KR20030045083A

KR20030045083A - β-카테닌 핵 국재화 단백질

Info

Publication number: KR20030045083A
Application number: KR10-2003-7004146A
Authority: KR
Inventors: 아키야마데쯔; 아다치슈운고
Original assignee: 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2003-06-09
Also published as: US20040073001A1; EP1323732B9; EP1323732B1; EP1323732A1; US7358348B2; CA2423108A1; WO2002024738A1; ES2264450T3; EP1323732A4; JPWO2002024738A1; ATE328899T1; DE60120440D1; DE60120440T2; AU2001290242A1

Abstract

본 발명은 신규한 β-카테닌 핵 국재화 단백질 및 상기 단백질을 코드하는 DNA를 제공하고, 더욱이 β-카테닌 핵 국재화 단백질 및 상기 단백질을 코드하는 DNA를 이용함으로써, 암 등의 β-카테닌 핵 국재화와 관련된 질환의 진단약 및 치료약을 제공한다.

Description

β-카테닌 핵 국재화 단백질{β-catenin nuclear localized protein}

대장선종증(APC; adenomatous polyposis coli) 유전자는 가족성 대장선종증(FAP)의 원인 유전자로서 단리된 유전자이지만[Kinzler K.W. & Vogelstein B., Cell,87, 159(1996)], FAP 뿐만 아니라 산발성 대장암의 70~80%의 증례에 APC 유전자의 이상을 일으키고 있는 것이 보고되어 있다. 대장암은 APC 뿐만 아니라 K-ras, p53, DCC 등 다수의 유전자에 단계적으로 변이가 일어남으로써 발증한다고 생각되고 있지만, APC 유전자는 이들 유전자 중에서 가장 조기에 변이가 보이기 때문에, 대장암 발증에는 먼저 APC 유전자의 이상이 일어날 필요가 있다고 생각되고 있다.

APC 유전자의 이상에서 암 발증으로 결부되는 기구를 해명하기 위해서는 유전자 산물인 APC의 기능을 해명할 필요가 있다. APC는 약 300 kDa의 단백질로, 세포내에서 β-카테닌(β-catenin), 글리코겐 신타아제 키나아제-3β(GSK-3β), DLG와 결합하고 있는 것이 보고되어 있다[Rubinfeld B. 등, Science,262, 1731(1993), Su L.K. 등, Science,262, 1734(1993), Rubinfeld B. 등, Science,272, 1023(1996), Matsumine A. 등, Science,272, 1020(1996)]. APC의 기능에 대해서는 APC 유전자에 변이를 갖는 대장암 세포주 SW480에 정상인 APC를 발현시키면, 세포내 β-카테닌의 양이 급격하게 저하되는 것이 보고되어 있다[Munemitsu S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92, 3046(1995)]. 이 APC가 기능하기 위해서는 APC내의 중앙부에 있는 7회 반복 구조의 영역이 필요한데, 이 영역은 대부분의 대장암에서 변이가 발견되고 있는 영역과 일치하고 있고, 또한 이들 대장암 세포에서는 세포내 β-카테닌의 양이 증대되고 있는 것도 보고되어 있다[Munemitsu S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92, 3046(1995), Rubinfeld B. 등, Cancer Res.,57, 4624(1997)].

β-카테닌은 세포접착분자 카드헤린(cadherin)의 막골격 단백질로서도 알려진 단백질이지만, 아래에 나타내는 Wnt 단백질의 정보전달계에 관한 것이 보고되어 있다[Cadigan K.M. & Nusse R., Genes Dev.,11, 3286(1997)]. Wnt 유전자는 동물의 초기발생이나 형태 형성과정에서 다양한 기능을 가지고 관여하고 있는 커다란 유전자 패밀리로, 마우스에서 약 20종류의 패밀리를 형성하는 것 이외에, 아프리카발톱개구리나 초파리, 선충 등 넓은 동물종에서 보존되고 있는 유전자이다. Wnt가 리셉터인 Frizzled와 결합하면 세포내 정보전달분자 Dishvelled(Dsh)를 매개로 하여 글리코겐 신타아제 키나아제-3β(GSK-3β)의 활성이 억제된다. GSK-3β는 β-카테닌을 인산화함으로써 β-카테닌의 분해를 일으키고 있기 때문에, GSK-3β의 활성이 억제됨으로써 β-카테닌은 세포내에 축적된다. β-카테닌은 Lef/Tcf 패밀리에 속하는 전사인자(이하 TCF라고 약기한다)와 결합하여 복합체를 형성하고, TCF를 전사인자로서 활성화하는 성질을 가지고 있기 때문에, β-카테닌의 축적에 의하여 β-카테닌/TCF 복합체가 형성되고, 핵내로 이행하여 타겟 유전자의 전사가 촉진된다. Tcf 중에서 Tcf-4는 대장 상피에 특이적으로 발현하고 있기 때문에, 대장암에서는 주로 β-카테닌은 Tcf-4와 복합체를 형성하고 있다고 생각되고 있다[Korinek V. 등, Science,275, 1784(1997)]. 또한, APC 유전자는 정상이지만, GSK-3β에 의한 제어를 받지 않는 β-카테닌 유전자의 변이를 갖는 대장암이나 흑색종 세포도 보고되어 있다[Morin P.J. 등, Science,275, 1787(1997), Rubinfeld B. 등, Science,275, 1790(1997)]. 이들 세포에서는 β-카테닌은 항상 세포내에 축적되고 β-카테닌/TCF 복합체에 의한 전사의 활성화가 일어나고 있다고 생각된다.

이상으로부터 β-카테닌은 대장암 발증에 크게 관여하고 있다고 생각되기 때문에, β-카테닌과 결합하여 그 기능을 억제하는 물질은 대장암 발증에 관여하여 그 치료나 진단 등에 유용하다고 생각된다. β-카테닌과 결합하는 분자로서는 Wnt 단백질의 정보전달계를 음으로 제어하는 단백질 Axin[Zeng L. 등, Cell,90, 181(1997)]이 보고되어 있다. Axin은 GSK-3β와 결합하여 β-카테닌의 인산화를 촉진[Ikeda S. 등, EMBO J.,17, 1371(1998)]할 뿐만 아니라, 더욱이 APC 및 β-카테닌과도 결합하고 있어 β-카테닌의 분해를 촉진함으로써 세포내 β-카테닌의 양을 저하시키는 작용을 갖는 것이 보고되어 있다[Kishida S. 등, J. Biol. Chem.,273, 10823(1998), Rubinfeld B. 등, Curr. Biol.,8, 573(1998), Nakamura T. 등,Genes Cells,3, 395(1998)]. 그러나, β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵에 국재시키는 기능을 갖는 단백질은 알려져 있지 않다.

bc19 단백질[Willis T.G. et al., Blood,91, 1871(1998)]은 B세포 전구체의 급성 림프아구성 백혈병 환자로부터 수립된 세포주 CEMO-1의 제1염색체의 염색체 전좌부위(translocation site)에서 클로닝된 유전자로, CEMO-1에서 이상적으로 높은 발현이 보이는 유전자이지만, β-카테닌과의 결합 등 β-카테닌과의 관련성은 알려져 있지 않다.

β-카테닌과 결합하여 그 기능을 제어하는 단백질 및 그 유전자를 해석함으로써 대장암을 비롯한 β-카테닌이 관여하는 암의 발증기구를 해명하여, 암의 치료나 진단에 유용한 단백질 및 상기 단백질을 코드하는 DNA를 단리하여 구조를 명확하게 하는 것이 요구되고 있었다.

본 발명은 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵에 국재시키는 작용을 갖는 신규 단백질, 상기 단백질을 코드하는 DNA, 상기 단백질을 인식하는 항체, 상기 단백질, 상기 DNA 또는 상기 항체를 함유하는 치료약 및 상기 항체를 함유하는 진단약에 관한 것이다.

발명의 개시

본 발명은 암의 치료나 진단에 유용한, β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질, 상기 단백질을 코드하는 DNA, 상기 단백질을 인식하는 항체, 상기 단백질 또는 상기 DNA를 함유하는 치료약, 상기 항체를 함유하는 진단약을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 아래의 (1) 내지 (47)에 관한 것이다.

(1) 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열의 아미노산번호 292~439로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 단백질.

(2) (1)에 있어서, 단백질이 서열번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질.

(3) 서열번호 10으로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 단백질.

(4) 서열번호 10 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 단백질.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 단백질이 갖는 아미노산서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 아미노산서열로 되고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질.

(6) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 단백질이 갖는 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로 되고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질.

(7) 상기 (3) 또는 (4)에 있어서, 단백질이 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로 되고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질인 단백질.

(8) 서열번호 12로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질.

(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나의 단백질이 갖는 아미노산서열 중 연속된 5~60의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드.

(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 단백질 또는 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(11) 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 염기번호 874~1317로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA.

(12) 상기 (11)에 있어서, DNA가 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA.

(13) 아래의 [1] 또는 [2]의 염기서열을 포함하고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

[1] 서열번호 9로 표시되는 염기서열

[2] 서열번호 9 및 11로 표시되는 염기서열

(14) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(15) DNA가 서열번호 9 및 11로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA이고, 또한 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 염기서열로 된 DNA이며, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(16) 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA.

(17) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA를 벡터에 삽입하여 얻어지는 재조합 DNA.

(18) 상기 (17)의 재조합 DNA를 숙주세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체.

(19) 상기 (18)의 형질전환체를 배양액 중에서 배양하고, 상기 (1) 내지 (9)중 어느 하나의 단백질 또는 폴리펩티드를 상기 배양물 중에 생성 축적시켜, 상기 배양물 중으로부터 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 제조방법.

(20) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA의 염기서열 중 연속된 10~60 염기의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 그들 올리고뉴클레오티드의 유도체.

(21) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA 또는 상기 (20)의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 사용하여, 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 어느 하나의 단백질의 발현량을 mRNA 레벨에서 검출 또는 정량하는 방법.

(22) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA 또는 상기 (20)의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 사용하여, 신체가 건강한 정상인과 피검자가 갖는 (3) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질의 발현량을 mRNA 레벨에서 측정 비교하여, 신체가 건강한 정상인에 비하여 상기 단백질의 발현량이 증가 또는 감소하고 있는 질환을 판별하는 방법.

(23) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA 또는 상기 (20)의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 함유하는, 상기 (3) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질의 발현량을 mRNA 레벨에서 측정 비교하여, 신체가 건강한 정상인에 비하여 상기 단백질의 발현량이 증가 또는 감소하고 있는 질환의 진단약.

(24) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA 또는 상기 (20)의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 사용하여, 상기 (3) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질의 유전자의 변이를 검출하는 방법.

(25) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA 또는 상기 (20)의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 사용하여, 상기 (3) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질의 유전자에 변이를 갖는 질환을 판별하는 방법.

(26) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA 또는 상기 (20)의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 함유하는, 상기 (3) 내지 (7)로부터 선택되는 단백질의 유전자에 변이를 갖는 질환의 진단약.

(27) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA 또는 상기 (20)의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 사용하여, 상기 (3) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질의 발현을 전사단계에서 억제하는 방법.

(28) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA, 상기 (20)의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체, bc19 단백질을 코드하는 DNA, bc19 단백질을 코드하는 DNA의 염기서열 중 연속된 10~60 염기의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 또는 DNA를 사용하여 β-카테닌의 핵 국재화를 저해하는 방법.

(29) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA, 상기 (20)의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체, bc19 단백질을 코드하는 DNA, bc19 단백질을 코드하는 DNA의 염기서열 중 연속된 10~60 염기의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드또는 그들 올리고뉴클레오티드의 유도체로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 또는 DNA를 함유하는 암 치료약.

(30) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA를 함유하는 유전자 치료용 벡터.

(31) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA를 도입함으로써 제작한 비인간 트랜스제닉 동물.

(32) 상기 (31)의 비인간 트랜스제닉 동물 또는 bc19 단백질을 코드하는 DNA를 도입함으로써 제작한 비인간 트랜스제닉 동물을 발암 모델동물로서 사용하는 방법.

(33) 상기 (31)의 트랜스제닉 동물 또는 bc19 단백질을 코드하는 DNA를 도입함으로써 제작한 트랜스제닉 동물을 사용하여 암 치료약을 평가하는 방법.

(34) 상기 (10) 내지 (16) 중 어느 하나의 DNA의 전부 또는 일부가 결손되어, β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 활성을 갖는 단백질의 기능이 상실 또는 저하된 유전자 결손 비인간 동물.

(35) [1] 피검시료 비존재하에서의 bc19 단백질과 β-카테닌의 결합과, [2] 피검시료 존재하에서의 bc19 단백질과 β-카테닌의 결합을 비교하여, 피검시료로부터 bc19 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는, bc19 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질의 스크리닝 방법.

(36) [1] 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질과 β-카테닌을 접촉시킨 경우와, [2] 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질, β-카테닌 및 피검시료를접촉시킨 경우를 비교하여, 피검시료로부터 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질의 스크리닝 방법.

(37) 상기 (35) 또는 (36)의 스크리닝 방법에 의하여 얻어지는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염.

(38) 상기 (37)의 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 암 치료약.

(39) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 단백질 또는 폴리펩티드를 인식하는 항체.

(40) 상기 (39)의 항체를 사용한 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질을 면역학적으로 검출 또는 정량하는 방법.

(41) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질과 결합하여, 상기 단백질이 갖는 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 저해하는 중화항체.

(42) bc19 단백질과 결합하여, bc19 단백질이 갖는 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 저해하는 중화항체.

(43) 상기 (39)의 항체를 사용하여 신체가 건강한 정상인과 피검자가 갖는 상기 (3) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질의 발현량을 정량, 비교하여, 신체가 건강한 정상인에 비하여 상기 단백질량이 증가 또는 감소하고 있는 질환을 판별하는방법.

(44) 상기 (39)의 항체를 함유하는, 상기 (3) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질의 발현량이 신체가 건강한 정상인과 비교하여 증가 또는 감소하고 있는 질환의 진단약.

(45) 상기 (41)의 항체를 사용하여 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 단백질의 기능을 저해함으로써, β-카테닌과 Lef/Tcf 패밀리에 속하는 전사인자와의 복합체에 의한 전사의 활성화를 저해하는 방법.

(46) 상기 (42)의 항체를 사용하여 bc19 단백질의 기능을 저해함으로써, β-카테닌과 Lef/Tcf 패밀리에 속하는 전사인자와의 복합체에 의한 전사의 활성화를 저해하는 방법.

(47) 상기 (41) 또는 (42)의 항체를 함유하는 암 치료약.

본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드로서는,

(a) 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열의 아미노산번호 292~439로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 단백질,

(b) 상기 (a)에 있어서, 단백질이 서열번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질,

(c) 서열번호 10으로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 단백질,

(d) 서열번호 10 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 단백질,

(e) 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 단백질이 갖는 아미노산서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 아미노산서열로 되고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질,

(f) 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 단백질이 갖는 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로 되고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질,

(g) 상기 (c) 또는 (d)에 있어서, 단백질이 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로 되고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질인 단백질,

(h) 서열번호 12로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질

(i) 상기 (a) 내지 (h) 중 어느 하나의 단백질이 갖는 아미노산서열 중 연속된 5~60 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.

상기 아미노산의 부가, 결실 또는 치환은 Zoller M.J. & Smith M., Nucleic Acids Res.,10, 6487(1982), Dalbadie-McFarland G. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79, 6409(1982), Wells J.A. 등, Gene,34, 315(1985), Carter P. 등, Nucleic Acids Res.,13, 4431(1985), Kunkel T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 488(1985) 등에 기재된 부위특이적 변이도입법을 사용하여, 서열번호 2에 기재된 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA에 부위특이적 변이를 도입함으로써 행할 수 있다.

결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 상기의부위특이적 변이법 등 주지의 방법에 의하여 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수로, 1개에서 수십 개, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더욱 바람직하게는 1~5개이다.

목적으로 하는 변이(결실, 치환, 부가)를 도입한 서열을 각각의 5'말단에 갖는 한쌍의 PCR 프라이머를 사용한 PCR[Ho S.N. 등, Gene,77, 51(1989)]에 의해서도, 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA에 변이를 도입하는 것이 가능하다. 즉, 먼저 상기 DNA의 5'말단에 대응하는 센스 프라이머와 5'말단에 변이 서열과 상보적인 서열을 갖는, 변이 도입부위의 직전(5'측) 서열에 대응하는 안티센스 프라이머로 상기 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행하여, 상기 DNA의 5'말단에서 변이 도입부위까지의 단편 A(3'말단에 변이가 도입되어 있다)를 증폭한다. 이어서, 5'말단에 변이 서열을 갖는, 변이 도입부위의 직후(3'측) 서열에 대응하는 센스 프라이머와 상기 DNA의 3'말단에 대응하는 안티센스 프라이머로 상기 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행하여, 5'말단에 변이가 도입된 상기 DNA의 변이 도입부위에서 3'말단까지의 단편 B를 증폭한다. 이들 증폭단편 끼리 정제한 후, 혼합하여 주형이나 프라이머를 가하지 않고 PCR를 행하면, 증폭단편 A의 센스가닥과 증폭단편 B의 안티센스가닥은 변이 도입부위가 공통되므로 하이브리다이즈하여, 프라이머 겸 주형으로서 PCR의 반응이 진행되어 변이가 도입된 상기 DNA가 증폭한다.

