JP4866006B2 - 抗体認識抗原 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の腫瘍塊形成時に該細胞表面に露出する部分を含む抗原に関する発明である。より具体的には、固形腫瘍において細胞表面に露出する非筋肉型ミオシン重鎖タイプＡ又はその変異体の一部を、抗原として認識する有用な医薬に関する発明である。

現在、抗癌剤としての高い効果と安全性を得るために、癌細胞に対する抗体を用いた癌ターゲティング剤の研究が進められている。例えば、胃癌及び大腸癌との反応性からスクリーニングされたヒトモノクローナル抗体がＧＡＨ抗体として知られており（ＥＰ公開第５２６７００号及びＥＰ公開第５２０４９９号各号公報参照）、該抗体を結合した薬剤封入リポソーム（ＥＰ公開第５２６７００号公報参照）の開発が進められている。
一方、癌化する細胞の種類により、該細胞を認識する抗体の種類も異なることが知られている。抗体が結合した薬剤封入リポソームを癌ターゲッティング剤として利用する場合には、該抗体が認識する抗原を同定することは、抗癌剤としてのより高い効果と安全性を得るために必要であると考えられる。しかしながら、これまでのところＧＡＨ抗体に関しては該抗体が認識する抗原の同定には至っていなかった。
また、これまでに、マウス線維芽細胞株Ｌ９２９から精製したミオシン重鎖をウサギに免疫して得た抗体が、Ｌ９２９その他の細胞表面に反応するという報告があるが（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ Ｍ．Ｃ．（１９７４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７１，４１４４、及び、Ｏｌｄｅｎ Ｋ．（１９７６）Ｃｅｌｌ ８，３８３−３９０参照）、ヒト非筋肉型ミオシン重鎖タイプＡ（以下「ｎｍＭＨＣＡ」と略することもある）が癌化によって細胞表面に露出するという報告はなく、さらに該タンパク質が癌関連抗原として報告されている例はない。
ＥＰ公開第５２６７００号公報 ＥＰ公開第５２０４９９号公報 Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ Ｍ．Ｃ．（１９７４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７１，４１４４ Ｏｌｄｅｎ Ｋ．（１９７６）Ｃｅｌｌ ８，３８３−３９０

本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねてきた結果、ＥＰ公開第５２０４９９号公報で開示されているヒトモノクローナル抗体（ＧＡＨ抗体）に代表されるような抗体が、細胞の腫瘍塊形成時に該細胞表面に露出する部分を含む抗原を認識することを見出した。
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）細胞の腫瘍塊形成時に該細胞表面に露出する部分を含む抗原。
（２）腫瘍塊が、培養癌細胞の皮下移植により形成した固形腫瘍である前記の抗原。
（３）固形腫瘍において、該固形腫瘍の培養細胞と比較してその存在量が増加している前記の抗原。
（４）固形腫瘍において、該固形腫瘍の培養細胞と比較して、その細胞表面の存在量が増加している前記の抗原。
（５）細胞骨格タンパク質又はその変異体である前記の抗原。
（６）ミオシン又はその変異体である前記の抗原。
（７）非筋肉型ミオシン重鎖タイプＡ又はその変異体であることを特徴とする前記の抗原。
（８）非筋肉型ミオシン重鎖タイプＡ又はその変異体の一部であることを特徴とする前記の抗原。
（９）非筋肉型ミオシン重鎖タイプＡ又はその変異体のタンパク質配列のＣ末端側配列であることを特徴とする前記の抗原。
（１０）タンパク質配列のＣ末端側配列が配列表の配列番号１７のＮ末端側から、６００残基以降１９６０残基までの配列である前記の抗原。
（１１）タンパク質配列のＣ末端側配列が配列表の配列番号２０、２１又は２２のいずれかである前記の抗原。
（１２）前記の抗原を認識するリガンド。
（１３）抗体であることを特徴とする前記のリガンド。
（１４）モノクローナル抗体であることを特徴とする前記のリガンド。
（１５）モノクローナル抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記のリガンド。
（１６）癌反応性のモノクローナル抗体であることを特徴とする前記のリガンド。
（１７）癌が、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌であることを特徴とする前記のリガンド。
（１８）重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記のリガンド。
（１９）配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むことを特徴とする前記のリガンド。
（２０）前記のリガンドを含有することを特徴とする医薬組成物。
（２１）ターゲッティング療法剤であることを特徴とする前記の医薬組成物。
（２２）癌組織又は癌細胞をターゲットとすることを特徴とする前記の医薬組成物。
（２３）抗癌剤、抗腫瘍性タンパク質、酵素、遺伝子又は治療用アイソトープを含有することを特徴とする前記の医薬組成物。
（２４）抗癌剤であることを特徴とする前記の医薬組成物。
（２５）癌が、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌であることを特徴とする前記の医薬組成物。
（２６）リポソームを含有することを特徴とする前記の医薬組成物。
（２７）前記のリガンドを含有する標識剤。
（２８）癌組織又は癌細胞を特異的に標識することを特徴とする前記の標識剤。
（２９）癌が、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌であることを特徴とする前記の標識剤。
（３０）蛍光剤、酵素、アイソトープ又はＭＲＩ造影剤を含有することを特徴とする前記の標識剤。
（３１）前記の抗原を発現している癌疾患患者に、当該疾患の治療の為に前記の医薬組成物を投与する方法。
（３２）前記の標識剤により標識される細胞を有する癌疾患患者に、当該疾患の治療の為に前記の医薬組成物を投与する方法。
（３３）前記の抗原を認識するリガンドの当該抗原への結合活性が、０．５×１０^６単位／ｍｇから２．０×１０^６単位／ｍｇであることを特徴とする前記のリガンド。
（３４）結合活性が、０．７×１０^６単位／ｍｇから１．５×１０^６単位／ｍｇ、０．７×１０^６単位／ｍｇから１．３×１０^６単位／ｍｇ又は０．８×１０^６単位／ｍｇから１．２×１０^６単位／ｍｇであることを特徴とする前記のリガンド。
（３５）結合活性が、０．８×１０^６単位／ｍｇから１．２×１０^６単位／ｍｇであることを特徴とする前記のリガンド。

