JP2004051553A - 抗ｍｒｐ１抗体を含有する抗癌剤の抗癌作用増強剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】抗ＭＲＰ１抗体を含有する抗癌剤の抗癌作用増強剤を提供することを課題とする。
【解決手段】３８例の肺癌由来細胞株および３例の正常繊維芽細胞株と４３例の肺癌臨床検体および６例の正常肺組織よりＲＮＡを調製、蛍光標識後７６８５種の遺伝子断片を固定化したスライドに対してハイブリダイゼーションを行った。通常行われる階層的クラスタリングを実施した結果、全ての細胞株と臨床検体とはそれぞれ異なるクラスターに分離された。培養細胞株あるいは臨床検体でそれぞれ共通して高発現あるいは発現低下している遺伝子を解析から除外する事により、各病型を反映した遺伝子発現プロファイルが得られるものと考え、これを可能とするフィルタリング法を新たに考え実施した。その結果、病型特異的な遺伝子発現プロファイルを得る事ができ、扁平上皮肺癌に特異的に発現上昇しているものとして、ＭＲＰ１が選別された。
【選択図】 なし
【解決手段】３８例の肺癌由来細胞株および３例の正常繊維芽細胞株と４３例の肺癌臨床検体および６例の正常肺組織よりＲＮＡを調製、蛍光標識後７６８５種の遺伝子断片を固定化したスライドに対してハイブリダイゼーションを行った。通常行われる階層的クラスタリングを実施した結果、全ての細胞株と臨床検体とはそれぞれ異なるクラスターに分離された。培養細胞株あるいは臨床検体でそれぞれ共通して高発現あるいは発現低下している遺伝子を解析から除外する事により、各病型を反映した遺伝子発現プロファイルが得られるものと考え、これを可能とするフィルタリング法を新たに考え実施した。その結果、病型特異的な遺伝子発現プロファイルを得る事ができ、扁平上皮肺癌に特異的に発現上昇しているものとして、ＭＲＰ１が選別された。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ＭＲＰ１抗体を含有する抗癌剤の抗癌作用増強剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肺癌は全世界的に見て男女を問わず癌による死亡原因の第１位の位置を占めており、その数は増加の一途にある。また日本だけを見ても年間に５０，０００人の命が肺癌により失われている。肺癌は病理学的にはその形態から小細胞性肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＬＣ）と非小細胞性肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＮＳＣＬＣ）に分類され、後者はさらに扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＣ）、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＡＣ）、大細胞性癌（ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＬＣＣ）に分類されている。個々に分類された肺癌は悪性度、治療に対する反応性が異なる事から、正確な病型診断は治療指針を決定するうえで極めて重要である。非小細胞性肺癌の場合は病巣が限局していて明らかな転移を認めない場合には外科的手術による摘除が第１選択肢となるが、種々の状況により手術が困難な場合および術後の維持には化学療法および放射線療法による治療が選択される。化学療法に対する反応性は症例により異なるが一般に、複数の異なる作用機序に基づいた薬剤を組み合わせて用いる事により相乗的な効果を期待しつつ副作用を最小限とする努力が為されている。化学療法を行う場合にしばしば問題となるのが多剤耐性の獲得であり、薬物代謝酵素類の過剰発現や薬剤標的蛋白の変異、薬剤の細胞内取り込みの減少、逆に細胞外排出の増大等の機序の関与が知られている。この様な薬剤耐性と云う新しい機能の獲得には癌細胞のゲノムの不安定性が寄与している事から癌細胞のもつ特権とも云えるものであり、一般に化学療法で一度縮小した腫瘍が再燃する場合の多くに多剤耐性の獲得が付随している。従って新規な作用機序に基づいた治療薬の開発と多剤耐性の克服は癌の化学療法を考えるうえで極めて重要な課題である。
【０００３】
従来の化学療法剤の殆どは癌細胞と正常細胞が共通して利用している基本的な経路に帰属するターゲットに対するものであるが故に副作用との分離は困難である。一方でより癌に特異的なターゲットを見出す事を目標とした細胞癌化のメカニズムに関する研究は著しい躍進を遂げ、多くの癌抑制遺伝子が癌において変異をうけて不活性化している事が細胞癌化の主たる原因となっている事が明らかとなってきた。しかし、これらの癌抑制遺伝子産物の機能が明らかになり、その変異が惹き起こす細胞増殖あるいはアポトーシス制御の破綻が明らかになるにつれ、これらの癌抑制遺伝子産物が制御する経路は全ての細胞に共通した基本的な経路であり低分子化合物を用いてその破綻を是正する事は一般に困難で、唯一遺伝子治療による失われた癌抑制遺伝子産物の補充以外には副作用を分離した癌に特異的な治療は困難である事が明らかとなってきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、癌特異的な遺伝子を見出し、該遺伝子の産物に対する抗体を含有する薬剤を提供することにある。より詳細には、抗ＭＲＰ１抗体を含有する抗癌剤の抗癌作用増強剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
癌細胞における遺伝子発現の異常は広く知られた現象であり、問題となる癌が発生した臓器では発現が認められない遺伝子の異所性発現や胎生期にしか発現が認められない遺伝子の発現が知られている。これらの遺伝子産物のうち細胞表面蛋白は抗体療法の格好のターゲットとなり得るし、また胎生期の細胞を含めた特殊な細胞集団でのみ機能している細胞周期調節機構やシグナル伝達機構をターゲットとした薬剤を開発する事により副作用との分離が可能になると考えられる。以上の考えに基づいて、本発明者らは新規な肺癌の治療ターゲットを見出すべく、各種病型肺癌の遺伝子発現プロファイル解析を実施した。個々の症例毎に異なる遺伝子発現異常はテーラーメード療法の対象とはなるが新規医薬品開発の為のターゲットとしては不適である事から、本発明者らは病型特異的な遺伝子発現に焦点を当てて解析を行った。
【０００６】
３８例の肺癌由来細胞株および３例の正常繊維芽細胞株と４３例の肺癌臨床検体および６例の正常肺組織よりＲＮＡを調製、蛍光標識後７６８５種の遺伝子断片を固定化したスライドに対してハイブリダイゼーションを行った。通常行われるｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ（階層的）クラスタリングを実施した結果、全ての細胞株と臨床検体とはそれぞれ異なるクラスターに分離された。細胞株のクラスターは培養系に特有の要因により細胞株に共通した遺伝子発現により形成されたものと考えられ、一方臨床検体クラスターでは腫瘍検体に混在する正常組織の影響を強く受けているものと考えられた。そこで、これら培養細胞株あるいは臨床検体でそれぞれ共通して高発現あるいは発現低下している遺伝子を解析から除外する事により、各病型を反映した遺伝子発現プロファイルが得られるものと考え、これを可能とするフィルタリング法（Ｂｉｎａｒｙ Ｓｔｒｉｎｇ Ｓｅａｒｃｈ）を新たに考えた。該フィルタリング法により、細胞株あるいは臨床検体に共通して発現亢進している遺伝子を解析から除外することができ、病型特異的な遺伝子発現プロファイルを得る事ができた。病型特異的に高発現している遺伝子の中には全ての細胞に共通した基本的経路の構成成分は殆ど含まれていなかった。これらの病型特異的遺伝子には既知の病型特異的マーカー（例、小細胞性肺癌のｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅマーカーや扁平上皮癌のケラチン等）が数多く含まれており、これらを除いた残りの遺伝子から新規医薬品開発の為のターゲット（例えば抗体療法のターゲット）としての可能性が想定されるものを検索した。
【０００７】
その結果、扁平上皮肺癌に特異的に発現上昇しているものとして、ＭＲＰ１が選別された。ＭＲＰ１はグルタチオンを補助因子とするｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐで、臨床で一般的に用いられる抗癌剤を細胞外に排出する事によりこれらの薬剤に対する抵抗性を賦与することが知られている。また、重金属の毒性に対しても抵抗性を賦与する事が報告されている。また一方、ＭＲＰ１はＬｅｕｃｏｔｒｉｅｎｅ Ｃ４ （ＬＴＣ４）トランスポーターとしても知られている。ＭＲＰ１を欠失させたマウスはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対して抵抗性となる事が示され、この効果がＭＲＰ１欠失の結果細胞内にＬＴＣ４が蓄積しｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎによりＬＴＣ４−ｓｙｎｔｈａｓｅの活性が低下し、ＬＴＣ４−ｓｙｎｔｈａｓｅとＬＴＡ４−ｈｙｄｒｏｌａｓｅ間の基質に対する競合がＬＴＡ４−ｈｙｄｒｏｌａｓｅ側にシフトした結果、肺胞滲出液中のＬＴＢ４レベルが増大した事によると説明されている。
【０００８】
以上の結果から、ＭＲＰ１を標的とした中和抗体は各種抗癌剤の抗癌作用を増強する（癌細胞の抗癌剤に対する多剤耐性を克服する）と同時に、随伴するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対する抵抗性を賦与する事が期待でき、この分子を過剰発現した癌のａｄｊｕｎｃｔ ｔｈｅｒａｐｙに有効であると考えられる。また、ＭＲＰ１を用いることで抗癌剤の抗癌作用を増強する薬剤をスクリーニングすることが可能になるものと考えられる。
【０００９】
即ち、本発明は、
〔１〕抗ＭＲＰ１抗体を有効成分として含有する、抗癌剤の抗癌作用を増強するための薬剤、
〔２〕抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤、
〔３〕癌が肺癌である、〔１〕または〔２〕に記載の薬剤、
〔４〕肺癌が扁平上皮肺癌である、〔３〕に記載の薬剤、
〔５〕抗ＭＲＰ１抗体を投与することを特徴とする、抗癌剤の抗癌作用の増強方法、
〔６〕抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を投与することを特徴とする、癌の治療方法、
〔７〕被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＭＲＰ１タンパク質に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該ＭＲＰ１タンパク質の活性を測定する工程、
を含み、上記ＭＲＰ１タンパク質の活性が、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強すると判定される方法、
〔８〕被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強すると判定される方法、
〔９〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法、
（ａ）〔７〕または〔８〕に記載の評価方法により、複数の被験試料ついて、抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する工程
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法、
（ａ）ＭＲＰ１タンパク質に複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＭＲＰ１タンパク質と被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）〔７〕または〔８〕に記載の評価方法により、該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料について、抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する工程
（ｅ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料から、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する工程
〔１１〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法、
（ａ）ＭＲＰ１タンパク質に複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＭＲＰ１タンパク質と被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料および抗癌剤を該抗癌剤に耐性を示す癌細胞に接触させる工程
（ｅ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料から、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する工程
〔１２〕〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載の工程に、さらに抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する医薬組成物の製造方法、
〔１３〕癌が肺癌である、〔５〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１４〕肺癌が扁平上皮肺癌である、〔１３〕に記載の方法、
を、提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、グルタチオンを補助因子とするｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐ として知られているＭＲＰ１（ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）が、癌特異的に過剰発現していることを見出した。該ＭＲＰ１は、臨床で一般的に用いられる抗癌剤を細胞外に排出する事によりこれらの薬剤に対する抵抗性を賦与することが知られている。よって、抗ＭＲＰ１抗体は、抗癌剤の抗癌作用の増強剤になりうる。また、抗癌剤とともに抗ＭＲＰ１抗体を有効成分として含有する薬剤は、該抗癌剤の抗癌活性が持続する有効な薬剤になりうる。一方、ＭＲＰ１はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎の成立に重要な役割を果たしていることが知られている。よって、上記薬剤は、癌に随伴するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対して抵抗性を賦与する薬剤としても使用できる。本発明は、このような特徴を有する薬剤を提供するものである。
【００１１】
本発明における癌としては、好ましくは肺癌であり、より好ましくは非小細胞性肺癌であり、さらに好ましくは扁平上皮肺癌である。また、本発明における抗癌剤としては、特に制限はないが、好ましくはＭＲＰ１により細胞外に排出される薬剤である。このような薬剤としては、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ＶＰ１６、ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ、重金属ｏｘｙａｎｉｏｎであるｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ、ａｎｔｉｍｏｎｙなどが例示できる。
【００１２】
また、本発明における抗体には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体変異体等が包含される。
【００１３】
本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、天然において起こり得る少量で存在する変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作用するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む慣用な（ポリクローナル）抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えば後述するハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ （１９７５） ２５６：４９５）、または、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９９１） ３５２：６２４−６２８； Ｍａｒｋｓ ｅｔａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． （１９９１）２２２：５８１−５９７）。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物学的活性を有する限り、このような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５ （１９８４））。
【００１４】
本発明において、「抗体変異体」とは、１またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアントであれ、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本発明における「抗体変異体」に含まれる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と１００％よりも少ない配列相同性、または類似性を有する。
【００１５】
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹膜内（ｉｐ）注射により非ヒト哺乳動物で作られる。免疫化される種に対して免疫原性の蛋白質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、仔ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに、例えば、マレイミドベンゾイル スルフォスクシンイミド エステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、塩化チオニル、若しくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＣＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）等の二機能性の薬剤若しくは誘導剤を用いて関連抗原を結合させることもできる。
【００１６】
例えば、１００μｇ若しくは５μｇの蛋白質若しくはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスについての量）を３倍量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバントと合わせ、溶液を複数回、皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫化する。一ヶ月後、動物をもとのＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの１／５〜１／１０量を複数の部位に皮下注射することにより追加免疫する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価について分析する。好ましくは、動物の追加免疫の際には、同じ抗原ではあるが異なる蛋白質に、及び／または、異なる交差結合試薬を介して結合されたコンジュゲートを用いる。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養蛋白質融合で作成することもできる。また、免疫応答を増幅するため、ミョウバン等の凝集剤が好ましくは用いられる。選択された哺乳動物抗体は通常、抗原に対して十分に強い結合親和性を有する。抗体の親和性は、飽和結合、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、及び競合分析（例えば、放射性免疫分析）により決定することができる。
【００１７】
所望のポリクローナル抗体のスクリーニング法としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｙ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ ｅｄｉｔ．（１９８８））に記載されるような慣用の交差結合分析を行うことができる。また、代わりに、例えば、エピトープマッピング（Ｃｈａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． （１９９５） ２７０：１３８８−１３９４）を行ってもよい。蛋白質または抗体の効力の測定方法として好ましいのは、抗体結合親和性の定量化を用いた方法であるが、その他の態様では、それに加えて、または結合親和性測定に代えて抗体の１若しくはそれ以上の生物学的特性を評価する方法を含む。このような分析法は特に、抗体の治療的な有効性を示すので有用である。通常、必ずしもではないが、このような分析において改善された特性を示す抗体はまた、結合親和性も増幅されている。
【００１８】
モノクローナル抗体は単一の抗原部位を認識する抗体であり、均一な特異性により、一般的に多数の異なる抗原部位を認識する抗体を含むポリクローナル抗体よりも有用である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法 （Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ （１９７５） ２５６：４９５）または、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）等により製造することができる。
【００１９】