또한 결실 변이체의 한 종류인 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 부분단편을 코드하는 DNA는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA의 임의의 DNA 단편의 양 말단의 염기서열에 대응된 프라이머를 사용하여, 상기 DNA를주형으로 한 PCR을 행함으로써 취득하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 단백질이 β-카테닌을 핵에 국재화시키는 기능을 갖기 위해서는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열과 적어도 60% 이상, 보통은 80% 이상, 특히 95% 이상의 상동성을 가지고 있는 것이 바람직하다.

아미노산서열이나 염기서열의 상동성은 Karlin and Altschul에 의한 알고리즘 BLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA,90, 5873(1993)]나 FASTA[Methods Enzymol.,183, 63(1990)]를 사용하여 결정할 수 있다. 이 알고리즘 BLAST를 토대로 BLASTN이나 BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되어 있다[J. Mol. Biol.,215, 403(1990)]. BLAST를 토대로 BLASTN에 의하여 염기서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 Score=100, wordlength=12로 한다. 또한, BLAST를 토대로 BLASTX에 의하여 아미노산서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는 예를 들면 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우에는 각 프로그램의 디폴트 파라미터(default parameter)를 사용한다. 이들 해석방법의 구체적인 수법은 공지이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

서열번호 2로 표시되는 아미노산서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 아미노산서열로 되고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질로서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열의 아미노산번호 245~564번째에 상당하는 부분단편인 서열번호 4의 아미노산서열로 된 단백질을 들 수 있다.

본 발명의 DNA로서는,

(j) 상기 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드를 코드하는 DNA,

(k) 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 염기번호 874~1317로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA,

(l) 상기 (k)에 있어서, DNA가 서열번호 1 또는 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA,

(m) 아래의 [1] 또는 [2]의 염기서열을 포함하고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질을 코드하는 DNA,

[1] 서열번호 9로 표시되는 염기서열

[2] 서열번호 9 및 11로 표시되는 염기서열

(n) 상기 (j) 내지 (m) 중 어느 하나의 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질을 코드하는 DNA,

(o) DNA가 서열번호 9 및 11로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA이고, 또한 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 염기서열로 된 DNA이며, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 또는

(p) 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA를 들 수 있다.

엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA란, 예를 들면 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등의 본 발명의 DNA 또는 그 일부의 DNA 단편을 프로브로 하여, 콜로니 하이브리다이제이션법(colony hybridization method), 플라크 하이브리다이제이션법(plaque hybridization method) 또는 서던 블롯 하이브리다이제이션법(southern blot hybridization method) 등을 사용함으로써 얻어지는 DNA를 의미하고, 구체적으로는 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA를 고정화한 필터를 사용하여 0.7~1.0 mol/L의 염화나트륨 존재하, 65℃에서 하이브리다이제이션을 행한 후, 0.1~2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150 mmol/L 염화나트륨, 15 mmol/L 구연산나트륨으로 된다)을 사용하여, 65℃ 조건하에서 필터를 세척함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다. 하이브리다이제이션은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(이하, Molecular Cloning 제2판으로 약기한다), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1~38, John Wiley & Sons(1987-1997)(이하, Current Protocols in Molecular Biology로 약기한다), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University(1995) 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다. 하이브리다이즈 가능한 DNA로서 구체적으로는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드로서는 본 발명의 DNA의 염기서열 중 10~60 염기의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 단, 공지의 염기서열, 즉 EST나 게놈 드래프트 시퀀스로서 그 서열이 공개되어 있는 염기서열로 된 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 제외된다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 또한, 이하의 설명에 있어서 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질을 「β-카테닌 핵 국재화 단백질」이라 총칭하고, 본 발명의 신규한 아미노산서열을 갖는 β-카테닌 핵 국재화 단백질을, 아미노산서열이 bc19와 상동성을 가지므로 bc19 유사 단백질(bc19 like protein, 이하 B9L 단백질이라고 약기한다)이라 칭한다.

1. β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA 및 상기 DNA의 부분서열로 된 올리고뉴클레오티드

1) B9L 단백질을 코드하는 DNA의 취득

본 발명의 B9L 단백질을 코드하는 DNA(이하, B9L DNA로 약기한다)로서 B9L 전장(full-length) cDNA, B9L 전장 cDNA에 대응하는 게놈 DNA, B9L 전장 cDNA의 B9L 단백질을 코드하고 있는 영역(서열번호 1로 표시되는 염기서열로 된 DNA), 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열을 코드하는 DNA를 들 수 있다.

B9L cDNA는 효모 투하이브리드법(yeast two-hybrid system)[Fields S. 등, Nature,340, 245(1989)]에 의하여 취득할 수 있다.

효모 투하이브리드법이란 GAL4와 같은 DNA 결합 도메인(BD)과 전사활성화 도메인(AD)이 따로따로 존재하는 효모의 전사인자 Z를 이용하여, 목적단백질[이 방법에서는 일반적으로 베이트(bait)라 불리운다] X와 피검단백질 Y의 결합을 검출하는 방법이다. 먼저, 숙주효모내에서 X를 전사인자 Z의 DNA 결합 도메인과의 융합단백(이하, BD-X라 칭한다)으로서 발현할 수 있는 플라스미드(베이트 플라스미드)를 제작한다. 한편, 숙주효모내에서 Y와 전사인자 Z의 전사활성화 도메인과의 융합단백(이하, AD-Y라 칭한다)으로서 발현할 수 있는 플라스미드를 제작한다. 두 플라스미드를 숙주의 효모에 도입하여 BD-X와 AD-Y를 동시에 발현시킨다. 이 숙주효모에는 전사인자 Z가 결합하여 전사를 활성화하는 프로모터의 제어하에서, 리포터 유전자를 발현할 수 있는 유전자형인 것을 사용한다. 단백질 Y가 X와 결합하는 성질을 가지고 있는 경우는 BD-X와 AD-Y가 결합하여 복합체를 형성하기 때문에, DNA 결합 도메인(BD)을 매개로 하여 프로모터에 결합한 복합체가 전사활성화 도메인(AD)을 매개로 하여 전사를 활성화하여 리포터 유전자가 발현한다. 따라서, 리포터 유전자의 발현을 지표로 하여 단백질 Y가 X와 결합하는 것을 검출하는 것이 가능하다. 여기에서 피검단백질 Y로서 cDNA 라이브러리 유래의 단백질을 사용하여, 리포터 유전자의 발현을 지표로 하여 형질전환체를 스크리닝함으로써, X와 결합하는 단백질 Y를 코드하는 cDNA를 포함하는 형질전환체를 단리할 수 있다. 상기 형질전환체로부터 플라스미드를 단리함으로써 목적으로 하는 cDNA를 클론화할 수 있다.

이하, 상기 방법에 의한 B9L cDNA의 클로닝을, 베이트로서 마우스 β-카테닌의 아르마딜로 도메인(armadillo domain)(이하, β-카테닌 arm으로 약기한다)을, 전사인자 Z로서는 효모 GAL4를 각각 사용한 경우를 예로 하여 구체적으로 설명한다.

(1) 베이트 플라스미드의 제작

본 발명에 있어서는 베이트로서 mβ-카테닌 arm(마우스 β-카테닌의 아미노산서열의 아미노산번호 128~683번째에 상당한다)을 사용하였다. 베이트 플라스미드의 제작을 위해서는 베이트가 되는 mβ-카테닌 arm을 코드하는 DNA(이하, mβ-카테닌 arm DNA로 약기한다)가 필요하다. 마우스 β-카테닌의 cDNA의 전 염기서열은 공지[GenBank 액세스번호: M90364, Butz S. 등, Science,257, 1142(1992)]이므로, mβ-카테닌 arm DNA에 상당하는 염기서열은 용이하게 발견하는 것이 가능하다. 따라서, 아래에 나타내는 RT-PCR[McPherson M. J. 등, PCR: A practical Approach, Oxford University Press(1991)]에 의하여 mβ-카테닌 arm DNA를 증폭하여 단리하는 것이 가능하다.

구체적으로는, β-카테닌을 발현하고 있는 마우스의 조직 또는 세포로부터 RNA를 단리하고, 상기 RNA를 재료로 하여 cDNA를 합성하여, 상기 cDNA를 주형으로 하여 mβ-카테닌 arm DNA의 5'말단 부분의 염기서열을 포함하는 센스 프라이머와 3'말단 부분의 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR을 행한다. 증폭용 프라이머 각각의 5'말단에 후술하는 베이트 플라스미드용 벡터의 클로닝용 제한효소 사이트의 인식서열을 존재시킴으로써, 후술하는 베이트 플라스미드 제작용 벡터에 증폭단편을 삽입할 때에 제한효소 사이트를 이용하여 효율적으로 삽입하는 것이 가능해진다. 또한 클로닝용 제한효소 사이트의 인식서열을 프라이머에 존재시키는 경우는, 벡터에 삽입했을 때에 전사인자의 전사활성화 도메인과 mβ-카테닌 arm의 코돈 프레임이 맞도록 디자인한다.

상기의 방법으로 조제한 mβ-카테닌 arm DNA를 삽입할 벡터로서는 효모Saccharomyces cerevisiae에서 복제 가능하고, 적당한 형질전환 마커 유전자, 예를 들면 TRP1, LEU2 등의 아미노산 합성계 유전자 등을 가지고, 효모에서 발현하는 프로모터, 예를 들면 알코올 데히드로게나아제(ADH) 프로모터의 제어하에서 GAL4의 DNA결합 도메인(이하, GAL4 BD로 약기한다)을 발현할 수 있는 벡터가 바람직하다. 이 경우 mβ-카테닌 arm DNA 삽입을 위해, GAL4 BD의 C말단측에 상당하는 부분에 적당한 제한효소 사이트가 있고, 또한 벡터 DNA 정제 등의 취급상 용이함 때문에, 대장균에서도 복제할 수 있고, 암피실린내성 유전자 등의 대장균에서 검출 가능한 형질전환 마커를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 벡터로서는 pGBT9[Clontech사], pAS1[Durfee T. 등, Genes Dev.,7, 555(1993)], pAS2-1(Clontech사제) 등을 들 수 있다.

상기에서 조제한 mβ-카테닌 arm DNA를 단리하여 벡터 중의 GAL4 BD의 C말단측의 제한효소 사이트에 코돈의 프레임이 맞도록 삽입한다.

(2) 투하이브리드법용 cDNA 라이브러리의 제작

GAL4의 전사활성화 도메인과의 융합단백질을 발현하는 cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 벡터로서는, 효모Saccharomyces cerevisiae에서 복제 가능하고, 적당한 형질전환 마커 유전자, 예를 들면 TRP1, LEU2 등의 효모의 아미노산 합성계 유전자 등을 가지고, 효모에서 발현하는 프로모터, 예를 들면 ADH 프로모터의 제어하에서 GAL4의 전사활성화 도메인(이하, GAL4 AD로 약기한다)을 발현할 수 있는 벡터가 바람직하다. 이 경우 GAL4 AD의 C말단측에 상당하는 부분에 적당한 제한효소 사이트가 있고, 또한 벡터 DNA 정제 등의 취급상 용이함 때문에, 대장균에서도 복제할 수 있고, 암피실린내성 유전자 등의 대장균에서 검출 가능한 형질전환 마커를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 벡터로서는 pGAD[Chien C.T. 등, Proc. Natl. Acad.Sci. USA,88, 9578(1991)], pGAD424(Clontech사제)나 pACT[Durfee T. 등, Genes Dev.,7, 555(1993)], pACT2-1(Clontech사제) 등을 들 수 있다.

세포내에서 β-카테닌과 상호작용하는 단백질은 β-카테닌과 동일한 세포나 조직에서 발현하고 있다고 생각된다. β-카테닌은 성체(adult)나 태아의 조직에서 넓게 발현하고 있는 것이 보고되어 있지만, β-카테닌이 발현하고 있다고 생각되는 마우스의 조직이나 세포로부터 cDNA를 조제하여, 상술한 융합단백질 발현용 벡터의 GAL4 AD의 C말단측 제한효소 사이트에 삽입함으로써, cDNA 라이브러리를 제작하는 것이 가능하다. 이 경우, cDNA와 GAL4 AD의 방향 및 프레임이 맞으면, GAL4 AD와 상기 cDNA가 코드하는 단백질과의 융합단백질이 발현한다. 또는 효모 투하이브리드법에 사용할 수 있는 시판의 라이브러리, 예를 들면 매치메이커(MATCHMAKER) cDNA 라이브러리(Clontech사제)를 사용하는 것도 가능하다.

(3) 효모 투하이브리드법에 의한 cDNA의 스크리닝

(1)에서 제작한 베이트 플라스미드와 (2)에서 제작한 cDNA 라이브러리를 도입하는 효모로서는Saccharomyces cerevisiae에 속하는 효모로서, 상술한 베이트 플라스미드와 cDNA 라이브러리를 도입할 수 있고, 더욱이 (a) 도입하는 플라스미드의 형질전환 마커의 유전자 및 투하이브리드법에 사용한 전사인자 GAL4의 유전자가 결실이나 변이에 의하여 발현할 수 없는 것, (b) 적당한 리포터 유전자의 프로모터 부위에 GAL4 BD가 결합하는 염기서열이 삽입되어 있는 것이 필요하다. 이 경우의 리포터 유전자로서는 베이트와의 결합에 의하여 전사가 개시된 경우에 검출이 용이한 것, 예를 들면 HIS3 등의 아미노산 합성계 유전자(이 경우, 베이트 플라스미드의 형질전환 마커와는 다른 것을 사용한다), 효모에서도 검출 가능한 대장균의 β갈락토시다아제 유전자 lacZ 등이 바람직하게 사용된다. 예를 들면Saccharomyces cerevisiaeCG1945주(Clontech사제), HF7C주(Clontech사제), Y153주[Durfee T. 등, Genes Dev.,7, 555(1993)], CGY1::171주[Gill G. & Ptashne M., Cell,51, 121(1987)] 등을 들 수 있다.

이 숙주 효모에 (1)에서 제작한 베이트 플라스미드와 (2)에서 제작한 cDNA 라이브러리를 도입하고, 리포터 유전자의 발현을 지표로 하여 mβ-카테닌 arm과 결합하는 단백질을 코드하는 cDNA를 포함하는 형질전환체를 선택한다. 예를 들면 히스티딘 생합성계 유전자 HIS3 유전자를 리포터 유전자로 한 경우는 히스티딘을 포함하지 않은 최소배지에서 배양했을 때에 생육하는 콜로니를, 대장균 lacZ 유전자를 리포터 유전자로 한 경우는 X-gal을 작용시켜 파랗게 발색하는 콜로니를 선택한다.

선택한 형질전환체 콜로니에는 베이트 플라스미드와 cDNA 라이브러리의 플라스미드 2종류의 플라스미드가 포함되어 있기 때문에, cDNA 라이브러리의 플라스미드만을 문헌[Glover D.M. & Hames B.D., DNA Cloning 2: Expression Systems(Practical Approach Series 149) Second Edition, Oxford University Press(1995), Chien C.T. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88, 9578(1991)] 기재의 방법에 의하여 단리한다. 즉, 콜로니로부터 플라스미드를 포함하는 DNA 전체를 단리하여 대장균을 형질전환한다. 이 때의 숙주 대장균은 cDNA 라이브러리의 마커 유전자에 대응하는 유전자를 발현하지 않고, 상기 마커 유전자가 도입된 형질전환체가 상기 마커유전자를 발현했을 때에 검출 가능한 주를 사용한다. 상기 형질전환체로부터 cDNA 라이브러리 유래의 마커 유전자를 발현하고 있는 형질전환체를 선택하고, 선택한 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 단리하여 cDNA 클론으로 한다.

(4) cDNA 클론의 염기서열 해석

(3)에서 얻어진 cDNA 클론의 염기서열은 얻어진 cDNA 클론을 그대로 또는 cDNA 부분을 적당한 제한효소로 잘라내어 pUC118 등의 적당한 클로닝 벡터에 서브클로닝한 후, 보통 사용되는 염기서열 해석방법, 예를 들면 Sanger 등의 디데옥시법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74, 5463 (1977)] 또는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)사 등의 DNA 시퀀서를 사용함으로써 결정하는 것이 가능하다.

얻어진 cDNA의 염기서열이 신규한 서열인지의 여부는 BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 사용하여 GenBank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기서열 데이터베이스를 검색함으로써, 데이터베이스 중 기존 유전자의 염기서열과 일치한다고 생각되는 명확한 상동성을 나타내는 염기서열이 없는 것으로 확인할 수 있다.

신규한 염기서열인 경우 (3)에서 얻어진 cDNA 클론은 (2)에서 기술한 바와 같이, GAL4 AD의 C말단에 B9L 단백질이 동일 프레임으로 연결되어 있는 융합단백질을 코드하고 있음에 틀림없다. 따라서, 여기에서 해명된 cDNA의 염기서열을 GAL4 AD의 번역 프레임과 동일한 프레임으로 아미노산으로 변환함으로써, 이 cDNA가 코드하고 있는 단백질의 아미노산서열을 얻는 것이 가능하다.

또한, 이 아미노산서열을 BLAST, FASTA, FrameSearch 등의 상동성 검색 프로그램을 사용하여 Genpept, PIR, Swiss-Prot 등의 아미노산서열 데이터베이스를 검색함으로써, cDNA가 코드하는 단백질과 상동성을 갖는 기존의 유전자를 검색하는 것이 가능하다.

