JP4287147B2 - 小細胞肺癌(sclc)の検出および治療のためのモノクローナル抗体および細胞表面抗原 - Google Patents
小細胞肺癌(sclc)の検出および治療のためのモノクローナル抗体および細胞表面抗原 Download PDFInfo
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Description
発明の分野
本発明は、一般的に抗体に、そしてより具体的には、特定の癌細胞および種に特異性を有するモノクローナル抗体(MoAb)に関すると共に、癌、特に小細胞肺癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、画像化し、そして/または治療する方法に関する。本発明はさらに、本発明のMoAbに認識される小細胞肺癌細胞表面上のエピトープを含んでなる抗原に関する。
【0002】
発明の背景
肺癌の攻撃的な型である、小細胞肺癌(SCLC)は、原発性肺腫瘍の約20%に相当し、そして肺癌で最も悪性の表現型を示す(Livingston, R.B., 1997, “肺癌の様式併用療法”, Clin Cancer Res., 3:2638−47およびGazdar, A.F., 1994, “ヒト肺癌の分子的および細胞的基礎”, Anticancer Res., 13:261−68に概説される)。SCLCと診断される患者の3分の2が、50から70歳の間であり、非常に男性優勢であるが、差は減少しつつある。SCLCに関連付けられる遺伝的素因の証拠はない。
【0003】
SCLCの主なリスク要因は喫煙である。SCLC患者の95%以上が現在喫煙者であるか、過去に喫煙者であり、1日あたりに吸うタバコの本数および喫煙期間両方に直接の相関がある。電離放射線および職業性発癌剤が、SCLCのさらなる既知のリスク要因である。
【0004】
SCLCの自然史は、疾患の初期および広範囲の蔓延において、他の種類の肺癌と異なる。SCLC患者の70から80%が、提示時に、潜在性またはそうでない汎発を有する。さらに、SCLCは、迅速な増殖速度および肺癌種すべての中で最速の倍加時間を有する(25−160日)。診断時からの生存時間中央値は、広範囲または限定疾患の患者で、それぞれ、約1.5から3ヶ月である。
【0005】
SCLCは、通常、中央に位置する気管気管支気道から生じ、そして縦隔に侵襲する、巨大な迅速に発展する病変として提示される(Stahel, R.A.ら, 1989, “小細胞肺癌における病期および予後要因:コンセンサスリポート”, Lung Cancer, 5:119−26)。典型的には、患者は、咳または呼吸困難、喘鳴、および/または胸痛を示す。体重減少、疲労および食欲不振は、患者の3分の1までに生じる。診断時、SCLC患者の3分の2は、骨(30%)、肝臓(25%)、骨髄(20%)および中枢神経系(10%)を含む、1又はそれより多くの臨床的に検出可能な遠距離の転移を有する。スクリーニング設定では、X線の感度は45−50%の範囲であり、痰細胞診断は25−30%の範囲であり、そしてその併用では、陽性診断の約60−70%の特異性に達する。
【0006】
SCLCは、神経内分泌表現型によって特徴付けられる肺癌の型である。これは、細胞質において、超微細構造的に可視である神経分泌顆粒の存在によって立証される。これらの顆粒は、ADH、ガストリン放出ペプチドおよびニューロメディンなどのペプチドホルモンを含有する。神経細胞接着分子が細胞表面に見られる。他の細胞表面抗原はまた、肺癌の他の型と関連付けられている。特異性および感度が低いため、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)、クレアチニンキナーゼBB、または神経内分泌マーカーのような腫瘍マーカーは、SCLC疾患の診断局面には有用でない。上述の腫瘍マーカーは、SCLC診断時、症例の約60−65%で上昇しており、そして腫瘍容積と相関する。「再発性診断予測」、すなわち腫瘍進行および疾患と腫瘍マーカーレベルを相関させる試みの有用性は、救済治療が実質的に存在しないため、最低限でしかない。
【0007】
大部分のSCLC患者は、手術の候補者でないため、SCLCの標準的治療には、病期I−IVにおける化学療法および放射療法が含まれる。SCLCは、初期化学療法に非常に感受性である。この初期反応性にも関わらず、残渣細胞は、化学耐性変異体の再出現のため、大部分の患者で致死的な再発を与える。その結果、広範囲のSCLC疾患の患者では、治癒率が非常に低いため、治療は対症的とみなさなければならない。再発した進行性疾患の患者には、化学療法は、臨床的有効性をめったに示さないし、また持続する反応も提供しない。
【0008】
100年以上前、Paul Ehrlichは、癌細胞に毒素を搬送する「魔法の弾丸」としての抗体の使用を提唱した。それ以来、標的化免疫療法の可能性が、多数の研究者の関心を引き付けてきた。1975年、モノクローナル抗体(MoAb)を産生する技術の開発(G. KohlerおよびC. Milstein, 1975, Nature, 256:495−497)に伴い、抗体療法の成功が迫っていると思われた。しかし、モノクローナル抗体を用いた初期試験は、癌療法における使用に対する重大な障害を明らかにした。例えば、ネズミモノクローナル抗体の免疫拒絶が、抗体療法を有効でそして成功する療法剤とする際の主なハードルであった。さらに、初期臨床経験中に、失望させられることに、細胞傷害性が低レベルであると報告された(L.W. Kwakら, 1995, モノクローナル抗体の臨床適用:Biologic Therapy of Cancer中, V.T. DeVita, Jr., S. HellmanおよびS.A. Rosenberg監修, 第2版, JB Lippincott Co., ペンシルバニア州フィラデルフィア, pp.553−565)。
【0009】
現在までの経験からは、腫瘍に実際に到達するのは、注射した抗体のわずかな割合でしかないことが示唆される(R.A. Millerら, 1981, Lancet, ii:226−230)。標的分子への抗体結合を最大にするため、癌療法の理想的な抗体は、抗原に高い親和性を有するべきである(A. Hekmanら, 1991, Cancer Immunol. Immunother., 32:364−372)。さらに、有効な非コンジュゲート化抗体は、宿主の免疫系エフェクター機構と相乗して働くべきである。抗体依存細胞傷害(ADCC)および補体依存細胞溶解(T.A. Waldmanら, 1994, Ann. Oncol., 5 Suppl. 1:13−17)などのエフェクター機構を誘導する療法抗体は、毒素または放射性核種などの潜在的に有害なコンジュゲートを使用することなく、安全でそして有用な標的化癌療法を提供する可能性を有する。
【0010】
ヒト癌細胞上の抗原を認識するモノクローナル抗体はほぼすべて、同一抗原を発現する正常ヒト細胞にも結合する(J.G. Jurcicら, 1996, Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers Annual, H.M. Pinedo, D.L. LongoおよびB.A. Chabner監修, pp.168−188)。この交差反応性は、潜在的に、療法的有用性を危うくし、そして毒性の問題を起こすため、腫瘍細胞にユニークな抗原性標的を定義することに引き続き関心が持たれている。
【0011】
ヒトSCLCは、放射標識モノクローナル抗体を用いた免疫療法に適した標的とみなされている(J. ZeuthenおよびA.J. Vangsted, 1993, Acta Oncologica, 32:845−51;Y. Olabiranら, 1994, Br. J. Cancer, 69:247−52;A. Smithら, 1991, Oncology, 64:263−6;P.L. Beaumierら, 1991, Cancer Res., 51:676−81;R.A. Stahel, 1989, Chest, 96:27S−29S;およびM. Hosonoら, 1994, J. Nuclear Med., 35:296−300)。しかし、現在までに単離されているSCLC特異的MoAbはまた、1又はそれより多くの神経内分泌組織、関連しない細胞、または正常免疫細胞に対しても反応する。例には、ニューロン細胞接着分子(NCAM)、ポリシアル酸、クラスターw4抗原(CD24)(D. Jacksonら, 1992, Cancer Res., 52:5264−70)、シアロ糖タンパク質抗原sGP90−135、ガングリオシドGD2、およびガングリオシド、フコシル−GM1(FucGM1)(J. ZeuthenおよびA.J. Vangsted, 1993, Acta Oncologica, 32:845−51)に結合するMoAbが含まれる。NCAM(CD56)に特異的なMoAb(N901)は、SCLC腫瘍および細胞株と共に、心筋、ナチュラルキラー(NK)細胞、および末梢神経に結合すると報告された。
【0012】
癌免疫療法の標的の選択には、癌および正常組織上の腫瘍関連抗原の組織分布を理解することが必須である。癌抗原の大部分は、正常細胞に由来し、そして発現される自己抗原である。しばしば、癌抗原は、正常抗原と同一であるが、より高いレベルで発現されるか、または自己抗原と区別するには不十分な、無視できる突然変異を与えられている。悪性細胞が免疫系から逃れる機構の1つは、正常細胞対応物と似ており、その結果、個体の免疫監視系による悪性細胞の認知度が低くなることである。
【0013】
ユニークな癌抗原の発見を導く過程は、長く、冗長で、そして複雑である。スクリーニング法は、癌または腫瘍細胞および正常組織両方で発現される抗原から、徹底的に整理することを含む。こうした抗原の発見に用いるプローブは、腫瘍抗原の免疫原性が基本的に低いため、有効性が限られている。さらに、癌患者由来の高力価の血清試料は、一般的にまれである。スクリーニングのためのこうしたプローブの利用は、しばしば、多数の人為的な結果の「同定」のため、または偽陽性ヒットのため、妨げられる。
【0014】
抗原の免疫原性、すなわち免疫反応を刺激する能力は多様である。別個の免疫原特性を持ついくつかの抗原が、抗原調製に同時に存在する場合、抗原優性が、抗原に対する免疫反応の強度を制御する。したがって、最も頑強な免疫反応は、抗原調製に見られる最強のエピトープに対して発展する。より弱い免疫原性の抗原は無視されるだろうし、または、より強く、そしてより優性のエピトープに対する免疫反応に重点が置かれるため、これらに対して誘発される免疫反応のレベルは無視できる程度であろう。したがって抗原調製(例えばワクチン)に含有される微量のエピトープは、より免疫原性のエピトープによってマスクされるであろう。優性エピトープを含有する抗原調製(癌細胞の細胞成分分画など)に存在する微量のエピトープのレパートリーに対する、識別力を持つMoAbを生成することは、長年、困難なままであった。
【0015】
しかし、上述の障害にもかかわらず、本発明は、SCLC細胞表面抗原と免疫反応性であり、そしていくつかのみを挙げると、免疫療法、診断、画像化、モニタリングおよびスクリーニング方法論に有用である、新規のそして特異的なモノクローナル抗体を提供する。本発明は、部分的に、緊密に関連する抗原、例えば類似の表現型を示す、正常細胞上または腫瘍細胞上の抗原の寛容化、その後のユニークな細胞表面抗原分子を有する、目的の腫瘍性細胞での免疫を伴う、差別的免疫技術を使用することによって、多数の非特異的抗体を生成する問題を解決した。この差別的/寛容化法は、B細胞を不死化細胞と融合させてハイブリドーマを生成する前に、B細胞の全プールから、望ましくない特異性を持つB細胞を除外することを可能にする。その結果、探し求める抗原特異性を持つハイブリドーマの頻度が、本発明にしたがって増幅され、そして全スクリーニング法が、非常に単純化される。
【0016】
発明の概要
小細胞肺癌(または癌)細胞上に存在する抗原分子のエピトープに特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその結合断片を提供するのが本発明の目的である。本発明にしたがって、モノクローナル抗体(具体的には、例えばMoAb51.2、109.12および37.14)は、還元条件下のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって測定されるように、約200キロダルトン(kDa)の分子量(MW)を有する一本鎖糖タンパク質抗原を検出し、そしてこれに結合する。さらに、MoAb37.14は、分子量が緊密に関連する2つのポリペプチド鎖を含んでなり、そして約35−50kDaの間の分子量を有する抗原と反応し、したがってSCLC抗原上の別のエピトープ部位と免疫反応性である能力が示される。さらに別のモノクローナル抗体(例えばMoAb26.1)は、SCLC表面抗原のコンホメーションエピトープを含んでなるようである、SCLC特異的分子に結合する。
【0017】
また、本発明にしたがって、抗SCLC抗体は、ヒト神経内分泌細胞株(例えば神経芽細胞腫)上に存在する抗原に、またはヒト多発性骨髄腫(MM)細胞(例えばRPMI 8226およびU266)上に存在する抗原に、または正常細胞(例えば正常肺細胞)上に存在する抗原に、いかなる認識可能な度合いでも結合しない。特に、SCLC細胞の表面分子上に存在する抗原性エピトープに高い特異性を有する、本発明の代表的なモノクローナル抗体は、MoAb IMM010.26.1(26.1)、IMM010.141.7(141.7)、IMM010.92.7(92.7)、IMM010.37.14(37.14)、IMM010.51.2(51.2)、IMM010.109.12(109.12)、IMM010.26.5(26.5)、IMM010.106.3(106.3)、IMM010.43.7(43.7)、IM010.142.1(142.1)、IMM010.37.26(37.26)およびIMM010.21.7(21.7)と、本明細書に定義される。
【0018】
本発明の別の目的は、本明細書に記載するモノクローナル抗体、特に、2000年8月10日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA., 20110−2209に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2360号および第PTA−2357号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体(それぞれ51.2および109.12)が結合するのと同一のSCLC上の抗原決定基に結合可能な抗体に関し、そして本明細書に記載するモノクローナル抗体、特に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ATCC寄託番号第PTA−2360号および第PTA−2357号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体(それぞれMoAb51.2および109.12)が結合するのと同一の抗原決定基に結合可能なモノクローナル抗体の結合断片に関する。
【0019】
本発明の別の目的は、本明細書に記載するモノクローナル抗体、特に、2000年8月10日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2358号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体(MoAb37.14)が結合するのと同一のSCLC上の抗原決定基に結合可能な抗体に関し、そして本明細書に記載するモノクローナル抗体、特に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2358号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体(MoAb37.14)が結合するのと同一の抗原決定基に結合可能なモノクローナル抗体の結合断片に関する。
【0020】