ハイブリドーマ法では、マウス、または、ハムスター若しくはアカゲザル等の他の適当な宿主動物を免疫化に使用した蛋白質に対して特異的に結合する抗体を産生するか、または、産生できるリンパ球を誘導するために上述と同様に免疫化する。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてリンパ球を免疫化することもできる。その後、リンパ球をポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９０−１０３， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６））。製造されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の生育または成長を阻害する１またはそれより多くの物質を含む適当な培養培地に植え、生育する。例えば、もし親ミエローマ細胞がヒポキサンチン グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、そのハイブリドーマのための培養培地には、典型的には、ＨＧＲＰＴ欠損細胞の生育を阻止する物質ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンが含まれる（ＨＡＴ培地）。好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞において、安定で高いレベルで抗体を産生し、そして、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性の細胞である。これらの中で好ましいミエローマ細胞株は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． ＵＳＡ）から入手できるＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞、並びに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ． ＵＳＡ）から入手できるＳＰ−２、またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞等のマウスミエローマ細胞株である。ヒトミエローマ、及び、マウス−ヒトｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ細胞株も、ヒトモノクローナ抗体の産生に用いられてきた（Ｋｏｚｂａｒ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３３：３００１ （１９８４）； Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， ｐｐ．５１−６３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。
【００２０】
次に、ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降、または、放射免疫分析（ＲＩＡ）若しくは酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）等のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合分析により測定する。所望の特異性、親和性及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限定的希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により生育する（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓａｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９−１０３， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）。この目的に適した培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＩＭ−１６４０培地である。さらに、ハイブリドーマ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで動物中の腹水腫瘍として生育させることもできる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、好ましくは培養培地、腹水液、または血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー等の慣用な免疫グロブリン精製方法により分離される。
【００２１】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させる。また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４ （１９９０））により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片は単離することができる。
【００２２】
Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８ （１９９１））、及びＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７ （１９９１））は、各々、ファージライブラリーを用いたマウス及びヒト抗体の単離について記載する。次の文献は、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体のチェーンシャッフリングによる製造（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３ （１９９２））について、そして、巨大なファージライブラリーを構築するための方法としてのコンビナトリアル感染、及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：２２６５−２２６６ （１９９３））について記載する。これらの技術も、モノクローナル抗体の単離のために従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代えて利用し得る。
【００２３】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖、及び軽鎖の定常ドメインのコード配列をそれに対するマウス配列に代えて置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１ （１９８４））、または免疫グロブリン蛋白質を共有結合により結合させることにより改変することができる。典型的には、このような非免疫グロブリン蛋白質は、１つの抗原に対して特異性を有する抗原結合部位、及び、異なる抗原に対して特異性を有する抗原結合部位を有するキメラ二特異性抗体を構築するため、抗体の定常ドメインで置換するか、または、抗体の抗原結合部位の可変ドメインを置換する。
【００２４】
また、本発明の蛋白質と結合する抗体としては、ヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体、および抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）等も挙げられる。
【００２５】
上記「ヒト型化抗体」とはマウス等のヒトにとって異種の抗体を改変して、Ｈ鎖とＬ鎖の相補性決定部以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造で置き換えた抗体を言う。「キメラ抗体」とは、異種抗体由来のＦａｂ領域とＦｃ領域とを有する抗体を意味する。
【００２６】
本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と呼ばれる、それぞれ１つの抗原結合部位を有する２つの同じ抗原結合断片、及び、残りの容易に結晶化するために「Ｆｃ」と呼ばれる断片が生じる。また、ペプシン消化により２つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得るＦ（ａｂ’）２断片、及び、残りの別な断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。その他の断片としては、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片より形成された多特異性抗体が含まれる。
【００２７】
ここで、「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。この領域は１つの重鎖及び軽鎖の可変ドメインが非共有結合により強く連結されたダイマーである（ＶＨ−ＶＬダイマー）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合部位を付与するものである。しかしながら、１つの可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００２８】
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常ドメイン、及び、重鎖の細胞の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点で異なる。
【００２９】
本発明において、「ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、該断片は、同じ蛋白質鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖中で２つのドメインの間を結合できない位に短いリンカーを用いると、２つのドメインはもう一方の鎖の定常ドメインとペアを形成し、２つの抗原結合部位が創り出される。Ｄｉａｂｏｄｙはより詳細に、例えば、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、及びＨｏｌｌｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８ （１９９３））に記載される。
【００３０】
一本鎖抗体（以下、一本鎖Ｆｖ若しくはｓＦｖとも呼ぶ）、またはｓＦｖ抗体断片には、抗体のＶＨ及びＶＬドメインが含まれ、これらのドメインは単一の蛋白質鎖中に存在する。一般に、Ｆｖ蛋白質はさらに、ＶＨ及びＶＬドメインの間に蛋白質リンカーを含み、それによりｓＦｖは、抗原結合のために必要な構造が形成できる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏｌ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．２６９−３１５ （１９９４））参照。
【００３１】
多特異性抗体は、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。通常このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体）、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類の）抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）であり得る。
【００３２】
従来、抗体断片は天然の抗体のプロテアーゼによる消化により製造されてきた（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７ （１９９２）； Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１ （１９８５））が、現在は組換技術により製造することも可能である。例えば、上述の抗体ファージライブラリーから抗体断片を単離することもできる。また、大腸菌等の宿主より直接Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片を回収し、Ｆ（ａｂ’）２断片の形態に化学的結合させることもできる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７ （１９９２））。さらにまた別の方法としては、Ｆ（ａｂ’）２断片を直接、組換宿主培養物から単離することもできる。その他、一本鎖抗体等の断片の作製方法も公知である一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。
【００３３】
当分野において多特異性抗体の製造法は公知である。全長の二特異性抗体の産生は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の共発現を含むものである（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９ （１９８３））。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖はランダムに取り合わされるので、共発現を行う得られた複数のハイブリドーマ（クワドローマ）は、各々異なる抗体分子を発現するハイブリドーマの混合物であり、このうち正しい二特異性抗体を産生するるものを選択する必要がある。選択はアフィニティークロマトグラフィー等の方法により行うことができる。また、別な方法では所望の結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。該定常ドメイン配列は、好ましくは免疫グロブリンの重鎖の定常領域の内、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖のＣＨ１領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。別々の発現ベクターに各遺伝子を挿入することにより、それぞれの鎖の存在割合が同じでない方が、得られる抗体の収量が上がる場合に、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。
【００３４】
好ましい態様においては、第一の結合特性を有する重鎖がハイブリッド免疫グロブリンの一方の腕として存在し、別の結合特性の重鎖−軽鎖複合体がもう一方の腕として存在する二重特異性抗体が望ましい。このように一方の腕のみに軽鎖を存在させることにより、二重特異性抗体の他の免疫グロブリンからの分離を容易に行うことができる。該分離方法については、ＷＯ９４／０４６９０参照。二特異性抗体の作成方法については、さらに、Ｓｕｒｅｓｈら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０ （１９８６））の方法を参照することができる。組換細胞培養物から得られる最終産物中のホモダイマーを減らしヘテロダイマーの割合を増加させる方法として、抗体の定常ドメインのＣＨ３を含み、一方の抗体分子において、他方の分子と結合する表面の１若しくは複数の小さな側鎖のアミノ酸を大きな側鎖のアミノ酸（例えば、チロシンやトリプトファン）に変え、他方の抗体分子の対応する部分の大きさ側鎖のアミノ酸を小さなもの（例えば、アラニンやスレオニン）に変えて第一の抗体分子の大きな側鎖に対応する空洞を設ける方法も知られている（ＷＯ９６／２７０１１）。
【００３５】
二重特異性抗体には、例えば、一方の抗体がアビジンに結合され、他方がビオチン等に結合されたようなヘテロ共役抗体が含まれる（米国特許第４，６７６，９８０号；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／００３７３；ＥＰ０３０８９）。このようなヘテロ共役抗体の作成に利用される架橋剤は周知であり、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号にもそのような例が記載されている。
【００３６】
また、抗体断片より二特異性抗体を製造する方法も報告されている。例えば、化学結合を利用して製造することができる。例えば、まずＦ（ａｂ’）２断片を作成し、同一分子内でのジフルフィド形成を防ぐため断片をジチオール錯化剤アルサニルナトリウムの存在化で還元する。次にＦ（ａｂ’）２断片をチオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。メルカプトエチルアミンを用いて一方のＦ（ａｂ’）２−ＴＮＢ誘導体をＦａｂ’−チオールに再還元した後、Ｆ（ａｂ’）２−ＴＮＢ誘導体及びＦａｂ’−チオールを等量混合し二特異性抗体を製造する。
【００３７】
組換細胞培養物から直接、二重特異性抗体を製造し、単離する方法も種々、報告されている。例えば、ロイシンジッパーを利用した二重特異性抗体の製造方法が報告されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５４７−１５５３ （１９９２））。まず、Ｆｏｓ及びＪｕｎ蛋白質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させ、ホモダイマーの抗体をヒンジ領域においてモノマーを形成するように還元し、抗体へテロダイマーとなるように再酸化する。また、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、これら２つのドメイン間での対形成できない位に短いリンカーを介して連結し、相補的な別のＶＬ及びＶＨドメンと対を形成させ、それにより２つの抗原結合部位を形成させる方法もある（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８ （１９９３））。また、一本鎖Ｆｖ（ｓＦＶ）を用いたダイマーについても報告されている（Ｇｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８ （１９９４））。さらに、二重特異性ではなく三重特異性の抗体についても報告されている（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０ （１９９１））。
【００３８】
ヒト型化抗体は、免疫原（抗原）をヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫し、既存の一般的な抗体産生方法によって取得することができる。用いるヒト型化抗体産生非ヒト哺乳動物、特にヒト型化抗体産生トランスジェニックマウスの作製方法は公知である（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１ （１９９４）； Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６ （１９９７）；特表平４−５０４３６５号公報；特表平７−５０９１３７号公報；日経サイエンス ６：４０−５０ （１９９５）；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報； Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９ （１９９４）；特表平６−５００２３３号公報等）。
【００３９】
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより宿主を形質転換して得られる遺伝子組換え宿主であって、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する宿主を培養することにより培養上清中から得ることもできる。ここで、該宿主は受精卵以外の真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞である。
【００４０】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８） が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ， ＰＯＲＯＳ， Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ． Ｆ． （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 等が挙げられる。
【００４１】
抗体には各種試薬を結合して使用することもできる。このような試薬としては、ドキソルビシン、メトトレキセート、タキソールなどの化学療法剤、重金属、放射核種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ解毒素などのトキシン類を挙げることができる。治療用試薬との結合体を生産する方法および治療用に使用する方法については、米国特許５０５７３１３号、米国特許５１５６８４０号に記載されている。
【００４２】
また、抗癌剤の抗癌作用を増強することを目的として、抗ＭＲＰ１抗体、または、抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤を投与することにより、癌の治療（または癌の予防）を行うことが可能である。また、該薬剤を投与することで、癌に随伴するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対する抵抗性を賦与することも可能である。本発明は、これら疾患の治療方法（または癌の予防方法）もまた提供する。
【００４３】
抗ＭＲＰ１抗体、または、抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
【００４４】
抗ＭＲＰ１抗体、または、抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与を行うことも可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００４５】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００４６】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００４７】