第１図は、ＭＫＮ４５の培養細胞及び移植由来細胞に対するＧＡＨ抗体の反応性を示す図である。
第２図の写真は、ｎｍＭＨＣＡ安定発現組織切片におけるＧＡＨ及び抗ｎｍＭＨＣＡ抗体の反応性の検討結果を示す図である。
第３図は、ｎｍＭＨＣＡ安定発現株を用いたＧＡＨの細胞表面反応性の検討結果であり、ＧＡＨ抗体結合数を示す図である。
第４図は、ｎｍＭＨＣＡ安定発現株を用いた抗ｎｍＭＨＣＡ抗体の細胞表面反応性の検討結果であり、抗ｎｍＭＨＣ抗体結合数を示す図である。
第５図は、抗ｎｍＭＨＣＡペプチド抗体のＭＫＮ４５培養細胞、ＭＫＮ４５の皮下移植により形成した腫瘍細胞表面に対する反応性の検討結果を示す図である。
第６図は、腫瘍増殖抑制効果と細胞あたりの抗原量との関係を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細胞としては、胃、大腸、食道、乳腺、肺、膵臓、肝臓、腎臓、卵巣又は子宮由来の細胞が挙げられる。好ましくは胃、大腸、食道又は乳腺由来の細胞が挙げられる。より好ましくは大腸由来の細胞が挙げられる。
本発明の腫瘍塊とは、可視的、微視的に腫瘍細胞の集合体を形成するものであればいかなるものでもよい。好ましくは、正常組織が自然発生的に固形癌化したもの、癌細胞の移植により該細胞が増殖したものが挙げられる。より好ましくは培養癌細胞の皮下移植により形成した固形腫瘍が挙げられる。
本発明の露出とは、内部にある物質が細胞膜の表面に現れること、あるいは表面を覆っている物質が剥がれることで内部にある物質が露呈することをいい、好ましくは、抗原の一部が細胞の表面に現れることをいう。さらに好ましくは、抗原のタンパク質配列のＣ末端側が細胞の表面に現れることをいう。
本発明の抗原としては、正常細胞においては細胞骨格や細胞内小器官として機能していると考えられるタンパク質、糖タンパク質、タンパク質脂質複合体又はこれらの変異体が挙げられる。好ましくは、細胞が腫瘍塊を形成することにより抗原として機能するものが挙げられる。さらに好ましくはミオシン、アクチン、トロポミオシン、ビメンチン、サイトケラチン等又はこれらの変異体が挙げられる。最も好ましくはヒト非筋肉型ミオシン重鎖タイプＡ（ｎｍＭＨＣＡ）が挙げられる。ここで、ｎｍＭＨＣＡは、Ｔｏｏｔｈａｋｅｒ ＬＥらの方法［Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．７８（７），ｐｐ．１８２６−１８３３，１９９１］や、Ｓａｅｚ ＣＧらの方法［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９０ Ｆｅｂ；８７（３）：１１６４−８］に従って遺伝子を取得し、該遺伝子を用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）に従いタンパク質を発現させることにより得られる。
本発明のタンパク質のＣ末端側配列としては、例えば、配列表の配列番号１７に示すｎｍＭＨＣＡのＮ末端側から６００残基以降１９６０残基までの配列が挙げられ、好ましくは配列表の配列番号２０、２１又は２２の配列が挙げられる。
本発明の固形腫瘍と該固形腫瘍の培養細胞との比較は、例えば、培養癌細胞と、当該培養細胞を一旦動物に移植して形成される固型腫瘍から分離される固型腫瘍由来の癌細胞を比較する方法や、患者の固型癌組織から分離した癌細胞と、当該癌細胞を一旦インビトロで培養し馴化した培養癌細胞とを比較する方法等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の細胞表面の存在量とは、細胞全体における抗原の存在量又は細胞表面のみにおける抗原の存在量を示すが、好ましくは細胞表面のみにおける抗原の存在量を示す。細胞表面の存在量は、例えばフローサイトメトリーによって定量することが可能であるがこれに限定されない。
本発明の増加とは、３倍以上増加することが挙げられるが、好ましくは４倍以上、より好ましくは１０倍以上増加することが挙げられる。
本発明の変異体とは、１又は数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加したアミノ酸配列を有するもの、又は正常のタンパク質の立体的構造が変化したものが挙げられる。
本発明のリガンドとは、各種抗体、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）等の成長因子又は増殖因子等のタンパク質が挙げられるが、好ましくは抗体が挙げられる。また、抗体としては各種動物のポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ヒト−マウスキメラ抗体又はヒト型モノクローナル抗体及びヒトモノクローナル抗体が挙げられるが、好ましくはヒトモノクローナル抗体が挙げられる。さらに好ましくは癌反応性のヒトモノクローナル抗体が挙げられ、好ましくはＥＰ公開第５２０４９９号公報で開示されているヒトモノクローナル抗体（ＧＡＨ抗体）が挙げられる。
ＧＡＨ抗体において、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列は、重鎖可変領域の中でも超可変領域と呼ばれ、同様に配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列は、軽鎖可変領域の中でも超可変領域と呼ばれる。かかる領域は、免疫グロブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合親和性を決定するものであり、相補性決定部とも呼ばれる。従って、かかる超可変領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。すなわち、ＧＡＨ抗体と同様の超可変領域を有する抗体はＧＡＨ抗体と同様に本発明において使用できると考えられる。
従って、本発明に使用される好ましいモノクローナル抗体としては、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含むものである。これらのアミノ酸配列は、通常、重鎖及び軽鎖の各鎖の３つの超可変領域に、Ｎ末端側から、配列表の配列番号１、２及び３並びに配列表の配列番号４、５及び６の順でそれぞれ含まれる。本発明においては、癌との反応性を損なわない範囲で一部のアミノ酸を置換、挿入、削除あるいは追加する等の改変を行ったものも、本発明において使用できるモノクローナル抗体に含まれる。
本発明のモノクローナル抗体は、癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、上記の特定のアミノ酸配列を有するものを選択することによって得ることができる。
