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子および選択可能なまたは同定可能な性質をコードする第２のＤＮＡ分子を、樹立した細胞株に導入することと；ｂ）選択可能なまたは同定可能な性質を発現するトランスフェクトされた細胞を選択することと；ｃ）こうして選択したトランスフェクトされた細胞を回収することと；ｄ）こうして回収した選択した細胞を、樹立した細胞株に対して作成した抗血清によりコーティングすることと；ｅ）抗血清でコーティングした細胞を適切な宿主に注入することと；ｆ）コーティングした細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定するために、得られた宿主をスクリーニングすることと；ｇ）こうして同定した宿主から脾臓を取り出すことと；ｈ）取り出した脾臓からＢリンパ球を単離することと；ｉ）異なるクローンを含有する組合せファージｃＤＮＡライブラリーを作成するために、Ｂリンパ球からＤＮＡを調製することと；ｊ）ライブラリー中のクローンを、工程（ｂ）からのコーティングした細胞と接触させ、ここでコーティングした細胞とクローンとの結合によって、該クローンにより発現するタンパクが細胞表面発現タンパクに結合できることが示されることとを具備する。本発明は、細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子および選択可能なまたは同定可能な性質をコードする第２のＤＮＡ分子を、樹立した細胞株に導入することと；ｂ）選択可能なまたは同定可能な性質を発現するトランスフェクトされた細胞を選択することと；ｃ）こうして選択したトランスフェクトされた細胞を回収することと；ｄ）こうして回収した選択された細胞を、樹立した細胞株に対して作成した抗血清によりコーティングすることと；ｅ）抗血清でコーティングした細胞を、刺激により抗体を産生させることの可能な適切な免疫応答性細胞と接触させることと；ｆ）ハイブリドーマを作成するために免疫応答性細胞を調製することと；ｇ）工程（ｄ）のコーティングした細胞と反応性のある抗体を産生するハイブリドーマを単離し、これにより細胞表面発現タンパクに特異的に結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製することとを具備する。一つの実施態様において、ＤＮＡ分子は、同時トランスフェクションにより樹立した細胞株に導入される。別の実施態様において、細胞表面発現タンパクをコードするＤＮＡ分子は、発現ベクターである。別の実施態様において、細胞表面発現タンパクは、Ｐ−糖タンパクである。別の実施態様において、細胞表面発現タンパクは、サイトカイン受容体である。さらなる実施態様において、サイトカイン受容体は、インターフェロン−アルファ受容体である。さらに別の実施態様において、サイトカイン受容体は、インターフェロン−ガンマ受容体である。また別の実施態様において、細胞表面発現タンパクは、腫瘍関連抗原である。さらに別の実施態様において、選択可能なまたは同定可能な性質をコードする第２のＤＮＡ分子は、プラスミドＤＮＡである。別の実施態様においで、プラスミドＤＮＡは、抗生物質に対する耐性をコードする。さらに別の実施態様において、プラスミドＤＮＡは、ｐＳＶ２−Ｎｅｏを含んでいる。別の実施態様において、細胞株は、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０５８４）である。本発明は、新生物ヒト細胞に関連する腫瘍関連抗原を特異的に認識しかつこれに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を調製する方法を提供する。この方法は、ａ）ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１０５８４）を、新生物ヒト細胞から単離したＤＮＡおよび選択可能なまたは同定可能な性質をコードするＤＮＡと同時トランスフェクションすることと；ｂ）選択可能なまたは同定可能な性質を発現するトランスフェクトされた細胞を選択することと；ｃ）こうして選択したトランスフェクトされた細胞を回収することと；ｄ）こうして回収したトランスフェクトされた細胞を、適切な第１のマウス宿主に注入することと；ｅ）注入したトランスフェクトされた細胞を誘導して第１のマウス宿主において腫瘍を形成させるのに有効な時間、得られた第１のマウス宿主を維持することと;ｆ)得られた腫瘍を第１のマウス宿主から単離することと；ｇ）こうして単離した腫瘍から腫瘍細胞を得ることと；ｈ）こうして得られた腫瘍細胞を、樹立した非ヒト非腫瘍形成性細胞株に対して作成した抗血清によりコーティングすることと；ｉ）抗血清でコーティングした細胞を適切な第２の宿主に注入することと；ｊ）新生物ヒト細胞と反応性のある血清を産生する宿主を同定するために、得られた第２の宿主をスクリーニングすることと；ｋ）こうして同定した第２の宿主から脾臓を取り出すことと；ｌ）こうして取り出した脾臓からハイブリドーマを調製することと；ｍ）細胞表面抗原を特異的に認識しかつこれに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をここから回収することとを具備する。ある実施態様において、新生物ヒト細胞は良性細胞である。別の実施態様において、新生物ヒト細胞は転移性細胞である。異なる実施態様において、新生物ヒト細胞は細胞株ＬＮＣａＰ由来のヒト前立腺癌細胞である（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１７４０）。別の実施態様において、細胞は、細胞株Ｔ４７Ｄ由来のヒト乳癌細胞である（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ１３３）。ある実施態様において、適切な第２の宿主はマウス宿主である。別の実施態様において、適切な第２の宿主は非ヒト霊長類宿主である。本発明は、新生物ヒト細胞に関連する細胞表面抗原をコードするＤＮＡを調製する方法を提供する。この方法は、ａ）ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞株を、新生物ヒト細胞から単離したＤＮＡおよび選択可能なまたは同定可能な性質をコードするＤＮＡと同時トランスフェクションすることと；ｂ）選択可能なまたは同定可能な性質を発現するトランスフェクトされた細胞を選択することと；ｃ）こうして選択したトランスフェクトされた細胞を回収することと；ｄ）こうして回収したトランスフェクトされた細胞を、適切な第１のマウス宿主に注入することと；ｅ）得られた第１のマウス宿主を、注入したトランスフェクト細胞を誘導して第１のマウス宿主に腫瘍を形成させるのに有効な時間だけ維持することと;ｆ)得られた腫瘍を第１のマウス宿主から単離することと；ｇ）こうして単離した腫瘍から腫瘍細胞を得ることと；ｈ）こうして得られた腫瘍細胞から新生物ヒト細胞に関連する細胞表面抗原をコードするＤＮＡを回収することと具備する。新生物ヒト細胞に関連する細胞表面抗原の配列を含有するＤＮＡ分子は、さらに単離することができる。ある実施態様において、新生物ヒト細胞は良性腫瘍細胞である。別の実施態様において、新生物ヒト細胞は転移性細胞である。異なる実施態様において、新生物ヒト細胞は、細胞株ＬＮＣａＰ由来のヒト前立腺癌細胞である（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１７４０）。別の実施態様において、新生物ヒト細胞は、細胞株Ｔ４７Ｄ由来のヒト乳癌細胞である（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ１３３）。別の実施態様において、新生物ヒト細胞は原発性腫瘍に由来するヒト神経膠芽腫（第IV 期星細胞腫）細胞である、さらなる実施態様において、新生物ヒト細胞は、患者由来の転移性大腸癌である、異なる実施態様において、選択可能なまたは同定可能な性質をコードするＤＮＡは、抗生物質に対する耐性をコードするプラスミドＤＮＡである。さらなる実施態様において、プラスミドＤＮＡは、ｐＳＶ２−Ｎｅｏを含み、選択は抗生物質Ｇ４１８による。上述の方法の細胞表面抗原には、腫瘍関連抗原、増殖因子受容体、ウイルスにコードされる表面発現抗原、癌遺伝子産物、表面エピトープ、典型的多剤耐性を仲介する膜タンパク、非定型多剤耐性を仲介する膜タンパク、腫瘍形成性表現型を仲介する抗原、転移性表現型を仲介する抗原、腫瘍形成性表現型を抑制する抗原、転移性表現型を抑制する抗原、並びにヒトインターフェロンαおよびインターフェロンγ受容体などのサイトカイン受容体が含まれるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様において、細胞表面抗原は、特異的免疫エフェクター細胞により認識される抗原である。さらなる実施態様において、特異的免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。異なる実施態様において、細胞表面抗原は、非特異的免疫エフェクター細胞により認識される抗原である。さらなる実施態様において、非特異的免疫エフェクター細胞は、マクロファージ細胞である。さらに別の実施態様において、非特異的免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー細胞である。本発明は、上述の方法で調製されたＤＮＡを提供する。本発明はまた、単離されたＤＮＡ分子とハイブリダイズ可能な核酸プローブを提供する。核酸プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。ある実施態様において、核酸プローブは、検出可能なマーカーにより標識される。さらなる実施態様において、ＤＮＡプローブは、検出可能なマーカーにより標識される。本発明はまた、被検体において新生物症状を診断する方法を提供し、この方法は、被検体からの試料を、上述のＤＮＡプローブが新生物症状に関連するＤＮＡとハイブリダイズすることができる条件下でＤＮＡプローブと接触させて、ハイブリダイズしたＤＮＡの存在を検出し、こうして新生物症状を診断することを具備してなるものである。本発明はまた、Ｐｒｏ１．１と呼ばれるモノクローナル抗体；Ｐｒｏ１．２と呼ばれるモノクローナル抗体；Ｐｒｏ１．３と呼ばれるモノクローナル抗体；Ｐｒｏ１．４と呼ばれるモノクローナル抗体；およびＰｒｏ１．５と呼ばれるモノクローナル抗体を提供する。本発明は、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の配列を有する哺乳動物の単離された核酸分子を提供する。この核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。本発明はまた、単離されたヒト核酸分子を提供する。本明細書に説明されかつ請求の範囲に記載される核酸分子は、ポリペプチドのアミノ酸配列に関してこれらが提供する情報のため、および種々の組換え法によるポリペプチドの大規模合成のための産物として有用である。この分子は、新規なクローニングベクターおよび発現ベクター、形質転換およびトランスフェクトされた原核および真核宿主細胞、並びにポリペプチドおよび関連産物の発現が可能なこのような宿主細胞の培養増殖のための新規で有用な方法を創作するために有用である。本発明はまた前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の配列と特異的にハイブリダイズすろことができる、少なくとも１５個のヌクレオチドの核酸分子を提供する。製造されるこの核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであってよい。本明細書で使用されるとき、「特異的にハイブリダイズする」という語句は、核酸分子の能力のうちで、それ自体に対して相補的である核酸配列を認識し、かつ相補塩基対の間の水素結合により二重らせんセグメントを形成する能力を意味する。前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５個のヌクレオチドのこの核酸分子は、プローブとして使用することができる。核酸プローブ法は、当業者にはよく知られており、当業者であれば、このようなプローブは長さが大きく変化してもよく、またこのプローブの検出を促進するため、放射性同位体または蛍光染料のような検出可能な標識によりこれを標識してもよいことは、容易に理解されよう。ＤＮＡプローブ分子は、当該分野で周知の方法を使用して、プラスミドまたはバクテリオファージのような適切なベクター中への、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１ＤＮＡ分子の挿入、続いて適切な細菌宿主細胞中への形質転換、形質転換した細菌宿主細胞における複製およびＤＮＡプローブの回収により製造することができる。あるいは、ＤＮＡ合成機により化学的にプローブを作成することができる。ＲＮＡプローブは、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６のようなバクテリオファージプロモーターの下流に前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１ＤＮＡ分子を挿入することにより作成することができる。大量のＲＮＡプローブは、適切なＲＮＡポリメラーゼの存在下で上流プロモーターを含有する、直鎖状化したＤＮＡ断片と共に標識ヌクレオチドをインキュベートすることにより製造することができる。本発明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に結合した前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の配列を有する、哺乳動物の単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の配列を有する哺乳動物の単離された核酸分子を含むベクターを提供する。ある実施態様において、ベクターはプラスミドである。本発明はまた、ＰＣＴＡ−１と呼ばれるプラスミドを提供する。このプラスミドＰＣＴＡ−１は、「特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約」の規定に従って、米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローンドライブ（Parklawn Drive）、ロックビル（Rockville）、メリーランド州２０８５２）に１９９５年１月１１日に寄託された。プラスミドＰＣＴＡ−１は、ＡＴＣＣ受託番号９７２０１が与えられた。ＰＣＴＡ−１遺伝子は、３８５０塩基対を含有する。これをpBluescriptベクターのＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。Ｔ３プロモーターは５ ’末端に近く、Ｔ７プロモーターはＰＣＴＡ−１の３’末端に近い。本発明はまた、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクをコードするｍＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズして、ｍＲＮＡ分子の翻訳を防止することができる配列を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はまた、細胞を含有する試料中の前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）細胞から全ＲＮＡを得ることと；（ｂ）こうして得られたＲＮＡを、ハイブリッド形成条件下で請求の範囲第７項記載の標識核酸分子と接触させることと；（ｃ）分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を測定し、これにより試料中の前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する工程とを具備する。本発明は、組織切片中の前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）組織切片を、標識核酸プローブと、プローブと前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１のＲＮＡのハイブリダイゼーションを可能にするハイブリッド形成条件下で接触させることと；（ｂ）プローブにハイブリダイズしたＲＮＡの存在を測定し、これにより組織切片中の前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する工程とを具備する。本発明はまた、ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に結合した上述の哺乳動物の単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、上述の哺乳動物の単離された核酸分子を含むベクターを提供する。ある実施態様において、ベクターはプラスミドである。別の実施態様において、ベクターはウイルスである。さらなる実施態様において、ウイルスはＤＮＡウイルスである。またさらなる実施態様において、ウイルスはＲＮＡウイルスである。別の実施態様において、ウイルスはレトロウイルスである。本発明は、精製された哺乳動物前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクを提供する。本発明はまた、上述の哺乳動物の単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドを提供する。本発明はまた、哺乳動物前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに特異的に結合できる抗体を提供する。本発明はまた、哺乳動物前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクとの上記抗体の結合を競合的に阻害することができる抗体を提供する。ある実施態様において、これらの抗体はモノクローナルである。本発明はまた、上述の抗体および薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤組成物を提供する。本発明はまた、上述の抗体および細胞毒性物質を含む、治療薬を提供する。細胞毒性物質は、放射性同位体または毒素であってよい。本発明は、生物学的試料中の前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する方法を提供する。この方法は、ａ）生物学的試料と哺乳動物前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに対する特異的な抗体とと、該抗体と哺乳動物前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクとの複合体の形成が可能な条件下で接触させることと；ｂ）該複合体の量を測定し、これにより該生物学的試料中の前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する工程とを具備する。ある実施態様において、試料は血清試料である。本発明はまた、被検体が転移可能性のある癌を担持しているかどうかを決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）被検体の血清試料中の前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定することと；（ｂ）工程（ａ）で測定した量と、健常被検体の試料から測定した量とを比較する工程とを具備する。本発明は、ある化合物が、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの発現を阻害することができるがどうかを決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）請求の範囲第１９項に記載の形質転換した細胞と適切な量の化合物とを、該化合物が前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの発現を阻害できる条件下で接触させることと；（ｂ）前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパク発現のレベルを検出し、この発現レベルの低下によって、前記化合物が前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの発現を阻害できることが示されることとを具備する。本発明は、ある化合物が、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに特異的に結合できるかどうかを決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）適切な量の精製した前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクと、適切な量の化合物とを、該化合物と精製したタンパクとの間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることと；、（ｂ）このような複合体を検出し、複合体の存在によって前記化合物が受容体に結合できることが示されることをと具備する。本発明は、上記方法により決定される前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１に結合し、またはその活性を阻害することができる有効量の化合物と、薬学的キャリアとを含有する薬剤組成物を提供する。本発明はまた、対象における転移可能性のある癌を治療する方法であって、有効量の上記薬剤組成物を、治療薬単体または組合せて、前記対象にに投与することを具備する方法を提供する。本発明は、前立腺癌誘導性遺伝子−１の配列を有する、哺乳動物の単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。本発明はまた、ヒト核酸分子を提供する。本発明はさらに、前立腺癌誘導性遺伝子−１の配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子を提供する。本発明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に結合した、前立腺癌誘導性遺伝子−１の配列を有する、哺乳動物の単離された核酸分子を提供する。本発明は、細胞における前立腺癌誘導性遺伝子−１の発現を検出する方法を提供する。この方法は、細胞から全ｍＲＮＡを得ることと、こうして得られたｍＲＮＡを、前立腺癌誘導性遺伝子−１の配列と特異的に結合できる少なくとも１５ヌクレオチドの標識核酸分子とを、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させることと、該分子にハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を測定し、これによって細胞中の前立腺癌誘導性遺伝子−１の発現を検出することとを具備する。本発明の１つの実施態様において、核酸は、溶解した細胞から沈降により抽出され、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子のポリＡテイルに結合するオリゴｄＴカラムを使用して、抽出物から単離される。次にｍＲＮＡは、ニトロセルロース膜上の放射性標識したプローブに暴露されて、ブローブは相補的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることにより、同配列を標識する。結合は、発光オートラジオグラフィーまたはシンチレーション計測により検出することができる。しかし、これらの工程を実施するための他の方法が当業者に知られており、上記は単なる一例に過ぎない。本発明はまた、組織切片中の前立腺癌誘導性遺伝子−１の発現を検出する方法を提供する。この方法は、組織切片と、前立腺癌誘導性遺伝子−１の配列と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１５ヌクレオチドの標識核酸分子とを、ハイブリッド形成条件下で接触させることと、該分子にハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を測定することによって、組織切片中の前立腺癌誘導性遺伝子−１の発現を検出することとを具備する。本プローブはまた、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションに、またはこの遺伝子を発現する組織の位置を特定するために、または種々の生物学的組織中のこの遺伝子若しくはそのｍＲＮＡの他のハイブリダイゼーション測定法のためにも有用である。標識核酸分子を使用するｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、当該分野でよく知られている。基本的には、組織切片を標識核酸分子と共にインキュベートして、ハイブリダイゼーションをさせる。この分子は、「標識」されているため検出用のマーカーを有しており、ハイブリッドの量は、マーカーの量の検出に基づき測定され、前立腺癌誘導性遺伝子−１の発現も同様に測定される。本発明は、ＲＮＡ転写のプローブに機能的に結合した前立腺癌誘導性遺伝子− １の配列を有する哺乳動物の単離された核酸分子を提供する。前立腺癌誘導性遺伝子−１の配列を有する哺乳動物の単離された核酸分子は、ベクター系に結合されていてもよい。プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターおよび他のウイルスを含む種々のベクターは、当業者にはよく知られている。本発明はまた、前立腺癌誘導性遺伝子−１の配列を有する単離された核酸分子を含むベクターを提供する、ある実施態様において、ベクターはプラスミドである。ある実施態様において、前立腺癌誘導性遺伝子−１配列は、pBluescriptベクターのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位にクローン化される。このプラスミドＰＴＩ− １（クローン１８）は、「特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約」の規定に従って、米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローンドライブ（Parklawn Drive）、ロックビル（Rockville）、メリーランド州２０８５２）に１９９５年１月１１日に寄託した。プラスミドＰＴＩ−１は、ＡＴＣＣ番号受託９７０２０が与えられた。ＰＴＩ−１遺伝子は、ＲＡＣＥにより１〜２５０塩基対までが決定され、残りはＰＴＩ−１によるクローンである。プラスミドＰＴＩ−１は、クローン１８であり、pBluescriptベクターＥｃｏＲＩ（挿入体の５’末端）およびＸｈｏＩ（３’ポリＡ側）に挿入された１９３７塩基対（２９塩基対＋１９０８塩基対）を含有する。この１９３７塩基対挿入体は、制限酵素ＸｈｏＩ＋ＥｃｏＲＩにより切断することができる。挿入体の５’末端はＴ３プロモーターに近く、３’末端はＴ７プロモーターに近い。実験により、挿入体の２９塩基対配列は、ＲＮＡの二次構造に由来し、そのため、この２９塩基対配列は、ＰＴＩ−１遺伝子の完全な配列（図８を参照のこと）には示されず、かつＲＡＣＥ法から得られる正しい配列により置換されたことが証明されている。最初の２９塩基対配列は、以下のとおりである：５’ＣＧＧＣＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＣＧＡＧＡＧＣＧＴＴＡＡＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＣＧＴＡＣＡＴＣＴＴ。３０〜１９３７塩基対（１９０７塩基対）の配列は、ＰＴＩ−１の完全な配列中の配列２１６〜２，１２３塩基対（１９０７塩基対）である（図８）。これらのベクターを得るための一例として、挿入体およびベクターＤＮＡは、両方とも制限酵素に暴露して、相互にハイブリダイズする両方の分子の相補末端を作成することができ、次にＤＮＡリガーゼにより一緒に連結される。あるいは、リンカーは、ベクターＤＮＡの制限部位に対応する挿入体ＤＮＡに連結することができ、次に、この部位で切断する制限酵素により消化される。ベクターを得るための他の手段も、当業者には利用可能であり知られている。本発明は、哺乳動物前立腺癌誘導性遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドの製造のための宿主ベクター系を提供する。この系は、上述のベクターおよび適切な宿主を含む。これらのベクターは、適切な宿主に形質転換されて、ポリペプチドの製造のための宿主細胞ベクター系を形成する。発現のために必要な制御要素には、ＲＮＡポリメラーゼに結合するためのプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターのようなプロモーター、および転写開始のためのシャインダルガノ配列および開始コドンＡＵＧを含む。