이상과 같이 하여 얻어지는 신규한 염기서열을 갖는 cDNA로서 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 cDNA를 들 수 있다. 상기 cDNA는 서열번호 4로 표시되는 신규한 아미노산서열을 갖는 단백질을 코드하고 있다.

단, 이와 같이 하여 얻어진 cDNA는 목적으로 하는 단백질 전체를 코드하고 있지 않은 비완전장(non-full-length) cDNA인 것이 많다. 이 경우는 아래 (5)에 나타내는 방법으로 전장의 cDNA를 얻은 후, 상기에서 취득한 cDNA를 아미노산으로 번역했을 때와 동일한 프레임으로 아미노산서열로 번역함으로써, 목적으로 하는 단백질 전체의 아미노산서열을 명백하게 하는 것이 가능하다. 또한, B9L 단백질 전체의 아미노산서열을 코드하고 있다면, B9L 단백질을 코드하고 있는 영역의 각 코돈의 염기서열은 cDNA로 사용되고 있는 코돈에 한정되는 것이 아니라, 동일한 아미노산을 코드하는 모든 코돈의 염기서열을 사용하는 것이 가능하다.

(5) B9L 전장 cDNA의 클론화

(4)의 염기서열 해석이나 후술하는 노던 블롯 하이브리다이제이션으로 얻어진 mRNA의 길이 정보로부터 (3)에서 얻어진 B9L cDNA가 전장이 아니라고 예측되는 경우는, 아래에 나타내는 방법으로 B9L 전장 cDNA를 조제할 수 있다.

(5-1) cDNA 라이브러리의 스크리닝

(2)에서 조제한 융합단백하는 발현 cDNA 라이브러리 또는 β-카테닌이 발현하고 있기 때문에 B9L 단백질도 동시에 발현하고 있다고 생각되는 조직 또는 세포,또는 후술하는 노던 블로팅으로 β-카테닌의 mRNA가 검출된 세포 등으로 조제한 cDNA 라이브러리에 대해서, (3)에서 얻어진 cDNA 전체 또는 일부를 프로브로 하여 콜로니 하이브리다이제이션이나 플라크 하이브리다이제이션을 행하여, 포지티브 클론 중에서 전장으로 생각되는 길이의 cDNA 클론을 선택한다. cDNA 라이브러리의 제작이나 하이브리다이제이션은 Molecular Cloning 제2판에 기재된 방법으로 행할 수 있다. 또한, Clontech사 등에서 시판되고 있는 cDNA 라이브러리를 이용하는 것도 가능하다. 얻어진 cDNA 클론에 대해서 (4)와 동일하게 하여 염기서열을 결정함으로써, 마우스 B9L 전장 cDNA의 염기서열 및 마우스 B9L 단백질 전체의 아미노산서열을 명확하게 하는 것이 가능하다.

(5-2) RACE법

B9L 단백질이 발현하고 있다고 생각되는 조직 또는 세포로부터 cDNA를 조제하고, 그 cDNA의 양 말단에 어댑터 올리고뉴클레오티드를 부가하여, 이 어댑터의 염기서열과 (3)에서 얻어진 cDNA 클론의 염기서열을 토대로 한 프라이머로 PCR을 행하는 5'-RACE(rapid amplification of cDNA ends)법 및 3'-RACE법[Frohman M.A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 8998(1988)]에 의하여, (3)에서 얻어진 cDNA 보다도 5'측 및 3'측의 cDNA 단편을 얻는 것이 가능하다. 얻어진 cDNA의 염기서열을 (4)와 동일하게 하여 결정함으로써 B9L 전장 cDNA의 염기서열을 명확하게 하는 것이 가능하다.

(5-3) EST 염기서열의 이용

(4)에서 결정한 B9L cDNA의 염기서열을 공지의 염기서열 데이터베이스와 상동성 해석을 행했을 때에 기지의 유전자 염기서열과는 일치가 보이지 않지만, 랜덤한 cDNA 클론의 부분 염기서열인 EST와 일치가 보이는 경우가 있다. 이 경우는 이들 EST 및 상기 EST 의 염기서열과 일치하는 염기서열을 갖는 EST, 상기 EST와 동일 클론 유래의 EST를 동일 유전자 유래의 EST로서 모은다. 이들 B9L cDNA 유래로 생각되는 EST의 염기서열을 연결하여 합치면, (4)에서 얻어진 cDNA 보다도 5'측 또는 3'측으로 연장된 부분의 염기서열이 발견되는 경우가 있다. 이 경우, 이들의 EST를 연결하여 합쳐 얻어진 염기서열의 가장 5'말단의 염기서열을 갖는 센스 프라이머 또는 3'말단의 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여, B9L 단백질이 발현하고 있다고 생각되는 마우스 조직 또는 세포 유래의 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 RT-PCR을 행함으로써, (4)에서 얻어진 cDNA의 염기서열 보다도 5'측 또는 3'측의 서열을 포함하는 cDNA 단편을 얻을 수 있다. 이들 cDNA 단편의 염기서열을 결정하여 이들이 B9L 전장 cDNA의 5'말단 또는 3' 말단에 상당하고 있다고 생각되는 경우는, (4)에서 얻어진 cDNA의 염기서열과 연결하여 합침으로써 마우스 B9L 전장 cDNA의 염기서열을 명확하게 할 수 있다. 마우스 B9L cDNA 유래로 생각되는 EST가 공지의 염기서열 데이터베이스로부터 다수 얻어진 경우는 RT-PCR을 행하지 않아도 모은 EST의 염기서열을 연결하여 합침으로써 마우스 B9L 전장 cDNA의 염기서열을 명확하게 하는 것이 가능한 경우도 있다.

(5-4) B9L 전장 cDNA의 조제

명확해진 B9L 전장 cDNA의 5'말단 및 3'말단의 염기서열을 토대로 한 프라이머를 사용하여, B9L 단백질을 발현하고 있다고 생각되는 마우스 조직 또는 세포로부터 (3)과 동일하게 하여 조제한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR을 행함으로써 B9L 전장 cDNA를 증폭하여 조제하는 것이 가능하다.

또한 (5-1)에서 얻어진 B9L 전장 cDNA 클론, 또는 (5-2)나 (5-3)에서 얻어진 5'측이나 3'측의 부분 cDNA와 최초로 얻어진 B9L cDNA를 cDNA 내의 제한효소 사이트를 이용하여 연결하여 합침으로써 제작한 B9L 전장 cDNA 클론 또는 상기의 PCR로 조제한 B9L 전장 cDNA를 적당한 클로닝 벡터로 클론화한 B9L 전장 cDNA 클론으로, 대장균을 형질전환하여 배양하고 거기에서 플라스미드 DNA를 조제함으로써 B9L 전장 cDNA를 조제하는 것이 가능하다.

이와 같이 하여 얻어진 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 된 DNA를 함유하는 플라스미드 DNA인 pEGFP-C2B9L을 함유하는 형질전환체Escherichia coliMM294/pEGFP-C2B9L은 2000년 9월 6일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6(우편번호 305-8566)(구칭 공업기술원 생명공학 공업기술연구소, 구주소 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 히가시 1-1-3)에 FERM BP-7291로서 기탁되어 있다.

또한 B9L 전장 cDNA를 그 염기서열을 토대로 DNA 합성기로 화학 합성하는 것도 가능하다. DNA 합성기로서는 포스포아미다이트법(phosphoramidite method)을 이용한 퍼킨 엘머사제의 DNA 합성기 model 392 등을 들 수 있다.

(6) 인간 B9L 단백질을 코드하는 DNA의 취득

인간의 대장암 발증기구의 해석, 그 치료나 진단을 위해서는 마우스 보다도 인간의 B9L 단백질 또는 상기 단백질을 코드하는 DNA를 취득하는 것이 중요하다.일반적으로 동일한 기능을 갖는 단백질은 생물종이 다른 경우, 동일하지 않지만 상동성을 나타내는 아미노산서열을 갖는 경우가 많다. 따라서 그 단백질을 코드하는 DNA도 동일하게 상동성을 나타낸다고 생각된다. 또한, 생물의 진화에 따라 유전자의 변이도 진행되기 때문에, 그 생물종이 계통적으로 가까울수록 그 상동성은 높다고 생각된다. 따라서, (3)에서 얻어진 마우스 B9L cDNA 또는 그 염기서열 정보를 사용함으로써, 아래에 나타내는 방법으로 다른 포유류, 예를 들면 인간의 B9L cDNA를 취득하는 것이 가능하다. 이 cDNA가 완전장 cDNA가 아닌 경우는 (5)와 동일한 방법을 사용함으로써 인간 B9L DNA를 얻는 것이 가능하다.

또한, 마우스 B9L DNA를 취득하지 않고 인간 β-카테닌[Hulsken J. 등, J. Cell Biol.,127, 2601(1994), GenBank 액세스번호 X87838]의 아르마딜로 도메인을 베이트로 한 베이트 플라스미드와 인간 cDNA 라이브러리를 사용한 효모 투하이브리드법으로 (1) 내지 (5)와 동일한 조작을 행함으로써 직접 인간 B9L cDNA를 취득하는 것도 가능하다.

(6-1) cDNA 라이브러리의 스크리닝

인간 B9L 단백질의 cDNA 클론은 마우스 B9L 단백질이 발현하고 있는 마우스 조직과 동일한 인간 조직 또는 그와 같은 조직 유래의 인간 세포로부터 (5-1)과 동일하게 하여 cDNA 라이브러리를 제작하거나, 그와 같은 인간 조직이나 세포 유래의 시판되는 인간 cDNA 라이브러리를 구입하여, 해당 cDNA 라이브러리로부터 마우스 B9L DNA를 방사성 동위체나 디곡시게닌(digoxigenin) 등으로 표지한 것을 프로브로 하여, 약간 엄격한 조건에서 콜로니 하이브리다이제이션이나 플라크 하이브리다이제이션을 행함으로써 취득하는 것이 가능하다.

여기서 말하는 약간 엄격한 조건이란, 인간 B9L cDNA와 마우스 B9L cDNA의 상동성 정도에 따라서 다르지만, 제한효소로 절단한 인간 염색체 DNA에 대해서 마우스 B9L cDNA를 프로브로 하여, 엄격한 정도가 다른 몇 개의 하이브리다이즈 조건에서 서던 블롯 하이브리다이제이션을 행하여 명확한 밴드가 보이는 조건 중 가장 엄격한 조건을 사용한다. 예를 들면 포름아미드를 포함하지 않는 하이브리다이즈액인 경우, 하이브리다이즈액의 조성은 염농도를 1 mol/l로 고정하고, 하이브리다이즈 온도를 68℃~42℃로 단계적으로 바꾼 몇 개의 조건하에서 하이브리다이즈를 행하여, 하이브리다이즈와 동일한 온도에서 0.5% SDS를 포함하는 2×SSC로 세척을 행하여 보고 결정한다. 또는 포름아미드를 포함하는 하이브리다이즈액인 경우, 온도(42℃)와 염농도(6×SSC)를 고정하고, 포름아미드 농도를 50~0%로 단계적으로 바꾼 몇 개의 조건하에서 하이브리다이즈를 행하여, 50℃에서 0.5% SDS를 포함하는 6×SSC로 세척을 행하여 보고 결정한다.

(6-2) EST 및 인간 게놈 염기서열을 이용한 인간 B9L 단백질을 코드하는 DNA의 취득

(4)에서 얻어진 마우스 B9L cDNA의 염기서열, 특히 단백질을 코드하고 있는 영역과 높은(구체적으로는 80% 이상의) 상동성을 갖는 인간 DNA의 염기서열을 GenBank 등의 염기서열 데이터베이스로부터 BLAST 등의 상동성 프로그램을 사용하여 검색함으로써, 인간 B9L cDNA 유래로 추정되는 EST 또는 인간 B9L 게놈 유전자의 엑손부분을 포함하는 인간 게놈 DNA의 염기서열을 발견하는 것이 가능하다. 이러한 염기서열로서 GenBank 액세스번호 U46365나 R24762의 인간 EST 또는 GenBank 액세스번호 AP000877, AP002357, AP000909의 인간 게놈 DNA의 워킹 드래프트 시퀀스(working draft sequence)를 들 수 있다.

이러한 인간 게놈 DNA의 서열과 마우스 B9L cDNA 및 인간 EST의 염기서열을 비교함으로써, 인간 B9L 단백질을 코드하는 엑손부분 즉 인간 B9L cDNA의 서열을 얻을 수 있다. 이러한 인간 B9L 게놈 DNA의 엑손의 염기서열로서 서열번호 5~8로 표시되는 염기서열을 들 수 있다. 상기 EST 클론은 예를 들면 Integrated Molecular Analysis of Genome Expression Consortium(I.M.A.G.E.Consortium)의 EST 클론을 ATCC로부터 입수하거나 또는 상동성을 갖는 인간 EST 또는 인간 게놈 DNA의 엑손의 서열을 토대로 한 프라이머를 제작하여, B9L 단백질이 발현하고 있다고 생각되는 인간의 조직 또는 세포로부터 조제한 mRNA를 주형으로 하여 (3)과 동일한 RT-PCR을 행하여 DNA 단편을 증폭함으로써 인간 B9L cDNA를 얻을 수 있다.

(7) B9L 게놈 DNA의 취득

Molecular Cloning 제2판에 기재된 방법에 의하여, 마우스 또는 인간의 세포나 조직으로부터 단리한 염색체 DNA를 사용하여 제작한 게놈 DNA 라이브러리에 대해서, (3) 또는 (6)에서 얻어진 마우스 또는 인간 B9L cDNA를 프로브로 하여, 플라크 하이브리다이제이션 등의 방법으로 스크리닝함으로써, B9L 유전자의 마우스 또는 인간의 게놈 DNA를 얻을 수 있다. B9L의 게놈 DNA의 염기서열과 cDNA의 염기서열을 비교함으로써 B9L 유전자의 엑손/인트론 구조를 명확하게 할 수 있다. 또한, 특히 cDNA의 5'측 부분을 프로브로 함으로써, B9L 유전자의 프로모터 등 전사를 제어하는 영역의 게놈 유전자의 염기서열을 명확하게 할 수 있다. 이 서열은 B9L 유전자의 전사 제어기구를 해석하는 데 도움이 된다. 또한, 상동성 재조합 수법[Kuehn M.R. 등, Nature,326, 295(1987), Thomas K.R. & Capecchi M.R., Cell,51, 503(1987)]에 의하여, 염색체 상의 B9L 유전자를 불활화 또는 임의의 서열과 치환한 클론을 제작할 수 있다.

(8) B9L 올리고뉴클레오티드의 조제

상기 (5)의 DNA 합성기에 의하여, 본 발명의 B9L DNA의 일부 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 이것과 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(이하, B9L 올리고뉴클레오티드로 약기한다)를 조제하는 것이 가능하다.

B9L 올리고뉴클레오티드로서는, 구체적으로는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 연속된 10~60 염기와 동일한 서열을 갖는 DNA 또는 상기 DNA와 상보적인 서열을 갖는 DNA를 들 수 있다. 이들 DNA를 센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머로서 사용하는 경우에는, 융해온도 및 염기수가 극단적으로 변하지 않는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.

더욱이, 이들 올리고뉴클레오티드의 유도체(이하, 올리고뉴클레오티드 유도체라고 한다)도 본 발명의 올리고뉴클레오티드로서 이용할 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드 유도체로서는 올리고뉴클레오티드 중 인산 디에스테르결합이 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate bond)으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중 인산 디에스테르결합이 N3'-P5' 포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중리보스와 인산 디에스테르 결합이 펩티드 핵산결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5 프로피닐우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5 티아졸우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 C-5 프로피닐시토신으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중 시토신이 페녹사진 수식 시토신(phenoxazine-modified cytosine)으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보스가 2'-o-프로필리보스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 또는 올리고뉴클레오티드 중의 리보스가 2'-메톡시에톡시리보스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다[요코야마 가즈나리, 세포공학,16, 1463(1997)].

2) bc19 단백질을 코드하는 DNA 및 상기 DNA의 부분 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 취득

bc19 단백질은 상기 방법으로 얻어지는 마우스 B9L 단백질과 아미노산서열 레벨에서 전체에 걸쳐 약 37%의 상동성을 갖는 단백질이지만, 본 발명에 의하여 β-카테닌과 결합하는 것이 발견된 것으로 보아 β-카테닌 핵 국재화 단백질이라고 생각되는 단백질이다. 인간 bc19 단백질을 코드하는 전장 cDNA의 염기서열 및 상기 cDNA가 코드하는 아미노산서열은 공지이다[Willis T.G. et al., Blood,91, 1871(1998)]. bc19 단백질을 코드하는 DNA나 올리고뉴클레오티드는 인간 cDNA나 게놈 DNA로부터 상기 (5-4), (7), (8)의 방법으로 얻을 수 있다. 또한, 상기 (6)의 방법과 동일하게 하여 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스의 bc19 DNA를 얻을 수있다.

2. β-카테닌 핵 국재화 단백질 또는 상기 단백질의 부분 폴리펩티드의 제조법 및 그 활성의 측정법

본 발명의 β-카테닌 핵 국재화 단백질인 B9L 단백질이나 bc19 단백질 및 상기 단백질의 부분 폴리펩티드는, Molecular Cloning 제2판, D.M.Glover and B.D.Hames; DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press(1995) 등에 기재된 방법을 사용하여, 1.에서 조제한 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA 또는 상기 단백질의 부분 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 숙주세포 속에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 이하에 B9L 단백질을 예로서 기재하지만, bc19 단백질 또는 상기 단백질의 부분 폴리펩티드도 동일하게 하여 제조할 수 있다.