ハイブリドーマは、Ａ．Ｉｍａｍらの方法〔Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓａｒｃｈ ４５，２６３（１９８５）〕に準じて、まず、癌患者から摘出された癌所属のリンパ節から、リンパ球を単離し、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞と融合して得られる。得られたハイブリドーマの上清を用いて、パラフォルムアルデヒド固定した各種癌細胞株に対し、エンザイムイムノアッセイにより陽性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローニングを行う。
さらに、ハイブリドーマの上清から、常法〔Ｒ．Ｃ．Ｄｕｈａｍｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１，２１１（１９７９）〕によりモノクローナル抗体を精製し、蛍光物質でラベルし、生癌細胞株、各種の赤血球、白血球等に対する反応性をフローサイトメトリーで検出することにより、生癌細胞株に対しては反応性を示す抗体を、赤血球、白血球に対しては、反応性を示さない抗体を選別する。また、癌患者から摘出される癌組織から単離される癌細胞、及び同一患者の同一組織の非癌部から単離される正常細胞に対する反応性を比較して、癌細胞に、より多量の抗体が結合し、正常細胞には反応がないか、もしくは健常人由来の抗体と同程度の反応性しかない抗体を選別する。
かくして選別されたハイブリドーマが産生する抗体をコードするＤＮＡの塩基配列は、たとえば、以下の方法によって得られる。抗体産生ハイブリドーマから、チオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法〔Ｃａｓａｒａら，ＤＮＡ，２，３２９（１９８３）〕でｍＲＮＡを調製して、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてそのｃＤＮＡライブラリーを作製する。次いで、ｃＤＮＡに（ｄＧ）テーリングを行い、このｄＧテールにハイブリダイズするポリＣと、既に遺伝子が取得されているヒト抗体重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の各々共通な配列部分をプローブとしてＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。その後、ＤＮＡの末端平滑化を行い、電気泳動法によってゲルから切りだしたＤＮＡをｐＵＣ１１９等のクローニングベクターに挿入し、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）〕によってその塩基配列が決定される。この塩基配列に基づいて、上記特定のアミノ酸配列を有するものを選別できる。
また、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、遺伝子工学的な手法により作製することもできる。
本発明において特に好適なモノクローナル抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が夫々配列表の配列番号７及び８のアミノ酸配列で表されるものである。重鎖及び軽鎖の定常領域の塩基配列は、例えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４，１７７９（１９８６）、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５７，１５１６（１９８２）及びＣｅｌｌ ２２，１９７（１９８０）に記載のものと同じ配列を有するものでよい。
本抗体は、本抗体を産生するハイブリドーマを牛胎児血清含有ｅＲＤＦ、ＲＰＭＩ １６４０培養液等を用いて培養するか、又は、上記の特定の超可変領域を含む可変領域をコードするＤＮＡにさらに重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡが夫々連結された遺伝子を化学合成し、その遺伝子の発現を可能とする公知の種々の発現ベクター、例えば、動物細胞における発現ベクターとして、ｐＫＣＲＨ２〔三品ら、Ｎａｔｕｒｅ，３０７，６０５（１９８４）〕からＥＰ公開第５２０４９９号公報の図１又は図２に示した手順で構築することができるｐＫＣＲ（ΔＥ）／ＨとｐＫＣＲＤに挿入し、ＣＨＯ細胞（チャイニーズ ハイスター 卵巣細胞）等の宿主中で発現させることにより得ることができる。例えば、重鎖遺伝子の両端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加したものをｐＫＣＲ（ΔＥ）／ＨのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、またこのプラスミドのＳａｌＩ部位にＤＨＦＲ遺伝子等の選択マーカー遺伝子を挿入する。一方、軽鎖遺伝子の両端にはＥｃｏＲＩ部位を付加したものをｐＫＣＲＤのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、さらにこのプラスミドのＳａｌＩ部位にもＤＨＦＲ遺伝子を挿入する。両プラスミドをＣＨＯｄｈｆｒ⁻〔Ｕｒｌａｕｂ Ｇ．＆ Ｃｈａｓｉｎ Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４２１６（１９８０）〕等の細胞にリン酸カルシウム法で導入し、ヌクレオチドを含まないαＭＥＭ培養液等で増殖する細胞から、さらに抗体を産生する細胞を選別することによって得ることができる。抗体は、これらの細胞を培養した培養液から、プロテインＡをセルロファイン、アガロース等の支持体に結合させたカラム等に吸着し、溶出させること等によって精製される。
本発明の癌とは、例えば単鎖抗体（ｓｃＦｖ）やｗｈｏｌｅ抗体あるいはそのフラグメントとして抗体を使用する場合、該抗体が反応性を有する可能性のある癌種が挙げられる。好ましくは胃癌、大腸癌、食道癌、肺癌、乳癌、肝癌、卵巣癌、子宮癌又は膵癌が挙げられる。さらに好ましくは、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌が挙げられる。
