JP2000504211A

JP2000504211A - デプレニル誘導性タンパク質

Info

Publication number: JP2000504211A
Application number: JP9524806A
Authority: JP
Inventors: フュルスト，ペーター; バルトマイヤー，ペーター; タットン，ウィリアム・ジョージ
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1996-01-12
Filing date: 1996-12-21
Publication date: 2000-04-11
Also published as: GB9600660D0; AU1305097A; WO1997025421A3; WO1997025421A2; ATE310083T1; EP0873406B1; EP0873406A2; US6232118B1; DE69635457D1

Abstract

(57)【要約】神経細胞においてデプレニルが新規なペプチドを誘導することを発見した。このポリペプチドは、配列番号１に示す構造を有し、ここではＤＩＰ１（デプレニル誘導タンパク質１）と略記する。

Description

【発明の詳細な説明】デプレニル誘導性タンパク質本発明は神経活性薬により誘導される新規なペプチド、そのペプチドをコードする配列、およびそれらの利用に関与する。損傷した細胞、栄養供給の不十分な細胞または相反するシグナルを受けている細胞もしくはその標的がなくなった細胞は、プログラムされた細胞死またはアポトーシスにより除去され、その後完全に消滅し、痕跡を残らない。アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、小脳萎縮および多発性硬化症である希突起神経膠細胞死を含む多くの神経変性々疾病の神経細胞死はアポトーシスと関係が深いということが証明されつつある。アポトーシスから細胞を救済するには、救済された細胞が機能を保持しているという条件下に、神経変性々疾病の進行を停止させることである。デプレニル（(-)-Depreny１）（式１；以下デプレニルと呼ぶ）によりパーキンソン病の進行は遅延し、まだ不明である機構を用いてＰＣ１２細胞および希突起神経膠細胞から得られる栄養因子におけるインビトロ特性のみならず多くのインビボのパラダイム（軸索切断後の顔の運動性ニューロン死；ＭＰＴＰおよびＭＰＰ⁺による黒質におけるドパミン作用性細胞の破壊；一方の頚動脈閉塞後の一過性低酸素状態によるＣＡ₁海馬ニューロン死；全身的なカイネート（kainate）投与後の海馬錐体細胞死；視覚神経破壊後の網膜神経節細胞死）において恐らくニューロンはアポトーシス性細胞死から救済される。デプレニルは、デスメチルデプレニル（(-)-desmethyldeprenyl）を経てメタアンフェタミン（(-)-methamphetamine）およびアンフェタミン（(-)-amphetam ine）へと代謝され、それらはいずれもインビボおよびインビトロにおいてデプレニルの作用に効果的に拮抗する。それゆえ、デプレニルと同等かそれ以上の細胞救済作用を有し、拮抗性代謝を生じない化合物は神経変性病の処置において高い治療効果が見られる。我々は、神経細胞内においてデプレニルが新規なペプチドを誘導することを発見した。このペプチドは、配列番号１に示す構造を有する。なお、ここではＤＩＰ１（ＤｅｐｒｅｎｙｌＩｎｄｕｃｅｄＰｒｏｔｅｉｎ１）と略する。従って好ましくは配列番号１に示す構造を有するＤＩＰ１を提供する。列挙した配列はラットＤＩＰ１であるが、本発明はヒトＤＩＰ１を含むすべての種から派生するＤＩＰ１に関与する。さまざまな種におけるラットＤＩＰ１の相同タンパク質は、以下に示すように列挙した配列を使い標準的な方法により得られる。本発明は、配列番号１のペプチドの機能における誘導体をも含む。「機能性誘導体」とは、少なくとも一つのＤＩＰ１機能決定基が誘導体となっていることを意味する。そのような機能には、デプレニルによる誘導に対する感受性および／または少なくとも一つのＤＩＰ１のインビボ機能が含まれる。例えば、本発明のＤＩＰ１誘導体はアポトーシス性神経変性を阻害しまたは遅延させる。さらにスプライス変異体（一次転写産物の第二スプライシングにより生ずるｍＲＮＡによってコードされる）、アミノ酸変異体、翻訳後修飾（例えばグリコシル化およびリン酸化変異体）および他のＤＩＰ１共有結合性誘導体（生理学的および／または物理学的なＤＩＰ１の性質を保有する）は、本発明により提供されるＤＩＰ１に含まれる。典型的な誘導体には、本発明のタンパク質であって置換、化学的、酵素学的または他の適当な手段により天然のアミノ酸とは異なる成分で共有結合的に修飾されたタンパク質分子が含まれる。そのような成分は、酵素、ラジオアイソトープまたは他の検出可能なラベル、例えば標識、トキシンもしくは遺伝子（例えば癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子）のような検出可能な成分であってもよい。さらに含まれるものには、個々の動物種、好ましくは哺乳類に見られる天然のＤＩＰ１変異体である。そのような変異体は同じ遺伝子ファミリーの関係遺伝子、特定の遺伝子の対立変異体によりコードされるか、またはＤＩＰ１遺伝子の第二スプライシング変異体であってもよい。共通の機能決定基を保持する誘導体は、ＤＩＰ１フラグメントであり得る。ＤＩＰ１フラグメントには、その個々のドメインおよびドメインから誘導された小さなポリペプチドが含まれる。好ましくは、本発明のＤＩＰ１から得られる小さなポリペプチドには、ＤＩＰ１に特徴的である一つの機能活性がある。理論上、ＤＩＰ１の特徴を保持する限り、フラグメントはどんなサイズであっても良い。好ましくは、フラグメントは５から２００のアミノ酸の長さになる。長いフラグメントは、完全長ＤＩＰ１のトランケーション（truncations）とみなされ、通常“ＤＩＰ１”という語意に含まれる。ＤＩＰ１の誘導体は、それらの変異体を含む。それにはアミノ酸の欠失、付加または置換が含まれるが、すくなくとも一つのＤＩＰ１の特徴を保持することが条件となる。５’または３’末端からトランケーション（truncations）されるため、ＤＩＰ１の性質を本質的に変化させず保存的アミノ酸置換がなされる。欠失および置換は、さらに本発明に含まれるＤＩＰ１フラグメントにおいて為される。ＤＩＰ１変異体は、例えば一つまたはそれ以上のアミノ酸の付加、変換および／または削除を起こすような、試験管内突然変異誘発に付することによってＤＩＰ１をコードするＤＮＡから産生される。例えば、ＤＩＰ１の置換変異、欠失変異また挿入変異は組み換え技術によりつくられ、天然型のＤＩＰ１に対する機能的類似性をもってスクリ−ニングできる。ＤＩＰ１のフラグメント、変異体および他の誘導体は好ましくはＤＩＰ１と実質的相同性が保持されている。ここで用いる“相同性”は、二つの比較物において起源および機能が類似すると当業者が認知できる重要な特徴を共有することの意である。好ましくは相同性は配列の同一性を述べるのに使用する。それゆえＤＩＰ１の誘導体は好ましくは配列番号１と実質的に同一な配列を保持する。相同性が配列の同一性を示すとき、“実質的な相同性”とは５０％以上の配列同一性を意味し、さらに好ましくは７５％の配列同一性および最も好ましくは９０％またはそれ以上の配列同一性を意味する。好ましくは本発明のタンパク質またはその誘導体は単離された状態で提供される。“単離する”とは、タンパク質または誘導体が同定されていることを意味し、一つまたはそれ以上の自然界の周辺物成分を含まないことを意味する。単離されたＤＩＰ１には組み換え体細胞の培養物中のＤＩＰ１をも含む。ＤＩＰ１タンパク質が“単離され”ていようといまいと、組み換えＤＩＰ１遺伝子を発現している生物内に存在するＤＩＰ１は本発明の範囲に入る。