JP2986549B2 - 転写因子、ｎｆ−ｉｌ６／ｌａｐの調節 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、合衆国予防衛生研究所の付与するグラント
番号CA50528およびHL35018を基に、政府の支援を受けて
行われた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有す
る。

発明の背景 1.発明の分野 本発明は、遺伝子発現調節の分野に関し、特に、転写
因子、NF−IL6/LAPによる遺伝子の調節および活性化に
関する。

2.関連技術の記載 多くの真核遺伝子は、誘発可能な、細胞の種類に特異
的なまたは構造的な態様で調節される。遺伝子発現の調
節に深く関与している様々な種類の構造成分が存在す
る。配列特異的DNA結合タンパク質に結合するために働
く、遺伝子の近傍または遺伝子内に存在するシス−作動
性成分、またはトランス−作動性因子が存在する。タン
パク質のDNAへの結合は、遺伝子転写の開始、維持また
はダウンレギュレーションに寄与している。

遺伝子を制御するシス−作動性成分は、プロモータ
ー、エンハンサーまたはサイレンサーと呼ばれる。プロ
モーターは転写開始部位の前に配置され、方向依存的態
様で機能し、一方、エンハンサーおよびサイレンサー
は、プロモーターの活性を調節し、転写開始部位へのそ
の方向性と距離に関して柔軟性がある。

細胞外シグナルは、多くの種類の転写因子の活性を調
節する。シグナル調節性転写因子の重要な１群はBZipタ
ンパク質であるが、これは、それぞれDNA結合と二量体
化のために必要な保存的ベーシック（Ｂ）ドメインおよ
びロイシンジッパー（Zip）ドメインのためにこのよう
に呼称される。この種類の転写活性タンパク質で良く研
究されている幾つかの例には、転写因子のAP−1/jun/fo
sファミリーおよびCREB/ATFタンパク質が含まれるが、
これらは、それぞれTPA（12−Ｏ−テトラデカノイルフ
ォルボール−13−アセテート）反応成分およびサイクリ
ックAMP（cAMP）反応成分（CRE）と結合する。BZipタン
パク質による調節は、DNA結合機能や転写活性化機能に
限らず、ある細胞で発現される因子の発現レベルやレパ
ートリーにも影響を与える種々の複雑なメカニズム、転
写メカニズム、一時的および翻訳後メカニズムを含む。

NF−IL6/LAP（核因子−インターロイキン6/リンホカ
イン活性化タンパク質）は、転写アクチベーター（活性
化物質）のbZIPファミリーのメンバーの１つである。NF
−IL6/LAPタンパク質は肝臓の核内に極めて豊富であ
り、そこでは、このタンパク質は急性期反応の主要な調
節因子と考えられてきた。これはインターロイキン６
（IL−６）および他の炎症仲介物質によって誘発され
る。NF−IL6/LAPはまた、IL−１および細菌性リポ多糖
類（LPS）に反応してIL−６プロモーターの活性化に関
与する。NF−IL6/LAPは、インターロキン６（IL−
６）、インターロイキン８（IL−８）、顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−CSF）および腫瘍壊死因子α（TNF−α）
を含む幾つかのサイトカイン遺伝子の誘発に深く関与し
ている。これらの遺伝子は、NF−IL6/LAP認識配列を含
むシス−作動性成分を含む。

長年の間、遺伝子の発現またはそのメッセージのタン
パク質産物への翻訳に変化を与える能力について、種々
の薬剤が調べられてきた。現存の治療薬のもつ１つの問
題は、無差別的に作用し、健常な細胞に新生細胞と同じ
ように影響を与えるということである。これは多くの化
学療法に関する主要な問題で、このような場合には、主
として健常な細胞に対する毒性薬剤の作用のために重篤
な副作用が存在する。

前述の観点から、その遺伝子の発現産物が細胞増殖性
疾患と深い関係にある遺伝子の過剰発現に関連した異常
細胞に特異的な標的を同定する必要性が、健常細胞に対
す潜在的なマイナスの影響を減少させるために存在す
る。本発明は、そのような標的を提供する。

発明の概要 本発明はNF−IL6/LAPの部位特異的翻訳後修飾の予期
せぬ発現に基づき、これは、例えばサイトカイン遺伝子
のような種々の標的遺伝子を活性化するその能力を強化
する。その修飾とは、NF−IL6/LAPの105番のセリン残基
におけるリン酸化である。本発明は、トランス型活性化
活性を有し、105番残基でアミノ酸置換したNF−IL6/LAP
のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。

本発明は、NF−IL6/LAPに付随する免疫病理学的また
は細胞増殖性疾患をもつ対象者に、NF−IL6/LAP活性を
調整する試薬を治療的に有効な量で投与することによる
当該疾患の治療方法を提供する。

本発明はまた、約75位から約125位までのアミノ酸に
対応し、さらにそのリン酸化部位である105位のセリン
残基を含むNF−IL6/LAP上の領域を含む合成ペプチドを
提供する。さらに、本発明は、残基105のセリンがリン
酸化不能アナログ（例えばアラニン）で置換されている
ペプチドを提供する。このペプチドは、NF−IL6/LAP活
性化量を減少させたい場合に、天然に生じるNF−IL6/LA
Pをリン酸化するキナーゼに対して競合的阻害物質また
は疑似基質として有用である。

図面の簡単な説明 図１は、PKC経路の活性化が、NF−IL6/LAPの部位特異
的リン酸化を誘発することを示す。図1Aは、CMV−LAPを
トランスフェクトし、さらにpUC19、pCDM8−０またはpC
DM−PKCαのいずれかでトランスフェクトしてTPAで処理
し、³²P−NF−IL6/LAPで標識したHepG2細胞の免疫沈降
を示す;1Bは、TPAで刺激したHepG2細胞のウェスタンブ
ロッティングを示す;1Cは、インビボ標識NF−IL6/LAPの
トリプシン消化リンペプチドマップを示す。

図２は、pCMV−LAP（wt）またはpCMV−LAP（Ala105）
でトランスフェクトし、TPAで処理したHepG2細胞の二次
元電気泳動分析を示す。

図３はCATアッセーの結果で、セリン105のリン酸化は
その活性化機能を強化することを示す。図3Aは、CATレ
ポータープラスミド並びにpCMV−LAP（wt）、pCMV−LAP
（Ala105）およびpCMV−LAP（Asp）プラスミドを同時ト
ランスフェクトしたHepG2細胞のCAT活性を示す。3Bは、
CATレポータープラスミド並びにpCMV−LAP（wt）、pCMV
−LAP（Ala105）、pCDM8およびpCDM8−PKCαで同時トラ
ンスフェクトし、さらに血清枯渇させTPAで刺激したHep
G2細胞のCAT活性を示す。3Cは、pCDM8−０、pCMV−LAP
（wt）＋pCDM8−PKCα、pCMV−LAP（Ala105）＋pCDM8−
０およびpCMV−LAP（Asp105）＋pCDM8−０で同時トラン
スフェクトしたHepG2細胞の移動度シフトアッセーを示
す。

図4Aは、キメラ活性化因子LAP/GAL4を作製するため
に、酵母GAL4DNA−結合ドメイン（aal−147）のＮ−末
端に連結させたNF−IL6/LAP（aa21−144）のトランス型
活性化ドメインの模式図を示す。図4Bは、GAL4応答性レ
ポーター5xGAL4−LUCおよびpSV40−LAP（Ser105）/GAL
4、pSV40−LAP（ALA105）/GAL4またはpSV40−LAP（Asp1
05）/GFL4発現ベクターでトランスフェクトした細胞の
ルシフェラーゼ活性を示す。図4Cは、4Bと同じである
が、プラスミドpCDM8−PKCαもまたトランスフェクトし
た。