同様に、真核発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼIIのための異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの脱離のための終止コドンを含む。このようなベクターは、市販されているか、または当該分野で公知の方法、例えば、一般にベクターを作成するために上述した方法により記載された配列から構築することができる。本発明はまた、哺乳動物前立腺癌誘導性遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造する方法を提供する。この方法は、上述の宿主ベクター系の宿主細胞を、ポリペプチドの製造を可能にする適切な条件下で増殖させることと、こうして製造したポリペプチドを回収することとを具備する。本発明はまた、上述の核酸分子を含む哺乳動物細胞を提供する。本発明は、精製された哺乳動物前立腺癌誘導性遺伝子−１タンパクを提供する。本発明はまた、前立腺癌誘導性遺伝子−１タンパクの配列を有する、哺乳動物の単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドを提供する。本発明はまた、上述の哺乳動物前立腺癌誘導性遺伝子−１タンパクを使用して、抗体を製造する方法を提供する。本発明は、哺乳動物前立腺癌誘導性遺伝子−１タンパクに特異的に結合できる抗体を提供する。ある実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。本発明はまた、上述の抗体および細胞毒性物質を含む、治療薬を提供する。ある実施態様において、細胞毒性物質は、放射性同位体または毒素のいずれかである。本発明はさらに、生物学的試料中の哺乳動物前立腺癌誘導性遺伝子−１タンパクの量を測定するための免疫測定法を提供する。この方法は、ａ）生物学的試料を、少なくとも１つの上述の抗体と接触させて、該抗体と哺乳動物前立腺癌誘導性遺伝子−１タンパクとの複合体を形成させるこ工程と；ｂ）該複合体の量を測定することにより、該生物学的試料中の前立腺癌誘導性遺伝子−１タンパクの量を測定する工程とを具備する。本発明はまた、細胞の腫瘍形成性形質転換を不活化する方法を提供する。この方法は、前立腺癌誘導性遺伝子−１の５’−ＵＴＲの発現を不活化することを具備している。ある実施態様において、不活化は、５’−ＵＴＲ配列のすべてまたは一部を欠失させることにより行われる。本発明は、前立腺癌誘導性遺伝子−２の配列を有する哺乳動物の単離された核酸分子を提供する。この核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ合成ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。本発明はまた、ヒト核酸分子を提供する。本発明はさらに、前立腺癌誘導性遺伝子−２の配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子を提供する。本発明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に結合した前立腺癌誘導性遺伝子−２の配列を有する、哺乳動物の単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、前立腺癌誘導性遺伝子−２の配列を有する、哺乳動物の単離された核酸分子を含むベクターを提供する。ある実施態様において、ベクターはプラスミドである。本発明はまた、ＰＴＩ−１と呼ばれるプラスミドを提供する。このプラスミドＰＴＩ−２は、「特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約」の規定に従って、米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Amer ican Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローンドライブ（Parklawn Drive）、ロックビル（Rockville）、メリーランド州２０８５２）に１９９５年１月１１日に寄託した。プラスミドＰＴＩ−２は、ＡＴＣＣ受託番号６９７４２が与えられた。ＰＴＩ−２は、１８１９塩基対のＤＮＡを含有する。これを、pBluescriptベクターのＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。Ｔ３プロモーターは５’末端に近く、Ｔ７プロモーターはＰＴＩ−２の３’末端に近い。ＰＴＩ−２の（１８１９塩基対）挿入体は、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ酵素により切断することができる。本発明は、前立腺癌誘導性遺伝子−３の配列を有する、哺乳動物の単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。本発明はまた、ヒト核酸分子を提供する。本発明はさらに、前立腺癌誘導性遺伝子−３の配列と特異的に結合できる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子を提供する。本発明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に結合した前立腺癌誘導性遺伝子−３の配列を有する、哺乳動物の単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、前立腺癌誘導性遺伝子−３の配列を有する、哺乳動物の単離された核酸分子を含むベクターを提供する。ある実施態様において、ベクターはプラスミドである。本発明はまた、ＰＴＩ−３と呼ばれるプラスミドを提供する。このプラスミドＰＴＩ−３は、「特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約」の規定に従って、米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Amer ican Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローンドライブ（Parklawn Drive）、ロックビル（Rockville）、メリーランド洲２０８５２）に１９９５年１月１１日に寄託した。プラスミドＰＴＩ−３は、ＡＴＣＣ受託番号９７０２２が与えられた。ＰＴＩ−３は、遺伝子の部分配列である。ＰＴＩ−３の１８６９塩基対のＤＮＡは、ＰＣＲ（登録商標）IIベクター（３．９kb）に挿入される。挿入体の５’ 末端はＳｐ−６プロモーターに隣接し、３’末端はＴ７プロモーターに隣接する。この挿入体を、ＥｃｏＲＩ制限酵素により切断して、１８６９塩基対のＤＮＡ（両方の側に余分に５塩基対のベクターを含む）を得ることができる。本発明は、以下の詳細な実験により理解を深められるであろう。しかし当業者であれば、検討される具体的な方法および結果は、本発明を説明するためのみであり、本発明はその後の請求の範囲により十分に記載されることは容易に理解するであろう。〔第一シリーズの実験〕＜材料と方法＞細胞タイプおよび培養条件ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞株（１１）は、親のＣＲＥＦ細胞に比較してトランスフェクトされた遺伝子の発現への高い感受性を示す、フィッシャー（Fische r）Ｆ２４０８ラット胚繊維芽細胞（ＣＲＥＦ）細胞株の特定のサブクローンである（１２）。ＬＮＣａＰ細胞株は、進行性前立腺癌の患者からの転移巣に由来し（１３）、A.K．Ng博士（コロンビア大学、医師および外科医のカレッジ（Col lege of Physicians and Surgeons）、病理学部、ニューヨーク、ニューヨーク州）およびSteven Harris博士（ダブリュー・アルトン・ジョーンズ細胞科学センター（W．Alton Jones Cell Science Center）、ニューヨーク、ニューヨーク州）により提供された。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ細胞は、ＬＮＣａＰ細胞からのＤＮＡとｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドと同時トランスフェクトされたＧ４１８耐性ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞の注入後にヌードマウスで誘導される腫瘍から得られた（１１）。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４−７ＮＭＴ細胞は、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４細胞からのＤＮＡとｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドと同時トランスフェクトされたＧ４１８耐性ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞の注入後にヌードマウスで誘導される腫瘍から得られた（１１）。ＭＤＲＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞は、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６を、ヒトＭＤＲ（ＰＧＹ１としても知られる）遺伝子（ｐＨａＭＤＲ１／Ａ）を含有する発現ベクタープラスミド［これは Michael M．Gottesman博士（国立癌研究所（National Cancer Institute）、ベセスダ、メリーランド州）により提供された］によりトランスフェクション（１４）して、前に報告されているようにコルヒチン耐性について選択する（１５）ことにより製造した。本研究のために、４つの独立のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ＭＤＲクローンを使用した：１）ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＡ１、２）ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＣ３、３）ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＤ２、および４）ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＦ４。４つ全てのＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ＭＤＲクローンは、親のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞よりもコルヒチンに対する耐性の上昇を示し、これらは、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびダクチノマイシンに対して交差耐性であった（データは示していない）。ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５およびＰＣ−３は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ロックビル（Rockville）、メリーランド州）から入手した。ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７は、Jphn W．Greiner 博士（国立癌研究所（National Cancer Institute））により提供された。ＭＣＦ７ＣＬ４Ｃ１（ＭＣＦ７ＣＬ４）は、コロンビア大学で出願人の１人の研究室で樹立したＭＣＦ７の単細胞由来のサブクローンである。ＭＤＲＭＣＦ７ＣＬ４サブクローン（ＭＣＦ７ＣＬ４：ＭＤＲ１、ＭＣＦ７ＣＬ４：ＭＤＲ IIおよびＭＣＦ７ＣＬ４：ＭＤＲ III）は、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ＭＤＲクローンについて使用した方法と同様にして入手した。ＭＣＦ７ＣＬ４：ＭＤＲＩ、ＭＣＦ７ＣＬ４：ＭＤＲ IIおよびＭＣＦ７ＣＬ４：ＭＤＲ III細胞は、ＭＤＲ１メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含有し、１７０kdのＰ−糖タンパクを発現し、そしてＭＣＦ７およびＭＣＦ７ＣＬ４細胞に比べて、コルヒチンおよびビンクリスチンに対する耐性の上昇を示した（データは示していない）。ＧＢＭ−１８腫瘍細胞は、第IV期星細胞腫（神経膠芽腫）の患者から得られた（１６）。正常ヒト皮膚繊維芽細胞ＮＨＳＦ−１は、皮膚生検から樹立し、Armand F．Miranda博士（コロンビア大学、病理学部）により提供された（１７）。ヒト黒色腫細胞株Ｈ０−１は、４９歳の女性から提供され、Be ppino Giovanella博士（ステーリン癌研究財団（Stehlin Foundation for Cance r Research）、ヒューストン、テキサス州）により提供された（１８）。ヒト黒色腫細胞株ＭｅＷｏは、Robert S.Kerbel博士（サニーブルック健康科学センター（Sunnybrook Health Science Center）、トロント、カナダ）により提供された。ヒト大腸癌細胞株のＷｉＤｒおよびＬＳ１７４Ｔは、John W．Greiner博士により提供された。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ＭＤＲサブクローン、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４−７ＮＭＴ、Ｈ０−１およびＭｅＷｏ細胞は、５％ウシ胎児血清を補足したダルベッコ改変イーグル培地中で３７℃で増殖させた。正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＳＦ−１）並びにＬＮＣａＰ、ＷｉＤｒ、ＬＳ１７４Ｔ、ＭＣＦ７およびＭＣＦ７ＣＬ４細胞およびＭＣＦＣＬ４ＭＤＲサブクローン細胞は、１０％ウシ胎児血清を補足したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。全ての細胞は、コンフルエンスになる前に、１：５または１：１０の新鮮培地に対する再懸濁した細胞の比で培養することにより対数増殖期で維持した。マウスポリクローナル抗体、酵素結合免疫吸着測定法、およびＳＥＭの調製メスのＢａｌｂ／ｃマウス（８〜１０週齢）（チャールズ・リバー飼育研究所（Charles River Breeding Laboratories）、ウィルミントン、マサチューセッツ州）を、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞により超免疫処理した。マウスの飼育は、施設の指針に従って行った。マウスには、０日目に、完全フロイントアジュバントと混合した、用手法により再懸濁したＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞（１：１）を皮下注射により投与した。７日目には、マウスに、不完全フロイントアジュバントと混合した、用手法により再懸濁したＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞（１：１）を皮下注射に上り投与した。１４日および２１日目には、マウスに、ハンクスのリン酸緩衝液中の用手法により再懸濁したＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞を腹腔内注入により投与した。３５日目には、眼窩後方（retro-orbital eye socket ）から血液を抜き取り、血清を調製し、酵素結合免疫吸着測定法により抗ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６活性に関して試験した。これらの測定法のため、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞をコンフルエンス近くまで９６ウェルマイクロタイタープレートで増殖させた。細胞は、リン酸緩衝液中の３．７％ホルマリンにより固定（室温で５分）し、１０％正常ヤギ血清によりブロック（３７℃で６０分）した。抗ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６抗血清は、固定したＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞に対して力価測定した（抗血清の連続希釈、３７℃で２時間）。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞への結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスイムノグロブリン二次抗体を使用して検出した（３７℃で６０分）。Ｈ２Ｏ２の存在下で３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（KirkegaardおよびPerry、ガイザースバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）を添加して、陽性結合を、分光光度計により色の変化をモニターして定量した（１９）。本試験において、ＳＥＭ法では、トランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスを超免疫処理する前に、高力価マウス抗ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６抗血清によりコーティングしてラットの抗原分子をブロックした。１〜３００万のトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞を、４℃ で一晩、１：１００希釈のマウス抗ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６抗血清と共にインキュベートした。ポリクローナル抗体でコーティングしたトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞をＢａｌｂ／ｃマウスへ注射する前に、まず細胞を１％中性緩衝化ホルマリン中で４℃で５分間インキュベートした。マウス抗ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６抗血清を作成するために利用したプロトコールと同様なプロトコールを使用して、２１日間にわたってホルマリンで固定した細胞を４回の注射によりマウスに与えた。超免疫化マウスの脾臓を取り出し、脾臓細胞を単離して、ＮＳ１マウスミエローマ細胞(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)と融合してすでに報告されているようにハイブリドーマを形成した(１９) 。免疫沈降分析免疫沈降分析は、すでに報告されているように実施した（２０）。ＣＲＥＦ− Ｔｒａｎｓ６、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４−７ＮＭＴ、ＬＮＣａＰ、およびＤＵ−１４５細胞を、６cmプレートで８０％コンフルエンスまで増殖させ、メチオニンを含まない培地で３７℃で１時間メチオニンを欠乏させ（２０）そして１mCiの［³⁵Ｓ］メチオニン（エクスプレス（E xpress）³⁵Ｓ；ＮＥＮケミカル、ボストン、マサチューセッツ州）を含む１mLの同じ培地中で３７℃で２時間標識した。細胞溶解物を調製して、Ｐｒｏ１．４モノクローナル抗体（ＳＥＭ法を使用して、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ細胞で調製したハイブリドーマにより産生された）によりすでに報告されているように免疫沈降させた（２０）。蛍光活性化細胞ソーター解析蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）解析は、すでに報告されているように実施した（２１、２２）。結果は、平均蛍光強度単位として表される。ヒト白血球抗原クラスＩ抗原に特異的なモノクローナル抗体は、Soldano Ferrone博士（ニューヨーク医科大学（New York Medical College）、ヴァルハッラ（Valhalla））により提供された。全ての試験は、各実験で２重の試料により少なくとも３回実施した個々の実験内の複製試料の変動は１０％またはそれ未満であり、実験間変動は一般に２０％またはそれ未満であった。＜実験結果＞ＭＤＲＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６およびＭＣＦ７細胞と反応するモノクローナル抗体の作成トランスフェクトされた標的細胞の細胞表面抗原と反応性のあるモノクローナル抗体を作成するためのＳＥＭ法の可能性を調べるために、出願人らは細胞表面上で発現する明確な分子、すなわち、典型的なＭＤＲ遺伝子産物を使用して最初の試験を行った。ＳＥＭプロトコールの概略図は、図１に示される。ＭＤＲ１遺伝子の過剰発現により、１７０kd膜糖タンパク（Ｐ−糖タンパク）の量が増大し、これが、アデノシン三リン酸依存性薬剤流出ポンプとして機能する［（２３）に総説されている］。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞をｐＨａＭＤＲ１／Ａ発現ベクター（１４）によりトランスフェクションし、コルヒチン中で生存するクローンを単離した。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲクローンは、ＭＤＲ１ｍＲＮＡを産生し、１７０kdのＰ−糖タンパクを発現し、そしてビンクリスチン、ドキソルビシン、およびダクチノマイシンを含む他の化学療法剤に対する交差耐性を示した（データは示していない）。ＭＤＲＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６クローン（すなわち、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＡ１）をＳＥＭ法と組合せて使用して、ＭＤＲＰ−糖タンパクに特異的なモノクローナル抗体を作成した。ホルマリンに固定し、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２１日間にわたって４回注射したＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞に対して産生したポリクローナル抗体により、ＣＲＥＦ− Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＡ１細胞をコーティングした。脾臓細胞を単離して、ＮＳ１マウスミエローマ細胞株と融合して、追加的に独立して誘導したＣＲＥＦ− Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲクローン上のＰ−糖タンパクの外側エピトープと反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが生じた（図２）。Ｐ−糖タンパクに特異的な４つのモノクローナル抗体、ＭＤＲ２．３、ＭＤＲ３．６、ＭＤＲ８．１２およびＭＤＲ９．７は、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＡ１、ＣＲＥＦＴｒａｎｓ６：ＭＤＲＣ３、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＤ２およびＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＦ４細胞と反応した。これに対して、異なるＳＥＭで得られたＭＤＲモノクローナル抗体は、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ、ＬＮＣａＰ、ＭＣＦ７、ＷｉＤｒ、ＬＳ１７４Ｔ、Ｈ０−１、ＭｅＷｏ、ＮＨＳＦ−１またはＧＢＭ−１８を含む、多くの非ＭＤＲ細胞とは反応しなかった（データは示していない）。次に出願人らは、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：ＭＤＲＡ１細胞と同じＭＤＲ１遺伝子およびＭＤＲ表現型を発現するさらなる細胞タイプも、同じＰ−糖タンパク表面抗原性エピトープを含有するかどうかを測定した。ｐＨａＭＤＲ１／Ａによりトランスフェクションし、コルヒチン耐性について選択することにより、ＭＤＲＭＣＦ７ＣＬ４細胞を作成した。ＭＣＦ７親細胞および単細胞由来ＭＣＦ７サブクローンのＭＤＦ７ＣＬ４は、ＭＤＲ表現型を示さず、モノクローナル抗体ＭＤＲ２．３、ＭＤＲ３．６、ＭＤＲ８．１２、またはＭＤＲ９．７と反応しなかった（図３）。しかしＭＣＦ７およびＭＣＦ７ＣＬ４細胞は両方ともヒト白血球抗原クラスＩモノクローナル抗体と反応した。ＭＣＦＣＬ４：ＭＤＲＩ、ＭＣＦＣＬ４：ＭＤＲ IIおよびＭＣＦＣＬ４：ＭＤＲ III細胞を含む独立に得られた一連のＭＤＲＭＣＦ７ＣＬ４サブクローンは、ヒト白血球抗原クラスＩおよびＳＥＭで得られたＭＤＲモノクローナル抗体の両方と反応することが判った（図３）。これらの結果は、トランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６でＳＥＭ法を使用して作成したモノクローナル抗体が、同じ表面局在分子を発現するさらなる細胞タイプとも反応することができることを示している。ヒト前立腺癌細胞と反応するモノクローナル抗体の作成ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６をヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰからの高分子量ＤＮＡとｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドとともに同時トランスフェクションし、続いてＧ４１８耐性について選択し、ヌードマウスに注射することにより腫瘍が形成された（１１）。腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞が、元の形質転換性ヒト腫瘍ＤＮＡに関連する新規な表面分子を示すかどうかを決定するために、出願人らは、原発性ヌードマウス腫瘍由来細胞株であるＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴを用いてＳＥＭ法を使用した（１１）。細胞をＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ポリクローナル抗体によりコーティングし、ホルマリンに固定して、Ｂａｌｂ／ｃマウスに反復注射したＭＤＲＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞について上述のように、ハイブリドーマを作成し、原発性腫瘍由来（ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ）および続発性腫瘍由来（ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４−７ＮＭＴ）細胞の両方と反応するモノクローナル抗体を産生する特異的なハイブリドーマを同定した（図４）。Ｐｒｏ１．１、Ｐｒｏ１．２、Ｐｒｏ１．３、Ｐｒｏ１．４およびＰｒｏ１．５と呼ばれるこれらのモノクローナル抗体は、ＦＡＣＳ解析によるとＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＮＨＳＦ−１、ＧＢＭ−１８、ＷｉＤｒ、ＬＳ１７４Ｔ、ＭｅＷｏ、またはＨＯ−１細胞と反応しなかった（データは示していない）。しかし５つ全てのモノクローナル抗体は、ＬＮＣａＰ細胞と反応し、特異的Ｐｒｏモノクローナル抗体も２つのさらなるヒト前立腺癌細胞株のＰＣ−３およびＤＵ −１４５と反応した（ＦＡＣＳ解析により証明される）。同じ細胞タイプに対する異なるＰｒｏモノクローナル抗体の表面結合の程度は様々であって、このことは、これらのモノクローナル抗体が、同じ腫瘍関連抗原の異なるエピトープを認識するかもしれないことを示唆している。大部分のＰｒｏモノクローナル抗体では、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴまたはＣＲＥＦ −Ｔｒａｎｓ６：４−７ＮＭＴ細胞とよりもＬＮＣａＰ細胞との方が結合が強い。ＰＣ−３およびＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞の場合には、５つのＰｒｏモノクローナル抗体の内４つ（１．２、１．３、１．４および１．５）がＰＣ−３細胞に結合したが、一方ＤＵ−１４５細胞ではＰｒｏ１．２、１．４および１．５のみで低レベルの結合が見られた。予備的ＦＡＣＳ解析でも、Ｐｒｏ１．１、１．３および１．５は、２つのヒト乳癌細胞株のＴ４７ＤおよびＭＣＦ７の表面への有意な結合を示すことが示された（データは示していない）。ＳＥＭ法を使用して作成されるＰｒｏモノクローナル抗体に関するさらなる情報を得るために、出願人らは、トランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６およびヒト前立腺癌細胞によりコードされるポリペプチドの免疫沈降分析を行った（図５）。