ＤＩＰ１はｂｃｌファミリーの一つであると考えられており、ｂｃｌｘＬと非常に相同性がある。しかしながら発表されているラットｂｃｌｘＬの配列とここで開示した配列の比較をすると二つのタンパク質間において明白な特徴の違いがある。本発明のポリペプチドは神経変性々症患に関与し、特に神経細胞のアポトーシスに関与する。それゆえ、神経性疾患の処置または診断の際、薬剤として用いる本発明のポリペプチドまたはそのモジュレーターを含む組成物を本発明は提供する。さらに本発明は別の観点から、ＤＩＰ１をコードする核酸も提供する。組み換えＤＩＰ１タンパク質の生産に有用であるだけでなく、核酸はプローブとしても有用である。それゆえ当業者はＤＩＰ１をコードする核酸の同定および／または容易に単離が可能となる。核酸は、ラベルされていなくてもよいし、検出可能な基でラベルされていてもよい。さらに本発明の核酸は、例えばＤＩＰ１に特異な核酸を検出する方法、すなわちテストサンプルの核酸に対してＤＩＰ１をコードする（あるいはＤＩＰ１と相補的な）ＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）をハイブリダイズさせ、ＤＩＰ１の存在を検定する方法に有用である。他の観点からは、本発明はＤＩＰ１をコードする核酸配列と相補的であり、または緊縮条件（stringent conditions）下においてハイブリダイズする核酸配列を提供する。本発明は、またＤＩＰ１をコードする（ＤＩＰ１と相補的な）核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いる核酸ポリメラーゼ連鎖反応の促進を含む核酸テストサンプルを増幅する方法も提供する。さらに本発明の他の観点から、核酸はＤＮＡであり、さらにベクターで形質転換された宿主が認識できる制御配列に作動可能に連結しＤＩＰ１をコードする核酸を含む複製可能なベクターを含む。さらに本発明は、当該ベクターで形質転換された宿主細胞およびＤＩＰ１の産生を可能にするＤＩＰ１をコードする核酸の使用法を含む。それには形質転換された宿主細胞の培養においてＤＩＰ１核酸の発現および、もし要求されるならば、宿主細胞の培養物からＤＩＰ１の回収も含む。さらに本発明は、上述した核酸にコードされ単離されたＤＩＰ１タンパク質およびそれらの誘導体に関する。単離されたＤＩＰ１核酸には、少なくとも一つの不純物核酸（通常、ＤＮＡライブラリー等のような天然のＤＩＰ１核酸源または粗分離核酸に付随している）も含まれていない核酸が含まれる。単離された核酸は、天然に見られる形態とは異なって存在する。しかしながら、核酸をコードする単離ＤＩＰ１には、天然の細胞とは異なるクロモソーム上の位置において、または他方で天然とは異なるＤＮＡ配列と隣接する位置においてＤＩＰ１を発現しているＤＩＰ１核酸を含む。本発明では、例えばＤＩＰ１（特に哺乳類のＤＩＰ１、例えばラットまたはヒトのＤＩＰ１、またはそれらのフラグメント）をコードする単離した核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。特に本発明はＤＩＰ１をコードするＤＮＡ分子またはそれらのフラグメントを提供する。明らかに、そのようなＤＮＡには、前述のＤＮＡをコードする一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよびそれらに相補するＤＮＡもしくはその相補的ＤＮＡ自身（一本鎖）を含む。好ましくは本発明の核酸は、ＤＩＰ１をコードする配列のフラグメントまたはポリペプチドに関して既に定義したようにそれらの誘導体である。新規ヌクレオチド全体の核酸配列フラグメント（好ましくは５〜１５０ヌクレオチドの長さ）は特にプローブとして有用である。本発明はさらにプロモーターおよびエンハンサーのようなＤＩＰ１遺伝子より得られる機能制御エレメントを提供する。そのようなエレメントはリポーター遺伝子と対にすると有用であり、分子レベルにおける神経活性薬によるＤＩＰ１発現のモジュレーション研究に利用できる。ＤＩＰ１制御転写単位は、細胞を元にした検定、トランスジェニックアミマル、遺伝治療法および他に以下に述べる技術に利用される。これらのコンディションは、さまざまなバッファー（例えばホルムアミドを元にしたバッファー）および温度を用いることによって適合化され、複製され得ることが理解される。デンハーツ溶液およびＳＳＣは、他の適切なハイブリダリゼーションバッファー（Sambrook，et al.，eds．（1989）Molecular Cloning:A L aboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York or Ausub el，et al.，eds．（1990）Current Protocols in Molecular Biology，John Wi ley & Sons，Inc．参照）として当業者に知られる。プローブの長さおよびＧＣ成分もまた反応に関与するから、最適なハイブリダイゼーションのコンディションは、経験的に決定しなければならない。ここで付け加えると、本発明の核酸は当分野に既知の方法で取得可能である。例えば本発明のＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使い化学合成により得られ、または検出できる程度にＤＩＰ１を発現し、保有していると考えられる起源より作製したゲノムライブラリーまたは適切なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。そのような方法では、さらにヒトのように異なる動物種から得た核酸源をスクリーニングすることにより、例示したラットＤＩＰ１の種相同性タンパク質を単離することができる。目的の核酸を合成する方法は当分野では既知であり、トリエステル法、亜リン酸法、ホスホルアミダイト法およびＨ−ホスホネート法、ＰＣＲ法および他のオートプライマー法ならびに固相支持体上のオリゴヌクレオチド合成法を含む。核酸配列全体がわかっているとき、またはコーディング鎖に相補的な核酸配列がわかっているときに、これらの方法が使える。あるいはまた、もし標的アミノ酸配列がわかっているならば、各アミノ酸残基についてコードされる既知のあるいは好ましいコード化残基を用いて可能性のある核酸配列を推定できる。ＤＩＰ１をコードする遺伝子を単離する他の方法には、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９の１４節に記載されているＰＣＲ技術を使ったものがある。この方法はＤＩＰ１核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドを選択する手法を以下で述べる。目的遺伝子またはその遺伝子のコードするタンパク質を同定するためにデザインしたプローブまたは分析ツールを使ってライブラリーをスクリ−ニングする。ｃＤＮＡ発現ライブラリー用の適切な手段にはＤＩＰ１（同種または異種のＤＩＰ１ｃＤＮＡと思われる全長約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド、および／または同一遺伝子またはハイブリダイズする遺伝子をコードする相補的または相同的ｃＤＮＡまたはそのフラグメント）を認識し特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が含まれる。ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリ−ニングには適切なプローブが含まれるが、それは同一ＤＮＡまたはハイブリダイズするＤＮＡ、および／またはそれに相同なゲノムＤＮＡまたはフラグメントをコードするオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはフラグメントに限定しない。