本発明の別の目的は、当該技術分野に知られるようなハイブリドーマ技術によって産生したハイブリドーマ細胞株であって、SCLC細胞上の表面抗原上のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する、前記ハイブリドーマ細胞株を提供することである。本発明の抗体に認識される抗原は、還元条件下のSDS−PAGEによって測定されるように、約200キロダルトン(kDa)の分子量(MW)を有する一本鎖糖タンパク質抗原、および分子量が緊密に関連し、そして還元条件下のSDS−PAGEによって測定されるように、約35−50kDaの間の分子量を有する2つのポリペプチド鎖を含んでなる、おそらく200kDa抗原の分解産物である抗原を含んでなる。クローン的に得たハイブリドーマ細胞株の限定されない例には、51.2、109.12および37.14と称する、サブクローニングしたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株が含まれる。やはり本発明にしたがって、本明細書に記載する26.1モノクローナル抗体などの、SCLC細胞表面抗原分子上のコンホメーションエピトープを認識するモノクローナル抗体がある。
【0021】
本発明の別の目的は、2000年8月10日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてIMM010.109.12(109.12)、ATCC表示第PTA−2357号;IMM010.37.14(37.14)、ATCC表示第PTA−2358号;IMM010.26.1(26.1)、ATCC表示第PTA−2359号;およびIMM010.51.2(51.2)、ATCC表示第PTA−2360号と称する、ハイブリドーマ細胞株を提供することである。
【0022】
本発明のさらに別の目的は、本明細書に記載するモノクローナル抗体に認識され、そして結合されるエピトープを含んでなる、SCLCの単離細胞表面糖タンパク質抗原を提供することである。本発明にしたがって、これらの抗原は、正常ヒト細胞、ヒト多発性骨髄腫細胞、または関連する起源の神経内分泌細胞上には、存在しないか、または有意により低い量で、好ましくは検出不能なレベルでしか存在しない。さらに、該抗原は、(i)約200kDaの分子量を有する、単一グリコシル化ポリペプチド、並びに(ii)類似の分子量であり、そして約35−50kDaの間の分子量範囲にある、2つのポリペプチド鎖を有する抗原分子を含んでなる。これらの認識される抗原の特性は、還元条件下のSDS−PAGEによって測定した。上記(i)にしたがった単離SCLC表面抗原は、本明細書に記載するようなモノクローナル抗体51.2、109.12および37.14に特異的に認識され;上記(ii)にしたがった単離SCLC表面抗原は、本明細書のモノクローナル抗体37.14に特異的に認識される。
【0023】
本発明のさらに別の目的は、例えば、単独で、またはカクテル中の他の抗体と共に、1若しくはそれより多くのモノクローナル抗体、又は1若しくはそれより多くのその結合断片を投与するか、あるいは1若しくはそれより多くのモノクローナル抗体またはその結合断片がSCLC細胞に結合するのに十分な条件下で、損なわれていない(intact)抗体(類)およびその結合断片(類)の混合物を投与して、個体の免疫細胞による癌細胞の阻害または殺傷を生じることによって、SCLCに罹患した個体において、SCLCを阻害するかまたは殺す方法を提供することである。本発明の1つの態様にしたがって、モノクローナル抗体またはその結合断片は、本明細書に記載するような、化学療法剤、光活性化毒素、または放射性剤などの毒性または細胞傷害性部分にコンジュゲート化する。
【0024】
本発明のさらなる目的は、SCLC細胞を殺すかまたは阻害するための、モノクローナル抗体またはその結合断片、および毒性または細胞傷害性部分のコンジュゲートを提供することである。
【0025】
本発明の別の目的は、本発明にしたがったモノクローナル抗体の結合部位(類)を反映し(mirror)、そして本発明の抗体に認識されるSCLCエピトープ、例えばコンホメーションエピトープに特異的である、抗イディオタイプ抗体を提供することである。こうした抗イディオタイプ抗体は、能動免疫によるSCLCの治療に使用可能である。
【0026】
本発明の別の目的は、固体支持体、基盤またはマトリックスに結合した、SCLCに特異性を有するモノクローナル抗体またはその結合断片を提供することである。やはり本発明にしたがって、記載するモノクローナル抗体またはその結合断片を、例えば、診断、療法、画像化、および化合物スクリーニングとして使用するため、フルオロフォア、発色団、放射性核種、または酵素などの検出可能標識で標識することが可能である。
【0027】
本発明のさらに別の目的は、本明細書記載の1若しくはそれより多くのモノクローナル抗体またはその結合断片を投与して、患者内の癌細胞または腫瘍細胞に結合させ、そして1若しくはそれより多くのモノクローナル抗体またはその結合断片の患者内の位置を決定することによって、患者において、SCLCを位置決定する方法を提供することである。こうした方法のため、モノクローナル抗体またはその結合断片は、好ましくは、放射性核種などの検出可能および生理学的的に許容しうる標識で標識する。
【0028】
本発明のさらなる目的は、癌または腫瘍細胞から、体液、例えば血液または血清中に、分断され、剥がれ落ち、または放出された抗原を検出することによって、SCLC、または本明細書の1若しくはそれより多くの抗体に認識されるエピトープを発現している他の細胞の診断を補助するため、体液試料において、本明細書に記載するような細胞表面抗原、例えば糖タンパク質の検出を提供する。さらに、本発明にしたがって、疾患の病期、および/または抗癌療法の有効性は、体液中の特異的に認識されるSCLC表面抗原のレベルまたは時間に渡る変化を測定することによって、モニター可能である。
【0029】
本発明の別の目的は、1若しくはそれより多くのモノクローナル抗体またはその結合断片、および薬学的に許容しうるキャリアー、希釈剤、または賦形剤を含んでなる薬剤組成物を提供することである。
【0030】
本発明に提供されるさらなる目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかであろう。
付随する図は、本発明をさらに説明し、そしてその多様な側面を明確にすることを通じて、本発明の理解を補助するために示す。
【0031】
発明の詳細な説明
ユニークな癌抗原の同定は、腫瘍性疾患の選択的免疫療法の設計を可能にする。癌細胞または腫瘍細胞にもっぱら発現されるが、正常細胞および組織に存在しない決定基を利用する能力は、腫瘍性細胞の標的化および除去を確実にする一方、正常細胞の生存性および機能を保護する。多くの悪性腫瘍および癌腫に関して、新規癌抗原は定義されておらず、そして特定の癌抗原と免疫反応性である抗体は発見されていない。
【0032】
癌抗原の大部分は、正常細胞に由来し、そして発現されるセルフ抗原またはオート抗原である。しばしば、癌抗原は、正常対応細胞抗原と同一であるが、より高いレベルで発現されるか、または自己抗原と区別するのを可能にするには不十分な無視できる突然変異を与えられている。悪性細胞が免疫系の監視から逃れる機構の1つは、悪性または癌細胞の表現型が正常細胞対応物と概して似ており、したがってその結果、免疫系における悪性または癌細胞の認知度が低くなり、そして免疫監視細胞による根絶から一般的に逃れることである。
【0033】
本発明は、小細胞肺癌腫または癌(SCLC)の腫瘍細胞または癌細胞に発現される細胞表面抗原上のエピトープを特異的に認識し、そして該エピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。本明細書に記載するいくつかのモノクローナル抗体は、SCLC細胞上にもっぱら存在するか、または高発現されるかいずれかであるが、一方、対照として働く、発生的に関連する神経内分泌細胞上には欠けているか、またはより低く発現されるかもしくは提示される、表面糖タンパク質分子を認識し、そして該分子に結合することが見出された。さらに、本明細書に記載するモノクローナル抗体に認識されるSCLC特異的抗原は、多発性骨髄腫細胞などの関連しない癌細胞には欠けているか、または検出不能である。新たに発見されたSCLC特異的表面抗原は、SCLC疾患における療法的介入と共に、診断および細胞精製目的のための標的を提供する。
【0034】
本発明の1つの側面において、差別的免疫プロトコルの使用は、SCLC細胞上にユニークに発現する癌抗原に対して免疫した動物宿主(ヒトを含む)における体液性免疫反応に重点を置くことを可能にする。宿主による免疫反応は、頑強であり、そしてその結果、免疫原に優れた親和性を有する血清抗体濃度の増加を誘発する。この方法で、SCLC表面抗原に特異性および高親和性を有するモノクローナル抗体を産生し、そしてSCLC疾患を有する患者の治療および療法用の組成物に用いると共に、疾患を決定する、および/またはモニターする、診断および/またはスクリーニングプロトコルに用いることが可能である。
【0035】
本発明の別の側面において、対照免疫として知られる技術を用いて、抗原、特にSCLC特異的抗原に対するモノクローナル抗体を得て、そして本明細書に記載するSCLC抗原を同定する。異なる解剖学的部位に提供する、2つの多岐に渡る免疫原を用いる(例えば実施例1)。二重免疫は、免疫細胞の別個の集団の遊走を、分離した排出リンパ節に極性化する。例えば、ヒトSCLC細胞株のプールを免疫原として用いて、SCLCに特異的な抗原に対するネズミモノクローナル抗体を得る。関連する神経内分泌細胞株のプールを構成する高用量の対照細胞を用いて、望ましい抗原での免疫部位に近いリンパ節から、望ましくない免疫細胞を効果的に取り除くように、免疫反応を極性化する。望ましいSCLC細胞免疫原での免疫部位に近い排出リンパ節から抽出した免疫細胞は、その後、当該技術分野に知られ、そして実行されるハイブリドーマプロトコルを用いて、ネズミ骨髄腫細胞との融合によって不死化する。この種の免疫プロトコル後、例えば反足細胞排出リンパ節は、対照、または望ましくない細胞免疫原に特異的な免疫細胞で占められ、それによって、免疫原としてSCLC細胞を用いた免疫の部位に近いリンパ節には、SCLC特異的免疫細胞が「捕捉」されることが可能になる。他の免疫法および免疫反応を誘発するプロトコルは、本発明にしたがった抗体を生成するのに適しているとみなすことが可能である。例えばWO 99/44583を参照されたい。
【0036】
抗原または抗原の組に対する大量域寛容の誘導は、免疫系のレパートリーの作り直しとみなすことが可能である。より低い用量の抗原で動物を免疫すると、優性エピトープが作る影から解放されるため、微量のまたは弱いエピトープに対する強い体液性反応が誘発される。
【0037】
寛容は、免疫系が抗原に反応するのに失敗することである。自己抗原に対する寛容は、宿主の組織および器官に対する損傷を自己が課すのを妨げる、免疫系の本質的な特徴である。寛容が失われると、免疫系は、自己免疫疾患で生じるように、自己組織を破壊する可能性がある。自己免疫障害はまれで、そしてHLA遺伝子組成に関連することが知られる。自己寛容の崩壊を導くのを促進する事象は未知であるが、感染性病原体に関連していると考えられる。寛容の故意の破壊は、非常に困難であり、そしていくつかの抗原に関しては、非常に強力なアジュバントの存在下で、反復免疫を用いて、達成可能である。
【0038】
しばしば非優性(例えば自己抗原)エピトープに対するモノクローナル抗体の産生が望ましいが、既知の免疫優性エピトープが免疫反応を制してしまうため、妨害される可能性がある。抗原での対照または差別的免疫などの技術は、抗原優性の階級を変化させることによって、望ましいエピトープを標的とする抗体反応に重点を置くのを可能にする。優性エピトープに対して免疫された宿主を寛容にすることによって、微量のまたはより弱い抗原が優性エピトープの圧倒的な影から「解放」され、そしてしたがって、免疫系の細胞によって、活発に反応される。非優性エピトープのアレイに向けられるモノクローナル抗体を産生する1つの方法は、免疫優性エピトープに対して免疫した動物を本質的に寛容にし、その後、非優性エピトープ、例えばSCLC細胞の表面抗原上に存在するエピトープで免疫することによる。
【0039】
差別的または対照免疫戦略はまた、広い化学的多様性を持つ抗原を検出することも可能である。タンパク質マーカーおよび産物の発見に用いるためのこれらの技術の限界のため、遺伝子発見および遺伝子産物技術が機能不能な領域で、このユニークな能力を、重要な抗原の発見に適用することが可能である。この種の免疫は、広い範囲の化学的に多様な抗原に対するモノクローナル抗体を生成するのに適しているため、この技術は、癌、腫瘍(良性および悪性両方)、感染性病原体、幹細胞移植、神経変性疾患、心臓血管疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患および炎症性疾患に関連するタンパク質マーカーおよび療法産物の発展に適用可能である。
【0040】
例えば対照免疫プロトコルを用いて、SCLC細胞に系譜が緊密に関連する、ヒト神経内分泌細胞、例えば神経芽細胞腫細胞株SK−N−AS、Be(2)−M17、およびMC−IXC(実施例1)のプールに、マウスを寛容にする。寛容マウスをその後、3つのヒトSCLC細胞株のプールで免疫する。差別的プロトコルで免疫したマウス由来の血清は、ヒトSCLC細胞に特異的な抗体を含有するが、一方、慣用法を用いて免疫したマウス由来の血清は、こうしたSCLC癌特異的抗体を欠いている。
【0041】
本発明は、ヒトSCLC細胞上に発現される癌特異的抗原(類)に対して向けられる新規モノクローナル抗体(MoAb)の発見を提供する。好ましいのは、SCLC癌または腫瘍細胞の表面抗原またはマーカーエピトープに対して特異性を有するモノクローナル抗体を誘発する、対照または差別的免疫技術の使用である。モノクローナル抗体を性質決定し、そしてSCLC細胞表面上の抗原に特異的に結合することを見出した。特に、3つの代表的で典型的なモノクローナル抗体を単離し、性質決定し、そしてSCLC細胞上に存在する約200kDaのMW(還元条件下のSDS−PAGEによって測定されるようなもの)を持つ一本鎖SCLC細胞表面糖タンパク質と特異的に反応することを見出した(図2、3および8B)。これらのMoAbは、51.2、37.14および109.12と命名された(それぞれ、ATCC表示第PTA−2360号、第PTA−2358号および第PTA−2357号)。MoAb109.12は、発生的に関連する神経内分泌細胞、すなわち神経芽細胞腫細胞株、または関連しないヒト多発性骨髄腫(MM)癌細胞と反応しないことを見出した。MoAb51.2は、神経内分泌細胞と最小限にしか反応せず、そしてMM細胞とまったく反応しない。
【0042】
代表的な単離モノクローナル抗体37.14が、還元条件下のSDS−PAGEによって測定されるように、約35−50kDaの間のMWを有する細胞表面糖タンパク質と特異的に反応することもまた見出した。この抗体は、ATCCにATCC表示第PTA−2358号で寄託した。35−50kDa抗原は、分子量が緊密に関連する、2つの鎖または断片で構成されるようであった。37.14抗体は、神経内分泌細胞または関連しないMW細胞いずれの類似の抗原いずれをも認識しなかった。
【0043】
さらに別の代表的な単離モノクローナル抗体、MoAb26.1(ATCCにATCC表示第PTA−2359号で寄託)は、FACS解析用の条件下でアッセイすると、SCLC特異的細胞表面分子を認識することを見出した。しかし、この抗体は、還元条件下で行ったウェスタンブロットアッセイでは、SCLC膜と反応しないようであった。こうした結果は、MoAb26.1に認識されるエピトープが、SDSの使用を伴うウェスタンブロッティング用の条件下では、直線化によって破壊される、コンホメーションエピトープであることを示唆する。
【0044】