즉, B9L DNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터 하류에 삽입한 재조합체 벡터를 조성하여, 상기 벡터를 숙주세포에 도입함으로써 B9L 단백질을 발현하는 형질전환체를 취득하고, 상기 형질전환체를 배양함으로써 본 발명의 B9L 단백질을 제조할 수 있다.

발현 벡터로서는 숙주세포에 있어서 자율복제 가능 내지는 염색체 속으로의 삽입이 가능하고, 숙주세포 속에서 B9L DNA로부터 mRNA를 전사할 수 있는 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.

숙주세포로서는 원핵생물, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 또한, 동물개체나식물개체를 사용할 수 있다.

세균 등의 원핵생물을 숙주세포로서 사용하는 경우는, 발현 벡터는 숙주 원핵생물 속에서 자율복제 가능하고, 리보솜결합 서열을 갖는 프로모터의 하류에 B9L DNA가 배치된 것을 사용한다. 리보솜결합 서열과 개시코돈과의 사이는 적당한 거리(예를 들면, 대장균 숙주의 벡터인 경우 6~18염기)로 조절되어 있는 것이 바람직하다. 반드시 필요하지는 않지만, B9L DNA의 바로 아래에 전사종결서열을 배치하는 것이 바람직하다. 또한, 형질전환체의 선택을 위하여 약제내성 유전자 등의 마커가 되는 유전자를 발현하는 서열을 포함하도록 한다.

프로모터로서는 숙주세포 속에서 기능하는 것이라면 어떠한 것이어도 된다. 예를 들면 대장균을 숙주로 한 경우는trp프로모터(Ptrp),lac프로모터(Plac), P_L프로모터, T7 프로모터, P_R프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터 등을 들 수 있다. 또한 Ptrp를 2개 직렬시킨 프로모터,tac프로모터, T7lac프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다. 고초균을 숙주로 한 경우는 고초균의 파지인 SP01이나 SP02의 프로모터, PenP 프로모터 등을 들 수 있다.

발현 벡터로서는 예를 들면, pSE280(Invitrogen사제), pGEMEX-1(Promega사제), pQE-8(Quiagen사제), pKYP200[Agric. Biol. Chem.,48, 669(1984)], pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA,82, 4306(1985)], pBluescript II SK(-)(Stratagene사제), pKK223-3(AmershamPharmacia Biotech사제), pGEX-5X-3(Amersham Pharmacia Biotech사제), pET14(Novagen사제) 등을 예시할 수 있다.

숙주세포로서는 Escherichia속, Serratia속, Bacillus속, Brevibacterium속, Corynebacterium속, Microbacterium속, Psedomonas속 등에 속하는 미생물, 예를 들면Escherichia coliXL1-Blue,Escherichia coliXL2-Blue,Escherichia coliDH1,Escherichia coliMC1000,Escherichia coliKY3276,Escherichia coliW1485,Escherichia coliJM109,Escherichia coliHB101,Escherichia coliNo.49,Escherichia coliW3110,Escherichia coliNY49,Serratia ficaria,Serratia fonticola,Serratia liquefaciens,Serratia marcescens,Bacillus subtilis,Bacillus amyloliquefaciens,Brevibacterium ammoniagenes,Brevibacterium immariophilumATCC14068,Brevibacterium saccharolyticumATCC14066,Corynebacterium glutamicumATCC13032,Corynebacterium glutamicumATCC14067,Corynebacterium glutamicumATCC13869,Corynebacterium acetoacidophilumATCC13870,Microbacterium ammoniaphilumATCC15354,Pseudomonassp. D-0110 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로서는 상기 숙주세포로 DNA를 도입하는 방법이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들면 전기천공법(electroporation method)[Dower W.J. 등, Nucleic Acids Res.,16, 6127(1988)], 칼슘이온을 사용하는 방법[Cohen S.N. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69, 2110(1972), Reid J.D. 등, Gene,17, 107(1982)], 프로토플라스트법(protoplast method)[일본국 특개소63-248394, ChanS. & Cohen S.N., Mol. Gen. Genet.,168, 111(1979)] 등을 들 수 있다.

효모를 숙주세포로서 사용하는 경우의 발현 벡터로서는 숙주효모에서 전사를 행하는 프로모터, B9L DNA, 전사의 종지서열 및 효모에서의 형질전환 마커가 되는 유전자, 예를 들면 약제내성 유전자나 TRP1, HIS3, LEU2 등의 아미노산 합성계의 유전자를 발현할 수 있는 서열을 함유하고 있는 것이 사용된다. 또한, 발현 벡터의 제작이나 유지를 용이하게 하기 위해, 대장균내에서도 자율 복제와 유전자도입 마커가 되는 약제내성 유전자를 발현할 수 있는 것이 바람직하다.

프로모터로서는 효모 속에서 기능하는 것이라면 어떠한 것을 사용해도 되고, 예를 들면Saccharomyces cerevisiae의 알코올 데히드로게나아제 유전자 ADH1, 갈락토오스 대사계 유전자 GAL1이나 GAL10 등의 프로모터, 산성 포스파타아제 유전자 PH05 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제 유전자(phosphoglycerate kinase gene) PGK 프로모터, 글리셀알데히드 3 인산 데히드로게나아제 유전자 GAP 프로모터, 히트 쇼크(heat shock) 단백질 유전자 프로모터, α접합인자 유전자 MFα1 프로모터, 구리 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자 CUP1 프로모터,Pichia pastoris의 알코올 옥시다아제 유전자 AOX1의 프로모터 등이 사용된다.

숙주세포로서는 Saccharomyces속, Schizosaccharomyces속, Pichia속 등에 속하는 효모균주를 들 수 있고, 구체적으로는Saccharomyces cerevisiae,Schizosaccharomyces pombe,Pichia pastoris등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로서는 효모에 DNA를 도입하는 방법이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들면 전기천공법[Becker D.M. & Guarente L., Methods.Enzymol.,194, 182(1991)], 스페로플라스트법(spheroplast method)(Shortle D. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81, 4889(1984)], 초산리튬법[Ito H. 등, J. Bacteriol.,153, 163(1983)] 등을 들 수 있다.

동물세포를 숙주로서 사용하는 경우의 발현 벡터로서는 숙주 동물세포에서 전사를 행하는 프로모터, B9L DNA, 전사의 종지와 전사물의 폴리아데닐화의 시그널 서열을 함유하고 있는 것이 사용된다. 또한 벡터의 제작이나 유지를 용이하게 하기 위하여, 대장균 내에서도 자율복제와 유전자도입 마커가 되는 약제내성 유전자를 발현할 수 있는 것이 바람직하다. 프로모터로서는 동물세포 속에서 기능하는 것이라면 모두 사용할 수 있지만, SV40의 초기 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터 및 인핸서, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus), 인간 T세포 백혈병 바이러스 I, 모로니마우스 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus) 등의 레트로바이러스의 LTR 등의 바이러스 유래의 서열, 또는 메탈로티오네인 유전자나 β-액틴 유전자, 신장인자-1(elongation factor-1) 등의 동물세포 유래 유전자의 프로모터 등을 들 수 있다. 또한 SV40의 초기 프로모터와 인간 T세포 백혈병 바이러스 I의 LTR을 조합한 SRα프로모터 등 이들 프로모터를 인위적으로 조합한 프로모터도 사용된다.

숙주염색체 DNA에 B9L DNA가 삽입된 항상적인 B9L 단백질 발현 세포는 G418, 하이그로마이신(hygromycin) 등의 약제에 대한 내성 유전자를 발현할 수 있는 서열을 포함하는 B9L 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여, 약제의 존재하에서 배양함으로써 선택할 수 있다. 또한, 숙주세포 속에서의 B9L 단백질의 생산량을 상승시키기 위해, 디히드로엽산 리덕타아제(dhfr; dihydrofolate reductase) 유전자를 발현할 수 있는 서열을 포함하는 B9L 단백질의 항상적 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여, dhfr 저해제인 메토트렉세이트(methotrexate)의 농도를 단계적으로 올리면서 배양함으로써, dhfr 유전자와 함께 B9L DNA의 복제수를 증폭시키는 것도 가능하다. 이 dhfr 유전자를 사용한 유전자증폭을 행하는 경우의 숙주세포로서는 dhfr 유전자가 기능하고 있지 않은 세포, 예를 들면 CHO/dhfr^-(ATCC: CRL-9096) 등을 들 수 있다.

상기의 B9L 단백질 발현 벡터의 제작에 사용되는 구체적인 벡터로서 예를 들면, pEGFP-C2(Clontech사제), pAGE107[일본국 특개평3-22979, Miyaji H. 등, Cytotechnol.,3, 133, (1990)], pAS3-3(일본국 특개평2-227075), pCDM8[Seed B., Nature,329, 840, (1987)], pcDNA3.1(+)(Invitrogen사제), pREP4(Invitrogen사제), pBK-RSV(Stratagene사제), pSVK3(Amersham Pharmacia Biotech사제), pcDNA1.1/Amp(Invitrogen사제), pAMo[Sasaki K. 등, J. Biol. Chem.,268, 22782(1993)] 등을 들 수 있다.

B9L 단백질의 동물세포 발현 벡터로서는 벡터 pEGFP-C2의EcoRi/SalI 사이트 사이에 마우스 B9L 전장 cDNA를 삽입한 pEGFP-C2B9L을 들 수 있다. pEGFP-C2B9L을 포함하는 형질전환체Escherichia coliMM294/pEGFP-C2B9L은 2000년 9월 6일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6(우편번호 305-8566)(구칭 공업기술원 생명공학 공업기술연구소, 구주소 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 히가시 1-1-3)에 FERM BP-7291로서 기탁되어 있다.

숙주세포로서는 인간세포인 HeLa, 나말와(Namalwa), 293, 아프리카녹색원숭이 신장세포인 COS-1이나 COS-7, 햄스터의 세포인 CHO나 BHK, 마우스 태아세포인 NHI3T3, 마우스 골수종 세포인 SP2/0이나 NSO, 래트 골수종 세포인 YB2/0 등의 세포주를 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로서는 동물세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들면 전기천공법[Miyaji H. 등, Cytotechnol.,3, 133(1990)], 인산칼슘법(일본국 특개평2-227075), 리포펙션법[Felgner P.L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.

곤충세포를 숙주세포로서 사용하는 경우는 바큘로바이러스 발현계[O'Reilly D.R. 등, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York(1992), Luckow V.A. & Summers M.D., Bio/Technology,6, 47(1988)]가 사용된다. 즉, 트랜스퍼 벡터라 불리는 벡터에 B9L DNA를 삽입한 후, 상기 벡터와 바큘로바이러스를 곤충세포에 동시에 도입하여, 강력한 프로모터인 폴리헤드린 유전자 프로모터 아래에 B9L DNA가 삽입된 재조합 바큘로바이러스를 상동 재조합에 의하여 제작한 후, 이 재조합 바큘로바이러스를 재차 곤충세포에 감염시킴으로써, B9L 단백질을 발현할 수 있다.

바큘로바이러스로서는Autographa californica핵 다각체병 바이러스(nucleus polyhedrosis virus), 누에 핵 다각체병 바이러스 등이 사용된다. 곤충세포로서는Spodoptera frugiperda의 세포인 Sf9 및 Sf21[O'Reilly D.R. 등, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992)],Trichoplusia ni의 세포인 High5(Invitrogen사제) 등을 사용할 수 있다. 또한, 누에 유충체를 그대로 사용하는 것도 가능하다. 트랜스퍼 벡터에는 폴리헤드린 프로모터 및 상동 재조합을 일으키기 위한 바큘로바이러스 유래의 서열, 벡터의 유지 증식이나 외래유전자의 삽입 등의 유전자조작을 대장균 내에서 행하기 위한 서열(대장균에서의 자율복제 가능한 서열 및 약제내성 유전자)이 포함되어 있고, 구체적으로는 pVL1392, pVL1393, pBluebac4(모두 Invitrogen사제) 등을 들 수 있다.

동물개체를 사용하여 B9L 단백질을 생산하는 것도 가능하다. 예를 들면, 공지의 방법[Colman A., Am. J. Clin. Nutr.,63, 639S(1996), Rosen J.M. 등, Am. J. Clin. Nutr.,63, 627S(1996), Wright G. 등, Bio/Technology,9, 830(1991)]에 준하여, B9L DNA를 도입한 동물 중에 B9L 단백질을 생산하는 것이 가능하다.

프로모터로서는 동물에서 기능하는 것이라면 모두 사용할 수 있지만, 예를 들면 유선세포 특이적인 프로모터인 α카세인 프로모터, β카세인 프로모터, β락토글로블린 프로모터, 훼이 산성(whey acidic) 단백질 프로모터 등이 적합하게 사용된다.

식물세포 또는 식물개체를 숙주로서 사용하는 경우에는 공지의 방법[이자와 쯔요시, 조직배양,20, 6(1994), 하시모토 다카시, 조직배양,21, 14(1995), Miele L., Trends Biotechnol.,15, 45(1997)]에 준하여 B9L 단백질을 생산할 수 있다.

B9L DNA의 발현에 사용하는 프로모터로서는 식물세포 속에서 기능하는 것이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들면 칼리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus)의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 프로모터와 발현시키는 B9L DNA와의 사이에 옥수수의 알코올 탈수소효소 유전자인 인트론 1 등을 삽입함으로써 B9L DNA의 발현효율을 올리는 것도 가능하다.

숙주세포로서는 감자, 담배, 옥수수, 벼, 유채, 콩, 토마토, 밀, 보리, 호밀, 자주개자리(alfalfa), 아마(flax) 등의 식물세포 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로서는 식물세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들면 아그로박테리움(Agrobacterium), 전기천공법[Miyaji H. 등, Cytotechnol.,3, 133(1990)], 입자 총(particle gun)을 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

B9L DNA를 도입한 식물의 세포나 기관은 자 퍼멘터(Jar Fermenter)를 사용하여 대량 배양할 수 있다. 또한, 유전자도입한 식물세포를 재분화시킴으로써 B9L DNA가 도입된 식물개체(트랜스제닉 식물)를 조성하는 것도 가능하다.

본 발명의 B9L DNA를 삽입한 재조합체 벡터를 보유하는 미생물, 동물세포 또는 식물세포 유래의 형질전환체를, 보통의 배양방법에 따라서 배양하고, B9L 단백질을 생성 축적시켜, 상기 배양물로부터 B9L 단백질을 채취함으로써 B9L 단백질을 제조하는 것이 가능하다.

동물세포를 숙주로 한 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지[J. Am. Med. Assoc.,199, 519(1967)], Eagle의 MEM배지[Eagle H., Science,122, 501(1952)], Dalbecco 개변 Eagle 배지[Dalbecco R. & Freeman G., Virology,8, 396(1959)], 199 배지[Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,73, 1(1950)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라서 페니실린이나 스트렙토마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다. 배양은 보통 pH 6~8, 30~40℃, 5% CO₂존재하 등의 조건하에서 1~7일간 행한다.

곤충세포를 숙주세포로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지[파민젠(Pharmingen)사제], Sf-900 II SFM 배지(Life-Technologies사제), ExCell400, ExCell405[모두 JRH 바이오사이언시즈(JRH Biosciences)사제], Grace's Insect Medium[Grace T.D.C, Nature,195, 788(1962)] 등을 사용할 수 있다. 배양조건은 pH 6~7, 배양온도 25~30℃가 좋고, 배양시간은 보통 1~5일간이다. 또한, 배양중 필요에 따라서 겐타마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

형질전환체가 동물개체 또는 식물개체인 경우는, 보통 방법에 따라서 사육 또는 재배하고, B9L 단백질을 생성 축적시켜, 상기 동물개체 또는 식물개체로부터 B9L 단백질을 채취함으로써 B9L 단백질을 제조할 수 있다.

즉, 동물개체인 경우, 예를 들면 B9L DNA를 보유하는 비인간 트랜스제닉 동물을 사육하여 상기 재조합 DNA가 코드하는 B9L 단백질을 상기 동물 중에 생성 축적시켜, 상기 동물 중으로부터 B9L 단백질을 채취함으로써 B9L 단백질을 제조할 수있다. 상기 동물 중의 생성 축적장소로서는 예를 들면 상기 동물의 밀크, 알 등을 들 수 있다.

식물개체인 경우, 예를 들면 B9L DNA를 보유하는 트랜스제닉 식물을 재배하고 B9L 단백질을 상기 식물 중에 생성 축적시켜, 상기 식물 중으로부터 B9L 단백질을 채취함으로써, B9L 단백질을 제조할 수 있다.

대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 상기 생물이 동화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고 형질전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지라면 천연배지, 합성배지 중 어느 것을 사용해도 된다.

탄소원으로서는 상기 생물이 동화할 수 있는 것이면 되고, 포도당, 과당, 자당, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 초산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등을 사용할 수 있다.

질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 밖의 질소 함유 화합물 및 펩톤, 고기 추출액, 효모 추출액, 콘 스팁 리쿼(corn steep liquor), 카세인 가수분해물, 대두박(soybean cake) 및 대두박 가수분해물, 각종 발효균체 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.

무기염으로서는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.

