JP2005538931A - ラムノース結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
a)分子量が約65〜70kDa、より好ましくは66〜69kDaであることと、
b)pIが10より大きく、または3未満であることと、
c)ソラマルギンのラムノース部分に結合する場合、解離定数が約1.5×10-6であることと、
d)実施例1に記載の条件下で、実施例1にしたがって調製したラムノースアフィニティカラムに結合するように構成されていることと、
e)100mMのラムノース溶液を使用して実施例1に記載のカラムから溶離するように構成されていることと、
f)水溶液に不溶であることと、
g)約2%を超える界面活性剤を含む高度に変性された緩衝液に溶解することと
を有する単離されたRBPを提供する。
本発明は、非癌細胞上よりも新生物(癌)細胞上に豊富なレクチン群の細胞受容体の単離および同定に基づく。受容体(「RBP」)は、ラムノースに結合してインターナリゼーションするように構成されているので、有益な診断ツールおよび治療ツールに相当する。
a)分子量が約65〜70kDa、より好ましくは66〜69kDaであることと、
b)pIが10より大きくまたは3未満であることと、
c)ソラマルギンのラムノース部分に結合する場合、解離定数が約1.5×10-6であることと、
d)実施例1に記載の条件下で、実施例1にしたがって調製したラムノースアフィニティカラムに結合するように構成されていることと、
e)100mMラムノース溶液を使用して実施例1に記載のカラムから溶離するように構成されていることと、
f)水溶液に不溶であることと、
g)約2%を超える界面活性剤を含む高度に変性された緩衝液に溶解することと
を有する単離されたRBPを提供する。
本発明のRBPを、RBPと相互作用する(例えば、結合する)化合物を同定するためのアッセイで使用することができる。
本発明のRBPまたはそのアゴニストを、癌の診断および予後評価に使用することができる。このような方法には、例えば、本明細書中に記載の抗体などの試薬を使用することができる。特に、このような試薬を使用して、例えば、正常な細胞と比較したRBPの過多を検出することができる。
本発明のアゴニストのRBPに結合して標的細胞中にインターナリゼーションする能力は、癌細胞などのRBP負荷の高い細胞への薬剤の優先的送達に有用である。
本発明はまた、本発明のアゴニストおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物または獣医学的組成物を意図する。好ましくは、組成物は、グリコシドなどの細胞死を引き起こすように構成された薬剤をさらに含む。本発明のタンパク質薬の薬学的組成物は、非経口投与(すなわち、皮下、筋肉内、または静脈内)に特に有用である。非経口投与のための組成物は、適切なキャリア(好ましくは、水性キャリア、乳濁液)に溶解されているか許容可能なキャリア中のミセルとして処方された本発明の化合物またはその反応混液を含み得る。例えば、水、緩衝化された水、0.4%生理食塩水、0.3%グリセリンなどの種々の水性キャリアを使用することができる。これらの溶液は、滅菌され、一般に特定の物質を含まないことが好ましい。これらの溶液を、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。組成物は、pH調整剤および緩衝剤などの生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容可能な補助剤をさらに含んでもよい。
本発明の薬学的組成物を、患者への局所適用に適合させることができる。
好ましい治療計画に依存して、本発明の組成物の投与に種々の局所送達系が適切であり得る。水性キャリアまたは非水性キャリアでの本発明のアゴニストの溶解または組み合わせによって局所処方物を生成することができる。一般に、組成物に導入することができ、且つ非炎症性のアゴニストまたは任意の他の有効成分と認め得るほどに反応しない任意の液体、クリーム、ゲル、または類似の物質が適切である。適切な噴霧不可能な粘性、半固体、または固体形態も使用することができ、これには、局所投与に適合し、且つ好ましくは水よりも動的粘度が高いキャリアが含まれる。
1つまたは複数のRBPのエピトープもしくはRBPの保存変異型のエピトープまたはRBPのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体も本発明に含まれる。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記の任意のエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
[材料/方法]
1.ラムノースプローブの標識