本発明の別の態様は、前述のSCLC細胞表面糖タンパク質を認識する、モノクローナル抗体およびその結合断片または部分に関連する。したがって、本発明は、寄託したモノクローナル抗体と共に、SCLC細胞上に存在する上述の抗原に特異性を有する、抗体、好ましくはモノクローナル抗体およびその結合断片を含む。SCLC抗原上のエピトープに結合する抗体断片または抗原結合可能断片の限定されない例には、以下が含まれる:Fab断片、F(ab)2断片、Fab’断片、F(ab)発現ライブラリーによって産生される断片、F(ab’)2断片、Fd断片、Fd’断片およびFv断片。抗体は、ヒト、またはヒト以外の動物、好ましくは、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびブタなどの哺乳動物由来であることが可能である。好ましいのは、マウスモノクローナル抗体およびその抗原結合断片または部分である。さらに、キメラ抗体およびハイブリッド抗体が、本発明に含まれる。
【0045】
本発明にしたがって、モノクローナル抗体およびその結合断片は、1)アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110−2209に、ATCC寄託番号第PTA−2357号、第PTA−2358号、第PTA−2359号および第PTA−2360号で寄託されるハイブリドーマ細胞株から産生されるもの;2)アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、ATCC寄託番号第PTA−2357号、第PTA−2358号、第PTA−2359号および第PTA−2360号で寄託されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体が結合するのと同一の抗原決定基に結合可能な抗体;3)アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、ATCC寄託番号第PTA−2357号、第PTA−2358号、第PTA−2359号および第PTA−2360号で寄託されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体の結合断片;または4)アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、ATCC寄託番号第PTA−2357号、第PTA−2358号、第PTA−2359号および第PTA−2360号で寄託されるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体が結合するのと同一の抗原決定基に結合可能なモノクローナル抗体の結合断片と性質決定可能である。本発明の寄託されるモノクローナル抗体の免疫グロブリンアイソタイプは、以下のとおり、表1に示す:
【0046】
【表1】
本発明にしたがって、モノクローナル抗体は、SCLC細胞に発現され、そして該細胞上に存在する特定の糖タンパク質表面抗原を認識する。MoAb37.14、MoAb51.2およびMoAb109.12、それぞれATCC寄託番号第PTA−2358号、第PTA−2360号、および第PTA−2357号に代表されるモノクローナル抗体のサブセットに認識される糖タンパク質表面抗原は、還元条件下のSDS−PAGEによって測定されるように、約200kDaの分子量を有する単一ポリペプチドである。MoAb37.14、ATCC寄託番号第PTA−2358号に代表されるモノクローナル抗体の別のサブセットに認識される糖タンパク質表面抗原、またはエピトープは、還元条件下のSDS−PAGEによって測定されるように、約35−50kDaの分子量を有する。本発明にしたがった他のモノクローナル抗体に認識されるSCLC特異的抗原は、コンホメーションエピトープを含有し、MoAb26.1に代表されるようなモノクローナル抗体によるその認識は、損なわれておらず、そして変性、分解、直線化、または別の方式で不都合に影響を受けていない抗原のコンホメーション的性質に依存する。
【0047】
本発明はさらに、本明細書に記載し、そして性質決定するような、SCLC細胞表面上の抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。ハイブリドーマ細胞株を調製する方法は、当該技術分野に公知であり、そして実行される。したがって、培養中の連続細胞株によって、特定の抗原に対する抗体分子の均質な集団、好ましくは単一特異的抗体分子、例えばモノクローナル抗体の産生を生じる、いかなる技術またはプロトコルも使用可能である。こうした技術には、限定されるわけではないが、KohlerおよびMilsteinに開発されたハイブリドーマ技術(1975, Nature, 256:495−497)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら, 1983, Immunology Today, 4:72;Coteら, 1983, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 80:2026−2030)と共に、ヒトモノクローナル抗体を産生するエプスタイン−バーウイルス(EBV)−ハイブリドーマ技術(Coleら, 1985:Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中, Alan R. Liss, Inc., pp.77−96)が含まれる。こうした抗体は、IgM、IgG、IgE、IgAおよびIgDを含む、いかなる免疫グロブリンクラス、またはいかなるそのサブクラスであることも可能である。ハイブリドーマ細胞は、確立された方法にしたがって、in vivoまたはin vitroで培養することが可能である。
【0048】
さらなる側面において、モノクローナル抗体は、国際特許出願第WO 98/02545号に記載される技術を利用して、無菌動物において産生することが可能である。本発明で使用するのにやはり適しているのは、ハイブリッド抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体である(例えばQueenらに対する米国特許第5,585,089号)。ヒトまたはヒト化抗体は、ヒト宿主に導入した際、異種間抗体よりも、免疫反応、特にアレルギー反応を誘導する可能性がはるかに低いため、ヒト疾患または障害の療法において使用するのには、ヒト成分を有するハイブリッドまたはキメラ抗体などの抗体、あるいはヒト化抗体が好ましい。
【0049】
さらに、適切な抗原特異性を持つマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性を持つヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによる、キメラ抗体産生のために開発された技術(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851−6855;Neubergerら, 1984, Nature, 312:604−608;Takedaら, 1985, Nature, 314:452−454)が、本発明で使用するのに適している。
【0050】
さらに、本発明にしたがって、一本鎖抗体産生のために記載される技術(例えば、Hustonに対する米国特許第5,476,786号および第5,132,405号;Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879−5883;R.C. Ladnerらに対する米国特許第4,946,778号;Bird, 1988, Science, 242:423−426およびWardら, 1989、 Nature, 334:544−546)を適応させて、SCLC表面抗原特異的一本鎖抗体を産生することが可能である。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介して、Fv領域の重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖断片を連結して、一本鎖ポリペプチドを生じることによって、形成される。一価抗体もまた、本発明に含まれる。さらに、Fab発現ライブラリー構築のための技術(Huseら, 1989, Science, 246:1275−1281)が、本発明で使用するのに適しており、これは、望ましい特異性を有する、モノクローナル抗体Fab断片、あるいは誘導体または類似体(analog)の迅速で、そして容易な同定を可能にする。
【0051】
特定の抗SCLC表面抗原抗体のイディオタイプを含有し、そしてSCLC特異的抗原を「模倣」する抗体断片は、既知の技術によって産生可能である(GreenspanおよびBona, 1993, FASEB J., 7(5):437−444およびNissinoff, 1991, J. Immunol., 147(8):2429−2438)。例えば、こうした断片には、限定されるわけではないが、損なわれていない抗体分子のペプシン消化によって産生可能であるF(ab’)2断片;F(ab’)2断片のジスルフィド架橋を還元することによって産生可能であるFab’抗原、並びに酵素パパインおよび還元剤で、損なわれていない抗体分子を処理することによって生成可能であるFab断片が含まれる。
【0052】
本明細書に記載する対照免疫および差別的抗原免疫法は、多くの使用のために望ましい抗体を得ることが可能な方法の限定されない例である。したがって、抗SCLC抗体が、SCLC細胞または細胞由来免疫原性構成要素で免疫することによって、動物宿主で誘発可能であるか、あるいは免疫細胞のin vitro免疫(感作)によって形成可能であることもまた、予期される。抗体はまた、適切な細胞株を、適切な抗体をコードするDNAで形質転換するか、トランスフェクションするか、感染させるか、または形質導入する、組換え系で産生することも可能である。あるいは、抗体は、精製重鎖および軽鎖の生化学的再構成によって構築可能である。前述の種類の抗体を用いて、例えば、特異的に認識される表面糖タンパク質抗原を提示する細胞、または抗原自体、あるいはその免疫原性断片または部分は、抗体コンジュゲート化固相マトリックスまたは支持体上でのクロマトグラフィーによって(E. HarlowおよびD. Lane 1999, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー)、またはイムノアッセイによって、試験試料中で検出可能である。好ましいのは、SCLC細胞に発現される表面抗原を特異的に認識し、そして該抗原に結合する抗体であり;より好ましいのは、本明細書に記載するSCLC特異的表面糖タンパク質抗原である。
【0053】
抗体は、抗SCLC抗原抗体アフィニティーカラムを用意するのに使用可能である。例えば、ゲル支持体またはビーズを、多様な化学的化合物、例えば臭化シアン、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化して、そして抗体をそこに結合させることが可能である。より具体的には、そして一例として、抗SCLC抗体を、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化したゲル支持体、Affigel−10(Biorad)に添加して、抗体がアガロースゲル支持体と共有結合を形成するようにしてもよい。その後、スペーサーアームとのアミド結合を介して、抗体をゲルにカップリングする。残った活性化エステルは、その後、エタノールアミンHCl、1M、pH8で失活させる。カラムを水で、その後、0.23MグリシンHCl、pH2.6で洗浄して、いかなる非コンジュゲート化抗体または無関係なタンパク質も除去する。その後、適切な界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、(pH7.3)中でカラムを平衡化し、そして例えばSCLC表面抗原を含有する、試料材料、すなわち細胞培養上清または細胞抽出物(例えば適切な膜可溶化界面活性剤を用いて調製したもの)をカラムにゆっくりと通過させる。光学密度がバックグラウンドに減少するまで、PBS/界面活性剤でカラムを洗浄する。その後、0.23Mグリシン−HCl、pH2.6/界面活性剤で、カラムからタンパク質を溶出する。その後、精製SCLC由来糖タンパク質を、PBS/界面活性剤に対して透析する。
【0054】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載するような、そして本発明にしたがったモノクローナル抗体に認識され、そして結合されるような、SCLCの1又はそれより多くの単離表面抗原を含む。特に、本発明は、それぞれ、ATCC寄託番号第PTA−2358号、ATCC寄託番号第PTA−2357号およびATCC寄託番号第PTA−2360号を有する、37.14、109.12および51.2モノクローナル抗体に認識される、SCLC細胞のおよそ200kDaの一本鎖糖タンパク質抗原、並びに、ATCC寄託番号第PTA−2358号を有する37.14モノクローナル抗体に認識されるような、SCLC細胞上のおよそ35−50kDa一本鎖糖タンパク質抗原またはエピトープ決定基を含む。本発明にさらに含まれるのは、本発明の抗体、例えばATCC寄託番号第PTA−2359号を有する26.1MoAbに認識されるエピトープを含んでなる、細胞表面糖タンパク質である。認識されるコンホメーションエピトープを含んでなる細胞表面糖タンパク質は、正常細胞、またはSCLCに発生的に関連しない細胞上には存在しない。
【0055】
本発明の別の側面は、SCLC特異的表面糖タンパク質(類)、特に、還元条件下のSDS−PAGEによって測定されるように、約200kDaまたは約35−50kDaの分子量を有し、そして本発明にしたがった抗体に認識されるものを提示する細胞を伴う、SCLCおよび神経内分泌疾患に罹患した個体の治療のための療法に関する。本明細書に記載する糖タンパク質抗原が細胞表面上に存在する他の増殖不全疾患もまた、本発明にしたがった抗体および方法を用いて治療可能である。
【0056】
本発明に含まれる療法は、原発腫瘍または癌と共に、転移も含む。例えば、SCLC細胞を阻害するかまたは殺す方法は、上述のように、SCLC細胞に特異性を有する、1若しくはそれより多くのモノクローナル抗体またはその結合断片を、モノクローナル抗体または結合断片が、患者において、腫瘍または癌細胞に結合するのに十分な条件下で、患者に投与することを含んでなる。抗体またはその結合断片が腫瘍細胞または癌細胞に結合すると、患者免疫細胞による、細胞の阻害または殺傷が誘導される。上述の方法は、修飾を伴わない抗体またはその結合断片を使用し、in situで、抗体がSCLC細胞の表面に結合して、免疫反応および自己免疫細胞による攻撃を刺激し、そして誘導することに頼る。しかし、こうした抗体仲介治療または療法にはまた、腫瘍または癌細胞に向けられる他の治療、例えば放射線照射、化学療法等と共に、上述の治療/療法(類)の後、オプソニン化した癌または腫瘍細胞に対する免疫系の攻撃を増進する、補助的療法が付随することも可能である。
【0057】
より具体的には、増殖因子、リンホカイン、またはサイトカイン、例えばエリスロポエチンおよび/またはGM−CSFを、1又はそれより多くの抗SCLCモノクローナル抗体と同時投与して、白血球細胞を刺激して、そして患者の免疫適格状態を補助することが可能である。さらに、本発明のキメラまたは融合抗体、あるいは他の組換え抗体を療法および治療に使用することが可能である。例えば、抗腫瘍または癌効果を有する第二のタンパク質、例えばリンホカインまたはオンコスタチンの少なくとも機能的に活性であるかまたは生理活性である部分に連結した、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含んでなる融合タンパク質分子を用いて、特に、in vivoで、SCLCまたは腫瘍を治療することが可能である。さらに、抗原結合部分または部位を、免疫グロブリン、例えばIgG1のヒトFc分子に連結して、抗体依存仲介細胞傷害または補体仲介細胞傷害を促進する、キメラ抗体を調製することが可能である。当該技術分野に知られ、そして実行されるような組換え技術およびプロトコル(例えばC.L. Readingに対する米国特許第4,474,893号、10/02/84発行)を用いて、結合特異性の1つが、本発明にしたがった抗体のものである、二特異性または二機能性キメラ抗体を構築可能である。
【0058】