例えば配列番号１の配列から派生するオリゴヌクレオチドを含み、ここで開示する核酸のようなプローブを使った適切なハイブリダイゼーションの条件下、ＤＩＰ１をコードする核酸は適切なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングにより単離される。適切なライブラリーは商業的に利用可能であり、例えば細胞系、組織サンプル等からつくられる。ここで用いるプローブは、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基および最も好ましくは少なくとも約２０塩基の連続的なヌクレオチド配列である一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである。プローブとして選択した核酸配列は、偽陽性を最小限にするため充分な長さおよび十分な正確さを必要とする。タンパク質の配列より得られ、プローブとして用いる核酸は、一つまたはそれ以上の位置で縮重的（ degenerate）となる。プローブ構成に好ましい領域には、ｂｃｌｘと相同性のないＤＩＰ１配列領域が含まれる。好ましくは本発明の核酸プローブは、ハイブリダイゼーションで検出できる適切なラベル法でラベルされる。例えば、適切なラベル法にはラジオラベルがある。ＤＮＡフラグメントの好ましいラベル法は、当分野においてよく知られるランダムプライミング反応によりＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを使ってα³²ＰｄＡＴＰを組み込む方法である。通常、オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドキナーゼを使って、ｇ^32PラベルされたＡＴＰでエンドラベルされる。しかしながら他の方法（例えば非放射活性的な方法）もまたフラグメントまたはオリゴヌクレオチドのラベルに用いられる。それには適切な発蛍光団およびビオチン化を伴う酵素ラベル、蛍光ラベルが含まれる。適切なオリゴヌクレオチドを用いたライブラリーのスクリーニングの後、陽性クローンはハイブリダイゼーションシグナルの検出により同定され、同定されたクローンは制限酵素マッピングおよび／またはＤＮＡシークエンス分析により特徴づけられる。その後、完全にＤＩＰ１をコードするＤＮＡを含むことを確認するためには（もし翻訳開始コドンまたは終止コドンが含まれていれば）、例えばここに記載の配列との比較により検定される。もし選択したクローンが不完全なものであれば、オーバーラップするクローンを得るため同ライブラリーまたは異なるライブラリーを再度スクリーニングするのに利用される。もしライブラリーがゲノム由来のものであるならば、オーバーラップするクローンはエクソンまたはイントロンを含む。もしライブラリーがｃＤＮＡライブラリーであるならば、オーバラップするクローンにはオープンリーディングフレームが含まれる。いずれの場合も、完全なクローンはＤＮＡとの比較により同定され、ここで提供するアミノ酸配列であることが予想される。内因性ＤＩＰ１の異常を検出するため、遺伝学的スクリーニングではハイブリダイゼーションプローブに本発明のヌクレオチド配列を用いる。また、ここで提供した核酸配列に基づいて、アンチセンス型の治療薬をデザインできる。本発明の核酸は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはヌクレオチド伸張の逆位ならびにそれらの組み合わせにより簡単に修飾されることが予測される。そのような変異体は、例えば本来のＤＩＰ１配列とは異なるアミノ酸配列であるＤＩＰ１変異体の産生に利用される。突然変異誘発は、あらかじめ決まった位置（部位特異的）であってもよく、またはランダムであってもよい。天然のＤＩＰ１または変異体ＤＩＰ１をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、さらなる操作のためにベクターへ組み込まれる。ここで言うベクター（またはプラスミド）とは、発現または複製を目的として異種性ＤＮＡを細胞へ導入するのに用いる特異エレメントである。そのようなベクターの選択および使用は当業者に既知である。多くのベクターが利用可能であり、ベクターの選択はベクター利用目的に依存する。すなわちＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現の何れかであり、挿入ＤＮＡのサイズならびにベクターで形質転換される宿主にも依存する。いずれのベクターにも、機能（ＤＮＡの増幅または発現）および適合性のある宿主細胞に依存する様々な構成遺伝子が含まれる。通常、ベクターには構成遺伝子が含まれるが、以下のうち一つまたはそれ以上のものを制限しない：複製起点、一つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終止配列およびシグナル配列。通常、発現ベクターまたはクローニングベクターはいずれも選択的に一つまたはそれ以上の宿主細胞内で複製可能とする核酸配列を含む。クローニングベクターの特徴として、この配列により宿主のクロモソームＤＮＡとは独立してベクターの複製を可能とし、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は、様々な細菌、酵母およびウィルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点はほとんどのグラム陰性細菌に適し、２μプラスミドの複製起点は酵母に適し、さらにさまざまなウィルス性複製起点（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス）は哺乳類細胞のクローニングベクターに使用される。高レベルのＤＮＡ複製を目的とした哺乳類の感応細胞（例えばＣＯＳ細胞）に使われるのでなければ、通常、複製起点構成遺伝子は哺乳類発現ベクターには必要でない。ほとんどの発現ベクターはシャトルベクターである。すなわち少なくとも一つの生物クラスにおいて複製可能であり、発現を目的として他の生物にトランスフェクトさせられる。例えばベクターは宿主細胞のクロモソームから独立して複製できなくとも、Ｅ．ｃｏｌｉでクローニングされ酵母または哺乳類細胞にトランスフェクトされる。ＤＮＡはまた宿主ゲノムへの挿入により複製される。しかしながらＤＩＰ１をコードするゲノムＤＮＡの回収は外性複製ベクターの回収よりも困難である。なぜならば制限酵素処理によるＤＩＰ１ＤＮＡの切断が必要だからである。ＤＮＡはＰＣＲにより増幅でき、複製構成遺伝子なしに直接宿主細胞にトランスフェクトできる。都合の良いことに、発現ベクターまたはクローニングベクターには、選択マーカーとして知られる選択遺伝子が含まれる。この遺伝子には、選択培養培地において、形質転換体である宿主細胞の増殖または生存に必要なタンパク質がコードされている。選択遺伝子を含むベクターを形質転換されていない宿主細胞は培養培地では生存できない。典型的な選択遺伝子には、抗生物質および他の毒物（例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン、完全な栄養欠乏、または複合培地由来の利用不能である必須栄養素の供給）に対する抵抗性を供するタンパク質がコードされている。酵母に適切な選択遺伝子マーカーとして、マーカー遺伝子の表現型発現により形質転換体の選択を促進させるのにマーカー遺伝子は利用される。例えば、酵母の適切なマーカーは、抗生物質であるＧ４１８、ヒグロマイシンまたはベロマイシンに対する抵抗性を供し、酵母の栄養性変異体であるプロトトロピーに提供される。例えばＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＬＹＳ２遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子またはＨＩＳ３遺伝子である。