また、患者の年齢、症状により適宜投与量を選択することができる。例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００４８】
本発明には、ＭＲＰ１タンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する抗癌剤もまた含まれる。
【００４９】
本発明において、ＭＲＰ１タンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体としては、特に制限はなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体が挙げられる。
【００５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列（例えば、アクセッションＡＡ４２４８０４）中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはＭＲＰ１タンパク質のＤＮＡ配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
【００５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとがＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１ 又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
【００５３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ＭＲＰ１タンパク質の産生細胞に作用して、該ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、ＭＲＰ１タンパク質の発現を抑制することにより、結果的にＭＲＰ１タンパク質の作用を抑制する効果を有する。
【００５４】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
【００５５】
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
【００５６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００５７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。
【００５８】
また、本発明は、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する方法、並びに、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法を提供する。
【００５９】
本発明の方法における「被検試料」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、「複数の被験試料」としては、特に制限はなく、例えば、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
【００６０】
本発明の方法において、ＭＲＰ１タンパク質が由来する生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。
【００６１】
また、本発明の方法において、「抑制されている」とは、完全に阻害されている場合だけでなく、減少している場合も含む。
【００６２】
本発明の評価方法の第一の態様としては、まず、ＭＲＰ１タンパク質に被験試料を接触させる。第一の態様に用いられるＭＲＰ１タンパク質の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
【００６３】
ＭＲＰ１タンパク質の精製は周知の方法で行うことができる（Ｍａｏ Ｑ． ｅｔ ａｌ．； Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９９ Ｎｏｖ ９；１４６１（１）：６９−８２．、Ｍａｏ Ｑ． ｅｔ ａｌ．； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０００ Ｎｏｖ ３；２７５（４４）：３４１６６−７２）。
【００６４】
また、ＭＲＰ１タンパク質が発現している細胞としては、内在性のＭＲＰ１タンパク質を発現している細胞、または外来性のＭＲＰ１タンパク質を発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＭＲＰ１タンパク質を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎで選択したＨ６９ＡＲ（小細胞性肺癌由来ＮＩＨ−Ｈ６９ の多剤耐性亜株）や、ｌｃ−１／ｓｑ（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ４９： ４３６−４４３， １９９１．）を用いることが可能である。
【００６５】
また、上記外来性のＭＲＰ１タンパク質を発現している細胞は、例えば、ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、当業者に一般的な方法によって実施することができる。また、上記外来性のＭＲＰ１タンパク質を有する細胞は、例えば、ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＭＲＰ１タンパク質が導入される細胞が由来する生物種としては、特に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
【００６６】
また、ＭＲＰ１タンパク質が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
【００６７】
また、本発明において「接触」は、ＭＲＰ１タンパク質の状態に応じて行う。例えば、ＭＲＰ１タンパク質が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＭＲＰ１タンパク質が発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＭＲＰ１タンパク質が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
【００６８】
第一の態様では、次いで、上記ＭＲＰ１タンパク質の活性を測定する。ＭＲＰ１タンパク質の活性としては、ＡＴＰａｓｅ活性、または、再構成したＭＲＰ１ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅへの［３Ｈ］−ＬＴＣ４あるいは［３Ｈ］−Ｅ２−１７βＧの取り込み活性が挙げられる（Ｍａｏ Ｑ． ｅｔ ａｌ．； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０００ Ｎｏｖ ３；２７５（４４）：３４１６６−７２）。
【００６９】
第一の態様においては、上記ＭＲＰ１タンパク質の活性が、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強すると判定される。
【００７０】
本発明の評価方法の第二の態様としては、まず、ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
【００７１】
第二の態様において、「機能的に結合した」とは、ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【００７２】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡもまた含まれる。
【００７３】
第二の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被験試料を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。
【００７４】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００７５】
また、ＭＲＰ１遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
【００７６】
また、該遺伝子からコードされるＭＲＰ１タンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該ＭＲＰ１タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＭＲＰ１タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該ＭＲＰ１タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
【００７７】
第二の態様においては、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強すると判定される。
【００７８】
さらに、本発明は、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料を効率的にスクリーニングする方法を提供する。本発明の抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法の一つの態様においては、上記評価方法を利用して、複数の被験試料について、抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価し、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する。
【００７９】
上記スクリーニング方法の他の態様においては、まず、ＭＲＰ１タンパク質に複数の被験試料を接触させる。次いで、ＭＲＰ１タンパク質と被験試料との結合を検出する。次いで、ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料を選択する。
【００８０】
ＭＲＰ１タンパク質を用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡを、ｐＳＶ２ｎｅｏ， ｐｃＤＮＡ Ｉ， ｐＣＤ８ などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしては ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｒｉｇｂｙ Ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ．３． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， ｐ．８３−１４１（１９８２））， ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｋｉｍら Ｇｅｎｅ ９１， ｐ．２１７−２２３ （１９９０））， ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ １０８， ｐ．１９３−２００ （１９９１））， ＲＳＶ ＬＴＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｃｕｌｌｅｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２， ｐ．６８４−７０４ （１９８７）， ＳＲ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８， ｐ．４６６ （１９８８））， ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ｐ．３３６５−３３６９ （１９８７））， ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １， ｐ．３８５−３９４ （１９８２））， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９， ｐ． ９４６ （１９８９））， ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ 等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
【００８１】
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法 （Ｃｈｕ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １５， １３１１−１３２６ （１９８７））、リン酸カルシウム法 （Ｃｈｅｎ， Ｃ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ， Ｈ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７， ２７４５−２７５２ （１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法 （Ｌｏｐａｔａ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ５７０７−５７１７ （１９８４）； Ｓｕｓｓｍａｎ， Ｄ． Ｊ． ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ， Ｇ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４， １６４２−１６４３ （１９８５））、リポフェクチン法 （Ｄｅｒｉｊａｒｄ， Ｂ． Ｃｅｌｌ ７， １０２５−１０３７ （１９９４）； Ｌａｍｂ， Ｂ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５， ２２−３０ （１９９３）； Ｒａｂｉｎｄｒａｎ， Ｓ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９， ２３０−２３４ （１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
【００８２】
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をＭＲＰ１タンパク質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてＭＲＰ１タンパク質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 １３， ８５−９０ （１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。また、融合ポリペプチドにすることによりＭＲＰ１タンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素 ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７ ｇｅｎｅ１０ タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、ＭＲＰ１タンパク質に結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学 １３， ８５−９０ （１９９５））。
【００８３】
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＭＲＰ１タンパク質、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ＭＲＰ１タンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。ＭＲＰ１タンパク質に対する抗体は、例えば、ＭＲＰ１タンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したＭＲＰ１タンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
【００８４】
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ 抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、ＭＲＰ１タンパク質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、ＭＲＰ１タンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
【００８５】
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ．： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｐｐ．５１１−５５２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８） ）記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
【００８６】
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはＭＲＰ１タンパク質に結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
【００８７】
また、ＭＲＰ１タンパク質を用いて、該ＭＲＰ１タンパク質に結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋらの方法（Ｓｋｏｌｎｉｋ， Ｅ． Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ （１９９１） ６５， ８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、ＭＲＰ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λｇｔ１１， ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識したＭＲＰ１タンパク質と上記フィルターとを反応させ、ＭＲＰ１タンパク質と結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。ＭＲＰ１タンパク質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、ＭＲＰ１タンパク質又はＭＲＰ１タンパク質に融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
【００８８】
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．， ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ， Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ． Ｇｅｎｅｔ． （１９９４） １０， ２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ， ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ （１９９２） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１， ａｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ． Ｃｅｌｌ ６８， ５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「ＭａｍｍａｌｉａｎＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
【００８９】
２−ハイブリッドシステムにおいては、ＭＲＰ１タンパク質またはその部分ペプチドをＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＭＲＰ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内でＭＲＰ１タンパク質と結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これによりＭＲＰ１タンパク質に結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
【００９０】
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
【００９１】
ＭＲＰ１タンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ＭＲＰ１タンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにＭＲＰ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、ＭＲＰ１タンパク質に結合したポリペプチドを調製することができる。
【００９２】
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００９３】