ラムノース−ITC(Sigma R6881;RMM 297.3)のDMSOへの溶解、10mMの重炭酸ナトリウム(pH9.1)での1mg/mlへの希釈、1:1または5:1のモル比でのビオチンヒドラジド(Sigma,RMM258.3)の添加、および室温で16時間の反応の進行によってビオチンラムノース−ITC(BRITC)を形成させた。
ストレプトアビジンセファロース抱合カラム(Amersham 17−5112−01)またはビオチン標識ラムノース(BRITC)の理論上の容量(60μg/ml)を有するフリーレジン(17−5113−01)を使用した。過剰量のBRITCをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に溶解し、0.2ml/分の低速で30分間予備平衡化カラムに循環させた。BRITC−PBS溶液のHPLC分析によってBRITCの首尾のよい結合をモニタリングした。
パッケージングした洗浄細胞を、凍結融解(−80℃/4℃)および短時間の超音波処理(マイクロチッププローブを備えた375W超音波処理機を使用した30〜40秒間の50%dutyのパルス)によって溶解した。タンパク質分解を最小にするために、プロテアーゼインヒビター反応混液(Roche 1−836−170)の存在下で細胞を溶解した。
MSSは、5Mの尿素、2Mのチオ尿素、0.002Mのn−トリブチルホスフィン、0.5%のファルマライトキャリア両性電解質(pH3〜10)(Pharmacia,Uppsala)(二次元調製物のみ)、2%の3−([3−コラミドプロピル]−ジメチルアンモニオ)−1−プロパンスルホン酸(CHAPS)、2%のカプリルイルスルホ−ベタイン、および0.001%のオレンジG色素を含む。DNA汚染を排除するために、材料をエンドヌクレアーゼ(EC3.1.30.2)でも処理した。
プレキャストTris−HCl 4〜20%ポリアクリルアミド勾配ゲル(Bio−Rad)を、電極緩衝液Tris/グリシン(pH8.3)と共に使用した。サンプルローディング溶液:Tris(pH6.8)、0.1%SDS、グリセロール、ジチオスレイトール、ブロモフェノールブルーマーカー。電気泳動条件:100Vで90分間。
銀を用いた染色またはクーマシーR250を含む水/メタノール/酢酸での染色のいずれかによってこれを行った。Fluoro−imager(Pharmacia)を使用して、蛍光を視覚化した。
MSSを使用して、108〜109個のA2058細胞の全細胞溶解調製物を調製した。次いで、可溶化タンパク質を140mMのNaCl、2mMのMgCl2、および2mMのCaCl2(pH7.4(HBS2+))を含むHEPES緩衝化生理食塩水で50倍に希釈し、コントロールカラム(ラムノースなし)およびラムノースアフィニティカラムに連続して通過させた。各カラムをHBS2+で洗浄し、100mMラムノースで溶離した。アクリルアミドミニゲルおよび1D SDS−PAGEおよびその後の銀を用いた染色を使用して画分を分析した。
分子量約65kDのバンドが溶離画分で視覚化された(図1)。BRITCを含まない対応するコントロールカラム由来の溶離物ではバンドは視覚化されなかった(結果を示さず)。
[材料/方法]
(a)ラムノースプローブの標識
10mMの重炭酸ナトリウム(pH9.1)中での1:10のモル比でのラムノース−ITCとフルオレセインアミン(Sigma F1148,RMM 347.3)との反応によってフルオレセインラムノース−ITC(FRITC)を形成させた。
実施例1のとおり。
実施例1のとおり。
実施例1のとおり。
実施例1のとおり。
顕微鏡に準拠したチャンバーに低密度でA2058細胞をコートした。細胞をHBS2+で洗浄し、FRITCと37℃で5〜15分間インキュベートした(最も高いDMSO濃度=2.5%)。FRITCを除去し、細胞をHBS2+で2回洗浄し、可視光線顕微鏡で試験した。0〜100μMフルオレセイン−アミンを使用してインキュベーションを繰り返し、25μMおよび6μMのFRITCについては1000倍過剰の非標識ラムノースを使用して繰り返した。
40mlの培養フラスコ中に調製したA2058細胞を、上記のようにFRITC(5μMまたは10μM)とインキュベートし、HBS2+で1回洗浄した。使用直前にカルボニルジイミダゾール(Ardrich 115533)を1MのDMSOに溶解した。このストック溶液を、HBS2+またはDMSOで100μM〜10mMに希釈し、室温で細胞に添加した。15分後、架橋を除去し、フラスコを氷上で保存した。次いで、掻き取りによって細胞をフラスコから取り出し、MSS溶解緩衝液に入れた。上記のように、タンパク質画分をSDS−PAGEに供し、ゲルを視覚化した。
5μMのFRITCを使用して、上記の方法7にしたがって調製した架橋細胞を、細胞の掻き取りによって350μlのMSSに溶解した。この材料を、18cm Immobiline DryStrip(pH3〜10)(Amersham)へのローディングによって等電点電気泳動用に調製し、ストリップを平衡化して約150kVhr(電圧勾配:200Vで12時間;250Vで1.5時間、500Vで2時間、1000Vで2.5時間、8000Vで19時間)で電気泳動した。