細胞を［³⁵Ｓ］メチオニンで標識し、細胞溶解物を調製してモノクロコーナル抗体Ｐｒｏ−１．４と合せた。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により免疫沈降物を分析した（１９）。約４２kdのタンパクが、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４−７ＮＭＴ、ＬＮＣａＰ、およびＤＵ−１４５から製造した細胞溶解物から免疫沈降した（図５）。これに対して、この潜在的に新規な腫瘍関連抗原は、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＮＨＳＦ−１、ＧＢＭ−１８、ＷｉＤＲ、ＭｅＷｏ、またはＨ０− １細胞から得られた細胞溶解物では検出されなかった（図５および示していないデータ）。免疫沈降した４２kdの腫瘍関連抗原の相対量は、モノクローナル抗体Ｐｒｏ１．４およびＦＡＣＳ解析を使用した表面結合の最も高いレベルをも示した、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４−７ＮＭＴおよびＬＮＣａＰ細胞で最も多かった（図４）。これらの結果は、細胞表面上で発現する腫瘍関連抗原をコードする同定されていないヒト形質転換性遺伝子を含有するトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞で発現される表面発現ヒト抗原を認識するモノクローナル抗体を作成するために、ＳＥＭ法が使用できることを示している。＜実験の考察＞多くのクラスの新生物細胞には、正常細胞と比較して、発現されないかまたは低レベルで発現されるユニークなセットの腫瘍関連抗原が存在する［（２〜６）に総説］。これらの分子を検出するための古典的な方法は、腫瘍細胞株または原発性腫瘍試料から完全な細胞または細胞膜調製物を使用して、特異的な腫瘍関連抗原と反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成することである［（１〜３、６）に総説］。この方法は、面倒であり、かつ癌診断薬または治療薬への使用を可能にするのに必要な特異性を示すモノクローナル抗体の作成はうまく行かないことが多い（３、４、６）。標的細胞で誘導される機能的変化に依する代替の方策は、ＤＮＡトランスフェクションおよび「表面エピトープ遮蔽（surface-epitope masking）」と呼ばれる方法を使用する。本試験において、出願人らは、既知の表面発現分子、Ｐ−糖タンパクが仲介するＭＤＲ、および同定されていない推定ヒト前立腺癌遺伝子に特異的なモノクローナル抗体の作成のためのこの組合せ方策の有機溶媒性有用性を示している。ＳＥＭ法はまた、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞で発現される、ヒトγ−インターフェロン受容体（ Su，Z-z.，Pestka，S.，Fisher，P.B.：原稿準備中）および同定されていない推定ヒト乳癌遺伝子（Yemul，s.，Su，Z-z.，Leon，J.A.ら：原稿準備中）と反応するモノクローナル抗体を産生するために使用した。これらの結果全てが、トランスフェクションとＳＥＭの組合せにより、これらの産物をコードする遺伝子の本体に関して前もって知らなくても、ヒト腫瘍関連抗原に特異的なモノクローナル抗体を作成するための独特の機会が提供されることを示している。適切な発現ベクター遺伝子作成体を用いることにより、この方策はまた、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞で発現する、十分に性状解析された表面局在性タンパクと反応するモノクローナル抗体を作成するために使用することもできる。この組合せ方法は、少なくとも原理的には、「テスター」（新規な表面発現分子を発現するトランスフェクトされた細胞）と「ドライバー」（トランスフェクションしていない親の細胞）の間で表面分子の発現に特異的変化が発生する任意の実験モデルに応用できるはずである。ＬＮＣａＰ細胞からＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞に安定に移した推定腫瘍誘導性ヒト前立腺癌遺伝子の本体および機能は不明である。しかし、この潜在性前立腺癌遺伝子を含有するＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ細胞は、ＬＮＣａＰでトランスフェクトされた細胞とヒト前立腺癌細胞株の両方の表面抗原と反応性のあるモノクローナル抗体を作成するのに使用することができる。この能力は、トランスフェクトされた遺伝子と前立腺癌表現型の発現の間の潜在的な因果関係を示唆している。以前の研究（２４、２５）では、特異的なヒト腫瘍ＤＮＡによりトランスフェクトされた、形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、元の腫瘍細胞株並びに組織学的に類似した組織型により発現される表面抗原に特異的なモノクローナル抗体を作成するために使用することができることを示した。この方法は、ヒト膵臓癌(２４)および急性骨髄性白血病（２５）ＤＮＡにより形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３で発現される細胞表面抗原に特異的なモノクローナル抗体を作成するために使用されている。ヒト膵臓癌からのＤＮＡで形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して製造したモノクローナル抗体は、トランスフェクトされた形質転換細胞、元のヒト膵臓癌細胞株、および６つのさらなるヒト膵臓癌細胞株の表面抗原と反応した（２４）。これらのモノクローナル抗体は、トランスフェクションしていないＮＩＨ３Ｔ３細胞またはヒトリンパ芽球、黒色腫、前立腺癌、または正常ヒト皮膚繊維芽細胞細胞株とは反応しなかった(２４)。両方の研究からの結果(２４、２５)は、ＤＮＡトランスフェクションとモノクローナル抗体作成の組合せが、異なる組織学的腫瘍型により示される細胞表面エピトープに対して特異性を有するモノクローナル抗体を作成するのに有用かも知れないことを示している。この点に関して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において生物学的活性のない腫瘍誘導性遺伝子を同定するＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６の能力は、この新規なヒト腫瘍ＤＮＡトランスフェクション−受容細胞株が、特異的なヒト癌を仲介する潜在的に新規な遺伝子要素の同定とクローニングに有用かも知れないことを示している。本研究において、ＳＥＭ法は、細胞表面に接近可能な分子と反応性のある脾臓細胞の産生を促進するために使用した。次に脾臓細胞を使用して、接近可能な表面抗原と反応性のあるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造した。この原稿に記載されるＳＥＭ法は、ホルマリン固定工程後に、ポリクローナル抗体でコーティングしたテスター細胞で動物を免疫する。この方法は元々、直接診断能力を有する（すなわち、これらはホルマリン固定組織上の抗原を検出するために使用することができるであろう）モノクローナル抗体を効率よく製造するために採用された。ＳＥＭ法を使用して製造されるモノクローナル抗体は、生存細胞、凍結組織検体、およびホルマリン固定組織検体とホルマリン固定細胞の両方に対する特異性を証明した。本出願に記載されるＳＥＭ法は、固定剤感受性抗原と反応するモノクローナル抗体を作成するは予測できであろう。しかし、未固定抗体でコーティングした細胞の注入または新規な免疫複合体の使用（２６）を含む、ホルマリン固定以外の方法を使用するＳＥＭ法の改変により、細胞表面上で発現される分子の固定剤感受性抗原性エピトープと反応するモノクローナル抗体の作成が可能になる。最近になって、組合せ相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーが、抗原刺激脾臓細胞から直接ファージ中で調製される、「ファージ表示組合せライブラリー（ph age display combinatorial libraries）」とよばれる方法が開発された（２７、２８）。これに関連して、ＳＥＭ法に付されたトランスフェクトされた細胞を免疫原として使用して、抗原応答を刺激し、次に脾臓細胞を単離して組合せファージｃＤＮＡライブラリーを作成することができた。この方法により、次に形質転換に関わり、かつ特異的なヒト腫瘍関連抗原および細胞表面上で発現する他の分子をコードする遺伝子に関与する、潜在的に決定的に重要な遺伝子の直接同定を可能にした。マウスモノクローナル抗体を使用して、ラット胚繊維芽細胞細胞株ＣＲＥＦ− Ｔｒａｎｓ６のラット抗原性表面エピトープをコーティングするために、ＳＥＭ法を実施した。あるいは、ラットハイブリドーマまたはラット×マウスヘテロミエローマの作成のために、同系のフィッシャーラットにおける直接免疫原として、トランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞を使用することが可能であろう。これらの研究は未だ進行中であるが、マウスモノクローナル抗体でコーティングしたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６を使用するＳＥＭ法が、トランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞の同系ラットへの直接注入より好適であることは明らかである。マウスモノクローナル抗体は、比較的容易に産生することができ、大量の精製が非常にしやすい。さらに、マウスモノクローナル抗体の遺伝子操作に必要な手法（例えば、キメラ化、ヒト化、および二重特異性（bispecif ic）モノクローナル抗体）は容易に利用可能である（２９〜３１）。これらの遺伝学的方法は、イメージングのため、または治療薬としてヒトの臨床試験においてモノクローナル抗体が使用されるならば、極めて重要である（４〜６）。ＳＥＭ法の理論的な基礎は、抗原サブトラクション、すなわち、２つの遺伝子の類似した細胞タイプにより共有される抗原部位のブロッキングである。この方法により、新規な表面抗原の検出の感度が上昇する。本研究では、既知および同定されていない細胞表面分子を発現するトランスフェクトされた細胞を使用する、ＳＥＭ法の応用を強調した。しかし、ＳＥＭ法に適合させうる多くのさらなる状況を想定することができる。例えば、ＳＥＭプロトコールを使用して、転移性腫瘍細胞に発生する表面変化に対して特異的なモノクローナル抗体を作成することができる。このゴールを達成するために、ポリクローナル抗体を、原発性腫瘍に対して作成して、これらのポリクローナル抗体を使用して転移性腫瘍の表面エピトープを遮蔽することができる。この工程は、ハイブリドーマの作成、または表面発現転移性抗原に対して特異的な組合せファージｃＤＮＡ発現ライブラリーの作成のため動物を感作する前に行われる。同様に、特異的な組織型の正常組織に対してポリクローナル抗体を作成することができ、次にこれらのポリクローナル抗体を使用して同じ患者から得られた組織学的に類似の腫瘍の表面エピトープを遮蔽した。遮蔽した表面エピトープを有する細胞を次に、ハイブリドーマまたは腫瘍関連抗原に対して特異的な組合せファージｃＤＮＡライブラリーの作成のための感作脾臓細胞を発生させるように、動物に注入した。ＳＥＭはまた、膜局在性増殖因子受容体および細胞膜トランスポータータンパクの膜外ドメインに対して特異的なモノクローナル抗体の作成に理想的に適しているようであった。ＳＥＭ法の将来の応用はまた、モノクローナル抗体の作成および／または非特異的および特異的免疫エフェクター細胞の両方による腫瘍細胞認識の測定、非定型多剤耐性の仲介および自己免疫疾患のメディエーターの同定に関わる適切な遺伝子の単離を可能にする。＜第一シリーズの実験の参照文献＞〔第二シリーズの実験〕前立腺癌の発生と進展を仲介する関連するゲノム変化の解明は、有効な診断と治療に重要である。改良したＤＮＡ受容体細胞株のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６および同時トランスフェクション法を使用して、ヒト前立腺癌ＤＮＡと共に、推定される優性に作用するヌードマウス腫瘍誘導性腫瘍遺伝子のＰＴＩ−１を同定してクローン化した。差別的ＲＮＡ表示（differenrial RNA display）により、腫瘍から得られたトランスフェクトされた細胞において差別的に発現されるＲＮＡを表す新規な２１４塩基対ＤＮＡ断片が明らかになった。新規な２１４塩基対ＤＮＡ配列によるヒト前立腺癌（ＬＮＣａＰ）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、完全長２．０Kb ＰＴＩ−１ｃＤＮＡが同定される。配列解析は、ＰＴＩ−１が、ユニークな６３０塩基対の５’配列と、ヒト延長因子−１アルファ（human elongation factor-1 alpha）の端を切って突然変異した型と相同的な３’配列を含有する新規な遺伝子であることを示している。インビトロ翻訳により、ＰＴＩ−１ｃＤＮＡは、優勢な約４６kDaのタンパクをコードすることを証明する。ＰＴＩ−１遺伝子の５’領域に対応するＤＮＡ断片を用いてノーザンブロットのプローブ結合を行うと、ＬＮＣａＰでトランスフェクトされた腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、並びに前立腺、肺、乳房および大腸から得られたヒト癌細胞株からのＲＮＡ中で複数のＰＴＩ−１転写物が同定される。これに対して、ＰＴＩ−１ＲＮＡはヒト黒色腫、神経芽腫、骨肉腫、正常小脳または神経膠芽腫細胞株には存在しない。ユニークな６３０塩基対５’ＰＴＩ−１配列内の２７９塩基対領域を認識する１対のプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲにより患者由来の前立腺癌においてＰＴＩ−１の発現が検出されるが、正常前立腺または良性前立腺肥大（ＢＰＨ）では検出されない。これに対して、ＲＴ−ＰＣＲにより全ての前立腺組織検体においで前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の発現が検出される。これらの結果は、ＰＴＩ−１が、ヒト前立腺および他の組織における癌の発生に寄与しうる新規な推定癌遺伝子であることを示している。使用した方法である、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６系による迅速発現クローニングおよび差別的ＲＮＡ表示法は、さらなる新規なヒト癌遺伝子を同定しクローニングするために広く適用可能であることを立証している。アメリカ癌協会（American Cancer Society）は、１９９４年には２００，０００名のアメリカ人男性が前立腺癌の診断を受け、３８，０００名の罹患男性がこの疾患により死亡したであろうと推定している（１）。初期前立腺癌を検出する現在の方法は、その感度および特異性の両方において限定されている（２）。これらには、小さいかまたは中央部に位置する腫瘍を容易に見過ごしてしまう理学的検査、悪性前立腺疾患に特異的ではない血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）測定、および試料採取の過誤が誤った良性の診断を導く組織生検がある（３、４）。ＰＳＡレベルのモニタリング、超音波および骨スキャンのような、治療上の再発の予測因子および早期検出もまた、発見の前にかなり大きな腫瘍の再増殖を必要とするため、満足のいくものではない（５、６）。現在の方法を使用して臨床的に局在する疾患を有すると考えられる高率（４０〜５０％）の患者が、実際には急進的な手術に続発する潜在する疾患を含むと考えられる（７、８）。外科的介入は、進行性疾患の患者には適切な治療プロトコールであるとは考えられない。これらの知見は、前立腺癌を同定し、臨床的悪性度を予測するための改良された診断および治療の方法の必要性を強調している。癌の病因を研究する研究者の主要な目的は、腫瘍形成性を有する腫瘍細胞の遺伝子の同定である。このゴールを達成するための方法は、樹立した腫瘍細胞株または原発性腫瘍からの高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡの、ＤＮＡトランスフェクションによる適切な受容細胞株への移動を含む（９）。次に標的細胞を、形態学的形質転換、すなわち、焦点形成について調べる。この方法の変法には、ＨＭＷＤＮＡと選択可能な抗生物質耐性遺伝子（例えば、ｐＳＶ２ｎｅｏ）による標的細胞の同時トランスフェクション、抗生物質耐性についての選択、および次に腫瘍形成性を有する細胞のクローンを同定するためのヌードマウスへのプールした抗生物質耐性細胞の注入がある（１０）。これらの方法を使用する研究の大多数は、不死化マウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３に依存してきた（９、１０）。残念なことに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は一般に、ヒト腫瘍細胞株または臨床試料から新規な優性に作用する癌遺伝子を同定すること成功していないことが証明され、成功したときでさえ、これに続くクローニングが、遺伝要素はヒト癌の大部分に関係がないことを示している。これらの研究は、優性に作用するヒト癌遺伝子を同定するためのよりよい方法、および新規な腫瘍誘導癌遺伝子を検出するためのより適切な標的細胞株の必要を強調している。同時トランスフェクション／ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ（１１）、および新規ＤＮＡ受容細胞株であるＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６（１２）からのＨＭＷＤＮＡによるヌードマウス腫瘍測定法を使用する最近の研究は、優性に作用する腫瘍誘導性遺伝子の存在を示している（１２）。出願人らは今回、差別的ＲＮＡ表示（ＤＤ）法（１３）、ライブラリースクリーニング法（１４、１５）およびＲＡＣＥ法（１４）を使用して、新規な遺伝子である前立腺癌誘導性遺伝子−１（ＰＴＩ−１）をクローン化して性状解析した。完全長ＰＴＩ−１ｃＤＮＡは、２，１２３ヌクレオチドからなり、ヒト延長因子−１アルファ（ＥＦ−１α）の端を切り取った突然変異した型である配列に融合した、細菌のリボソーム２３ＳＲＮＡと相同的な配列を共有する新規な６３０nt領域を含有する。ＬＮＣａＰでトランスフェクトされた腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞、並びにヒト前立腺癌細胞株および患者由来前立腺癌は、ＰＴＩ−１を発現する。これに対して、ＲＴ−ＰＣＲを使用しても、正常前立腺または良性前立腺肥大（ＢＰＨ）組織検体では、ＰＴＩ−１ＲＮＡは明確ではない。ＰＴＩ−１の発現は、乳房、大腸および肺を含む別のヒト癌で起こるが、正常小脳、神経膠芽腫、黒色腫、神経芽腫または骨肉腫細胞株では起こらない。これらの観察は、ＰＴＩ−１が、特異的なヒト癌において発現を示す新規な遺伝要素であり、癌形成過程に寄与するものとしてＥＦ−１αにおける突然変異原性変化を意味している。＜材料と方法＞細胞株ＬＮＣａＰ細胞株は、進行性前立腺癌の患者からの転移性堆積物（１１）に由来し、Steven Harris博士（ダブリュー・アルトン・ジョーンズ細胞科学センター（W．Alton Jones Cell Science Center）、ニューヨーク州）により提供された。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６およびＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされたヌードマウス由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴは、以前に報告されたように単離した（１２）。ホルモン非依存性前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５、子宮内膜癌細胞株ＨＴＢ−１１３、小細胞性肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ６９およびヒト神経芽腫細胞株ＩＭＲ−３２は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から入手した。鼻咽腔癌細胞株ＫＢ３−１は、Michael M．Gottesman博士（ＮＣＩ、メリーランド州）により提供された。ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７およびヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒ、ＨＴ２９、ＳＷ４８０およびＬＳ１７４Ｔは、John W，Greiner博士（ＮＣＩ、メリーランド州）により提供された。ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄは、Ricard o Mesa-Tejada博士（メトパス社（MetPath Inc.）、ニュージャージー州）により提供された。正常ヒト小脳細胞株、ヒト神経膠芽腫細胞株ＧＢＭ−１８およびヒト神経芽腫細胞株ＮＢ−１１は、出願人らの研究室で樹立確立した（１７〜１９）。Ｈ０−１ヒト黒色腫細胞は、Beppino Giovanella博士（ステーリン財団（ Stehlin Foundation）、テキサス州）から入手した。Ｃ８１６１転移ヒト黒色腫細胞は、Danny R．Welch博士（ハーシー医療センター（Hershey Medical Center ）、ペンシルバニア州）により提供された。ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２は、 C.S．Hamish Young博士（コロンビア大学、ニューヨーク州）により提供された。種々の細胞タイプを増殖させる条件は、以前に報告されたとおりであった（１１、１２、１７〜１９）。ＲＮＡ調製、差別的ＲＮＡ表示（ＤＤ）およびＲＴ−ＰＣＲ全細胞質ＲＮＡは、以前に報告されたように対数増殖している細胞培養物から単離した（１４、１５）。正常前立腺および前立腺癌またはＢＰＨの患者からの組織検体は、液体窒素中で凍結して、ＲＮＡは、ギブコＢＲＬ（GibcoBRL）（メリーランド州）により記載されているようにＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して単離した。組織検体は、ヒト腫瘍協力ネットワーク（Cooperative Human Tumor Networ k）（ＣＨＴＮ）により供給された。正常前立腺の検体は、年齢＜４０歳の男性の剖検から入手した。全ての組織は、組織学的に、正常、ＢＰＨまたは前立腺の癌であることを確認した。ＤＤ法は、本質的にLiangとPardee（１３）により報告されたように行った。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６およびＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ細胞からの２μgのｍＲＮＡを、２，５μMのプライマーＴ１２ＧＣ（５’ −ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣ−３’）および２０μM ｄＮＴＰミックス（ＢＲＬ）の存在下で３００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）により、３５℃ で６０分間逆転写した。２μgのｃＤＮＡを、２μM Ｔ１２ＧＣおよび２μMの５’−プライマーＪＢ−２４（５’−ＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡ−５’）の存在下でＰＣＲ増幅した。試料を５％変性配列決定用ゲルで平行レーン中で分解して、差別的に発現されるバンドをゲルから取り出して、０．２×ＴＢＥ溶液中で電気溶出した。同じプライマー対を使用して差別的に発現される配列のＰＣＲ増幅を行い、続いてＴＡクローニングキットを使用した（インビトロジェン（Invitorogen））。予測される大きさの挿入体を含有するプラスミドを、サンガー法（シーケナーゼキット（Sequenase kit）、バージョン２．０、ＵＳＢ）により配列決定するか、または挿入体を単離して、ノーザンブロットをプローブ結合させるために使用した（１４〜１６）。適切なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲは以前に報告されたように実施した（１６）。ｃＤＮＡライブラリー作成、スクリーニングおよび配列決定ユニ−ＺＡＰＸＲ（Uni-ZAP XR）ベクター（ストラタジーン（Stratagene））でＬＮＣａＰｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーを作成し、以前に報告されたようにスクリーニングした（１４）。ＤＤにより得られた２１４塩基対ＤＮＡ内の２０量体（５’−ＡＡＣＴＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＣ−３’）によるＬＮＣａＰｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲ増幅により１．８kbのＰＴＩ−１ＤＮＡ断片を得た。最大のＰＴＩ−１挿入体を含有するプラスミドからの挿入体を、制限酵素ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化して切り出して、適切なＲＮＡ試料を用いてノーザンブロッティングにより試験して、アプライド・バイオシステムズ（ Applied Biosystems）（モデル３７３Ａ、バージョン１．２．１）配列決定機によりサンガー法を使用して配列決定して、遺伝子挿入体の両方の末端からオリゴヌクレオチドを合成した。ＲＡＣＥ法ＰＴＩ−１の５’伸長領域を同定するために、各々配列２６２〜２８３塩基対および３１７〜３３６塩基対のアンチセンス方向である、２２塩基のオリゴマー（Ｉ）（５’−ＣＣＴＴＧＣＡＴＡＴＴＡＡＣＡＴＡＡＣＴＣＧ−３’）および１９塩基オリゴマー（II）（５’−ＡＡＧＴＣＧＣＣＣＴＡＴＴＣＡＧＡＣＴ− ３’）を合成した。ＲＡＣＥプロトコールは、５’ＲＡＣＥ系（ギブコＢＲＬ（ GibcoBRL）、メリーランド州）を使用して以前に報告されたように行った（１４）。ＰＴＩ−１がコードするタンパクのインビトロ翻訳ＰＴＩ−１は、ＸｈｏＩで消化して直鎖化して、ｍＣＡＰｍＲＮＡキャッピングキット（ストラタジーン（Stratagene））を使用してｍＲＮＡを合成するための鋳型として使用した。ＰＴＩ−１のインビトロ翻訳は、ギブコＢＲＬ（Gibc oBRL）（メリーランド州）により記載された条件により、ウサギ網状赤血球溶解物翻訳キットを使用して行った。＜実験結果＞ＰＴＩ−１の同定と性質迅速発現クローニング系により、ＬＮＣａＰ細胞中の潜在的腫瘍形成性要素を同定した（１２）。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞とヌードマウス腫瘍由来ＬＮＣａＰでトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞であるＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴにおける差別的発現を示す遺伝子を同定するために、Lian gとPardee（１３）により開発されたＤＤ法を使用した。このプロトコールにより、ヌクレオチド組成または機能ではなく、大きさに基づき差別的に発現されるｃＤＮＡを同定することができる。ＤＤを使用するときしばしば遭遇する問題は、適切なＲＮＡ試料とノーザンブロッティングを使用して試験したときに差別的な発現を示さない増幅配列の同定である（１２）。この型の人為産物の一例、すなわち矢印のすぐ下のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴに存在するバンドが図６に示される。偽シグナルの頻度は、ＰＣＲ増幅とＤＤの前に、サブトラクションハイブリダイゼーションを使用することによりかなり低下させることができる（データは示していない）。ＤＤを使用して、ＬＮＣａＰでトランスフェクトされたヌードマウス由来のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞株である、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ中で２１４塩基対のＤＮＡ断片（ＰＴＩ−１）を同定したが、これは親のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞には存在しなかった（図６、矢印）。ＰＴＩ−１断片を単離し、クローン化し、配列決定して、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６；４ＮＭＴおよびＬＮＣａＰ細胞からのＲＮＡを含有するノーザンブロットをプローブ結合させるために使用した（図７）。