また、ポリペプチドに限らず、ＭＲＰ１タンパク質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定したＭＲＰ１タンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、ＭＲＰ１タンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ； Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ； Ｃｈａｎｇ Ｒ； Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ； Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ； Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ； Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ； Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ； Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．， Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ） Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．， Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ． Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ） Ｎｏｖ ７ １９９６， ３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｎａｔｕｒｅ （ＥＮＧＬＡＮＤ） Ｎｏｖ ７ １９９６， ３８４ ｐ１７−９）が当業者に公知である。
【００９４】
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ＭＲＰ１タンパク質と被験試料との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることによりＭＲＰ１タンパク質と被験試料との結合を評価することが可能である。
【００９５】
本発明のスクリーニング方法においては、上記方法により得られたＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料について、本発明の評価方法により、抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する。次いで、ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料から抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する。また、該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料および抗癌剤を該抗癌剤に耐性を示す癌細胞に接触させ、例えば該癌細胞の増殖を測定することで、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料（該癌細胞の増殖を阻害する試料）を選択することが可能である。上記癌細胞としては、特に制限はなく、ＭＲＰ１により細胞外に排出される薬剤（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎなど）に耐性を示す臨床検体や培養細胞株などが例示できる。
【００９６】
さらに、本発明においては、抗癌剤の抗癌作用を増強する医薬組成物の製造方法を提供する。該製造方法においては、上記スクリーニング方法によって抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料と上述した医薬上許容される担体とを混合する。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００９７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ アレイスライドの作成
スライドグラスに貼り付ける７６８５遺伝子のうち６７３４はＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社より購入したＩＭＡＧＥクローン、６９９は癌への関与が知られた、あるいは想定される中外所有のクローンに由来し、残る２５２は陰性コントロールとして加えた（Ａｌｕ配列、ルシフェラーゼ等）ものでデータ解析からは除外した。スライド作成はＨｅｇｄｅ，Ｐ．等の方法（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （２００１） ６１： ７７９２−７７９７）に準じて行い、Ｍｉｃｒｏｇｒｉｄ ＩＩ （ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ社製）を用いて１枚のスライドに７６８５遺伝子をｄｕｐｌｉｃａｔｅで貼り付けた。
【００９８】
［実施例２］ プローブの調製、ハイブリダイゼーション及び測定
３８株のヒト肺癌由来細胞株、３株の正常ヒト繊維芽細胞株（表１）、４３例の各種病型肺癌臨床検体および６例の正常肺組織（表２）を材料とした。
【００９９】
【表１】
【０１００】
【表２】
【０１０１】
臨床検体は（財）癌研究会癌研究所にて患者のｉｎｆｏｒｍｅｄ ｃｏｎｓｅｎｔおよび倫理委員会の承認のもとで外科的摘除時に採取したものである。レファレンスサンプルとしては可能な限り多くの遺伝子について情報が得られる事を考慮して、２０％の正常肺組織にＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ｌｕ−１３４Ａ、ＭＲＣ５、ＳＱ５、Ｈ２３、ＰＣ１４、ＭＳ１の１０種の細胞株を夫々８％ずつ加えたものを用いた。全ての細胞株はＲＮＡｌａｔｅｒ （Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて細胞浮遊液とした。臨床検体はＲＮＡの分解を最小限にすべく採取後液体窒素にて瞬時に凍結せしめた。Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを抽出後、Ｌｕｏ， Ｌ．等の方法（Ｎａｔ． Ｍｅｄ． （１９９９） ５ ： １１７−１２２）に従ってｃＲＮＡ合成を行った。プローブ合成はＨｕｇｈｅｓ， ＴＲ等の方法（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１） １９ ： ３４２−３４７）に従って２ｕｇのｃＲＮＡを鋳型として行った。レファレンスサンプルはＣｙ３にてテストサンプルはＣｙ５にて蛍光標識した。ハイブリダイゼーションとその後の洗浄はＨｅｇｄｅ， Ｐ．等の方法（前出）に従った。ハイブリダイズしたシグナルの測定と定量はＳｃａｎｎａｒｒａｙ ４０００スキャナーとＱｕａｎｔａｒｒａｙ （何れもＰａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。
【０１０２】
［実施例３］ データ解析
全てのｃＲＮＡサンプルはｄｕｐｌｉｃａｔｅにて蛍光標識を行った。標識後のプローブを７６８５個のＤＮＡスポットがｄｕｐｌｉｃａｔｅで貼り付けてあるスライドにハイブリダイズさせる事により、個々の遺伝子について４回の独立した測定を行った。スポットした７６８５ ｅｌｅｍｅｎｔ中２５２はｃｏｎｔｒｏｌとして加えたもの（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、Ａｌｕ等）で残る７４３３のうち６３８４は５６２２個のＵｎｉＧｅｎｅクラスターに相当し、１０４９はＵｎｉＧｅｎｅクラスターに一致しない事から全体で６６７１個のユニークな遺伝子がスポットされている事になる。さらに初期の検討結果から、このうち２８５は全ての臨床検体・細胞株を含めた異なる検体間で同様な発現パターンを示した事から以後の解析から除外した。この初期フィルタリングの結果、６３８６のユニークな遺伝子が以下の解析の対象として残った（図１）。１回のアレイ実験内でのデータの標準化はｌｏｗｅｓｓ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． （２００２）， ３０ ： ｅ１５）に準拠し、標準化されたシグナル強度をレファレンスサンプルのシグナル強度で割る事により値を得た後に、Ｔｓｅｎｇ等のプログラム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（２００１）， ２９ ： ２５４９−２５５７）を用いてＣＶ値が９６％信頼区間から外れるデータをｏｕｔｌｉｅｒとして以後の解析から除外した。得られたデータセットはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いてクラスター解析、視覚化を行った（図２）。腫瘍臨床検体と細胞株のデータの直接比較をした場合に異なる病型に関わらず臨床検体に共通して高い発現を示す遺伝子、逆に細胞株に共通して高い発現を示す遺伝子が認められた。これらの遺伝子を選別する目的でＢｉｎａｒｙ Ｓｅａｒｃｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを新たに考えた。すなはち、個々の遺伝子について全てのサンプルでのシグナルの平均値を求めこれより高い値を示すものに”１”、低い値を示すものに”０”の値を与える事により個々のサンプルのプロファイルをＢｉｎａｒｙ Ｓｔｒｉｎｇｓとして表現した。これをｉｄｅａｌ ｓｔａｔｅ（臨床検体で全て”１”／細胞株で全て”０”あるいはその逆）のｓｔｒｉｎｇと比較して６６％以上のサンプルで”１”の場合、”ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ”、６６％以上のサンプルで”０”の場合、”ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ”とした。この処理により６３８６のユニークな遺伝子中２２１８が臨床検体で細胞株と比較して発現が高い（１３１３）あるいは低い（９０５）ものとして選別された（図３）。さらにこれら２２１８遺伝子のクラスタリングの結果を目で見て確認した結果、２９９の遺伝子は臨床検体と細胞株間で際立った発現の差を認めなかった事から残る１９１９を以下の検討からは除去する事とした（図４）。全てのフィルタリングの結果最終的に４２４０の遺伝子が解析の対象として残った。Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇの結果（図５、図６）、９０の検体（肺癌臨床検体４３、正常肺臨床検体６、肺癌細胞株３８、正常胎児繊維芽細胞株３）は４つの大きなｂｒａｎｃｈに分かれた（表３）。
【０１０３】
【表３】
ＳＣＬＣは小細胞性肺癌、ＳＣＣは扁平上皮癌、ＮＳＣＬＣは非小細胞性肺癌、ＡＣは腺癌、ＬＣＣは大細胞性癌を示す。また、＊は、非小細胞性肺癌由来細胞株（病型分類不明）を示す。
【０１０４】
Ｂｒａｎｃｈ １は殆ど全ての小細胞性肺癌由来細胞株と全ての小細胞性肺癌とカルチノイドの臨床検体を含む。Ｂｒａｎｃｈ ２には扁平上皮癌の臨床検体と細胞株が多く含まれ、Ｂｒａｎｃｈ ３は細胞株のｂｒａｎｃｈで胎児由来正常繊維芽細胞株は全てこのｂｒａｎｃｈに含まれる。Ｂｒａｎｃｈ ４には全ての腺癌、大細胞癌と正常肺の臨床検体が含まれる。２株の非小細胞性肺癌由来細胞株（病型分類不明）は上記４つのｂｒａｎｃｈからは独立したｂｒａｎｃｈを形成している。Ｂｉｎａｒｙ Ｓｅａｒｃｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを適用して、細胞株全般に固有の遺伝子発現プロファイルおよび臨床検体全般に固有の遺伝子発現プロファイルを除去する事により、それまで困難であった臨床検体と細胞株を直接比較する事が可能となった。特に小細胞性肺癌由来細胞株の大部分（１１／１３）と扁平上皮癌由来細胞株の一部（４／８）は夫々の細胞株が由来する病型の臨床検体クラスターに帰属された事からこれらの細胞株はもとの腫瘍の形質をよく保持していると考えられた。腺癌については今回実施したフィルタリング・クラスタリングでは正常肺組織との分離が不充分でかつ腺癌由来細胞株の帰属は得られなかった（０／１１）。この理由として、腺癌臨床検体が異なる分化度の症例からなっており、正常肺組織の混入度が高い為正常肺組織とのクラスター分離が不充分であったと考えられる一方、腺癌由来細胞株は由来する癌組織中の最も未分化な細胞が株化の過程で選択された事によると考えられた。
【０１０５】
以下に、各種病型肺癌で病型特異的に発現変化を示す遺伝子一覧を示す。
（１）正常肺組織で高発現していて癌化で低下するもの（表４）
【表４】
【０１０６】
（２）小細胞性肺癌で高発現を示すもの（表５）
【表５】
【０１０７】
（３）扁平上皮癌で高発現を示すもの（表６）
【表６】
【０１０８】
（４）カルチノイドで高発現を示すもの（表７）
【表７】
【０１０９】
（５）腺癌および正常肺組織で高発現を示すもの（表８）
【表８】
【０１１０】
上記フィルタリング法により、細胞株あるいは臨床検体に共通して発現亢進している遺伝子を解析から除外する事により病型特異的な遺伝子発現プロファイルを得る事ができた。病型特異的に高発現している遺伝子の中には全ての細胞に共通した基本的経路の構成成分は殆ど含まれていない事から、フィルタリングが予想通りの効果を発揮したものと考えられた。
【０１１１】
［実施例４］ 新規医薬品開発の為のターゲット分子の探索
これらの病型特異的遺伝子には既知の病型特異的マーカー（小細胞性肺癌のｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅマーカーや扁平上皮癌のケラチン等）が数多く含まれており、これらを除いた残りの遺伝子から新規医薬品開発の為のターゲット（例えば抗体療法のターゲット）としての可能性が想定されるものを検索した。その結果扁平上皮肺癌に特異的に発現上昇しているものとして、ＡＡ４２４８０４ （ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１； ＭＲＰ１）が選別された。ＭＲＰ１はグルタチオンを補助因子とするｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐで、臨床で一般的に用いられる抗癌剤である、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ＶＰ１６、ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ等を細胞外に排出する事によりこれらの薬剤に対する抵抗性を賦与するがｔａｘｏｌに対する感受性には変化を与えない（ＰＮＡＳ， １９９４ Ｓｅｐ； ９１： ８８２２−２６）。また、重金属ｏｘｙａｎｉｏｎであるｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ や ａｎｔｉｍｏｎｙの毒性に対しても抵抗性を賦与する事が報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００２ Ｍａｒ １；２９１）。また一方、ＭＲＰ１はＬｅｕｃｏｔｒｉｅｎｅ Ｃ４ （ＬＴＣ４）トランスポーターとしても知られている（Ｃｅｌｌ ２０００， Ｎｏｖ ２２； １０３： ７５７−６８）。興味深い事に、ＭＲＰ１を欠失させたマウスはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対して抵抗性となる事が示され、この効果がＭＲＰ１欠失の結果細胞内にＬＴＣ４が蓄積しｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎによりＬＴＣ４−ｓｙｎｔｈａｓｅの活性が低下し、ＬＴＣ４−ｓｙｎｔｈａｓｅとＬＴＡ４−ｈｙｄｒｏｌａｓｅ間の基質に対する競合がＬＴＡ４−ｈｙｄｒｏｌａｓｅ側にシフトした結果、肺胞滲出液中のＬＴＢ４レベルが増大した事によると説明されている（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００１； １６６： ４０５９−６４）。従ってＭＲＰ１を標的とした中和抗体は各種抗癌剤に対する多剤耐性を克服すると同時に、随伴するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対する抵抗性を賦与する事が期待でき、この分子を過剰発現した扁平上皮肺癌のａｄｊｕｎｃｔ ｔｈｅｒａｐｙに有効であると考える。
【０１１２】
【発明の効果】
本発明によって、ＭＲＰ１を発現した癌の治療に使用可能な新たな薬剤が提供できるものと期待される。抗ＭＲＰ１抗体を有効成分として含有する薬剤やスクリーニングによって得られるＭＲＰ１阻害剤は、各種抗癌剤の抗癌作用を増強する（癌細胞の抗癌剤に対する多剤耐性を克服する）と同時に、随伴するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対する抵抗性を賦与する事が期待される。また、抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤は、該抗癌剤の抗癌活性が持続する有効な薬剤になりうるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】６３８６の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。タイプに応じて着色された標本が、左側に示され、赤はＡＣ、緑はＳＣＣ、紫は正常、青はＳＣＬＣ、黒はＬＣＣ； オレンジ色はカルチノイド、茶色は線維芽細胞、ピンクはＮＳＬＣを表わしている。各欄は、特定の遺伝子を表わす。正方形は、４つの複製にわたる対数平均発現比率に従って着色されている。基準標本との関係において、赤は１より大きい発現比率（過剰発現）、緑は１未満（過小発現）、黒はほぼ１に等しい比率（発現変化無し）を表わしている。
【図２】本文中に記述されているように統計的にろ過することによって得られた細胞系統中の５２５５の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。タイプに応じて着色された標本が左側に示され、赤はＡＣ、緑はＳＣＣ、青はＳＣＬＣ、茶色は線維芽細胞、ピンクはＮＳＬＣを表わしている。各欄は、特定の遺伝子を表わす。正方形は４つの複製にわたる対数平均発現比率に従って着色されている。基準標本との関係において、赤は１より大きい発現比率（過剰発現）、緑は１未満（過小発現）、黒はほぼ１に等しい比率（発現変化無し）を表わしている。
【図３】腫瘍及び細胞系統の間で示差的に調節された遺伝子の同定を示す図および写真である。（Ａ）新鮮な標本に比べ細胞系統標本内で一般に過剰発現された９０５の遺伝子及び（Ｂ）新鮮な標本に比べて細胞系統標本中で一般に過小発現された１３１３の遺伝子についての全ての標本にわたる発現変化。（Ｃ）新鮮な標本と細胞系統標本の間で示差的に調節されている１９１９の遺伝子の２次元階層的クラスター化。左側の樹状図は、細胞系統標本と新鮮な標本のクラスター化を示す。分岐色は、図１に示されたとおりである。上部樹状図は、遺伝子のクラスター化を示している。
【図４】新鮮な標本と細胞系統標本の間で示差的に調節されるＢｉｎａｒｙ Ｓｅａｒｃｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍによって選択され２２１８の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。左側の樹状図は、細胞系統標本と新鮮な標本のクラスター化を示す。上部樹状図は、遺伝子のクラスター化を示す。新鮮な標本中でアップレギュレートされた遺伝子は右に向かってクラスター化している状態で示され、細胞系統標本中でアップレギュレートされた遺伝子は、左に向かってクラスター化している状態で示されている。主要データセットに内含させるのに、新鮮な標本と細胞系統標本の間で著しい対比を示さない遺伝子分岐（合計２９９）が選定された。
【図５】新鮮な標本又は細胞系統標本内の一般的に調節された遺伝子についてろ過した後の４２４０の遺伝子の削減されたデータセットの樹状図を示す写真である。標本は、図１の場合と同様に着色されている。左側に示されたグループは、特定の癌腫タイプの全く異なるクラスターを表わす。ｃｌ：細胞系統標本； ｆｒ：新鮮な腫瘍標本。
【図６】全く異なる発現パターンを示す、図５からの８つの選択された遺伝子クラスターの全ての標本にわたる発現プロファイルを示す写真である。図５からの樹状図及び強調されたクラスターは、参考として底部に沿って及び個々の遺伝子クラスターの間に示されている。（Ａ）カルチノイド内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｂ）正常組織内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｃ）ＡＣ及びＬＣＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｄ〜Ｅ）ＳＣＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｆ〜Ｈ）ＳＣＬＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ＭＲＰ１抗体を含有する抗癌剤の抗癌作用増強剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肺癌は全世界的に見て男女を問わず癌による死亡原因の第１位の位置を占めており、その数は増加の一途にある。また日本だけを見ても年間に５０，０００人の命が肺癌により失われている。肺癌は病理学的にはその形態から小細胞性肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＬＣ）と非小細胞性肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＮＳＣＬＣ）に分類され、後者はさらに扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＣ）、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＡＣ）、大細胞性癌（ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＬＣＣ）に分類されている。個々に分類された肺癌は悪性度、治療に対する反応性が異なる事から、正確な病型診断は治療指針を決定するうえで極めて重要である。非小細胞性肺癌の場合は病巣が限局していて明らかな転移を認めない場合には外科的手術による摘除が第１選択肢となるが、種々の状況により手術が困難な場合および術後の維持には化学療法および放射線療法による治療が選択される。化学療法に対する反応性は症例により異なるが一般に、複数の異なる作用機序に基づいた薬剤を組み合わせて用いる事により相乗的な効果を期待しつつ副作用を最小限とする努力が為されている。化学療法を行う場合にしばしば問題となるのが多剤耐性の獲得であり、薬物代謝酵素類の過剰発現や薬剤標的蛋白の変異、薬剤の細胞内取り込みの減少、逆に細胞外排出の増大等の機序の関与が知られている。この様な薬剤耐性と云う新しい機能の獲得には癌細胞のゲノムの不安定性が寄与している事から癌細胞のもつ特権とも云えるものであり、一般に化学療法で一度縮小した腫瘍が再燃する場合の多くに多剤耐性の獲得が付随している。従って新規な作用機序に基づいた治療薬の開発と多剤耐性の克服は癌の化学療法を考えるうえで極めて重要な課題である。