架橋実験由来のタンパク質成分の電気泳動プロフィールを、図2Aおよび図2Bに示す。図2Aは、蛍光スキャニングによって視覚化されたフルオレセインに架橋したタンパク質を示し、図2Bはクーマシーブリリアントブルーで染色された全タンパク質を示す。
[材料/方法]
前に記載のようにフルオレセインタグ化ラムノースプローブ(FRITC)を調製し、これを使用してA2058細胞を染色した。
インキュベーション後の細胞は蛍光を発することが見出され、細胞上のラムノース結合タンパク質の存在が確認された。細胞の画像を図4に示す。染色細胞のより綿密な調査により、細胞核中の染色濃度の増加が示され、ラムノースプローブも核膜内に取り込まれたことが示唆される。FRITCと濃度が10mMのラムノースを含まない細胞との同時インキュベーションによって染色を阻害することができることが見出された。
[材料/方法]
異なるサイズの細胞集団を使用して行うことが必要な異なる細胞株の細胞傷害性を評価する場合、あるとすればLD50の測定値に対する細胞数の効果の決定を慎重に考慮した。5つの細胞株(HT−29、LS174−T、5637、A431、およびMCF−7)を、4つの異なる播種細胞密度で評価した。Hs578TおよびCCD 18Luを、3つの播種密度で評価し、Hs578Bst(初期および後期継代細胞)を、2つの播種密度で評価した。
各細胞株についてのLD50の細胞あたりの用量と第1日目の細胞密度との間の関係のプロッティング(図5)により、扁平上皮癌A431、直腸結腸腺癌HT−29、および正常な乳児肺線維芽細胞株(CCD 18Lu)の挙動が同一であることが明らかとなる。同様に、結腸癌LS174−Tおよび膀胱癌5637のプロットはほとんど一致する。
LD50での播種細胞あたりの用量=切片×e-k×播種密度+極限
[材料/方法]
他の細胞株の範囲を、実施例4で実施した評価と類似の様式で評価した。
図10は、全てが図6の同一の指数曲線上にあるMIA PaCa−2、乳癌細胞株、および初期に継代された正常な乳房線維芽細胞以外の評価された他の細胞株についての単一データポイントがプロットされることを示す。
[材料/方法]
2つの異なる細胞密度のA2058細胞を、BEC(登録商標)+/−ラムノースで処置し、4日後に細胞の生存をモニターした。処置には、(i)BEC(登録商標)のみで4日間、(ii)BEC(登録商標)のみで5分間、(iii)BEC(登録商標)および5mMラムノースで4日間、および(iv)BEC(登録商標)および5mMラムノースで5分間が含まれる。
図11および図12は、BEC(登録商標)取り込みに対するラムノース競合はより高い細胞密度(5000細胞)で容易に認められることを示す。これらの条件下で、各細胞に対して利用可能なBEC(登録商標)の量がLD50の主な決定因子である場合、5mMの比較的高濃度のラムノースの存在が、5分間および4日間の両方での細胞による、特定の濃度範囲の溶液からのBEC(登録商標)取り込み量に影響を与える。図12に示すデータにより、ラムノース保護効果は、パルス処置実験でより有意であることが示唆される。
[材料/方法]
1.FRITCの調製
以下の反応混合物を使用した。
カラム:C18逆相カラム
溶媒A:水+0.06%トリフルオロ酢酸(TFA)
溶媒B:80%アセトニトリル(ACN)/水+0.06%TFA
分析勾配:98−50%(A)で15分間。1ml/分で溶離する。波長:225nmまたは220nm。
分離勾配:98%(A)で2.5分間。98−50%(A)で20分間。2ml/分で溶離する。波長255nmまたは220nm。
A2058細胞を、25ml培養フラスコ中で80〜90%の細胞密集度に成長させ、140mMのNaCl、2mMのMgCl2、および2mMのCaCl2(pH7.4(HBS2+))を含む2×HEPES緩衝化生理食塩水で洗浄した。FRITCを最小量のDMSO(5〜10μl)に溶解し、1mlのHBS2+に添加して、濃度が2〜10μMのFRITCとした。FRITC溶液を細胞に添加し、フラスコを37℃で15分間インキュベートした。FRITCを除去し、細胞をHBS2+で1回洗浄し、新たに調製したカルボニルジイミダゾール(1mlのDMSO中100μM)を室温で直接添加した。15分後、架橋剤を除去し、フラスコを氷上で保存した。
全てのDMSOを細胞から吸引し、300〜400μlのMSS(セクション10)をフラスコに添加する。MSSをフラスコの全表面領域に広げ、細胞を細胞スクレーパー/ハーベスターを使用して掻きとる。MSS中の細胞を室温で15分間インキュベートして、できるだけ大量のタンパク質を取り出す。