배양은 보통 진탕배양 또는 심부 통기 교반배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양온도는 15~40℃가 좋고, 배양기간은 보통 16~96시간이다. 배양중 pH는 3.0~9.0으로 유지한다. pH의 조정은 무기 또는 유기의 산, 알칼리용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 행한다. 필요에 따라서 배양기간 중에 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라서 인듀서(inducer)를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들면,lac프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 IPTG 등을trp프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.

상기 형질전환체의 배양물 중에 축적된 B9L 단백질을 단리 정제하기 위해서는 아래와 같은 보통의 단백질의 단리 정제법을 사용하면 된다.

B9L 단백질이 세포밖으로 분비되는 경우에는 배지 중에 B9L 단백질이 축적된다. 따라서 배양종료 후, 원심분리 등의 수법에 의하여 세포를 포함하지 않은 배지 만 회수한다. 상기 배지로부터 보통 단백질의 단리 정제법, 즉 용매추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, DEAE 세파로오스, DIAION HPA-75(Mitsubishi Chemical사제), Mono-Q(Amersham Pharmacia Biotech사제) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, SP 세파로오스(Amersham Pharmacia Biotech사제) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸 세파로오스, 페닐 세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자 체(molecular sieve)를 사용한 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토 포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합하여 사용하여 정제 샘플을 얻을 수 있다.

B9L 단백질이 형질전환체의 세포내에 축적되는 경우에는, 배양종료 후의 배양물로부터 형질전환체 세포를 원심분리 등의 수법에 의하여 회수하여, 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스(French press) 등에 의하여 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다.

B9L 단백질이 세포내에서 용해상태로 존재하는 경우에는 상기 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어진 상청으로부터, 상기 배지로부터의 정제 단리와 동일하게 하여 정제 샘플을 얻을 수 있다. 또한, B9L 단백질이 세포내에 불용체를 형성하여 존재하는 경우는 상기 무세포 추출액을 원심분리한 후, 침전획분으로서 B9L 단백질의 불용체를 회수한다. 이 B9L 단백질의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한 후, 상기 가용화액을 단백질 변성제를 포함하지 않거나 또는 단백질 변성제의 농도가 단백질이 변성되지 않을 정도로 희박한 용액으로 희석 또는 투석하여, B9L 단백질을 정상 입체구조로 복원시킨 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의하여 정제 샘플을 얻을 수 있다.

또한, 공지의 방법[Kigawa T. 등, J. Biomol. NMR,6, 129(1998), Spirin A.S. 등, Science,242, 1162(1988), Kigawa T. & Yokoyama S., J. Biochem.,110, 166(1991)]에 준하여,in vitro전사 번역계를 사용하여 B9L 단백질을 생산할 수 있다. 즉, B9L DNA를 SP6, T7, T3 등의 프로모터의 하류에 연결시켜 각각의 프로모터 특이적인 RNA 폴리머라아제를 반응시킴으로써 대량의 B9L RNA를 인비트로에서합성한 후, 무세포계의 번역계 예를 들면 토끼 망상 적혈구 라이세이트(rabbit reticulocyte lysate)나 밀 배아 추출액을 사용한 번역계를 이용하여 B9L 단백질을 생산할 수 있다.

정제한 B9L 단백질의 구조해석은 단백질 화학에서 보통 사용되는 방법, 예를 들면 「유전자 클로닝을 위한 단백질 구조해석」(히라노 히사시 저, 도쿄화학동인 발행, 1993년)에 기재된 방법에 의하여 실시 가능하다.

B9L 단백질 또는 bc19 단백질 및 이들 단백질의 아미노산서열 중 아미노산의 치환, 결실 또는 부가된 유도체나 부분단편, 또는 이들 단백질과 아미노산서열에서 상동성을 갖는 단백질(이하 이들을 「B9L/bc19 유사체」라 총칭한다)이 β-카테닌과 결합하는지의 여부는 1.에 나타낸 효모 투하이브리드법에 있어서, 전사활성화 도메인과 이들 단백질을 코드하는 DNA의 융합단백질 발현 벡터와 β-카테닌의 베이트 플라스미드를 사용하여, 리포터 유전자의 전사가 검출되는지의 여부로 조사된다.

또한, 인비트로에서 직접 B9L/bc19 유사체와 β-카테닌을 혼합하여 결합반응을 시킨 후 또는 세포내에서 B9L/bc19 유사체를 발현시킴으로써 세포내에서 결합시킨 후, 반응액 또는 세포추출액에 대해서 β-카테닌에 대한 항체를 사용하여 면역침강을 행하고, 침강물 중에 상기 B9L/bc19 유사체가 존재하는지의 여부를 웨스턴블롯 등에 의하여 검출함으로써 조사된다. 또한 항체를 사용하지 않고, B9L/bc19 유사체를 GST 등의 정제가 용이한 단백질 또는 펩티드와의 융합단백질을 제작한 후³⁵S 등으로 표지한 β-카테닌과 결합반응을 행하여, B9L/bc19 유사체의 융합단백질을 정제한 후, 정제물 중에 표지된 β-카테닌이 존재하는지의 여부를 오토라디오그래프(autoradiography) 등에 의하여 검출함으로써도 조사할 수 있다.

또한, B9L/bc19 유사체가 β-카테닌을 핵으로 국재시키는 작용을 갖는지의 여부는 β-카테닌 및 B9L/bc19 유사체 양자를 강제 발현시킨 세포와 β-카테닌만을 강제 발현시킨 세포에서, 세포를 고정화하여 각각 항β-카테닌 항체를 사용한 면역 염색에 의하여 β-카테닌을 검출함으로써 조사할 수 있다. 이 경우, 보통의 β-카테닌으로는 세포내에서 GSK-3β에 의한 분해제어를 받기 때문에, 분해를 받지 않고 축적되는 인산화 부위의 변이체 예를 들면, 33번 위치의 세린을 티로신으로 치환한 β-카테닌 변이체를 사용함으로써, 세포내에 존재하는 β-카테닌의 양이 많아져 세포내에서의 β-카테닌 검출이 용이해진다. β-카테닌에는 세포내 국재성은 없어, β-카테닌만을 강제 발현시킨 세포에서는 세포 전체에 고르게 분포하지만, B9L/bc19 유사체에 β-카테닌을 핵으로 국재시키는 작용이 있는 경우는 세포질에 비하여 핵에 보다 많은 β-카테닌이 검출된다. 이러한 β-카테닌을 핵에 국재화시키는 활성을 갖는 B9L/bc19 유사체로서 B9L 단백질, 본 발명에서 투하이브리드법에 의하여 얻어진 cDNA 클론이 코드하는 B9L 단백질 부분단편(마우스 B9L 단백질의 아미노산서열의 245~564번째의 부분에 상당한다. 서열번호 4에 아미노산서열을 나타냈다.) 을 들 수 있다.

B9L 단백질 또는 bc19 단백질은 핵내로 이행하는 β-카테닌을 증가시키기 때문에, β-카테닌/TCF에 의한 전사활성화를 촉진한다고 생각된다.

B9L 단백질 및 bc19 단백질 자체도 포함하여 B9L/bc19 유사체가, Wnt의 시그널 전달결과 일어나는 β-카테닌/TCF에 의한 전사활성화에 어떠한 영향을 미치는 지는 TCF와 결합하는 서열을 가지고 β-카테닌/TCF에 속하는 단백질과의 복합체에 의하여 전사의 활성화를 받는 프로모터의 하류에 루시페라아제나 클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제, β-갈락토시다아제 등의 리포터 유전자를 접속시킨 플라스미드 예를 들면 pTOPFLASH, pTOPCAT[둘다 Korinek V. 등, Science,275, 1784(1997)]를 이용하여 조사할 수 있다. 상기의 리포터 유전자 발현 플라스미드와 항상적으로 TCF/Lef 패밀리에 속하는 단백질과 결합하여 전사활성화를 행할 수 있는 변이형 β-카테닌, 예를 들면 33번째의 세린 잔기를 티로신으로 치환한 β-카테닌의 발현 플라스미드를 동물세포에 도입하고, 거기에 B9L/bc19 유사체의 발현 플라스미드를 추가로 도입한 경우와 도입하지 않은 경우에서, 리포터 유전자의 발현량을 측정하여 비교함으로써, 상기 B9L/bc19 유사체가 β-카테닌/TCF에 의한 전사활성화를 더욱 촉진할 수 있는지의 여부를 조사할 수 있다.

3. β-카테닌 핵 국재화 단백질을 인식하는 항체의 조제

(1) 다중클론항체의 조제

상기 2.에 기재된 방법에 의하여 취득한 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 전장 또는 부분단편 단백질, 또는 펩티드 합성기에 의한 화학합성법 등에 의하여 제조한 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 부분 펩티드를 항원으로서 사용하여, 동물에 투여함으로써 다중클론항체를 제작할 수 있다.

투여하는 동물로서 토끼, 염소, 래트, 마우스, 햄스터 등을 사용할 수 있다. 상기 항원의 투여량은 동물 1마리 당 50~100 ㎍이 바람직하다.

부분 펩티드를 항원으로서 사용하는 경우는 상기 부분 펩티드를 KLH나 소 티오글로블린 등의 캐리어 단백에 공유결합시킨 것을 항원으로 하는 것이 바람직하다.

상기 항원의 투여는 1회째의 투여 후 1~2주 간격으로 3~10회 행한다. 각 투여 후, 3~7일 째에 안저 정맥총(venous plexus of eyeground)으로부터 채혈하여, 상기 혈청이 면역에 사용한 항원과 반응하는 것을 효소 면역측정법[이사카와 에이지, 효소 면역측정법 의학서원(1978), Harlow E. & Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등으로 확인한다.

면역에 사용한 항원에 대해서 상기 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 비인간 포유동물로부터 혈청을 취득하여, 상기 혈청을 분리, 정제함으로써 다중클론항체를 취득할 수 있다.

분리, 정제하는 방법으로서는 원심분리, 40~50% 포화 황산암모늄에 의한 염석, 카프릴산 침전[Harlow E. & Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 또는 DEAE-세파로오스 컬럼, 음이온 교환 컬럼, 프로틴 A 또는 G-컬럼 또는 겔 여과 컬럼 등을 사용하는 크로마토그래피 등을 단독 또는 조합하여 처리하는 방법을 들 수 있다.

(2) 단일클론항체의 조제

(2-1) 항체 생산세포의 조제

상기 (1)에 있어서, 면역에 사용한 항원에 대해서 그 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 래트를 항체 생산세포의 공급원으로서 제공한다.

상기 항체가를 나타낸 래트에 항원물질을 최종 투여한 후 3~7일째에 비장을 적출한다.

상기 비장을 MEM 중에서 작게 자르고, 핀셋으로 분산시켜 1200 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상청을 버린다.

얻어진 침전획분의 비장세포를 Tris-염화암모늄 완충액(pH 7.65)으로 1~2분간 처리하여 적혈구를 제거한 후, MEM 배지로 3회 세척하여 얻어진 비장세포를 항체 생산세포로서 사용한다.

(2-2) 골수종 세포의 조제

골수종 세포로서는 마우스 또는 래트로부터 취득한 세포주를 사용한다.

예를 들면, 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Yelton D.E. 등, Curr. Topics Microbiol. Immunol.,81, 1(1978), Kohler G. & Milstein C., Eur. J. Immunol.,6, 511(1976)], SP2/0-Ag14(SP-2)[Shulman M. 등, Nature,276, 269(1978)], P3-X63-8653(653)[Seeger R.C. 등, J. Immunol.,123, 1548(1979)], P3-X63-Ag(X63)[Kohler G. & Milstein C., Nature,256, 495(1975)] 등을 사용할 수 있다. 이들 세포주는 8-아자구아닌 배지[RPMI1640 배지에 1.5 mmol/l 글루타민, 5×10^-5mmol/l 2-메르캅토에탄올, 10 ㎍/ml 겐타마이신 및 10% 소 태아 혈청(CSL사제)을 가한 배지(이하, 정상배지라고한다)에 추가로 15 ㎍/ml 8-아자구아닌을 가한 배지]로 계대하지만, 세포융합의 3~4일 전에 정상배지에서 배양하여 융합에는 상기 세포를 2×10⁷개 이상 사용한다.

(2-3) 하이브리도마의 제작

(2-1)에서 취득한 항체생산 세포와 (2-2)에서 취득한 골수종 세포를 MEM 배지 또는 PBS(인산이나트륨 1.83 g, 인산일칼륨 0.21 g, 염화나트륨 7.65 g, 증류수 1리터, pH 7.2)로 잘 세척하고, 세포수가 항체생산 세포:골수종 세포=5~10:1이 되도록 혼합하여 1200 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상청을 버린다.

얻어진 침전획분의 세포군을 잘 분산시켜 상기 세포군에 교반하면서, 37℃에서 10⁸항체생산 세포당 PEG-1000 2 g, MEM 2 ml 및 DMSO 0.7 ml를 혼합한 용액을 0.2~1 ml 첨가하고 추가로 1~2분 마다 MEM 1~2 ml를 수회 첨가한다.

첨가 후, MEM을 가하여 전체량이 50 ml가 되도록 조제한다.

상기 조제액을 900 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상청을 버린다.

얻어진 침전획분의 세포를 부드럽게 푼 후, 메스피펫(measuring pipette)으로 빨아들이고 내뿜어 부드럽게 HAT 배지[정상 배지에 10^-4mmol/l 히포크산틴, 1.5×10^-5mmol/l 티미딘 및 4×10^-7mmol/l 아미노프테린을 가한 배지] 100 ml 중에 현탁한다.

상기 현탁액을 96웰 배양용 플레이트에 100 ㎕/웰씩 분주하여, 5% CO₂인큐베이터 속에서 37℃로 7~14일 동안 배양한다.

배양 후, 배양상청의 일부를 취하여 Harlow E. & Lane D., Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988) Chapter 14 등에 언급되어 있는 효소 면역측정법에 의하여, 상기 항체생산 세포를 취득하기 위해 면역에 사용한 항원에 특이적으로 반응하는 하이브리도마를 선택한다.

효소 면역측정법의 구체적인 예로서 아래의 방법을 들 수 있다.

면역시, 항원에 사용한 본 발명 단백질의 전장 또는 부분단편 정제 샘플을 적당한 플레이트에 코팅하여, 하이브리도마 배양상청 또는 후술하는 (2-4)에서 얻어지는 정제 항체를 제1항체로서 반응시키고, 더욱이 제2항체로서 비오틴, 효소, 화학 발광물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 항래트 이뮤노글로블린 항체를 반응시킨 후에 표지물질에 따른 반응을 행하여, 본 발명의 단백질에 특이적으로 반응하는 것을 본 발명의 단백질에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마로서 선택한다.

상기 하이브리도마를 사용하여 한계희석법에 의하여 클로닝을 2회 반복하여[1회째는 HT 배지(HAT 배지로부터 아미노프테린을 제거한 배지), 2회째는 정상배지를 사용한다], 안정되고 강한 항체가가 인정된 것을 본 발명의 단백질에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마주로서 선택한다.

(2-4) 단일클론항체의 조제

프리스탄(Pristane; 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸) 0.5 ml를 복강내 투여하고, 2주간 사육한 8~10주령의 마우스 또는 누드 마우스에 (2-3)에서 취득한 본 발명의 단백질에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포 5~20×10⁶세포/마리를 복강내에 주사한다. 10~21일 동안 하이브리도마는 복수암화된다.

상기 복수암화된 마우스로부터 복수를 채취하여 3000 rpm으로 5분간 원심분리하여 고형분을 제거한다.

얻어진 상청으로부터 다중클론항체에서 사용한 방법과 동일한 방법으로 단일클론항체를 정제, 취득할 수 있다.

항체의 서브클래스 결정은 마우스 단일클론항체 타이핑 키트(typing kit) 또는 래트 단일클론항체 타이핑 키트를 사용하여 행한다. 단백질량은 로리법(Lowry method) 또는 280 nm에서의 흡광도로부터 산출한다.

4. β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 mRNA의 검출 정량법 및 상기 단백질의 발현량이 mRNA 레벨에서 변동하고 있는 질환의 진단방법

β-카테닌 핵 국재화 단백질의 DNA, 예를 들면 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 B9L DNA나 bc19 DNA, 상기 DNA의 부분단편, 예를 들면 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 연속되는 200 bp 이상의 연속된 염기서열을 갖는 단편이나 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 올리고뉴클레오티드를 사용하여, β-카테닌 핵 국재화 단백질의 mRNA를 검출할 수 있다.

β-카테닌 핵 국재화 단백질의 mRNA를 검출하는 방법으로서는 예를 들면 노던 블롯법,in situ하이브리다이제이션법, 정량적 PCR법, 디퍼렌셜 하이브리다이제이션법(differential hybridization), DNA칩법, RNase 보호 어세이법 등의 방법등을 들 수 있다. 이들 방법에 의하여 조직이나 세포에 있어서의 B9L 단백질의 mRNA 레벨에서의 발현량을 조사할 수 있다.

이들 방법에 의하여 β-카테닌 핵 국재화 단백질이 어떠한 조직이나 세포에서 발현하고 있는가 하는 정보나, 세포가 어떠한 자극을 받았을 때에 그 발현량이 변화되는가 하는 정보를 얻을 수 있다.

이들 방법에 사용하는 시료로서는 인간이나 동물로부터 채취한 장기나 생체조직, 혈액 등의 생체시료 또는 이들의 생체시료로부터 수립한 초대배양세포, 세포주가 사용된다.