ベクターの複製は都合の良いことにＥ．ｃｏｌｉで行えるため、Ｅ．ｃｏｌｉの遺伝的マーカーおよびＥ．ｃｏｌｉ複製起点は都合よく含まれる。これらはＥ．ｃｏｌｉプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターまたはｐＵＣ（例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）より得られる。それらのプラスミドには、Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点およびアンピシリンのような抗生物質に対し抵抗性を供するＥ．ｃｏｌｉの遺伝的マーカーの両方が含まれている。哺乳類細胞において適切な選択マーカーとは、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ、メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼ、またはＧ４１８またはヒグロマイシンに対し耐性を供する遺伝子のような、ＤＩＰ１核酸を保有する感応細胞を確実に同定できるものである。哺乳類細胞の形質転換体は、マーカーを保有し発現している形質転換体のみが生存できる選択圧力下に置かれる。ＤＨＦＲまたはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）マーカーの場合、進行的に圧力が増大する状態において培養中の形質転換体は選択圧力にさらされる。その結果、選択遺伝子およびＤＩＰ１をコードするＤＮＡと連結する遺伝子の両遺伝子は増幅（クロモソームにおける組み込み部位）される。増幅とは、近傍に付随遺伝子（好ましいタンパク質がコードされる）を伴う遺伝子（増殖に必須なタンパク質の産生を非常に要求される）が、組み換え体細胞のクロモソーム内でタンデムに反復するプロセスである。好ましいタンパク質の量の増大は通常増幅したＤＮＡより得られる。発現ベクターまたはクローニングベクターは、宿主生物が認識でき、ＤＩＰ１核酸と連結したプロモーターが通常含まれる。そのようなプロモーターにより誘導または合成される。プロモーターは、制限酵素処理によりＤＮＡ源から除去し、その後単離されたプロモーター配列をベクターへ挿入してＤＩＰ１をコードするＤＮＡと連結させる。本来のＤＩＰ１プロモーター配列および多くの異質性プロモーターはいずれもＤＩＰ１ＤＮＡの直接増幅および／または発現に使用される。原核宿主の使用に適切なプロモーターには、例えばｂ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステムおよびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれる。それらのヌクレオチド配列はすでに開示されているため、当業者は必要な制限酵素部位を供給するリンカーまたはアダプターを使いＤＩＰ１をコードするＤＮＡとプロモーターを連結することが可能である。バクテリアシステムで利用するプロモーターには、ＤＩＰ１をコードするＤＮＡと連結しているシャイン−ダルガノ配列が通常含まれている。さらに本発明のＤＩＰ１遺伝子には、好ましいことに細菌宿主由来ポリペプチドの分泌を促進する分泌配列を含む。そのためインクルージョンボディよりも可溶性ネイティブペプチドとして産生される。ペプチドは細菌性細胞質スペースまたは適切な培養培地より回収される。酵母宿主の使用に適切なプロモーター配列は、制御または構成され、好ましいことに高発現酵母遺伝子、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子より得られる。そのためＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩまたはＡＤＨＩＩ遺伝子、アシッドホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子のプロモーター、ａ−またはａ−因子をコードする酵母接合ホルモン遺伝子のプロモーターまたはエノラーゼ遺伝子、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ遺伝子、３−ホスホグリセレートムターゼ遺伝子、ピルビン酸キナーゼ遺伝子、トリオースホスフェートィソメラーゼ遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子またはグルコキナーゼ遺伝子のような解糖系酵素をコードする遺伝子より得られるプロモーター、またはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子のプロモーターが使用される。さらに、ある酵母遺伝子の上流活性配列（ＵＡＳ）および他の酵母遺伝子のＴＡＴＡボックスの機能を持つ下流プロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーターの使用が可能である。例えば酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳおよび酵母ＧＡＰ遺伝子のＴＡＴＡボックスの機能を持つ下流プロモーターエレメントを含むハイブリッドプロモーター（ＰＨ０５−ＧＡＰハイブリッドプロモーター）である。適切な構成ＰＨ０５プロモーターは、例えばＰＨ０５遺伝子のうちヌクレオチド−１７３から始まってヌクレオチド−９で終わるＰＨ０５（−１７３）プロモーターエレメントのように上流制御エレメント（ＵＡＳ）が欠如し短くなったアシッドホスファターゼＰＨ０５プロモーターである。哺乳類宿主のベクターによるＤＩＰ１遺伝子の転写は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、フォウルポックスウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、レトロウィルスおよびシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムより得られるプロモーター、アクチンプロモーターのような異種性哺乳類プロモーターまたはリボソーム性タンパク質のプロモーターのような強力なプロモーター、およびＤＩＰ１配列に付随する通常のプロモーターにより制御され、その提供されるプロモーターは宿主細胞システムと適合性がある。高等真核のＤＩＰ１をコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサーを挿入することにより促進される。エンハンサーの配向および位置は比較的独立している。多くのエンハンサー配列が哺乳類遺伝子において知られている（例えばエラスターゼおよびグロビン）。しかしながら真核細胞ウィルスのエンハンサーが通常使用される。実施例では、複製起点の下流に位置するＳＶ４０エンハンサーおよびＣＭＶ上流のプロモーターエンハンサーを含む。エンハンサーは、ＤＩＰ１ＤＮＡの５’または３’側にベクターとつながれるが、好ましいのはプロモーターの５’側に位置することである。都合の良いことにＤＩＰ１をコードする真核発現べクターには遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）が含まれる。ＬＣＲは、宿主細胞のクロマチンへ組み込まれる形質転換遺伝子の発現とは独立して高レベルの組み込み部位を指示する。それは、永久感染した真核細胞系（遺伝子治療用にデザインしたベクターまたはトンラスジェニックアニマルではベクターのクロモソームへの組み込みが生じる）でＤＩＰ１遺伝子が発現する場合に特に重要である。ＤＩＰ１の発現に適切な真核宿主細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、人間または他の多細胞生物の核細胞を含む）は、転写終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。