図５は、NF−IL6/LAPのヌクレオチド配列および推定
アミノ酸配列を示す。アミノ酸配列75−125には下線を
引いた。

発明の詳細な説明 本発明は、転写因子NF−IL6/LAPの活性化ドメイン内
の特定部位の発見に基き、この部位は、リン酸化される
とNF−IL6/LAP認識部位を含む遺伝子を活性化させると
いうNF−IL6/LAPの能力を増強する。NF−IL6/LAPは遺伝
子の特定部位に結合するトランス型活性化タンパク質で
あるので、NF−IL6/LAPの活性化の調節は、正常な遺伝
子発現、細胞増殖制御および炎症において重要であろ
う。セリン残基105という特定のリン酸化部位の発見
は、NF−IL6/LAP認識部位を含むこのような遺伝子の遺
伝子発現の制御手段を提供するかもしれない。

本発明は、野性型NF−IL6/LAPのアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを提供するが、105位のアミノ酸が、ト
ランス型活性化活性を強化または減少させるアミノ酸で
置換されていてもよい。好ましくは、その活性を強化し
たい場合は、負に帯電したアミノ酸、例えばアスパラギ
ン酸またはグルタミン酸に置換される。NF−IL6/LAP活
性を減少させたい場合は、中性アミノ酸に置換される。
好ましくは、中性アミノ酸はアラニンである。野性型NF
−IL6/LAPのトランス型活性化活性を強化または減少さ
せる他のアミノ酸で、105位のセリンを置換することも
できる。置換できる他のアミノ酸には、化学的に製造さ
れまたは修飾され、NF−IL6/LAPトランス型活性化活性
を変化させることができる合成アミノ酸が含まれる。

本発明のポリペプチドのアミノ酸の一次配列における
マイナーな修飾は、本明細書に開示した特定のポリペプ
チドと比較して実質的に同等の活性を有するポリペプチ
ドを生じるかもしれない。そのような修飾は、例えば部
位指向突然変異によるような意図されたものであって
も、また偶発的なものであってもよい。このような修飾
によって製造される全てのペプチドは、当該ポリペプチ
ドの生物学的活性が依然として存在する限り本発明に含
まれる。例えば、そのようなポリペプチドが、天然のNF
−IL6/LAPリン酸化部位（Ser105）に対して依然として
競合的抑制物質として作用することもあり、認識されに
くいリン酸化部位（Ala105）を提供することもあり、ト
ランス型活性化を高める部位（Asp105）を提供すること
もある。さらに、１つまたは２つ以上のアミノ酸の欠失
はまた、その活性を顕著に変化させることなく、生じた
分子の構造修飾をもたらすことが可能である。これによ
って、より広い利用性を有する、より小さな活性分子の
開発がもたらされるであろう。例えば、その生物学的活
性に不要であろうアミノ末端またはカルボキシ末端のア
ミノ酸を除去することが可能である。

本発明のNF−IL6/LAPポリペプチドはまた、このポリ
ペプチドの保存的変形も含む。上記のセリン105リン酸
化部位における限定的置換に加え、本発明は、本発明の
ポリペプチドのその他のアミノ酸配列における保存的変
形をも包含する。本明細書で用いられているように、
“保存的変形”とは、１つのアミノ酸残基を別の生物学
的に同様な残基と置換することを指す。保存的変形の例
には、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメ
チオニンのような１つの疎水性残基を別のものに置換す
ること、または１つの極性残基を別のものに置換するこ
と例えば、リジンをアルギニンに、アスパラギン酸をグ
ルタミン酸に、またはアスパラギンをグルタミンに置換
することなどを含む。“保存的変形”はまた、置換ポリ
ペプチドに対して作製された抗体が未置換ポリペプチド
と免疫的に反応するならば、未置換親アミノ酸の代わり
に置換アミノ酸を使用する場合も含む。

本発明はまた、配列番号１のアミノ酸配列をもつ合成
ペプチドおよびその保存的変形を提供する。この配列
は、NF−IL6/LAPポリペプチドのアミノ酸75−125をも
ち、リン酸化およびそれに続くNF−IL6/LAPの活性化の
ための部位となる105位のセリンを含む（Akiraら、EMBO
J.,6:1897（1990）;Descombesら、Genes ＆ Dev.,4:15
41（1990）;Poliら、Cell,63:643（1990））。本明細書
で用いられているように、“合成ペプチド”という用語
は、完全に天然で生じるタンパク質分子を含まないペプ
チドを指す。このペプチドは、化学合成、遺伝子組み換
え技術または完全抗体のフラグメント化のような技術を
用いて人間の仲介によって製造されるということにおい
て“合成”である。

本発明はまた、配列番号１の配列を有するペプチドで
あって、天然のNF−IL6/LAPの105位のセリンが修飾され
ているものを含む。例えば、修飾の１つは、セリンをア
ラニンで置換するものであり、それによってこのペプチ
ドのリン酸化を低下させる傾向を与える。本発明はま
た、配列番号１の配列を有するペプチドであって、天然
のNF−IL6/LAPの105位のセリンを負に帯電したアミノ酸
によって置換し、それによってトランス型活性化の活性
が強化されているものを含む。NF−IL6/LAPのトランス
型活性化の活性を強化するそのような負に帯電したアミ
ノ酸の例には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含
まれる。

本発明のペプチドは、α−アミン基のｔ−BOCまたはF
MOC保護のような通常的に用いられている方法によって
合成できる。この方法は両方とも、ペプチドのＣ−末端
から始まり、ただ１つのアミノ酸が各段階で付加される
多段合成を伴う（Coliganら、免疫学の今日のプロトコ
ル（Currenet Protocols in Immunology）、ウィリーイ
ンターサイエンス、（1991）、ユニット９参照）。本発
明のペプチドはまた、0.1−1.0mMolアミン/gポリマーを
含むコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いて、
メリーフィールド並びにスチュワートおよびヤンの記載
（Merrifield J.Am.Chem.Soc.,85:2149（1962）;Stewar
t ＆ Young固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Sy
nthesis）、フリーマン、サンフランシスコ（1969）、2
7−62ページ）にしたがって、既知の固相ペプチド合成
によって合成できる。化学合成の終了時には、ペプチド
は脱保護され、液体HF−10％アニゾールにより０℃約1/
4−１時間で処理してポリマーから切断される。試薬を
蒸発させた後、１％酢酸溶液でポリマーからペプチドを
溶出させ、続いて凍結乾燥させて粗物質が得られる。通
常は、この粗物質は例えば、溶媒として５％酢酸を用い
てセファデックスＧ−15でゲル濾過して精製できる。こ
のカラムの適切な分画を凍結乾燥して、均質なペプチド
またはペプチド誘導体が得られるが、続いてアミノ酸分
析、薄層クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラ
フィー、紫外線吸収分光分析、分子回転、溶解性および
固相エドマン分解による定量のような標準的技術によっ
て性状を決定できる。

本発明はまた、本発明のNF−IL6/LAPポリペプチド並
びに配列番号１の合成ペプチドおよび前述のその改造型
をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書で
用いられるように、“ポリヌクレオチド”とは、分離フ
ラグメント形または大型構築物の成分としてのデオキシ
リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを
指す。本発明のポリペプチドをコードするDNAは、cDNA
フラグメントからまたはオリゴヌクレオチドから組み立
てることができるが、これは、組換え体転写ユニット中
で発現させることができる合成遺伝子を提供する。本発
明のポリヌクレオチド配列は、DNA、RNAおよびcDNA配列
を含む。