別の側面において、本発明は、細胞傷害剤を結合させたか、添付したか、またはカップリングした、記載するモノクローナル抗体またはその結合断片を利用する療法を含んでなる。細胞傷害性抗体またはその結合断片が、SCLC腫瘍または癌細胞に結合すると、細胞の増殖が阻害され、そして最適には細胞が殺される。適切な細胞傷害剤の限定されない例には、化学療法化合物、薬剤(例えばGarnettおよびBaldwin, 1986, Cancer Res., 46:2407−24112)、プロドラッグ、酵素、光活性化毒素、または放射性剤が含まれる。細胞傷害剤には、限定されるわけではないが、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、ゲロニン、メルファラン、ブレオマイシン、アドリアマイシン、ダウノマイシン、またはヤマゴボウ(pokeweed)抗ウイルスタンパク質(PAP、PAPII、またはPAP−S)が含まれる。
【0059】
当業者は、公知の技術によって腫瘍特異的抗体にカップリングし、そして腫瘍細胞および組織を特に破壊しようとする部位に搬送することが可能な、多くの放射性核種および化学細胞傷害剤があることを認識するであろう(例えば、W.A. Blattlerらに対する米国特許第4,542,225号、09/17/85発行;およびPastanら, 1986, Cell, 47:641−648を参照されたい)。光活性化毒素の限定されない例には、ジヒドロピリジン−およびオメガ−コノトキシンが含まれる(Schmidtら, 1991, J. Biol. Chem., 266(27):18025−18033)。使用に適した画像化および細胞傷害試薬の限定されない例には、125I、123I、111In(例えばSumerdonら, 1990, Nucl. Med. Biol., 17:247−254)、99mTc、32P、3Hおよび14C;フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識;ルシフェリンなどの化学発光標識、および磁気共鳴画像法で使用する常磁性イオン(Laufferら, 1991, Magnetic Resonance in Medicine, 22:339−342)が含まれる。抗体は、当該技術分野に知られ、そして実行されるプロトコルおよび技術を用いて、こうした試薬で標識することが可能である。例えば、抗体の放射標識に関する技術には、WenzelおよびMeares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, ニューヨーク, 1983;Colcerら, 1986, Meth. Enzymol., 121:802−816;およびMonoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwinら監修, Academic Press, 1985, pp.303−316を参照されたい。正常組織への毒性を制限しつつ、腫瘍または癌細胞および/または組織に搬送する用量を最大化するため、イットリウム−90で標識したモノクローナル抗体が記載されてきている(例えば、GoodwinおよびMeares, 1997, Cancer Supplement, 80:2675−2680)。限定されるわけではないが、銅−67(67Cu)、ヨウ素−131(131I)およびレニウム−186を含む、他の細胞傷害放射性核種もまた、SCLC表面抗原に対して向けられるモノクローナル抗体を標識するのに使用可能である。
【0060】
用いる検出可能/検出標識は、使用しようとする画像法様式にしたがって選択する。例えば、インジウム−111(111In)、テクネチウム−99m(99mTc)、またはヨウ素131(131I)などの放射性標識は、平面スキャンに、または単光子放射型コンピューター撮影(CT)(SPECT)に使用可能である。また、フッ素−19などのポジトロン放出標識は、ポジトロン放出断層撮影(PET)において使用可能である。ガドリニウム(III)またはマンガン(II)などの常磁性イオンは、磁気共鳴画像法(MRI)において使用可能である。モノクローナル抗体はまた、例えば、X線、CATスキャン、またはMRIによって、注入後にSCLC細胞を視覚化するため、放射線不透性標識で標識することも可能である。特に、SCLC疾患に関して、肺内部、または肺の外側での標識の位置決定は、疾患の拡散の決定を可能にする。肺内部に存在し、そして検出可能な標識の量は、例えば、肺における癌または腫瘍の存在または非存在の決定を可能にする。
【0061】
本発明で使用するため、本明細書に記載するようなモノクローナル抗体またはその結合断片の、他の共有および非共有修飾が、さらに含まれる。こうした修飾は、抗体(類)または断片が結合する細胞の増殖阻害または殺傷を誘導するかまたは刺激するため、抗体(類)、またはその断片の投与と同時に、またはそれに続いて投与される剤を含むことを意味する。例えば、モノクローナル抗体にコンジュゲート化した免疫毒素が、動物モデルで有効であることが見出された。リボソーム不活性化タンパク質(例えばリシンA鎖、トウゴマ(ricinus)凝集素、またはビスキュミン)または光不活性化剤とMoAbのコンジュゲート化が記載されてきている(例えばD.B. Papkovskiiら, 1990, Biomed. Sci., 1(4):401−406を参照されたい)。さらに、ヤマゴボウ(pokeweed)抗ウイルスタンパク質(PAP)は、標的細胞内で、抗アポトーシス複合体を破壊するか、またはタンパク質合成を阻害して、最終的に細胞の死を生じる能力を有する。さらに、チロシンキナーゼを阻害する小分子のいくつかは、増殖因子コンジュゲートとして癌細胞を特異的に標的とすることが可能であり、そしてこれを本発明にしたがったモノクローナル抗体またはその断片と共に投与することが可能である。
【0062】
本発明の関連する態様において、本発明にしたがったモノクローナル抗体は、療法剤で標識されていなくてもまたは標識されていても、免疫療法に使用可能である。これらの療法剤は、当該技術分野で日常的に実行される技術を用いて、記載するモノクローナル抗体に直接または間接的にカップリングすることが可能である。間接的カップリングの一例は、スペーサー部分の使用による。次に、スペーサー部分は不溶性または可溶性であってもよく(Dieherら, 1986, Science, 231:148)、そして、標的部位でモノクローナル抗体分子から薬剤が放出されることを可能にするように、選択することが可能である。抗癌免疫療法のため、本発明のモノクローナル抗体にカップリングすることが可能な療法剤の例は、薬剤、放射性同位元素、レクチン、および毒素である。
【0063】
本発明のモノクローナル抗体にコンジュゲート化可能な薬剤には、非タンパク質性と共にタンパク質性化合物が含まれる。用語「非タンパク質性薬剤」は、古典的に薬剤と称される化合物、例えばマイトマイシンC、ダウノルビシン、およびビンブラスチンを含む。本発明のモノクローナル抗体を標識することが可能なタンパク質性薬剤には、免疫調節因子および他の生物学的反応修飾因子が含まれる。
【0064】
用語「生物学的反応修飾因子」は、本発明のモノクローナル抗体が特異的である抗原を持つ腫瘍の破壊を増進するような方式で、免疫反応を修飾するのに関与する物質を含むと意図する。免疫反応修飾因子の例には、リンホカインなどの化合物が含まれる。リンホカインには、腫瘍壊死因子、インターロイキン類、例えばIL1からIL15、リンホトキシン、マクロファージ活性化因子(MAF)、遊走阻害因子(MIF)、コロニー刺激因子(CSF)、およびインターフェロンが含まれる。本発明のモノクローナル抗体を標識可能なインターフェロンには、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロンおよびガンマ−インターフェロン、並びにそのサブタイプが含まれる。
【0065】
放射性同位元素にコンジュゲート化した、本発明のモノクローナル抗体を免疫療法に用いる際、白血球分布、並びに、同位元素安定性および放出などの要因に応じて、他のものより特定の同位元素がより好ましい可能性がある。望ましい場合、腫瘍細胞分布は、上述のin vivo診断技術によって評価することが可能である。悪性度に応じて、ある放射体が他のものより好ましい可能性がある。一般的に、免疫療法ではアルファおよびベータ粒子放射性同位元素が好ましい。例えば、動物が癌腫におけるように固形腫瘍病巣を有する場合、組織数ミリメートルに浸透することが可能な、90Yなどの高エネルギーベータ放射体が好ましい可能性がある。一方、白血病の場合におけるように、悪性腫瘍が単純な標的細胞からなる場合、212Biなどの、より短い範囲の高エネルギーアルファ放射体が好ましい可能性がある。療法目的のため、本発明のモノクローナル抗体に結合可能な放射性同位元素の例は、125I、131I、90Y、67Cu、212Bi、211At、212Pb、47Sc、109Pd、および188Reである。
【0066】
レクチンは、通常、植物材料から単離されるタンパク質であり、特定の糖部分に結合する。多くのレクチンはまた、細胞を凝集させ、そしてリンパ球を刺激することも可能である。リシンは、免疫療法的に用いられてきている、毒性レクチンである。これは、好ましくは、毒性に関与するリシンのアルファペプチド鎖を抗体分子に結合させて、毒性効果の部位特異的搬送を可能にすることによって、達成する。
【0067】
毒素は、植物、動物、または微生物に産生される毒性物質であり、十分な用量で、しばしば致死性である。ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)に産生される物質であるジフテリア毒素(DT)は、療法的に使用可能である。DTはアルファおよびベータサブユニットからなり、これは適切な条件下で分離可能である。毒性のアルファ成分は、抗体に結合させ、そして本発明のモノクローナル抗体が特異的である抗原を持つ細胞への部位特異的搬送に使用することが可能である。本発明のモノクローナル抗体にカップリングさせることが可能な他の療法剤は既知であるか、または一般の当業者によって容易に確認可能である。
【0068】
本発明の標識または非標識モノクローナル抗体はまた、上述のものなどの療法剤と組み合わせて使用可能である。特に好ましいのは、本発明のモノクローナル抗体および免疫調節因子および他の生物学的反応修飾剤を含んでなる併用療法である。したがって、例えば、本発明のモノクローナル抗体はアルファ−インターフェロンと組み合わせて使用可能である。この治療様式は、癌腫細胞によるモノクローナル抗体反応性抗原の発現を増加させることによって、癌腫のモノクローナル抗体標的化を増進する(Greinerら, 1987, Science, 235:895)。あるいは、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ガンマ−インターフェロンと組み合わせて用いて、エフェクター細胞によるFc受容体の発現を活性化し、そして増加させることが可能であり、この結果、次に、エフェクター細胞へのモノクローナル抗体の結合、および標的腫瘍細胞の殺傷が増進される。当業者は、本発明のモノクローナル抗体の有効性を増進する、望ましいエフェクター機能を生成するため、多様な生物学的反応修飾因子から選択することが可能であろう。
【0069】
本発明のモノクローナル抗体を、本明細書に記載するものなどの多様な療法剤と組み合わせて用いる場合、モノクローナル抗体および療法剤の投与は、通常、実質的に同時に起こる。用語「実質的に同時」は、モノクローナル抗体および療法剤が、時間的に、妥当に近く、共に投与されることを意味する。通常、モノクローナル抗体の前に療法剤を投与することが好ましい。例えば、療法剤は、モノクローナル抗体の1から6日前に投与することが可能である。療法剤の投与は、例えば腫瘍の性質、患者の状態および剤の半減期などの要因に応じて、毎日、または他の間隔いずれかで投与することが可能である。
【0070】
本発明のモノクローナル抗体を用いて、本明細書に記載する性質すべてを合わせた療法を設計することが可能である。既定の状況において、本発明のモノクローナル抗体の投与前に、エフェクター細胞および同一のまたは異なる療法剤または剤類と組み合わせて、療法剤または剤類を投与することが望ましい可能性がある。例えば、まずガンマ−インターフェロンおよびインターロイキン−2を毎日3から5日間投与し、そして第5日に、エフェクター細胞と共にガンマ−インターフェロン、およびインターロイキン−2と組み合わせて、本発明のモノクローナル抗体を投与することによって、悪性疾患の患者を治療することが望ましい可能性がある。
【0071】
本発明のモノクローナル抗体をその膜中に含むリポソームを利用して、SCLC特異的抗原を発現する腫瘍領域に、リポソームを特異的に搬送することもまた可能である。これらのリポソームは、これらが、モノクローナル抗体に加えて、上述のものなどの免疫療法剤を含有し、その後、これらが腫瘍部位で放出されるであろうように産生可能である(例えばWolffら, 1984, Biochem. et Biophys. Acta, 802:259)。
【0072】
本発明のモノクローナル抗体の投与のための投薬範囲は、悪性疾患の症状が軽減される望ましい効果を生じるのに、十分に大きいものである。投薬量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの副作用を引き起こすほど大きくあるべきではない。一般的に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の度合いに応じて多様であろうし、そして当業者によって決定することが可能である。投薬量は、いかなる合併症の事象においても、個々の医師によって調整することが可能である。投薬量は、1または数日、毎日1又はそれより多くの用量投与で、約0.1mg/kgから約2000mg/kg、好ましくは約0.1mg/kgから約500mg/kgで多様である可能性がある。
【0073】
一般的に、本発明のモノクローナル抗体を、療法剤と組み合わせて投与する場合、in vivo免疫診断画像化に使用したものに匹敵する、より低い投薬量が使用可能である。本発明のモノクローナル抗体は、注射によって、または時間に渡る漸進的灌流によって、非経口的に投与可能である。本発明のモノクローナル抗体は、単独で、またはエフェクター細胞と組み合わせて、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、腔内、または経皮投与することが可能である。非経口投与用の調製には、滅菌水性または非水性溶液、懸濁物、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。水性キャリアーには、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール性/水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム液、乳酸リンゲル液または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充剤、電解質補充剤(リンゲルのデキストロース液に基づくようなもの)などが含まれる。例えば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加物もまた、存在することが可能である。
【0074】
上述のように、本発明にしたがった抗体に対する、抗イディオタイプモノクローナル抗体は、活性腫瘍免疫および腫瘍療法における療法および治療で用いることが可能である(S.M. Larsonら, 1986, “放射標識抗体の療法適用:現在の状況および展望”, Int. J. Rad. Appl. Instrum., Bを参照されたい)。
【0075】
本発明にしたがったモノクローナル抗体またはその結合断片を用いて、腫瘍または癌細胞上の、記載するようなSCLC特異的抗原の存在を、定量的にまたは定性的に検出することが可能である。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量検出と組み合わせて、蛍光標識した抗体を使用した免疫蛍光技術によって、達成可能である。さらに、本発明にしたがった抗体またはその結合断片は、モニターリング、診断、または検出アッセイで使用するためなど、細胞上のSCLC特異的抗原のin situ検出のため、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡、または非イムノアッセイにおけるように、組織学的に使用することが可能である。
