JPWO2003010542A1 - 癌診断薬 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、診断薬、診断方法又は診断薬キットに関する。さらに、これらを用いて適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療剤に関する。
背景技術
抗癌剤としての高い効果と安全性を得るために、癌細胞に対する抗体を用いた癌ターゲティング剤の研究が進められているが、癌化する細胞の種類により、これを認識する抗体の種類も異なることが知られている。例えば、胃癌及び大腸癌との反応性からスクリーニングされたヒトモノクローナル抗体がGAH抗体として知られている(特開平4−346918号公報、特開平5−304987号公報)。
そこで、このような癌ターゲッティング剤を患者に投与する際には、患者の臨床組織を用いて抗体の反応性を事前に診断することで、より高い効果と安全性が期待されると考えられる。
従来、癌細胞に対する抗体の反応性の検出法としては、細胞を単離した後フローサイトメトリーで解析する方法や、細胞を単離することなく、組織切片を酵素抗体法や蛍光抗体法を用いて染色し解析する方法が用いられている。
フローサイトメトリー法は、血液系細胞や培養細胞の検出方法としては非常に有用であるが、組織切片を直接観察することはできず、組織から細胞を単離する煩雑な操作と、ある程度大きな組織片を用いる必要がある。さらに、フローサイトメトリー装置は高価であり、汎用性に欠けている。
また、組織切片、とくに臨床の現場において、作製の利便性と長期保存が可能である点において汎用されているホルマリン固定パラフィン包埋切片(パラフィン切片)を解析する方法としては、蛍光抗体法や酵素抗体法が知られている。
酵素抗体法は、抗体とhorseradish peroxidase(HRP)等の酵素との複合体を切片に反応させて、その酵素の基質、例えば3,3’−diaminobenzidine(DAB)等の不溶性色素を沈着させて検出する方法である。しかしこの場合、染色強度は酵素反応条件に依存しており、反応が過多になると、色素の非特異的な過剰沈着により、その染色の度合いから正確な評価を得ることが困難な場合がある。そのため、信頼性の高い診断結果を得るためには、反応時間や評価基準を極めて厳重に管理し、標準化する必要がある。
一方、蛍光抗体法は、蛍光色素を用いるため鮮明なコントラストを有し、定量性にも優れた方法である。しかしながら、パラフィン切片を蛍光観察する場合は、切片自体の有する自家蛍光が高いバックグラウンドとなり、抗体染色像の検出が容易ではない。この点を解決し、鮮明なコントラストを有し、かつ、定量性のある蛍光抗体法をパラフィン切片にも応用すべく、これまで幾つかの試みがなされてきた。
例えばフルオレッセインイソチオシアネート(FITC)ラベル抗体で染色後、アゾ色素で対比染色を施し、自家蛍光をFITCの緑色蛍光と全く異なる色調に変化させる手法(Hall,C.T.Bakteriol.184:548−555,1962.Hokenson,E.O.Stain Technology,41:9−14,1966.Fey,H.Microbiol.38:271−277,1972.Schenk,E.A.Cytochem.22:962−966,1974.Hoff,H.F.Artery 6(4):328−339,1980.)が報告されている。また、R−フィコエリスリン(R−PE)、7−アミノ−4−クマリン−3−酢酸(AMCA)のように、励起波長よりもある程度長い波長にストークスシフト(ある蛍光物質に励起波長(Ex)を照射して得られる蛍光波長(Em)の差(Em−Ex))を示す蛍光物質は、顕微鏡に適切なフィルターを設置して励起波長域の自家蛍光を含む短波長側の蛍光を遮断し、目的蛍光だけを分離して検出することができる。また、RichardらはR−PEよりもさらに長いストークスシフトを有するランタノイドの一種、Europiumの錯体を用いてTime−Resolved Fluorescence Imaging法により切片の自家蛍光の影響を低減させている(Haas,R.R.,J.Histochem.Cytochem.44(10):1091−1099,1996)。
これらの手法により自家蛍光の影響を低減することはできるが、得られる画像は暗視野の中に目的蛍光だけが観察されることになり、診断において重要な組織形態の情報は、別の手法で得られた画像と照合して判断する必要がある。
このように、蛍光抗体法の利点を臨床切片に応用すべく検討がなされているが、簡便さや定量性、あるいは組織形態の観察の点等で未だ解決されるべき課題を残している。
発明の開示
本発明の課題は、組織切片を用いた高感度で判定の容易な診断薬及び方法を提供することである。特にターゲティング療法の対象患者を選択するのに有用な診断薬及び方法を提供することにある。
本発明者らは、組織切片が有する自家蛍光により実質的に影響されない波長の蛍光波長を有する蛍光物質とペプチド又はタンパク質とを組み合わせることで、判別の容易な組織切片の染色が可能になることを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
(1)組織切片の少なくとも一部を認識するペプチド又はタンパク質と、以下i)及びii)の特徴を有する蛍光物質とを含む診断薬。
i) 所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有する。
ii) 該ペプチド又はタンパク質の像と該組織切片の像とを同時に観察することができる蛍光特性を有する。
(2)蛍光物質が、所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない長波長側に蛍光物質のストークスシフトを示す前記に記載の診断薬。
(3)組織切片がヒト由来のパラフィン切片又はヒト由来のホルマリン固定パラフィン切片である前記に記載の診断薬。
(4)ペプチド又はタンパク質が抗体である前記に記載の診断薬。
(5)抗体がモノクローナル抗体である前記に記載の診断薬。