本発明のDNA配列はいくつかの方法によって得ること
ができる。例えば、このDNAは、当該技術分野で周知の
ハイブリダイゼーション方法を用いて単離することがで
きる。これらには以下の手段が含まれるが、これに限定
されるものではない:1）共通するヌクレオチド配列を検
出するためにゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリ
ーに対してプローブをハイブリダイゼさせる、２）共通
した構造物を検出するために発現ライブラリーを抗体で
スクリーニングする、３）ポリメラーゼ鎖伸長反応（PC
R）によって合成する。

ハイブリダイゼーション法は、混合標識合成オリゴヌ
クレオチドプローブを用いることによって、組換え体ク
ローンをスクリーニングするについて有用である。この
場合、各プローブは、変性した二本鎖DNAの異種混合物
を含むハイブリダイゼーションサンプル中の特異的なDN
A配列に対して潜在的に完全な相補性を有する。そのよ
うなスクリーニングのために、ハイブリダイゼーション
は、好ましくは、一本鎖DNAまたは変性二本鎖DNAのいず
れかで実施される。対象ポリペプチドに関連するmRNA配
列の存在量が極めて少ない材料起源から得られたcDNAを
検出する場合に、ハイブリダイゼーションは特に有用で
ある。言い換えれば、非特異的結合を避けることを目的
とした厳格なハイブリダイゼーション条件を用いること
によって、混合物中のただ１つの完全に相補的なプロー
ブに対して標的DNAをハイブリダイズさせることによっ
て、特異的cDNAクローンを、例えばオートラジオグラフ
ィーによって可視化させることができる（Wallanceら、
Nucleic Acid Research,9:879（1981））。

本発明のNF−IL6/LAPポリペプチドをコードする特異
的DNA配列の作製はまた以下によって達成できる:1）ゲ
ノムDNAから二本鎖DNA配列を単離する、２）対象ポリペ
プチドに必要なコドンを提供するために、DNA配列を化
学的に製造する、３）真核ドナー細胞から単離したmRNA
の逆転写によって二本鎖DNAをインビトロで合成する。
後者の場合は、一般的にcDNAと呼称されるmRNAに相補的
な二本鎖DNAが最後に形成される。組換え体工程で使用
される特異的なDNA配列を作製するこれら３通りの方法
のうち、ゲノムDNA単離物の単離が最も共通性が少な
い。これは、哺乳類ポリペプチドを細菌で発現させたい
と考える場合に、イントロンの存在ゆえに特にそうであ
る。

所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の完全な配列
が分かっている場合は、DNA配列の合成はしばしば最良
の方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の完
全な配列が分からない場合、DNA配列の直接的合成は不
可能で、最良の方法はcDNA配列の合成である。対象cDNA
配列を単離する標準的な方法のうち、とりわけ、高レベ
ルの遺伝子発現をもつドナー細胞で豊富なmRNAの逆転写
に由来するプラスミドまたはファージ保有cDNAライブラ
リーが用いられる。ポリメラーゼ鎖伸長反応技術と組み
合わせて用いる場合は、発現産物が極めて稀であっても
クローニングが可能である。ポリペプチドのアミノ酸配
列の大半が分かっている場合は、標的cDNAに存在が推定
される配列を複製した標識一本鎖もしくは二本鎖DNAま
たはRNAプローブ配列を作製して、DNA/DNAハイブリダイ
ゼーション工程に用いることができる。この工程は、一
本鎖形に変性させたcDNAのクローニングコピーで実施さ
れる（Jayら、Nucl.Acid Res.11:2325（1983））。

cDNA発現ライブラリー例えばラムダgt11は、NF−IL6/
LAPに特異的な抗体を用いて、少なくとも１つのエピト
ープを有するNF−IL6/LAPポリペプチドを間接的にスク
リーニングすることができる。そのような抗体はポリク
ローナルかモノクローナルで、NF−IL6/LAPcDNAの存在
を示唆する発現産物を検出するために用いることができ
る。

ポリヌクレオチド配列は遺伝暗号から推定できるが、
コドンの縮退（degeneracy）は考慮されなければならな
い。本発明のポリヌクレオチドには、伝暗号の結果とし
て縮退した配列も含まれる。天然には20個のアミノ酸が
存在し、そのうちの大半は、１つ以上のコドンによって
特定される。したがって、NF−IL6/LAPのアミノ酸配列
が機能的なポリペプチドが生じるかぎり（少なくともポ
リヌクレオチドのセンス鎖において）、全ての縮退ヌク
レオチド配列が本発明に含まれる。

本発明のポリペプチドまたは合成ペプチド（配列番号
１）をコードするポリヌクレオチド配列を、原核細胞ま
たは真核細胞のいずれかで発現させることができる。宿
主には、細菌、酵母、昆虫および哺乳類生物が含まれ
る。原核細胞で真核細胞配列はウイルス配列を有するDN
A配列を発現させる方法は、当該技術分野で周知であ
る。宿主で発現と増殖が可能な生物学的に機能を有する
ウイルスおよびプラスミドDNAベクターは、当該技術分
野で周知である。そのようなベクターは、本発明のDNA
配列を組み入れるために用いられる。

ポリヌクレオチドをコードするDNA配列は、適切な宿
主細胞にDNAを移すことによってインビトロで発現させ
ることができる。“宿主細胞”とは、ベクターが増殖
し、そのDNAを発現させることができる細胞である。こ
の用語はまた対象の宿主細胞の一切の子孫を含む。増殖
中に変異が生じるので、全ての子孫が親細胞と同一であ
るとは限らないことは理解されるところである。しかし
ながら、“宿主細胞”という用語が用いられる場合に
は、そのような子孫も含まれる。適切な移入の方法、言
い換えれば、宿主中で外来DNAが接続的に維持される方
法は、当該技術分野で周知である。

本発明では、NF−IL6/LAPポリヌクレオチド配列は組
換え体発現ベクターに挿入してもよい。“組換え体発現
ベクター”という用語は、プラスミド、ウイルス、また
は遺伝配列の挿入または組み込みによって操作された当
技術分野の既知の他の運搬体を指す。そのような発現ベ
クターは、挿入された遺伝配列の宿主による効率的転写
を促進するプロモーターを含む。発現ベクターは、典型
的には、形質転写細胞の表現型選別を可能にする特定遺
伝子の他に複製起点、プロモーターを含む。本発明の使
用に適したベクターには以下のものが含まれるが、これ
らに限られるものではない：細菌での発現にT7主体発現
ベクター（Rosenbergら、Gene 56:125（1987））、哺乳
類細胞での発現にpMSXND発現ベクター（Lee ＆ Nathan
s,J.Biol.Chem.263:3521（1988））、昆虫細胞での発現
にバキュロウイルス由来ベクター。DNAセグメントは、
調節成分例えばプロモーター（例えばT7、メタロチオネ
インＩ、またはポリヘドリンプロモーター）に機能でき
るように連結されて存在する。

ベクターは、発現ベクターを含む宿主細胞を識別する
ために、表現型として選別できるマーカーを含むことが
できる。原核細胞の発現ベクターとして典型的に用いら
れるマーカーの例には、アンピシリン（β−ラクタマー
ゼ）、テトラサイクリンおよびクロラムフェミコール
（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）
に対する抗生物質耐性遺伝子が含まれる。哺乳類発現ベ
クターで代表的に用いられるマーカーの例には、アデノ
シンデアミナーゼ（ADA）、アミノグリコシドホスホト
ランスフェラーゼ（neo、G418）、ジヒドロホレートレ
ダクターゼ（DHFR）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホト
ランスフェラーゼ（HPH）、チミジンキナーゼ（TK）お
よびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（XGPRT、gpt）に対する遺伝子を含む。