そのような配列は、真核、ウィルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの翻訳されない領域の５’および３’より通常使用される。これらの領域には、ＤＩＰ１をコードするｍＲＮＡで翻訳されない部分内にあるポリアデニレートフラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントが含まれる。発現ベクターには、プロモーター領域のように制御配列と連結するとそのＤＮＡが発現可能となり、ＤＩＰ１核酸を発現可能とするベクターが含まれる。それゆえ発現ベクターには、プラスミド、ファージ、組み換え体ウィルスまたは他のベクターのような組み換えＤＮＡまたはＲＮＡが使われる。それらは適当な宿主細胞へ導入され、クローン化ＤＮＡを発現する。適切な発現ベクターは当業者に既知であり、真核細胞および／または原核細胞で複製され、エピソームを保持し、宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターである。例えばＤＩＰ１をコードするＤＮＡは、哺乳類細胞においてｃＤＮＡの発現に適切なベクター（例えばｐＥＶＲＦ（Matthias，et al.，（1989）NAR 17，6418）のようなＣＭＶエンハンサーをもとにしたベクター）へ挿入される。特に本発明を実施する有用性は、哺乳類細胞においてＤＩＰ１をコードするＤＮＡを一時的に発現する発現ベクターである。一時的な発現には宿主細胞において効率良く複製される発現ベクターが使用される。そのため、宿主細胞において発現ベクターのコピーが蓄積し、次にＤＩＰ１が高レベルで産生する。本発明の目的上、一時的な発現システムは、例えばＤＩＰ１変異体を同定するようなリン酸化される可能性のある部位の同定またはタンパク質の機能ドメインの特徴づけに有用である。本発明のベクターの構成は、簡便な連結技術により行った。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを切断し、混合し、プラスミドが好ましい形態となるよう再度連結する。もし必要ならば、構成したプラスミドの配列分析が既知の方法により行える。適当な発現ベクターの構成法、インビトロの転写物の回収法、宿主細胞へのＤＮＡ導入法およびＤＩＰ１の発現と機能の判定分析は当業者に既知である。遺伝子の存在、増幅および／または発現は、直接サンプルにおいて検定できる。例えば、ここで提供する配列をもとにしたプローブに適切にラベルして使用する簡便なサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量できるノーザンブロッティング、ドットブロッエィング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）または切片上ハイブリッド形成法により行える。もし必要ならば、当業者は、これらの方法をどのように変化させたらよいか、容易に考えつくであろう。本発明の他の態様では、上述した核酸を含む細胞が提供される。原核細胞、酵母細胞および高等真核細胞のような宿主細胞はＤＮＡ複製およびＤＩＰ１産生に使用される。適切な原核生物には、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌（Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２株、ＤＨ５ａおよびＨＢ１０１のようなＥ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｉ）のような真正細菌が含まれる。さらにＤＩＰ１をコードするベクターに適切な宿主は、糸状菌または酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような真核微生物である。高等真核細胞には、昆虫細胞および脊椎動物細胞、特に哺乳類細胞が含まれる。近年、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増大により、型にはまった手法となった。有用な哺乳類宿主細胞系の実施例は、チャイニーズハムスター卵細胞（ＣＨＯ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞または２９３Ｔ細胞のような上皮細胞系または繊維芽細胞系である。この開示する宿主細胞には、宿主動物の細胞およびインビトロの培地における細胞を含む。ＤＮＡは細胞に安定して組み込まれ、当分野において既知の方法を用い一時的に発現できる。選択マーカー遺伝子を保持する発現ベクターで細胞を感染させ、マーカー遺伝子を発現している細胞を選択的に増殖させることにより安定に感染した哺乳類細胞はつくられる。一時的に感染体を得るには、感染効率をモニターするレポーター遺伝子で哺乳類細胞を感染させる。安定し、一時的に感染した細胞を得るには、ＤＩＰ１をコードする十分量の核酸で細胞を感染させる。ＤＩＰ１をコードするＤＮＡの明確な量は、経験的に決定され、特に細胞および検定のために最適化される。上記で説明した本発明の発現ベクターまたはクローニングベクターで宿主細胞を感染または形質転換した後、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または好ましい配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に変化させた簡便な栄養培地で培養する。異質ＤＮＡは、異質ＤＮＡをコードするベクターで感染させるリン酸カルシウム法またはエレクトロポレーションのような当分野では既知である方法により宿主細胞に導入される。多くの感染法が当業者に既知である。宿主細胞内のベクターが操作できるとき、通常感染が成功したと認識できる。形質転換は、特に宿主細胞に使用するのに適切である標準的な方法により行える。適切な発現ベクターへのクローン化したＤＮＡの組み込み、プラスミドベクターまたは組み合わせプラスミドベクターによる真核細胞への感染、コードされている一つまたはそれ以上の異なる遺伝子あるいは直鎖状ＤＮＡをともなう遺伝子ならびに感染細胞の選択は当分野では既知である（Sambrook et al．（1989）Mo lecular Cloning:A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press）。感染した細胞または形質転換した細胞は培地を使って培養され、当分野にて知られる方法、特にその状態において培養され、それによってＤＮＡによりコードされるＤＩＰ１は発現する。適切な培地の組成物は当分野では既知であるため、容易に準備できる。適切な培養用培地は、また商業的に利用可能である。ここで提供されるＤＮＡは、上述したような適切な宿主細胞で発現するが、機能的なＤＩＰ１をコードするＤＮＡの好ましい発現は真核発現システムである。それは当業者に既知である商業的に利用可能なシステムおよび他のシステムを含み、バキュロウィルスをもとにしたシステムまたは特に哺乳類発現システムのようなものである。好ましい態様ではＤＩＰ１をコードするＤＮＡは、ベクターと連結され、ＤＩＰ１を発現するように形質転換される細胞系をつくるため適切な宿主細胞に導入される。その結果、ＤＩＰ１機能に影響する可能性のある薬の効果における再現可能な質的および／または量的分析に用いる量が細胞系により産生され得る。それゆえＤＩＰ１発現細胞は化合物の同定、特に有用なＤＩＰ１機能を妨げる小さな拮抗分子の同定に使われる。他に拮抗効果を得るには、アンチセンスＤＩＰ１ＲＮＡの過剰発現と考えられる。それゆえＤＩＰ１を発現する宿主細胞は薬を使ったスクリーニングに有用であり、さらに本発明の目的は以下の方法を提供することである。