(6)モノクローナル抗体が、癌反応性のモノクローナル抗体である前記に記載の診断薬。
(7)癌が胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である前記に記載の診断薬。
(8)モノクローナル抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号1、2及び3のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号4、5及び6のアミノ酸配列を含む前記に記載の診断薬。
(9)モノクローナル抗体が、配列表の配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む前記に記載の診断薬。
(10)モノクローナル抗体が、ビオチン標識したモノクローナル抗体である前記に記載の診断薬。
(11)蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約80nm以上長波長である前記に記載の診断薬。
(12)蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約150nm以上長波長である前記に記載の診断薬。
(13)励起波長が、約450nmから約500nmである前記に記載の診断薬。
(14)励起波長が、約480nmから約500nmである前記に記載の診断薬。
(15)励起波長が、約490nmである前記に記載の診断薬。
(16)蛍光物質が、ペリジニン クロロフィル プロテイン又はその蛍光団部分を含む当該タンパク質の断片である前記に記載の診断薬。
(17)ペリジニン クロロフィル プロテインが、ストレプトアビジン結合ペリジニン クロロフィル プロテインである前記に記載の診断薬。
(18)診断薬が、病理組織診断薬である前記に記載の診断薬。
(19)前記に記載の診断薬を用いて組織染色することを特徴とする診断方法。
(20)診断方法が、癌と薬剤の反応性を診断することを特徴とする前記に記載の診断方法。
(21)前記に記載の診断方法を用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬。
(22)疾患が、癌である前記に記載の治療薬。
(23)癌が胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である前記に記載の治療薬。
(24)以下の特徴を有する蛍光物質とタンパク質とを融合することにより得られる融合タンパク質を用いる解析方法。
i) 所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有する。
ii) 該ペプチド又はタンパク質の像と該組織切片の像とを同時に観察することができる蛍光特性を有する。
(25)蛍光物質が、所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない長波長側に蛍光物質のストークスシフトを示す前記に記載の解析方法。
(26)蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約80nm以上長波長である前記に記載の解析方法。
(27)蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約150nm以上長波長であることを特徴とする前記に記載の解析方法。
(28)解析方法が、細胞内におけるタンパク質の発現及び/又は挙動を解析する前記に記載の解析方法。
(29)前記に記載の診断薬を用いて組織染色した組織切片。
(30)前記に記載の診断薬を含む診断薬キット。
(31)診断薬キットが、癌に対する薬剤の反応性を判定する前記に記載の診断薬キット。
(32)前記に記載の診断薬キットを用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬。
(33)疾患が、癌である前記に記載の治療薬。
(34)癌が、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である前記に記載の治療薬。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において組織切片とは、凍結切片等、パラフィン切片、ホルマリン切片、特殊条件で固定したパラフィン切片、培養細胞、組織由来細部等が挙げられるが、好ましくはヒト由来のパラフィン切片又は、ヒト由来のホルマリン固定パラフィン切片が挙げられる。
本発明の組織切片の少なくとも一部を認識するペプチド又はタンパク質とは、例えば抗体等が挙げられ、中でもモノクローナル抗体が挙げられる。また、モノクローナル抗体は、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌等の癌細胞、癌組織に反応する抗体であればいずれも用いることができ、マウスモノクローナル抗体などでも良いが、より好ましくは特開平5−304987号公報で開示されているビオチン化したヒトモノクローナル抗体(GAH抗体)が挙げられる。
GAH抗体において、配列表の配列番号1、2及び3のアミノ酸配列は、重鎖可変領域の中でも超可変領域と呼ばれ、同様に配列表の配列番号4、5及び6のアミノ酸配列は、軽鎖可変領域の中でも超可変領域と呼ばれる。かかる領域は、免疫グロブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合親和性を決定するものであり、相補性決定部とも呼ばれる。従って、かかる超可変領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。すなわち、GAH抗体と同様の超可変領域を有する抗体はGAH抗体と同様に本発明において使用できると考えられる。