組換え体DNAによる宿主細胞の形質転換は、当業者に
周知の通常の技術によって実施できる。宿主が原核細胞
（例えば大腸菌）である場合、DNAの取り込み能力をも
つコンピテント細胞は、増殖期後に採取し続いて当業者
に周知の技術で塩化カルシウム法で処理した細胞から調
製できる。また別には、MgCl₂またはRbClを用いてもよ
い。形質転換は、宿主細胞のプロトプラストを形成して
から実施してもよいし、また電気的穿孔によって実施し
てもよい。

宿主が真核細胞の場合は、リン酸カルシウム共沈、通
常の機械的方法例えばマイクロインジェクション、電気
的穿孔、リポゾーム封入プラスミドの挿入、またはウイ
ルスベクターのようなDNAのトランスフェクション方法
が用いられる。真核細胞はまた、本発明のポリペプチド
をコードするDNA配列とともに、選別可能な表現型をコ
ードする第二の外来DNA分子例えばヘルペスシンプレッ
クスチミジンキナーゼ遺伝子を同時トランスフェクトす
ることができる。別の方法は、真核細胞ウイルスベクタ
ー例えばシミアンウイルス40（SV40）またはウシパピロ
ーマウイルスを用いて、一時的に真核細胞を感染または
形質転換させ、当該タンパク質を発現させる（真核細胞
ウイルスベクター（Eukaryotic Viral Vectors）、コー
ルドスプリングハーバー研究所、Gluzman偏（198
9））。哺乳類宿主細胞の例には、COS、BHK、293および
CHO細胞が含まれる。

本発明で提供されるポリペプチドまたはそのフラグメ
ントを発現した宿主細胞の単離および精製は、調製用ク
ロマトグラフィーおよび免疫学的分離（モノクローナル
抗体はまたはポリクローナル抗体を含む）を含む通常の
手段によって実施できる。

さらに、NF−IL6/LAPのためのリボザイムヌクレオチ
ド配列も本発明に含まれる。リボザイムは、DNA制限エ
ンドヌクレアーゼと同じ態様で特異的に他の一本鎖RNA
を切断する能力をするRNA分子である。これらのRNAをコ
ードするヌクレオチド配列の修飾を通して、RNA分子の
特異的ヌクレオチド配列を認識し、これを切断する分子
を創出することができる（Cech、J.Amer.Med.Assn.,26
0:3030（1988））。このアプローチの主要な利点は、そ
れらは配列特異的であるが故に、特定の配列をもつmRNA
のみが不活性化されるということである。例えば、NF−
IL6/LAPのリン酸化部位の周辺の領域およびこの部位を
含む領域にリボザイムを誘導することができる。

リボザイムには２つの基本的なタイプが存在する、す
なわちテトラヒメナ型（Hasselhoff、Nature,334:585
（1988））と、“ハンマーヘッド”型である。テトラヒ
メナ型リボザイムは、４塩基の長さの配列を認識し、一
方、“ハンマーヘッド”型リボザイムは、長さが11−18
塩基の配列を認識する。認識配列が長ければ長いほど、
そのような配列がもっぱら標的mRNA種にのみ生じる可能
性は高くなる。結果として、ハンマーヘッド型リボザイ
ムは、特異的mRNA種を不活性化するについてテトラヒメ
ナ型リボザイムより好ましく、18塩基認識配列は、より
短い認識配列より好ましい。

本発明で提供される抗体は、本発明のポリペプチドま
たはペプチドと免疫反応性を有しまたはこれと結合す
る。実質的に、個々のモノクローナル抗体調製物だけで
なく、異なるエピトープ特異性をもつモノクローナル抗
体の集合物から成る抗体が提供される。モノクローナル
抗体は、当技術分野で既知の方法によって該タンパク質
フラグメントを含む抗原から作製される（Kohlerら、Na
ture,256:495（1975）；分子生物学の今日の手法（Curr
ent Protocols in Molecular Biology）、Ausubelら、
（1989））。

本発明のNF−IL6−LAPポリペプチドに結合する抗体
は、問題の小ペプチドを含む完全なポリペプチドまたは
フラグメントを用いて調製することができる。動物を免
疫するために用いられる配列番号１のようなポリペプチ
ドまたはペプチドは、cDNAの翻訳または化学合成から得
られ、精製して所望の場合には単体タンパク質に共役さ
せることができる。ペプチドに化学的に共役させる通常
用いられる単体には、キーホールリンペットのヘモシア
ニン（KLH）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（B
SA）および破傷風毒素が含まれる。続いてこの共役ペプ
チドを動物（例えばマウス、ラットまたはウサギ）の免
疫に用いる。

所望の場合には、ポリクローナル抗体はさらに、例え
ば抗体をそれに対して作製させたポリペプチドまたはペ
プチドを結合させたマトリックスに結合させ、さらに溶
出させることによって精製することができる。当業者に
は、モノクローナル抗体に限らずポリクローナル抗体の
精製および／または濃縮のための免疫分野で普通の種々
の技術は知りえるところであろう（例えば、Coligan
ら、免疫学の今日の手法（Currenet Protocols in Immu
nology）、ウィリーインターサイエンス、（1991）、ユ
ニット９参照、この文献は参照により本明細書に含まれ
る）。

本発明で用いられる“抗体”という用語は、完全な分
子の他にそのフラグメント、例えばFab、Ｆ（ab′）_２
およびFvを含むが、これらは、エピトープ決定基に結合
することができる。これらの抗体フラグメントは、選択
的にその抗原またはレセプターに結合するなんらかの能
力を保持し、以下のように定義される： （１）Fabとは、１つの抗体分子の一価の抗原結合フラ
グメントを含むフラグメントで、完全抗体を酵素パパイ
ンで消化して、１個の完全な軽鎖と１個の重鎖の一部分
を得ることによって製造できる； （２）Fab′とは、完全な抗体をペプシンで処理し、続
いて還元して完全な軽鎖１個と重鎖の一部分を得ること
によって調製できる抗体フラグメントで、１個の抗体分
子から２個のFab′フラグメントが得られる； （３）（Fab′）_２とは、完全抗体を酵素ペプシンで処
理し、その後の還元を行わないで得られるフラグメント
であり、Ｆ（ab′）_２は、２個のジスルフィド結合によ
って一緒に保持された２個のFab′フラグメントの二量
体である。

（４）Fvは２本の鎖として発現された、軽鎖の可変領域
と重鎖の可変領域を含む遺伝子工学的に創出されたフラ
グメントと定義される； （５）単鎖抗体（“SCA"）とは、遺伝子融合させた単鎖
分子として適切なリンカーで連結させた、軽鎖の可変領
域と重鎖の可変領域を含む遺伝子工学創出分子と定義さ
れる。

これらのフラグメントを作製する方法は当技術分野で
既知である（例えば、Harlow ＆ Lane,抗体（Antibodie
s）：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバ
ー、ニューヨーク（1988）を参照のこと、この文献は参
照により本明細書に含まれる）。

本発明で用いられるように、“エピトープ”という用
語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の一切の抗原
決定基を指す。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸ま
たは糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面分族から
成り、さらに通常は特異的電荷特性の他に特異的な三次
元構造特性を有する。

また、抗イディオタイプ技術を用いて、エピトープを
模倣するモノクローナル抗体を製造することも可能であ
る。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して作製さ
れた抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモ
ノクローナル抗体が結合するエピトープの“イメージ”
である超可変領域内の結合ドメインを有するであろう。
したがって、本発明では、NF−IL6/LAPポリヌクレオチ
ドまたは配列番号１の合成ペプチドに結合する抗体から
製造された抗イディオタイプ抗体は、NF−IL6/LAP認識
部位を含有する遺伝子のリン酸化およびその後の活性化
に必要なNF−IL6/LAP上の部位に対して競合的な抑制物
質として作用することができ、したがって特定の遺伝子
を活性化しないようにNF−IL6/LAPを妨げる。