それはＤＩＰ１の活性をモジュレートおよび減少させる化合物の同定法、ＤＩＰ１をコードする異種ＤＮＡを含む細胞（機能するＤＩＰ１を産生する細胞である）に少なくとも一つの化合物またはシグナル（ＤＩＰ１活性のモジュレート能により探索、決定できる）をさらすことを含む前述の方法である。そのため細胞変化のモニターは前述のモジュレーションにより行える。そのような検定は薬物、拮抗体およびＤＩＰ１のモジュレーターの同定を可能にする。細胞をもとにしたスクリーニング検定は、例えばレポータータンパク質の発現すなわち簡単に検定可能であるタンパク質（例えばβガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、またはルシフェラーゼ）がＤＩＰ１依存の細胞系の構築によりデザインされる。そのような検定によりＤＩＰ１機能を直接モジュレートする化合物（例えばＤＩＰ１を誘導する化合物またはＤＩＰ１活性に必要な他の細胞機能を促進させる化合物である）の検出が可能になる。ＤＩＰ１はデプレニルに依存して神経細胞で誘導されることが判明した。そのため本発明では、そのような細胞内に生じるＤＩＰ１依存性過程に外因性影響を与える方法をも提供する。ＤＩＰ１を産生している細胞、例えば神経細胞はテスト化合物に接触し、それらのモジュレーション効果はテスト化合物の存在下、非存在下においてＤＩＰ１誘導応答を比較することにより、またはテスト細胞または参照細胞（すなわちＤＩＰ１を発現しない細胞）のＤＩＰ１誘導応答が化合物の存在と関与することにより評価される。同じ手法は、ＤＩＰ１による下流の効果をモジュールするテスト化合物の効果を観察するのに使用され得る。ここでの使用として、ＤＩＰ１の活性をモジュレートする化合物またはシグナルは、ＤＩＰ１の活性が化合物またはシグナルの存在下で異なる（前述の化合物またはシグナルの非存在下と比べて）ような方法においてＤＩＰ１のレベルまたは活性を変化させる化合物を参考としている。そのため本発明はＤＩＰ１活性のモジュレーターである化合物を提供する。好ましくは、そのような化合物により神経細胞内のＤＩＰ１は誘導される。都合の良いことに、本発明のＤＩＰ１誘導性化合物は以下より選択され得る。さらに置換、側鎖の変化および環修飾を含む化合物のクラスが意図される。さらにそのような化合物は、ＤＩＰ１合成の誘導またはＤＩＰ１活性の増大における活性測定により検定される。本発明には、神経細胞と化合物が接触し神経細胞のアポトーシスを妨げる化合物をスクリーニングする方法およびＤＩＰ１活性のレベル、神経細胞のアポトーシスを妨げる化合物の作用力を示す上昇レベルを観察する方法を含む。さらに本発明は神経細胞のアポトーシスを妨げる組成物を提供する。その組成物により神経細胞内のＤＩＰ１活性は効果的に上昇する。さらに本発明の観点から、神経細胞においてＤＩＰ１活性を効果的にモジュールする薬理的に効果のある量の組成物を神経を患う患者に投与することを含む患者の処置法を提供する。上述の派生として、ＤＩＰ１の発現レベルを変化させることにより、または下流標的に対するＤＩＰ１活性を変えることによりＤＩＰ１活性のモジュレーションが行える。好ましいことにＤＩＰ１の活性は増大する。上述の治療法の効果は神経性疾患にともなう神経性アポトーシスの発病および／または進行を遅延させ得る。本発明では、内因性ＤＩＰ１発現のモジュレートを変化させるトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。好ましくはトランスジェニック非ヒト哺乳動物はトランスジェニックマウスである。例えばそれらのトランスジェニックマウスはＤＩＰ１産生の減少または産生しなくなるようにデザインされている。代わりに本発明のトランスジェニックマウスは、ＤＩＰ１の発現レベルが上昇し、発展的であるＤＩＰ１発現の制御または組織特異的な手法または外性の薬による制御の支配下にある。そのような動物の研究によりインビボにおけるＤＩＰ１の重要性に知見を与え、分子レベルにおいて上述したような神経活性薬のインビボにおける効果の測定を可能とする。好ましいことに組織特異的な手法により、都合の良いことにプロモーター、エンハンサーまたは遺伝子座制御エレメントのような組織特異的制御配列の使用によりＤＩＰ１は発現する。好ましいのはＴＨ遺伝子プロモーターであり、それは神経細胞内の組織特異的な発現を指示する（Joh et al.，Mol．Brain Res.，199 4，27，281-289）。そのような制御配列は、組織特異性と抗アポトーシス薬に対する応答性を組み合わせるためＤＩＰ１制御配列とともに使用される。制御配列は、ＤＩＰ１のコーディング配列またはＤＩＰ１制御配列の誘導がモニターできるレポーター遺伝子に連結される。さらに本発明のポリペプチドは神経細胞におけるアポトーシスの進行に付随するので、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む組成物ならびに神経性疾患の処置または薬物において医薬として使用するそれらの拮抗体を本発明で提供する。好ましい態様では本発明のポリペプチドをコードする転写単位もしくは神経性または他の状態（例えば異常なＤＩＰ１遺伝子の発現を含む）における遺伝子治療による処置法を使用目的とした拮抗体を提供する。本発明の観点から提供される転写単位には、一つまたはそれ以上のエンハンサーおよび／またはＬＣＲとともにプロモーターを含む制御可能領域が含まれる。転写単位は適切な手段により目的に通づる。それにはウィルス性ベクター、特にレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクターおよびアデノ付随ウィルスベクター、非ウィルスデリバリーシステム（リポソームおよび抗体標的デリバリーシステム、裸のＤＮＡの直接の取り込みおよび例えばインビボにおける感染細胞への転移を含む）が含まれる。標的組織は都合の良いことに神経組織である。本発明の他の態様ではＤＩＰ１に特異的に認識し結合する抗体を提供する。例えば、そのような抗体は、配列番号１から派生するアミノ酸配列を持つＤＩＰ１に対し生ずる。その他、ＤＩＰ１またはＤＩＰ１フラグメント（インビトロの方法により合成され得る）は、免疫的なポリペプチドに融合（組み換え体の発現またはインビトロのペプチジル結合による）し、この融合ポリベプチドは、今度はＤＩＰ１エピトープに対して抗体を生じさせるのに使用される。抗ＤＩＰ１抗体は免疫のある動物の血清から回収される。その他モノクローナル抗体は簡易な手法によりインビトロの細胞またはインビボにおける免疫のある動物から回収される。本発明の抗体は、ＤＩＰ１の組織における存在位置の探索、ＤＩＰ１をコードする核酸を同定するための発現ライブラリーのスクリーニング、機能ドメインの構造の研究およびＤＩＰ１の精製などに有用である。さらにインビボの神経活性薬の作用をモニターするのにも有用である。本発明の抗体は、ＩｇＥおよびＩｇＭのようなナチュラルクラスのすべての抗体であるが、好ましいのはＩｇＧ抗体である。さらに本発明にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、ＦｖおよびＳｃＦｖのような抗体フラグメントを含む。サイズの小さいことおよび必然的な優位組織の分布といった理由でＦｖおよびＳｃＦｖのような小さなフラグメントには診断法および治療法における都合の良い性質がある。本発明の抗体は、神経性疾患の診断に適用される。それに応じて、それらはラベルのようなエフェクタータンパク質を含む変性抗体である。特に好ましいラベルはインビボの神経細胞で抗体の分布が造画できるものである。そのようなラベルには、ラジオアクティブラベルまたは患者の体の中で容易に視覚化できる金属粒子のようなラジオオパークラベルがある。さらに患者から採取した組織サンプルを視覚化できる蛍光ラベルまたは他のラベルがある。組み換えＤＮＡ技術を使って本発明の抗体は改良される。