従って、本発明に使用されるモノクローナル抗体としてはは、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号1、2及び3のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号4、5及び6のアミノ酸配列を含むものである。これらのアミノ酸配列は、通常、重鎖及び軽鎖の各鎖の3つの超可変領域に、N末端側から、配列表の配列番号1、2及び3並びに配列表の配列番号4、5及び6の順でそれぞれ含まれる。本発明においては、癌との反応性を損なわない範囲で一部のアミノ酸を置換、挿入、削除あるいは追加する等の改変を行ったものも、本発明において使用できるモノクローナル抗体に含まれる。
本発明において使用されるモノクローナル抗体は、癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、上記の特定のアミノ酸配列を有するものを選択することによって得ることができる。
ハイブリドーマは、A.Imamらの方法〔Cancer Resarch 45,263(1985)〕に準じて、まず、癌患者から摘出された癌所属のリンパ節から、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞と融合して得られる。得られたハイブリドーマの上清を用いて、パラフォルムアルデヒド固定した各種癌細胞株に対し、エンザイムイムノアッセイにより陽性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローニングを行う。
さらに、ハイブリドーマの上清から、常法〔R.C.Duhamelら、J.Immunol.Methods 31,211(1979)〕によりモノクローナル抗体を精製し、蛍光物質でラベルし、生癌細胞株、各種の赤血球、白血球等に対する反応性をフローサイトメトリーで検出することにより、生癌細胞株に対しては反応性を示す抗体を、赤血球、白血球に対しては、反応性を示さない抗体を選別する。また、癌患者から摘出される癌組織から単離される癌細胞、及び同一患者の同一組織の非癌部から単離される正常細胞に対する反応性を比較して、癌細胞に、より多量の抗体が結合し、正常細胞には反応がないか、もしくは健常人由来の抗体と同程度の反応性しかない抗体を選別する。
かくして選別されたハイブリドーマが産生する抗体をコードするDNAの塩基配列は、たとえば、以下の方法によって得られる。抗体産生ハイブリドーマから、チオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法〔Casaraら,DNA,2,329(1983)〕でmRNAを調製して、オリゴ(dT)プライマーを用いてそのcDNAライブラリーを作製する。次いで、cDNAに(dG)テーリングを行い、このdGテールにハイブリダイズするポリCと、既に遺伝子が取得されているヒト抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の各々共通な配列部分をプローブとしてPCR法によって、抗体をコードするcDNAを増幅させる。その後、DNAの末端平滑化を行い、電気泳動法によってゲルから切りだしたDNAをpUC119等のクローニングベクターに挿入し、Sangerらのジデオキシ法〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(1977)〕によってその塩基配列が決定される。この塩基配列に基づいて、上記特定のアミノ酸配列を有するものを選別できる。
また、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、遺伝子工学的な手法により作製することもできる。
本発明において特に好適なモノクローナル抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が夫々配列表の配列表の配列番号7及び8のアミノ酸配列で表されるものである。重鎖及び軽鎖の定常領域の塩基配列は、例えばNucleic Acids Research 14,1779(1986)、The Journal of Biological Chemistry 257,1516(1982)及びCell 22,197(1980)に記載のものと同じ配列を有するものでよい。
本抗体は、本抗体を産生するハイブリドーマを牛胎児血清含有eRDF、RPMI 1640培養液等を用いて培養するか、又は、上記の特定の超可変領域を含む可変領域をコードするDNAにさらに重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするDNAが夫々連結された遺伝子を化学合成し、その遺伝子の発現を可能とする公知の種々の発現ベクター、例えば、動物細胞における発現ベクターとして、pKCRH2〔三品ら、Nature,307,605(1984)〕から特開平5−304987号公報の図1又は図2に示した手順で構築することができるpKCR(ΔE)/HとpKCRDに挿入し、CHO細胞(チャイニーズハイスター卵巣細胞)等の宿主中で発現させることにより得ることができる。例えば、重鎖遺伝子の両端にHindIII部位を付加したものをpKCR(ΔE)/HのHindIII部位に挿入し、またこのプラスミドのSalI部位にDHFR遺伝子等の選択マーカー遺伝子を挿入する。一方、軽鎖遺伝子の両端にはEcoRI部位を付加したものをpKCRDのEcoRI部位に挿入し、さらにこのプラスミドのSalI部位にもDHFR遺伝子を挿入する。両プラスミドをCHOdhfr−〔Urlaub G.& Chasin L.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,4216(1980)〕等の細胞にリン酸カルシウム法で導入し、ヌクレオチドを含まないαMEM培養液等で増殖する細胞から、さらに抗体を産生する細胞を選別することによって得ることができる。抗体は、これらの細胞を培養した培養液から、プロテインAをセルロファイン、アガロース等の支持体に結合させたカラム等に吸着し、溶出させること等によって精製される。