この２１４塩基対のＰＴＩ−１ＤＮＡ断片は、新規な配列であり、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ、ＬＮＣａＰおよびホルモン非依存性前立腺癌細胞株のＤＵ−１４５に存在する幾つかのＲＮＡにハイブリダイズする（図７）。ＰＴＩ−１の完全な配列は、図８に示される。ＰＴＩ−１は、２，１２３塩基対よりなり、５’隣接領域（１〜２１５塩基対）は、ＲＡＣＥ５’−伸長により得られ、遺伝子の残り（２１６〜２，１２３塩基対）は、直接配列決定により決定した。プライマー伸長解析およびＬＮＣａＰｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより、ＰＴＩ−１が完全長ｃＤＮＡであることが確認された（データは示していない）。６３０〜２，１２３塩基対に伸長しているＰＴＩ−１の３’領域は、端を切り取ったヒトＥＦ−１α遺伝子と９７％の相同性を示す。ＰＴＩ−１の５’領域は、真核生物遺伝子との相同性は示さないが、代わりにマイコプラズマ・ヒオニュウモニー（Mycoplasma hyoneumoniae）からの原核生物性２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子と約８５％相同である。ＰＴＩ−１のこの領域は、ＤＤを使用して得られた２１４塩基対のＤＮＡマーカー（コア）配列を含有する（図６）。ユニークな５’領域はまた、多くの停止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡおよびＴＡＧ配列）を含有する（図８）。これらの観察は、ＰＴＩ−１が、２つの領域：５’のユニークな領域（６３０塩基対領域と３’の端を切り取って突然変異したＥＦ−１α 遺伝子）よりなる、融合遺伝子であることを示唆している。ＰＴＩ−１は、最後のアミノ酸Ｋの後に停止コドンを有する塩基対６２１〜１，８１４の読み取り枠を含有し、３９８aaのタンパクをコードする（図８）。ＰＴＩ−１のアミノ酸配列（１〜３９８aa）と部分ヒトＥＦ−１α（aa１〜４６２）との比較を図８に示す。ＰＴＩ−１および端を切り取ったヒトＥＦ−１αは、９８．４％の類似性と９７．７％の同一性を共有する。ＰＴＩ−１は、ヒトＥＦ − １αと同じカルボキシ末端を含有する。ＰＴＩ−１のＮ末端は、ヒトＥＦ−１α とは異なり、通常ヒトＥＦ−１αで見い出される６７aaの欠失およびＰＴＩ−１の３つのユニークなアミノ酸（ＭＱＳ）の挿入（このため、元のヒトＥＦ−１α のＮ未端（ＭＧＫ）とは異なる）よりなる。さらに、６つのアミノ酸フレーム内変化がＰＴＩ−１には存在する（図８）。Ｎ末端の６７アミノ酸の消失と特異的アミノ酸の変化（正に荷電したアミノ酸から正に荷電していないアミノ酸へ、およびヒドロキシル基含有アミノ酸から非ヒドロキシル基含有アミノ酸への変化）は、この突然変異ＥＦ−１αタンパクの三次元構造および機能に強い影響を与えることが予測される。配列解析に基づくと、ＰＴＩ−１は４３．８kDaのタンパクをコードするはずである。この予測を確認するために、ＰＴＩ−１ｃＤＮＡによりコードされるタンパクのインビトロ翻訳解析を行った（図９）。ＰＴＩ−１のインビトロ翻訳後に優勢に存在するタンパクは、約４６kDaのＭｒを有する。この値は、予測されたものより大きく、タンパク修飾、すなわち、ウサギ赤血球溶解物系でのリン酸化のために生じたのかもしれない。４つの別の少量のタンパク（Ｍｒ４１〜３０．５kDa）もインビトロ翻訳後に存在する。これらのタンパクは、恐らくＰＴＩ−１中の最初の開始コドン（ＡＴＧ）の下流の開始コドンでのタンパク合成の開始により生じる（図８）。患者由来組織および細胞株からのＲＮＡ試料中のＰＴＩ−１の発現重要な問題は、ＰＴＩ−１発現が、インビボの前立腺癌で発生するかどうかである。この解析のために、ＲＮＡを、手術中に得られた患者からの急速凍結前立腺試料から単離して、前立腺癌またはＢＰＨであることを組織学的に確認した。４０歳未満の男性からの剖検で得られた組織学的に正常な正常前立腺からのＲＮＡも抽出した。ユニークな６３０塩基対の５’ＰＴＩ−１配列から合成したプライマー（ＡおよびＬ）（図８）を用いてＲＴ−ＰＣＴ行うと、８つのヒト前立腺癌中７つで発現が見られる（図１０および示していないデータ）。これに対して、ＰＴＩ−１は、４つの正常前立腺または３つのＢＰＨ患者試料では発現されない（図１０）。これに対して、ＬＮＣａＰ並びに正常、ＢＰＨおよび癌を含む全ての前立腺試料は、ＰＳＡ発現が陽性であり、一方ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴおよびＤＵ−１４５はＰＳＡｆを発現しない（図１０）。全ての試料がＧＡＰＤＨ発現は陽性であった（図１０）。これらの結果は、ＰＴＩ−１がヒト前立腺癌で発現されるが、正常前立腺またはＢＰＨでは発現されないことを示している。さらなる細胞タイプにおけるＰＴＩ−１発現のパターンを決定するために、種々の細胞株からのＲＮＡを、ＰＴＩ−１およびＧＡＰＤＨをプローブとして使用して、ノーザンブロッティングにより解析した（図７）。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ、ＬＮＣａＰおよびＤＵ−１４５で発現することに加えて、ＰＴＩ −１発現は、ＮＣＩ−Ｈ６９（小細胞性肺癌）、Ｔ４７Ｄ（乳癌）、並びにＳＷ４８０およびＬＳ１７４Ｔ（大腸癌）を含む他のヒト癌で明白である。これに対して、ＰＴＩ−１発現は、ＨＴＢ−１１３（子宮内膜腺癌）、ＫＢ３−１（鼻咽腔癌）、ＭＣＦ７（乳癌）、ＷｉＤｒおよびＨＴＴ２９（大腸癌）、正常小脳、ＧＢＭ−１８（神経膠芽腫）、Ｈ０−１およびＣ８１６１（黒色腫）、ＮＢ−１１およびＩＭＲ−３２（神経芽腫）またはＳａｏｓ−２（骨肉腫）細胞では検出されない。これらの観察は、ＰＴＩ−１発現が、ヒト前立腺癌に限定されず、解析したヒト癌の約５０％に発生することを示している。＜実験の考察＞癌は、腫瘍細胞が、染色体異常および突然変異の頻度の上昇に相関する連続的な遺伝子の変化が顕在化する進行性の疾患である（総説２０〜２２）。最近の研究により、ＤＮＡ修復、ミスマッチ修復、ＤＮＡ複製および染色体分離を含む、ゲノムの安定性の維持に関係する遺伝子の突然変異は、癌細胞による突然変異誘発遺伝子表現型の獲得を引き起こし、これらをさらに突然変異を受けやすくして腫瘍の進行を引き起こすことが示唆されている（総説２１）。白血病においても、また特定の固形腫瘍においても、細胞遺伝学の改善した手法および分子的方法により、特異的な翻訳が、プロト癌遺伝子産物の活性化および腫瘍特異的な融合タンパクの創造を引き起こすことを示している（２２）。共通の観察は、両方の型の新規な腫瘍形成性要素はしばしば転写因子であり、このことは、転写制御の改変が、癌の発生および進展に直接に寄与しうることを示唆している（２２、２３）。真核生物開始因子と延長因子の両方の変化を含む、細胞の翻訳機構の修飾はまた、特異的標的細胞における形質転換に対する感受性および形質転換された腫瘍形成性の獲得を引き起こしうる（総説２４、２５）。例えば、通常は律速となるタンパク開始因子のｅＩＦ−４Ｅの過剰発現は、主な齧歯類の繊維芽細胞の形質転換を誘導するのにｖ−ｍｙｃおよびアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の両方と共同して（２６）、ＮＩＨ３Ｔ３とＲａｔ２細胞の両方で腫瘍形成性形質転換を誘導し（２７）、そしてＭａｘとの組合せでチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において腫瘍形成性表現型および転移性表現型の両方を誘導する（２８）。ＧＴＰとアミノアシル−ｔＲＮＡに結合して、リボソームのＡ部位でのこのアミノアシル−ｔＲＮＡのコドン依存性配置を引き起こすヌクレオチド交換タンパクである（２４、２５）、延長因子−１ａ（ＥＦ−１α）の発現の増強は、マウスおよびシリアンハムスター（Syrian hamster）細胞株に、発癌物質−および紫外光−誘導性形質転換に対する感受性を与える（２９）。野生型ＥＦ−１αのレベルの上昇も、正常組織と比較して、膵臓、大腸、乳房、肺および胃の腫瘍において起こる（３０）。さらには、ＲＮＡ翻訳の間８０ＳリボソームへのアミノアシルｔＲＮＡの輸送を仲介するヌクレオチド交換タンパクであるＥＦ−１γの発現の増強は、正常な外見の隣接する組織に比較して、膵臓腫瘍（７８％）、結腸直腸腫瘍（８６％）および結腸直腸腺腫（５６％）で高い割合で見い出される（３１〜３３）。これらの知見は、遺伝子転写とタンパク合成過程の両方の改変が、腫瘍形成に寄与することを示している。本研究は、腫瘍形成性形質転換および前立腺癌発生における、端を切り取り突然変異したＥＦ−１α遺伝子に結合したユニークな配列を含有する、新規な遺伝子ＰＴＩ−１を包含する。ＰＴＩ−１は、ＬＮＣａＰでトランスフェクトされた腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞、ヒト前立腺癌細胞株および患者由来の癌で発現されるが、一方発現は正常前立腺またはＢＰＨ組織では検出されない。ＰＴＩ−１ＲＮＡはまた、乳房、肺および大腸のさらなるヒト癌において見い出される。これらの結果は、ＰＴＩ−１発現が、ヒト癌に共通の変化であることを示している。ＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーからのＰＴＩ−１の直接クローニングは、この新規な細胞株が、元々この前立腺癌細胞株に存在し、ＣＲＥＦ− Ｔｒａｎｓ６細胞へのトランスフェクション、またはヌードマウスにおける腫瘍形成の選択中に生じる突然変異の結果として起こるのもではないことを示している。ＥＦ−１αは、細菌の延長因子−Ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ）に類似しており、両方ともタンパクのＧＴＰａｓｅスーパーファミリーのメンバーである（総説３４〜３６）。ＥＦ−Ｔｕ／ＥＦ−１αの主要な機能は、適切なコドン−アンチコドン結合相互作用を引き起こす速度論的プルーフリーディングの過程である（３６）。ＥＦ−Ｔｕの特異的順域の突然変異により、グアニンヌクレオチド放出タンパク（ＧＮＲＰ）と相互作用するＧ−４ＧＴＰａｓｅ中のグルタミン酸またはグルタミンによるＬｙｓ１３６の突然変異置換によるタンパク合成の優性な陰性阻害を含む、生物学的機能が変化する（３７）。大腸菌（Escherichia coli）およびサルモネラにおけるＥＦ−Ｔｕ変異体は、ミスセンスエラーの割合の上昇を示す（３８、３９）。ＥＦ−１αの変異体は、フレームシフトの頻度およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）のアミノ酸取り込みの誤りに直接影響しうる（４０）。ＥＦ−１αにおける単一アミノ酸置換が、コドン− アンチコドン一致の選択および／またはプルーフリーディングを変化させる（４０）、さらには、サッカロミセス・セレヴィシエにおけるＥＦ−１αのレベルを変更すると、ナンセンス突然変異の抑制に直接影響するため、これは、さらに翻訳の正確さに決定的に重要な関与を示している（４１）。これに関連して、ＰＴＩ−１によりコードされる突然変異したＥＦ−１αタンパクは、正常ＥＦ−１α の機能を修飾して、タンパク翻訳の正確さを低下させ、癌における特異的突然変異を抑制することができなくなる。この「翻訳の不正確さ」仮説が正しいならば、ＰＴＩ−１は、突然変異した「ゲノムの安定性」遺伝子を表し（２１）、癌細胞の突然変異誘発遺伝子表現型および腫瘍の進行への重要な寄与物質となりうる。発癌における重要な初期のイベントは、不死性または細胞寿命の延長を与える突然変異に関わる（２０、２１）。細胞老化の間、ＥＦ−１αのレベルおよび触媒活性は低下する（４２）。ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melan ogaster）におけるＥＦ−１αの強制発現は、対照のハエに比較して寿命を延長させる（４３）。老化に伴う増殖能力の低下は、有糸分裂能力の低下と相関する。この意味で、ＥＦ−１αが有糸分裂紡錘体形成に重要な要素であるという最近の証明（４４）は適切であろう。この報告で証明されるように、ＰＴＩ−１中のＥＦ−１α配列は、野生型ヒトＥＦ−１αに比べて、６７アミノ酸の欠失および６つの点突然変異を含有する（図８）。これらの変更のＥＦ−１αに対する関連は未知であるが、この遺伝子が前立腺癌発生の間、一連の段階的な突然変異を受けることはありうる。この仮説が正しいならば、ＰＴＩ−１遺伝子の構造の変化は、前立腺癌の発生と進行の遺伝子マーカーとなりうる。これらの仮説を検証し、ＰＴＩ−１および／または遺伝子修飾したＥＦ−１α遺伝子のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞における発現が、腫瘍形成性の獲得をもたらすかどうかを調べるための研究が現在進行中である。新規な癌遺伝子の同定およびクローニングを妨げる以前の制限は、感受性の高いトランスフェクション可能な指示細胞株が存在しないことであった。この問題はＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６クローンの同定により改善された（１２）。ＣＲＥＦ −Ｔｒａｎｓ６受容細胞株による迅速発現クローニングおよびＤＤ法を使用して、ヒト前立腺、乳房、肺および大腸癌において発現を示す新規な推定癌遺伝子ＰＴＩ−１が同定されクローン化された。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用する比較試験において、ＬＮＣａＰ細胞からの高分子量ＤＮＡと抗生物質耐性プラスミド（ｐＳＶ２ｎｅｏ）ＤＮＡの同時トランスフェクションは、ヌードマウスへのＧ４１８耐性細胞の注射後に腫瘍を引き起こさなかった（１２）。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６による迅速発現クローニングも、ヒト乳癌、神経膠芽腫および小細胞性肺癌細胞株、並びに患者由来の転移性大腸癌病変部からの腫瘍誘導性癌遺伝子の移動を引き起こす（データは示していない）。これらのヒト腫瘍ＤＮＡでトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６クローンに存在する優性に作用する遺伝子要素の同定は、知られておらず、これらの刺激的な予備的結果は、この新規な受容細胞株が、多様なヒト癌の発生に関与する潜在的に新規なヒト癌遺伝子を同定しクローニングするのに有用であることを示唆している。＜第二シリーズの実験の参照文献＞〔第三シリーズの実験〕アメリカ癌協会（American Cancer Society）は、１９９４年には２００，０００名のアメリカ人男性が前立腺癌の診断を受け、３８，０００名の罹患男性がこの疾患により死亡したであろうと推定している。初期前立腺癌を検出する現在の方法は、その感度および特異性の両方において限定されている。これらには、小さいかまたは中央部に位置する腫瘍を容易に見過ごしてしまう理学的検査、悪性前立腺疾患に特異的ではない血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）測定、および試料採取の過誤が誤った良性の診断を導く組織生検がある。ＰＳＡレベルのモニタリング、超音波および骨スキャンのような、治療上の再発の予測因子および早期検出もまた、発見の前にかなり大きな腫瘍の再増殖を必要とするため、満足のいくものではない。集中的な科学的努力にも拘らず、前立腺癌の発生と進展を仲介する関連するゲノムの変化はまだ規定されていない。さらに、特異的な前立腺癌の潜在的悪化に相関する生化学マーカーおよび分子マーカー、並びに疾患の進行を有効に防止する適切な治療法は現在のところ存在しない。現在多くの型の癌が、複合多重因子相互作用の結果であり、発癌は多段階プロセスであることが十分に確立されている。発癌に寄与している遺伝学的要因には、癌表現型を促進する優性に作用する癌遺伝子および癌過程の陰性阻害物質として機能する腫瘍抑制遺伝子がある。我々の大きな目標は、分子学的用語で前立腺癌を定義し、この悪性腫瘍に対するよりよい診断手段および治療法を設計するためにこの情報を使用することである。これらの目的を達成するために、この疾患の過程を誘導および阻害する遺伝子の両方を同定し性状解析することが必要となる。一旦ヒト前立腺癌の適切な遺伝子メディエーターが同定されれば、この情報は、より有効な診断手段を開発するために、さらに究極的にはこの広がった癌の改善された、遺伝子ベースかつ免疫学ベースの治療法を開発するために有用であることが立証されよう。迅速発現クローニング（ＲＥｘＣＳ）システムヒト癌の病因に関心のある研究者の主要な目的は、腫瘍形成性を有する腫瘍細胞内の遺伝子の同定である。このゴールを達成するために使用される１つの方法は、カルシウム介在ＤＮＡトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法または他の方法による、樹立した腫瘍細胞株または原発性腫瘍から単離された高分子量（ＨＭＶ）ＤＮＡの適切な細胞株への移動である。次に標的細胞は、形態的形質転換、すなわち焦点形成について検査される。この方法の変法は、ＨＭＷＤＮＡと選択可能な抗生物質耐性遺伝子（例えば、ｐＳＶ２ｎｅｏ）による標的細胞の同時トランスフェクション、抗生物質耐性の選択、および次に腫瘍形成性を有する細胞のクローンを同定するためのヌードマウスへのプールした抗生物質耐性細胞の注入を含む、これらの方法を使用する研究の大部分は、不死化マウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３に依存してきた。残念なことに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は一般に、ヒト腫瘍細胞株または臨床試料からの新規な優性に作用する癌遺伝子の同定に成功しておれず、成功したときでさえ、これに続くクローニングが、遺伝要素はヒト癌の大部分に関係がないことを明らかにした。これらの知見は、優性に作用するヒト癌遺伝子を同定するための改善法、および新規な腫瘍誘導癌遺伝子を発現することができるより適切な標的細胞株の同定の必要性を強調している。ヒト前立腺癌細胞中で優性に作用する癌遺伝子を同定するために、出願人らは、２つの方法（新規なＤＮＡアクセプター細胞株ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６によるＤＮＡ同時トランスフェクション法、および終点としてヌードマウスにおける腫瘍形成を両方とも利用する）を使用した。ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰからのＨＭＷＤＮＡおよびｐＳＶ２ｎｅｏＤＮＡによるＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６の同時トランスフェクション、Ｇ４１８耐性の選択およびヌードマウスへの注入により、腫瘍形成が起こった。これに対して、単層培養のみで維持した同様にトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞では形質転換焦点は見られなかった。ＬＮＣａＰおよびｐＳＶ２ｎｅｏＤＮＡと同時トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞では、優性に作用する焦点形成性または腫瘍誘導性の癌遺伝子は検出されなかった。原発性および続発性ヌードマウス腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞は両方とも、トランスフェクションしていないＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞には存在しないヒトの反復（Ａｌｕ）配列を含有する。共通のＡｌｕ断片は、原発性および続発性腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞両方のサザンブロットに存在する。腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞はまた、異なる見掛け分子サイズのさらなるＡｌｕ配列を含有する。このデータは、ヒト遺伝子が、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰから転移した非腫瘍形成性ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞において、潜在的に腫瘍形成性表現型を誘導することができることを支持する最初の証拠を提供した。分子的および免疫学的方法の両方を使用して、腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞は、（ａ）ヒト前立腺癌の病因に潜在的に関与する前立腺癌誘導性遺伝子（ＰＴＩ−１、ＰＴＩ−２、図１３およびＰＴＩ−３、図１４）を同定し、クローン化するために；そして（ｂ）ヒト前立腺癌細胞の表面および前立腺癌腫瘍抗原遺伝子（ＰＣＴＡ−１、図１５）と呼ばれる新規な腫瘍関連抗原をコードするｃＤＮＡのクローニング物と反応するモノクローナル抗体を製造するために使用されている。ＲＥｘＣＳの他の応用：ｐＳＶ２ｎｅｏＤＮＡ並びにヒト神経膠芽腫細胞株（ＧＢＮ−１８）、ヒト乳癌細胞株（Ｔ４７Ｄ）およびヒト小細胞性肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ６９）からの高分子量ＤＮＡによるＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６の同時トランスフェクションにより、ヌードマウスに腫瘍形成が起こる。同様に、ｐＳＶ２ｎｅｏＤＮＡおよび患者由来転移性結腸直腸癌からの高分子量ＤＮＡをＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６を同時トランスフェクションすると、ヌードマウスに腫瘍形成が起こる。腫瘍由来細胞株は、単離されて、今や、腫瘍形成性表現型を仲介する形質転換性遺伝要素をクローン化するために；およびＳＥＭ法により特異的なヒト癌により発現されるＴＡＡと反応する潜在的に新規なＭＡｂを開発するために使用することができる。前立腺癌誘導性遺伝子−１（ＰＴＩ−１）：ＰＴＩ−１は、ＲＮＡ差別的表示（ＤＤ）と呼ばれる方法を使用して、ＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞で最初に同定された。ＤＤにより、密接に関連した細胞タイプによりコードされる差別的に発現されるｍＲＮＡの同定およびクローニングが可能になる。基本的なＤＤ法は、（ａ）２つの密接に関連する細胞タイプからｍＲＮＡを単離し;（ｂ）このｍＲＮＡの３’末端にＰＣＲ産物を固定するプライマーと、種々の大きさの任意のオリゴヌクレオチドを含有する５’プライマーを使用して、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）産物を調製し；（ｃ）配列決定用ゲルの隣り合うレーンに両方の細胞タイプからのＲＴ−ＰＣＲ産物を流し；（ｄ）差別的に発現されたバンドを配列決定用ゲルから切り出し、ＰＣＲ産物を溶出して、ＰＣＲを増幅を行い；（ｅ）関連するＲＮＡ試料を含有するノーザンブロットを使用してＰＣＲ産物の発現について試験し；そして（ｆ）適切に発現された配列を配列決定して、以前に報告された遺伝子との同一性を決定することを含んでなる、一連の相互関連する工程を含む。ＤＤにおける改善は、ＲＴ−ＰＣＲを実施する前のサブトラクションハイブリダイゼーション工程の使用を含む。このＤＤの技術的改善は、標準的ＤＤを使用すると４０％を超えることもある偽陽性の数の劇的な低下をもたらす。ＤＤクローニング法は、今やトランスフェクションしていないＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞およびＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされたヌードマウス腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６クローンのＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴで使用されてＰＴＩ−１の同定に成功している（ＰＴＩ−２およびＰＴＩ−３は以下に記載される）。１２個のＴと特異性を提供するさらに２つの３’塩基より構成される固定されたオリゴーｄＴプライマーをを使用して、逆転写のためにｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルの亜集団の開始をアニーリングした。任意のプライマーのセットを、ｍＲＮＡからの逆転写により作成されるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のための５’−プライマーとして使用した。次にこれらの増幅したｃＤＮＡ断片を、変性ポリアクリルアミドゲル上で最大５００塩基対までのサイズにより分離した。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴには存在するが、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６には存在しない、２１４塩基対の差別的に発現されたバンドをゲルから切り出し、ＴＢＥ中で電気溶出して、ＤＤで使用したのと同じプライマーを使用してＰＣＲにより再増幅した。１％アガロースゲルから精製した２１４塩基対のＤＮＡ断片を、次にＰＣＲ（登録商標）IIベクターにクローン化して、ワンショット（ OneS hot）（登録商標）コンピタント細胞に形質転換した。この２１４塩基対ＰＴＩ −１と呼ばれる配列を、ノーザンブロッティング解析を使用して発現について試験した。ＰＴＩ−１はＬＮＣａＰおよびＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴでは発現したが、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ７）、ヒト神経膠芽腫（ＧＢＭ−１８）またはヒト黒色腫細胞（Ｈ０−１およびＣ８１６１）では発現しなかった。サンガー配列決定法を使用した２１４塩基対のＰＴＩ−１ＤＮＡ断片の配列解析では、種々の遺伝子バンクに寄託された以前に報告された遺伝子との相同性は示されなかった（ジーンバンク（GenBank）（Ｒ）、ブルックヘーブンタンパクデータバンク（Brookhaven Protein Data Bank）、ＥＭＢＬデータライブラリー）。２１４塩基対ＤＮＡの５’−および３’−フランキング領域を同定するために、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施した。ＲＡＣＥ法は、規定された内部部位と、ｍＲＮＡの３’または５’末端のいずれかを表す未知の配列の間のｍＲＮＡからの核酸配列の増幅のための方法である。ＲＡＣＥおよび２１４塩基対ＰＴＩ−１配列から設計したプライマーを使用して、ＰＣＲにより１．８KbのＰＴＩ−１ＤＮＡ断片を作成した。１．８KbのＰＴＩ−１ＤＮＡ断片を使用したノーザン解析では、２１４塩基対ＰＴＩ−１ＤＮＡ断片で得られたのと同じ反応性パターンが得られた。約６００塩基対のＰＴＩ−１ＤＮＡ断片の５’領域を配列決定した結果、報告されている真核生物遺伝子配列との相同性は示さないが、マイコプラズマ・ヒオニュウモニー（Mycoplasma hyo pneumoniae ）からの２３ＳリボソームＲＮＡと約８５％相同であることが判った。この１．８Kb ＰＴＩＤＮＡはＰＴＩ−３と呼ばれ、後述される。この１．８Kb ＰＴＩＤＮＡは、ユニ−ＺＡＰＸＲ（Uni-ZAP XR）ベクター中で作成されるＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために後で使用した。２つのクローンを同定した。１つは、クローン１８であり、これはＰＴＩ −１と呼ばれ；もう１つのクローン８は、ＰＴＩ−２と呼ばれ、後述される。ＰＴＩ−１遺伝子は、２つの部分よりなる；１つは、５’−ＲＡＣＥ伸長領域（１〜２１５塩基対）であり、もう１つは、クローン１８部分である。クローン１８（ＰＴＩ−１）は、pBluescriptベクター中に１９３７塩基対（２９塩基対＋１９０８塩基対）の挿入体を含有する。この実験は、５’末端の２９塩基対は、低い温度とＲＮＡの二次構造のために、誤った逆転写に由来することが証明されたため、この２９塩基対配列は、ＲＡＣＥ法により得られた正しい配列により置換され、ＰＴＩ−１の完全な配列には現れなかった。クローン１８の３０〜１９３７塩基対（１９０７塩基対）の配列は、図３の配列２１６塩基対〜２１２３塩基対（１９０７塩基対）として示された。プラスミドの寄託はクローン１８（ＰＴＩ−１）である。１．８Kb ＰＴＩ−１ＤＮＡの５’領域の配列を有する１対のオリゴヌクレオチドを合成して、細胞株とヒト組織試料の両方から単離したｍＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。この解析により、ＰＴＩ−１が、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ、ＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５（ホルモン非依存性ヒト前立腺癌細胞株）、８つの患者由来前立腺癌の内７つにおいて発現されることが示される。