本発明の医薬組成物としては、リガンド単独、あるいはリガンドに作用性物質を結合したターゲッテイング療法剤が挙げられるが、好ましくは、ターゲッティング療法剤が挙げられる。ターゲッティング療法剤は、リガンドに作用性物質が直接結合したもの、リガンドに作用物質が水溶性高分子を介して結合したもの、リガンドに作用性物質を含有した微粒子が結合したものが挙げられる。微粒子としてはマイクロスフェア、ミセル又はリポソームが挙げられるが、好ましくはリポソームが挙げられる。リポソームの中には医薬品や標識剤が封入されていても良い。これらに封入する医薬品としては、アドリアマイシン、ダウノマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）の抗腫瘍剤又はそれらの薬学的に許容しうる塩及び誘導体が挙げられる。また、リシンＡやジフテリアトキシンの毒素タンパク質及びそれをコードするＤＮＡ、ＴＮＦのサイトカイン遺伝子をコードするＤＮＡ又はアンチセンスＤＮＡにヌクレオチド類が挙げられる。特に好ましくはアドリアマイシンが挙げられる。また、これらに封入する標識剤としては放射性元素、例えばインジウム、テクネシウムのイメージング薬剤や、ホースラディシュパーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼの酵素、ガドリニュームのＭＲＩ造影剤、ヨーソのＸ線造影剤、ＣＯ２の超音波造影剤、ユーロピウム誘導体、カルボキシフルオレッセインの蛍光体又はＮ−メチルアクリジウム誘導体の発光体が挙げられる。水溶性高分子誘導体としては、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリグリセリン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はポリアミノ酸の合成高分子が挙げられ、好ましくはポリエチレングリコールが挙げられる。該ターゲッティング療法剤は癌組織又は癌細胞をターゲットとすることがより好ましい。この場合の癌としては、胃癌、大腸癌、食道癌、肺癌、乳癌、肝癌、卵巣癌、子宮癌、又は膵癌が挙げられる。好ましくは、胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌が挙げられる。
本発明において、抗原を認識するリガンドの当該抗原への結合活性は、例えば、抗原を認識するリガンドを工業的に用いる場合に、当該リガンドの品質の恒常性を確保するためなどに測定されるが、この目的に限定されない。また、測定方法としては、例えば、一定量の抗体を含む標準溶液からマイクロプレートリーダー等を用いて検量線を作成し、試験溶液に含まれる抗体の抗原に対する結合活性を測定する方法等があるが、この測定方法に限定されない。
結合活性を力価で示す場合には、０．５×１０^６から２．０×１０^６単位／ｍｇの範囲が挙げられるが、好ましくは、０．７×１０^６から１．５×１０^６単位／ｍｇ、０．７×１０^６から１．３×１０^６単位／ｍｇ又は０．８×１０^６から１．２×１０^６単位／ｍｇの範囲が挙げられる。より好ましくは、０．８×１０^６から１．２×１０^６単位／ｍｇが挙げられる。
リガンドが結合した作用性物質及び水溶性分子誘導体の複合体は、例えば、ＥＰ公開第５２６７００号公報又はＥＰ公開第５２０４９９号公報に記載の方法により製剤化することができ、該複合体を、癌等の各種疾患の治療のために、血管内投与、膀胱投与、腹腔内投与、局所投与等の方法で患者に投与することができる。投与量は有効成分の抗腫瘍性物質の種類に応じて適宜選択することができるが、例えばドキソルビシンを封入したリポソームを投与する場合には、有効成分量として５０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下で用いることができる。

以下、本発明を実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例には限定されない。
実施例１ 抗体の反応性比較及び免疫沈降による細胞表面抗原の検出
ＭＫＮ４５の皮下移植による腫瘍細胞の調製
ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５（日本免疫生物研究所）を牛胎児血清（シグマ社）を１０％含む液体培地ｅＲＤＦ（ギブコ社）で培養し、細胞を回収して５週齢前後のＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス（日本クレア）の背部皮下に移植した。形成された皮下腫瘍組織を摘出し、時田らの方法［癌の臨床、３２，１８０３（１９８６）］に従って組織からの細胞の単離を行った。組織をゴム板の上に敷いたテフロンシートにのせ、カミソリで叩いて細切し、ナイロンメッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社 セルストレーナー）を通して結合組織を除去した。濾液である細胞懸濁液を１５００回転５分間遠心し（トミー卓上遠心機 ＬＣ０６−ＳＰ）、浮遊した脂肪と懸濁した壊死部分を捨て、沈査を繰り返し洗浄した。
フローサイトメトリーによるＧＡＨ抗体の反応性 比較
ＭＫＮ４５の培養細胞、あるいはＭＫＮ４５の皮下移植により形成した固形腫瘍細胞（以下「腫瘍細胞」という）に、フルオレッセインイソチアネート（ＦＩＴＣ：シグマ社）で標識した、ＥＰ公開第５２０４９９号公報及びＥＰ公開第１１７４１２６号公報に記載のＧＡＨ抗体を２０μｇ／ｍｌの濃度で４℃１時間反応させ、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。プロピジウムアイオダイド（ＰＩ：シグマ社）を含むＰＢＳ中でフローサイトメータ（ＦＡＣＳｃａｎ：ベクトンディッキンソン社）を用いて解析した。ＰＩ陽性細胞すなわち死細胞はゲーティンク操作により解析の対象から除外した。ＦＩＴＣ蛍光強度を表す指標であるＦＬ１の平均チャンネル数を求めて、ＭＫＮ４５の培養細胞と腫瘍細胞の比較を行った。
結果を第１図に示す。縦軸は平均チャンネル数から、抗体を含まない場合の値をバックグラウンド値（ＢＧ）として差し引いた値を示す。Ｅは１０のべき乗を示す。
ＧＡＨ抗体は、ＭＫＮ４５の培養細胞に比べて、腫瘍細胞に対して約１８倍という、より強い反応性を示した。
この結果より、培養細胞と比較して、ＧＡＨ抗体は腫瘍細胞に対してより高い反応性を有することが明らかとなった。
細胞の表面のビオチン標識及び可溶化上清の調製
ＭＫＮ４５の培養細胞、あるいは腫瘍細胞に、ビオチン試薬（ｓｕｌｆｏＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ：ＰＩＥＲＣＥ社）１ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液を加え、４℃で３０分振とうしながらインキュベートした。その後５ｍＭグリシン（ナカライ社）を含むＰＢＳ、ついでＰＢＳで洗浄した。細胞のペレットに１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス（シグマ社）塩酸緩衝液ＰＨ７．５、（ＴＮＥバッファー）に１％ＮＰ４０、アプロチニン（シグマ社）、メシル酸ナファモスタット（鳥居薬品社）を含む溶液を加えて撹拌、超音波処理し、氷上１時間放置後、１５０００ｒｐｍ１０分間（トミー小型冷却遠心機ＭＲＸ−１５０）遠心して、上清を細胞の可溶化上清とした。
免疫沈降及びｂｉｏｔｉｎ標識バンドの検出