【0076】
in situ検出は、患者から組織学的標本を取り除き、そしてそこに本発明にしたがった標識抗体を適用することによって、達成可能である。好ましくは、抗体またはその抗原結合断片は、生物学的試料上に、標識抗体または断片を重層することによって、適用する。こうした方法の使用を通じて、SCLC抗原、または保存変異体、またはペプチド断片の存在だけでなく、調べた組織におけるその分布も決定することが可能である。当業者は、いかなる多様な組織学的方法、例えば染色法もこうしたin situ検出を達成するため、修飾可能であると容易に認識するであろう。
【0077】
SCLC抗原、またはその保存変異体、またはペプチド断片に関するイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、典型的には、生物学的液体、組織抽出物、新鮮に採取した細胞、または細胞培養中でインキュベーションした細胞の溶解物などの試料を、SCLC抗原、その保存変異体、またはペプチド断片を認識する、本発明のSCLC特異的モノクローナル抗体またはその結合断片などの、検出可能に標識した抗体の存在下で、インキュベーションすることを含んでなる。その後、結合した抗体またはその結合断片は、当該技術分野に公知のいくつかの技術によって、検出する。
【0078】
生物学的試料は、細胞、細胞粒子、膜、または可溶性タンパク質を固定することが可能な、ニトロセルロースなどの固相支持体またはキャリアー、あるいは他の固体支持体またはマトリックスと接触させ、そしてこれに固定することが可能である。その後、支持体を適切な緩衝液で洗浄し、その後、検出可能に標識した抗SCLC抗体で処理する。その後、固相支持体は、二回目に緩衝液で洗浄して、非結合抗体を除去することが可能である。その後、固体支持体上の結合標識の量は、慣用的手段によって検出可能である。したがって、本発明の別の態様において、本明細書に記載するような、固相支持体に結合した、モノクローナル抗体またはその結合断片を含んでなる組成物を提供する。
【0079】
固相支持体またはキャリアーまたはマトリックスは、抗原または抗体に結合可能ないかなる支持体も意味する。公知の支持体またはキャリアーには、ガラス、プラスチック、ナイロンウール、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、フィルム、樹脂、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、アルミナゲル、斑れい岩(gabbros)、および磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的には、キャリアーの性質は、ある程度まで可溶性であっても、または不溶性であっても、いずれでもよい。支持体材料は、カップリングした分子が、抗原または抗体に結合可能である限り、実質的にいかなる可能な構造的立体配置を有することも可能である。したがって、支持体立体配置は、ビーズにおけるように球形であっても、試験管の内部表面または棒の外部表面におけるように筒状であってもよい。あるいは、表面は、シート、フィルム、試験片、スティックなどのように、平らであってもよい。さらに、固体支持体は、好ましくは、結合のための反応条件には不活性であり、そしてモノクローナル抗体、結合断片、または抗体の結合パートナーに付着させるため、反応基、または活性化した基を有することが可能である。固相支持体はまた、炭水化物ポリマー、Sepharose(登録商標)、Sephadex(登録商標)、またはアガロースなどのクロマトグラフィー支持体としても有用である可能性がある。実際、抗体または抗原を結合させるこうした支持体の多数が、商業的に入手可能であり、そして当業者に知られる。
【0080】
既定の抗SCLC抗体の結合活性は、公知の方法によって測定可能である。当業者は、日常的な実験を使用することによって、各測定の実行可能でそして最適なアッセイ条件を決定することが可能であろう。
【0081】
抗SCLC抗体に関して、こうしたタンパク質分子を検出可能に標識する多くの方法が知られ、そして当該技術分野で実行される。例えば、抗体を検出可能に標識する1つの方法は、例えば、酵素イムノアッセイ(EIA)で使用するため、抗体を酵素に連結することによる(A. Vollerら, 1978, “酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)”, Diagnostic Horizons, 2:1−7;Microbiological Associate Quarterly Publication. メリーランド州ウォーカーズビル;A.Vollerら, 1978, J. Clin. Pathol. 31:507−520;J.E. Butlerら, 1981, Meths. Enzymol.,73:482−523;Enzyme Immunoassay, 1980, E. Maggio監修, CRC Press, フロリダ州ボカラトン;Enzyme Immunoassay, 1981, E. Ishikawaら監修, 日本・東京・科学書院)。抗体に結合している酵素は、例えば分光光度、蛍光定量、または視覚的検出手段によって検出可能である化学部分を産生するように、適切な基質、好ましくは色素原基質と反応する。抗体を検出可能に標識するのに使用可能な酵素の限定されない例には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−5−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−6リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。検出は、酵素の色素原基質を使用する熱量測定法によって、または同様に調製した標準または対照と比較した、基質の酵素的反応の度合いを視覚的に比較することによって、達成可能である。
【0082】
多様な他のイムノアッセイもまた、検出に使用可能である。例えば、抗体またはその結合断片を放射性同位元素で標識することによって、ラジオイムノアッセイ(RIA)を用いて、SCLC特異的抗原が検出可能である(例えばB. Weintraub, “ラジオイムノアッセイの原理”, Seventh Training Course on Radioligand Techniques, The Endocrine Society, March, 1986)。放射性同位元素標識は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターを用いることによって、あるいはX線撮影によって、検出可能である。
【0083】
抗体またはその抗原結合断片はまた、蛍光化合物を用いても標識可能である。蛍光標識した抗体を、適切な波長の光に曝露すると、その後、その存在は、蛍光によって検出可能である。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物の中には、限定なしに、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。152Euまたは他のランタニドシリーズなどの検出可能に標識した蛍光放出金属を用いて、続く検出のため、抗体またはその結合断片を標識することが可能である。金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの金属キレート基を介して、抗体にカップリングすることが可能である。
【0084】
抗体はまた、化学発光化合物にこれらをカップリングすることによって、検出可能に標識することも可能である。その後、化学発光タグ化抗体の存在は、化学反応の経過中に発展する、発光の存在を検出することによって、測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例には、限定なしに、ルミノール、イソルミノール、セロマティック(theromatic)、アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが含まれる。同様に、生物発光化合物を用いて、本発明の抗体を標識することが可能である。生物発光は、触媒タンパク質が、化学発光反応の有効性を増加させる、生物学的系に見られる種類の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって、測定する。有用な生物発光標識化合物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが含まれる。
【0085】
本発明の別の態様は、本発明に記載するモノクローナル抗体およびその結合断片を用いて、SCLC癌および腫瘍の診断剤、診断法および画像法を提供する。本発明にしたがった抗体の診断使用は、原発腫瘍および癌と共に転移を含む。本発明の、そして本明細書に記載する、モノクローナル抗体またはその結合断片が結合可能な、SCLC細胞上に発見される表面抗原を持つ他の癌および腫瘍もまた、これらの診断および画像法を受け入れやすい。
【0086】
本発明にしたがった診断法は、本明細書に記載するようなモノクローナル抗体またはその結合断片を、放射性同位元素などの検出可能部分へのコンジュゲート化を伴いまたは伴わず、投与するか、導入するか、または注入することを含んでなる。投与または注入後、抗体または結合断片は、腫瘍または癌細胞に結合し、その後、結合した抗体または断片の位置を検出する。検出可能標識抗体または断片、例えば、放射性同位元素で標識されたものに関しては、体内の剤の位置を同定するのに、画像化装置が使用可能である。非標識抗体または断片に関しては、結合した抗体または断片が適切に検出可能であるように、これらを位置決定する、第二の検出可能試薬を投与することが可能である。同様の方法が他の抗体に関して使用されてきており、そして当業者は、体内の検出可能に結合した抗体または断片の位置を画像化するのに適した多様な方法を知っているであろう。限定しない指針として、約10−1000μg、好ましくは約50−500μg、より好ましくは約100−300μg、最も好ましくは約200−300μgのプロテインG精製MoAbを投与する。マウスには、例えば、200μg MoAbおよび腹腔内(i.p.)投与を用いて、MoAbを週3回3週間投与する。300μg MoAbおよび腹腔内(i.p.)投与では、MoAbを週2回3週間注射する。ヒトに適用可能な用量には、約100−200mcg/kg、または350−700mg/m2が含まれる。
【0087】
本明細書に記載する特異的モノクローナル抗体またはその結合断片の混合物などの、異なるモノクローナル抗体のカクテルを投与して、必要ならば、または望ましいならば、SCLCを軽減することが可能であるとさらに理解すべきである。実際、カクテル中で、癌細胞上の、いくつかの抗原、または異なるエピトープを標的とする、モノクローナル抗体またはその結合断片の混合物を使用するのは、特に抗原の1つの下方制御による、腫瘍細胞および/または癌細胞の回避を妨げるため、好適なアプローチである。
【0088】
別の態様において、本発明は、血液、血清、血漿、痰などの体液中の分断されたSCLC細胞表面糖タンパク質の同定および測定による、癌および腫瘍の診断を補助する。本明細書に記載する表面抗原を発現する癌であって、該抗原が本発明にしたがったモノクローナル抗体およびその結合断片に認識され、そしてこれらと免疫反応性である、前記癌に関しては、癌または腫瘍細胞から分断されたかまたは剥がれ落ちた抗原を検出する能力は、早期診断に必要な手段を提供し、それによって、早期治療の機会を提供する。早期検出は、早期段階で診断するのが困難な癌では、特に重要である。全血試料における分断表面糖タンパク質の、例えば本発明にしたがった1又はそれより多くの抗体またはその結合断片の使用による測定は、回避性癌または腫瘍の早期検出、診断および即時介入および/または治療を提供する。治療は、上述のように、抗体に基づく免疫療法を、必要ならば、または望ましいならば、他の免疫調節剤と組み合わせて含んでなることが可能である。
【0089】
さらに、血液などの体液試料において検出されそして測定される、分断された抗原のレベルは、限定されるわけではないが、手術、化学療法、放射療法、本発明の療法、およびその組み合わせを含む、癌または腫瘍のための療法経過をモニターする手段を提供する。体液中のSCLC特異的抗原のレベルを疾患の重症度と相関させることによって、こうした抗原のレベルを用いて、原発腫瘍、癌、および/または転移の除去に成功したことを示すと共に、例えば、時間に渡る他の療法の有効性を示し、そして/またはモニターすることが可能である。例えば、時間に渡る癌または腫瘍特異的抗原レベルの減少は、患者において、腫瘍負荷が減少した示標となる。対照的に、時間に渡る抗原レベルが不変であるか、または増加することは、療法が無効であるか、あるいは腫瘍または癌の増殖が続いている示標となる。
【0090】
関連する態様において、本発明は、細胞、組織または体液中のSCLC細胞表面抗原レベルの変化を、好ましくは正常ヒト対照由来の同一種の、細胞、組織、または体液中のレベルと比較して、アッセイすることによって、SCLCの存在を診断する方法を提供する。正常ヒト対照に対する、患者における抗原レベルの変化は、SCLCの存在と関連する。本発明のこの側面を限定することなく、典型的には、定量的診断アッセイのため、試験した患者が癌を有する示標となる陽性結果は、細胞、組織または体液中または上のSCLC抗原レベルが、対照としての正常個体の同一細胞、組織、または体液中の、またはこれら上の抗原レベルより、少なくとも2倍、より高く、そして好ましくは、3から5倍、より高いものである。正常対照には、癌を持たないヒトおよび/または患者由来の非癌性試料が含まれる。
【0091】
本発明の別の態様は、本発明にしたがった1又はそれより多くのモノクローナル抗体またはその結合断片を、生理学的に、および/または薬学的に許容しうるキャリアー、賦形剤、または希釈剤と共に含んでなる、薬剤組成物に関する。抗体または結合断片は、1又はそれより多くのSCLC細胞表面抗原上のSCLCエピトープを特異的に認識し、そして該抗原に結合する。SCLC特異的細胞表面抗原は、本明細書に記載し、そして上述するように、さらに性質決定される。
【0092】
より具体的には、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ATCC寄託番号第PTA−2357号、第PTA−2358号、第PTA−2359号および第PTA−2360号を有するハイブリドーマ細胞株から産生されるモノクローナル抗体;アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2357号、第PTA−2358号、第PTA−2359号および第PTA−2360号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体が結合するのと同一の抗原決定基に結合可能な抗体;アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2357号、第PTA−2358号、第PTA−2359号および第PTA−2360号を有するハイブリドーマ細胞株の結合断片;およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2357号、第PTA−2358号、第PTA−2359号および第PTA−2360号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体が結合するのと同一の抗原決定基に結合可能なモノクローナル抗体の結合断片を含む、モノクローナル抗体またはその結合断片;並びに薬学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤を含んでなる薬剤組成物に関する。抗体断片には、限定されるわけではないが、F(ab’)2断片、F(ab)断片、F(ab)発現ライブラリーによって産生される断片、Fv断片、Fd’断片、またはFd断片が含まれる。