本発明のNF−IL6/LAPトランス型アクチベータータン
パク質は、タンパク質の活性に影響を与える化合物また
は組成物の識別スクリーニングの方法として有用であ
る。したがって、ある実施例では、NF−IL6/LAPに影響
を与える組成物を識別する方法を提供し、この方法は：
被験組成物とNF−IL6/LAPを含む成分を、当該成分が相
互に作用するために十分な条件下でインキュベートし、
続いて当該組成物がトランス型活性化の活性に対して有
する作用を測定することを含む。NF−IL6/LAPに対して
認められる作用は、抑制性が刺激性（stimulate）かの
いずれかである。例えば、トランス型活性化活性の増加
または減少は、成分混合物に放射性化合物例えば³²P−A
TPを添加し、NF−IL6/LAPまたはセリン105を含む本発明
のペプチド（配列番号１）のセリン105への放射能取り
込みを調べることによって測定し、当該化合物がトラン
ス型活性化を抑制するか、刺激するかを決定することが
できる。この方法はまた、セリン105での置換を含むNF
−IL6/LAPポリペプチドにおける組成物の影響を測定す
るためにも有用である。また別に、他の標識もNF−IL6/
LAPに対する組成物の影響を決定するために用いること
ができる。例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、化学
発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵
素を用いることができる。当業者には他の適切な標識に
ついて理解し、または日常的な実験を用いてそのような
標識を確認することが可能であろう。

本発明はまた、NF−IL6/LAP関連免疫病理学的疾患の
治療用組成物を提供するが、この組成物は、NF−IL6/LA
P活性を調整する試薬を治療的に有効な量で含み、ま
た、この組成物は当該疾患をもつ対象者に投与され得
る。“免疫病理学的疾患”という用語は、免疫反応また
は一般に免疫の状態に深く関与する一切の疾患を指す。

本発明の組成物は、免疫病理学的疾患について上記に
述べたように、NF−IL6/LAPに関連する細胞増殖性疾患
の治療にも同様に用いることができる。“治療的に有効
な量”という用語は、例えば使用するポリペプチド、ペ
プチド、ポリヌクレオチドまたはモノクローナル抗体の
量が、NF−IL6/LAP関連疾患を緩和するために十分な量
であるという意味である。“細胞増殖性疾患”という用
語は、悪性だけでなく非悪性細胞増殖も意味し、後者は
しばしば周囲の組織と形態学的に異なる外観を呈する。
例えば、本組成物は、種々の器官系（例えば、肺、乳
房、リンパ系、胃腸管および泌尿生殖管）の悪性疾患の
他、腺癌（例えば殆どの大腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、
肺の非小細胞癌、小腸の癌および食道癌のような悪性疾
患を含む）を治療するために有用であろう。

本組成物は、また、非悪性または免疫関連細胞増殖疾
患、例えば乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症候群、
急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、虚血生心疾患、透析後症
候群、白血病、リューマチ様関節炎、後天的免疫不全症
候群、脈管炎、脂質組織球症、敗血症性ショックおよび
一般の炎症の治療に有用である。本質的には、病因学的
にNF−IL6/LAPと連携している一切の疾患に有効に作用
すると考えられる。

本発明の免疫病理学的疾患の治療用組成物は、NF−IL
6/LAP活性を調整する試薬を含む。“調整”という用語
は、NF−IL6/LAPが過剰にリン酸化されている場合にはN
F−IL6/LAPの抑制を意味し、そのリン酸化が低下してい
る場合はNF−IL6/LAP活性の増強を意味する。免疫病理
学的または細胞増殖性疾患が過剰リン酸化に連関してい
る場合は、例えば配列番号１のペプチドのような抑制性
試薬を、細胞内の天然のNF−IL6/LAPの競合的抑制物質
として用いることができる。例えば、NF−IL6/LAP（Ser
105）または（Asp105）ペプチドを細胞に導入し、NF−I
L6/LAPキナーゼによるリン酸化に対して競合させること
ができる。これらのペプチドは、転写因子として作用す
ることができないであろう。さらにNF−IL6/LAP結合抗
体または、本発明のペプチドに結合するモノクローナル
抗体に結合する抗イディオタイプ抗体もまた、本発明の
治療用組成物に含まれる。免疫病理学的疾患がNF−IL6/
LAPの低リン酸化と結びついており、NF−IL6/LAP認識部
位を含む遺伝子の発現レベルの低下と一致する場合は、
105位に負に帯電したアミノ酸を含む本発明のポリペプ
チドは本組成物に有効に含まれるであろう。

NF−IL6/LAP認識部位を含む遺伝子は、サイトカイン
遺伝子が含まれる。したがって、本発明の組成物は、サ
イトカイン遺伝子の発現と関連している免疫病理学的疾
患の治療薬として有効である。これらの遺伝子の例に
は、インターロイキン６（IL−６）、インターロイキン
８（IL−８）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）
および腫瘍壊死因子α（TNF−α）が含まれる。

本発明の抗体は、注射または時間をかけた緩慢な輸液
によって非経口的に投与できる。本発明のモノクローナ
ル抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、髄腔内また
は経皮的に投与できる。

本発明のペプチドは、モノクローナル抗体の投与につ
いて記載した方法で投与できる。ペプチドの体内送達に
ついて好ましい方法には、微小球体もしくは類タンパク
質中への被包化による経皮的な方法、肺へのエアーゾル
送達による方法、またはイオン浸透療法もしくは経皮的
電気穿孔による経皮的方法が含まれる。他の投与方法も
当業者には知りえるところである。

本発明のペプチドまたは抗体の注射投与用調製物は、
滅菌水溶液または非水性溶液、懸濁液および乳濁液を含
む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール、植物油例えばオリーブ油、および注
射可能有機エステル例えばオレイン酸エチルである。水
性担体には、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液また
は懸濁液を含み、食塩水および緩衝性媒体が含まれる。
注射用担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキス
トロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リ
ンゲル、不揮発油が含まれる。静脈内用担体は、液体と
栄養補充物、電活質補充物（例えばリンゲルデキストロ
ースを基礎としたようなもの）などを含む。保存料およ
び他の添加物、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤お
よび不活性ガスなど）もまた存在してもよい。

ポリヌクレオチド配列は、当業者に既知の種々の技術
によって治療として投与できる。そのような治療は、増
殖性疾患をもつ動物の細胞中にNF−IL6/LAPポリヌクレ
オチドを導入することによって治療効果を達成するであ
ろう。NF−IL6/LAPの送達（デリバリー）は、組換え体
発現ベクター例えばキメラウイルスまたはコロイド分散
系を用いて達成できる。ヌクレオチド配列の治療的送達
のために特に好ましいものは、標的設定（targeted lip
osome）リポゾームの使用である。本明細書で教示した
ように遺伝子治療に利用できる種々のウイルスベクター
は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアま
たは好ましくはレトロウイルスのようなRNAウイルスを
含む。好ましくは、レトロウイルスベクターは、ネズミ
またはニワトリのレトロウイルスから派生したウイルス
である。ただ１つの外来遺伝子を挿入できるレトロウイ
ルスベクターの例には以下が含まれるが、但しこれらに
限定されるものではない：モロニーネズミ白血病ウイル
ス（MoMuLV）、ハーベーネズミ肉腫ウイルス（HaMuS
V）、ネズミ乳癌ウイルス（MuMTV）、およびラウス肉腫
ウイルス（RSV）。さらに別の多数のレトロウイルスで
多くの遺伝子を組み込むことが可能である。これらのベ
クターの全ては、選択可能なマーカー用遺伝子を移送
（transfer）または組み込むことができ、それによっ
て、形質導入細胞を同定および増殖させることができ
る。特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドを
コードする別の遺伝子とともに、NF−IL6/LAP配列をウ
イルスベクターに挿入することによって、例えばこのベ
クターは標的特異的となる。例えば糖、糖脂質またはタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するする
ことによって、レトロウイルスベクターを標的特異的に
することができる。好ましい標的設定は、レトロウイル
スベクターを標的にする抗体を用いて達成される。当業
者には、NF−IL6/LAPポリヌクレオチドを含むレトロウ
イルスベクターの標的特異的送達を可能にするために、
レトロウイルスゲノムに挿入できる特異的ポリヌクレオ
チド配列を知ることができ、または不都合な実験を行う
ことなく容易に確めることができる。