100μlのタンパク質抽出物(上記のセクション1)を、50mMのTris−HCl(pH7)および0.05%のTween20で10mlに希釈した。非結合物質を予め除去するために、50μlのプロテインAセファロース(Amersham)を添加し、回転ホイール上にて4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを2000rpmで5分間遠心分離してセファロースをペレット化した。上清を、10μlの抗FITC抗体(Sigma)および50μlのプロテインAセファロースに添加し、回転ホイール上にて4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、セファロースを、2×1mlの10mMのTris(pH7)で洗浄し、全サンプル(マトリクスを含む)を、4−20%SDS−PAGEで電気泳動した。次いで、ゲルを蛍光検出によってFRITC標識タンパク質について評価した。
蛍光標識タンパク質を検出するために、Fluoro−imager(Pharmacia)(蛍光励起波長:494nm、発光波長:520nm)を使用してゲルをスキャニングした。
1.FRITC(フルオレセインラムノースイソチオシアネート)の調製
大量のフルオレセイン標識されたラムノースプローブ(FRITC)をHPLCで精製し、その生存度を質量分析によって確認した。−20℃で乾燥保存した場合、プローブは無期限に安定なようである。
FRITCのA2058細胞表面への架橋を、25mlの培養フラスコ中で首尾よく行った。同濃度の試薬を使用した大規模FRITC架橋(75mlフラスコ)では成功しなかった。これにより、反応は細胞環境中の僅かな変化に容易に影響を受けることが示唆される。本発明者らの所見はまた、カルボニルジイミダゾール架橋剤使用の有利な副次的影響は手順時に細胞をフラスコ表面に接着し、それにより洗浄が容易であることを示した。
本発明者らの手順は、FRITC−受容体複合体の収量の最大化およびその後の望ましくない夾雑物からの複合体の単離に主眼を置く。反応手順は、異なるタンパク質沈殿方法およびその後の可溶化工程を含んでいた。A2058受容体−FRITC複合体は、多界面活性剤溶液(SPRL21111)中で完全に溶解し、一定範囲の非イオン性界面活性剤(2%のTween20、2%のTriton X−100、2%のCHAPS)中で部分的に溶解するようであるが、複合体を完全に溶解する単一の非イオン性界面活性剤は同定されなかった。
タンパク質−FRITC複合体を、低界面活性剤を含む低塩緩衝液で希釈し、フルオレセインに対する抗体とインキュベートした。形成された任意の複合体をプロテインAに吸着させ、沈殿させ、SDS−PAGEで分析した。実験により、クーマシーブリリアントブルー染色によって検出可能な約70kDの見せかけのタンパク質バンドが得られた(図14)。
Claims (28)
- a)分子量が約65〜70kDa、より好ましくは66〜69kDaであることと、
b)pIが10より大きい、または3未満であることと、
c)ソラマルギンのラムノース部分に結合する場合、解離定数が約1.5×10-6であることと、
d)実施例1に記載の条件下で、実施例1にしたがって調製したラムノースアフィニティカラムに結合するように構成されていることと、
e)100mMのラムノース溶液を使用して実施例1に記載のカラムから溶離するように構成されていることと、
f)水溶液に不溶であることと、
g)約2%を超える界面活性剤を含む高度に変性された緩衝液に溶解することと
のうち、少なくとも1つの特徴を有する単離されたRBP。 - a)分子量が約65〜70kDa、より好ましくは66〜69kDaであることと、
b)ソラマルギンのラムノース部分に結合する場合、解離定数が約1.5×10-6であることと、
c)実施例1に記載の条件下で、実施例1にしたがって調製したラムノースアフィニティカラムに結合するように構成されていることと、
d)100mMラムノース溶液を使用して実施例1に記載のカラムから溶離するように構成されていることと、
e)水溶液に不溶であることと、
f)約2%を超える界面活性剤を含む高度に変性された緩衝液に溶解することと
のうち、少なくとも1つの特徴を有する単離されたRBP。 - 分子量が約67kDaである、請求項1または2に記載の単離されたRBP。
- 候補化合物をRBPに接触させる工程と、結合を評価する工程とを含む請求項1〜3のいずれか1項に記載のRBPに結合する化合物の同定方法。
- 前記化合物が、ペプチド、抗体およびそのフラグメント、ならびにペプチド模倣物からなる群から選択されるアゴニストである、請求項4に記載の方法。
- 前記化合物が、ペプチド、抗体およびそのフラグメント、ならびにペプチド模倣物からなる群から選択されるアンタゴニストである、請求項4に記載の方法。
- 候補化合物をラムノースおよびRBPに接触させる工程と、該化合物がラムノースについてRBPと競合するかどうかを評価する工程とを含む、RBP(またはその一部)の細胞外ドメインを模倣し、且つラムノースに結合する化合物の同定方法。