노던 블롯법은 시료로부터 추출한 전체 RNA 또는 mRNA(이하 「시료 유래 RNA」라고 한다)를 겔 전기영동으로 분리한 후, 나일론필터 등의 막에 전사하여 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA 또는 그 부분서열을 갖는 DNA, β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA의 부분서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 방사성 동위체나 디곡시게닌, 비오틴 등으로 표지하여 조제한 프로브를 사용하여, 하이브리다이제이션 및 세척을 행하여, β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 mRNA를 표지 프로브가 특이적으로 결합한 밴드로서 검출하는 방법으로, Molecular Cloning 제2판에 기재된 방법 및 조건을 토대로 행할 수 있다. 밴드의 강도, 즉 결합한 표지 프로브의 양은 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 mRNA 양을 반영하고 있기 때문에, 조직이나 병태에 따라 발현량이 거의 변화되지 않아, 항상 구성적으로 발현하고 있는 액틴이나 G3PDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 등의 mRNA의 밴드를 동일 필터상에서 검출하여, 그 강도에 따라 표준화를 행함으로써 β-카테닌 핵국재화 단백질을, mRNA 레벨에서의 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 시료 유래 RNA를 전기영동할 때에 표지한 RNA 분자량 마커를 동시에 전기영동하여, 밴드의 영동위치를 분자량 마커의 위치와 비교함으로써, β-카테닌 핵 국재화 단백질의 mRNA의 길이를 측정할 수 있다.

in situ하이브리다이제이션법은 시료인 장기나 생체조직으로부터 파라핀 포매 절편(paraffin embedded slice) 또는 크라이오스태트(cryostat) 절편을 제작하여, 상기 절편에 대해서 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA, 상기 DNA의 부분서열을 갖는 DNA 또는 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA의 부분 염기서열로 된 올리고뉴클레오티드로부터 조제한 표지 프로브와 하이브리다이제이션 및 세척의 공정을 행하여, 조직내의 β-카테닌 핵 국재화 단백질 발현 세포나 발현 부위를 상세하게 검출하는 방법으로, Current Protocols in Molecular Biology에 기재된 방법 및 조건에 따라 행할 수 있다.

정량적 PCR법[Delidow B.C. 등, Gene Anal. Tech.,6, 120(1989]은 시료 유래 RNA로부터 올리고 dT 프라이머와 역전사효소를 사용하여 합성한 cDNA(이하 「시료 유래 cDNA」라고 한다)를 주형으로 하여 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 cDNA의 염기서열을 토대로 설계한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR을 행하여, β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 mRNA 유래의 DNA 단편을 특이적으로 증폭하는 방법이다. 상기 증폭 DNA 단편의 양은 시료 중의 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 mRNA의 양을 반영하기 때문에, 조직이나 병태에서 발현량이 변화되지 않는 액틴이나 G3PDH 등의 cDNA에 대한 PCR을 대조군으로 함으로써β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 mRNA를 정량하는 것이 가능하다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프라이머 사이 또는 프라이머 내에서의 하이브리다이제이션을 일으키지 않는 어닐링 온도에서 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 cDNA와 특이적으로 결합하여, 변성온도에서 벗어나도록 설계한다. 상기 증폭 DNA 단편의 정량은 증폭산물이 지수함수적으로 증가하고 있는 PCR 횟수내로 행하는 것이 필요하다. 이러한 PCR 횟수는 한 시료에 관하여 증폭횟수를 바꾸어 PCR을 행하여, 각 횟수 마다 증가하는 상기 증폭 DNA 단편의 양을 겔 전기영동으로 분석함으로써 알 수 있다.

디퍼렌셜 하이브리다이제이션법[Lennon G.G. & Lehrach H., Trends Genet.,7, 314(1991)]이나 DNA칩법[Shalon D. 등, Genome Res.,6, 639(1996)]은 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA, 상기 DNA의 부분 염기서열을 갖는 DNA 또는 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA의 부분 염기서열로 된 올리고뉴클레오티드를 고정화시킨 필터 또는 슬라이드글라스나 실리콘 등의 기반에 대해서, 시료 유래 RNA로부터 올리고 dT 프라이머와 표지 dNTP 및 역전사 효소를 사용하여 합성한 표지 cDNA를 프로브로 하여 하이브리다이제이션 및 세척을 행함으로써, 측정의 대조가 되는 검체의 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 mRNA 레벨에서의 발현량의 변동을 검출하는 방법이다. 어떠한 방법도 필터 또는 기반상에 액틴이나 G3PDH의 DNA를 고정화하여 내부 대조군으로 함으로써, 측정검체와 대조검체 사이에서의 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 mRNA 레벨에서의 발현 차를 검출할 수 있다. 또한 측정검체와 대조검체로부터 표지 cDNA 프로브를 제작할 때, 양자에서 다른 표지 dNTP를 사용하여 제작하여, 한 장의 필터 또는 한 장의 기반에 두 개의 표지 cDNA 프로브를 동시에 하이브리다이즈시킴으로써 정확한 정량을 행할 수 있다.

리보뉴클레아제 보호 어세이[Pape M.E. 등, Genet. Anal. Tech. Appl.,8, 206(1991)]에서는, 먼저 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA의 3'말단에 T7 프로모터, SP6 프로모터 등의 프로모터 서열을 결합하여, 표지 NTP 및 프로모터 특이적인 RNA 폴리머라아제를 사용한 인비트로의 전사계에 의하여 표지한 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 안티센스 RNA를 합성한다. 상기 표지 안티센스 RNA를 검체로부터 조제한 전체 RNA 또는 mRNA와 하이브리다이제이션시켜, 검체 중의 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 mRNA와 RNA-RNA 하이브리드를 형성시킨 후, 리보뉴클레아제로 소화하여 하이브리드 형성에 의하여 리보뉴클레아제에 의한 소화로부터 보호된 밴드를 겔 전기영동으로 검출한다. 보호된 밴드를 정량함으로써 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 mRNA 레벨에서의 발현을 정량할 수 있다.

이상과 같은 방법에 의하여, 피검자 및 대조군이 되는 신체가 건강한 정상인으로부터 생체검사법 등에 의하여 채취한 장기나 생체조직, 혈액 등의 생체시료, 또는 이것으로부터 배양한 초대배양세포를 검체로서 사용하여, 양자의 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 mRNA 레벨에서의 발현 정량을 행하고 비교함으로써, β-카테닌 핵 국재화 단백질의 mRNA 레벨에서의 발현량이 신체가 건강한 정상인과 비교하여 증가 또는 감소하고 있는 질환을 진단할 수 있다.

상기 질환으로서는 예를 들면 대장암 등의 암을 들 수 있다. 대장암 등의 암에서는 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 발현량이 증가하고, β-카테닌의 핵내로의이행 및 β-카테닌/TCF에 의한 전사활성화가 촉진되는 것이, 세포의 암화 원인 중 하나가 될 수 있다. 따라서 대장암 등의 암세포 중에는, 보통의 세포에 비하여 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 발현량이 증가하고 있는 것이 있다고 생각되어, 상기 방법에 의하여 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 발현량이 증가하고 있다고 진단된 경우, 암에 걸려 있을 가능성을 생각할 수 있다.

5. β-카테닌 핵 국재화 단백질의 유전자의 변이검출법 및 상기 유전자에 변이를 갖는 질환의 진단방법

β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA, 상기 DNA의 부분 염기서열을 갖는 DNA 또는 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA의 부분 염기서열로 된 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 10~100명으로 된 대장암 등의 질환을 갖는 환자집단과 신체가 건강한 정상인 등의 대조집단에 있어서의 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 게놈 DNA의 염기서열을 비교하여, 상기 질환과 β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자 등의 변이의 유무관계를 평가할 수 있다.

검체로서는 인간으로부터 채취한 장기나 생체조직, 혈액 등의 생체시료 또는 이들로부터 수립한 초대 배양세포로부터 추출한 게놈 DNA 또는 이들로부터 추출한 전체 RNA 또는 mRNA로부터 조제한 cDNA를 사용할 수 있다(이하 이들을 「검체 DNA」라 칭한다).

또한, 검체 DNA를 주형으로 B9L DNA의 염기서열을 토대로 설계한 프라이머로 증폭한 DNA 단편의 염기서열을 결정하여, 신체가 건강한 정상인 B9L DNA의 염기서열과 비교함으로써 변이의 유무를 발견하는 것도 가능하다.

B9L 유전자의 DNA에 질환과 관련되는 변이가 있는지의 여부를 선별하는 방법으로서, 단일가닥 컨포메이션 다형(single strand conformation polymorphism; SSCP) 해석[Sheffield V.C. 등, Genomics,16, 325(1993)], 미스매치 절단, 변성 겔 전기영동 등의 방법을 들 수 있다.

SSCP 해석은 B9L DNA의 200 bp 보다도 작은 단편을 증폭할 수 있는 프라이머를 B9L 단백질을 코드하는 DNA의 염기서열을 토대로 설계하고, 상기 프라이머를 사용하여 검체 유래 DNA를 주형으로 PCR을 행하여, 증폭한 DNA 단편을 변성 후, 미변성의 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전기영동을 행하는 방법이다. PCR을 행할 때에 프라이머를 방사성 동위체나 형광색소로 표지하거나 또는 증폭한 DNA 단편을 은염색함으로써, 증폭한 DNA 단편을 밴드로서 검출할 수 있다. 미변성 겔 중에서는 염기서열의 차이에 의하여 이동도가 변화되기 때문에, 정상 염기서열을 갖는 B9L DNA 단편과의 이동도를 비교함으로써 변이를 검출할 수 있다.

미스매치 절단법은 검체 DNA를 주형으로 B9L DNA의 염기서열을 토대로 설계한 프라이머로 PCR을 행하고, 증폭한 DNA 단편을 방사성 동위체나 형광색소로 표지한 정상 염기서열을 갖는 B9L DNA와 하이브리다이즈시켜, 사산화 오스뮴 또는 T4 파지 엔도뉴클레아제 Ⅶ[Dean M., Nat. Genet.,9, 103(1995)]로 처리함으로써, 미스매치 부위에서 DNA를 절단하는 방법이다. 가장 감도가 높은 검출법의 하나로 킬로베이스(kilobase) 길이의 검체에도 적용할 수 있다.

변성 겔 전기영동(denaturing gradient gel electrophoresis: DGGE)법[Fischer S.G. & Lerman L.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,80,1579(1983), Cariello N.F. & Skopek T.R., Mutat. Res.,288, 103(1993)]은 검체 DNA를 주형으로, B9L DNA의 염기서열을 토대로 설계한 프라이머로 증폭한 DNA 단편을 화학적 변성제의 농도구배나 온도구배를 갖는 겔을 사용하여 전기영동하는 방법이다. 염기서열의 변이에 따라 DNA 단편의 변성이 일어나는 온도 또는 변성제 농도가 변화되어 이동도가 변화되기 때문에, 변이의 존재를 검출할 수 있다. 프라이머에 폴리(G:C) 단말을 부착함으로써 검출감도를 올릴 수 있다[Sheffield V.C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86, 232(1989)].

이상과 같은 방법으로 발견된 돌연변이는 Handbook of Human Genetics Linkage, The John Hopkins University Press(1994)에 기재된 방법에 따라 통계처리를 행함으로써, 질환과의 연쇄가 있는 1염기 다형(single nucleotide polymorphisms; SNPs)으로서 동정할 수 있다.

암 등의 질환과 연쇄가 있는 돌연변이가 발견된 경우는, 이 변이부위와 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드 프로브에 의하여 염색체 DNA를 서던 하이브리다이제이션 해석하는 것이나, 3'말단이 일치하지 않으면 PCR에 의한 증폭이 일어나지 않는 것을 이용한, 질환에서는 변이가 일어나고 있는 부위에 대응하는 정상서열을 3'말단에 갖는 B9L 단백질의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의한 PCR, B9L의 올리고뉴클레오티드 시퀀스 프라이머에 의한 변이부위의 염기서열 해석 등에 의하여 질환의 진단을 행할 수 있다.

또한, B9L 단백질을 코드하는 DNA 또는 상기 DNA의 부분 염기서열을 갖는 DNA를 프로브로 하여, 적당한 제한효소로 절단한 염색체 DNA에 대해서 서던 하이브리다이제이션함으로써, B9L 유전자의 결실, 복제수의 변화, 염색체 전좌 등의 이상을 검출할 수 있다.

DNA에 변이가 있는지의 여부를 선별하는 다른 방법으로서, 단백질 단축시험(protein truncation test: PTT)법[van der Luijt R. 등, Genomics,20, 1(1994)]이 있다. 이 방법은 변이의 결과, 번역 프레임의 도중에서 종지코돈이 생겨 단백질의 결실을 낳는 프레임 시프트 돌연변이, 스플라이스 부위 돌연변이, 넌센스 돌연변이 등을 특이적으로 검출할 수 있는 방법이다. PTT법에서는 B9L 단백질을 코드하는 DNA 염기서열의 5'말단에 T7 프로모터서열과 진핵생물 번역개시서열을 연결한 특수한 프라이머를 설계하고, 상기 프라이머를 사용하여 검체 유래 RNA로부터 RT-PCR에 의하여 cDNA 단편을 증폭시킨다. 상기 cDNA에 대해서 T7 RNA 폴리머라아제를 포함하는 인비트로 전사계를 사용하여 mRNA의 전사를 행하고, 이 mRNA에 대해서 인비트로 번역계를 사용하여 단백질을 생산시킨다. 상기 단백질의 SDS-PAGE를 행하여 정상 B9L 단백질의 mRNA로부터 번역된 B9L 단백질과 분자량을 비교함으로써, 단백질의 결손을 낳는 변이를 검출할 수 있다.

6. β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자의 염색체 위치의 결정

β-카테닌 핵 국재화 단백질의 DNA를 사용하여 라디에이션(radiation) 하이브리드법[Science,250, 245(1990)]이나in situ하이브리다이제이션법[Annals of Human Genetics,45, 135(1981), Cell,52, 51(1998)]에 의하여 β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자의 염색체 상 위치를 결정할 수 있다.

라디에이션 하이브리드법이란 Gene-Bridge 4 등의 인간 염색체 단편을 갖는다수의 패널(어느 부분의 염색체 단편이 포함되어 있는지가 염색체 마커에 의하여 해석되어 있는 것) DNA에 대해서, β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자를 특이적으로 증폭시키는 PCR을 행하여, 증폭결과를 해석함으로써 상세한 염색체의 위치를 특정하는 방법이다.

in situ하이브리다이제이션법에서는, 먼저 인간 염색체의 표본에 대해서 인간 B9L 단백질을 코드하는 DNA를 프로브로 하여 하이브리다이즈한 시그널을 검출하여 표본상의 시그널 위치를 특정한다. 이에 의하여, β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자가 존재하는 염색체의 번호 뿐만 아니라 그 염색체 상에서의 물리적인 위치를 특정할 수 있다. 프로브는 방사성 동위체³H나 비오틴에 의하여 표지하고,³H 표지에서는 오토라디오그래프에 의하여, 비오틴 표지에서는 형광색소 FITC로 표지한 아비딘을 사용하여 시그널을 검출할 수 있다.

또한 상기와 같이 직접 β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자의 염색체 위치를 검출하는 방법은 아니지만, STS(Sequence-tagged site: 여러 가지 EST의 염기서열에 유래하는 프라이머와 그 프라이머에 의하여 증폭되는 염색체 DNA 단편 및 그 단편의 염색체 상 위치에 대한 정보를 갖는다)의 데이터베이스에 대해서 B9L 단백질을 코드하는 DNA의 염기서열과 상동성을 검색함으로써, β-카테닌 핵 국재화 단백질의 DNA 일부와 동일한 염기서열을 갖는 STS가 발견된 경우는, 그 STS는 염색체 상의 β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자와 대응하는 것으로 생각되기 때문에, 그 STS의 염색체 상 위치가 β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자의 염색체 상 위치인것으로 추정할 수 있다.

또한, 데이터베이스상의 인간 게놈 DNA의 서열에는 보통, 그 서열의 염색체 위치에 대한 정보가 기재되어 있다. 예를 들면, 상기 1. (6-2)에서 얻어진 인간 B9L 게놈 유전자의 엑손을 포함하는 인간 게놈 DNA의 서열인 GenBank 액세스번호 AP000877, AP000909에 대해서는 인간 염색체 llq23에 위치하는 것이 데이터베이스상에 기재되어 있다. 따라서 인간 B9L 유전자는 인간 염색체 llq23에 위치한다고 할 수 있다.

또한, bc19 유전자에 대해서는 인간 염색체 lq21에 위치하는 것이 이미 보고되어 있다.

이와 같이 하여 얻어진 β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자의 염색체 상 위치 정보는 질환과 β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자의 관련을 연구하는 데 도움이 된다. 예를 들면 암에서는 암 억제 유전자가 존재할 가능성이 높은 염색체 상 영역으로서, 대부분의 암에 대해서 높은 빈도로 LOH(loss of heterozygosity: 2쌍 중 한쪽 유전자에 보이는 염색체 결실)가 검출되는 영역의 특정이 진행되고 있지만(LOH가 일어나고 있는 영역에 있는 암 억제 유전자의 또 다른 한쪽에서 변이가 일어남으로써 암 억제 유전자의 불활화가 일어나, 암이 발증한다고 생각되고 있기 때문에), 이러한 영역과 β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자가 존재하는 염색체 위치가 일치하면 β-카테닌 핵 국재화 단백질이 이 영역에 LOH를 갖는 암의 발증에 관여할 가능성이 있는 것이 된다. 이 경우, 이러한 암에서의 β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자의 변이나 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 발현량을 해석함으로써,β-카테닌 핵 국재화 단백질의 관련이 명확해지면, 이러한 암의 진단이나 치료에 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 DNA나 β-카테닌 핵 국재화 단백질 또는 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 인식하는 항체를 사용할 수 있다.