【０００３】
従来の化学療法剤の殆どは癌細胞と正常細胞が共通して利用している基本的な経路に帰属するターゲットに対するものであるが故に副作用との分離は困難である。一方でより癌に特異的なターゲットを見出す事を目標とした細胞癌化のメカニズムに関する研究は著しい躍進を遂げ、多くの癌抑制遺伝子が癌において変異をうけて不活性化している事が細胞癌化の主たる原因となっている事が明らかとなってきた。しかし、これらの癌抑制遺伝子産物の機能が明らかになり、その変異が惹き起こす細胞増殖あるいはアポトーシス制御の破綻が明らかになるにつれ、これらの癌抑制遺伝子産物が制御する経路は全ての細胞に共通した基本的な経路であり低分子化合物を用いてその破綻を是正する事は一般に困難で、唯一遺伝子治療による失われた癌抑制遺伝子産物の補充以外には副作用を分離した癌に特異的な治療は困難である事が明らかとなってきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、癌特異的な遺伝子を見出し、該遺伝子の産物に対する抗体を含有する薬剤を提供することにある。より詳細には、抗ＭＲＰ１抗体を含有する抗癌剤の抗癌作用増強剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
癌細胞における遺伝子発現の異常は広く知られた現象であり、問題となる癌が発生した臓器では発現が認められない遺伝子の異所性発現や胎生期にしか発現が認められない遺伝子の発現が知られている。これらの遺伝子産物のうち細胞表面蛋白は抗体療法の格好のターゲットとなり得るし、また胎生期の細胞を含めた特殊な細胞集団でのみ機能している細胞周期調節機構やシグナル伝達機構をターゲットとした薬剤を開発する事により副作用との分離が可能になると考えられる。以上の考えに基づいて、本発明者らは新規な肺癌の治療ターゲットを見出すべく、各種病型肺癌の遺伝子発現プロファイル解析を実施した。個々の症例毎に異なる遺伝子発現異常はテーラーメード療法の対象とはなるが新規医薬品開発の為のターゲットとしては不適である事から、本発明者らは病型特異的な遺伝子発現に焦点を当てて解析を行った。
【０００６】
３８例の肺癌由来細胞株および３例の正常繊維芽細胞株と４３例の肺癌臨床検体および６例の正常肺組織よりＲＮＡを調製、蛍光標識後７６８５種の遺伝子断片を固定化したスライドに対してハイブリダイゼーションを行った。通常行われるｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ（階層的）クラスタリングを実施した結果、全ての細胞株と臨床検体とはそれぞれ異なるクラスターに分離された。細胞株のクラスターは培養系に特有の要因により細胞株に共通した遺伝子発現により形成されたものと考えられ、一方臨床検体クラスターでは腫瘍検体に混在する正常組織の影響を強く受けているものと考えられた。そこで、これら培養細胞株あるいは臨床検体でそれぞれ共通して高発現あるいは発現低下している遺伝子を解析から除外する事により、各病型を反映した遺伝子発現プロファイルが得られるものと考え、これを可能とするフィルタリング法（Ｂｉｎａｒｙ Ｓｔｒｉｎｇ Ｓｅａｒｃｈ）を新たに考えた。該フィルタリング法により、細胞株あるいは臨床検体に共通して発現亢進している遺伝子を解析から除外することができ、病型特異的な遺伝子発現プロファイルを得る事ができた。病型特異的に高発現している遺伝子の中には全ての細胞に共通した基本的経路の構成成分は殆ど含まれていなかった。これらの病型特異的遺伝子には既知の病型特異的マーカー（例、小細胞性肺癌のｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅマーカーや扁平上皮癌のケラチン等）が数多く含まれており、これらを除いた残りの遺伝子から新規医薬品開発の為のターゲット（例えば抗体療法のターゲット）としての可能性が想定されるものを検索した。
【０００７】
その結果、扁平上皮肺癌に特異的に発現上昇しているものとして、ＭＲＰ１が選別された。ＭＲＰ１はグルタチオンを補助因子とするｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐで、臨床で一般的に用いられる抗癌剤を細胞外に排出する事によりこれらの薬剤に対する抵抗性を賦与することが知られている。また、重金属の毒性に対しても抵抗性を賦与する事が報告されている。また一方、ＭＲＰ１はＬｅｕｃｏｔｒｉｅｎｅ Ｃ４ （ＬＴＣ４）トランスポーターとしても知られている。ＭＲＰ１を欠失させたマウスはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対して抵抗性となる事が示され、この効果がＭＲＰ１欠失の結果細胞内にＬＴＣ４が蓄積しｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎによりＬＴＣ４−ｓｙｎｔｈａｓｅの活性が低下し、ＬＴＣ４−ｓｙｎｔｈａｓｅとＬＴＡ４−ｈｙｄｒｏｌａｓｅ間の基質に対する競合がＬＴＡ４−ｈｙｄｒｏｌａｓｅ側にシフトした結果、肺胞滲出液中のＬＴＢ４レベルが増大した事によると説明されている。
【０００８】
以上の結果から、ＭＲＰ１を標的とした中和抗体は各種抗癌剤の抗癌作用を増強する（癌細胞の抗癌剤に対する多剤耐性を克服する）と同時に、随伴するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対する抵抗性を賦与する事が期待でき、この分子を過剰発現した癌のａｄｊｕｎｃｔ ｔｈｅｒａｐｙに有効であると考えられる。また、ＭＲＰ１を用いることで抗癌剤の抗癌作用を増強する薬剤をスクリーニングすることが可能になるものと考えられる。
【０００９】
即ち、本発明は、
〔１〕抗ＭＲＰ１抗体を有効成分として含有する、抗癌剤の抗癌作用を増強するための薬剤、
〔２〕抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤、
〔３〕癌が肺癌である、〔１〕または〔２〕に記載の薬剤、
〔４〕肺癌が扁平上皮肺癌である、〔３〕に記載の薬剤、
〔５〕抗ＭＲＰ１抗体を投与することを特徴とする、抗癌剤の抗癌作用の増強方法、
〔６〕抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を投与することを特徴とする、癌の治療方法、
〔７〕被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＭＲＰ１タンパク質に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該ＭＲＰ１タンパク質の活性を測定する工程、
を含み、上記ＭＲＰ１タンパク質の活性が、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強すると判定される方法、
〔８〕被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強すると判定される方法、
〔９〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法、
（ａ）〔７〕または〔８〕に記載の評価方法により、複数の被験試料ついて、抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する工程
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法、
（ａ）ＭＲＰ１タンパク質に複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＭＲＰ１タンパク質と被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）〔７〕または〔８〕に記載の評価方法により、該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料について、抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する工程
（ｅ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料から、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する工程
〔１１〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法、
（ａ）ＭＲＰ１タンパク質に複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＭＲＰ１タンパク質と被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料および抗癌剤を該抗癌剤に耐性を示す癌細胞に接触させる工程
（ｅ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料から、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する工程
〔１２〕〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載の工程に、さらに抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する医薬組成物の製造方法、
〔１３〕癌が肺癌である、〔５〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１４〕肺癌が扁平上皮肺癌である、〔１３〕に記載の方法、
を、提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、グルタチオンを補助因子とするｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐ として知られているＭＲＰ１（ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）が、癌特異的に過剰発現していることを見出した。該ＭＲＰ１は、臨床で一般的に用いられる抗癌剤を細胞外に排出する事によりこれらの薬剤に対する抵抗性を賦与することが知られている。よって、抗ＭＲＰ１抗体は、抗癌剤の抗癌作用の増強剤になりうる。また、抗癌剤とともに抗ＭＲＰ１抗体を有効成分として含有する薬剤は、該抗癌剤の抗癌活性が持続する有効な薬剤になりうる。一方、ＭＲＰ１はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎の成立に重要な役割を果たしていることが知られている。よって、上記薬剤は、癌に随伴するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対して抵抗性を賦与する薬剤としても使用できる。本発明は、このような特徴を有する薬剤を提供するものである。
【００１１】
本発明における癌としては、好ましくは肺癌であり、より好ましくは非小細胞性肺癌であり、さらに好ましくは扁平上皮肺癌である。また、本発明における抗癌剤としては、特に制限はないが、好ましくはＭＲＰ１により細胞外に排出される薬剤である。このような薬剤としては、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ＶＰ１６、ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ、重金属ｏｘｙａｎｉｏｎであるｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ、ａｎｔｉｍｏｎｙなどが例示できる。
【００１２】
また、本発明における抗体には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体変異体等が包含される。
【００１３】
本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、天然において起こり得る少量で存在する変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作用するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む慣用な（ポリクローナル）抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えば後述するハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ （１９７５） ２５６：４９５）、または、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９９１） ３５２：６２４−６２８； Ｍａｒｋｓ ｅｔａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． （１９９１）２２２：５８１−５９７）。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物学的活性を有する限り、このような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５ （１９８４））。
【００１４】
本発明において、「抗体変異体」とは、１またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアントであれ、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本発明における「抗体変異体」に含まれる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と１００％よりも少ない配列相同性、または類似性を有する。
【００１５】
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連抗原及びアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹膜内（ｉｐ）注射により非ヒト哺乳動物で作られる。免疫化される種に対して免疫原性の蛋白質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、仔ウシチログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに、例えば、マレイミドベンゾイル スルフォスクシンイミド エステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介した）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、塩化チオニル、若しくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＣＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）等の二機能性の薬剤若しくは誘導剤を用いて関連抗原を結合させることもできる。
【００１６】
例えば、１００μｇ若しくは５μｇの蛋白質若しくはコンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスについての量）を３倍量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバントと合わせ、溶液を複数回、皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫化する。一ヶ月後、動物をもとのＦｒｅｕｎｄ’ｓ完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの１／５〜１／１０量を複数の部位に皮下注射することにより追加免疫する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価について分析する。好ましくは、動物の追加免疫の際には、同じ抗原ではあるが異なる蛋白質に、及び／または、異なる交差結合試薬を介して結合されたコンジュゲートを用いる。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養蛋白質融合で作成することもできる。また、免疫応答を増幅するため、ミョウバン等の凝集剤が好ましくは用いられる。選択された哺乳動物抗体は通常、抗原に対して十分に強い結合親和性を有する。抗体の親和性は、飽和結合、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、及び競合分析（例えば、放射性免疫分析）により決定することができる。
【００１７】
所望のポリクローナル抗体のスクリーニング法としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｙ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ ｅｄｉｔ．（１９８８））に記載されるような慣用の交差結合分析を行うことができる。また、代わりに、例えば、エピトープマッピング（Ｃｈａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． （１９９５） ２７０：１３８８−１３９４）を行ってもよい。蛋白質または抗体の効力の測定方法として好ましいのは、抗体結合親和性の定量化を用いた方法であるが、その他の態様では、それに加えて、または結合親和性測定に代えて抗体の１若しくはそれ以上の生物学的特性を評価する方法を含む。このような分析法は特に、抗体の治療的な有効性を示すので有用である。通常、必ずしもではないが、このような分析において改善された特性を示す抗体はまた、結合親和性も増幅されている。
【００１８】
モノクローナル抗体は単一の抗原部位を認識する抗体であり、均一な特異性により、一般的に多数の異なる抗原部位を認識する抗体を含むポリクローナル抗体よりも有用である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法 （Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ （１９７５） ２５６：４９５）または、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）等により製造することができる。
【００１９】
ハイブリドーマ法では、マウス、または、ハムスター若しくはアカゲザル等の他の適当な宿主動物を免疫化に使用した蛋白質に対して特異的に結合する抗体を産生するか、または、産生できるリンパ球を誘導するために上述と同様に免疫化する。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてリンパ球を免疫化することもできる。その後、リンパ球をポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させハイブリドーマ細胞を形成させる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９０−１０３， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６））。製造されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の生育または成長を阻害する１またはそれより多くの物質を含む適当な培養培地に植え、生育する。例えば、もし親ミエローマ細胞がヒポキサンチン グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、そのハイブリドーマのための培養培地には、典型的には、ＨＧＲＰＴ欠損細胞の生育を阻止する物質ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンが含まれる（ＨＡＴ培地）。好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞において、安定で高いレベルで抗体を産生し、そして、ＨＡＴ培地等の培地に対して感受性の細胞である。これらの中で好ましいミエローマ細胞株は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． ＵＳＡ）から入手できるＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞、並びに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ． ＵＳＡ）から入手できるＳＰ−２、またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞等のマウスミエローマ細胞株である。ヒトミエローマ、及び、マウス−ヒトｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ細胞株も、ヒトモノクローナ抗体の産生に用いられてきた（Ｋｏｚｂａｒ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３３：３００１ （１９８４）； Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， ｐｐ．５１−６３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。
【００２０】