ＰＢＳで平衡化したプロテインＡセファロースＣＬ４Ｂ（ファルマシア社）にＧＡＨ抗体、又は健常人血清由来ヒト免疫グロブリン（ヒトＩｇｓ）（スキャンティボディズラボラトリー社から入手したヒト血清からプロテインＡカラム（レプリジェン社）を用いて精製した）溶液を加えて抗体を樹脂に結合させたものをＰＢＳで洗浄し、細胞の可溶化上清を添加して４℃一晩振とうしながらインキュベートした。遠心して上清を除去した後、樹脂を０．１％ＮＰ４０（ナカライ社）を含むＴＮＥバッファーで３回洗浄し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用サンプルバッファーで抽出してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（グラジエントゲル４から１２％）を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社）にウエスタンブロッティングを行った。タンパク質が転写された膜を、０．１％ゼラチン（ナカライ社）及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ナカライ社）を含むＰＢＳで室温１時間インキュベートした後、ｂｉｏｔｉｎ標識タンパク質を検出するためにベクトステインエライトＡＢＣ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥｌｉｔｅＡＢＣ：ベクター社）で室温１時間反応させた。発色にはコニカイムノステインＨＲＰ１０００（コニカ社）を用いた。レーン１に用いたサンプルは腫瘍細胞のＧＡＨ抗体による免疫沈降物、レーン２に用いたサンプルは培養細胞のＧＡＨ抗体による免疫沈降物、レーン３に用いたサンプルは腫瘍細胞のヒトＩｇｓによる免疫沈降物、レーン４に用いたサンプルは培養細胞のヒトＩｇｓによる免疫沈降物である。
レーン１の腫瘍細胞のＧＡＨ抗体による免疫沈降物に対して、ＧＡＨ抗体に特異的なバンドが分子量約２００ｋｄの位置に検出された。レーン２の培養細胞のＧＡＨ抗体による免疫沈降物に対しては、相当する位置にバンドはほとんど検出されなかった。
この結果より、ＧＡＨ抗体は、約２００ｋｄのタンパク質に反応性を有することが明らかになった。さらに、この約２００ｋｄのタンパク質は、腫瘍細胞表面に露出していることが示された。
２００ｋｄタンパク質のアミノ酸配列解析
免疫沈降で特異的に検出された２００ｋｄタンパク質をポリアクリルアミドゲルから切り出し、リジルエンドペプチダーゼ（和光純薬社）処理後逆相クロマトグラフィーで得られたピークについてアミノ酸配列解析を行った（配列表の配列番号９から１６）。
これらの配列を元にホモロジー検索を行ったところ、ヒト非筋肉型ミオシンＡ鎖（ｎｍＭＨＣＡ）とこの２００ｋｄのタンパク質は一致した（配列表の配列番号１７）。
この結果より、２００ｋｄのタンパク質は、ｎｍＭＨＣＡであることが明らかになった。
抗非筋肉型ミオシン重鎖（ｎｍＭＨＣ）抗体による 検出
上述の免疫沈降サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングを行い、０．１％ゼラチン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで室温１時間インキュベートした後、抗ｎｍＭＨＣウサギポリクローナル抗体（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）溶液中で室温１時間反応さた。抗体の陰性コントロールとして、ノーマルウサギ免疫グロブリン（ノーマルウサギＩｇＧ：バイオジェネシス社）を用いた。２次抗体として抗ウサギＩｇＧのペルオキシダーゼ標識体（カペル社）の溶液中で反応した後、コニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色させた。レーン１、２及び３に用いたサンプルは腫瘍細胞のＧＡＨ抗体による免疫沈降物であり、レーン４、５及び６に用いたサンプルは培養細胞のＧＡＨ抗体による免疫沈降物であった。レーン１及び４はＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅＡＢＣで検出、レーン２及び５は抗ｎｍＭＨＣ抗体で検出、レーン３及び６はノーマルウサギＩｇＧで検出したものである。
レーン１、２及び５でバンドが検出された。
この結果より、培養細胞及び腫瘍細胞いずれにおいてもＧＡＨ抗体により約２００ｋｄのタンパク質すなわちｎｍＭＨＣＡが認識され、腫瘍細胞では、ｎｍＭＨＣＡが細胞表面に存在することが明らかとなった。
実施例２ ｎｍＭＨＣＡ強制発現株を用いた検証
ｎｍＭＨＣＡ発現ベクターの作製
ｎｍＭＨＣＡ遺伝子であるＨＡ１．０とＨＡＬＥＳ（Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ａｄｅｌｓｔｅｉｎより提供）を、制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）にて切断した。一方、ｎｍＭＨＣＡ遺伝子を組込む側のほ乳類細胞遺伝子発現用プラスミドベクターｐＥＦ１／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）も同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断を行い、次いでＢＡＰにて脱リン酸化処理を行った。ｎｍＭＨＣＡ遺伝子断片と、ｐＥＦ１／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢ断片をライゲーションし、トランスフォーメーションして、ＨＡ１．０を組み込んだもの（ｐＥＦ１Ｂ−ＨＡ１．０と名付けた）、ＨＡＬＥＳを組み込んだもの（ｐＥＦ１Ｂ−ＨＡＬＥＳと名付けた）を得た。ｎｍＭＨＣＡ全長ほ乳類細胞発現用ベクターの調製は、ｐＥＦ１Ｂ−ＨＡ１．０を鋳型として、配列表の配列番号１８のプライマーと配列表の配列番号１９のプライマーを用い、ＰＣＲ反応（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ クロンテック社）を行った。このＰＣＲ産物をＫｐｎＩ−ＨＡ１．０−ＳｐｅＩと名付けた。一方で、ｐＥＦ１Ｂ−ＨＡＬＥＳを制限酵素ＫｐｎＩとＳｐｅＩ（いずれもタカラバイオ社）にて切断した。ＫｐｎＩ−ＨＡ１．０−ＳｐｅＩをｐＥＦ１Ｂ−ＨＡＬＥＳ制限酵素切断物に挿入し、次いで大腸菌の形質転換を行った。得られたクローンのプラスミドのマッピングを行って、目的であるｎｍＭＨＣＡ全長ほ乳類細胞発現用ベクターが作製されたことを確認した。
ＣＯＳ−７強制発現細胞株の作製