抗体としては、全長抗体(抗体全体)又は抗体断片(抗体フラグメント)、又は抗体誘導体等いずれも用いることができる。本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗体自体及び抗体フラグメント(例えば、F(ab)、F(ab)2、scFv(1本鎖抗体)等)のほか、誘導化抗体又はビオチン等を用いて標識した修飾抗体等を包含しており、最も広義に解釈しなければならない。
本発明において、癌とは、例えばペプチド又はタンパク質として抗体を使用する場合、該抗体が反応性を有する可能性のある癌種であれば特に限定するものではないが、例えば胃癌、大腸癌、食道癌、肺癌、乳癌、肝癌、卵巣癌、子宮癌、膵癌等が挙げられる。より好ましくは、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌が挙げられる。
本発明における蛍光物質としては、以下の特徴を有する蛍光物質であればいかなるものでも良い。
i) 所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有する。
ii) 該ペプチド又はタンパク質と該組織切片の像とを同時に観察することができる蛍光特性を有する。
このような蛍光物質としては、該組織切片のストークスシフトよりも長波長のストークスシフトを有し、組織を染色するのに実質的に十分な蛍光強度を有する蛍光物質を用いることが好ましく、該組織切片のストークスシフトよりも、約80nm以上長波長のストークスシフトを有する蛍光物質がさらに好ましく、約150nm以上長波長のストークスシフトを有する蛍光物質を用いることがより好ましい。なお、ストークスシフトとはある蛍光物質に励起波長(Ex)で励起して得られる蛍光波長(Em)の差(Em−Ex)を意味する。
本発明においては、蛍光物質の励起波長としては、約450nmから約500nmである場合が好ましく、約480nmから約500nmである場合がさらに好ましい。このとき、蛍光波長が約570nmから約750nmである場合がより好ましい。最も好ましくは、励起波長が約490nmであり蛍光波長が約640nmから約750nmである蛍光物質である。
本発明においては、蛍光物質として上記励起・蛍光特性を有するものであれば、既知の、あるいは、今後開発されるいかなる蛍光物質を用いることもできる。特に限定するものではないが、ペリジニン クロロフィル プロテイン(Peridinin Chlorophyll Protein:PerCP:BECTON DICKINSON社)、フィコエリスリンR(Molecular Probes社)、アレクサ フルオロ(Alexa Fluor)546(Molecular Probes社),ユーロピュームキレート化合物(Research Organics社)、イソギンチャク近縁類(Discosoma)(Clontech社)より得られる赤色蛍光物質あるいはこの変異体、六放サンゴ(理化学研究所)から得られた赤色蛍光物質あるいはこの変異体、オワンクラゲ(Clontech社)由来の蛍光物質ミュータント等を例示することができるが、好ましくは、渦鞭毛虫(eukaryoticdinoflagellates)のPerCPである。なお、以下、蛍光物質としてPerCPを使用した場合を例として説明する部分もあるが、本発明の蛍光物質としてはPerCPに限定されない。
蛍光物質はペプチド又はタンパク質に直接化学結合してもよく、また中間物質を介して結合することもできる。その結合は既知のあるいは今後開発されるいかなる方法を用いて結合させてもよい。
限定するものではないが、蛍光物質と抗体等のペプチド又はタンパク質との結合はスクシンイミドエステル等を用いた活性エステル法、イソチオシアネートを用いた方法、アルキルハライドを用いた方法、マレイミドを用いた方法、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法あるいはピリジルジ・ジスルフィド法等の架橋方法を用いることができる(酵素免疫測定法、石川栄治ら、医学書院)。
PerCPを例にとれば、PerCPを直接抗体に結合してもよく、またアビジン−ビオチン複合体等を介して抗体と結合することができるものが挙げられるが、より好ましくはストレプトアビジン結合PerCPである。
本発明の別の形態として、ペプチド又はタンパク質と蛍光物質を水溶性高分子、例えばデキストラン、アガロース、セルロース、等の多糖類、ポリエチレングリコール等の合成水溶性高分子を介して結合させることができる。
また、別の形態として蛍光物質をポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン等の合成有機高分子化合物等を用いたマイクロスフェアや、高分子ミセル、リポソーム、リピッドマイクロスファア等に包埋し、この微粒子にペプチド又はタンパク質を結合させることができる。これらの微粒子はアミノ基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水酸基等の官能基を導入したものであってもかまわない。
本発明の診断薬は、例えば、病理組織診断薬として用いられる。
本発明においては、上述のペプチド又はタンパク質と上述の蛍光物質とを含む診断薬を上述の組織切片に反応させて組織染色を行い、その染色度合い等を確認することにより診断を行うことができる。
より具体的には、染色した組織切片は実質的にペプチド又はタンパク質の蛍光反応を検出できるいかなる機器を用いても検査することができるが、例えば蛍光顕微鏡を挙げることができる。蛍光顕微鏡で自家蛍光と、例えば、PerCP蛍光を同時観察する場合は、励起波長約450nmから約500nmを用い、約515nm以上の蛍光波長を観察する。あるいは自家蛍光像と赤色蛍光像をそれぞれに適した励起波長、蛍光波長で観察し、画像上重ねて使用することができる。
本発明によれば、非特異的染色が少ないため、赤色蛍光の陽性像が、陰性対照のヒトイムノグロブリンを用いた染色像や組織の自家蛍光像(黄緑色から深緑色)と明確に区別できる。従って、色の違いを判定の指標にすることができる。