【0093】
好ましくは、抗体またはその結合断片は、静脈内、皮下、または腹腔内投与、例えば注射によるなど、非経口的に搬送する。適切な貯蔵寿命および投与との適合性のため、抗体または断片を含んでなる組成物を処方する際に、当該技術分野に知られる、適切な緩衝剤、キャリアー、および他の構成要素が使用可能である。これらの物質は、緩衝剤およびタンパク質安定化剤(例えば多糖)などの補助的な剤を含むことが可能である。
【0094】
より具体的には、抗体またはその結合断片の療法処方は、望ましい度合いの純度を有する抗体またはその結合断片を、所望による生理学的に許容しうるキャリアー、賦形剤、または安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第17版, A. Osol監修, Mack Publishing Company, ペンシルバニア州イーストン, 1985)と、凍結乾燥ケーキまたは水性溶液の形で混合することによって、貯蔵用に調製する。許容しうるキャリアー、賦形剤または安定化剤は、使用する投薬量および濃度で、レシピエントに非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む、単糖、二糖、および他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの塩形成対イオン;および/またはTween、プルロニックまたはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含む。
【0095】
抗体またはその結合断片はまた、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって(例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン微小カプセルおよびポリ[メタクリル酸メチル]微小カプセル)、コロイド薬剤搬送系(例えばリポソーム、アルブミン微小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中で、またはマクロエマルジョン中で、調製した微小カプセル中に捕捉することも可能である。こうした技術は、上記のRemington’s Pharmaceutical Scienceに開示される。
【0096】
in vivo投与に用いる抗体またはその結合断片は、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成前または後に、滅菌ろ過膜を通じてろ過することによって、容易に達成される。抗体またはその結合断片は、通常、凍結乾燥型または溶液中で保存されるであろう。
【0097】
療法抗体組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈内溶液バッグ、または皮下注射針で貫通可能な栓を有するバイアル中に入れる。本発明にしたがった抗体またはその結合断片の投与経路は、既知の方法にしたがい、例えば静脈内、腹腔内、筋内、動脈内、皮下、病巣内経路による注射または注入、エアロゾルまたは鼻内経路によるか、あるいは以下に記載するような持続放出系による。注入または多量(bolus)注射によって、抗体またはその結合断片を連続的に投与する。持続放出調製の適切な例には、タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形物品、例えばフィルム、または微小カプセルの形である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばLangerら, 1981, J. Biomed. Mater. Res., 15:167−277およびLanger, 1982, Chem. Tech., 12:98−105に記載されるようなポリ(2−ヒドロキシメチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号;EP 58,481)、L−グルタミン酸およびガンマエチル−L−グルタミン酸のコポリマー(Sidmanら, 1983, Biopolymers, 22:547−556)、非分解可能エチレン−酢酸ビニル(Langerら、上記)、LUPRON DEPOT.TM.(乳酸−グリコール酸および酢酸ロイプロリドで構成される注射可能微小球体)などの分解可能乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)が含まれる。
【0098】
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、100日以上に渡って分子を放出することが可能であるが、特定のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。被包抗体は、長期間体内に留まると、37℃で水分に曝露された結果、変性するかまたは凝集し、生物学的活性の損失を生じ、そして有効性の変化を生じうる。関与する機構に応じて、抗体安定化のため、合理的戦略を考案することが可能である。例えば、凝集機構が、チオジスルフィド交換を通じた、分子内S−−S結合形成であることが発見されたならば、安定化は、スルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適切な添加剤を用い、そして特定のポリマーマトリックス組成を発展させることによって、達成可能である。
【0099】
持続放出抗体組成物にはまた、リポソーム捕捉抗体またはその結合断片も含まれる。抗体を含有するリポソームは、既知の方法、例えばDE 3,218,121;Epsteinら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688−3692;Hwangら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030−4034;EP 52,322;EP 36,676;EP 88,046;EP 143,949;EP 142,621;日本特許出願83−118008;米国特許第4,485,045号および第4,544,545号;並びにEP 102,324によって調製する。通常、リポソームは、脂質含量が約30モル%コレステロールより高い、小(約200−800オングストローム)単層型であり、選択される比率は、最適な抗体療法用に調整する。
【0100】
療法的に使用しようとする抗体の有効量は、例えば、療法および治療目的、投与経路、治療または療法を受けている患者の年齢、状態、および体重、並びに患者に提供されている付属または補助療法に応じるであろう。したがって、必要に応じて、投薬量を滴定し、そして投与経路を修飾して、最適療法効果を得るのは、当業者には必要で、そして日常的であろう。典型的な1日投薬量は、上述の要因に応じて、約1mg/kgから約100mg/kg以上まで、好ましくは約1から約10mg/kg/日の範囲である可能性がある。典型的には、望ましい効果を達成する投薬量に達するまで、臨床医が抗体を投与するであろう。この療法の進行は、慣用的なアッセイによって容易にモニターされる。
【0101】
多様なアジュバントを用いて、SCLC抗原に対する免疫学的反応を増加させ、そして本発明にしたがった特異的な抗SCLC抗体を誘発することが可能である。免疫しようとする宿主種に応じて、アジュバントには、限定されるわけではないが、フロイント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性剤、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペット(keyhole limpet)ヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにBCG(カルメット・ゲラン桿菌)および坐瘡プロピオンバクテリウム(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれることが可能である。
【0102】
本発明の抗体はまた、抗体が特異的である抗原を所持する、ヒトSCLC細胞、または神経内分泌細胞、例えば神経芽細胞腫の検出のためのin vitro診断適用にも有用である。上に詳細に記載されるような、in vitro診断法には、腫瘍細胞の免疫組織学的または免疫組織化学的検出(例えば、ヒト組織上、または切除した腫瘍標本から解離した細胞上)、あるいは腫瘍関連抗原の血清学的検出(例えば血液試料または他の生物学的液体)が含まれる。免疫組織化学的技術は、本発明の1又はそれより多くの抗体で組織標本などの生物学的標本を染色して、そしてその後、同族(cognate)抗原に結合した抗体を含んでなる抗体−抗原複合体の、標本上の存在を検出することを伴う。標本とのこうした抗体−抗原複合体の形成は、組織中にSCLCが存在する示標となる。
【0103】
標本上の抗体の検出は、免疫酵素技術、例えば免疫ペルオキシダーゼ染色技術、またはアビジン−ビオチン技術、または免疫蛍光技術(例えばCioccaら, 1986, “モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学技術”, Meth. Enzymol., 121:562−79およびIntroduction to Immunology, Kimball監修, (第2版), Macmillan Publishing Company, 1986, pp.113−117を参照されたい)などの、当該技術分野に知られる技術を用いて、達成可能である。血清学的診断技術は、本明細書に上述するように、SCLCを患うと考えられる患者の血清または他の生物学的液体中に分泌されているかまたは「分断」されている、腫瘍関連抗原の検出および定量化を伴う。こうした抗原は、分断された抗原と反応性である抗体を用いて、液体試料中の抗原の存在を検出する、ラジオイムノアッセイ(RIA)または酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)などの、当該技術分野に既知の技術を用いて、体液中で検出可能である(例えばUotilaら, 1981, J. Immunol. Methods, 42:11およびS.T. Fayedら, 1998, Disease Markers, 14(3):155−160を参照されたい)。分断SCLC抗原の検出は、上述のように行う。
【0104】
本発明のさらなる側面において、SCLC表面糖タンパク質に対するモノクローナル抗体または結合断片は、上述の抗原を有する細胞を診断するかまたは同定するため、例えばキットにパッケージングし、そして用いることが可能であるように、検出可能部分で標識して提供する。該キットは、好ましくは、キット使用のための指示マニュアルを含有する。こうした標識の限定されない例には、フルオレセインイソチオシアネートなどのフルオロフォア;色素原、放射性核種または酵素が含まれる。こうした標識抗体または結合断片は、抗原の組織学的位置決定、ELISA、細胞分取と共に、抗原、および例えば抗原を所持する細胞を検出するかまたは定量化する、他の免疫学的技術に使用可能である。
【0105】
本発明の抗SCLC抗体は、狭い腫瘍特異性を示す。これに関連し、代表的なMoAb109.12は、ヒトSCLC抗原と反応したが、ヒト神経内分泌抗原、ヒト(非SCLC)肺、ヒト多発性骨髄腫組織、ヒト卵巣組織(新鮮卵巣組織および細胞株)、ヒト慢性骨髄性白血病組織、およびヒトB細胞腫瘍とは反応しなかった。しかし、SCLC特異的MoAbは、ヒト膵臓癌由来の細胞と免疫反応することが見出され、そして別個のパターンの反応性を示した(図6Aおよび6B)。これに関連して、多様なヒト癌性組織由来の細胞株または細胞株を、本発明にしたがったモノクローナル抗体への結合に関して試験した。109.12および51.2MoAbを代表的な抗体として用いた実験の結果によって、試験した3つの膵臓腫瘍のうち、モノクローナル抗体と反応した2つが、異なるパターンの反応性を示し、そして抗体がまた、別個のMWの細胞表面抗原にも(すなわちSCLC細胞上の〜200kDaの単一抗原に対して、〜200kDa抗原と共に、膵臓癌上の79−120kDaの抗原にも)結合することが立証された。さらに、SCLC特異的MoAbは、ヒトB細胞腫瘍(IM9およびHT)、ヒト乳房組織(新鮮乳房組織および細胞株)およびヒト前立腺組織と反応しなかった。本発明にしたがって、SCLC特異的MoAbは、膵臓癌細胞上の同一抗原の異なるエピトープと免疫反応し、そして狭い腫瘍特異性を示す。
【0106】
SCLC 200kDa表面抗原の性質決定は、この抗原が、MoAb51.2、109.12および37.14によって、ウェスタンブロット解析による単一バンドとして検出されることを示す(例えば代表的なMoAb109.12を用いた図8Bを参照されたい)。およそ200kDaの抗原が統合された(integral)膜タンパク質であることは、煮沸(5分間)後、損なわれないままであること、非イオン性界面活性剤IGEPAL(登録商標)(Sigma、ミズーリ州セントルイス)で可溶化されること、およびSDSで可溶化されることに反映される。109.12モノクローナル抗体にカップリングしたCN−Br活性化セファロースカラム上の抗原のIGEPAL(登録商標)可溶化部分の免疫親和性精製後、200kDa抗原は、2つのバンドを含んでなり、このどちらも、サイズが約75および120MWの間である。
【0107】
内部移行研究において(図7Aおよび7B)、MoAb51.2は、ヒトSCLC細胞に内部移行するが、ヒト神経内分泌癌細胞株の細胞には内部移行しないことが示された。こうした知見は、本明細書に記載するモノクローナル抗体の標的特異性に直接関連する。内部移行の結果は、抗体(類)が毒素にコンジュゲート化することが可能であり、これが癌性細胞への抗体(類)の結合に際して、細胞内部に毒素を搬送し、そしてこうして近傍の細胞および組織を危うくすることなく、細胞を根絶するであろうことを示す。内部移行は、MoAb、例えば51.2の結合特性と平行し、そして抗体、特に51.2 MoAbの高い特異性を強調する。
【0108】
【実施例】
本明細書に示す実施例は、本発明を実行する多様な側面を例示することを意味し、そしていかなる点でも本発明を限定することを意図しない。
【0109】
実施例1
材料および方法
細胞供給源:
記載する実験で利用し、そして評価した細胞および細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)、10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110−2209から購入した。特に、細胞株には、ヒトSCLC細胞株、すなわちDMS114(ATCC第CRL−2066号)、NCI−H209(ATCC第HTB−172号)、NCI−H510A(ATCC第HTB−184号);神経内分泌細胞株、すなわちSK−N−AS(ATCC第CRL−2137号)、Be(2)−/M17(ATCC第CRL−2267号)、MC−IXC(ATCC第CRL−2270号);LnCap(前立腺癌細胞株、ATCC第CRL−1740号);Caski(子宮頚癌細胞株、ATCC第1550号);Namalwa(EBV形質転換腫瘍細胞株、ATCC第CRL−1432号);HT(ATCC第CRL−2260号);IM9(ATCC第CCL−159号);ヒト骨髄腫細胞株(U266、OPM、RPMI−1860、KR12およびNCI H929);神経芽細胞腫細胞株(NCI H2106);および慢性骨髄性白血病細胞株K562(ATCC第CCL−243号)が含まれる。乳癌、肝癌腫、卵巣癌、子宮頚癌などの新鮮な臨床標本は、スタンフォード大学病院(カリフォルニア州)またはNDRI(メリーランド州)から得た。
【0110】
細胞膜の調製:
細胞は、凍結融解周期を3回反復した後、溶解した。膜は、2500rpmで30分間遠心分離した後、細胞溶解物から調製した。細胞質ゾルタンパク質および膜を含有する上清は、さらに、40,000rpmで遠心分離することによって分離した。膜分画を含有するペレットを収集し、そして−20℃で保存した。