7. β-카테닌 핵 국재화 단백질의 활성을 저해하는 것에 의한 암의 치료

APC 유전자나 β-카테닌 유전자에 변이를 갖는 대장암 등의 암세포에서는, β-카테닌의 분해제어가 불가능해져 β-카테닌이 축적됨으로써 β-카테닌/TCF에 의한 전사활성화의 억제가 불가능해진 것이 암으로서의 발증에 관여하고 있다고 생각된다. β-카테닌 핵 국재화 단백질의 β-카테닌을 핵내에 국재시킨다는 작용을 저해하거나 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 발현을 억제함으로써, 축적된 β-카테닌의 핵내로의 이행이 방해되어 β-카테닌/TCF에 의한 전사의 활성화를 억제할 수 있다고 생각된다. 이러한 작용을 갖는 물질은 암의 치료약으로서 사용할 수 있다.

(1) β-카테닌 핵 국재화 단백질의 저해제 및 그 스크리닝 방법

β-카테닌 핵 국재화 단백질의 저해제란 β-카테닌 핵 국재화 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해함으로써, β-카테닌의 핵으로의 이행을 저해하는 물질이다.

β-카테닌과 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 접촉시켜, 시검화합물을 첨가한 경우와 하지 않은 경우에서의 β-카테닌과 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 결합량을 비교함으로써, β-카테닌 핵 국재화 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질을 스크리닝할 수 있다.

예를 들면 β-카테닌 핵 국재화 단백질을³⁵S 등으로 표지한 β-카테닌을 시검화합물의 존재하/비존재하에서 혼합하여 결합시킨 후, 항체 등에 의하여 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 단리하여 표지물질의 양을 측정함으로써, β-카테닌 핵 국재화 단백질과 결합한 β-카테닌의 양을 평가할 수 있다. 시검화합물이 존재하지 않는 경우와 비교하여 존재한 경우에, 결합한 β-카테닌의 양이 감소하고 있는 경우, β-카테닌 핵 국재화 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질로 생각된다.

이와 같이 하여 얻어진 β-카테닌 핵 국재화 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질이 β-카테닌의 핵으로의 이행을 저해하는 지의 여부는, β-카테닌 및 β-카테닌 핵 국재화 단백질 양자를 강제 발현시킨 세포에 시검화합물을 첨가/비첨가한 경우의 세포를 각각 고정화하여, 각각 항β-카테닌 항체를 사용한 면역염색에 의하여 β-카테닌을 검출함으로써 조사할 수 있다. 이 경우, 보통의 β-카테닌으로는 세포내에서 GSK-3β에 의한 분해제어를 받기 때문에, 분해를 받지 않고 축적되는 인산화 부위의 변이체 예를 들면, 33번 위치의 세린을 티로신으로 치환한 β-카테닌 변이체를 사용함으로써, 세포내에 존재하는 β-카테닌의 양이 많아져, 세포내에서의 β-카테닌 검출이 용이해진다. β-카테닌에는 세포내 국재성은 없어, β-카테닌만을 강제 발현시킨 세포에서는 세포 전체에 고르게 분포하지만, B9L/bc19 유사체에 β-카테닌을 핵으로 국재시키는 작용이 있는 경우는 세포질에 비하여 핵에 보다 많은 β-카테닌이 검출된다.

상기 스크리닝법에 사용하는 β-카테닌 및 β-카테닌 핵 국재화 단백질은 상기 단백질을 발현하고 있는 조직, 세포 등으로부터 정제한 단백질을 사용해도 되지만, 상기 단백질을 코드하는 DNA를 사용하여 형질전환된 형질전환체를 배양하여,일반적인 방법에 따라 정제함으로써 대량의 상기 단백질을 얻을 수 있다. 또한 상기 단백질을 생산하는 배양세포나 배양세포 처리물을 사용해도 본 스크리닝을 행하는 것은 가능하지만, 세포를 그대로 사용하는 경우는 상기 단백질을 분비 생산하는 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 배양세포 처리물이란 농축물, 배양세포의 건조물, 배양액을 원심분리하여 얻어지는 세포, 상기 세포의 건조물, 상기 세포의 동결건조물, 상기 세포의 계면활성제 처리물, 상기 세포의 초음파 처리물, 상기 세포의 기계적 파쇄처리물, 상기 세포의 용매처리물, 상기 세포의 효소처리물, 상기 세포의 단백질 분획물, 상기 세포의 고정화물 또는 상기 세포로부터 추출하여 얻어지는 효소 샘플 등을 들 수 있다.

(2) β-카테닌 핵 국재화 단백질의 발현을 억제하는 방법

β-카테닌 핵 국재화 단백질의 발현을 억제하는 방법으로서는 β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자에 대한 안티센스 DNA나 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여 또는 안티센스 RNA 발현 벡터의 투여에 의한 mRNA로부터 β-카테닌 핵 국재화 단백질로의 번역 억제, β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자 프로모터와 결합하는 트리플헬릭스 형성 올리고뉴클레오티드 투여에 의한 전사의 저해, 리보자임 투여에 의한 β-카테닌 핵 국재화 단백질 mRNA의 분해, β-카테닌 핵 국재화 단백질 유전자의 전사를 특이적으로 저해하는 화합물의 투여에 의한 전사의 저해를 들 수 있다.

8. 유전자 치료용 벡터

β-카테닌 핵 국재화 단백질의 발현량이 적은 것이 원인인 질환에 대해서는, β-카테닌 핵 국재화 단백질 또는 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 인간 생체내에서생산하는 유전자 치료용 벡터를 투여함으로써 치료를 행할 수 있다.

β-카테닌 핵 국재화 단백질을 인간 생체내에서 생산하는 유전자 치료용 벡터로서 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 생산하는 재조합 바이러스 벡터를 들 수 있다. 상기 재조합 바이러스 벡터는 1.에 기재한 방법으로 취득한 인간 β-카테닌 핵 국재화 단백질 완전장 cDNA, 또는 필요에 따라 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 영역을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제하여, 바이러스 벡터내의 프로모터 하류에 삽입함으로써 조성할 수 있다. 상기 재조합 바이러스 벡터는 바이러스의 팩키징에 필요한 단백질 예를 들면 마우스 모로니 백혈병 바이러스 등의 레트로바이러스인 경우는 gag, pol, env 등, HIV 등의 렌티바이러스인 경우는 gag, pol, env, vpr, vpu, vif, tat, rev, nef 등, 아데노바이러스인 경우는 E1A, E1B 등, 아데노 수반 바이러스인 경우는 Rep(p5, p19, p40), Vp(Cap) 등의 유전자가 결손하고 있다.

상기 재조합 바이러스 벡터를, 상기 재조합 바이러스 벡터에 적합한 팩키징 세포에 도입한다. 팩키징 세포로서는 상기 재조합 바이러스 벡터에서 결손되어 있는 바이러스의 팩키징에 필요한 단백질을 보급할 수 있는 세포는 모두 사용할 수 있고, 예를 들면 인간 신장 유래의 HEK293 세포, 마우스 섬유아세포 NIH3T3 등을 사용할 수 있다.

바이러스 벡터로서는 상기 팩키징 세포에 있어서 재조합 바이러스를 생산할 수 있고, 표적세포에서 B9L 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다. 플라스미드 벡터로서는 MFG[Riviere I. 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA,92, 6733(1995)], pBabepuro[Morgrnstern J.P. & Land H., Nucleic Acids Res.,18, 3587(1990)], LL-CG, CL-CG, CS-CG, CLG[Miyoshi H. 등, J. Virol.,72, 8150(1998)], pAdexl[Kanegae Y. 등, Nucleic Acids Res.,23, 3816(1995)], 프로모터로서는 인간조직 중에서 발현할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있고, 예를 들면 사이토메갈로바이러스의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 LTR, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 단백질 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 사이토메갈로바이러스의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.

상기 팩키징 세포로의 상기 재조합 바이러스 벡터의 도입법으로서는 예를 들면 인산칼슘법, 리포펙션법[Felgner P.L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.

또한, 바이러스 벡터를 사용하지 않는 유전자 치료방법으로서는 목적으로 하는 조직에 DNA를 직접 수송하는 수단으로서, 노출된 플라스미드 DNA의 형태로 직접 주입되는 치료용 유전자 트랜스펙션법이 있다[US 5589466]. 즉, β-카테닌 핵 국재화 단백질을 코드하는 DNA를 갖는 발현 벡터를 치료가 필요한 조직, 예를 들면 대장암 조직에 주사기 등을 사용하여 주입함으로써 상기 단백질을 상기 암 조직내에서 발현시킬 수 있다.

9. 항체를 사용한 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 검출 및 정량방법

β-카테닌 핵 국재화 단백질을 인식하는 항체를 사용하여 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 면역학적으로 검출하는 방법으로서는 면역조직 염색법, 면역세포 염색법 등의 면역조직 화학염색법, 플로우 사이트메트리(flow cytometry), 웨스턴 블로팅법, 샌드위치 ELISA 등의 효소 면역측정법(enzyme immunoassay; EIA)이나 방사성 면역측정법(Radioimmunoassay; RIA) 등이 있고, 문헌[도야마 사쿠지, 야스 도미에편 단일클론항체 실험 매뉴얼(고단샤 사이언티픽 1987년), 속 생화학 실험강좌 5 면역생화학연구법(도쿄화학동인 1986년), Goding J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Third edition(Academic Press 1996), Harlow E. & Lane D., Antibodies: A laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory 1988)]을 토대로 행할 수 있다.

면역조직 화학염색법은 생체조직이나 세포를 고정화하여 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 인식하는 항체를 반응시키고, 더욱이 형광물질, 효소, 비오틴, 금 콜로이드, 방사성 물질 등으로 표지한 항이뮤노글로블린 항체 또는 항체 단편을 반응시킨 후, 필요하면 표지항체의 가시화 처리를 행하고 현미경을 사용하여 관찰함으로써 조직이나 세포 중의 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 검출하는 방법이다. 형광물질 표지에는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(tetramethylrhodamine isothiocyanate) 등이 사용되고, 형광현미경에 의하여 관찰함으로써 검출된다. 효소표지인 경우는 퍼옥시다아제나 알카리 포스파다아제 등이 사용되고, 효소에 의하여 발색하는 기질을 첨가하여 발색반응시킨 후, 광학현미경으로 관찰함으로써 검출할 수 있다. 비오틴 표지인 경우는 퍼옥시다아제 등의 효소로 표지한 아비딘을 반응시킨 후, 효소표지 항체와 동일한 조작을 행한다. 금 콜로이드 표지인 경우는 전자현미경으로 관찰함으로써 검출한다. 방사성 물질 표지에는¹²⁵I 등이 사용되고, 감광유제를 코팅하여 방사선에 의하여 석출된 은 입자를 광학현미경으로 관찰함으로써 검출할 수 있다.

플로우 사이토메트리는 피검자로부터 채취한 세포에 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 인식하는 항체를 반응시키고, 더욱이 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 피코에리트린(phycoerythrin) 등의 형광물질로 라벨한 항이뮤노글로블린 항체 또는 항체단편을 반응시킨 후, 형광색소를 플로우 사이토미터로 측정함으로써 세포에서의 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 발현을 검출하는 방법이다.

웨스턴 블로팅법은 피검자로부터 채취한 생체조직 또는 세포, 또는 그들의 파쇄액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분획한 후, 상기 겔을 PVDF 막 또는 니트로셀룰로오스 막에 블로팅하여, 상기 막에 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 인식하는 항체 또는 그 항체단편을 반응시키고, 더욱이 퍼옥시다아제나 알칼리 포스파타아제 등의 효소나¹²⁵I 등의 방사성 물질로 표지한 항이뮤노글로블린 항체 또는 항체단편을 반응시킨 후 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 밴드를 검출하는 방법이다. 검출은 효소표지인 경우는 효소에 의하여 발색하는 기질을 첨가하여 반응시켜 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 밴드를 가시화하거나, 효소에 의하여 발광하는 기질을 첨가하여 X선 필름의 오토라디오그래피에 의하여 검출하고 방사성물질인 경우는 X선 필름의 오토라디오그래피에 의하여 검출한다.

효소 면역측정법의 일종인 샌드위치 ELISA에서는 항원인식부위가 다른 두 종류의 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 인식하는 단일클론항체를 준비하여, 미리 한쪽의 단일클론항체 또는 항체단편은 플레이트에 흡착시키고, 또 다른 한쪽의 단일클론항체 또는 항체단편은 퍼옥시다아제나 알칼리 포스파타아제 등의 효소로 표지하여 둔다. 피검자로부터 채취한 생체조직 또는 세포로부터 세포 파쇄액을 조제하여 시검 샘플로 한다. 항체흡착 플레이트에 시검 샘플을 반응시키고, 더욱이 효소표지한 β-카테닌 핵 국재화 단백질 단일클론항체 또는 그 항체단편을 반응시키고, 효소에 의하여 발색하는 기질을 첨가하여 발색반응시킨 후, 분광광도계에 의하여 발색강도를 측정함으로써, 샘플 중의 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 검출 또는 정량을 행한다.

방사성 면역측정법은 효소가 아니라¹²⁵I 등의 방사성 물질로 표지한 항체를 사용하여 효소 면역측정법과 동일한 조작을 행하고, 신틸레이션 카운터로 방사선을 측정함으로써 샘플 중의 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 검출 또는 정량을 행하는 방법이다.

또한 효소 면역측정법이나 방사성 면역측정법에는 상기와 같은 샌드위치법 외에, 항체가 아니라 β-카테닌 핵 국재화 단백질 샘플을 표지하여, 일정량의 표지 β-카테닌 핵 국재화 단백질 샘플과 시험 샘플을 플레이트에 고상화한 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 인식하는 항체와 반응시켜, 플레이트상의 효소활성이나 방사선을 측정함으로써, 샘플 중의 β-카테닌 핵 국재화 단백질의 검출 또는 정량을 행하는 경합법도 있다.

10. 의약조성물

상기 β-카테닌 핵 국재화 단백질을 함유하는 치료약은 약제로서 상기 물질 또는 상기 중화항체 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 보통은 약리학적으로 허용되는 하나 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술분야에 있어서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조한 의약제제로서 제공하는 것이 바람직하다. 투여경로는 치료시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하여, 경구투여 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 및 정맥 내 등의 비경구투여를 들 수 있다. 투여형태로서는 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.

경구투여에 적당한 제제로서는 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다. 예를 들면 유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 콩기름 등의 유류, p-히드록시안식향산 에스테르류 등의 방부제, 스트로베리 향미, 페퍼민트 등의 향미류 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다. 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은 락토오스, 포도당, 수크로오스, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산 나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 탈크 등의 활택제, 폴리비닐 알코올, 히드록시프로필 셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.

비경구투여에 적당한 제제로서는 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다. 예를 들면, 주사제는 소금용액, 포도당용액, 또는 양자의 혼합물로 된 담체 등을 사용하여 조제한다. 좌제는 카카오버터, 수소화지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 조제된다. 또한, 분무제는 상기 단백질 그 자체 내지는 수용자의 구강 및 기도점막을 자극하지 않고, 또한 상기 단백질을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 조제한다. 담체로서 구체적으로는 락토오스, 글리세린 등이 예시된다. 상기 단백질 및 사용하는 담체의 성질에 따라 에어로졸, 드라이 파우더 등의 제제가 가능하다. 또한, 이들 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가하는 것도 가능하다.

투여량 또는 투여횟수는 목적으로 하는 치료효과, 투여방법, 치료기간, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 보통 성인 하루당 10 ㎍/kg~100 mg/kg이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 마우스 B9L과 인간 bc19의 아미노산서열을 비교한 도이다.

상단이 마우스 B9L, 하단이 인간 bc19의 아미노산서열을 1문자 표기로 표시한 것이다. 단, *는 인간 bc19에서 상단의 마우스 B9L과 동일한 아미노산을 나타내고, -는 대응하는 아미노산이 없는 것을 나타낸다. 밑줄은 β-카테닌과의 결합부위를 표시하고, 이중 밑줄은 핵 이행 시그널과 유사한 서열을 나타낸다.

도 2는 세포내에서의 β-카테닌과 B9L의 결합을 나타내는 도이다.

레인 아래의 +는 발현시키는 유전자를 나타낸 것으로, 중앙과 오른쪽은 S33Y β-카테닌과 GFP-B9L을 발현시킨 COS-7, 왼쪽은 대조용 S33Y β-카테닌과 GFP를 발현시킨 COS-7의 세포용해액의 면역침강물을 항β-카테닌항체를 1차항체로서 사용한웨스턴 블로팅의 결과이다. 레인 위는 면역침강을 행한 항체를 나타낸 것으로, 왼쪽과 중앙은 항GFP항체이고, 오른쪽은 β-카테닌항체로 각각 면역침강을 행한 것이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 상세하게 설명한다.

실시예 1 B9L cDNA의 클론화

효모 투하이브리드 시스템을 이용하여, 마우스 mβ-카테닌 arm과 결합하는 단백질을 코드하는 유전자를 클론화하였다.