そのために、診断法または治療法において免疫原性が低下するためキメラ抗体がつくられる。さらに免疫原性は、ヒトの抗体により、ＣＤＲ拒絶（ヨーロッパ特許出願 0 239 400(W inter)参照）および任意的な構成変化（国際特許出願 W0 90/07861(Protein Des ign Labs)参照）により最小限になる。本発明の抗体は動物血清より得られ、またはモノクローナル抗体、そのフラグメントの場合、抗体は細胞培養でつくられる。細菌の培養または好ましくは哺乳動物の培養において確立された手法による抗体の産生に組み換えＤＮＡ技術が利用される。選択された細胞培養システムにより好ましくは抗体生産物が分泌する。それゆえ本発明には、Ｅ．ｃｏｌｉまたは哺乳動物細胞のような宿主（シグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列に連結し、適当なリーディングフレーム内において当該タンパク質をコードする第二ＤＮＡ配列に連結するプロモーターを含める発現カセットを含み、当該タンパク質を単離できるハイブリッドベクターで形質転換される）の培養を含める発明による抗体の産生方法が含まれる。インビトロにおけるハイブリドーマ細胞または哺乳宿主細胞は適切な培地において増殖する。それは通常の標準的な培養培地である。例えば哺乳類の血清（例えば胎児のウシ血清）またはトレースエレメントおよび増殖維持補足物（例えば通常のマウスの腹膜滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージのような支持細胞、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸など）を任意に添加したＤｕｌｂｅｃｃ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地である。細菌細胞または酵母細胞の宿主細胞は、同様に当分野において既知である適切な培養培地で増殖する。例えば細菌培地ではＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴまたは最小培地のＭ９であり、酵母培地ではＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地または完全最小ドロップアウト培地である。インビトロの産物は抗体沈降で比較的精製され、好ましい抗体を多量に得るためにスケールアップ可能である。細菌細胞、酵母細胞または哺乳類細胞の培養は当分野では既知であり、同質支持培地（例えばエアーリフトリアクターおよび連続スターラーリアクター）もしくは固定化またはトラップされた細胞培地（例えば中空ファイバー、マイクロカプセル内の培地、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上の培地）を含む。多量の好ましい抗体は、またインビボにおける哺乳類細胞の増殖により得られる。この目的上、好ましい抗体を産するハイブリドーマ細胞に抗体産生腫瘍の増殖原因となる組織適合性の哺乳類細胞を導入される。動物細胞は、導入前に炭水化物で、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）のようなミネラルオイルで任意に促進される。１〜３週間の後に抗体が、これら哺乳動物の体液より単離される。例えば任意にプリスタンで前処理したＢａｌｂ／ｃマウスにハイブリドーマ細胞（抗体を産生するＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞、または好ましい抗体を産するハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０から派生した細胞であって感染した細胞と適切な骨髄腫細胞の融合により得られる）を腹膜腔内に注入し、１〜２週間後には腹水が回収される。ＤＩＰ１を発現している細胞の免疫蛍光染色、イムノブロッティング、サンドイッチアッセイおよびドットアッセイのような酵素学的イムノアッセイ、あるいはラジオイムノアッセイにより細胞培養の上清から好ましい抗体がスクリーニングされる。抗体の単離のため、例えば硫安沈殿、ポリエチレングリコールのような吸水剤を使った透析、選択膜を使ったフィルトレーションなどにより培養上清または腹水のイムノグロブリンは濃縮される。もし必要および／または好ましいならば、抗体は通常のクロマトグラフィーにより精製される。例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースを使ったクロマトグラフィーおよび／または例えばＤＩＰ１タンパク質またはＰｒｏｔｅｉｎ−Ａを使ったアフィニティー（イムノアフィニティー）クロマトグラフィーある。本発明は、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞にも関与する。本発明の好ましいハイブリドーマ細胞は、通常安定であり、好ましい特異性のある本発明のモノクローナル抗体を分泌し、凍結貯蔵された培地の溶解および再クローニングにより活性化される。本発明は、ＤＩＰ１を指示するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を得る方法にも関与する。それは、適切な哺乳動物（例えばＢａｌｂ／ｃマウス）は精製したＤＩＰ１タンパク質、精製したＤＩＰ１を含む抗原担体またはＤＩＰ１を産する細胞を使って免疫化され、免疫化された哺乳類細胞である抗体産生細胞は、適切な骨髄腫細胞系の細胞と融合され、融合により得たハイブリッド細胞はクローン化され、好ましい抗体を分泌するクローンが選ばれることを特徴とする。例えばＤＩＰ１を産生する細胞を使って免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓は、骨髄腫細胞系ＰＡＩ細胞または骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０−Ａｇ１４で融合され、得られたハイブリッド細胞の中から好ましい抗体を分泌する細胞をスクリーニングし、陽性のハイブリドーマをクローン化する。好ましいのはハイブリドーマ細胞系を得る方法である。それは、数カ月（２〜４カ月）に渡って数回（４〜６回）、１０および１０⁷および１０⁸のヒト腫瘍（適切なアジュバントを含めるＤＩＰ１を発現する）を皮下注射および／または腹膜腔内注射することによりＢａｌｂ／ｃマウスは免疫化され、免疫化したマウスの脾臓は最後の注射から２〜４日後に回収し、融合プロモーターの存在下において骨髄腫細胞系ＰＡＩ細胞で融合される（好ましくはポリエチレングリコールを用いる）ことを特徴とする。好ましくは骨髄腫細胞は、約３０〜５０％のポリエチレングリコール（分子量約４０００）を含む溶液中において３〜２０倍を越える免疫化したマウスの脾臓で融合される。融合後、細胞は既に述べたような適切な培地で増殖させ、好ましいハイブリドーマ細胞の過剰増殖によって通常の骨髄腫細胞の増殖が妨げられるため、選択培地（例えばＨＡＴ培地）を断続的に補う。本発明は、既に述べたようにＤＩＰ１の細胞外ドメインを指示する抗体であるヘビーチェーンの多様性ドメインおよび／またはライトチェーンの多様性ドメインをコードする挿入遺伝子を含む組み換えＤＮＡにも関与する。当然、ＤＮＡには前述のコードされるＤＮＡおよびそれらに相補するＤＮＡよりなる一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡもしくはこれらの相補的ＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）を含める。さらにＤＩＰ１を指示する抗体のヘビーチェーンの多様性ドメインおよび／またはライトチェーンの多様性ドメインをコードするＤＮＡは、酵素学的にまたは化学的に合成され、そのＤＮＡはヘビーチェーンの多様性ドメインおよび／またはライトチェーンの多様性ドメイン、またはそれらの変異体をコードする真正ＤＮＡ配列である。