- 前記候補化合物が、
(i)可溶性ペプチドおよびランダムペプチドライブラリーまたはD型および/またはL型アミノ酸から作製されたコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバー、(ii)ホスホペプチド(ランダムなまたは部分的に変成された、有向ホスホペプチドライブラリーのメンバーが含まれるが、これらに限定されない)、(iii)抗体(ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、または単鎖抗体;FAb、F(ab’)2およびFAb発現ライブラリーのフラグメントおよびそのエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない)、(iv)有機小分子または無機小分子からなる群から選択される、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。 - RBPの生物学的機能の決定または癌治療のための請求項4〜8のいずれか1項に記載の方法を使用して同定した化合物の使用。
- RBPホモログを単離するための請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法を使用して同定した化合物の使用。
- 野生型および/または変異RBPの活性を改変するか、RBPの生物学的機能を解明するか、正常なRBP相互作用を崩壊する化合物をスクリーニングするための請求項7の方法を使用して同定した化合物の使用。
- (i)サンプル中のRBPレベルを検出する工程と、(ii)非癌由来のサンプル中のRBPレベルと比較する工程とを含む、サンプル中の癌の検出方法。
- (i)患者由来のサンプル中のRBPレベルを検出する工程と、(ii)非癌由来のサンプル中のRBPレベルと比較する工程とを含む、患者の癌の診断方法。
- (i)患者のRBPのレベルおよび/または分布を検出する工程と、(ii)RBPの分布および/またはレベルを分析して癌の徴候である差違を同定する工程とを含む、患者の癌の診断方法。
- RBPまたはその保存変異型、ペプチド、もしくはフラグメントを同定することができる検出可能に標識した抗体の存在下で、細胞株中でインキュベートした生体液、組織抽出物、新たに採取した細胞、または細胞ライセートなどのサンプルをインキュベートする工程と、結合した前記抗体を検出する工程とを含む、免疫アッセイ。
- 癌細胞などのより高い負荷のRBPを有する細胞に薬剤を送達するためのRBPアゴニストの使用。
- 細胞の成長または分裂を防止するか細胞死を引き起こすように構成された薬剤に連結したRBPアゴニスト。
- 前記薬剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、メトトレキセート、シタラビン、エトプシド、シスプラチン、カルボプラチン、5−フルオロウラシル、ブレオマイシン、エピルビシン、シプロテロン、およびイリノテカンからなる群から選択される、請求項17に記載のRBPアゴニスト−薬剤抱合物。
- 患者の癌治療のための請求項17または18に記載のRBPアゴニストの使用。
- BEC(登録商標)の過剰摂取の治療のための請求項17または18に記載のRBPアゴニストの使用。
- 前記アゴニストがRBP抗体、ラムノース、または他のRBPリガンドである、請求項19または20に記載の使用。
- RBPアゴニストおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む、薬学的または獣医学的組成物。
- グリコシドなどの細胞死を引き起こすように構成された薬剤をさらに含む、請求項22に記載の薬学的組成物。
- 患者への局所投与に適合した、請求項22または23に記載の薬学的組成物。
- 溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、ゲル、軟膏(ointment)、粉末、湿布剤、軟膏(salve)、エアゾール、または経皮パッチの形態である、請求項24に記載の薬学的組成物。
- RBPの1つまたは複数のエピトープ、RBPの保存された変異体のエピトープ、またはRBPのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体。
- ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記の任意のエピトープ結合フラグメントを含む、請求項26に記載の抗体。
- 生体サンプル中のRBPを検出するための請求項26または27に記載の抗体の使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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