これに対して、ＰＴＩ−１は、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、Ｈ０−１、ＭＣＦ−７または正常ヒト前立腺若しくは良性前立腺肥大（ＢＰＨ）からの組織では発現されない。これらの研究は、ＰＴＩ−１が、ヒト前立腺癌細胞において形質転換および腫瘍形成のメディエーターであるか、またはこれらに関連するかもしれない新規なヒト癌遺伝子であることを示す。完全長ＰＴＩ−１ｃＤＮＡを同定するために、ユニ−ＺＡＰＸＲベクター中でＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーを作成した。１．８Kb ＰＴＩ−１ＤＮＡプローブを使用してＬＮＣａＰライブラリーをスクリーニングすると、このライブラリーから約２．０KbのＰＴＩ−１ｃＤＮＡを同定できた。２つの方法は、このＰＴＩ−１ｃＤＮＡが、完全長ｃＤＮＡであることを示す。１つの方法では、約２．０Kb ｃＤＮＡのプライマー伸長解析を使用し、第２の方法では、約２．０Kb ＤＮＡから転写したインビトロＲＮＡのインビトロ翻訳が関与する。赤血球翻訳系を使用して、約２．０Kb ＰＴＩ−１ｃＤＮＡから転写したＲＮＡは、幾つかのタンパク産物を作り出し、このうち約４６kDaのタンパクが優勢である。ＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーから単離した約２．０Kb ＰＴＩ−１ｃＤＮＡの、完全配列解析および存在するＤＮＡデータベースとの比較は、ＰＴＩ−１が、新規な融合遺伝子であることを示している。ＰＴＩ−１は、独特な６３０塩基対の５’配列と、ヒト延長因子−１アルファの端を切り取って突然変異した型と相同的な３’配列よりなる。配列および特異性に関するＰＴＩ−１の完全な説明は、我々のＰＮＡＳ論文に見い出すことができる。ＰＴＩ−１：ＰＴＩ−１のユニークな６３０塩基対の５’領域に存在する塩基用のプライマー配列（ＡおよびＬ）およびＰＴＩ−１の延長因子−１アルファ領域に対応するプライマー配列、並びにＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、ＰＴＩ−１に関して以下の追加的情報が現在利用可能である：（Ａ）組織分布の検討（クローンテック（ Clontech）からのポリＡ⁺ｍＲＮＡブロットを使用する）は、ＡおよびＬプライマー並びにＰＴＩ−１の延長因子−１アルファ相同領域に対応する領域をプローブとして使用して行われているた。ＰＴＩ−１のユニークな領域は、骨格筋および大腸組織のみで発現されるが、一方延長因子−１アルファは、全ての組織試料に存在するｍＲＮＡとハイブリダイズする。これらには、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢血白血球、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓がある。これらの研究は、ＰＴＩ−１のユニークな領域は、正常ヒト前立腺では発現されないという我々の以前の観察を強化する。（Ｂ）ＰＴＩ−１の発現（ＡおよびＬプライマー）は、ＬＮＣａＰ細胞におけるアポトーシスを誘導するホルボールエステル腫瘍プロモーター（１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）；スラミン（suramin）；上皮成長因子；トランスフォーミング成長因子−アルファ；または合成アンドロゲンのＲ１８８１により処理したＬＮＣａＰ細胞では低下する。前立腺特異抗原(ＰＳＡ)のプライマーを使用すると、ＬＮＣａＰ細胞において同じ薬剤を使用するＰＴＩ−１ｍＲＮＡレベルの低下も明らかである。これらの結果は、ＰＳＡ発現のダウンレギュレーションを誘導する同様な変化が、ヒト前立腺癌細胞におけるＰＴＩ−１発現をも低下させうることを示唆している。（Ｃ）発現はヒト前骨髄性白血病（ＨＬ−６０）および別の白血病細胞株Ｋ５６２において明らかである。ＴＰＡにより分化誘導されると、ＰＴＩ−１発現は低下し、ＨＬ−６０細胞における３時間の処理後にはもはや検出されない。ＴＰＡ処理後のｍＲＮＡレベルにおけるこの変化は、ＰＴＩ−１の発現低下は、成長阻止およびＨＬ−６０細胞における末端分化の機能として調節を受けることを示唆している；（Ｄ）野生５型アデノウイルス（Ａｄ５）、変異５型アデノウイルス（Ｈ５ｈｒ１）、Ｈａ− ｒａｓ癌遺伝子、ｖ−ｓｒｃ、ヒトパピローマウイルス１８型（ＨＰＶ−１８）およびＨＰＶ−５１を含む、多様に作用する癌遺伝子により形質転換したＣＲＥＦ細胞において発現は明らかである。マウス乳癌ウイルスプロモーターの転写制御下でＡｄ５Ｅ１Ａ形質転換性遺伝子を誘導可能なデキサメタゾン（ＤＥＸ）を使用すると、ＰＴＩ−１の発現は、ＤＥＸの存在下でのみ見られる。これらの培養条件下で、ＤＥＸはまたＥ１Ａの発現および形質転換を引き起こす。これらのデータは、ＰＴＩ−１の誘導は、機作の異なる癌遺伝子により誘導される形質転換と直接相関することを示している（ノーザンブロットの図；図１１）。ＰＴＩ−１の用途：ＰＴＩ−１のユニークな領域は、（Ａ）前立腺癌と正常またはＢＰＨ組織試料とを区別するＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーを製造するため（診断への応用）；（Ｂ）転移性を有し、前立腺から漏れでた前立腺癌細胞を同定するための血液試験の開発を可能にするため（診断への応用）；（Ｃ）拡散した転移性癌から生じた血流中の、別の癌、すなわち、乳癌、大腸癌および肺癌の同定を可能にするため（診断への応用）；および（Ｄ）前立腺癌細胞において、および恐らく他の癌および白血病細胞において、発現を阻害し、成長阻止および／またはアポトーシスを誘導するための、アンチセンスベクターおよび／またはリボザイム法を開発するため（治療への応用）に使用することができる。ＰＴＩ−１の突然変異した延長因子１−アルファ領域は、（Ａ）癌の発生と進展に傾く細胞の遺伝子変化を同定するため（診断への応用）；（Ｂ）癌の発生と進展を予測するのに有用であるこの遺伝子の点突然変異および／または欠失領域を同定するため（診断への応用）；および（Ｃ）延長因子１−アルファの突然変異型の発現を阻害しで癌の成長を抑制するためのアンチセンスおよびリボザイム法を開発するため（治療への応用）に有用であろう。ＰＴＩ−１および前立腺癌誘導性遺伝子−２（ＰＴＩ−２）：ユニ−ＺＡＰＸＲベクター（ストラタジーン（Stratagene））でＬＮＣａＰ細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製した。差別的表示法により得られた２１４塩基対ＤＮＡを含有する³²ｐ標識１．８Kb ＤＮＡ（ＰＴＩ−３）により、ＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１５０mm×１５mm（約２ ×１０⁴プラーク／プレート）の１０個のプレートの内容物を二重測定でナイロン膜に移した。以下の条件を使用してハイブリダイゼーションを行った：５％硫酸デキストラン、４５％脱イオン化ホルムアミド、４×ＳＳＣ、１mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５％ＳＤＳ、５％デンハルト試薬（Denhardt's reagent ）を４２℃でハイブリダイゼーション・インキュベーターモデル４００（ロビン科学（Robbin Scientific）中で；５５℃で６０分間０．２５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＣの溶液で洗浄。最初の実験で得られた陽性プラークを、第２実験のために二重測定でスクリーニングして、次にインビボの切除によりpBluescriptベクター中に遺伝子挿入体を含有するプラスミドを製造した。最長の挿入体を含有するプラスミドを、サザンブロッティングおよび１．８Kb（ＰＴＩ−３）ＤＮＡプローブによるプローブ結合により同定した。この方法を使用して２つのクローンを同定した：クローン８（ＰＴＩ−２）およびクローン１８（ＰＴＩ−１の部分配列）。ＰＴＩ−１の完全な配列は、２，１２３塩基対を含有し、５’フランキング（１〜２１５塩基対）は、ＲＡＣＥ５’伸長（ギブコ−ＢＲＬ（GIBCO-BRL））により入手し、残りの２１６〜２，１２３塩基対は、クローン１８の配列決定により得た。ＲＡＣＥ５’伸長は、２つのオリゴヌクレオチド（両方ともクローン１８の５’末端に位置する）により行った。１つのオリゴヌクレオチドは、２３量体（５’−ＣＣＴＴＧＣＡＴＡＴＴＡＡＣＡＴＡＡＣＴＣＧＣ−３’）であり、もう一方のオリゴヌクレオチドは、２０量体（５’−ＡＡＧＴＣＧＣＣＣＴＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣ−３’）である。ジーンバンク（GenBank）とのＰＴＩ− １の比較は、この遺伝子の３’部分（６３０〜２，１２３塩基対）がヒト延長因子１−アルファに対して９７％の相同性を有することを示している。この遺伝子の５’部分（１〜６２９塩基対）は、既知の真核生物遺伝子とは何ら相同性を示さない。ジーンバンク（GenBank）とＰＴＩ−２の比較は、これが、マイコプラズマ・フロックラー（Mycoplasma floccular）の１６ＳリボソームＲＮＡおよび２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子との１３５６塩基対の重複において８６．９％の同一性を有するが、以前に同定されている真核生物遺伝子とは何ら相同性を持たないことを示している。前立腺癌誘導性遺伝子−３（ＰＴＩ−３）：ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ（ＬＮＣａＰ細胞からのＤＮＡにより形質転換した）において特異的に発現するが、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６では発現しない遺伝子を同定するために、出願人らは、差別的ＲＮＡ表示法を使用した。この方法により、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞には存在しない、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ中の２１４塩基対のＤＮＡ断片を同定することができた（ＰＮＡＳ論文）。ノーザンブロッティングは、この２１４塩基対ＤＮＡがＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴおよびＬＮＣａＰ細胞では発現するが、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞では発現しないことを示している。２１４塩基対ＤＮＡ断片内に配列５’−ＡＡＣＴＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＣ−３’を有する２０量体オリゴヌクレオチドを使用して、ＲＡＣＥ法により２１４塩基対ＤＮＡを超える伸長配列を得た。オリゴｄＴを用いてＬＮＣａＰ細胞からｃＤＮＡを合成した。末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼにより３’末端にポリｄＣを添加した。アンカープライマー（ギブコ−ＢＲＬ（GIBCO-BRL）５’ＲＡＣＥキットのプロトコールを使用する）および上記２０量体を使用してＬＮＣａＰ細胞からｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施すると、２１４塩基対ＤＮＡの部分配列を含有する１．８Kb ＤＮＡ断片が得られた。この１．８Kb ＤＮＡ断片は、ユニークな２１４塩基対配列と同じノーザンブロッティングパターンを示す。ＴＡクローニングキット（インビトロジェン（Invitrogen））を使用することにより、１．８Kb ＤＮＡ断片をＰＣＲ（登録商標）IIベクターにクローン化した。この１．８Kb ＤＮＡの配列を、サンガー法（シーケナーゼキット（Sequen ase kit）、バージョン２．０、ＵＳＢ）により決定した。１．８Kb ＤＮＡは、ＰＴＩ−１／３の部分配列を含有する。ＰＴＩ−３遺伝子の５’および３’末端はまだ確認されていない。ＰＴＩ−３の１．８Kb挿入体の挿入体は、ＥｃｏＲＩを用いて消化することによりＰＣＲ（登録商標）IIベクターから回収することができる。ジーンバンク（GenBank）データベースとのＰＴＩ−３の配列の比較により、この遺伝子が、マイコプラズマ・フロックラー（Mycoplasma floccular）の１６ＳリボソームＲＮＡおよび２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子との１８５８塩基対の重複において８７％の同一性を有し、かつマイコプラズマ・ヒオニュウモニエ（Mycoplasma hyopneumoniae）の２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子との１５５８塩基対の重複において８９．８％の同一性を有することが示される。前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１（ＰＣＴＡ−１）：ＬＮＣａＰＤＮＡによりトランスフェクトされた腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞が、ヒト前立腺癌に関連する遺伝子情報をコードすることの証拠は、表面エピトープ遮蔽（ＳＥＭ）と呼ばれる方法を使用して得られている。ＳＥＭ法では、トランスフェクションしていない親の細胞（「ドライバー」と呼ばれる）に対する高力価ポリクローナル抗体により、遺伝子操作した細胞（「テスター」と呼ばれる）中に存在する表面抗原を選択的にブロッキングする。表面エピトープ遮蔽されたテスター細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに注射して、次に免疫脾臓細胞をこれらのマウスから取り出して、これらをミエローマ細胞と融合する。この方法により、トランスフェクトされたテスター細胞の細胞表面抗原および同じ表面分子を発現するさらなる細胞タイプと反応するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を分泌するハイブリドーマを効率的に作成することができる。ＬＮＣａＰでトランスフェクトされた腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴをテスター細胞株として使用した。ＳＥＭ法を適用して、ヒト前立腺癌ＤＮＡを得るために使用した元のＬＮＣａＰ細胞株、腫瘍由来の原発性および続発性ヌードマウストランスフェクション体並びに２つのさらなるヒト前立腺癌細胞株（ＤＵ−１４５およびＰＣ−３）の表面上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と反応するＭＡｂ産生するハイブリドーマを作成することができた。これらのＭＡｂは、Ｐｒｏ１．１〜１．５と命名されている。特異的ＭＡｂはまた、２つのヒト乳癌細胞株（ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ）への反応性も示している。しかしこれらは、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＳＦ−１）、２つの大腸癌細胞株（ＷｉＤｒおよびＬＳ１７４Ｔ）、２つのヒト黒色腫細胞株（Ｈ０−１およびＭｅＷｏ）主たはヒト神経膠芽腫細胞株（ＧＢＭ−１８）とは反応しない。ＰＣＴＡ−１Ｐｒｏ１．５ＭＡｂによる³⁵Ｓ−メチオニン標識細胞抽出物の免疫沈降分析は、原発性および続発性ヌードマウス腫瘍由来のＬＮＣａＰでトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞、ＬＮＣａＰおよびＤＵ−１４５細胞は、トランスフェクションしていないＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６または別のヒト腫瘍(黒色腫および神経膠芽腫を含む)には存在しない約４２kDaのタンパクを含有することを示す。これらの結果は、ヒト前立腺癌（および恐らく乳癌）ＴＡＡをコードする遺伝子がＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞に移され発現されていることを示している。ＰＣＴＡ−１をコードする遺伝子を同定するために、ＳＥＭにより得られたＭＡｂ（Ｐｒｏ１．５）を使用してＬＮＣａＰｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングした（ピコブルー（PicoBlue）イムノスクリーニングキット、ストラタジーン（STRATAGENE））。全ＲＮＡをオリゴ−ｄＴカラム（ギブコ（GIBCO））に流した後、ＬＮＣａＰ細胞からｍＲＮＡを単離した。ユニ−ＺＡＰ（Uni-ZAP ）ベクター（ストラタジーン（Stratagene））でＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーを作成した。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは以下のようにして実施した：（１）ＳＵＲＥ宿主細胞を６．５mLの上部寒天を有する１５個の１５０mm×１５mmＮＺＹプレートに接種した（約２×１０⁴プラーク／プレート）；（２）４２℃で３．５時間インキュベーション後、１０mM ＩＰＴＧ溶液で浸漬したニトロセルロースフィルターをプレートに適用してプラークを引き揚げた；（３）プラークリフトを含有するフィルターを３回または４回ＴＢＳＴ（２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ツイン−２０）で洗浄して、ブロッキング液（ＴＢＳ［２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ］中１％のＢＳＡ）に室温で１時間浸漬した；（４）次にフィルターを、Ｐｒｏ１．５腹水を含有する新鮮ブロッキング液（１：５００希釈）に移して、続いて室温で穏やかに振盪しながら３時間インキュベーションを行った；（５）フィルターを４×ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄した；（６）フィルターを、Ａｂ−ＡＰ結合体を含有する新鮮なブロッキング液（１：２０００希釈）に移して室温で１時間インキュベートした；（７）フィルターを４×ＴＢＳＴで洗浄し、０．３mg/ml ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム、０．１５mg/mlのＢＣＩＰ（リン酸５ −ブロモ−４−クロロ−３−インドリル）、１００mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ２）を含有する展開溶液に入れた；そして（８）２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ２．９）および１mM ＥＤＴＡを含有する停止溶液により反応を停止させて、フィルターを乾燥した。Ｐｒｏ１．５による最初のスクリーニングでは、３×１０⁶（１５×２×１０⁴）個を超えるコロニーからわずか２個の陽性クローンを得た。スクリーニングは２回目も行い、クローンを単離して性状解析した。この方法を使用して、約３．８KbのｃＤＮＡ挿入体を含有する抗体陽性クローンを同定した。ＰＣＴＡ−１の配列解析により、以前に同定されている遺伝子との相同性はないことが示されている。ＰＣＴＡ− １の５’領域は、幾つかの発現される配列断片［ホモ・サピエンス（Homo sapie ns ）の部分ｃＤＮＡ配列クローンＨＥＣ０７７、クローンｃ−ｚｖｈ０１、クローンｈｂｃ１１２７（３’末端）、クローンｈｂｃ１２０８（５’末端）およびクローンｈｂｃ１０７４（３’末端）を含む］と相同である（下記を参照のこと）。Ｐｒｏ１．５による免疫沈降を伴うおよび伴わないウサギ赤血球溶解物系におけるインビトロ翻訳は、約３６kDaのタンパクの存在が示す。これらの観察は、ＰＣＴＡ−１ｃＤＮＡは、ＳＥＭ法を使用して同定される前立腺癌細胞に存在する推定腫瘍関連抗原であるタンパクをコードすることを示す。（１）分子量１７０，０００の細胞表面輸送タンパクをコードする多剤耐性( ＭＤＲ)Ｐ−糖タンパクに特異的なＳＥＭにより得られたＭＡｂ：ＭＤＲを仲介するＰ−糖タンパクに特異的なＭＡｂを作成するために、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞をヒトＭＤＲ−１遺伝子によりトランスフェクションして、コルヒチンに耐性の細胞を単離した。これらのＭＤＲクローンは、ＭＤＲ遺伝子を含有し、ＭＤＲｍＲＮＡを発現し、そして幾つかの化学療法剤により誘導される毒性と交差耐性がある。ＭＤＲ−ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞をＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ポリクローナル抗体によりコーティングして、Ｂａｌｂ／ｃマウスに注射し、脾臓を単離してハイブリドーマを形成するために使用した。ＭＤＲ−ＣＲＥＦ− Ｔｒａｎｓ６細胞に特異的なＭＡｂを分泌するハイブリドーマを単離した。これらのＳＥＭにより得られたＭＡｂは、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）解析により証明されるように、ＭＤＲ−ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞と反応し、細胞表面で発現するＰ−糖タンパクのエピトープとのこれらの相互作用が確認された。さらに同じＭＤＲ−１遺伝子によりトランスフェクトされた、ＭＤＲ表現型を示すヒト乳癌（ＭＣＦ−７）細胞もまた、ＳＥＭにより得られたＭＡｂと反応する。これに対して、非ＭＤＲ親ＭＣＦ−７細胞は、これらのＭＡｂとは反応しない。これらの結果は、ＳＥＭ法を使用して、明確な細胞表面発現分子に特異的なＭＡｂを作成することができることを示している。(詳細は我々のＪＮＣＩ原稿に−Ｓhen，Sn，Olsson，GoldsteinおよびFisher）。（２）ヒト白血球インターフェロンα（ＩＦＮ−α）受容体に特異的なＳＥＭにより得られたＭＡｂ：ヒトＩＦＮ−α受容体に特異的なＭＡｂを作成するために、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞をヒトＩＦＮ−α受容体発現ベクターによりトランスフェクションして、受容体を発現するクローンを単離した。これらのクローンは、標識ＩＦＮ−αと相互作用したが、一方トランスフェクションしていないＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞はＩＦＮ−αと反応しない。これらの結果は、明確な細胞表面発現分子に特異的なＭＡｂの製造におけるＳＥＭ法の有効性をさらに説明している。（３）ヒト免疫インターフェロン（ＩＦＮ−γ）受容体に特異的なＳＥＭにより得られたＭＡｂ：ヒトＩＦＮ−γ受容体に特異的なＭＡｂを作成するために、ＣＲＥＦＴｒａｎｓ６細胞をヒトＩＦＮ−γ受容体発現ベクターによりトランスフェクションして、受容体を発現するクローンを単離した。これらのクローンは、標識ＩＦＮ−γと相互作用したが、一方トランスフェクションしていないＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞はＩＦＮ−γと反応しない。これらの結果は、明確な細胞表面発現分子に特異的なＭＡｂの製造におけるＳＥＭ法の有効性をさらに説明している。（４）ヒト前立腺癌と反応するＳＥＭにより得られたＭＡｂ：推定ヒト前立腺癌誘導遺伝子を含有するＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞であるＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴが、これもヒト前立腺癌細胞で発現する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を提示するかどうかを決定するために、ＳＥＭ法を使用した。この方法およびＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴクローンを使用する実験結果は、我々のＪＮＣＩ原稿に記載されている（Shenら，JNCI 86:91-98，1994）。ＳＥＭにより得られたＰｒｏＭＡｂ（Ｐｒｏ１．１、Ｐｒｏ１．２、Ｐｒｏ１．３、Ｐｒｏ１．４およびＰｒｏ１．５）は、ＬＮＣａＰ細胞並びに２つのさらなるヒト前立腺癌のＤＵ−１４５およびＰＣ−３との反応性を示す。特異的なＰｒｏＭＡｂはまた、２つのヒト乳癌細胞株のＴ４７ＤおよびＭＣＦ−７との表面反応性を示す。これらのＭＡｂは、ｉｎｓｉｔｕ免疫組織化学を使用して前立腺癌患者から得られた切片との反応性について現在試験している。ＳＥＭによりこれらのＰｒｏＭＡｂを作成できるということは、この方法が、起源が未知の細胞表面発現分子に特異的なＭＡｂを製造するためにも使用できるということを示している。Ｐｒｏ１．４ＭＡｂはまた、発現クローニングおよびヒト前立腺癌ライブラリースクリーニングと組合せて使用され、特異的なＴＡＡであるＰＣＴＡ−１をコードする遺伝子が同定されクローン化された。（５）ヒト乳癌と反応するＳＥＭにより得られたＭＡｂ：推定ヒト乳癌腫瘍誘導遺伝子を含有するＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞であるＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：Ｔ４７ＤＮＭＴが、これもヒト乳癌細胞で発現するＴＡＡを示すかどうかを決定するために、ＳＥＭ法を使用した。この方法により、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株と反応する、ＳＥＭにより得られたＢｒ−ｃａｒ（乳癌）ＭＡｂ（４．２．１および５．２．４）が作成できた。ｉｎｓｉｔｕ免疫組織化学（全１０試料）は、ＳＥＭにより得られたＢｒ−ｃａｒＭＡｂが、導菅性および髄様乳癌の患者からの癌切片とも反応することを示す（図１２）。これらのＭＡｂは、ヒト黒色腫および小細胞性肺癌の切片では陰性である（図１２）。ＳＥＭによりこれらのＢｒ−ｃａｒＭＡｂを作成できるということは、この方法が、起源が未知の細胞表面発現分子に特異的なＭＡｂを製造するために使用できるということをさらに説明している。ＳＥＭ法およびＳＥＭにより得られたＭＡｂの応用可能性：（Ａ）ＳＥＭ法は、細胞表面で発現する分子に特異的なＭＡｂを製造するための、一般的な方策である。これらは、新規なＴＡＡ、増殖因子受容体、Ｔ細胞反応性エピトープ、細胞表面抗原（異なる発生の段階を表す）、表面発現腫瘍遺伝子産物、細胞表面に見い出されるウイルスがコードするタンパク、腫瘍の進行の関数として発現する表面抗原（例えば、良性疾患および転移性疾患に関連する抗原）、非特異的免疫反応性細胞との反応性を誘発するおよび自己免疫疾患を誘発する表面抗原を含むが、これらに限定されない（診断および治療応用）；（Ｂ）ＳＥＭにより得られたＭＡｂは、ｉｎｓｉｔｕ免疫組織化学に使用して、増殖因子受容体、細胞表面抗原、表面発現腫瘍遺伝子産物、ＴＡＡおよび細胞表面に見い出されるウイルスがコードするタンパクを含む、特異的な細胞表面発現分子を同定することができる（診断応用）；（Ｃ）ＳＥＭにより得られたＭＡｂは、腫瘍細胞に対して、毒素および放射性核種を標的化するために使用することができる（治療応用）；（Ｄ）特異的な臨床的に重要な標的分子に対する高い反応性を有するＳＥＭにより得られたＭＡｂは、ヒトにおける診断応用および治療応用の両方のために、キメラ化（ヒト−マウス）およびヒト化ＭＡｂを作成するために使用することができる；（Ｅ）ＳＥＭにより得られたＭＡｂは、ＴＡＡおよび未知構造のさらなる細胞表面発現分子をコードする遺伝子をクローン化するために使用することができる。次にこれらの遺伝子は、診断応用および最終的には治療応用のために使用することができる；（Ｅ）ＳＥＭにより得られたＭＡｂは、潜在的に重要なＴＡＡを同定するために使用することができる。一旦適切な遺伝子および抗原が同定されると、これらは特異的なＴＡＡに対して予防接種するための方策の一部として使用することができる（治療応用）。〔第四シリーズの実験〕明確な細胞表面発現分子と反応するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の選択的製造は、現在免疫学的サブトラクション法である表面エピトープ遮蔽（ＳＥＭ）により容易に達成される。ＳＥＭを使用して、ヒト前立腺癌細胞株および患者由来癌で発現する腫瘍関連抗原と反応する、前立腺癌（Ｐｒｏ１．５）ＭＡｂは作成された。Ｐｒｏ１．５ＭＡｂによりヒトＬＮＣａＰ前立腺癌ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすると、遺伝子、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１（ＰＣＴＡ−１）が同定される。ＰＣＴＡ−１は、Ｓ−（可溶性）−ガラクトース結合レクチン（ガレクチン）遺伝子ファミリーのメンバーのＮアミノ末端領域と約４０％の配列相同性を共有する、約３５kDaの分泌タンパクをコードする。