真正ＤＮＡの変異体は、上述した抗体（一つまたはそれ以上のアミノ酸が欠失または一つまたはそれ以上の他のアミノ酸と置換している）のヘビーチェーンの多様性ドメインおよび／またはライトチェーンの多様性ドメインをコードするＤＮＡである。好ましくは抗体のヘビーチェーンの多様性ドメインおよび／またはライトチェーンの多様性ドメインのＣＤＲの外側が修飾されている。そのような変異体ＤＮＡはサイレント変異体となることを目的とし、一つまたはそれ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されている（新しいコドンは同じアミノ酸をコードする）。そのような変異体の配列は縮重配列である。本来コードされるアミノ酸配列に変化を与えずに無数のヌクレオチドが他のヌクレオチドと置換されるという遺伝的コードの意義内で縮重配列は縮重される。そのような縮重配列は、異なる制限部位および／またはマウスのヘビーチェーンの多様性ドメインおよび／またはマウスのライトチェーンの多様性ドメインの最適な発現を得る特異な宿主、特にＥ．ｃｏｌｉにより好まれる特定コドンの頻度に有用である。変異体という語は、当分野に既知の方法によるインビトロの真正ＤＮＡの突然変異誘発より得られるＤＮＡ変異体を含めることを目的とする。完全な四量体である免疫グロブリン分子の集合およびキメラな抗体の発現のため、ヘビーおよびライトチェーンの多様性ドメインをコードする挿入遺伝子（組み換えＤＮＡ）は、ヘビーおよびライトチェーンの定常ドメインをコードするそれ相応のＤＮＡで融合され、例えばハイブリッドベクターへ組み込んだ後適当な宿主細胞に導入する。それゆえ本発明は、ヒトの定常ドメインγ（例えばγ１、γ２、γ３またはγ ４、好ましくはγ１またはγ４）と融合しＤＩＰ１を指示するマウスの抗体のヘビーチェーンの多様性ドメインをコードする挿入遺伝子を含める組み換えＤＮＡにも関与する。同様に本発明は、ヒトの定常ドメイン（κまたはλ、特にκ）と融合しＤＩＰ１を指示するマウスの抗体のライトチェーンの多様性ドメインをコードする挿入遺伝子を含める組み換えＤＮＡに関与する。他の態様ではヘビーチェーンの多様性ドメインおよびライトチェーンの多様性ドメインが、スベーサーグループ（宿主細胞内で抗体のプロセスを促進させるシグナル配列および／または抗体の精製を促進するペプチドをコードするＤＮＡおよび／または切断部位をコードするＤＮＡおよび／またはペプチドスペーサーをコードするＤＮＡおよび／またはエフェクター分子をコードするＤＮＡを任意に含める）をコードするＤＮＡの挿入法により連結する組み換えＤＮＡは本発明に直接関与する。エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断法に有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡとなることを目的としている。そのようなエフェクターをコードするＤＮＡは当分野にて既知の方法により得られる。診断組成物の場合、抗体は好ましいことに抗体を検出する方法とともに提供される。それは酵素的方法、蛍光的方法、ラジオアイソトープによる方法または他の方法である。神経性疾患の診断を目的とした診断キットにおいて抗体および検出法は同時に提供され、同時に分離され、またはその結果として使用され得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年３月１３日（１９９８．３．１３）【補正内容】請求の範囲１．配列番号１に示す配列を有するデプレニル誘導性タンパク質１およびその機能性誘導体。２．神経性疾患においてアポトーシス性細胞死の妨止または緩和のために使用する請求項１に記載のタンパク質、その機能性誘導体またはＤＩＰ１活性のモジュレーター。３．神経細胞と化合物または化合物の組み合わせと接触させ、その上昇が当該化合物または化合物の組み合わせの神経細胞をアポトーシスから救済する能力の指標となる請求項１記載のタンパク質活性の強度を観察することを含む、化合物または化合物の組み合わせを神経細胞をアポトーシスから救済する能力についてスクリーニングする方法。４．神経活性薬または神経活性薬の組み合わせのインビボの活性をモニターする請求項３記載の方法。５．神経細胞における請求項１記載のタンパク質の活性を増大する効果を有する、神経細胞をアポトーシスから救済するための組成物。６．神経細胞において請求項１記載のタンパク質の活性をモジュレートする効果がある組成物の薬学的有効量を患者に投与することを含む神経疾状を有する患者の処置法。７．神経細胞に投与したとき、当該細胞における請求項１記載のタンパク質活性を増大させる効果を有する化合物。８．式II〜ＸＸIIの化合物のうちの何れかを選択した請求項７記載の化合物。９．請求項１記載のタンパク質活性を増大させる組成物の製造における請求項７記載の化合物の使用。１０．式II〜ＸＸIIの化合物のうちの何れかの化合物を選択した請求項９記載の使用。１１．請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。１２．機能制御エレメントをコードする請求項１１記載の核酸フラグメント。１３．異種遺伝子の発現を制御するための請求項１記載のタンパク質の制御配列の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/352 Ａ６１Ｋ 31/35 ６０２ 31/395 31/395 31/40 31/40 31/4409 31/44 ６０３ 31/5377 31/535 ６０６ 31/7088 31/70 ６２３Ｃ０７Ｃ 211/23 Ｃ０７Ｃ 211/23 211/27 211/27 211/32 211/32 Ｃ０７Ｄ 213/36 Ｃ０７Ｄ 213/36 295/02 295/02 Ｚ 311/82 311/82 313/14 313/14 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者タットン，ウィリアム・ジョージカナダ、ビー３ピー・１エイ５、ノバ・スコティア、ハリファクス、カーク・ロード 27番

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１に示す配列を有するデプレニル誘導性タンパク質１（ＤＩＰ1）およびその機能性誘導体。２．神経性疾患においてアポトーシス性細胞死の妨止または緩和のために使用する請求項１に記載のタンパク質、その機能性誘導体またはＤＩＰ1活性のモジュレーター。３．神経細胞と化合物または化合物の組み合わせと接触させ、その上昇が当該化合物または化合物の組み合わせの神経細胞をアポトーシスから救済する能力の指標となるＤＩＰ1活性の強度を観察することを含む、化合物または化合物の組み合わせを神経細胞をアポトーシスから救済する能力についてスクリーニングする方法。４．神経活性薬または神経活性薬の組み合わせのインビボの活性をモニターする請求項３記載の方法。５．神経細胞におけるＤＩＰ１活性を増大する効果を有する、神経細胞をアポトーシスから救済するための組成物。６．神経細胞においてＤＩＰ１の活性をモジュレートする効果がある組成物の薬学的有効量を患者に投与すること含む神経疾状を有する患者の処置方法。７．神経細胞に投与したとき、当該細胞におけるＤＩＰ１活性を増大させる効果を有する化合物。８．式Ｉ〜ＸＸIIの化合物のうちの何れかを選択した請求項７記載の化合物。９．ＤＩＰ１の活性を増大させる組成物の製造における化合物の使用。１０．式Ｉ〜ＸＸIIの化合物のうちの何れかの化合物を選択した請求項９記載の使用。１１．請求項１記載のＤＩＰ１をコードする核酸。１２．機能制御エレメントを含む請求項１１記載の核酸のフラグメント。１３．異種遺伝子の発現を制御するためのＤＩＰ１制御配列の使用。