判定基準は赤色蛍光強度と染色頻度を考慮した肉眼によるスコアリングの他、適切な画像解析ソフトで赤色蛍光強度の数値化を行うことができる。また、切片に結合したPerCPを酸性溶液で抽出して定量してもよい。この方法により、癌と薬剤の反応性を診断することができる。
本発明においては、上記の診断方法を用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬も提供される。この場合の薬剤とは、抗体を有する癌ターゲッティング剤等が挙げられるが、好ましくは特開平5−304987号公報に記載の抗腫瘍剤が挙げられる。
また、本発明の蛍光物質を用いれば、細胞を構成するタンパク質であって、その発現方法や局在の不明なタンパク質と上記の蛍光物質を融合させることにより、該タンパク質の発現及び/又は挙動を追うことが可能となる。融合タンパク質の作製方法は、公知の方法(「遺伝子導入&発現解析実験方」羊土社(1997年発行))に従って行えば良い。この融合タンパク質を用いることにより、現在汎用されている緑色蛍光物質(Greeen Fluorescent Protein:GFP)と同時に、異なるタンパク質の発現及び/又は挙動を検討することが可能となる。
本発明の組織染色した組織切片としては、上記の診断薬を用いて、癌を染色した病理組織が挙げられるが、好ましくはストレプトアビジン結合PerCPとビオチン化したヒトモノクローナル抗体であるGAH抗体を用いて染色した、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌等の病理組織が挙げられる。
本発明の診断薬キットとしては、上記の診断薬をキット中に含むことにより、抗原等に対する薬剤の反応性を判定することができるものが挙げられる。以下、抗原を例に説明する。
該診断薬キットは、被検サンプル中の抗原を免疫学的に検出する方法によりなされ、その検出値から薬剤と抗原の反応性を判定するために使用するものである。従って、本発明の該診断薬キットは少なくとも、抗原に対する抗体、蛍光物質から構成されることを特徴とし、さらに、必須ではないが、緩衝液、界面活性剤及び洗浄液から構成されることを特徴とする。免疫学的に検出する方法としては、蛍光物質を直接抗体に化学結合した蛍光ラベル抗体を用い直接抗体の反応性を検出する直接法、蛍光ラベルした2次抗体を介して該抗体の反応を間接的に検出する間接法、あるいは、アビジン(あるいはストレプトアビジン)・ビオチンを介して抗体と蛍光物質を結合するアビジン・ビオチン法等を用いることができる。抗体の蛍光物質における標識化は、公知の方法(「続生化学実験 講座5免疫生化学研究法」(株)東京化学同人、(1986年発行)第102〜112頁等参照)に準じて行えばよい。
本発明のキット内のタンパク質は、アジ化ナトリウム等の防腐剤、アルブミン等の安定化剤、糖質等の賦形剤を含むことができる。滅菌状態で室温、冷蔵あるいは凍結状態で保存することができ、必要に応じて窒素ガス等の不活性ガスを充填して保存することができる。タンパク質は溶液、凍結あるいは凍結乾燥した状態でキット化することができ、使用時必要に応じて融解あるいはキットに添付された溶液で溶解し用いることができる。
抗体及び蛍光物質の試薬以外には、緩衝液、界面活性剤、洗浄液、2次抗体、対照用抗体、増感剤の他、採用したアッセイ法で通常使用しているもの(酵素溶液、基質溶液、反応停止液、検体希釈液、退色防止剤、スライド用保存剤等)の中から、適宜選択して使用すればよい。また、非特異的な反応を抑制するため、血清やアルブミン等のブロッキング剤をキット中に含んでいても良い。
本発明のキットは、好ましくは、緩衝液の滅菌バイアル、注射器、フィルター、カラム等によって補うことができる。
蛍光検出を行なう場合、直接法では、蛍光ラベルした抗体を切片に添加し、反応、洗浄後、切片の蛍光を観察すれば良い。間接法の場合、抗体を切片に添加し、反応、洗浄後、蛍光ラベルした2次抗体を添加し、組織に反応した抗体を可視化することができる。また、別の形態としては、抗体と蛍光ラベルした2次抗体をまず混合して、切片に添加し反応性を観察することができる。アビジンとビオチンを使った方法の場合は、ビオチン化した抗体を切片に添加し、反応、洗浄後、アビジン化したPerCP等の蛍光剤を添加し、組織に反応した抗体を可視化することができる。さらに別の形態としては、抗体を切片に添加し、反応、洗浄後、ビオチン化した二次抗体と反応させ、アビジン化したPerCP等の蛍光剤を添加し、組織に反応した抗体を可視化することができる。また、別の形態としては、ビオチン化した抗体とアビジン化したPerCP等の蛍光剤をまず混合して、切片に添加し反応性を観察することができる。さらに別の組み合わせとしてアビジン化した抗体とビオチン化したPerCP等の蛍光剤を用い上記方法で抗体の反応性を検出することができる。
これらの測定方法や測定キットによる測定の結果、組織と高い反応性を得た場合には、組織の薬剤に対する反応性が高い可能性があると判断し、薬剤の投与を考慮することが適当である。薬剤としては、抗体を有する癌ターゲッティング剤等が挙げられる。癌としては、好ましくは胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌が挙げられ、癌ターゲッティング剤としては、好ましくは特開平5−304987号公報に記載の抗腫瘍剤が挙げられる。
実施例
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
<実施例1:胃癌組織に対するGAH抗体の反応性>
特開平5−304987号公報(実施例1、2、3)に記載のGAH抗体、及び対照としてヒトイムノグロブリンにビオチン化試薬(アマシャム社製)を用いて各々の抗体にビオチン化標識を行った。ヒト胃癌組織のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、5%−BSA/PBS溶液に室温で1時間浸してブロッキングを行った後、100μg/mlの各ビオチン化抗体溶液と37℃で2時間反応させた。切片をPBSで洗浄し、4μg/mlのPerCP標識ストレプトアビジン溶液(Becton/Dickinson社製)と遮光下、氷冷中で30分間反応させた。GAH抗体の胃癌組織切片に対する反応性は、蛍光顕微鏡を用い、励起波長490nmにおける680nmのPerCPの赤色蛍光として検出した。