【0111】
膜タンパク質を界面活性剤で抽出するため、およそ10mg/mlの濃度の細胞膜を、PBS中、0.312%のIGEPAL(登録商標)CA−630(以前はNonidet P−40として知られた非イオン性界面活性剤)で1:1に希釈し(最終界面活性剤濃度0.156%)、そして氷上で1時間インキュベーションした。調製は、16,000xg、4℃で1時間遠心分離した。可溶性部分(上清)をSDS−PAGEに供し、そしてウェスタンブロットによってMoAbを用いて検出した(図8Bを参照されたい)。
【0112】
マウスおよび免疫:
Balb/cおよびSCID(6−8週齢メス)マウスは、Taconic(ニューヨーク州)より購入した。
【0113】
マウスは、ヒトSCLC細胞(すなわちDMS114、NCI−H209およびNCI−H510A)のプールで免疫した。約5x105−5x106総細胞(Ribiアジュバント、50% v/vを含有する50μl中)を右足蹠に注射した。マウスの左足蹠には、Ribiアジュバント、50% v/vを含有する50μl中のヒト神経内分泌細胞株(SK0N−AS、MC−IXCおよびBe(2)−/M17)のプールを注射した。14日後、SCLC細胞のプール(総数5x104−5x105)でマウスを追加免疫した。第二の免疫3日後、右膝窩リンパ節を除去し、そして抽出した細胞をネズミ骨髄腫Sp2/0細胞と融合させた。
【0114】
B細胞ハイブリドーマの生成:
SCLCに特異的なモノクローナル抗体は、慣用的な方法によって産生した。脾臓細胞をネズミ骨髄腫sp2/0と融合させ、そして最終濃度1x104細胞/ウェルで96ウェルプレートに蒔いた。
【0115】
細胞ELISA:
ELISAアッセイを用いて、ハイブリドーマ培養由来の上清を、SCLC細胞株のプールから抽出した膜調製への直接結合に関してスクリーニングし、そして対照神経内分泌細胞株へのバックグラウンド結合に比較した。SCLCおよび神経内分泌細胞(1x105細胞/ウェル)を、96ウェル組織培養プレート(Costar、マサチューセッツ州ケンブリッジ)に分配し、そしてハイブリドーマ上清(50μl/ウェル)と室温(RT)で30分間インキュベーションした。その後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4(PBS)(Gibco BRL)で3回洗浄した。次に、ビオチン化ウサギ抗マウス(ガンマ)溶液(0.5μg/ml)をウェルに添加した(ウェルあたり50μg)。1時間インキュベーションし、そして上述のように徹底的に洗浄した後、ブロッキング緩衝液で1:10,000に希釈した、ストレプトアビジンコンジュゲート化西洋ワサビペルオキシダーゼ(Zymed、カリフォルニア州)をウェルに添加し、そしてその後、30分間インキュベーションした。基質(100μl/ウェルのテトラメチルベンジジン(DAKO Corporation、カリフォルニア州))を添加し、そしてプレートをRTで30分間インキュベーションした。100μl/ウェルの2N H2SO4を用いて反応を停止した。自動化ELISAプレート読み取り装置を用いて、450nmの波長で、プレートを読み取った。
【0116】
ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング:
SDS−ポリアクリルアミドゲル(8%)を標準的プロトコルにしたがって調製し、そしてウェスタンブロッティングに用いた。膜調製またはホモジネート(50μg/レーン)(例えば腫瘍細胞株、新鮮な正常ヒト組織、および新鮮な切除ヒト腫瘍)を、上記のSDSゲルに装填し、そして分画した。TBST緩衝液(20mM Tris−塩基、137mM NaCl{pH7.6}、および0.05% Tween20)中、10% BSAを含有するブロッキング緩衝液中で、ブロットを1時間インキュベーションした後、一次MoAb(0.1μg/ml)中で1−2時間インキュベーションした。TBST緩衝液中で3回洗浄した後、二次抗体にコンジュゲート化した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(0.05μg/ml)とブロットを30分間インキュベーションした。ブロットは、製造者の指示にしたがって、ECLTM(Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ)ウェスタンブロット化学発光検出試薬で現像した。
【0117】
SCLC特異的MoAbに認識される糖タンパク質(類)中の炭水化物の評価:
上述のように調製したSCLC由来の膜ブロットを、一団のレクチン(例えばWGA、コムギ(Triticum vulgarまたはwheat)胚芽;PNA、ピーナッツ(Arachis hypogaeaまたはpeanut);BPA、ムラサキソシンカ(Bauhinia purpureaまたはcamel’s foot tree);SBA、ダイズ(Glycine maxまたはsoybean);MPA、オーセージオレンジ(Maclura pomiferaまたはosage orange);UEA−I、ハリエニシダ(Ulex europaeusまたはgorse);およびConA、タチナタマメ(Concanavalia ensiformisまたはjack bean)で試験して、特定の糖残基の存在を決定する。あるいは、放射標識溶解物を、多様なレクチン−アガロースビーズ(Vector Labs、カリフォルニア州バーリンゲーム)で前吸収し、そしてその後、本発明のモノクローナル抗体とインキュベーションする。抗原(該MoAbに結合)は、抗マウスIgでコーティングしたビーズと上清をインキュベーションすることによって免疫沈降し、そしてその後、SDS−PAGEによって分画する。免疫沈降材料から抗原が除去されることは、あらかじめ除去したレクチンに抗原が結合する、そしてしたがって、それぞれの糖特異性を発現する示標となるであろう。
【0118】
炭水化物同定のための別の代替プロトコルは、レクチン特異的抗体での競合を通じた、抗原へのモノクローナル抗体結合の阻害を伴う。レクチン特異的抗体は、非コンジュゲート型、あるいはビオチンまたはフルオレセインへのコンジュゲート型いずれかで入手可能である。選択が可能なことによって、多様な方法を用いたアッセイの実行が可能になる。レクチンおよびその対照を含有する商業的キット(Vector Labs)が入手可能である。該レクチンスクリーニングキットは、研究者に、7つのレクチンまたはレクチンコンジュゲートの一団を提供するよう設計される。レクチンは、多様な糖特異性を提供するよう選択されており、そして個々に提供する試薬として、同一の高い品質のものである。
【0119】
補体仲介細胞傷害性:
腫瘍細胞は、96ウェルプレートにおいて、RPMI+10% FBS中で、1x105細胞/ウェルでインキュベーションする。プロテインG精製SCLC特異的MoAbまたはアイソタイプ対照抗体は、ヒト補体の存在下で、1μg/mlから10μg/ml、37℃および5% CO2で、1時間添加する。対照プレートは、抗体のみ、補体のみ、1% SDS、完全培地のみ、および2μg/ml PHAとインキュベーションした腫瘍細胞を含有する。プレートを、37℃で12−16時間、1μCi/ウェルの3H−チミジン(Dupont−NEN)でパルス処理し、採取して、そしてWallac Trilux MicroBetaカウンターで読み取る。溶解パーセントは:100−{[平均カウント/平均自発的増殖(CM)]x100}として計算する。調整した溶解パーセントは、[平均溶解パーセント/平均最大溶解]x100として計算する。
【0120】
腫瘍細胞のin vivo根絶:
SCLCまたは対照腫瘍細胞を、C.B−17 SCIDベージュマウス(Taconic、ニューヨーク州)に腹腔内(i.p.)注射する。各マウスには、洗浄し、そしてPBSに再懸濁した、1x106細胞を投与する。10日後、200μgプロテインG精製SCLC特異的MoAb、またはアイソタイプマッチ対照抗体を、週3回3週間i.p.注射する。巨大腫瘍によって無能力になったマウスは、安楽死させる。腹水増加に関してマウスを監視し、そして結果は、生存割合としてプロットする。
【0121】
抗体の内部移行:
SCLC細胞内部へのMoAbの内部移行を測定する研究を行う。MoAbは、リシンA鎖毒素にコンジュゲート化し、免疫毒素を形成する。内部移行は、癌細胞のどの程度がリシンA鎖毒素に殺されるかを測定することによって評価されるであろう(I.Hellstromらに対する米国特許第5,491,088号、02/13/96発行)。
【0122】
実施例2
陽性ハイブリドーマは、SCLCに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する
実施例1に記載するように免疫したマウスから樹立したB細胞ハイブリドーマは、ヒト神経内分泌細胞株(SK−N−AS、MC−IXC、Be(2)−M17)のプールに比較して、ヒトSCLC細胞株(すなわちDMS114、NCI−H209、NCI−H510A)のプールを用いた細胞ELISAによって、スクリーニングした。SCLCに特異的に結合する能力を有するモノクローナル抗体の産生に基づいて、170のプールから11のハイブリドーマを選択した。クローンB細胞ハイブリドーマを樹立するため、限界希釈培養(ウェルあたり1細胞)を用意した。生じたサブクローンは、上述のようにスクリーニングした。SCLC細胞に対する吸収に関して、最高の平均値を示す12の代表的なサブクローンを、さらなる試験用に選択した。値は、SCLC細胞から神経内分泌細胞の平均O.D.を減じることによって調整した(図1)。選択したモノクローナル抗体産生B細胞ハイブリドーマは、アイソタイプ決定して、Ig遺伝子使用(すなわち産生した抗体の免疫グロブリンアイソタイプ)を確立すると共に、サブクローニングしたハイブリドーマのクローン性を立証した。
【0123】
実施例3
MoAbはSCLCの細胞膜に存在する抗原と反応する
選択した一団のモノクローナル抗体は、対照(神経内分泌または多発性骨髄腫)細胞株と比較した、SCLC細胞の染色に関して、FACSによって試験した。4つのMoAb、26.1、141.7、92.7、および37.14は、対照細胞株と比較した際、SCLC細胞のより強い染色を示した。還元条件下で行ったウェスタンブロッティングを用いて、選択したMoAbの特異性をさらに解明した。MoAb51.2および109.12は、SCLC細胞株(DMS114、NCI−H209、およびNCI−H510A)のプールを含有するレーンにおいて、約200kDaのMWを持つ抗原を検出した(図2および3)。単一のぼやけたバンドの出現は、MoAbに認識される分子が、一本鎖糖タンパク質であることを示す。
【0124】
神経内分泌(SK−N−AS、MC−IXC、およびBe(2)−M17)および多発性骨髄腫(RPMI 8226およびU266)細胞株のプールから単離した対照細胞膜調製は、それぞれ、MoAb109.12に染色されなかった。MoAb51.2では、有意により薄いバンドが、神経内分泌レーンに出現し、そしてMMレーンには欠けていた。この観察は、認識されるSCLC抗原が、緊密に関連する神経内分泌細胞に比較して、SCLC細胞で過剰増幅されていることを示す可能性がある。該抗原は、SCLC細胞から発生的により遠いMM細胞によっては発現されないようである。
【0125】
モノクローナル抗体37.14は、低分子量(35−50kDaの間)を有する抗原と反応した。後者の抗原は、分子量が緊密に関連する、2つの断片または鎖を含んでなるようであった(図4)。興味深いことに、MoAb26.1は、SCLC特異的細胞表面分子を明確に認識したが、還元条件下で行ったウェスタンブロットにおいて、SCLC膜と反応するのに失敗した。この結果は、MoAb26.1に認識されるエピトープが、SDSの存在下での直線化処理によって破壊される、コンホメーションエピトープであることを示す可能性がある。
【0126】
実施例4
免疫組織化学解析
正常ヒト肺組織およびSCLC疾患組織に対して行う免疫組織化学解析(図9A−9D)のため、以下の方法および材料を使用した:
組織供給源:組織学的に正常なヒト組織および腫瘍は、手術および剖検標本から得て、そして免疫組織化学解析用に調製した(IMPATH、カリフォルニア州ロサンゼルス)。新鮮な組織をOCT化合物(Miles Laboratories, Inc.、イリノイ州ネーパービル)に包埋し、そして液体窒素で冷却したイソペンタン中で瞬間凍結した。標本は必要になるまで−80℃で保存した。組織を5ミクロンでカットし、正に荷電したスライド上に置き、そして風乾した。ヒトMM細胞株(U266)は陽性対照として働き、そして2つのB細胞株(IM9、HT)は、陰性対照として用いた。
【0127】
試薬:51.2MoAbは、免疫組織化学解析において試験抗体として用いた。陰性試薬対照、ネズミIgG1は、DAKO Corporation(カリフォルニア州カーピンテリア)から購入した。抗体は、一次抗体希釈剤(Research Genetics、アラバマ州ハンツビル)で、作業濃度に希釈した。
【0128】
免疫組織化学:研究は、製造者の指示にしたがって、間接的ペルオキシダーゼコンジュゲート化免疫組織化学検出技術;DAKO Envision+TM系(DAKO Corporation)を用いて行った。クリオスタット−カット切片を−80℃フリーザーから取り出し、そして30分間風乾した。スライドは、アセトン中、4℃で5分間固定し、そしてpH7.2のリン酸緩衝生理食塩水(PBS;Amresco、オハイオ州ソロン)で洗浄した。内因性ペルオキシダーゼ活性は、過酸化水素溶液で5分間処理し、その後PBSで洗浄してブロッキングした。
【0129】
スライドは、51.2モノクローナル抗体またはアイソタイプマッチ対照抗体と、室温で30分間インキュベーションし、その後PBSで洗浄した。次に、スライドは、ペルオキシダーゼ標識デキストランポリマーにコンジュゲート化した抗マウス抗体と、室温で30分間インキュベーションし、そしてその後、PBSで洗浄した。ペルオキシダーゼ反応は、3,3’−ジアミノベンジジン四塩酸溶液と5±1分間インキュベーションすることによって視覚化した。スライドは、水道水で完全に洗浄し、修飾ハリスヘマトキシリン(American Master Tech. Scientific Inc.、カリフォルニア州ロディ)で対比染色し、0.25%酸アルコールに浸し、0.2%アンモニアで青くし、段階的なアルコールで脱水し、キシレンで清浄にし、そしてカバーをかぶせた。
【0130】
対照:陽性対照組織切片は、U266細胞株から調製した凍結細胞ブロック由来であった。陰性対照切片は、IM9およびHT細胞株から調製した凍結細胞ブロック由来であった。陰性試薬対照には、一次抗体の代わりに、試験物品と同一抗体濃度で、アイソタイプマッチ対照抗体を用いた。陰性対照切片は、アイソタイプ対照抗体を適用した組織切片を指す。
【0131】
スライドの解釈:染色したスライドの解釈は、顕微鏡検査によって行った。スライド上の組織の形態学的概観は、適切な量の組織が存在するかどうか、そして指定した組織が適切に示されているかどうかを決定する。上記の基準に合わない試料は、解析から除外した。試験物品の染色強度は、対照スライドの強度に比較して判断した。陰性試薬対照で標識した切片の染色は、「バックグラウンド」とみなした。
【0132】
固定解析:解析は、陽性および陰性対照細胞株、それぞれU266およびIM9を用いて行った。評価した固定剤(未固定、アセトン、エタノール、メタノール/アセトン、および10%中性緩衝ホルマリン)のうち、4℃5分間のアセトンが、形態学的提示および染色強度の最適な組み合わせを生じた。
【0133】
本明細書に引用する、すべての特許出願、発行特許、公表論文および参考文献、並びに教科書は、本発明が関連する技術分野の状態をより十分に説明するため、本明細書に完全に援用される。