組換え体レトロウイルスは不完全であるので、感染性
ベクター粒子を産生するために補助が必要である。この
補助は、例えばLTR内の調節配列の制御下でレトロウイ
ルスの全ての構造遺伝子を発現するプラスミドを含むヘ
ルパー細胞株を用いることによって提供できる。こっら
のプラスミドは、封入メカニズムが被包化のためのRNA
転写物を認識可能とするヌクレオチド配列を欠いてい
る。封入シグナルが欠失しているヘルパー細胞株には、
例えばΨ２、PA317およびPA12が含まれるが、これらに
限定されるものではない。これらの細胞株は、ゲノムが
封入されないので空ウイルス粒子（ビリオン）を産生す
る。封入シグナルは完全であるが、構造遺伝子が他の対
象遺伝子で置き換えられている細胞にレトロウイルスベ
クターが導入されると、ベクターは封入され、ベクター
ビリオンが産生される。この方法で産生されたベクター
ビリオンは、続いて組織細胞株例えばNIH3T3細胞の感染
に用いられ、大量のキメラレトロビリオンが産生され
る。

NF−IL6/LAPポリヌクレオチドのためのまた別の標的
設定送達システムは、コロイド分散系である。コロイド
分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球
体、ビーズ、並びに、油中水滴乳濁液、ミセル、混合ミ
セルおよびリポゾームを含む脂質基材システムが含まれ
る。本発明の好ましいコロイド系はリポゾームである。
リポゾームは人工膜担体で、これはインビトロおよびイ
ンビボでの送達用担体として有用である。サイズが0.2
−4.0μｍの範囲の大型単ラメラ小胞（LUV）が大型巨大
分子を含む水性緩衝液の相当な部分を被包することがで
きることが示されている。RNA、DNAおよび完全なビリオ
ンが水を含む内部に被包化され、生物学的に活性化形で
細胞に送達される（Fraleyら、Trends Biochem.Sci.,6:
77（1981））。哺乳類細胞の他に、植物、酵母および細
菌細胞にポリヌクレオチドを送達するためにもリポゾー
ムは用いられた。リポゾームを効果的な遺伝子伝達用担
体にするために、以下の特性がなければならない：
（１）対象遺伝子の生物学的活性を損なうことなく当該
遺伝子を高効率で被包化する；（２）非標的細胞に較
べ、標的細胞に優先的かつ実質的に結合する；（３）高
効率で標的細胞の細胞質に担体の水性成分を送達する；
（４）遺伝情報を正確にかつ効果的に発現させる（Mann
inoら、Biotechniques 6:682（1988））。

リポゾームの標的設定は解剖学的および機械的因子を
基に分類されている。解剖学的分類は選択性、例えば器
官特異性、細胞特異性およびオルガネラ特異性のレベル
に基づく。機械的標的設定は、それが受動的であるか能
動的であるかによって区別できる。受動的標的設定は、
類洞毛細管を含む器官内の細網内皮系（RES）細胞に分
布しようとするリポゾームの本来の傾向を利用する。他
方受動的標的設定は、リポゾームに特異的なリガンド例
えばモノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質
を共役させることによって、または本来生じる局在部位
以外の器官および細胞タイプに標的を設定するためにリ
ポゾームの構成またはサイズを変更することによってリ
ポゾームを変化させることを必要とする。

NF−IL6/LAPの特異的リン酸化部位としてのセリン105
の発見によって、当業者がNF−IL6/LAPをリン酸化する
特異的タンパク質キナーゼを見分けることが可能になっ
た。例えば、候補キナーゼをNF−IL6/LAPとともにイン
キュベートし、セリン105におけるリン酸塩の取り込み
を測定しNF−IL6/LAPタンパク質キナーゼを同定する。

以下の実施例は本発明を詳述することを目的とするも
のであって、制限することを目的とするものではない。
これらは代表的なものであるが、当業者に既知の他の方
法もまた選択的に用いることができる。

実施例１ PKC経路の活性化はNF−IL6/LAPの部位特異的リン酸化を
誘発する HepG2細胞の半集密（subconflent）培養物に、記載
（P.Descombesら、Genes ＆ Dev.,4:1541（1990）;C.R.
Mullerら、Cell,61:278（1990））にしたがってリン酸
カルシウム法を用いてpCMV−LAP（wt）（1.0μｇ）（De
scombesら、上掲書）、pGDM（3.0μｇ）およびpGDM8−P
KCα（3.0μｇ）（G.Jamesら、J.Cell Biol.,116:863
（1992））をトランスフェクトした。トランスフェクシ
ョン後、細胞を40時間培養液のみで保持し、〔³²P〕−
オルソホスフェート（2.5mCi/ml）で４時間標識付けし
た。表示の通り最後の20分間TPA（100ng/ml）を添加し
た。RIPA緩衝液（放射性免疫沈降緩衝液（Radio Immune
Precipitation Buffer））で細胞を溶解し、特異的抗
体（Descombesら、上掲書（1990））でNF−IL6/LAPを免
疫沈降させ、さらに記載（B.Binetruyら、Nature 351:1
22（1991））にしたがってSDS−ポリアクリルアミド−
ゲル−電気泳動によって分離した。ニトロセルロース上
にブロットを移した後、インビボ標識LAPをトリプシン
で消化した。消化ペプチドをメンブレンから溶出させ、
TLCプレートに滴下し、記載（W.J.Boyleら、Enzymol.,2
01:110（1991））にしたがって二次元電気泳動によって
分離した。記載の方法を（Descombesら、上掲書（199
0））を用いて、³²P標識でトランスフェクトしたHepG2
細胞から核抽出物を調製し、抗LAP抗体（Descombesら、
上掲書（1990））を用いてウェスタンブロッティンで分
析した。抗原抗体複合物は、ECL検出系（アマシャム）
を用いて可視化した。CMV−LAPは、NF−IL6/LAPのオー
プンな読み枠の二番目のATGで始まる肝臓において大半
が翻訳されるNF−IL6/LAP形をコードする（P.Descombes
ら、Cell 67:569（1991））。

NF−IL6/LAP活性の翻訳後制御を調べるために、12−
０−テトラデカノイル−フォルボール−13−アセテート
（TPA）およびPKCを用いた。この系の感受性を増強させ
るために、NF−IL6/LAPをコードするCMV−LAP発現ベク
ター（Descombesら、上掲書（1990））を、PKCα発現ベ
クター（G.Jamesら、J.Cell Biol.,116:863（1992））
の存在下で、無視できる量の内在性タンパク質を発現さ
せているHepG2へパトーマ細胞に同時トランスフェクト
した。TPAによるPKCαの活性化は、NF−IL6/LAPの全リ
ン酸化において少量ではあるが再現性のある増加をもた
らしたが（図1A、レーン３と４を比較）、その発現レベ
ルに対しては影響を与えなかった（図1B）。HepG2細胞
にCMV−LAP発現ベクターを一時的にトランスフェクト
し、〔³²P〕−オルソホスフェートとともにインキュベ
ートし、³²P標識NF−IL6/LAPを抗LAP抗体を用いて免疫
沈降によって精製した。細胞をpUC19（図1A、レーン
１）、pCDM8−０（レーン2;空の発現ベクター）またはp
CDM8−PKCα（レーン３および４）のいずれかで同時ト
ランスフェクトした。レーン４で用いた細胞は採取前に
20分間TPA（100ng/ml）で刺激した。