次に、ハイブリドーマ細胞が生育する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降、または、放射免疫分析（ＲＩＡ）若しくは酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）等のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合分析により測定する。所望の特異性、親和性及び／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限定的希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により生育する（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓａｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９−１０３， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）。この目的に適した培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＩＭ−１６４０培地である。さらに、ハイブリドーマ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで動物中の腹水腫瘍として生育させることもできる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、好ましくは培養培地、腹水液、または血清から、例えば、プロテインＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー等の慣用な免疫グロブリン精製方法により分離される。
【００２１】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させる。また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４ （１９９０））により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片は単離することができる。
【００２２】
Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８ （１９９１））、及びＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７ （１９９１））は、各々、ファージライブラリーを用いたマウス及びヒト抗体の単離について記載する。次の文献は、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体のチェーンシャッフリングによる製造（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３ （１９９２））について、そして、巨大なファージライブラリーを構築するための方法としてのコンビナトリアル感染、及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：２２６５−２２６６ （１９９３））について記載する。これらの技術も、モノクローナル抗体の単離のために従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代えて利用し得る。
【００２３】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖、及び軽鎖の定常ドメインのコード配列をそれに対するマウス配列に代えて置換すること（米国特許第４，８１６，５６７号； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１ （１９８４））、または免疫グロブリン蛋白質を共有結合により結合させることにより改変することができる。典型的には、このような非免疫グロブリン蛋白質は、１つの抗原に対して特異性を有する抗原結合部位、及び、異なる抗原に対して特異性を有する抗原結合部位を有するキメラ二特異性抗体を構築するため、抗体の定常ドメインで置換するか、または、抗体の抗原結合部位の可変ドメインを置換する。
【００２４】
また、本発明の蛋白質と結合する抗体としては、ヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体、および抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）等も挙げられる。
【００２５】
上記「ヒト型化抗体」とはマウス等のヒトにとって異種の抗体を改変して、Ｈ鎖とＬ鎖の相補性決定部以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造で置き換えた抗体を言う。「キメラ抗体」とは、異種抗体由来のＦａｂ領域とＦｃ領域とを有する抗体を意味する。
【００２６】
本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と呼ばれる、それぞれ１つの抗原結合部位を有する２つの同じ抗原結合断片、及び、残りの容易に結晶化するために「Ｆｃ」と呼ばれる断片が生じる。また、ペプシン消化により２つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得るＦ（ａｂ’）２断片、及び、残りの別な断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。その他の断片としては、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片より形成された多特異性抗体が含まれる。
【００２７】
ここで、「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。この領域は１つの重鎖及び軽鎖の可変ドメインが非共有結合により強く連結されたダイマーである（ＶＨ−ＶＬダイマー）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲは、抗体に抗原結合部位を付与するものである。しかしながら、１つの可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００２８】
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常ドメイン、及び、重鎖の細胞の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点で異なる。
【００２９】
本発明において、「ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、該断片は、同じ蛋白質鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖中で２つのドメインの間を結合できない位に短いリンカーを用いると、２つのドメインはもう一方の鎖の定常ドメインとペアを形成し、２つの抗原結合部位が創り出される。Ｄｉａｂｏｄｙはより詳細に、例えば、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、及びＨｏｌｌｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８ （１９９３））に記載される。
【００３０】
一本鎖抗体（以下、一本鎖Ｆｖ若しくはｓＦｖとも呼ぶ）、またはｓＦｖ抗体断片には、抗体のＶＨ及びＶＬドメインが含まれ、これらのドメインは単一の蛋白質鎖中に存在する。一般に、Ｆｖ蛋白質はさらに、ＶＨ及びＶＬドメインの間に蛋白質リンカーを含み、それによりｓＦｖは、抗原結合のために必要な構造が形成できる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏｌ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．２６９−３１５ （１９９４））参照。
【００３１】
多特異性抗体は、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。通常このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体）、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類の）抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）であり得る。
【００３２】
従来、抗体断片は天然の抗体のプロテアーゼによる消化により製造されてきた（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７ （１９９２）； Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１ （１９８５））が、現在は組換技術により製造することも可能である。例えば、上述の抗体ファージライブラリーから抗体断片を単離することもできる。また、大腸菌等の宿主より直接Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片を回収し、Ｆ（ａｂ’）２断片の形態に化学的結合させることもできる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７ （１９９２））。さらにまた別の方法としては、Ｆ（ａｂ’）２断片を直接、組換宿主培養物から単離することもできる。その他、一本鎖抗体等の断片の作製方法も公知である一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。
【００３３】
当分野において多特異性抗体の製造法は公知である。全長の二特異性抗体の産生は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の共発現を含むものである（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９ （１９８３））。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖はランダムに取り合わされるので、共発現を行う得られた複数のハイブリドーマ（クワドローマ）は、各々異なる抗体分子を発現するハイブリドーマの混合物であり、このうち正しい二特異性抗体を産生するるものを選択する必要がある。選択はアフィニティークロマトグラフィー等の方法により行うことができる。また、別な方法では所望の結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。該定常ドメイン配列は、好ましくは免疫グロブリンの重鎖の定常領域の内、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖のＣＨ１領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。別々の発現ベクターに各遺伝子を挿入することにより、それぞれの鎖の存在割合が同じでない方が、得られる抗体の収量が上がる場合に、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。
【００３４】
好ましい態様においては、第一の結合特性を有する重鎖がハイブリッド免疫グロブリンの一方の腕として存在し、別の結合特性の重鎖−軽鎖複合体がもう一方の腕として存在する二重特異性抗体が望ましい。このように一方の腕のみに軽鎖を存在させることにより、二重特異性抗体の他の免疫グロブリンからの分離を容易に行うことができる。該分離方法については、ＷＯ９４／０４６９０参照。二特異性抗体の作成方法については、さらに、Ｓｕｒｅｓｈら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０ （１９８６））の方法を参照することができる。組換細胞培養物から得られる最終産物中のホモダイマーを減らしヘテロダイマーの割合を増加させる方法として、抗体の定常ドメインのＣＨ３を含み、一方の抗体分子において、他方の分子と結合する表面の１若しくは複数の小さな側鎖のアミノ酸を大きな側鎖のアミノ酸（例えば、チロシンやトリプトファン）に変え、他方の抗体分子の対応する部分の大きさ側鎖のアミノ酸を小さなもの（例えば、アラニンやスレオニン）に変えて第一の抗体分子の大きな側鎖に対応する空洞を設ける方法も知られている（ＷＯ９６／２７０１１）。
【００３５】
二重特異性抗体には、例えば、一方の抗体がアビジンに結合され、他方がビオチン等に結合されたようなヘテロ共役抗体が含まれる（米国特許第４，６７６，９８０号；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／００３７３；ＥＰ０３０８９）。このようなヘテロ共役抗体の作成に利用される架橋剤は周知であり、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号にもそのような例が記載されている。
【００３６】
また、抗体断片より二特異性抗体を製造する方法も報告されている。例えば、化学結合を利用して製造することができる。例えば、まずＦ（ａｂ’）２断片を作成し、同一分子内でのジフルフィド形成を防ぐため断片をジチオール錯化剤アルサニルナトリウムの存在化で還元する。次にＦ（ａｂ’）２断片をチオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。メルカプトエチルアミンを用いて一方のＦ（ａｂ’）２−ＴＮＢ誘導体をＦａｂ’−チオールに再還元した後、Ｆ（ａｂ’）２−ＴＮＢ誘導体及びＦａｂ’−チオールを等量混合し二特異性抗体を製造する。
【００３７】
組換細胞培養物から直接、二重特異性抗体を製造し、単離する方法も種々、報告されている。例えば、ロイシンジッパーを利用した二重特異性抗体の製造方法が報告されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５４７−１５５３ （１９９２））。まず、Ｆｏｓ及びＪｕｎ蛋白質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させ、ホモダイマーの抗体をヒンジ領域においてモノマーを形成するように還元し、抗体へテロダイマーとなるように再酸化する。また、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、これら２つのドメイン間での対形成できない位に短いリンカーを介して連結し、相補的な別のＶＬ及びＶＨドメンと対を形成させ、それにより２つの抗原結合部位を形成させる方法もある（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８ （１９９３））。また、一本鎖Ｆｖ（ｓＦＶ）を用いたダイマーについても報告されている（Ｇｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８ （１９９４））。さらに、二重特異性ではなく三重特異性の抗体についても報告されている（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０ （１９９１））。
【００３８】
ヒト型化抗体は、免疫原（抗原）をヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫し、既存の一般的な抗体産生方法によって取得することができる。用いるヒト型化抗体産生非ヒト哺乳動物、特にヒト型化抗体産生トランスジェニックマウスの作製方法は公知である（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１ （１９９４）； Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６ （１９９７）；特表平４−５０４３６５号公報；特表平７−５０９１３７号公報；日経サイエンス ６：４０−５０ （１９９５）；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報； Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９ （１９９４）；特表平６−５００２３３号公報等）。
【００３９】
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより宿主を形質転換して得られる遺伝子組換え宿主であって、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する宿主を培養することにより培養上清中から得ることもできる。ここで、該宿主は受精卵以外の真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞である。
【００４０】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８） が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ， ＰＯＲＯＳ， Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ． Ｆ． （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 等が挙げられる。
【００４１】
抗体には各種試薬を結合して使用することもできる。このような試薬としては、ドキソルビシン、メトトレキセート、タキソールなどの化学療法剤、重金属、放射核種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ解毒素などのトキシン類を挙げることができる。治療用試薬との結合体を生産する方法および治療用に使用する方法については、米国特許５０５７３１３号、米国特許５１５６８４０号に記載されている。
【００４２】
また、抗癌剤の抗癌作用を増強することを目的として、抗ＭＲＰ１抗体、または、抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤を投与することにより、癌の治療（または癌の予防）を行うことが可能である。また、該薬剤を投与することで、癌に随伴するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対する抵抗性を賦与することも可能である。本発明は、これら疾患の治療方法（または癌の予防方法）もまた提供する。
【００４３】
抗ＭＲＰ１抗体、または、抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
【００４４】
抗ＭＲＰ１抗体、または、抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与を行うことも可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００４５】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００４６】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００４７】
また、患者の年齢、症状により適宜投与量を選択することができる。例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００４８】
本発明には、ＭＲＰ１タンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する抗癌剤もまた含まれる。
【００４９】
本発明において、ＭＲＰ１タンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体としては、特に制限はなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体が挙げられる。
【００５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列（例えば、アクセッションＡＡ４２４８０４）中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはＭＲＰ１タンパク質のＤＮＡ配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
【００５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとがＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１ 又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
【００５３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ＭＲＰ１タンパク質の産生細胞に作用して、該ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、ＭＲＰ１タンパク質の発現を抑制することにより、結果的にＭＲＰ１タンパク質の作用を抑制する効果を有する。
【００５４】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
【００５５】
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
【００５６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００５７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。
【００５８】
また、本発明は、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する方法、並びに、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法を提供する。
【００５９】
本発明の方法における「被検試料」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、「複数の被験試料」としては、特に制限はなく、例えば、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
【００６０】