ほ乳類細胞遺伝子発現用プラスミドベクターｐＥＦ１／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）にｎｍＭＨＣＡ遺伝子を組み込み、培養したアフリカミドリザル腎臓由来細胞株ＣＯＳ−７細胞（東北大学加齢研究所医用細胞資源センターより入手）に、ポリフェクト（ＰｏｌｙＦｅｃｔ：キアゲン社）を用いたリポフェクション法により遺伝子導入を行った。遺伝子導入した細胞を３７℃、５％ ＣＯ_２存在下にて培養し、４８時間後に一過性発現細胞株として免疫沈降の実験に用いた。安定発現株は、遺伝子導入後、３７℃ ５％ ＣＯ_２存在下にて培養し、ジェネテシンＧ４１８（シグマ社）により安定発現株の薬剤選択を行うことで樹立した。また、ｎｍＭＨＣＡ安定発現株を用いた試験を行う際に、遺伝子導入操作、薬剤選択操作による細胞株への影響を考慮するため、ネガティブコントロールとしてＣＯＳ−７のｍｏｃｋ細胞を作製した。ｍｏｃｋ細胞は、ｎｍＭＨＣＡ遺伝子を組み込んだ際に使用したプラスミドの、プラスミド部分（ｐＥＦ１／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ）のみを用いて、ＣＯＳ−７細胞にリポフェクション法により遺伝子導入し、薬剤選択を行うことで作製した。
ＨＣＴ−１５安定発現株の作製
ＣＯＳ−７と同様な方法で、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ−１５細胞（東北大学加齢研究所医用細胞資源センターより入手）を用いたｎｍＭＨＣＡ遺伝子導入安定発現株の作製を行った。ＨＣＴ−１５においてもｍｏｃｋ細胞を作製した。
ＧＡＨ抗体による免疫沈降
ＣＯＳ−７及びＨＣＴ−１５のｎｍＭＨＣＡ一過性発現細胞と非導入細胞の各々をスクレイパーで回収し、０．５ｍｌの可溶化バッファーを加えて超音波処理（出力２、頻度５０％）を５秒間行い、細胞を破砕した。氷上１時間放置した後、マイクロチューブ遠心機にて１５０００ｒｐｍ １０分遠心分離し可溶化上清を得た。得られた上清に含まれるタンパク質濃度をそろえるため、実施例１と同様にＢＣＡタンパク質解析キット（ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ：ピアース社）を用いてタンパク質定量を行った。免疫沈降についても実施例１と同様に行い、免疫沈降物及び、比較のため可溶化上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度６％）を行い、ウエスタンブロッティングを行った。膜をブロッキングバッファー（０．１％ゼラチン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、０．０５％ ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ（和光純薬社））中で室温１時間インキュベートし、抗ｎｍＭＨＣ抗体をブロッキングバッファーで１００倍に希釈して室温１時間反応させた。反応後ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で室温５分間ずつ３回洗浄し、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ標識抗体をＨＲＰ標識体希釈バッファー（０．１％ゼラチンを含むＰＢＳ）で１５００倍に希釈したものを室温１時間反応させた。反応後ＰＢＳＴで室温５分間ずつ３回洗浄し、発光基質ＥＣＬ（アマシャム社）を用いてバンドを検出した。レーン１、２及び３に用いたサンプルはｎｍＭＨＣＡ導入細胞で、レーン１は可溶化上清、レーン２はＧＡＨ抗体による免疫沈降物、レーン３はヒトＩｇｓによる免疫沈降物である。またレーン４、５及び６に用いたサンプルはｍｏｃｋ細胞で、レーン４は可溶化上清、レーン５はＧＡＨ抗体による免疫沈降物、レーン６はヒトＩｇｓによる免疫沈降物である。
レーン１及び２において約２００Ｋｄのバンドが確認された。
この結果より、ｎｍＭＨＣＡ一過性発現株のみにおいて、ＧＡＨ抗体特異的にｎｍＭＨＣＡが免疫沈降されることが明らかになった。
ウエスタンブロッティングによるｎｍＭＨＣＡ安定発 現株取得確認
ＣＯＳ−７、ＨＣＴ−１５共に薬剤選択後の安定発現株及びｍｏｃｋを、スクレイパーにより回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加えて超音波処理行い、細胞を破砕した。調製したサンプルのタンパク質濃度をＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔにて定量し、これについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度６％）、ウエスタンブロット、及び抗ｎｍＭＨＣ抗体による検出をおこなった。
ＣＯＳ−７のｍｏｃｋ細胞ではｎｍＭＨＣＡが検出限界以下であるのに対し、ｎｍＭＨＣＡ安定導入株ＦＬ１１ではｎｍＭＨＣＡ分子量相当の約２００ｋｄのバンドが確認された。また、ＨＣＴ−１５についても、ｍｏｃｋ細胞ではｎｍＭＨＣＡが検出限界以下であるのに対し、ｎｍＭＨＣＡ安定発現株ＦＬ１及びＦＬ２においてｎｍＭＨＣＡが検出され、発現量はＦＬ１にくらべて高いことが示された。
ｎｍＭＨＣＡ発現細胞株を用いたヌードマウス移植癌細 胞切片の免疫染色
ＨＣＴ−１５の各種ｎｍＭＨＣＡ安定発現株をマトリゲル（ベクトンディッキンソン社）に懸濁し、ヌードマウス背部皮下に５ ｘ １０^６ｃｅｌｌｓ／ｓｐｏｔとなるよう２箇所ずつ移植した。腫瘍の生着性を確認した後摘出し、一部を１０％ホルマリン−ＰＢＳに浸して奈良病理研究所にてパラフィン切片の作製及びヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を行った。
切片はキシレン、エタノールを用いて脱パラフィンし、１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ６．０ ｂｕｆｆｅｒに浸してマイクロウェーブを照射し（６００Ｗ５分を３回）、３０分間室温放置して空冷した後５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳＡｚ溶液に１時間浸した。ビオチン標識Ｆ（ａｂ’）_２化ＧＡＨ抗体６６μｇ／ｍｌ、あるいはビオチン標識抗ｎｍＭＨＣ抗体１００μｇ／ｍｌと３７℃で２時間インキュベートし、続いてストレプトアビジンＰｅｒＣＰ（ベクトンディッキンソン社）溶液２．５倍希釈液と氷冷遮光下で３０分反応させた。反応終了後、オリンパス落射蛍光顕微鏡ＢＸ−５０を用いて各切片の同視野におけるＰｅｒＣＰの赤色蛍光を観察した。
結果を第２図に示す。ＧＡＨ抗体は、対照として用いたｍｏｃｋ細胞の組織切片（Ｍｏｃｋ）に比べ、ｎｍＭＨＣＡ安定発現株の組織切片（ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ７）に対して、強い赤色蛍光を示した。さらに、抗ｎｍＭＨＣ抗体は、ｎｍＭＨＣＡ安定発現株の組織切片のみに明確な赤色蛍光が認められた。また、抗ｎｍＭＨＣ抗体の赤色蛍光像は、ＧＡＨ抗体の赤色蛍光像と類似していた。