結果を第1図に示す。ビオチン化GAH抗体とPerCP標識ストレプトアビジン溶液を反応させた胃癌組織切片(第1図a)は赤色蛍光が検出された。対照であるビオチン化ヒトイムノグロブリンとPerCP標識ストレプトアビジン溶液を反応させた胃癌組織切片(第1図b)では赤色蛍光は検出されなかった。
<比較例1:胃癌組織に対するGAH抗体の反応性(HRP酵素抗体法)>
対照例として、同組織の連続切片を脱パラフィン処理し、過酸化水素水で内因性のペルオキシダーゼを不活性化した後、5%−BSA/PBS溶液に室温で1時間浸してブロッキングした。10μg/mlの実施例1に記載の各ビオチン化抗体溶液と37℃で2時間反応させ、さらにベクタステインeliteABCキット(avidin−biotinylHRP−complex、Vector製)と室温で1時間反応させた。
GAH抗体の胃癌組織切片に対する反応性は、ジアミノベンチジン(DAB)の赤褐色染色像として検出し、ヘマトキシリンにて核を対比染色した。
結果を第2図に示す。GAH抗体染色像(第2図a)には赤褐色染色像が認められたもののバックグラウンドとの差別化がつきにくく、加えて対照であるイムノグロブリン染色像(第2図b)と比べてどの程度赤褐色染色像が認められるかの判断が難しかった。
<実施例2:乳癌組織に対するGAH抗体の反応性>
特開平5−304987号公報(実施例1、2、3)に記載のGAH抗体にビオチン化試薬(アマシャム社製)を用いてビオチン化標識を行った。ヒト乳癌組織のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、5%−BSA/PBS溶液に室温で1時間浸してブロッキングを行った後、100μg/mlのビオチン化GAH抗体溶液と37℃で2時間反応させた。切片をPBSで洗浄し、4μg/mlのPerCP標識ストレプトアビジン溶液(Becton/Dickinson社製)と遮光下、氷冷中で30分間反応させた。GAH抗体の乳癌組織切片に対する反応性は、蛍光顕微鏡を用い、励起波長490nmにおける680nmのPerCPの赤色蛍光として検出した。
結果を第3図に示す。抗体存在下では染色が認められた(第3図a)が、抗体非存在下では染色が認められなかった(第3図b)。
<実施例3:大腸癌組織に対するGAH F(ab’)2の反応性>
特開平5−304987号公報(実施例1、2、3)に記載のGAH F(ab’)2、及び対照としてヒトIgG F(ab’)2に対してビオチン化試薬(アマシャム社製)を用いて各々の抗体にビオチン化標識を行った。ヒト大腸癌組織のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、5%−BSA/PBS溶液に室温で1時間浸してブロッキングを行った後、66μg/mlの各ビオチン化抗体溶液と37℃で2時間反応させた。切片をPBSで洗浄し、4μg/mlのPerCP標識ストレプトアビジン溶液(Becton/Dickinson社製)と遮光下、氷冷中で30分間反応させた。GAH抗体の大腸癌組織切片に対する反応性は、蛍光顕微鏡を用い、励起波長490nmにおける680nmのPerCPの赤色蛍光として検出した。
結果を第4図に示す。ビオチン化GAH F(ab’)2とPerCP標識ストレプトアビジン溶液を反応させた大腸癌組織切片(第4図a)は赤色蛍光が検出された。対照であるビオチン化ヒトIgG F(ab’)2とPerCP標識ストレプトアビジン溶液を反応させた大腸癌組織切片(第4図b)では赤色蛍光が検出されなかった。
<実施例4:食道癌組織に対するGAH F(ab’)2の反応性>
特開平5−304987号公報(実施例1、2、3)に記載のGAH F(ab’)2にビオチン化試薬(アマシャム社製)を用いてビオチン化標識を行った。ヒト食道癌組織のパラフィン切片を脱パラフィン処理し、5%−BSA/PBS溶液に室温で1時間浸してブロッキングを行った後、66μg/mlのビオチン化GAH抗体溶液と37℃で2時間反応させた。切片をPBSで洗浄し、4μg/mlのPerCP標識ストレプトアビジン溶液(Becton/Dickinson社製)と遮光下、氷冷中で30分間反応させた。GAH抗体の食道癌組織切片に対する反応性は、蛍光顕微鏡を用い、励起波長490nmにおける680nmのPerCPの赤色蛍光として検出した。
結果を第5図に示す。抗体存在下では染色が認められた(第5図a)が、抗体非存在下では染色が認められなかった(第5図b)。
<参考例1:GAH抗原陽性、陰性のin vivo試験(大腸癌組織切片観察)>
ヒト大腸癌細胞株WiDr−Tc(GAH抗体陽性細胞株、東北大学加齢研より入手)、SW837(GAH抗体陽性細胞株、免疫生物研究所より入手)、Caco−2(GAH抗体陰性細胞株、大日本製薬社)をそれぞれヌードマウス皮下に移植して腫瘍を作製し、その腫瘍組織でパラフィン切片を作製した。切片を脱パラフィン処理し、5%−BSA/PBS溶液に室温で1時間浸してブロッキングを行った後、100μg/mlのビオチン化GAH抗体溶液と37℃で2時間反応させた。切片をPBSで洗浄し、4μg/mlのPerCP標識ストレプトアビジン溶液(Becton/Dickinson社製)と遮光下、氷冷中で30分間反応させた。GAH抗体の反応性は蛍光顕微鏡を用い、励起波長490nmにおける680nmのPerCPの赤色蛍光として検出した。
結果を第6図に示す。ヒト大腸癌細胞株WiDr−Tc(a)及びSW837(b)では癌細胞に対して強い赤色蛍光が検出されたが、Caco−2(c)ではこれらに比べて赤色蛍光は弱かった。
<参考例2:GAH抗原陽性、陰性のin vivo試験(抗腫瘍効果)>