本発明の方法において、ＭＲＰ１タンパク質が由来する生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。
【００６１】
また、本発明の方法において、「抑制されている」とは、完全に阻害されている場合だけでなく、減少している場合も含む。
【００６２】
本発明の評価方法の第一の態様としては、まず、ＭＲＰ１タンパク質に被験試料を接触させる。第一の態様に用いられるＭＲＰ１タンパク質の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
【００６３】
ＭＲＰ１タンパク質の精製は周知の方法で行うことができる（Ｍａｏ Ｑ． ｅｔ ａｌ．； Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９９ Ｎｏｖ ９；１４６１（１）：６９−８２．、Ｍａｏ Ｑ． ｅｔ ａｌ．； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０００ Ｎｏｖ ３；２７５（４４）：３４１６６−７２）。
【００６４】
また、ＭＲＰ１タンパク質が発現している細胞としては、内在性のＭＲＰ１タンパク質を発現している細胞、または外来性のＭＲＰ１タンパク質を発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＭＲＰ１タンパク質を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎで選択したＨ６９ＡＲ（小細胞性肺癌由来ＮＩＨ−Ｈ６９ の多剤耐性亜株）や、ｌｃ−１／ｓｑ（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ４９： ４３６−４４３， １９９１．）を用いることが可能である。
【００６５】
また、上記外来性のＭＲＰ１タンパク質を発現している細胞は、例えば、ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、当業者に一般的な方法によって実施することができる。また、上記外来性のＭＲＰ１タンパク質を有する細胞は、例えば、ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＭＲＰ１タンパク質が導入される細胞が由来する生物種としては、特に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
【００６６】
また、ＭＲＰ１タンパク質が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
【００６７】
また、本発明において「接触」は、ＭＲＰ１タンパク質の状態に応じて行う。例えば、ＭＲＰ１タンパク質が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＭＲＰ１タンパク質が発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＭＲＰ１タンパク質が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
【００６８】
第一の態様では、次いで、上記ＭＲＰ１タンパク質の活性を測定する。ＭＲＰ１タンパク質の活性としては、ＡＴＰａｓｅ活性、または、再構成したＭＲＰ１ ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅへの［３Ｈ］−ＬＴＣ４あるいは［３Ｈ］−Ｅ２−１７βＧの取り込み活性が挙げられる（Ｍａｏ Ｑ． ｅｔ ａｌ．； Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０００ Ｎｏｖ ３；２７５（４４）：３４１６６−７２）。
【００６９】
第一の態様においては、上記ＭＲＰ１タンパク質の活性が、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強すると判定される。
【００７０】
本発明の評価方法の第二の態様としては、まず、ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
【００７１】
第二の態様において、「機能的に結合した」とは、ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【００７２】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡもまた含まれる。
【００７３】
第二の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被験試料を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。
【００７４】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００７５】
また、ＭＲＰ１遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
【００７６】
また、該遺伝子からコードされるＭＲＰ１タンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該ＭＲＰ１タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＭＲＰ１タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該ＭＲＰ１タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
【００７７】
第二の態様においては、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強すると判定される。
【００７８】
さらに、本発明は、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料を効率的にスクリーニングする方法を提供する。本発明の抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法の一つの態様においては、上記評価方法を利用して、複数の被験試料について、抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価し、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する。
【００７９】
上記スクリーニング方法の他の態様においては、まず、ＭＲＰ１タンパク質に複数の被験試料を接触させる。次いで、ＭＲＰ１タンパク質と被験試料との結合を検出する。次いで、ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料を選択する。
【００８０】
ＭＲＰ１タンパク質を用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。ＭＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡを、ｐＳＶ２ｎｅｏ， ｐｃＤＮＡ Ｉ， ｐＣＤ８ などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしては ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｒｉｇｂｙ Ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ．３． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， ｐ．８３−１４１（１９８２））， ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｋｉｍら Ｇｅｎｅ ９１， ｐ．２１７−２２３ （１９９０））， ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ １０８， ｐ．１９３−２００ （１９９１））， ＲＳＶ ＬＴＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｃｕｌｌｅｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２， ｐ．６８４−７０４ （１９８７）， ＳＲ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８， ｐ．４６６ （１９８８））， ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ｐ．３３６５−３３６９ （１９８７））， ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １， ｐ．３８５−３９４ （１９８２））， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９， ｐ． ９４６ （１９８９））， ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ 等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
【００８１】
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法 （Ｃｈｕ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １５， １３１１−１３２６ （１９８７））、リン酸カルシウム法 （Ｃｈｅｎ， Ｃ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ， Ｈ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７， ２７４５−２７５２ （１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法 （Ｌｏｐａｔａ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ５７０７−５７１７ （１９８４）； Ｓｕｓｓｍａｎ， Ｄ． Ｊ． ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ， Ｇ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４， １６４２−１６４３ （１９８５））、リポフェクチン法 （Ｄｅｒｉｊａｒｄ， Ｂ． Ｃｅｌｌ ７， １０２５−１０３７ （１９９４）； Ｌａｍｂ， Ｂ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５， ２２−３０ （１９９３）； Ｒａｂｉｎｄｒａｎ， Ｓ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９， ２３０−２３４ （１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
【００８２】
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をＭＲＰ１タンパク質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてＭＲＰ１タンパク質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 １３， ８５−９０ （１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。また、融合ポリペプチドにすることによりＭＲＰ１タンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素 ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７ ｇｅｎｅ１０ タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、ＭＲＰ１タンパク質に結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学 １３， ８５−９０ （１９９５））。
【００８３】
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＭＲＰ１タンパク質、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ＭＲＰ１タンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。ＭＲＰ１タンパク質に対する抗体は、例えば、ＭＲＰ１タンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したＭＲＰ１タンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
【００８４】
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ 抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、ＭＲＰ１タンパク質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、ＭＲＰ１タンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
【００８５】
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｄ．： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｐｐ．５１１−５５２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８） ）記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
【００８６】
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはＭＲＰ１タンパク質に結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
【００８７】
また、ＭＲＰ１タンパク質を用いて、該ＭＲＰ１タンパク質に結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋらの方法（Ｓｋｏｌｎｉｋ， Ｅ． Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ （１９９１） ６５， ８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、ＭＲＰ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λｇｔ１１， ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識したＭＲＰ１タンパク質と上記フィルターとを反応させ、ＭＲＰ１タンパク質と結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。ＭＲＰ１タンパク質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、ＭＲＰ１タンパク質又はＭＲＰ１タンパク質に融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
【００８８】
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．， ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ， Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ． Ｇｅｎｅｔ． （１９９４） １０， ２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ， ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ （１９９２） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１， ａｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ． Ｃｅｌｌ ６８， ５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「ＭａｍｍａｌｉａｎＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
【００８９】
２−ハイブリッドシステムにおいては、ＭＲＰ１タンパク質またはその部分ペプチドをＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＭＲＰ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内でＭＲＰ１タンパク質と結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これによりＭＲＰ１タンパク質に結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
【００９０】
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
【００９１】
ＭＲＰ１タンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ＭＲＰ１タンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにＭＲＰ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、ＭＲＰ１タンパク質に結合したポリペプチドを調製することができる。
【００９２】
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００９３】
また、ポリペプチドに限らず、ＭＲＰ１タンパク質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定したＭＲＰ１タンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、ＭＲＰ１タンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ； Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ； Ｃｈａｎｇ Ｒ； Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ； Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ； Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ； Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ； Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ； Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．， Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ） Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．， Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ． Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ） Ｎｏｖ ７ １９９６， ３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｎａｔｕｒｅ （ＥＮＧＬＡＮＤ） Ｎｏｖ ７ １９９６， ３８４ ｐ１７−９）が当業者に公知である。
【００９４】
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ＭＲＰ１タンパク質と被験試料との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることによりＭＲＰ１タンパク質と被験試料との結合を評価することが可能である。
【００９５】
本発明のスクリーニング方法においては、上記方法により得られたＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料について、本発明の評価方法により、抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する。次いで、ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料から抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する。また、該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料および抗癌剤を該抗癌剤に耐性を示す癌細胞に接触させ、例えば該癌細胞の増殖を測定することで、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料（該癌細胞の増殖を阻害する試料）を選択することが可能である。上記癌細胞としては、特に制限はなく、ＭＲＰ１により細胞外に排出される薬剤（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎなど）に耐性を示す臨床検体や培養細胞株などが例示できる。
【００９６】