特異的なガレクチンは、ヒトおよびマウス新生物細胞の表面上に見い出され、腫瘍形成および転移に関与するといわれている。ＰＣＴＡ−１の３’未翻訳領域内のプライマー対および逆転写−ＰＣＲにより、正常前立腺および良性前立腺肥大に対して選択的な前立腺癌によるＰＣＴＡ−１の発現が証明されている。これらの知見は、ヒト前立腺癌で発現する腫瘍関連抗原と反応するＭＡｂの作成のためのＳＥＭ法の使用の根拠となる。ＳＥＭにより得られたＭＡｂは、このヒト腫瘍抗原をコードする遺伝子を発現クローン化するために使用されている。記載される方法である発現クローニングと組合せたＳＥＭは、ヒト癌に関連した遺伝子に特異的な免疫学的試薬を開発しこれを同定するため有用であろう。腫瘍細胞の表面には存在するが、正常細胞では制限された発現を示す抗原と反応するＭＡｂの製造は、しばしば困難で効率の悪いプロセスである（１〜３）。免疫学的サブトラクションに基づく方法のＳＥＭが開発され、この方法は、細胞表面で発現する分子に対する効率的なＭＡｂの作成を妨げる多くの限定を原則としてうまく回避することができる（３、４）。ＳＥＭは、遺伝子を修飾した標的細胞（すなわち、テスター）の抗原の、同じ未修飾の細胞株、すなわち、ドライバーに対して調製したポリクローナル抗体による選択的なブロッキングに基づく。抗原でブロックされた細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに注射して、感作した脾臓細胞を取り出し、ＮＳ１ミエローマ細胞に融合して、反応性ＭＡｂを分泌するハイブリドーマを単離する（３）。このＳＥＭ法は、多くの応用に成功して、既知および未知の機能を有する表面発現分子に特異的なＭＡｂの製造を可能にしている（３、４）。これらは、Ｍｒ１７０，０００のヒト多剤耐性タンパク（Ｐ−糖タンパク）およびヒトインターフェロン−ガンマ受容体と反応するＭＡｂを含む（３、４）。さらに、ＳＥＭは、適切な遺伝子修飾したＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６およびヒト前立腺癌細胞株で発現するＴＡＡと反応するＭＡｂのＰｒｏ１．１〜１．５を製造するために使用されている（３）。迅速発現クローニングと呼ばれる、優性に作用する腫瘍遺伝子を同定しクローニングするための改良法が開発されている（５、６）。この方法では、高分子量ヒト腫瘍ＤＮＡを新規なアクセプター細胞株のＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６にトランスフェクションし、ヌードマウスで腫瘍を誘導する遺伝子を発現する細胞を選択して、差別的ＲＮＡ表示のような分子生物学的方法を使用して推定腫瘍遺伝子をクローン化する（５、６）。腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞はまた、形質転換性ＤＮＡの最初の供給源として作用する癌細胞の細胞表面で発現するＴＡＡを同定するのにも有用であることが立証された（５、６）。これらのコードされたタンパクと反応する抗体を使用するｃＤＮＡの発現クローニングは、機能性遺伝子を同定しクローニングする直接の手段である（２）。この方法は、現在遺伝子（ＭＡｂＰｒｏ１．５により認識されるＴＡＡをコードする、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１（ＰＣＴＡ−１））を同定しクローン化するために使用されている。配列解析により、ＰＣＴＡ−１が、以前に同定された遺伝子との相同性のない３．８KbのｃＤＮＡよりなることが示されている。幾つかの重複した相同性は、発現されるヒト配列断片として以前に同定された幾つかの小さい不連続な部分ｃＤＮＡ配列（５００ヌクレオチド未満）で検出されている（７）。タンパク構造の解析は、ＰＣＴＡ−１は、ガラクトース結合レクチンタンパクのガレクチンのＳ−レクチンファミリーの特異的な構造ドメインと約４０％の相同性を有することを示す（８〜１０）。これらの高度に相同的なタンパクには、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞で発現する炭水化物結合３５kDaタンパクのＣＢＰ３５、転移性マウス腫瘍に存在する３４kDaガラクトース結合表面抗原、転移性ヒト腫瘍の３１k Daガラクトース結合表面タンパク、ベビーハムスター腎臓細胞、ラットおよびヒト肺で見い出される３０kDa炭水化物結合タンパクＣＢＰ３０、ラット好塩基球のＩｇＥ結合タンパクである２９kDaガラクトース結合レクチン、およびチオグリコール酸誘導性マウスマクロファージで見い出される３２kDa表面抗原Ｍａｃ− ２がある（６〜８）。Ｓ−レクチン（ガレクチン）タンパクの役割は、多様であり、細胞シグナル生成、増殖制御、細胞接着および細胞遊走を含む重要な生物学的プロセスに影響を与える（８〜１０）。これに関連して、ＰＣＴＡ−１がＳ− レクチン（ガレクチン）と相同性を有するタンパクをコードするという証明は、ヒト前立腺癌の発生と進展に関して、この分子を中枢的な位置に置いている。＜材料と方法＞細胞株ＬＮＣａＰ細胞株は、進行した前立腺癌の患者の転移性堆積物から得た(１１) 。ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、およびＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされたヌードマウス腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞であるＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴは、以前に報告されたように単離した（５）。ホルモン非依存性前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５およびＰＣ−３は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から入手した。種々の細胞タイプを増殖させるための条件は、以前に報告されたとおりとした（５、６、１１）。ｃＤＮＡライブラリー作成、発現クローニングおよび配列決定ＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーは、ユニ−ＺＡＰＸＲ（Uni-ZAP XR)ベクター（ストラタジーン（Stratagene）（登録商標））で作成した（６、１２、１３）。このｃＤＮＡライブラリーを、Ｐｒｏ１．５ＭＡｂを使用してピコブルー（picoBlue）イムノスクリーニングキット（ストラタジーン（Stratagene））のプロトコールによりスクリーニングした。宿主細菌細胞（シュア（SURE））を１５個の１５０mm×１５mmのＮＺＹプレートに接種して、約２０，０００プラーク／プレートが得られた。４２℃で３．５時間のインキュベーション後、１０ mM ＩＰＴＧ溶液に浸漬したニトロセルロースフィルターを、プラークリフトのためにコロニーの上に添加した。このフィルターを３〜４回ＴＢＳＴ（２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ツイン−２０）で洗浄して、ブロッキング溶液〔ＴＢＳ（２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ）中の１％ＢＳＡ］に浸漬して、室温で１時間インキュベートした。次にフィルターを、Ｐｒｏ１．５腹水を含有する新鮮ブロッキング溶液（１：５００希釈）に移して、穏やかに振盪しながら室温で３時間インキュベートした。４×ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄後、Ａｂ−ＡＰ結合体を含有する新鮮なブロッキング溶液（１：２０００希釈）にフィルターを移して、室温で１時間インキュベートした。０．３mg/ml ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、０．１５mg/mlのＢＣＩＰ（リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル）、１００mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００mM ＮａＣｌおよび５mM ＭｇＣｌ２を含有する溶液でフィルターを展開することにより陽性コロニーを同定した。停止溶液（２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ２．９）および１mM ＥＤＴＡ）を添加することにより反応を停止させた。ＰＣＴＡ−１を含有する陽性の１つのコロニーを単離した。ＰＣＴＡ−１の完全な配列は、サンガー法を使用して得た（１４）。pBluescripttベクター中のＰＣＴＡ−１挿入体の両側から合成された一連のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。配列解析は、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）（モデル３７３Ａ、バージョン１．２．１）配列決定機を使用して確認した。ＰＣＴＡ−１のインビトロ翻訳ＰＣＴＡ−１を含有するプラスミドＤＮＡを、ＸｍａIIIで消化して直鎖状にして、ｍＣＡＰｍＲＮＡキャッピングキット（ストラタジーン（Stratagene））を使用してｍＲＮＡを合成するための鋳型として使用した。ＰＴＩ−１のインビトロ翻訳は、ギブコＢＲＬ（GibcoBRL）（メリーランド州）により記載された条件によりウサギ赤血球溶解物翻訳キットを使用して行った（６）。マウスポリクローナル抗体の調製およびＳＥＭ報告されているようにＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ポリクローナル抗体を調製した（３）。このＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ポリクローナル抗体を使用してＳＥＭ法によりＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ細胞をコーティングして、Ｐｒｏ１．５ＭＡｂを分泌するハイブリドーマを製造した（３）。Ｐｒｏ１．５およびＰＳＡを用いる組織切片の蛍光細胞染色および免疫染色Ｐｒｏ１．５ＭＡｂを使用する蛍光染色は、以前に報告されているプロトコールを使用した（１５）。組織切片は、液体窒素で凍結した新鮮組織から調製した。幾つかの組織の連続切片を使用してＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡを調製した（６）。組織切片の染色は標準的プロトコールを使用した（スーパー高感度検出システム（Super Sensitive Detection System）（バイオジェネックス（BioGen ex））。簡単に述べると、切片をアセトンに固定し、３％Ｈ２Ｏ２で室温で７分間ブロックして、３％子ヒツジ血清を含有するＰＢＳ中で室温で２０分間インキュベートした。次に切片をＰｒｏ１．５（１：１００）またはＰＳＡ（１：２００）（ダコ社（DAKO Corporation））と共に室温で４５分間インキュベートした。試料を、ビオチン化二次抗体およびアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンと共にＰＢＳ中でインキュベートした。各インキュベーション工程の前に、切片を３〜５回ＰＢＳで洗浄した。反応性はＤＡＢを添加することにより検出し、カウンター染色はヘマトキシリンで行った。免疫沈降分析細胞を³⁵Ｓ−メチオニンで標識して、細胞溶解物を、以前に報告されているようにＰｒｏ１．５ＭＡｂを用いる免疫沈降分析により、ＰＣＴＡ−１タンパクレベルについて分析した（３、１６）。分泌されたＰＣＴＡ−１は、細胞を³ ⁵ Ｓ−メチオニンで４時間標識し、標識の非存在下でさらに２４時間細胞を増殖させ、培地を回収し、培地を濃縮してＰｒｏ１．５ＭＡｂによる免疫沈降分析を行うことにより検出した。ＲＮＡ調製およびＲＴ−ＰＣＲ以前に報告されているように、対数増殖している細胞培養物から全細胞質ＲＮＡを単離した（６、１３）。正常前立腺および前立腺癌またはＢＰＨの患者からの組織試料は、液体窒素で凍結して、ギブコＢＲＬ（GibcoBRL）（メリーランド州）により記載されたように、トリゾール（TRIzol）試薬を使用してＲＮＡを単離した。組織試料は、ヒト腫瘍協力ネットワーク（Cooperative Human Tumor Ne twork）（ＣＨＴＮ）により供給された。正常前立腺の３つの試料は、年齢＜４０歳の男性の剖検から入手した。全ての組織は組織学的に、前立腺が正常、ＢＰＨまたは癌として確認した（６）。ＰＣＴＡ−１、ＰＳＡおよびＧＡＰＤＨについでプライマー対を使用するＲＴ−ＰＣＲは、以前に報告されているように行った（６、１６）。＜実験結果＞ＳＥＭによるＰｒｏ１．５ＭＡｂｓの産生、およびＰｒｏ１．５とＰＳＡの正常なプロテアーゼ、ＢＰＨおよび前立腺癌との反応性マウスに注射する前にＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６ポリクローナル抗体で、ヌードマウスの腫瘍由来ＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞上の抗原性エピトープを阻止するＳＥＭ法を用いて、ＭａｂのＰｒｏ（前立腺癌）シリーズを分泌するハイブリドーマを産生させた（３）。ＰｒｏＭａｂは、ｉｎｓｉｔｕ蛍光顕微鏡および蛍光活性化細胞ソーター解析により、ＬＮＣａＰでトランスフェクトされた原発性（ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ）と続発性腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞およびＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５とＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞株上の腫瘍関連抗原の表面発現を検出できる（３）（図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび示していないデータ）。これに対して、Ｐｒｏ１．５は、蛍光顕微鏡またはＦＡＣＳを用いてもＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞とは反応しない（３）。ヒト前立腺癌細胞中のＰｒｏ１．５との染色パターンは、特異的ガレクチン（galectins）と反応するＭａｂですでに観察されたように、ミクロクラスターを有して不規則である（１０、１７、１８）（図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ）。免疫沈降解析では、ＬＮＣａＰでトランスフェクトされた原発性と続発性腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞、ＬＮＣａＰ、ＤＵ −１４５およびＰＣ−３細胞からの溶解物中で約３５〜４２キロダルトンタンパクが同定される（図１Ｄおよび示していないデータ）。検討した前立腺癌細胞株中で、ＰＣ−３クローンは、最少量の細胞関連、表面発現（ＦＡＣＳ）および分泌されたＰＣＴＡ−１タンパクを含有する。Ｐｒｏ１．５Ｍａｂが患者由来の前立腺癌試料と反応するか否かを検討するために、正常（男性＜４０才）、ＢＰＨおよび前立腺癌から凍結切片を準備した。正常な前立腺はＰｒｏ１．５とは限定された反応性を示すが、ＰＳＡは正常な前立腺上皮細胞を容易に染色する（図１７）。予想されるように、ＰＳＡはまた、ＢＰＨと前立腺癌の組織切片中の前立腺細胞も染色する。ＭａｂＰｒｏ１．５は、凍結組織切片中に存在する前立腺癌細胞と強く反応するが、正常な前立腺またはＢＰＨ上皮を含有する、隣接する良性の腺または組織切片とは反応しない。しかし、前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）中で、Ｐｒｏ１．５とのある程度の反応性が見られる。これらの研究は、Ｐｒｏ１．５Ｍａｂは前立腺癌とＰＩＮ対、常な前立腺上皮細胞とＢＰＨを区別することができることを示す。この意味でＰｒｏ１．５は、非特異的前立腺上皮細胞マーカーであるＰＳＡの検出のための差別能以上の、前立腺癌の検出のための差別能を有する。ＳＥＭにより得られたＰｒｏ１．５Ｍａｂを用いるＰＣＴＡ−１の発現クローニングＭＡｂＰｒｏ１．５によりヒト前立腺癌細胞上で同定されるＴＡＡをコードする遺伝子を同定するために、抗体発現クローニング法を行った。Ｕｎｉ−ＺＡＰＸＲベクター（ストラタジーン（Stratagene）（登録商標））でＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーを作成し、Ｐｒｏ１．５Ｍａｂでスクリーニングした(１２、１３)。この方法により、ＰＣＴＡ−１と呼ぶ３．８KbのｃＤＮＡクローンを同定した。ＰＣＴＡ−１ｃＤＮＡのインビトロタンパク翻訳により、約３５k Daの３１７aaのタンパクが得られた（データは示していない）。ＰＣＴＡ−１のＤＮＡ配列は、これまでに同定された遺伝子とは相同性を示さないが、タンパクを比較するとＰＴＣＡ−１タンパクはガラクトース結合レクチンタンパクのＳ− レクチンファミリーであるガレクチンの特異的領域と約４０％の相同性を有する（図１８Ａ、１８Ｂ）。ＰＣＴＡ−１と他のガレクチンの間でいくつかの型のタンパク配列の相同性が見いだされている。同一のアミノ酸の帯がＰＣＴＡ−１と小さな約１４kDaと大きな約２９〜３４kDaガレクチン（例えば、ＨＦＮＰＲＦ、ＩＶＣＮおよびＷＧ）の両方で見いだされている。これらのアミノ酸は充分保存されており、ウナギ、ニワトリ、マウス、ラット、ウシおよびヒトを含む多様な種から単離されたガレクチン中に見いだされている（図１８ｂ）（１０、１９、２０）。これらはガレクチンの重要な構造成分であり、その推定リガンドへのガレクチンの結合を仲介するかも知れない（１０）。おそらく関係のあるのは多くのガレクチンの保存領域に通常存在する２つのアミノ酸の、ＰＣＴＡ−１中の置換、すなわちＲの代わりにＩおよびＦの代わりにＴの置換である（図１８Ｂ）。多くの同様の位置のアミノ酸がＰＣＴＡ−１と大きな約２９〜３４kDaヒトおよびマウスガレクチンの間に見いだされ、これらは多くの他の種から単離される約１４kDaガレクチン中には存在しない（例えば、ＤＶＡＦとＷＧＲＥＥ）（図１８Ｂ）。さらに、多くのアミノ酸が、ヒトガレクチン−３Ｌ２９およびヒトＬ −３１タンパク中のＰＣＴＡ−１対他の同様の位置のアミノ酸について見いだされる（ＲＡ、ＫＲＡＧ、ＬＩ、およびＩＴＹＤＴを含む）。ＰＣＴＡ−１と他のガレクチンの間の保存された構造の領域中の類似性は、これらが多くの重複する性質を共有することを示唆する。しかし、ＰＣＴＡ−１中の保存された領域およびこのタンパクの残りの部分全体で観察される多くのアミノ酸は、構造に影響し、ＰＣＴＡ１タンパクの性質に影響を与えることが予想される。細胞株と正常な前立腺、ＢＰＨと前立腺癌中のＰＣＴＡ−１の発現ＰＣＴＡ−１の配列を得た後、この遺伝子の特異的な領域のプライマーが、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ発現の検出を可能にするか否かを調べる実験を行った。３’非翻訳領域中の３０１０塩基対と３４２３塩基対の間のプライマーを用いると、ＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＬＮＣａＰおよびＤＵ−１４５細胞では発現が明らかであったが、トランスフェクションしなかったＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞では発現はなかった（図１９）。ＰＣＴＡ−１発現はまた、７人のＰＴＣＡ−１から得られた前立腺癌の７つ、４つのＢＰＨの１つ、および４つの推定の正常な前立腺組織試料の１つにも存在する（図１９）。ＰＣＴＡ−１発現を示す１つのＢＰＨ試料では、組織学的解析は、ＰＩＮに一致する上皮非定型の存在を示した。ＰＣＴＡ−１を発現すろ１つの推定の正常な前立腺組織試料では、組織学的解析ができる組織は入手できなかった。しかしこの組織は６０才の男性から得られたため、この組織が臨床的に確実な前立腺疾患を含有した可能性はある。同じＲＮＡ試料を前立腺特異抗原（ＰＳＡ）について試験した（図１９）。ＰＳＡＲＮＡは、ＬＮＣａＰとすべての前立腺組織試料中に存在したが、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６またはＤＵ− １４５細胞中には存在しなかった。予測されるように、すべての試料はハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現については陽性であった（図１９）。サンプリングサイズは小さいが、これらの結果は、ＰＣＴＡ−１発現は前立腺癌とＢＰＨを示す初期段階の癌のサブセット（すなわち、ＰＩＮ）に限定されるかも知れないことを示している。これに対してＰＣＴＡ−１発現は、正常な前立腺またはＢＰＨでは明らかではない。ヒト前立腺癌細胞株によるＰＣＴＡ−１の分泌多くのガレクチンは、典型的な分泌シグナルペプチドが関与しない非古典的分泌機構により外部に分泌される（１０、１７、１８）。ＰＣＴＡ−１はＰｒｏ１．５Ｍａｂ陽性細胞により分泌されるか否かを調べるために、標的細胞を³⁵Ｓ− メチオニンで４時間標識し、標識物を除去し、細胞をメチオニンを含有しない培地で３回洗浄し、次に標識物を含有しない完全培地中でさらに１８〜２４時間インキュベートした。調整培地（ＣＭ）を採取し、汚染している細胞を除去し、ＣＭを濃縮し、Ｐｒｏ１．５Ｍａｂで免疫沈降させた（図１６Ｃ）。約３５〜４２ kDaの一部が、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴ、ＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５およびＰＣ−３からのＣＭに存在したが、ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞から得られたＣＭには存在しなかった（図１６Ｃ）。同じ型の細胞の³⁵Ｓ−メチオニンで標識した細胞溶解物の免疫沈降解析は、同様のパターンのＰＣＴＡ−１発現を示し、すなわちＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６：４ＮＭＴおよびヒト前立腺癌細胞株中には存在するが、非翻訳ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞には存在しなかった（図１６Ｃ）。ＰｒｏＭＡｂを用いるＦＡＣＳ解析を用いて見いだされたように、ＰＣ −３細胞は最も低いレベルの細胞結合性および分泌性ＰＣＴＡ−１を産生した。これらの結果は、ＰＣＴＡ−１は前立腺癌細胞から分泌されることを示す。この意味で、循環中のＰＣＴＡ−１タンパクを追跡することは、前立腺癌の診断マーカーとして有用である可能性がある。＜実験の考察＞前立腺癌の早期検出とその臨床的経過の正確な予測は、現在の方法では不可能である。理学的検査、組織の生検、血清ＰＳＡレベルの追跡、および超音波や骨スキャンなどの現在の方法では、早期前立腺癌の検出は確実ではなく、疾患の進行の予測における価値は低い。正確な診断とヒト前立腺癌の治療にとって大きな価値を有するのは、前立腺癌と正常な前立腺およびＢＰＨの間の明瞭な区別を可能にする適切な特異性を示す免疫学的および遺伝学的試薬を見つけることである。多くの革新的方策（迅速発現クローニング、ＳＥＮ４および抗体発現クローニングを含む）を用いて、我々はヒト前立腺癌細胞に対して正常な前立腺およびＢＰＨで差別的に発現されるＴＡＡと反応するＭａｂを作成し、このタンパクをコードする遺伝子ＰＣＴＡ−１をクローン化した。ＰＣＴＡ−１は侵襲的前立腺癌、早期前立腺癌、ＰＩＮで発現されるが、組織学的に確認される正常な前立腺またはＢＰＨでは発現されない。ＰＣＴＡ−１にコードされたＴＡＡは、前立腺癌の表面に検出され、前立腺癌細胞により分泌される。これらの性質により、診断的応用のためにＰｒｏシリーズのＭａｂとＰＣＴＡ−１遺伝子を直接使用することが可能になる。より大きな組織サンプリング数によりＰＣＴＡ−１遺伝子の適切な特異性が見いだされるなら、この遺伝子はまた、前立腺癌の治療法のための遺伝子ベースの方策を設計するのに有用となるかも知れない。ＰＣＴＡ−１タンパクは、ガレクチン遺伝子ファミリーのほとんどのメンバーに見いだされる保存された構造モチーフを保持する（１０、１９、２０）。これらの保存された領域は、ウナギ、マウス、ラットおよびヒトのような多様な種に存在する（１０）。ＰＣＴＡ−１とそのコードされたタンパクのＤＮＡ配列に基づくと、ＰＣＴＡ−１はガレクチン遺伝子ファミリーの新しいメンバーのガレクチン−８であり、これはヒト前立腺癌の癌表現型に寄与している可能性がある。ガレクチンは明瞭な成長制御および区別的レベルを示し、哺乳動物細胞の多くの生物学的に重要な過程に寄与しているかも知れないという仮説を支持する(１０) 。癌に直接関係のあるのは、ガレクチン並びにＣ−型ラクチンのセレクチン亜集団（２１、２２）は、細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用を仲介する可能性がある（１０、１７、２３）という知見である。これらの相互作用は、腫瘍細胞の転移的拡散を仲介するのに決定的に重要な要素である（２４）。さらに、ガレクチン−３は転移過程に重要な役割を果たしているかも知れないことを示す実験的証拠が蓄積している（１７、２５〜２９）。ガレクチン−３は、正常な組織や良性の組織に対してヒト大腸癌や胃癌で過剰に発現され、弱い転移性ＵＶ −２２３７−ｃｌ−１５マウス繊維肉腫細胞株中での組換えＬ−３４の発現増加は、同系およびヌードマウスの肺癌転移を上昇させる（１７、２５〜２９）。さらに抗ガレクチンＭａｂは、同型凝集、足場非依存性増殖およびＵＶ−２２３７中の実験的転移を阻害する（３０〜３２）。ＰＣＴＡ−１遺伝子およびＰｒｏＭａｂが、それぞれクローン化ガレクチン−３位でおよび抗ガレクチンＭａｂと同じ性質を示すか否かを調べる研究が進行中である。アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンス発現ベクターまたはリボザイム法を用いて、ＰＣＴＡ−１発現の阻害はヒト前立腺癌の癌原性または転移性に影響を与えるか否かを確認することも重要であろう。ＳＥＭ以前に、発現された表面分子と差別的に反応するＭａｂを効率的に産生させる簡便で迅速な方法はなかった。理論的には、ＳＥＭは、遺伝的に修飾されたテスター細胞株上で発現されるが、同種の未修飾のドライバー細胞株上では発現されない表面分子を抗体産生の標的とするように、マウスの免疫系を誘導する免疫学的サブトラクションを用いる（３、４）。テスター細胞株上のエピトープをコーティングするためのドライバー細胞株に対して産生されたポリクローナル抗体を用いて、テスター細胞タイプの表面上に発現されるエピトープに対するモノクローナル抗体の濃縮産生が達成される（３、４）。ヒト前立腺癌細胞（Ｐｒｏ１．１〜１．５）の表面上に存在するＴＡＡを同定する以外に、ヒト乳癌細胞と反応するモノクローナル抗体を開発するために迅速発現クローニングとともにＳＥＭ法が用いられている（データは示していない）。これらの結果は、これらの方法がヒトの癌上の抗原性エピトープを同定するための効率的な方策であることを示す。ＳＥＭのさらなる応用により、モノクローナル抗体のターゲティングした産生と、重要な生物学的過程（細胞増殖と分化、免疫学的認識、癌原性、転移、細胞の老化、非定型多剤耐性および自已免疫疾患などを含む）に関連する遺伝子の同定ができる。要約すると、出願人らは、ヒトの前立腺癌に関連するモノクローナル抗体の開発およびＰＣＴＡ−１のクローニングのための迅速な発現クローニングとＳＥＭ技術の直接的応用を証明する。ＰＣＴＡ−１遺伝子および最近同定された前立腺癌誘導性遺伝子ＰＴＩ−１（６）は、前立腺癌を正常な前立腺およびＢＰＨから区別できる遺伝成分である。さらに研究が必要であるが、ＰＣＴＡ−１は、ＰＴＩ −１よりヒト前立腺癌進行の早期の遺伝的変化を示すようである。この意味で、ＰｒｏＭａｂとＰＣＴＡ−１遺伝子は前立腺癌の診断と段階分けに直接応用され、およびこの拡散性でしばしば致死性の新生物疾患の重要な治療薬にもなるであろう。＜第四シリーズの実験の参照文献＞〔第５シリーズの実験〕迅速発現クローニングと差別的ＲＮＡ表示により、新規の前立腺癌遺伝子である前立腺癌誘導性遺伝子−１（ＰＴＩ−１）が同定された。ＰＴＩ−１は、マイコプラズマ・ヒポニューモニー（Mycoplasma hyopneumoniae）（５’−ＵＴＲ）との配列相同性と、ヒト延長因子−１ａの端を切り取った型および突然変異型をコードする３’配列を有する、６３０塩基対の５’−ＵＴＲから構成される。５ ’−ＵＴＲを用いてＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーは、同様の５’−ＵＴＲ領域を有するが異なる３’領域を有する迫加のＰＴＩｃＤＮＡを識別する。ゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析は、細菌、酵母およびヒトという多様な生物におけるＰＴＩ５’−ＵＴＲの存在を証明する。