参考例1に記載の腫瘍細胞株にてヌードマウス腎皮膜下移植モデルを作製し、塩酸ドキソルビシン(DXR)(協和発酵社)、DXR封入PEGリポソーム(PL)、GAH結合DXR封入PEGリポソーム(PGL)をそれぞれドキソルビシン3mg/kg相当量静脈内投与した。対照群には同量の生理食塩液を投与した。これを1週間に1回、計3回投与し、最終投与から1週間後に腫瘍重量を測定したところ、GAH抗体陽性細胞株であるWiDr−Tc(第7図a)、SW837(第7図b)ではPGLの有意な抗腫瘍効果が得られたのに対し、GAH抗体陰性株であるCaco−2(第7図c)ではPGLの効果は小さかった。
ここで用いたPL及びPGLはWO00/64413号公報(実施例1)に記載の方法に準じて作製した。すなわち、DXRを封入したリポソームを作製し、チオール化したGAH抗体を結合させ、さらにチオール化したポリエチレングリコール(PEG)を結合させ、PGLを作成した。また、これらの手順から抗体結合の操作を省くことによってPLを作成した。
<比較例2>
PerCPラベル及びFITCラベル抗体を用いて、ヒト大腸癌組織切片の染色像を比較した。抗体はビオチン化GAH F(ab’)2を用い、対照抗体としてビオチン化ヒトIgG F(ab’)2を用いた。
結果を第8図に示す。図中、AはGAH F(ab’)2(FITCラベル)、Bは対照抗体(FITCラベル)、CはGAH F(ab’)2(PerCPラベル)をまた、Dは対照抗体(PerCPラベル)を示す。なお、組織切片のみの蛍光像は対照抗体染色像(D)と同じであった。
<実施例5 組織切片の自家蛍光>
実施例1と同様にして作製したヒト大腸癌切片の自家蛍光のスペクトルを固体試料ホルダーを装着した蛍光分光光度計(日本分光製)を用いて測定した。第9図中に各励起波長における蛍光スペクトルを示す。図中Aは励起波長350nmにおける360nmから700nmの蛍光スペクトルを、Bは励起波長490nmにおける500nmから700nmの蛍光スペクトルを、Cは励起波長595nmにおける605nmから700nmの蛍光スペクトルを示す。それぞれの励起波長でレーリー光の強い影響がある為、レーリー光を遮断するため、受光部に(A)は420nm以上、(B)は520nm以上、(C)は620nm以上の蛍光を透過するフィルターL−42、Y−52、R−62フィルター(ケンコー社製)をそれぞれ用いた。第9図に示すように、組織切片は各励起波長においても、広範囲に強い自家蛍光を持つことがわかる。
さらに、この組織切片の励起波長490nmにおける自家蛍光スペクトルと各色素の蛍光スペクトルを比較したのが第10図である。
組織切片(A)に加え、溶液用セルを用い、FITC溶液(B)、AlexaFluor488溶液(C)、AlexaFluor546溶液(D)、及びPerCP溶液(E)の励起波長490nmにおける500nmから700nmの蛍光スペクトルを同様にして取得した。結果を第11図に示し比較した。自家蛍光(A)とFITC(B)やAlexaFluor488(C)の蛍光スペクトルは、重複していることが示された。またAlexaFluor546(D)の蛍光も自家蛍光と近接した波長であった。従って、本励起波長においては、約600nm以下の蛍光波長では自家蛍光との分離が不明確であることがわかる。一方PerCPの蛍光(E)は組織切片の自家蛍光から明確に分離され、自家蛍光の影響を受けないことがわかる。
<実施例6 組織からの蛍光物質の抽出>
大腸癌細胞株DLD−1(大日本製薬社)、及びCOLO205(大日本製薬社)、胃癌細胞株MKN45(免疫生物研究所)のヌードマウス皮下移植腫瘍をビオチン標識GAH抗体とストレプトアビジンPerCPを用いて免疫染色した。各スライド10枚分の組織から10mM Glycine−HCl buffer,pH1.7を用いてPerCPを抽出した。JASCO蛍光分光光度計にて励起波長490nmにおける蛍光波長680nmの赤色蛍光量を測定した。一方、各組織染色像よりAdobePhotoshop ver.5.5を用いて画像を構成するピクセルの赤色チャンネル強度のヒストグラム平均値と、明るさの指標として輝度ヒストグラム平均値の差を、PerCP赤色蛍光定量値として算出したところ、第11図に示すように抽出測定した蛍光量と画像処理による定量値は良い相関を示した。
<実施例7 抗サイトケラチン抗体の例>
実施例1と同様にして作製したヒト胃癌切片に10μg/mlの抗サイトケラチン8/18マウスモノクロナール抗体(Zymed社)を添加し37℃で1時間反応させた。対照としてマウスIgGを用いた。PBSで洗浄後、ビオチン標識抗マウスIgG抗体(Zymed社)を加え室温で1時間反応させた。再度PBSで洗浄後、実施例1と同様にストレプトアビジンPerCP(A)、ストレプトアビジンAlexaFluor546(B,C)で染色し蛍光を観察した。第12図に染色像を示す。図中AはPerCPの赤色蛍光によって組織中の癌細胞が明確に識別できたが、黄赤色蛍光を有するAlexaFluor546で染色したBは、組織中の癌細胞の識別が不明瞭であった。一方、対照抗体を用いた染色では 非染色組織と同様に陰性像であった。代表例として対照抗体/AlexaFluor546の陰性像(C)を示す。
産業上の利用可能性
本発明は、組織切片を用いた高感度で判定の容易な診断薬であり、診断方法として極めて有用である。また、本発明の診断方法を用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療剤を提供することができる。また、本発明の蛍光物質との融合タンパク質を用いたタンパク質の解析方法を提供することも可能である。また、本発明の診断薬を用いて組織染色する組織切片や、癌に対する薬剤の親和性を判定するための診断薬キット、さらに、該診断薬キットを用いて適切な薬剤を選択した上で投与される疾患の治療剤を提供することができる。
なお、本出願は、日本特許出願 特願2001−224054号を優先権主張して出願されたものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第1図は、胃癌組織のGAH抗体染色像である。
第2図は、胃癌組織のGAH抗体染色像(HRP酵素抗体法)である。
第3図は、乳癌組織のGAH抗体染色像である。
第4図は、大腸癌組織のF(ab)2化GAH抗体染色像である。