さらに、本発明においては、抗癌剤の抗癌作用を増強する医薬組成物の製造方法を提供する。該製造方法においては、上記スクリーニング方法によって抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料と上述した医薬上許容される担体とを混合する。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００９７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ アレイスライドの作成
スライドグラスに貼り付ける７６８５遺伝子のうち６７３４はＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社より購入したＩＭＡＧＥクローン、６９９は癌への関与が知られた、あるいは想定される中外所有のクローンに由来し、残る２５２は陰性コントロールとして加えた（Ａｌｕ配列、ルシフェラーゼ等）ものでデータ解析からは除外した。スライド作成はＨｅｇｄｅ，Ｐ．等の方法（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （２００１） ６１： ７７９２−７７９７）に準じて行い、Ｍｉｃｒｏｇｒｉｄ ＩＩ （ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ社製）を用いて１枚のスライドに７６８５遺伝子をｄｕｐｌｉｃａｔｅで貼り付けた。
【００９８】
［実施例２］ プローブの調製、ハイブリダイゼーション及び測定
３８株のヒト肺癌由来細胞株、３株の正常ヒト繊維芽細胞株（表１）、４３例の各種病型肺癌臨床検体および６例の正常肺組織（表２）を材料とした。
【００９９】
【表１】
【表２】
臨床検体は（財）癌研究会癌研究所にて患者のｉｎｆｏｒｍｅｄ ｃｏｎｓｅｎｔおよび倫理委員会の承認のもとで外科的摘除時に採取したものである。レファレンスサンプルとしては可能な限り多くの遺伝子について情報が得られる事を考慮して、２０％の正常肺組織にＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ｌｕ−１３４Ａ、ＭＲＣ５、ＳＱ５、Ｈ２３、ＰＣ１４、ＭＳ１の１０種の細胞株を夫々８％ずつ加えたものを用いた。全ての細胞株はＲＮＡｌａｔｅｒ （Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて細胞浮遊液とした。臨床検体はＲＮＡの分解を最小限にすべく採取後液体窒素にて瞬時に凍結せしめた。Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを抽出後、Ｌｕｏ， Ｌ．等の方法（Ｎａｔ． Ｍｅｄ． （１９９９） ５ ： １１７−１２２）に従ってｃＲＮＡ合成を行った。プローブ合成はＨｕｇｈｅｓ， ＴＲ等の方法（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１） １９ ： ３４２−３４７）に従って２ｕｇのｃＲＮＡを鋳型として行った。レファレンスサンプルはＣｙ３にてテストサンプルはＣｙ５にて蛍光標識した。ハイブリダイゼーションとその後の洗浄はＨｅｇｄｅ， Ｐ．等の方法（前出）に従った。ハイブリダイズしたシグナルの測定と定量はＳｃａｎｎａｒｒａｙ ４０００スキャナーとＱｕａｎｔａｒｒａｙ （何れもＰａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。
【０１０２】
［実施例３］ データ解析
全てのｃＲＮＡサンプルはｄｕｐｌｉｃａｔｅにて蛍光標識を行った。標識後のプローブを７６８５個のＤＮＡスポットがｄｕｐｌｉｃａｔｅで貼り付けてあるスライドにハイブリダイズさせる事により、個々の遺伝子について４回の独立した測定を行った。スポットした７６８５ ｅｌｅｍｅｎｔ中２５２はｃｏｎｔｒｏｌとして加えたもの（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、Ａｌｕ等）で残る７４３３のうち６３８４は５６２２個のＵｎｉＧｅｎｅクラスターに相当し、１０４９はＵｎｉＧｅｎｅクラスターに一致しない事から全体で６６７１個のユニークな遺伝子がスポットされている事になる。さらに初期の検討結果から、このうち２８５は全ての臨床検体・細胞株を含めた異なる検体間で同様な発現パターンを示した事から以後の解析から除外した。この初期フィルタリングの結果、６３８６のユニークな遺伝子が以下の解析の対象として残った（図１）。１回のアレイ実験内でのデータの標準化はｌｏｗｅｓｓ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． （２００２）， ３０ ： ｅ１５）に準拠し、標準化されたシグナル強度をレファレンスサンプルのシグナル強度で割る事により値を得た後に、Ｔｓｅｎｇ等のプログラム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（２００１）， ２９ ： ２５４９−２５５７）を用いてＣＶ値が９６％信頼区間から外れるデータをｏｕｔｌｉｅｒとして以後の解析から除外した。得られたデータセットはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いてクラスター解析、視覚化を行った（図２）。腫瘍臨床検体と細胞株のデータの直接比較をした場合に異なる病型に関わらず臨床検体に共通して高い発現を示す遺伝子、逆に細胞株に共通して高い発現を示す遺伝子が認められた。これらの遺伝子を選別する目的でＢｉｎａｒｙ Ｓｅａｒｃｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを新たに考えた。すなはち、個々の遺伝子について全てのサンプルでのシグナルの平均値を求めこれより高い値を示すものに”１”、低い値を示すものに”０”の値を与える事により個々のサンプルのプロファイルをＢｉｎａｒｙ Ｓｔｒｉｎｇｓとして表現した。これをｉｄｅａｌ ｓｔａｔｅ（臨床検体で全て”１”／細胞株で全て”０”あるいはその逆）のｓｔｒｉｎｇと比較して６６％以上のサンプルで”１”の場合、”ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ”、６６％以上のサンプルで”０”の場合、”ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ”とした。この処理により６３８６のユニークな遺伝子中２２１８が臨床検体で細胞株と比較して発現が高い（１３１３）あるいは低い（９０５）ものとして選別された（図３）。さらにこれら２２１８遺伝子のクラスタリングの結果を目で見て確認した結果、２９９の遺伝子は臨床検体と細胞株間で際立った発現の差を認めなかった事から残る１９１９を以下の検討からは除去する事とした（図４）。全てのフィルタリングの結果最終的に４２４０の遺伝子が解析の対象として残った。Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇの結果（図５、図６）、９０の検体（肺癌臨床検体４３、正常肺臨床検体６、肺癌細胞株３８、正常胎児繊維芽細胞株３）は４つの大きなｂｒａｎｃｈに分かれた（表３）。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
Ｂｒａｎｃｈ １は殆ど全ての小細胞性肺癌由来細胞株と全ての小細胞性肺癌とカルチノイドの臨床検体を含む。Ｂｒａｎｃｈ ２には扁平上皮癌の臨床検体と細胞株が多く含まれ、Ｂｒａｎｃｈ ３は細胞株のｂｒａｎｃｈで胎児由来正常繊維芽細胞株は全てこのｂｒａｎｃｈに含まれる。Ｂｒａｎｃｈ ４には全ての腺癌、大細胞癌と正常肺の臨床検体が含まれる。２株の非小細胞性肺癌由来細胞株（病型分類不明）は上記４つのｂｒａｎｃｈからは独立したｂｒａｎｃｈを形成している。Ｂｉｎａｒｙ Ｓｅａｒｃｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを適用して、細胞株全般に固有の遺伝子発現プロファイルおよび臨床検体全般に固有の遺伝子発現プロファイルを除去する事により、それまで困難であった臨床検体と細胞株を直接比較する事が可能となった。特に小細胞性肺癌由来細胞株の大部分（１１／１３）と扁平上皮癌由来細胞株の一部（４／８）は夫々の細胞株が由来する病型の臨床検体クラスターに帰属された事からこれらの細胞株はもとの腫瘍の形質をよく保持していると考えられた。腺癌については今回実施したフィルタリング・クラスタリングでは正常肺組織との分離が不充分でかつ腺癌由来細胞株の帰属は得られなかった（０／１１）。この理由として、腺癌臨床検体が異なる分化度の症例からなっており、正常肺組織の混入度が高い為正常肺組織とのクラスター分離が不充分であったと考えられる一方、腺癌由来細胞株は由来する癌組織中の最も未分化な細胞が株化の過程で選択された事によると考えられた。
【０１０５】
以下に、各種病型肺癌で病型特異的に発現変化を示す遺伝子一覧を示す。
（１）正常肺組織で高発現していて癌化で低下するもの（表４）
【表４】
（２）小細胞性肺癌で高発現を示すもの（表５）
【表５】
（３）扁平上皮癌で高発現を示すもの（表６）
【表６】
（４）カルチノイドで高発現を示すもの（表７）
【表７】
（５）腺癌および正常肺組織で高発現を示すもの（表８）
【表８】
上記フィルタリング法により、細胞株あるいは臨床検体に共通して発現亢進している遺伝子を解析から除外する事により病型特異的な遺伝子発現プロファイルを得る事ができた。病型特異的に高発現している遺伝子の中には全ての細胞に共通した基本的経路の構成成分は殆ど含まれていない事から、フィルタリングが予想通りの効果を発揮したものと考えられた。
【０１１１】
［実施例４］ 新規医薬品開発の為のターゲット分子の探索
これらの病型特異的遺伝子には既知の病型特異的マーカー（小細胞性肺癌のｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅマーカーや扁平上皮癌のケラチン等）が数多く含まれており、これらを除いた残りの遺伝子から新規医薬品開発の為のターゲット（例えば抗体療法のターゲット）としての可能性が想定されるものを検索した。その結果扁平上皮肺癌に特異的に発現上昇しているものとして、ＡＡ４２４８０４ （ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ−１； ＭＲＰ１）が選別された。ＭＲＰ１はグルタチオンを補助因子とするｄｒｕｇ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐで、臨床で一般的に用いられる抗癌剤である、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、ＶＰ１６、ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ等を細胞外に排出する事によりこれらの薬剤に対する抵抗性を賦与するがｔａｘｏｌに対する感受性には変化を与えない（ＰＮＡＳ， １９９４ Ｓｅｐ； ９１： ８８２２−２６）。また、重金属ｏｘｙａｎｉｏｎであるｓｏｄｉｕｍ ａｒｓｅｎｉｔｅ や ａｎｔｉｍｏｎｙの毒性に対しても抵抗性を賦与する事が報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００２ Ｍａｒ １；２９１）。また一方、ＭＲＰ１はＬｅｕｃｏｔｒｉｅｎｅ Ｃ４ （ＬＴＣ４）トランスポーターとしても知られている（Ｃｅｌｌ ２０００， Ｎｏｖ ２２； １０３： ７５７−６８）。興味深い事に、ＭＲＰ１を欠失させたマウスはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対して抵抗性となる事が示され、この効果がＭＲＰ１欠失の結果細胞内にＬＴＣ４が蓄積しｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎによりＬＴＣ４−ｓｙｎｔｈａｓｅの活性が低下し、ＬＴＣ４−ｓｙｎｔｈａｓｅとＬＴＡ４−ｈｙｄｒｏｌａｓｅ間の基質に対する競合がＬＴＡ４−ｈｙｄｒｏｌａｓｅ側にシフトした結果、肺胞滲出液中のＬＴＢ４レベルが増大した事によると説明されている（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００１； １６６： ４０５９−６４）。従ってＭＲＰ１を標的とした中和抗体は各種抗癌剤に対する多剤耐性を克服すると同時に、随伴するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対する抵抗性を賦与する事が期待でき、この分子を過剰発現した扁平上皮肺癌のａｄｊｕｎｃｔ ｔｈｅｒａｐｙに有効であると考える。
【０１１２】
【発明の効果】
本発明によって、ＭＲＰ１を発現した癌の治療に使用可能な新たな薬剤が提供できるものと期待される。抗ＭＲＰ１抗体を有効成分として含有する薬剤やスクリーニングによって得られるＭＲＰ１阻害剤は、各種抗癌剤の抗癌作用を増強する（癌細胞の抗癌剤に対する多剤耐性を克服する）と同時に、随伴するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺炎に対する抵抗性を賦与する事が期待される。また、抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤は、該抗癌剤の抗癌活性が持続する有効な薬剤になりうるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】６３８６の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。タイプに応じて着色された標本が、左側に示され、赤はＡＣ、緑はＳＣＣ、紫は正常、青はＳＣＬＣ、黒はＬＣＣ； オレンジ色はカルチノイド、茶色は線維芽細胞、ピンクはＮＳＬＣを表わしている。各欄は、特定の遺伝子を表わす。正方形は、４つの複製にわたる対数平均発現比率に従って着色されている。基準標本との関係において、赤は１より大きい発現比率（過剰発現）、緑は１未満（過小発現）、黒はほぼ１に等しい比率（発現変化無し）を表わしている。
【図２】本文中に記述されているように統計的にろ過することによって得られた細胞系統中の５２５５の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。タイプに応じて着色された標本が左側に示され、赤はＡＣ、緑はＳＣＣ、青はＳＣＬＣ、茶色は線維芽細胞、ピンクはＮＳＬＣを表わしている。各欄は、特定の遺伝子を表わす。正方形は４つの複製にわたる対数平均発現比率に従って着色されている。基準標本との関係において、赤は１より大きい発現比率（過剰発現）、緑は１未満（過小発現）、黒はほぼ１に等しい比率（発現変化無し）を表わしている。
【図３】腫瘍及び細胞系統の間で示差的に調節された遺伝子の同定を示す図および写真である。（Ａ）新鮮な標本に比べ細胞系統標本内で一般に過剰発現された９０５の遺伝子及び（Ｂ）新鮮な標本に比べて細胞系統標本中で一般に過小発現された１３１３の遺伝子についての全ての標本にわたる発現変化。（Ｃ）新鮮な標本と細胞系統標本の間で示差的に調節されている１９１９の遺伝子の２次元階層的クラスター化。左側の樹状図は、細胞系統標本と新鮮な標本のクラスター化を示す。分岐色は、図１に示されたとおりである。上部樹状図は、遺伝子のクラスター化を示している。
【図４】新鮮な標本と細胞系統標本の間で示差的に調節されるＢｉｎａｒｙ Ｓｅａｒｃｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍによって選択され２２１８の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。左側の樹状図は、細胞系統標本と新鮮な標本のクラスター化を示す。上部樹状図は、遺伝子のクラスター化を示す。新鮮な標本中でアップレギュレートされた遺伝子は右に向かってクラスター化している状態で示され、細胞系統標本中でアップレギュレートされた遺伝子は、左に向かってクラスター化している状態で示されている。主要データセットに内含させるのに、新鮮な標本と細胞系統標本の間で著しい対比を示さない遺伝子分岐（合計２９９）が選定された。
【図５】新鮮な標本又は細胞系統標本内の一般的に調節された遺伝子についてろ過した後の４２４０の遺伝子の削減されたデータセットの樹状図を示す写真である。標本は、図１の場合と同様に着色されている。左側に示されたグループは、特定の癌腫タイプの全く異なるクラスターを表わす。ｃｌ：細胞系統標本； ｆｒ：新鮮な腫瘍標本。
【図６】全く異なる発現パターンを示す、図５からの８つの選択された遺伝子クラスターの全ての標本にわたる発現プロファイルを示す写真である。図５からの樹状図及び強調されたクラスターは、参考として底部に沿って及び個々の遺伝子クラスターの間に示されている。（Ａ）カルチノイド内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｂ）正常組織内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｃ）ＡＣ及びＬＣＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｄ〜Ｅ）ＳＣＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｆ〜Ｈ）ＳＣＬＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。
Claims (14)
- 抗ＭＲＰ１抗体を有効成分として含有する、抗癌剤の抗癌作用を増強するための薬剤。
- 抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を有効成分として含有する薬剤。
- 癌が肺癌である、請求項１または２に記載の薬剤。
- 肺癌が扁平上皮肺癌である、請求項３に記載の薬剤。
- 抗ＭＲＰ１抗体を投与することを特徴とする、抗癌剤の抗癌作用の増強方法。
- 抗ＭＲＰ１抗体および抗癌剤を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
- 被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＭＲＰ１タンパク質に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該ＭＲＰ１タンパク質の活性を測定する工程、
を含み、上記ＭＲＰ１タンパク質の活性が、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強すると判定される方法。 - 被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＭＲＰ１遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ減少する場合に、被験試料が抗癌剤の抗癌作用を増強すると判定される方法。 - 以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法。
（ａ）請求項７または８に記載の評価方法により、複数の被験試料ついて、抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する工程 - 以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法。
（ａ）ＭＲＰ１タンパク質に複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＭＲＰ１タンパク質と被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）請求項７または８に記載の評価方法により、該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料について、抗癌剤の抗癌作用を増強するか否かを評価する工程
（ｅ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料から、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する工程 - 以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する試料のスクリーニング方法。
（ａ）ＭＲＰ１タンパク質に複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＭＲＰ１タンパク質と被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料および抗癌剤を該抗癌剤に耐性を示す癌細胞に接触させる工程
（ｅ）該ＭＲＰ１タンパク質と結合する被験試料から、抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料を選択する工程 - 請求項９〜１１のいずれかに記載の工程に、さらに抗癌剤の抗癌作用を増強すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、抗癌剤の抗癌作用を増強する医薬組成物の製造方法。
- 癌が肺癌である、請求項５〜１２のいずれかに記載の方法。
- 肺癌が扁平上皮肺癌である、請求項１３に記載の方法。
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|---|---|---|---|---|
| WO2022051390A1 (en) * | 2020-09-02 | 2022-03-10 | Kenjockety Biotechnology, Inc. | Anti-abcc1 antibodies and uses thereof |
| CN115772219A (zh) * | 2022-07-29 | 2023-03-10 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | 一种特异性结合mrp1蛋白的结合蛋白、试剂盒及其应用 |
-
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- 2002-07-19 JP JP2002211576A patent/JP2004051553A/ja active Pending
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