平行実験で、HepG2細胞を疑似トランスフェクト（レ
ーン１）またはCMV−LAP発現ベクター（レーン２−５）
でトランスフェクトした。細胞をpUC19（レーン２）、p
CDM8−０（レーン３）またはpCDM8−PKCα（レーン４お
よび５）で同時トランスフェクトした。レーン５で用い
た細胞は、採取前に20分間TPA（100ng/ml）で処理し
た。核抽出物を調製し、10μｇのサンプルを抗LAP抗体
を用いてウェスタンブロットで調べた。免疫ブロット
は、PKCαの存在下または非存在下で、他に翻訳された
（alternatively translated）LIPタンパク質の産生を
示さなかった（Descombesら、上掲書（1990））。免疫
精製NF−IL6/LAPのトリプシン消化二次元リンペプチド
解析（w.j.Boyleら、Meth.Enzymol.,201:201（1991））
によって、TPAによるPKCαの活性化はNF−IL6/LAPの部
位特異的リン酸化を刺激することが示された（図1C）。

インビボ標識NF−IL6/LAPのトリプンシン消化リンペ
プチマップ。等量のNF−IL6/LAPを、パネルＡ（レーン
３および４）で述べたようにトランスフェクトし、TPA
で処理（＋）または未処理（−）のHepG2細胞から単離
した。得られたペプチドを高電圧電気泳動（水平方向）
で、続いて上昇薄層クロマトグラフィー（垂直方向）で
分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。
PKC活性化後、リンペプチドＩおよび３の両方のレベル
が増加した。しかしながらリンペプチドＩのみが、別の
細胞タイプのTPA処理に反応して再現性をもって増加し
た。再現性をもって観察されたNF−IL6/LAP由来リンペ
プチドにのみ番号を付与した；他のリンペプチドは夾雑
タンパク質に由来する可能性が高い。矢印は起点を示
す。

内在性および一時的に発現させたNF−IL6/LAPの両方
が、異なる細胞タイプにおいてそれらのリン酸化部位で
同様な変化を受けることを確認するために、PKCαを安
定的に発現し、内在性NF−IL6/LAPを発現することが分
かっているラット線維芽細胞株でこのような実験を処理
した。HepG2細胞で認められたように、TPAは内在性およ
び一時的発現の両方のNF−IL6/LAPの部位特異的リン酸
化を刺激した。幾つかのリンペプチドのレベルはTPA処
理後増加したが、両方の細胞タイプで共通で、しかも内
在性および一時的発現NF−IL6/LAPの両方に生じた唯一
の変化は³²PペプチドＩのレベルの上昇であった（図1
C）。

実施例２ NF−IL6/LAPのPKC刺激リン酸化部位 105位にアラニンまたはアスパラギン酸のためのコド
ンを含む変異体NF−IL6/LAPクローンを、標準的な部位
指向変異技術（Ausubelら、Current Protocols in Mole
cular Biology,ユニット８ ウィリーインターサイエン
ス（1989））を用いて作製した。HepG2細胞を一時的にp
CMV−LAP（wt）またはpCMV−LAP（Ala105）でトランス
フェクトし、〔³²P〕−オルソホスフェート（2.5mCi/m
l）で４時間標識付けした。図１で述べたようにTPA（10
0ng/ml）で処理した後、細胞をRIPA緩衝液で溶解させ
た。等量の細胞溶解物から抗LAP抗体で免疫沈降によっ
て野性型および変異体NF−IL6/LAPを単離した（Descomb
esら、上掲書（1990））。トリプシン消化の後、実施例
１図１で述べたように二次元電気泳動でペプチドを分離
した。

リンペプチドＩの移動位置は、先の実験でそのリンア
クセプターとしてのSer105を含むことが観察されたリン
ペプチドのそれと同一のようであった。Ser105が実際TP
A応答リン酸化部位であるか否かを決定するために、コ
ドンをアラニンに置換した。野性型（wt）NF−IL6/LAP
またはNF−IL6/LAP（Ala105）を発現しているベクター
をHepG2細胞ヘトランスフェクトし、〔³²P〕−オルソホ
スフェートでインビボ標識した後、得られたタンパク質
を単離した。図２に示したように、AlaによるSer105の
置換はリンペプチドＩの出現を妨げた。

実施例３ Ser105のリン酸化後のNF−IL6/LAPの活性化 主要なTPA応答リン酸化部位としてSer105を同定した
後、NF−IL6/LAP活性に対するそのリン酸化の影響を調
べた。NF−IL6/LAP反応性レボーター遺伝子を活性化す
るwtNF−IL6/LAPの能力を、Ala105変異体の該レポータ
ー遺伝子を活性化させる能力と比較した（図３）。

NF−IL6/LAP反応性Ｄ−CATレポータープラスミド３μ
ｇ（Descombesら、上掲書（1990）;C.R.Mullerら、Cel
l.61:279（1990））を、pCMV−LAP（wt）、pCMV−LAP
（Ala105）およびpCMV−LAP（Asp105）発現ベクターの
量を増加させながら、HepG2細胞に同時トランスフェク
トした。48時間後に細胞を採取し、CAT活性を求めた。
結果は３回の実験の平均である（図3A）。

第二の実験では、HepG2細胞を３μｇのＤ−CATレポー
ター並びに、表示の通りpCMV−LAP（wt）、pCMV−LAP
（Ala105）、pCDM8およびpCDM8−PKCα発現ベクター
（各々１μｇ）で同時トランスフェクトした。トランス
フェクション後20時間で表示の通り、血清枯渇細胞をTP
A（100ng/ml）で刺激した。トランスフェクション後40
時間して細胞を採取し、CAT発現を測定した。結果は３
回の実験の平均である（図3B）。

次に、各々１μｇのpCDM8−０（レーン１）、pCMV−L
AP（wt）＋pCDM8−PKCα（レーン２と３）、pCMV−LAP
（Ala105）＋pCDM8−０（レーン４）、pCMV−LAP（Asp1
05）＋pCDM8−０（レーン５）でHepG2細胞を同時トラン
スフェクトした。細胞の核抽出物をトランスフェクショ
ン後20時間して調製した。レーン３の細胞は採取前20分
TPA（100ng/ml）で刺激した。移動度シフトアッセー
を、アルブミンプロモーターのＤ部位（オリゴＤ）（De
scombesら、上掲書（1990））に広がる³²P標識オリゴヌ
クレオチドを15pgを用いて実施した。NF−IL6/LAPおよ
び非特異的（NS）タンパク質DNA複合体の移動位置は、
遊離（Ｆ）プローブと同様に表示した。図は、プローブ
の約10％が特異的にNF−IL6/LAPによって移動した代表
的なゲル移動アッセーを示す（図3C）。

別の実験では、一定量（15pg）の³²P標識オリゴＤ
を、上記と同じ条件下で核抽出物の量を増加（μｇ）さ
せながらインキュベートした。特異的に結合したプロー
ブの分画をアンビス（Ambis）ゲルスキャナーで定量
し、核抽出物量の関数として作図した。50％占有に必要
な核抽出物量を表示した（図3D）。

細胞を２回氷冷リン酸緩衝食塩水で洗浄した後、ディ
グナムら（Dignamら、Nucleic Acids Res.,11:1475（19
83））にしたがい僅かに改造して核抽出物を調製した。
前述のように（Descombesら、上掲書（1990））、アル
ビミンプロモーターのＤ部位に広がる³²P標識オリゴヌ
クレオチドとともに核抽出物をインキュベートした。遊
離DNAおよびDNA−タンパク質複合体を６％ポリアクリル
アミドゲル上で解析した。