【0134】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、上述の組成物および方法に、多様な変更を行うことが可能であるため、上記説明に含有するか、付随する図に示すか、または付随する請求項に定義するすべての内容は、例示と解釈し、そして限定する意味でないと意図する。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、本明細書に記載するようなモノクローナル抗体が、SCLC細胞上に存在する細胞表面抗原に高い結合特異性を示すことを立証する、ELISAイムノアッセイの結果を示す。
【図2】 図2は、SCLC抗原に対するモノクローナル抗体51.2(MoAb51.2)の特異性を評価するため、還元条件下で行ったウェスタンブロットのスキャン結果を示す。すべてのレーンは、示した細胞株由来の膜調製の等しい総濃度を含有した。膜調製は、レーンあたり50マイクログラムの量で、SDSゲルに装填する。レーン1:SCLC細胞膜;レーン2:神経芽細胞腫細胞膜;レーン3:多発性骨髄腫(MM)細胞膜。図2に示すように、MoAb51.2は、SCLC細胞上に最も有意に存在し、そして約200kDaのMWを有する抗原を検出した。単一のぼやけたバンドの出現は、MoAb51.2に認識される分子が、一本鎖糖タンパク質であることを示す。神経内分泌細胞(すなわちSK−N−AS、MC−IXCおよびBe(2)−M17)のプール由来の細胞膜を含有する神経芽細胞腫レーン2に、うすいバンドが現れたが、MM細胞(RPMI 8226およびU266)のプール由来の細胞膜で構成される骨髄腫(MM)レーン3には欠けていた。この結果は、起源が神経内分泌である、緊密に関連する神経芽細胞腫細胞と比較して、認識される抗原が、SCLC細胞で、過剰発現されるか、または増幅されていることを示す可能性がある。神経芽細胞腫細胞より、SCLC細胞と発生的により遠いMM細胞は、認識される抗原を発現しないようである。
【図3】 図3は、SCLC抗原に対するモノクローナル抗体109.12(MoAb109.12)の特異性を評価するため、還元条件下で行ったウェスタンブロットのスキャン結果を示す。すべてのレーンは、示した細胞株由来の膜調製の等しい総濃度を含有した。レーン1:多発性骨髄腫(MM)細胞膜;レーン2:神経芽細胞腫細胞膜;レーン3:SCLC細胞膜。図3に示すように、MoAb109.12は、SCLC細胞上に有意に存在し、そして約200kDaのMWを有する抗原を検出した。単一のぼやけたバンドの出現は、MoAb109.12に認識される分子が、一本鎖糖タンパク質であることを示す。神経内分泌細胞(すなわちSK−N−AS、MC−IXCおよびBe(2)−M17)のプール由来の細胞膜を含有する対照膜調製、レーン2、およびMM細胞(すなわちRPMI 8226およびU266)のプール由来の細胞膜を含有する対照膜調製、レーン1は、MoAb109.12に染色されなかった。
【図4】 図4は、SCLC抗原に対するモノクローナル抗体37.14(MoAb37.14)の特異性を評価するため、還元条件下で行ったウェスタンブロットのスキャン結果を示す。すべてのレーンは、示した細胞株由来の膜調製の等しい総濃度を含有した。レーン1:SCLC細胞膜;レーン2:神経芽細胞腫細胞膜;レーン3:多発性骨髄腫(MM)細胞膜。図4に示すように、MoAb37.14は、約35−50kDaの範囲のMWを有するSCLC抗原を検出した。この抗原は、分子量が緊密に関連する、2つの断片または鎖からなるようであった。神経内分泌細胞(すなわちSK−N−AS、MC−IXCおよびBe(2)−M17)のプール由来の対照膜調製、レーン2、およびMM細胞(すなわちRPMI 8226およびU266)のプール由来の対照膜調製、レーン1は、MoAb37.14に染色されなかった。
【図5】 図5は、SCLC細胞、神経芽細胞腫細胞および多発性骨髄腫細胞上に存在する抗原に対して、本発明にしたがって生成したSCLC特異的モノクローナル抗体26.1の反応性の蛍光活性化細胞選別装置(FACS)解析を示す。(IMM010)26.1ハイブリドーマクローン由来のモノクローナル抗体を含有する上清を、多様な細胞種との抗体反応性に関してアッセイした。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識抗マウスIgGを用いて、細胞に結合したMAb21.6の存在を検出した。
【図6】 図6Aおよび6Bは、本発明にしたがった代表的な抗SCLC抗体を使用した、腫瘍特異性研究の結果を示す。図6Aでは、ヒトSCLC組織(NCI−H209)、ヒト神経内分泌組織(Be(2)−M17)、ヒト(非SCLC)肺組織(NCI−H2106)、ヒト多発性骨髄腫組織(RPMI−8226)、ヒト膵臓組織(HPAC)、ヒト卵巣組織(新鮮卵巣組織およびMDAH−2774)、ヒト慢性骨髄性白血病組織(K562)およびヒトB細胞腫瘍(Namalwa)から調製した膜を、SDS−ゲル(4−20%)上で分画した。ゲルをニトロセルロース上にブロッティングし、そして代表的なIMM010.109.12MoAbとインキュベーションした。図6Bでは、ヒトSCLC組織(NCI−H209)、ヒト膵臓組織(HPAC、BxPc−3およびMia−PaCa2)、ヒトB細胞腫瘍(IM9およびHT)、ヒト乳房組織(新鮮乳房組織およびT−47D)およびヒト前立腺組織(LnCap)から調製した膜を、SDS−ゲル(4−20%)上で分画した。ゲルをニトロセルロース上にブロッティングし、そして本発明のIMM010.109.12MoAbとインキュベーションした。
【図7】 図7Aおよび7Bは、本発明のMoAb51.2を用いた、内部移行研究の結果を示す。図7A:MoAb IMM010.51.2(MoAb51.2)でのヒト神経内分泌癌細胞(Be(2)−M17)の細胞内染色。細胞は、IMM010.51.2で細胞外染色した。固定および透過処理後、細胞は、フィコエリトリン(PE)コンジュゲート化モノクローナル抗体またはPEコンジュゲート化アイソタイプ対照で、細胞内を染色した。ヒストグラムにおいて、黒べたの部分は、アイソタイプ対照抗体に検出される染色の量を示す。より濃く太い線は、抗マウスIg抗体に検出される染色の量を示す。図7B:MoAb IMM010.51.2でのヒトSCLC細胞(NCI−H209)の細胞内染色。細胞は、IMM010.51.2で細胞外染色した。固定および透過処理後、細胞は、PEコンジュゲート化Ig抗体またはPEコンジュゲート化アイソタイプ対照で、細胞内を染色した。ヒストグラムにおいて、黒べたの部分は、アイソタイプ対照抗体に検出される染色の量を示す。より濃く太い線は、抗マウスIg抗体に検出される染色の量を示す。
【図8】 図8Aおよび8Bは、モノクローナル抗体109(MoAb109.12)が、界面活性剤でSCLC細胞膜を処理した後、より低いMWの2サブユニットSCLS抗原を同定することを示す。細胞膜は、NCI−H209細胞株のSCLC培養から抽出した(実施例1)。膜調製の一部は、NP−40(2%)で可溶化した。膜調製は、SDS勾配ゲル(4−20%)上で分画し、これをニトロセルロース上にブロッティングし、そしてMoAb109.12とインキュベーションした。図8Aは、クーマシーブルーでゲルを染色した後の、分画したSCLC細胞膜のタンパク質スキャンを示す。図8Bは、NP−40で可溶化したもの(すなわち(+)界面活性剤)に比較した、非可溶化して(すなわち(−)界面活性剤)MoAb109.12とインキュベーションしたSCLC細胞膜のウェスタンブロットのスキャンを示す。SCLC膜の界面活性剤処理は、図8Bに示すように、一本鎖、およそ200kDaの高MWの抗原を、2サブユニットのより低MWの抗原に変換することが示された。
【図9】 図9A−9Dは、臨床試料に対する、アイソタイプマッチ対照モノクローナル抗体に比較した、本発明にしたがった代表的なモノクローナル抗体、MoAb51.2を用いた免疫組織化学的研究の結果を例示する。結果は、正常ヒト肺切片とは免疫反応性を欠くのに対して、SCLC患者から切除した癌性組織と51.2MoAbが、特異的でそして優先的な免疫反応性を持つことを示す。図9Aは、正常ヒト肺組織を染色するのに用いた、対照MoAbの結果を示し;図9Bは、正常ヒト肺組織のMoAb51.2染色の結果を示す。図9Cは、ヒトSCLC組織の対照MoAb染色の結果を示し;図9Dは、ヒトSCLC組織のMoAb51.2染色の結果を示す。
Claims (17)
- アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2360号(MoAb51.2)、ATCC寄託番号第PTA−2358号(MoAb37.14)およびATCC寄託番号第PTA−2357号(MoAb109.12)からなる群より選択されるATCC寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される、モノクローナル抗体またはその結合断片。
- モノクローナル抗体またはその結合断片に認識される細胞表面糖タンパク質抗原が、ヒト小細胞肺癌細胞表面上に存在し、そして還元条件下のSDS−PAGEによって測定されるように、約200kDaの分子量を有する単一グリコシル化ポリペプチドである、請求項1記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
- 結合断片が、Fab断片、F(ab)2断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fd断片、Fd’断片およびFv断片からなる群より選択される、請求項1又は請求項2記載のモノクローナル抗体またはその結合断片。
- アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2360号(MoAb51.2)、ATCC寄託番号第PTA−2358号(MoAb37.14)およびATCC寄託番号第PTA−2357号(MoAb109.12)からなる群より選択されるATCC寄託番号を有する、ハイブリドーマ細胞株。
- 固体マトリックスに結合した、請求項1から請求項3のいずれか1項記載の、モノクローナル抗体またはその結合断片。
- 請求項1から請求項3のいずれか1項記載のモノクローナル抗体またはその結合断片、および薬学的に許容しうるキャリアー、賦形剤、または希釈剤を含んでなる、組成物。
- モノクローナル抗体またはその結合断片が、ヒト小細胞肺癌細胞の表面上に存在するが、正常肺細胞上、またはヒト多発性骨髄腫細胞上に存在しない抗原を認識する、請求項6記載の組成物。
- モノクローナル抗体またはその結合断片であって、該抗体が(i)アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2360号(MoAb51.2)を有するハイブリドーマ細胞株から産生されるモノクローナル抗体、(ii)アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2357号(MoAb109.12)を有するハイブリドーマ細胞株から産生されるモノクローナル抗体;(iii)アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2358号(MoAb37.14)を有するハイブリドーマ細胞株から産生されるモノクローナル抗体からなる群より選択され;ここでモノクローナル抗体(i)−(iii)はヒト小細胞肺癌細胞上の細胞表面糖タンパク質抗原に結合する、前記モノクローナル抗体または断片;および薬学的に許容しうるキャリアー、賦形剤または希釈剤を含んでなる、組成物。
- 検出可能部分で標識された、請求項1から請求項3のいずれか1項記載のモノクローナル抗体。
- 検出可能部分が、フルオロフォア、発色団、放射性核種、化学発光剤、生物発光剤および酵素からなる群より選択される、請求項9記載のモノクローナル抗体。
- 患者において、膵臓腫瘍細胞または癌細胞を検出する方法であって:請求項1から請求項3のいずれか1項記載のモノクローナル抗体またはその結合断片を、患者から採取された膵臓細胞とインキュベーションし;そして膵臓細胞へのモノクローナル抗体またはその結合断片の結合を検出し、それによって、患者における膵臓腫瘍細胞または癌細胞を検出することを含んでなる、前記方法。
- モノクローナル抗体が、ATCC寄託番号第PTA−2357号を有するMoAb109.12である、請求項11記載の方法。
- モノクローナル抗体が、フルオロフォア、発色団、放射性核種、化学発光剤、生物発光剤および酵素からなる群より選択される検出可能標識で標識されている、請求項11記載の方法。
- 請求項1から請求項3のいずれか1項記載のモノクローナル抗体またはその結合断片、および薬学的に許容しうるキャリアー、賦形剤、または希釈剤を含んでなり、該モノクローナル抗体またはその結合断片が、ヒト膵臓癌細胞表面上に存在する抗原を認識する、組成物。
- 患者において、小細胞肺癌の存在および度合いを検出する方法であって:
患者由来の体液試料をモノクローナル抗体またはその断片と接触させることにより、小細胞肺癌に関連する抗原に特異的に結合させ、ここで前記モノクローナル抗体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2360号(MoAb51.2)、ATCC寄託番号第PTA−2358号(MoAb37.14)およびATCC寄託番号第PTA−2357号(MoAb109.12)からなる群より選択されるATCC寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体であり;そして
前記モノクローナル抗体またはその断片の、前記抗原への結合のレベルを測定することを含み、
ここで前記モノクローナル抗体またはその断片の結合の量と、前記患者における小細胞肺癌の存在および度合いの間に相関がある、前記方法。 - 小細胞肺癌疾患に対する療法の有効性をモニターする方法であって:
療法を受けている患者から採取した体液試料をモノクローナル抗体またはその断片と接触させることにより、小細胞肺癌に関連する抗原に特異的に結合させ、ここで前記モノクローナル抗体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2360号(MoAb51.2)、ATCC寄託番号第PTA−2358号(MoAb37.14)およびATCC寄託番号第PTA−2357号(MoAb109.12)からなる群より選択されるATCC寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体であり、
前記モノクローナル抗体またはその断片の前記抗原への結合のレベルを定期的に測定し;そして
前記モノクローナル抗体またはその断片の前記抗原への結合のレベルの変化を治療の有効性と相関させることを含み、
ここで療法経過中のより早い時点で測定した前記モノクローナル抗体またはその断片の前記抗原への結合のレベルに比較して、より遅い時点で測定した前記モノクローナル抗体またはその断片の前記抗原への結合のレベルがより低いことが、小細胞肺癌疾患療法が有効である示標となる、前記方法。 - 患者において、小細胞肺癌の存在を検出する方法であって:
(a)患者から採取した細胞、組織、または体液をモノクローナル抗体またはその断片と接触させることにより、小細胞肺癌に関連する抗原に特異的に結合させ、ここで前記モノクローナル抗体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、そしてATCC寄託番号第PTA−2360号(MoAb51.2)、ATCC寄託番号第PTA−2358号(MoAb37.14)およびATCC寄託番号第PTA−2357号(MoAb109.12)からなる群より選択されるATCC寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体であり、
(b)前記モノクローナル抗体またはその断片の前記抗原への結合のレベルを測定し;そして
(c)(b)の測定した前記モノクローナル抗体またはその断片の前記抗原への結合のレベルを、正常ヒト対照由来の細胞、組織、または体液中の前記モノクローナル抗体またはその断片の前記抗原への結合のレベルと比較することを含み、
ここで正常対照に対して、患者において測定した前記モノクローナル抗体またはその断片の前記抗原への結合のレベルが増加していることが、小細胞肺癌の存在と関連する、前記方法。
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