この結果より、ｎｍＭＨＣＡの導入により組織切片でのＧＡＨの反応性が上昇することが示された。
ｎｍＭＨＣＡ安定発現細胞株を用いたＧＡＨ抗体生細胞反応 性
ｎｍＭＨＣＡ安定発現株をマトリゲルに懸濁し、ヌードマウス背部皮下に５ ｘ １０^６ｃｅｌｌｓ／ｓｐｏｔとなるよう２箇所ずつ移植した。腫瘍の生着性を確認した後摘出し、細切して腫瘍細胞を採取した。ＦＩＴＣ標識ＧＡＨ抗体、あるいはＦＩＴＣ標識ヒトイムノグロブリンをヒト血清（スキャンティボディズラボラトリーズ社）で３３μｇ／ｍｌとなるよう希釈した。またＦＩＴＣ標識抗ｎｍＭＨＣ抗体、あるいはＦＩＴＣ標識ウサギＩｇＧをヒト血清で５０μｇ／ｍｌとなるよう希釈した。これらの抗体液を各腫瘍細胞と良く混和して遮光氷冷下で１時間反応させた。反応終了後０．１％ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅを含むＰＢＳにて細胞を洗浄し、ベクトンディッキンソンＢＤ−ＬＳＲを用いて以下の通りフローサイトメトリー解析を行った。細胞を５μｇ／ｍｌＰＩを含むＦＡＣＳｆｌｏｗ（フローサイトメーター付属バッファー）溶液に懸濁し、実施例１と同様にＰＩ陽性細胞すなわち死細胞はゲーティング操作により解析の対象から除外し、生細胞集団における細胞１個当たりのＦＩＴＣ蛍光強度の平均値を求めた。同条件下で測定した結合ＦＩＴＣ分子数既知の標準蛍光ビーズ（フローサイトメトリースタンダーズ社）の蛍光強度の平均値より検量線を作成し、各試料の蛍光強度平均値を結合ＦＩＴＣ量に換算した。さらに得られた値を各ＦＩＴＣ標識抗体のＦ／Ｐ値で除して抗体結合数とした。
結果を第３図及び第４図に示す。ＣＯＳ−７及びＨＣＴ−１５共にｎｍＭＨＣＡ安定発現株においてｍｏｃｋ細胞株に比べてＧＡＨ反応性が増加していることが示された。
この結果より、ｎｍＭＨＣＡを導入することにより、移植腫瘍細胞の表面に対するＧＡＨの反応性が上昇することが示された。
実施例３ 抗ｎｍＭＨＣＡペプチド抗体による細胞表面反応性の確認
ｎｍＭＨＣＡのペプチド部分配列である配列表の配列番号２０、２１及び２２のペプチドを合成し、Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）に結合させてウサギに免疫し、各ペプチドに対するポリクローナル抗体を作成した。抗体は各ペプチドをＣＮＢｒセファロース（アマシャムバイオサイエンス社）に固定化したアフィニティカラムを用いて精製した。精製した各ポリクローナル抗体及びコントロール用のノーマルウサギ免疫グロブリン（ノーマルウサギＩｇＧ：バイオジェネシス社）をＦＩＴＣで標識し、各抗体を５０μｇ／ｍｌに調製し、ＭＫＮ４５の培養細胞及びＭＫＮ４５の皮下移植により形成した腫瘍細胞に４℃１時間反応させた。ＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＩを含むＰＢＳ中でフローサイトメータ（ＬＳＲ：ベクトンディッキンソン社）を用いて解析した。ＰＩ陽性細胞すなわち死細胞はゲーティンク操作により解析の対象から除外した。ＦＩＴＣ蛍光強度を表す指標であるＦＬ１の平均チャンネル数（ｍｅａｎ値）を求めて各抗体間で比較した。
結果を第５図に示す。Ａ、Ｂ及びＣは各抗ｎｍＭＨＣＡペプチド抗体を示し、Ｉｇはコントロール用のノーマルウサギ免疫グロブリンを示す。縦軸は、平均チャンネル数（ｍｅａｎ値）から細胞のみの場合のバックグラウンド値（ＢＧ）を差し引いた値を示す。図中の凡例の「培養」はＭＫＮ４５培養細胞、「移植」はＭＫＮ４５の皮下移植により形成した腫瘍細胞を示す。
それぞれの抗体でＭＫＮ４５培養細胞に対してＭＫＮ４５の皮下移植により形成した腫瘍細胞でどの程度反応が上昇しているか、コントロール用のノーマルウサギ免疫グロブリンの反応をバックグラウンド値として差し引いて計算したところ、抗体Ａ及び抗体Ｂで３倍以上、また、抗体Ｃでは１０倍以上の上昇が認められた。
この結果より、ｎｍＭＨＣＡペプチドのうち、配列表の配列番号２０、２１及び２２で示した部分配列は、細胞表面に局在していることが明らかとなった。さらに、ＭＫＮ４５の皮下移植により形成した腫瘍細胞では、ＭＫＮ４５培養細胞に比べて、配列表の配列番号２０、２１及び２２で示した部分配列の存在量が増加していることが明らかとなった。
実施例４ 抗原量と抗腫瘍活性の確認
癌細胞培養株
ヒト大腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２、ＤＬＤ−１及びＳＷ６２０はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手した。ヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒ−Ｔｃ及びヒト食道癌細胞株ＴＥ−８は東北大学加齢研究所医用細胞資源センターより入手した。ヒト胃癌細胞株ＨＳＣ−３，ＭＫＮ−１，ＭＫＮ−４５及びヒト結腸癌細胞株ＳＷ８３７は免疫生物研究所から入手した。Ｂ３７細胞株はヒト胃癌より、公知の方法により樹立した。
癌細胞表面の抗原量測定
各種癌細胞株を実施例１の記載の方法に従って、皮下腫瘍移植由来癌細胞を調整した。Ｆ（ａｂ’）_２化ＧＡＨ抗体ＦＩＴＣで標識し、Ｆ（ａｂ’）_２化ＧＡＨ抗体の濃度を５０μｇ／ｍｌとし氷上で１時間反応すること以外は実施例１の方法に従って、各種癌細胞に対する反応量をフローサイトメトリーで検出した。さらに、蛍光検出量を癌細胞あたりの抗体反応量（抗原量）として表わす為に、ＦＩＴＣ含量の分かっている蛍光ラテックス（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ）を標準として用い定量化した。
イムノリポソーム及びリポソームの作製
Ｆ（ａｂ’）_２化ＧＡＨ抗体を用い、ＥＰ公開第１１７４１２６号公報の方法に従って抗体結合リポソーム（イムノリポソーム）を作製した。すなわちジパルミトイルフォスファチジルコリン／コレステロール／ε−マレイミドカプロイルジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン（１８／１０／０．５ モル比）からなる脂質混合物、分子量５０００のポリエチレングリコールを２本有する同公報記載のポリエチレングリコール誘導体（ＰＥＧ）及びＦ（ａｂ’）_２化ＧＡＨ抗体を用いドキソルビシン（ＤＸＲ）封入イムノリポソームを形成した。得られたイムノリポソームは粒径が１２５ｎｍから１６０ｎｍであり、Ｆ（ａｂ’）_２化ＧＡＨ抗体／ＰＥＧ／ＤＸＲ／脂質の量比は０．２：０．８：１：１０（重量比）であった。
抗原量とｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の相関