ＰＴＩ−１の５’−ＵＴＲプローブを用いると、ＲＮＡ発現は、多様作用性ウイルス癌遺伝子（アデノウイルス５型（Ａｄ５）、低温感受性宿主範囲Ａｄ５突然変異体、Ｔ２４Ｈａ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃおよびヒトパピローマウイルス５１型（ＨＰＶ−５１）を含む）により形質転換されたクローン化ラット胚繊維芽細胞（ＣＲＥＦ）中で起きる。デキサメタゾン（ＤＥＸ）誘導性マウス乳癌ウイルスプロモーターの制御下の野生型Ａｄ５Ｅ１Ａ形質転換性遺伝子を含有するＣＲＥＦクローンは、Ａｄ５Ｅ１Ａ、ＰＴＩ−１の５’−ＵＴＲおよび細胞形質転換の間の直接の関係を証明する。ＰＴＩ−１の５’−ＵＴＲの発現は、ＤＥＸ誘導性Ａｄ５Ｅ１Ａで形質転換されたＣＲＥＦクローン、並びにｖ −ｓｒｃ、Ｈａ−ｒａｓおよびＨＰＶ−５１で形質転換したＣＲＥＦ細胞中で、転写レベルで制御される。これらの結果は、ＣＲＥＦ細胞の形態学的および癌遺伝子的形質転換は、ＰＴＩ遺伝子の５’−ＵＴＲの転写誘導と相関することを示す。この５’−ＵＴＲ配列は複数の細胞性ＲＮＡの成分であるため、この５’− ＵＴＲに結合した遺伝子は癌遺伝子形質転換の標的かも知れない。新しいＤＮＡアクセプター細胞株ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６による迅速発現クローニング法を用いて、ヒト癌細胞株および原発性ＰＴＣＡ−１由来腫瘍のゲノムＤＮＡ中の優性に作用する腫瘍誘導性癌遺伝子を検出することが今や可能である。この方法は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞による同様の方法を用いては検出されない、推定ヌードマウス腫瘍誘導性遺伝子の存在を証明するために、ヒトＬＣａＰ前立腺癌細胞株からの高分子量ＤＮＡを用いて、使用されてきた。ＬＮＣａＰＤＮＡでトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞を注射したヌードマウス中で成長する腫瘍を培養して樹立し、差別的ＲＮＡ表示（ＤＤ）によるｍＲＮＡを比較し、２１４塩基対の新規配列（ＰＴＩ−１の５’−ＵＴＲの一部である）を同定し、クローン化した。種々の型の細胞からのＲＮＡを含有するノーザンブロットを２１４塩基対配列とプローブ結合させると、ＬＮＣａＰでトランスフェクトされたヌードマウス腫瘍由来ＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６、ＬＮＣａＰ、ＤＵ− １４５（相同性屈折性ヒト前立腺癌）、ＮＣＩ−Ｈ６９（ヒト小細胞性肺癌）、Ｔ４７（ヒト乳癌）、ＳＷ−４８０およびＬＳ１７４Ｔ（ヒト大腸直腸癌）細胞中でＲＮＡ発現が検出された。ＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーの２１４塩基対断片によるスクリーニングおよびＲＡＣＥ５’延長により、全長２．０kbのＰＴＩ−１ｃＤＮＡがクローニングされた。配列解析により、ＰＴＩ−１は、マイコプラズマ・ヒポニューモニー（Mycoplasma hyopneumoniae）と相同性を有する６３０塩基対の５’配列、およびヒト延長因子１−ａ（ＥＦ−１ａ）の端を切り取った型および突然変異体型と相同的な３’配列から構成されることが証明された。６３０塩基対の５’−ＵＴＲＰＴＩ−１配列内の２８０塩基対領域を認識する一対のプライマーを用いると、逆転写酵素−ＰＣＲにより患者由来前立腺癌中にＰＴＩ−１が検出されるが、正常な前立腺または良性の肥大前立腺組織中には検出されない。これらの知見は、ＰＴＩ−１は、タンパク翻訳に影響を与える癌遺伝子のクラスのメンバーであり、ヒト前立腺および他の組織の癌の増殖に寄与するかも知れないことを示している。本研究は、ＰＴＩ−１のマイコプラズマ様５’−ＵＴＲ領域の遺伝子の可能性のある意義を調べるために設計した。我々は、原核および真核細胞の両方のゲノムＤＮＡ中にこの配列が存在することを証明する。ヒトでは、５’−ＵＴＲの組織発現は、正常な骨格筋および結腸組織、並びに前立腺、結腸、肺および乳房の特異的な癌で起きる。ＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡは、５’−ＵＴＲが複数の別個の３’領域と関連することを示し、この配列がＰＴＩマルチ遺伝子ファミリーの一部であることを示唆している。ＰＴＩ−１の５’−ＵＴＲの発現は、多様なＤＮＡウイルスによるラット胚繊維芽細胞の形質転換と相関する。癌遺伝子で形質転換したラット胚細胞中の５’−ＵＴＲの誘導は、転写機構により起きる。これらの観察結果は、ＰＴＩ−１の５’−ＵＴＲを含有するｃＤＮＡが、癌遺伝子形質転換中に起きる転写活性化の標的である可能性を示唆している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１０月２１日【補正内容】ＤｒおよびＬＳ１７４Ｔ）、２つのヒト黒色腫細胞株（Ｈ０−１およびＭｅＷｏ）またはヒト神経膠芽腫細胞株（ＧＢＭ−１８）とは反応しない。ＰＣＴＡ−１Ｐｒｏ１．５ＭＡｂによる³⁵Ｓ−メチオニン標識細胞抽出物の免疫沈降分析は、原発性および続発性ヌードマウス腫瘍由来のＬＮＣａＰでトランスフェクトされたＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞、ＬＮＣａＰおよびＤＵ−１４５細胞は、トランスフェクションしていないＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６または別のヒト腫瘍(黒色腫および神経膠芽腫を含む)には存在しない約４２kDaのタンパクを含有することを示す。これらの結果は、ヒト前立腺癌（および恐らく乳癌）ＴＡＡをコードする遺伝子がＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６細胞に移され発現されていることを示している。ＰＣＴＡ−１をコードする遺伝子を同定するために、ＳＥＭにより得られたＭＡｂ（Ｐｒｏ１．５）を使用してＬＮＣａＰｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングした（ピコブルー（PicoBlue）イムノスクリーニングキット、ストラタジーン（STRATAGENE））。全ＲＮＡをオリゴ−ｄＴカラム（ギブコ（GIBCO））に流した後、ＬＮＣａＰ細胞からｍＲＮＡを単離した。ユニ−ＺＡＰ（Uni-ZAP ）ベクター（ストラタジーン（Stratagene））でＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーを作成した。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは以下のようにして実施した：（１）ＳＵＲＥ宿主細胞を６．５mLの上部寒天を有する１５個の１５０mm×１５mmＮＺＹプレートに接種した（約２×１０⁴プラーク／プレート）；（２）４２℃で３．５時間インキュベーション後、１０mM ＩＰＴＧ溶液で浸漬したニトロセルロースフィルターをプレートに適用してプラークを引き揚げた；（３）ブラークリフトを含有するフイルターを３回または４回ＴＢＳＴ（２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ツイン−２０（ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート））で洗浄して、ブロッキング液（ＴＢＳ［２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ］中１％のＢＳＡ）に室温で１時間浸漬した：（４）次にフィルターを、Ｐｒｏ１．５腹水を含有する新鮮ブロッキング液（１：５００希釈）に移して、続いて室温で穏やかに振盪しながら３時間ノンキュベーションを行った；（５）フィＬＮＣａＰｃＤＮＡライブラリーは、ユニ−ＺＡＰＸＲ（Uni-ZAP XR）ベクター（ストラタジーン（Stratagene）（登録商標））で作成した（６、１２、１３）。このｃＤＮＡライブラリーを、Ｐｒｏ１．５ＭＡｂを使用してピコブルー（picoBlue）イムノスクリーニングキット（ストラタジーン（Stratagene））のプロトコールによりスクリーニングした。宿主細菌細胞（シュア（SURE））を１５個の１５０mm×１５mmのＮＺＹプレートに接種して、約２０，０００プラーク／ブレートが得られた。４２℃で３．５時間のインキュベーション後、１０ mM ＩＰＴＧ溶液に浸潰したニトロセルロースフィルターを、プラークリフトのためにコロニーの上に添加した。このフィルターを３〜４回ＴＢＳＴ（２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、０．０５％ツイン−２０（ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート））で洗浄して、ブロッキング溶液［ＴＢＳ（２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ）中の１％ＢＳＡ］に浸漬して、室温で１時間インキュベートした。次にフィルターを、Ｐｒｏ１．５腹水を含有する新鮮ブロッキング溶液（１：５００希釈）に移して、穏やかに振盪しながら室温で３時間インキュベートした。４×ＴＢＳＴ緩衝液で洗浄後、Ａｂ−ＡＰ結合体を含有する新鮮なブロッキング溶液（１：２０００希釈）にフィルターを移して、室温で１時間インキュベートした。０．３mg/ml ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、０．１５mg/mlのＢＣＩＰ（リン酸５−ブロモ−４−クロコ−３−インドリル）、１００mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００mM ＮａＣｌおよび５mM ＭｇＣｌ２を含有する溶液でフィルターを展開することにより陽性コロニーを同定した。停止溶液（２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ２．９）および１mM ＥＤＴＡ）を添加することにより反応を停止させた。ＰＣＴＡ−１を含有する陽性の１つのコロニーを単離した。ＰＣＴＡ−１の完全な配列は、サンガー法を使用して得た（１４）。pBluescriptベクター中のＰＣＴＡ−１挿入体の両側から合成された一連のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。配列解析は、アブライド・バイオシステムズ（Appl ied Biosystems）（モデル３７３Ａ、バージョン１．２．１）配列決定機を使用して確認した。ＰＣＴＡ−１のインビトロ翻訳請求の範囲１．前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクをコードする、単離された哺乳類核酸分子。２．請求項１に記載のＤＮＡ分子。３．請求項２に記載のゲノムＤＮＡ分子。 4 請求項２に記載のｃＤＮＡ分子。５．請求項１に記載のＲＮＡ分子。６．請求項１に記載の単離されたヒト核酸分子。７．請求項１の核酸分子の独特な配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５ヌクレオチドの単離された核酸分子。８．前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクをコードするＲＮＡ分子に対して特異的にハイブリダイズして、該ＲＮＡ分子の翻訳を防止し、または該ＲＮＡ分子を分解させることができる配列を有する、単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド分子。９．細胞を含有するサンプル中の前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する方法であって：（ａ）前記細胞から全ＲＮＡを得る工程と；（ｂ）こうして得られたＲＮＡを、請求項７の分子と前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１との特異的ハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイズ条件下で、標識された請求項７の核酸分子と接触させる工程と；（ｃ）前記分子とハイブリダイズしたＲＮＡの存在を測定することにより、前記サンプルにおける前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する工程とを具備する方法。１０．組織切片における前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する方法であって：（ａ）前記組織切片を、請求項７の分子および前立腺癌腫瘍抗原遺伝子 −１の特異的ハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーション条件下で、請求項７のラベルされた核酸分子と接触させる工程と；（ｂ）請求項7の分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を決定することによって、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する工程とを具備した方法。１１．ＲＮＡ転写のプロモータに機能的にリンクした請求項２の単離された哺乳類核酸分子。１２．請求項1の単離された哺乳類核酸分子を具備するベクター。１３．請求項１２に記載のプラスミド。１４．請求項１２に記載のウイルス。１５．請求項１４に記載のＤＮＡウイルス。１６．請求項１４に記載のＲＮＡウイルス。１７．請求項１４に記載のレトロウイルス。１８．ＡＴＣＣ受付番号第97021号を有する、PCTA-1と命名された請求項１３のプラスミド。１９．哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを産生するための宿主ベクター系であって、請求項１２のベクターと適切な宿主とを含む宿主ベクター系。２０．請求項１９に記載の宿主ベクター系であって、前記適切な宿主が、バクテリア細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される宿主ベクター系。２１．哺乳類前立腺腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、請求項１６の宿主ベクター系の宿主細胞を、ポリペプチドの産生を可能にする条件下で増殖させることと、こうして産生されたポリペプチドを回収することとを具備した方法。２２．細胞を形質転換する方法であって、請求項１２のベクターを適切な宿主細胞に導入することを具備した方法。２３．請求項２２に記載の形質転換細胞。２４．生成された哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパク。２５．請求項１の単離された哺乳類核酸分子によってコードされるポリペプチド。２６．請求項２０または２１の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクに対して特異的に結合できる抗体。２７．請求項２６に記載のモノクローナル抗体。２８．請求項２６または２７の抗体の、哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクとの結合を拮抗的に阻害できる化合物。２９．請求項２６もしくは２７の抗体または請求項２８の化合物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。３０．請求項２６または２７に記載の抗体と、細胞毒性物質とを含有する治療剤。３１．請求項３０に記載の治療剤であって、前記細胞毒性物質が放射性アイソトープまたはトキシンの何れかである治療剤。３２．生物学的サンプルにおける哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する方法であって：（ａ）前記サンプルと請求項２６または２７の抗体とを、該抗体と前記哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクとの間の複合体を形成させる条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記複合体の量を測定し、これによって前記生物学的サンプルにおける前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する工程とを具備した方法。３３．生物学的サンプルにおける哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する方法であって：（ａ）前記サンプルと、哺乳類前立腺癌腫抗原遺伝子−１タンパクに結合でき且つ固体マトリックスに結合しているる捕捉モノクローナル抗体とを、前記哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクと結合した抗本との間の複合体を形成させる条件下で接触させる工程と；（ｂ）結合しなかったサンプルを除去する工程と；（ｃ）前記固体マトリックスを、前記捕捉抗体以外の少なくとも一つの部位で前記哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに結合できる二次抗体と接触させる工程と；（ｄ）前記複合体の量を測定し、これによって前記生物学的サンプルにおける前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する工程とを具備した方法。３４．請求項３３に記載の方法であって、更に、前記工程（ｄ）の前に、検出マーカーでラベルされ且つ前記二次抗体に結合できる三次抗体と接触させる工程を具備した方法。３５．請求項３２，３３または３４に記載の方法であって、前記サンプルは血清サンプルである方法。３６．患者が転移能力をもった癌を保有しているかどうかを決定する方法であって：（ａ）前記患者の血清サンプルにおける前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する工程と；（ｂ）工程（ａ）で決定された量を、健康な患者または良性腫瘍を保有する患者のサンプルから決定された量と比較する工程とを具備した方法。３７．或る化合物が前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの活性の発現を阻害できるかどうかを決定する方法であって：（ａ）請求項１９の形質転換細胞と適切な量の前記化合物とを、該化合物が前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの活性の発現を阻害する条件下で接触させる工程と；（ｂ）前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの発現のレベルを検出し、該発現レベルの減少によって、前記化合物は前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの発現または活性を阻害できることが示される工程とを具備した方法。３８．或る化合物が前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに特異的に結合できるかどうかを決定する方法であって：（ａ）適切な量の請求項２０の精製タンパクと適切な量の前記化合物とを、該化合物と前記精製タンパクとの間での複合体形成を可能にする条件下で接触させる工程と；（ｂ）かかる複合体を検出し、該複合体の存在によって、前記化合物は前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに結合できることが示されるする工程とを具備する方法。３９．請求項３１または３２の方法によって決定された、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに結合でき又はその活性を阻害できる有効量の化合物と、薬学的キャリアとを含有する薬学的組成物。４０．患者における転移能力をもった癌を治療する方法であって、前記患者に対して、有効量の請求項２９の組成物、請求項３０または３１の治療剤、請求項３０の薬学的組成物を、単独または組み合わせて投与することを具備した方法。４１．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の配列を有する、単離された哺乳類核酸分子。４２．請求項４１に記載のＤＮＡ分子。４３．請求項４１に記載のゲノムＤＮＡ分子。４４．請求項４１に記載のｃＤＮＡ分子。４５．請求項４１に記載のＲＮＡ分子。４６．請求項４１に記載の単離されたヒト核酸分子。４７．請求項４１の核酸分子の配列と特異的に結合できる少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子。４８．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクをコードするＲＮＡに対して特異的にハイブリダイズして、該ＲＮＡ分子の翻訳を阻止できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。４９．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１配列の５´−ＵＴＲの発現を不活性化できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。５０．細胞を含むサンプル中における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の発現を検出する方法であって、（ａ）前記細胞から全ＲＮＡを採取し、こうして得られたＲＮＡと請求項４７のラベルされた核酸分子とを、ハイブリダイズ条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を検出し、これによって前記サンプル中での前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の発現を検出する工程とを具備した方法。５１．組織切片における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の発現を検出する方法であって、（ａ）前記組織切片とラベルされた請求項４７の核酸分子とを、ハイブリダイズ条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を検出し、これによって前記組織切片における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の発現を検出する工程とを具備する方法。５２．ＲＮＡ転写のプロモータに対して機能的にリンクした、請求項４１に記載の単離された哺乳類核酸分子。５３．請求項４１の単離された哺乳類核酸分子を含んだベクター。５４．請求項５３に記載のプラスミド。５５．請求項５３に記載のプラスミドであって、ＰＴＩ−１と命名され、且つＡＴＣＣ受付番号第97020号を有するプラスミド。５６．請求項５４に記載のウイルス。５７．請求項５４に記載のＤＮＡウイルス。５８請求項５４に記載のＲＮＡウイルス。５９．請求項５４に記載のレトロウイルス。６０．哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造するための宿主ベクター系であって、請求項５３のベクターと適切な宿主とを含んでなる宿主ベクター系。６１．請求項６０に記載の宿主ベクター系であって、前記適切な宿主がバクテリア細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳類細胞である方法。６２．哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、請求項６１の宿主ベクター系を、前記ポリペプチドを産生させる条件下で増殖させることと、こうして産生された前記ポリペプチドを回収することとを具備した方法。６３．請求項５３のベクターを含んだ哺乳類細胞。６４．精製された哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパク。６５．請求項４１の単離された哺乳類核酸分子によってコードされるポリペプチド。６６．請求項６４または６５の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクを使用した、抗体を製造する方法。６７．請求項６４または６５の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクに対して特異的に結合できる抗体。６８．請求項６７に記載のモノクローナル抗体。６９．請求項６６または６７の抗体と、薬学的に許容され得るキャリアとを含有する薬学的組成物。７０．請求項６６または６７の抗体と、細胞毒性物質とを含有する薬学的組成物。７１．請求項７０に記載の治療剤であって、前記細胞毒性物質が放射性アイソトープまたはトキシンである治療剤。７２．生物学的サンプル中の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクの量を測定するための免疫検定法であって：（ａ）前記生物学的サンプルと請求項６６または６７の抗体とを、該抗体と前記哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記複合体の量を測定し、これによって前記生物学的サンプル中の前記前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクの量を測定する工程とを具備した方法。７３．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−２の配列を有する、単離された哺乳類核酸分子。７４．請求項７３に記載のＤＮＡ分子。７５．請求項７３に記載のゲノムＤＮＡ分子。７６．請求項７３に記載のｃＤＮＡ分子。７７．請求項６３に記載のＲＮＡ分子。７８．請求項７３に記載の単離されたヒト核酸分子。７９．請求項７３の核酸分子の独特の配列と特異的にハイブリダイズできる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子。８０．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−２タンパク配列の５´−ＵＴＲの発現を不活性化できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。８１．ＲＮＡ転写のプロモータに機能的にリンクした、請求項７３に記載の単離された哺乳類核酸分子。８２．請求項７３の単離された哺乳類核酸分子を含んだベクター。８３．請求項８２に記載のプラスミド。８４．請求項８３に記載のプラスミドであって、ＰＴＩ−２と命名され、且つＡＴＣＣ受付番号第69742号を有するプラスミド。８５．請求項８２に記載のウイルス。８６．請求項８２に記載のＤＮＡウイルス。８７請求項８２に記載のＲＮＡウイルス。８８請求項８２に記載のレトロウイルス。８９．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３の配列を有する、単離された哺乳類核酸分子。９０．請求項８９に記載のＤＮＡ分子。９１．請求項８９に記載のゲノムＤＮＡ分子。９２．請求項８９に記載のｃＤＮＡ分子。９３．請求項８９に記載のＲＮＡ分子。９４．請求項８９に記載の単離されたヒト核酸分子。９５．請求項８６の核酸分子の独特の配列と特異的にハイブリダイズできる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子。９６．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクをコードするＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズして、該ＲＮＡ分子の翻訳を妨げることができ、または該ＲＮＡ分子を分解させることができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。９７．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパク配列の５´−ＵＴＲの発現を不活性化できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。９８．細胞を含むサンプル中における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３の発現を検出する方法であって、（ａ）前記細胞から全ＲＮＡを採取し、こうして得られたＲＮＡと請求項９２のラベルされた核酸分子とを、ハイブリダイズ条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を検出し、これによって前記サンプル中での前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３の発現を検出する工程とを具備した方法。９９．組織切片における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３の発現を検出する方法であって、（ａ）前記組織切片とラベルされた請求項９５の核酸分子とを、ハイブリダイズ条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を検出し、これによって前記組織切片における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３の発現を検出する工程とを具備した方法。