Ser105のリン酸化に続くNF−IL6/LAPの増加した活性
は、増加したDNA結合し親和性によるか否かを調べるた
めに、移動度シフトアッセーを実施した。種々のNF−IL
6/LAPベクターでトランスフェクトした細胞の核抽出物
を増量しながら、NF−IL6/LAP認識部位に広がる³²P標識
オリゴヌクレオチドとともにインキュベートした。特異
的結合は、wtと変異体NF−IL6/LAP発現ベクターの両方
の一時的なトランスフェクションによって顕著に増加し
た（図3C）。TPA処理およびSer105のAlaまたはAspによ
る置換は、DNA結合活性に全く影響を与えなかった（図3
D）。結合の特異性は競合実験および抗体スーパーシフ
ト実験によって明らかにされた。

両方とタンパク質（wtおよびAla105）は発現され（図
3C）、極めて同じようなレベルで核に移動したが、wtタ
ンパク質は、Ala105変異体よりも効果的な、NF−IL6/LA
P認識配列に連結させたCATレポーターのアクチベーター
であった（S.Akiraら、EMBO J.9:1897（1990）;Descomb
esら、上掲書（1990）;C.R.Mullerら、上掲書（199
0））。NF−IL6/LAP発現ベクターとのPKCα発現ベクタ
ー同時トランスフェクシャンおよびTPA処理は、トラン
ス型活性化を５倍増加させ、一方、NF−IL6/LAP（Ala10
5）によるトランス型活性化は影響されなかった（図3
B）。トランス型活性化に対するSer105リン酸化効果は
負に帯電した残基の導入によって模倣することができ
る；変異体NF−IL6/LAP（Asp105）は、wtタンパク質よ
りアクチベーターとして数倍強力であった（図3A）。こ
れらの結果は、Ser105のリン酸化はNF−IL6/LAPの活性
化機能に影響を与えることを強く示唆している。

実施例４ Ser105のリン酸化はNF−IL6/LAPの活性化機能を強化す
る Ser105のリン酸化がNF−IL6/LAPの活性化機能を強化
することを確認するために、wtおよび変異体（すなわ
ち、Ｎ−末端活性化ドメインのAla105、Asp105（Descom
besら、上掲書（1990））の両方をGAL4DNA結合ドメイン
（Sadowskiら、Nucleic Acids Res.,17:7639（1989））
に融合させた（図４）。

GAL4融合タンパク質を構成するために、pET8c−LAP
（Ser105）およびpET8c−LAP（Ala105）（Descombes
ら、上掲書（1990））のNco I−EcoR Iフラグメント
を、pSG424ベクター（Sadowskiら、上掲書（1989））の
改造体由来のGAL4DNA結合ドメイン（aal−147）のコー
ド配列を含むBapH I−EcoR Iフラグメントによって置き
変えた。キメラLAP−GAL4のオープンな読み枠をBgl II/
EcoR I消化により切り出し、GAL4DNA結合ドメインを除
去したpSG424ベクターでクローニングした。

NF−IL6/LAP（aa21−144）のトランス型活性化ドメイ
ン（黒枠）を酵母GAL4DNA結合ドメイン（aal−147）の
Ｎ−末端（斜線枠）を連結し、キメラアクチベーターLA
P/GAL4を作製した（図4A）。

次にGAL4応答レポーター5xGAL4−LUC（３μｇ）をpSV
40−LAP（Ser105）/GAL4、pSV40−LAP（Ala105）/GAL4
またはpSV40−LAP（Asp105）/GAL4発現ベクター（Desco
mbesら、上掲書（1990））の量を増しながら同時トラン
スフェクトした。40時間後、細胞を採取し、ルシフェラ
ーゼ活性を求めた。pSV40−LAP（Ser105）/GAL4ととも
に5xGAL4−LUCレポーターを同時トランスフェクトして
得られた最大ルシフェラーゼ活性を100％と考えた。結
果は２回の実験の平均である（図4B）。

表示のように、SV40−LAP（Ser105）/GAL4（10ng）、
pSV40−LAP（Ala105）/GAL4（10ng）、pCDM8−PKCα（1
00ng）とともに、5xGAL4−LUCレポーター（３μｇ）を
同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、
細胞を20時間血清枯渇させ、続いて20時間TPA（100ng/m
l）で処理するか、または未処理のままにした。細胞抽
出物を調製し、ルシフェラーゼ活性を求めた。結果は別
個の３回の実験の平均を示す（図4C）。

GAL4応答レポーター（5xGAL4−LUC）を活性化させるL
AP（Ser105）/GALの能力は、LAP（Ala105）/GAL4のそれ
と極めて類似しており、両者とも、GAL4DNA結合ドメイ
ン単独より50−200倍活性が高かった（図4B）。対照的
に、LAP（Asp105）/GAL4はLAP（Ser105）/GAL4より３倍
活性が高かった。LAP（Ser105）/GAL4の活性はPKCαの
活性化によって４倍刺激され、一方、LAP（Ala105）/GA
L4の活性は微かに増加しただけであった（図4C）。これ
らの結果は、NF−IL6/LAPの活性化の潜在能力はSer105
のリン酸化、その部位への負電荷の導入によって模倣さ
れる作用によって直接強化されることを示している。

Ser105は精製PKCによってインビトロでリン酸化され
ないので、この残基のリン酸化に反応するタンパク質キ
ナーゼはPKC自体であることはないであろう。さらに、
専ら核に存在する（G.Jamesら、J.Cell Biol.,116:863
（1992））PKCαの構造的に活性化された誘導体は、NF
−IL6/LAP活性またはリン酸化を刺激しない。しかしな
がら、この誘導体は、他の核タンパク質、例えばミオジ
ェニック（L.Liら、71:1181（1992）のリン酸化および
活性化に影響を与えることができる。PKCの活性化は、S
er105におけるNF−IL6/LAPのリン酸化に対して直接反応
するものを含む下流側のタンパク質キナーゼの活性化を
もたらす可能性が最も高い。本発明では、PKC活性化
は、炎症仲介物によって誘発される可能性があるシグナ
リング応答の一部分を模倣するために役立つ。

前述の記載は、本発明の範囲を詳述することを目的と
し、制限するためのものではない。実際、当業者には、
本明細書に記載されたものを基礎としてさらに別の具体
例を不適切な実験を行うことなく容易に考案することが
できるであろう。

配列番号表 配列番号１は、NF−IL6/LAPの（アミノ酸75−125）の
ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。

配列番号２は、NF−IL6/LAP（アミノ酸75−125）の推
定アミノ酸配列を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 トラウトヴァイン、クリスティアン ドイツ連邦共和国 デー―30171 ハノ ーヴァー フライリグラト ストリート 13 (56)参考文献 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．10［12 ］（1990）ｐ．6642−6653 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】残基105位のアミノ酸が置換されたNF−IL6
   /LAPであって、 （ａ）トランス型活性化活性を示し；さらに （ｂ）下記アミノ酸配列の31番目のセリン残基が該残基
   105位のアミノ酸に相当する部分アミノ酸配列を有する
   こと、 を特徴とする単離ポリペプチド。
2. 【請求項２】残基105位のアミノ酸が置換されたNF−IL6
   /LAPであって、 （ａ）トランス型活性化活性を示し；さらに （ｂ）下記アミノ酸配列の31番目のセリン残基が該残基
   105位のアミノ酸に相当する部分アミノ酸配列を有する
   こと、 を特徴とする単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌ
   クレオチド。