各種癌細胞をヌードマウス皮下に移植し、腫瘍塊を形成した。腫瘍塊を数ｍｍ^３に細切し、別途用意したヌードマウスの腎臓の皮膜下に移植（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４５：４９６３−４９６９）した。翌日よりＤＸＲ、イムノリポソームを（ＤＸＲ換算量として３ｍｇ／ｋｇ）尾静脈より１週間おきに３回投与した。２２日目に解剖し、摘出腫瘍の重量を測定した。陰性対照には生理食塩水投与群を用いた。効果の指標として腫瘍増殖抑制率を以下の式によって算出した。
腫瘍増殖抑制率（％）＝
（１−薬剤処置群の平均腫瘍重量／陰性対照群の平均腫瘍重量）ｘ１００
結果を第６図に示す。縦軸は腫瘍増殖抑制率（％）を横軸は癌細胞あたりの抗原量を示す。図中、各数字は下記癌細胞株を表わす。１，Ｃａｃｏ−２；２，ＤＬＤ−１；３，ＨＳＣ−３；４，ＳＷ６２０；５，ＳＷ８３７；６，ＭＫＮ−１；７，Ｂ−３７；８，ＭＫＮ−４５；９，ＴＥ−８；１０，ＷｉＤｒ−Ｔｃ．
その結果、癌細胞あたりの抗原量が１０^５／細胞程度までの癌細胞に対しては、抗原量が増加するにしたがい、腫瘍増殖抑制率が向上し、それ以上の抗原量を示す癌細胞に対しては、抗腫瘍効果はほぼプラトーに達していることが示された。
実施例５ Ｆ（ａｂ’）_２化ＧＡＨ抗体の結合活性試験
ＭＫＮ４５固定化プレートの調製
培養液の入ったフラスコにＭＫＮ４５細胞株を接種し、ＣＯ_２インキュベーター内で培養を行う。フラスコのプレート面が細胞で満たされた状態となったら、培養液を取り除き、トリプシン溶液（トリプシン１：２５０（ディフコ社）２．５ｇ及びＮａ_２ＥＤＴＡ（シグマ社）０．２ｇをＰＢＳで溶かし、１０００ｍＬとする）を添加して細胞を剥離させ、遠心管にとる。遠心後、上清を除き、新鮮な培養液に懸濁する。細胞数を計測し、約４×１０^５個／ｍＬとなるように培養液に懸濁し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、２日間培養する。ウェルの培養液を除き、ＰＢＳを各ウェルに２００μＬずつ加えて、液を除く。次に、パラホルムアルデヒド溶液を各ウェルに１５０μＬずつ加えて、室温で１時間静置後、ウェルのパラホルムアルデヒド溶液を除く。ＰＢＳを各ウェルに少しずつ加えて、液を除く操作を５回行う。ＢＳＡ溶液（シグマ社）を各ウェルに２００μＬずつ加え、４℃で保存する。
標準溶液及び試料溶液の調製
Ｆ（ａｂ’）_２化ＧＡＨ抗体を１×１０^６単位／ｍＬ含む標準原液に、ウシ血清アルブミン（シグマ社）１ｇをＰＢＳで希釈した希釈液を加えて、標準溶液１から６を調製する。また、試験溶液のタンパク質含量に従い、上述の希釈液を用いて標準溶液と同等のタンパク質濃度の試料溶液１から６を調製する。

操作方法
プレートのウェルの液を除き、ＰＢＳ２００μＬを各ウェルに加え、液を除く操作を５回行う。標準溶液及び試料溶液を１ウェルあたり５０μＬずつ添加し、３７℃で２時間静置後、液を除く。ＰＢＳ２００μＬを各ウェルに加え、液を除く操作を５回行う。
次に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトκ鎖抗体溶液（カペル社）５０μＬを、各ウェルに加えて３７℃で１時間静置する。液を除き、洗浄液２００μＬを各ウェルに加えて、３７℃で５から１０分間静置後、液を除く。更に、洗浄液２００μＬを各ウェルに加えて液を除く操作を５回繰り返す。
ο−フェニレンジアミン溶液（シグマ社）１００μＬを、各ウェルに加え、遮光して室温で１から２分間静置する。停止液１００μＬを各ウェルに加え、穏やかに振り混ぜる。
マイクロプレートリーダーを用いて波長４９０ｎｍ及び６５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度Ａ１及びＡ２を測定し、（Ａ１−Ａ２）を求める。
横軸に標準溶液の濃度、縦軸にその吸光度（Ａ１−Ａ２）をとり、検量線を求める。各試料溶液の吸光度から、各試料溶液１ｍＬ当たりの力価（単位／ｍＬ）を求め、本品１ｍｇ当たりの力価（単位／ｍｇ）を算出する。
その結果、結合活性の力価が０．８から１．２×１０^６単位／ｍｇのＦ（ａｂ’）_２化ＧＡＨ抗体を用いることが有用であることが明らかになった。

本発明によれば、固形腫瘍において細胞表面に露出する部分を含む抗原の提供が可能である。
なお、本出願は、日本特許出願 特願２００２−２９１９５３号を優先権主張して出願されたものであり、その全体が引用により援用される。

Claims (7)

1. 非筋肉型ミオシン重鎖タイプＡのＮ末端側から６００残基以降１９６０残基までの部分若しくはその変異体に対する抗体［ただし、重鎖の超可変領域に配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体、及び癌との反応性を損なわない範囲で当該抗体の一部のアミノ酸が置換、挿入、削除又は追加された抗体を除く。］又はそのＦ（ａｂ’）_２を含有する抗癌剤。
2. 配列番号２０、２１、又は２２を認識する抗体［ただし、重鎖の超可変領域に配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体、及び癌との反応性を損なわない範囲で当該抗体の一部のアミノ酸が置換、挿入、削除又は追加された抗体を除く。］又はそのＦ（ａｂ’） _２ を含有する請求項１記載の抗癌剤。
3. 胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌に対する請求項１又は２記載の抗癌剤。
4. 非筋肉型ミオシン重鎖タイプＡのＮ末端側から６００残基以降１９６０残基までの部分若しくはその変異体に対する抗体［ただし、重鎖の超可変領域に配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体、及び癌との反応性を損なわない範囲で当該抗体の一部のアミノ酸が置換、挿入、削除又は追加された抗体を除く。］又はそのＦ（ａｂ’）_２に、抗腫瘍剤及び／又は標識剤が封入されたリポソームを結合した癌ターゲッティング療法剤。
5. 配列番号２０、２１、又は２２を認識する抗体［ただし、重鎖の超可変領域に配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体、及び癌との反応性を損なわない範囲で当該抗体の一部のアミノ酸が置換、挿入、削除又は追加された抗体を除く。］又はそのＦ（ａｂ’） _２ に、抗腫瘍剤及び／又は標識剤が封入されたリポソームを結合した、請求項４記載の癌ターゲッティング療法剤。
6. 胃癌、乳癌、大腸癌又は食道癌をターゲットとする請求項４又は５記載の癌ターゲッティング療法剤。
7. リポソームに抗腫瘍剤が封入されている請求項４又は５記載の癌ターゲッティング療法剤。

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