１００．ＲＮＡ転写のプロモータに機能的にリンクした、請求項８９に記載の単離された哺乳類核酸分子。１０１．請求項８９の単離された哺乳類核酸分子を含んだベクター。１０２．請求項１０１に記載のプラスミド。１０３．請求項１０２に記載のプラスミドであって、ＰＴＩ−３と命名され、且つＡＴＣＣ受付番号第97022号を有するプラスミド。１０４．請求項１０２に記載のウイルス。１０５．請求項１０２に記載のＤＮＡウイルス。１０６．請求項１０２に記載のＲＮＡウイルス。１０７．請求項１０２に記載のレトロウイルス。１０８．哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造するための宿主ベクター系であって、請求項９６のベクターと適切な宿主とを含んでなる宿主ベクター系。１０９．請求項１０８に記載の宿主ベクター系であって、前記適切な宿主がバクテリア細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳類細胞である方法。１１０．哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、請求項１０９の宿主ベクター系を、前記ポリペプチドを産生させる条件下で増殖させることと、こうして産生された前記ポリペプチドを回収することとを具備した方法。１１１．請求項１０１のベクターを含んだ哺乳類細胞。１１２．精製された哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパク。１１３．請求項８９の単離された哺乳類核酸分子によってコードされるポリペプチド。１１４．請求項１１２または１１３の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクを使用した、抗体を製造する方法。１１５．請求項１１２または１１３の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクに対して特異的に結合できる抗体。１１６．請求項１１５のモノクコーナル抗体。１１７．請求項１１４または１１５の抗体と、薬学的に許容され得るキャリアとを含有する薬学的組成物。１１８請求項１１４または１１５の抗体と、細胞毒性物質とを含有する薬学的組成物。１１９．請求項１１６に記載の治療剤であって、前記細胞毒性物質が放射性アイソトープまたはトキシンである治療剤。１２０．生物学的サンプル中の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクの量を測定するための免疫検定法であって：（ａ）前記生物学的サンプルと請求項１１４または１１５の抗体とを、該抗体と前記哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記複合体の量を測定し、これによって前記生物学的サンプル中の前記前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクの量を測定する工程とを具備した方法。１２１．細胞の発癌性形質転換を不活性化する方法であって、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１，２または３の５´−ＵＴＲの発現を不活性化することを具備した方法。１２２．請求項１２１に記載の方法であって、前記不活性化は、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１配列の完全な５´−ＵＴＲまたは５´−ＵＴＲの一部を不活性できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって行われる方法。１２３．請求項１２１に記載の方法であって、前記不活性化は、前立腺腫瘍誘導性還伝子−２配列の完全な５´−ＵＴＲまたは５´−ＵＴＲの一部を不活性できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって行われる方法。１２４．請求項１２１に記載の方法であって、前記不活性化は、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３配列の完全な５´−ＵＴＲまたは５´−ＵＴＲの一部を不活性できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって行われる方法。１２５．請求項１２２，１２３または１２４に記載の方法であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがレトロウイルスベクターによって細胞に導入される方法。１２６．請求項１２２，１２３または１２４に記載の方法であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＤＮＡウイルスベクターによって細胞に導入される方法。１２７．請求項１２２，１２３または１２４に記載の方法であって、前記アンチセスオリゴヌクレオチドがＲＮＡウイルスベクターによって細胞に導入される方法。

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Claims

【特許請求の範囲】１．前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクをコードする、単離された哺乳類核酸分子。２．請求項１に記載のＤＮＡ分子。３．請求項２に記載のゲノムＤＮＡ分子。４．請求項２に記載のｃＤＮＡ分子。５．請求項１に記載のＲＮＡ分子。６．請求項１に記載の単離されたヒト核酸分子。７．請求項１の核酸分子の独特な配列と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子。８．前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクをコードするＲＮＡ分子に対して特異的にハイブリダイズして、該ＲＮＡ分子の翻訳を防止し、または該ＲＮＡ分子を分解させることができる配列を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子。９．細胞を含有するサンプル中の前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する方法であって：（ａ）前記細胞から全ＲＮＡを得る工程と；（ｂ）こうして得られたＲＮＡを、ハイブリダイズする条件下で、標識された請求項７の核酸分子と接触させる工程と；（ｃ）前記分子とハイブリダイズしたＲＮＡの存在を測定することにより、前記サンプルにおける前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する工程とを具備する方法。１０．組織切片における前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する方法であって：（ａ）前記組織切片を、請求項７の分子および前立腺癌腫瘍抗原遺伝子 −１のハイブリダイゼーションを可能にするハイブリダイゼーション条件下で、請求項７のラベルされた核酸分子と接触させる工程と；（ｂ）請求項7の分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を決定することによって、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１の発現を検出する工程とを具備した方法。１１．ＲＮＡ転写のプロモータに機能的にリンクした請求項２の単離された哺乳類核酸分子。１２．請求項1の単離された哺乳類核酸分子を具備するベクター。１３．請求項１２に記載のプラスミド。１４．請求項１２に記載のウイルス。１５．請求項１４に記載のＤＮＡウイルス。１６．請求項１４に記載のＲＮＡウイルス。１７．請求項１４に記載のレトロウイルス。１８．請求項１３に記載のプラスミドであって、PCTA-1と命名され、ＡＴＣＣ受付番号第97021号を有するプラスミド。１９．哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを産生するための宿主ベクター系であって、請求項１２のベクターと適切な宿主とを含む宿主ベクター系。２０．請求項１９に記載の宿主ベクター系であって、前記適切な宿主が、バクテリア細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される宿主ベクター系。２１．哺乳類前立腺腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、請求項１６の宿主ベクター系の宿主細胞を、ポリペプチドの産生を可能にする条件下で増殖させることと、こうして産生されたポリペプチドを回収することとを具備した方法。２２．細胞を形質転換する方法であって、請求項１２のベクターを適切な宿主細胞に導入することを具備した方法。２３．請求項２２に記載の形質転換細胞。２４．生成された哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパク。２５．請求項１の単離された哺乳類核酸分子によってコードされるポリペプチド。２６．請求項２０または２１の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクに対して特異的に結合できる抗体。２７．請求項２６に記載のモノクローナル抗体。２８．請求項２６または２７の抗体の、哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクとの結合を拮抗的に阻害できる化合物。２９．請求項２６もしくは２７の抗体または請求項２８の化合物と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。３０．請求項２６または２７に記載の抗体と、細胞毒性物質とを含有する治療剤。３１．請求項３０に記載の治療剤であって、前記細胞毒性物質が放射性アイソトープまたはトキシンの何れかである治療剤。３２．生物学的サンプルにおける哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する方法であって：（ａ）前記サンプルと請求項２６または２７の抗体とを、該抗体と前記哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクとの間の複合体を形成させる条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記複合体の量を測定し、これによって前記生物学的サンプルにおける前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する工程とを具備した方法。３３．生物学的サンプルにおける哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する方法であって：（ａ）前記サンプルと、哺乳類前立腺癌腫抗原遺伝子−１タンパクに結合でき且つ固体マトリックスに結合しているる捕捉モノクローナル抗体とを、前記哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクと結合した抗体との間の複合体を形成させる条件下で接触させる工程と；（ｂ）結合しなかったサンプルを除去する工程と；（ｃ）前記固体マトリックスを、前記捕捉抗体以外の少なくとも一つの部位で前記哺乳類前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに結合できる二次抗体と接触させる工程と；（ｄ）前記複合体の量を測定し、これによって前記生物学的サンプルにおける前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する工程とを具備した方法。３４．請求項３３に記載の方法であって、更に、前記工程（ｄ）の前に、検出マーカーでラベルされ且つ前記二次抗体に結合できる三次抗体と接触させる工程を具備した方法。３５．請求項３２，３３または３４に記載の方法であって、前記サンプルは血清サンプルである方法。３６．患者が転移能力をもった癌を保有しているかどうかを決定する方法であって：（ａ）前記患者の血清サンプルにおける前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの量を測定する工程と；（ｂ）工程（ａ）で決定された量を、健康な患者または良性腫瘍を保有する患者のサンプルから決定された量と比較する工程とを具備した方法。３７．或る化合物が前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの活性の発現を阻害できるかどうかを決定する方法であって：（ａ）請求項１９の形質転換細胞と適切な量の前記化合物とを、該化合物が前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの活性の発現を阻害する条件下で接触させる工程と；（ｂ）前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの発現のレベルを検出し、該発現レベルの減少によって、前記化合物は前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクの発現または活性を阻害できることが示される工程とを具備した方法。３８．或る化合物が前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに特異的に結合できるかどうかを決定する方法であって：（ａ）適切な量の請求項２０の精製タンパクと適切な量の前記化合物とを、該化合物と前記精製タンパクとの間での複合体形成を可能にする条件下で接触させる工程と；（ｂ）かかる複合体を検出し、該複合体の存在によって、前記化合物は前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに結合できることが示されるする工程とを具備する方法。。３９．請求項３１または３２の方法によって決定された、前立腺癌腫瘍抗原遺伝子−１タンパクに結合でき又はその活性を阻害できる有効量の化合物と、薬学的キャリアとを含有する薬学的組成物。４０．患者における転移能力をもった癌を治療する方法であって、前記患者に対して、有効量の請求項２９の組成物、請求項３０または３１の治療剤、請求項３０の薬学的組成物を、単独または組み合わせて投与することを具備した方法。４１．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の配列を有する、単離された哺乳類核酸分子。４２．請求項４１に記載のＤＮＡ分子。４３．請求項４１に記載のゲノムＤＮＡ分子。４４．請求項４１に記載のｃＤＮＡ分子。４５．請求項４１に記載のＲＮＡ分子。４６．請求項４１に記載の単離されたヒト核酸分子。４７．請求項４１の核酸分子の配列と特異的に結合できる少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子。４８．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクをコードするＲＮＡに対して特異的にハイブリダイズして、該ＲＮＡ分子の翻訳を阻止できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。４９．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１配列の５´−ＵＴＲの発現を不活性化できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。５０．細胞を含むサンプル中における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の発現を検出する方法であって、（ａ）前記細胞から全ＲＮＡを採取し、こうして得られたＲＮＡと請求項４７のラベルされた核酸分子とを、ハイブリダイズ条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を検出し、これによって前記サンプル中での前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の発現を検出する工程とを具備した方法。５１．組織切片における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の発現を検出する方法であって、（ａ）前記組織切片とラベルされた請求項４７の核酸分子とを、ハイブリダイズ条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を検出し、これによって前記組織切片における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１の発現を検出する工程とを具備する方法。５２．ＲＮＡ転写のプロモータに対して機能的にリンクした、請求項４１に記載の単離された哺乳類核酸分子。５３．請求項４１の単離された哺乳類核酸分子を含んだベクター。５４．請求項５３に記載のプラスミド。５５．請求項５３に記載のプラスミドであって、ＰＴＩ−１と命名され、且つＡＴＣＣ受付番号第97020号を有するプラスミド。５６．請求項５４に記載のウイルス。５７．請求項５４に記載のＤＮＡウイルス。５８．請求項５４に記載のＲＮＡウイルス。５９．請求項５４に記載のレトロウイルス。６０．哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造するための宿主ベクター系であって、請求項５３のベクターと適切な宿主とを含んでなる宿主ベクター系。６１．請求項６０に記載の宿主ベクター系であって、前記適切な宿主がバクテリア細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳類細胞である方法。６２．哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、請求項６１の宿主ベクター系を、前記ポリペプチドを産生させる条件下で増殖させることと、こうして産生された前記ポリペプチドを回収することとを具備した方法。６３．請求項５３のベクターを含んだ哺乳類細胞。６４．精製された哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパク。６５．請求項４１の単離された哺乳類核酸分子によってコードされるポリペプチド。６６．請求項６４または６５の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクを使用した、抗体を製造する方法。６７．請求項６４または６５の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクに対して特異的に結合できる抗体。６８．請求項６７に記載のモノクローナル抗体。６９．請求項６６または６７の抗体と、薬学的に許容され得るキャリアとを含有する薬学的組成物。７０．請求項６６または６７の抗体と、細胞毒性物質とを含有する薬学的組成物。７１．請求項７０に記載の治療剤であって、前記細胞毒性物質が放射性アイソトープまたはトキシンである治療剤。７２．生物学的サンプル中の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクの量を測定するための免疫検定法であって：（ａ）前記生物学的サンプルと請求項６６または６７の抗体とを、該抗体と前記哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記複合体の量を測定し、これによって前記生物学的サンプル中の前記前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクの量を測定する工程とを具備した方法。７３．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−２の配列を有する、単離された哺乳類核酸分子。７４．請求項７３に記載のＤＮＡ分子。７５．請求項７３に記載のゲノムＤＮＡ分子。７６．請求項７３に記載のｃＤＮＡ分子。７７．請求項６３に記載のＲＮＡ分子。７８．請求項７３に記載の単離されたヒト核酸分子。７９．請求項７３の核酸分子の独特の配列と特異的にハイブリダイズできる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子。８０．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−２タンパク配列の５´−ＵＴＲの発現を不活性化できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。８１．ＲＮＡ転写のプロモータに機能的にリンクした、請求項７３に記載の単離された哺乳類核酸分子。８２．請求項７３の単離された哺乳類核酸分子を含んだベクター。８３．請求項８２に記載のプラスミド。８４．請求項８３に記載のプラスミドであって、ＰＴＩ−２と命名され、且つＡＴＣＣ受付番号第69742号を有するプラスミド。８５．請求項８２に記載のウイルス。８６．請求項８２に記載のＤＮＡウイルス。８７．請求項８２に記載のＲＮＡウイルス。８８．請求項８２に記載のレトロウイルス。８９．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３の配列を有する、単離された哺乳類核酸分子。９０．請求項８９に記載のＤＮＡ分子。９１．請求項８９に記載のゲノムＤＮＡ分子。９２．請求項８９に記載のｃＤＮＡ分子。９３．請求項８９に記載のＲＮＡ分子。９４．請求項８９に記載の単離されたヒト核酸分子。９５．請求項８６の核酸分子の独特の配列と特異的にハイブリダイズできる、少なくとも１５ヌクレオチドの核酸分子。９６．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクをコードするＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズして、該ＲＮＡ分子の翻訳を妨げることができ、または該ＲＮＡ分子を分解させることができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。９７．前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパク配列の５´−ＵＴＲの発現を不活性化できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。９８．細胞を含むサンプル中における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３の発現を検出する方法であって、（ａ）前記細胞から全ＲＮＡを採取し、こうして得られたＲＮＡと請求項９２のラベルされた核酸分子とを、ハイブリダイズ条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を検出し、これによって前記サンプル中での前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３の発現を検出する工程とを具備した方法。９９．組織切片における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３の発現を検出する方法であって、（ａ）前記組織切片とラベルされた請求項９５の核酸分子とを、ハイブリダイズ条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記分子にハイブリダイズしたＲＮＡの存在を検出し、これによって前記組織切片における前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３の発現を検出する工程とを具備した方法。１００．ＲＮＡ転写のプロモータに機能的にリンクした、請求項８９に記載の単離された哺乳類核酸分子。１０１．請求項８９の単離された哺乳類核酸分子を含んだベクター。１０２．請求項１０１に記載のプラスミド。１０３．請求項１０２に記載のプラスミドであって、ＰＴＩ−３と命名され、且つＡＴＣＣ受付番号第97022号を有するプラスミド。１０４．請求項１０２に記載のウイルス。１０５．請求項１０２に記載のＤＮＡウイルス。１０６．請求項１０２に記載のＲＮＡウイルス。１０７．請求項１０２に記載のレトロウイルス。１０８．哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造するための宿主ベクター系であって、請求項９６のベクターと適切な宿主とを含んでなる宿主ベクター系。１０９．請求項１０８に記載の宿主ベクター系であって、前記適切な宿主がバクテリア細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳類細胞である方法。１１０．哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１タンパクの生物学的活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、請求項１０９の宿主ベクター系を、前記ポリペプチドを産生させる条件下で増殖させることと、こうして産生された前記ポリペプチドを回収することとを具備した方法。１１１．請求項１０１のベクターを含んだ哺乳類細胞。１１２．精製された哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパク。１１３．請求項８９の単離された哺乳類核酸分子によってコードされるポリペプチド。１１４．請求項１１２または１１３の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクを使用した、抗体を製造する方法。１１５．請求項１１２または１１３の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクに対して特異的に結合できる抗体。１１６．請求項１１５のモノクローナル抗体。１１７．請求項１１４または１１５の抗体と、薬学的に許容され得るキャリアとを含有する薬学的組成物。１１８．請求項１１４または１１５の抗体と、細胞毒性物質とを含有する薬学的組成物。１１９．請求項１１６に記載の治療剤であって、前記細胞毒性物質が放射性アイソトープまたはトキシンである治療剤。１２０．生物学的サンプル中の哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクの量を測定するための免疫検定法であって：（ａ）前記生物学的サンプルと請求項１１４または１１５の抗体とを、該抗体と前記哺乳類前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程と；（ｂ）前記複合体の量を測定し、これによって前記生物学的サンプル中の前記前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３タンパクの量を測定する工程とを具備した方法。１２１．細胞の発癌性形質転換を不活性化する方法であって、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１，２または３の５´−ＵＴＲの発現を不活性化することを具備した方法。１２２．請求項１２１に記載の方法であって、前記不活性化は、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１配列の完全な５´−ＵＴＲまたは５´−ＵＴＲの一部を不活性できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって行われる方法。１２３．請求項１２１に記載の方法であって、前記不活性化は、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−２配列の完全な５´−ＵＴＲまたは５´−ＵＴＲの一部を不活性できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって行われる方法。１２４．請求項１２１に記載の方法であって、前記不活性化は、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−３配列の完全な５´−ＵＴＲまたは５´−ＵＴＲの一部を不活性できる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって行われる方法。１２５．請求項１２２，１２３または１２４に記載の方法であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがレトロウイルスベクターによって細胞に導入される方法。１２６．請求項１２２，１２３または１２４に記載の方法であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＤＮＡウイルスベクターによって細胞に導入される方法。１２７．請求項１２２，１２３または１２４に記載の方法であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＲＮＡウイルスベクターによって細胞に導入される方法。