第5図は、食道癌組織のF(ab)2化GAH抗体染色像である。
第6図は、大腸癌細胞株移植腫瘍のGAH抗体染色像である。
第7図は、大腸癌細胞株移植腫瘍に対するin vivo抗腫瘍効果である。
第8図は、FITC染色像とPerCP染色像との比較である。
第9図は、組織切片の自家蛍光スペクトル解析である。
第10図は、各種蛍光物質のスペクトル解析である。
第11図は、PerCP染色像の定量性についての検討である。
第12図は、AlexaFluor546染色像とPerCP染色像との比較である。
Claims (34)
- 組織切片の少なくとも一部を認識するペプチド又はタンパク質と、以下i)及びii)の特徴を有する蛍光物質とを含む診断薬。
i) 所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有する。
ii) 該ペプチド又はタンパク質の像と該組織切片の像とを同時に観察することができる蛍光特性を有する。 - 蛍光物質が、所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない長波長側に蛍光物質のストークスシフトを示す請求項1に記載の診断薬。
- 組織切片がヒト由来のパラフィン切片又はヒト由来のホルマリン固定パラフィン切片である請求項1又は2に記載の診断薬。
- ペプチド又はタンパク質が抗体である請求項1から3のいずれかに記載の診断薬。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項4に記載の診断薬。
- モノクローナル抗体が、癌反応性のモノクローナル抗体である請求項5に記載の診断薬。
- 癌が胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である請求項6に記載の診断薬。
- モノクローナル抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号1、2及び3のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号4、5及び6のアミノ酸配列を含む請求項5から7のいずれかに記載の診断薬。
- モノクローナル抗体が、配列表の配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む請求項5から8に記載の診断薬。
- モノクローナル抗体が、ビオチン標識したモノクローナル抗体である請求項5から9のいずれかに記載の診断薬。
- 蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約80nm以上長波長である請求項2から10のいずれかに記載の診断薬。
- 蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約150nm以上長波長である請求項11に記載の診断薬。
- 励起波長が、約450nmから約500nmである請求項1から12のいずれかに記載の診断薬。
- 励起波長が、約480nmから約500nmである請求項13に記載の診断薬。
- 励起波長が、約490nmである請求項13又は14に記載の診断薬。
- 蛍光物質が、ペリジニン クロロフィル プロテイン又はその蛍光団部分を含む当該タンパク質の断片である請求項1から15のいずれかに記載の診断薬。
- ペリジニン クロロフィル プロテインが、ストレプトアビジン結合ペリジニン クロロフィル プロテインである請求項16に記載の診断薬。
- 診断薬が、病理組織診断薬である請求項1から17のいずれかに記載の診断薬。
- 請求項1から18のいずれかに記載の診断薬を用いて組織染色することを特徴とする診断方法。
- 診断方法が、癌と薬剤の反応性を診断することを特徴とする請求項19に記載の診断方法。
- 請求項19又は20に記載の診断方法を用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬。
- 疾患が、癌である請求項21に記載の治療薬。
- 癌が胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である請求項22に記載の治療薬。
- 以下の特徴を有する蛍光物質とタンパク質とを融合することにより得られる融合タンパク質を用いる解析方法。
i) 所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない蛍光波長を有する。
ii) 該ペプチド又はタンパク質の像と該組織切片の像とを同時に観察することができる蛍光特性を有する。 - 蛍光物質が、所定の励起波長において、該組織切片が有する非特異的な自家蛍光の波長域に近接しない長波長側に蛍光物質のストークスシフトを示す請求項24に記載の解析方法。
- 蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約80nm以上長波長である請求項24又は25に記載の解析方法。
- 蛍光物質のストークスシフトが、該組織切片のストークスシフトよりも約150nm以上長波長であることを特徴とする請求項24から26のいずれかに記載の解析方法。
- 解析方法が、細胞内におけるタンパク質の発現及び/又は挙動を解析する請求項24から27のいずれかに記載の解析方法。
- 請求項1から18のいずれかに記載の診断薬を用いて組織染色した組織切片。
- 請求項1から18のいずれかに記載の診断薬を含む診断薬キット。
- 診断薬キットが、癌に対する薬剤の反応性を判定する請求項30に記載の診断薬キット。
- 請求項30又は31に記載の診断薬キットを用いて、適切な薬剤を選択した上で投与する疾患の治療薬。
- 疾患が、癌である請求項32に記載の治療薬。
- 癌が、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌である請求項33に記載の治療薬。
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