(1) mβ-카테닌 arm의 베이트 플라스미드의 제작

마우스 β-카테닌의 cDNA의 염기서열 및 그 cDNA가 코드하는 마우스 β-카테닌의 아미노산서열은 공지이다[GenBank 액세스번호 M90364, Science,257, 1142(1992)]. 마우스 β-카테닌은 그 아미노산서열의 128~683번째에 아르마딜로 도메인(mβ-카테닌 arm)이라 불리는 반복서열을 갖는다. 이 mβ-카테닌 arm 부분을 코드하는 마우스 β-카테닌의 DNA 단편을, 마우스 세포 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 행함으로써 증폭하여 단리하였다. PCR 프라이머는 상기 mβ-카테닌 arm을 코드하는 cDNA의 부분 염기서열을 토대로 디자인하였다. 증폭한 DNA 단편의 염기서열을 결정하여, mβ-카테닌 arm을 코드하고 있는 것인 것을 확인한 후, 벡터 pGBT9(Clontech사제)의BamHI/SalI 사이트 사이에 삽입함으로써 GAL4 BD와 융합시킨 단백질을 발현시키는 플라스미드 GAL4-β-catenin을 제작하였다.

(2) 투하이브리드법에 의한 스크리닝

Clontech사제의 투하이브리드법에 사용하는 라이브러리인 매치마커 마우스 태아(Swiss Webster/NIH 마우스의 17일배) cDNA 라이브러리에 대해 스크리닝을 행하였다. 이 cDNA 라이브러리는 벡터 pGAD10(Clontech사제)에 cDNA가 삽입되어 있는 것으로, 선택 마커로서 효모 류신 합성계 유전자 LEU2를 가지고, ADH1 프로모터를 사용하여 GAL4 AD와 cDNA가 코드하는 단백이 융합단백의 형태로 발현한다. 스크리닝의 구체적 방법은 라이브러리에 첨부된 Clontech사의 매뉴얼에 따라, 아래와 같이 행하였다.

즉, 투하이브리드법용 마우스 태아 cDNA 라이브러리와 상기 (1)에서 제작한 플라스미드 GAL4-β-catenin을 효모Saccharomyces cerevisiaeHF7C주(Clontech사제)에 도입하였다. HF7C주는 트립토판, 류신, 히스티딘 요구성으로, 그 염색체 중에는 리포터 유전자로서 GAL4 BD가 결합하는 프로모터인 GAL1 프로모터의 하류에 연결한 히스티딘 합성계 유전자 HIS3 및 GAL4 BD가 결합하는 염기서열의 하류에 연결한 대장균 유래 β-갈락토시다아제 유전자 lacZ를 가지고 있는 균주이다[Gene,212, 197(1998)]. 플라스미드 GAL4-β-catenin 및 mβ-카테닌 arm과 결합하는 단백질의 cDNA 클론 양자를 보유하여 각각의 융합단백질을 발현하는 형질전환체는, mβ-카테닌 arm과 상기 결합단백질의 결합에 의하여 GAL4 BD와 GAL4 AD가 근접하여, GAL4 BD가 결합하는 염기서열 하류의 HIS3 유전자 및 lacZ 유전자의 전사가 활성화되기 때문에, 히스티딘 비요구성, β-갈락토시다아제 활성 양성이 된다. 1.2×10⁶개의 형질전환체로부터 류신, 히스티딘, 트립토판을 포함하지 않는 배지 상에서 증식하여, β-갈락토시다아제 활성 양성의 콜로니를 선택하였다.

이 클론으로부터 플라스미드 DNA를 회수하고, 삽입되어 있는 cDNA 단편의 염기서열을 결정하여 서열번호 3으로 나타냈다. 이 염기서열을 염기서열 데이터베이스에 대해 상동성 검색한 바, 몇 마리 마우스의 EST에 염기서열이 일치하는 것이 있었지만, 기존 유전자의 염기서열에서 일치하는 것은 발견되지 않았다. 따라서 투하이브리드법으로 단리된 상기 cDNA 단편은, 마우스 β-카테닌과 결합하는 단백질을 코드하는 신규한 염기서열을 갖는 cDNA 단편인 것이 명확해졌다. 이 cDNA 단편이 코드하는 단백질의 아미노산서열을 서열번호 4에 나타냈다. 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 cDNA 단편은, 종지코돈이 보이지 않고 전체가 단백질을 코드하고 있는 것으로부터, 전장 cDNA의 부분단편으로 생각되었다. 전장 cDNA는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 5' 및 3'측에 더욱이 염기서열이 연장되는 것으로 생각되었다. 따라서, 5'-RACE법 및 3'-RACE법에 의해 얻어진 cDNA 단편 보다도 더욱 5'측의 염기서열을 포함하는 cDNA 단편 및 3'측의 염기서열을 포함하는 cDNA 단편을 증폭하여, 그 염기서열을 결정하였다. 투하이브리드법에 의하여 얻어진 클론의 cDNA의 염기서열과 5'-RACE법 및 3'-RACE법에 의하여 얻어진 cDNA의 염기서열을 연결하여 합침으로써 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 얻었다. 이 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 1494 아미노산으로 된 단백질을 코드하고 있었다. 또한 투하이브리드법으로 얻어진 cDNA 단편의 염기서열은 서열번호 1로 표시되는 염기서열의염기번호 733~1692번째에 상당하고, 이 cDNA 단편이 코드하고 있었던 아미노산서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열의 245~564번째에 상당하고 있었다. 이 아미노산서열에 대해서 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 아미노산서열 데이터베이스와 상동성 해석 프로그램 BLAST2를 사용하여 상동성을 조사한 바, 도 1에 나타내는 바와 같이 bc19 단백질[액세스번호 CAA73942; Willis T.G. et al., Blood,91, 1871(1998)]과 전체에 걸쳐 37%의 상동성이 보였기 때문에, 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열로 된 β-카테닌 결합 단백질을 B9L 단백질(bc19 like protein)이라 명명하였다. 또한, 상기의 bc19 단백질은 인간의 것으로, 마우스 bc19 단백질의 아미노산서열은 명확해져 있지 않지만, 마우스 bc19 단백질을 코드하는 DNA의 염기서열로 생각되는 EST가 염기서열 데이터베이스 GenBank에 존재하고(액세스번호 AI550007, AI426858), 그들 염기서열은 인간 bc19 단백질에 대해 90% 이상으로 매우 높은 상동성을 가지고 있기 때문에(B9L 단백질 염기서열의 상당부분인 염기서열의 상동성은 40% 이하), 얻어진 B9L 단백질(마우스)은 마우스의 bc19 단백질에 해당하는 것이 아니라고 생각된다. B9L 단백질은 bc19 단백질과 동일하게 프롤린을 매우 높은 비율로 포함하는 단백질로, 핵내 이행 시그널과 유사한 서열을 갖는다.

또한, 이 cDNA를 프로브로서 마우스 태아(13.5일배) mRNA에 대해 노던 블로팅 하이브리다이제이션을 행한 바, 길이 7.5 kb의 mRNA 밴드가 검출되었다.

(3) 인간 B9L 유전자 및 염색체 상의 위치

(2)에서 얻어진 마우스 B9L cDNA의 염기서열과 상동성을 갖는 인간 DNA의 염기서열을 GenBank 등의 염기서열 데이터베이스로부터 BLAST 등의 상동성 프로그램을 사용하여 검색하였다. 그 결과, 인간 B9L cDNA 유래로 추정되는 GenBank 액세스번호 U46365나 R24762의 인간 EST 및 인간 B9L 게놈 유전자의 엑손부분을 포함하는 GenBank 액세스번호 AP000877, AP002357, AP000909의 인간 게놈 DNA의 워킹 드래프트 시퀀스를 발견하였다. 이들 워킹 드래프트 시퀀스와, 마우스 B9L cDNA 및 인간 EST의 염기서열을 비교함으로써, 인간 B9L을 코드하는 엑손부분의 서열로서 서열번호 5~8의 염기서열이 얻어졌다. 서열번호 5는 마우스 B9L cDNA의 염기서열(서열번호 1)의 27~412번째에, 서열번호 6은 413~532번째에, 서열번호 7은 1183~3115번째에, 서열번호 8은 3116~3397번째에 각각 대응하는 엑손이다. 서열번호 9에 서열번호 5 및 6으로부터 유도되는 인간 B9L cDNA의 부분 염기서열(서열번호 1의 마우스 B9L cDNA의 염기서열의 27~532번째에 대응한다), 서열번호 10에 서열번호 9의 염기서열이 코드하는 인간 B9L 단백질의 부분 아미노산서열(서열번호 2의 마우스 B9L 단백질의 아미노산서열의 10~177번째에 대응한다), 서열번호 11에 서열번호 7 및 8로부터 유도되는 인간 B9L cDNA의 부분 염기서열(서열번호 1의 마우스 B9L cDNA의 염기서열의 1183~3397번째에 대응한다), 서열번호 12에 서열번호 11의 염기서열이 코드하는 인간 B9L 단백질의 부분 아미노산서열(서열번호 2의 마우스 B9L 단백질의 아미노산서열의 395~1132번째에 대응한다)을 나타냈다.

또한, AP000877, AP000909에 대해서는 인간 염색체 11q23에 위치하는 것이 데이터베이스 상에 기재되어 있어, 인간 B9L 유전자는 인간 염색체 11q23에 위치한다고 생각되었다.

실시예 2 B9L 단백질과 β-카테닌의 인비트로에서의 결합

B9L 단백질이 β-카테닌과 직접 결합하는 것을 아래와 같이 하여 확인하였다. 또한, 실시예 2~5에서 B9L 단백질로서 사용하고 있는 것은, 실시예 1의 투하이브리드법에 의하여 얻어진 B9L cDNA 단편이 코드하는 서열번호 4의 아미노산서열로 된 단백질이다.

실시예 1에서 투하이브리드법에 의하여 얻어진 B9L cDNA 단편으로부터,³⁵S 표지 메티오닌과 TNT-망상 적혈구 용해액 시스템(Promega사제)을 이용한 인비트로 전사 번역에 의하여³⁵S 표지 B9L 단백질을 합성하였다. 마우스 β-카테닌 DNA를 대장균용 글루타티온-S-트랜스페라아제(GST) 발현 플라스미드 벡터 pGEX5X-1(Amersham Pharmacia Biotech사제)의 클로닝사이트에 삽입한 GST-β-카테닌 융합단백질(이하, GST-β-카테닌으로 약기한다) 발현 플라스미드[Nakamura et al., Genes to Cells,3, 395(1998)] 및 대조용으로서 pGEX5X-1로 각각 형질전환한 대장균을 배양하여, 각각의 균체 파쇄액을 조제하였다. 이들 균체 파쇄액에 글루타티온-세파로오스 4B(Amersham Pharmacia Biotech사제)를 첨가하여, GST-β-카테닌 또는 GST를 흡착시켜 단리하였다. GST-β-카테닌 또는 GST를 각각 흡착시킨 글루타티온-세파로오스 4B와 상기³⁵S 표지 B9L 단백질을 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 완충액 A[10 mmol/l Tris-HCl(pH8.0), 140 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EGTA, 10 ㎍/ml 류펩틴(leupeptin), 10 ㎍/ml 어프로티닌(aprotinin)] 중에서 4℃에서 2시간반응시켰다. 글루타티온-세포로오스 4B를 완충액 A로 잘 세척한 후, SDS-PAGE용 샘플 버퍼를 첨가함으로써, 결합해 있었던 단백질을 샘플 버퍼 중으로 용출시켰다. 이 용출액 및³⁵S 표지 B9L 단백질을 샘플로 하여 SDS-PAGE를 행한 후, 겔의 오토라디오그래피를 행하였다. 그 결과, GST-β-카테닌 발현 대장균에서는³⁵S 표지 B9L 단백질의 밴드가 검출된 것에 대해, GST 발현 대장균에서는 밴드는 검출되지 않았다. 따라서, GST-β-카테닌에 B9L 단백질이 인비트로에서 직접 결합하는 것 및 B9L 단백질이 결합하는 부분은 GST-β-카테닌 중의 β-카테닌 부분인 것이 확인되었다.

실시예 3 B9L 단백질과 β-카테닌의 동물세포 내에서의 결합

실시예 1에서 얻어진 B9L cDNA 단편을 그린 형광 단백질(GFP) 발현 벡터 pEGFP-C2(Clontech사제)에 삽입하여, GFP-B9L 융합단백질(이하 GFP-B9L이라고 약기한다.) 발현 플라스미드를 제작하였다. 또한, 동물세포 발현용 플라스미드 벡터 pMKITneo[Nakamura et al., Genes to Cells,3, 395 (1998)]에, GSK-3β에 의하여 인산화를 받는 33번 위치의 세린 잔기를 티로신으로 치환한 변이형 마우스 β-카테닌 S33Y cDNA를 서브클로닝하여, SS3Y β-카테닌 발현용 플라스미드를 제작하였다. 이들 플라스미드 DNA를 리포펙트아민(LipofectAMINE; Life-Technologies사제)을 사용하여 원숭이 신장 세포주 COS-7(ATCC: CRL-1651)에 도입하여 강제 발현시켰다. 24시간 후에 세포를 회수하여, 1% 트리톤 X-100을 포함하는 완충액 A를 첨가하여 세포용해액을 조제하고, 이 세포용해액과 항GFP 항체 또는 항β-카테닌 항체와 4℃에서 1시간 반응시켜서, GFP-B9L 또는 S33Y β-카테닌과 항체의 면역복합체를 형성시킨 후, 반응액에 IgG와 결합하는 성질을 갖는 프로틴 G-세파로오스 4B(Amersham Pharmacia Biotech사제)를 첨가하여, 면역복합체를 흡착시켰다. 프로틴 G-세파로오스 4B를 용해용 완충액 A로 잘 세척한 후, SDS-PAGE용 샘플 버퍼를 첨가하여 면역복합체를 용출시켰다. 이 용출액을 샘플로 하여 SDS-PAGE를 행한 후, PVDF 막 이모빌론 P(Immobilon P; Millipore사제)에 전사하여, 1차항체로서 항β-카테닌항체[트랜스덕션 라보라토리(Transduction Laboratory)사제; 면역동물은 마우스], 2차항체로서 알칼리 포스파타아제 표지 항마우스 IgG 항체를 사용한 웨스턴 블로팅에 의하여 S33Y β-카테닌의 검출을 행하였다. 그 결과를 도 2에 나타냈지만, GFP-B9L을 침강시키기 위한 항GFP 항체에 의한 면역침강물 중에, 항β-카테닌 항체에 의하여 밴드가 검출된 것으로부터, 세포내에 있어서도 GFP-B9L은 β-카테닌과 결합하고 있는 것이 확인되었다.

실시예 4 B9L 단백질의 β-카테닌의 세포내 국재에 대한 작용

실시예 3에서 제작한 GFP-B9L 발현용 플라스미드 및 S33Y β-카테닌 발현용 플라스미드에 대해서, 각각 단독 또는 양자를 마우스 NIH3T3 세포에 에펙틴(Effectene: Qiagen사제)을 사용해서 도입하여 강제 발현시켰다. 또 대조군으로서 GFP 발현 벡터 pEGFP-C2도 동일하게 하여 마우스 NIH3T3 세포에 강제 발현시켰다. 24시간 후의 세포를 포름알데히드로 고정화한 후, 항β-카테닌 항체로 세포를 염색한 후, RITC 표지 항토끼 IgG 항체를 반응시켜 형광현미경으로 관찰함으로써 세포내의 S33Y β-카테닌을 검출하였다. 또한, GFP-B9L은 GFP의 직접 형광현미경(FITC용 필터 사용)관찰에 의하여 검출하였다.

그 결과, S33Y β-카테닌만을 발현시킨 세포에서는, S33Y β-카테닌이 세포질 및 핵내에 고르게 분포하고 있는 것에 대해, S33Y β-카테닌과 GFP-B9L 양자를 발현시킨 세포에서는 S33Y β-카테닌, GFP-B9L 모두 핵내에 국재하고 있었다. 따라서, B9L 단백질은 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내에 국재시키는 성질을 갖는 것을 알 수 있었다. 또한, GFP-B9L만을 발현시킨 경우도, GFP-B9L은 핵내에 국재했지만, GFP만을 발현시킨 경우는 세포질 및 핵내에 고르게 분포하고 있는 것으로부터, 핵내로의 국재는 부가한 GFP와는 관계없이 B9L 단백질에 의한다는 것이 확인되었다.

또한, 실시예 1에서 얻어진 B9L 전장 cDNA를 pEGFP-C2의EcoRI/SalI 사이트 사이에 삽입한 동물세포 발현용 플라스미드 pEGF-C2B9L을 제작하여, 상기와 동일하게 마우스 3T3 세포에 S33Y β-카테닌 발현용 플라스미드와 함께 강제 발현시켜 세포내의 S33Y β-카테닌을 검출한 바, 투하이브리드법으로 얻어진 B9L 단백질 단편과 동일하게, S33Y β-카테닌, GFP-B9L(전장) 모두 핵내에 국재하고 있었다. 따라서, B9L 전장도 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내에 국재시키는 성질을 갖는 것이 확인되었다.

실시예 5 B9L 단백질과 β-카테닌의 결합 양식

(1) β-카테닌 중의 결합영역

실시예 1에 기재된 바와 같이 B9L 단백질은 β-카테닌의 아르마딜로 도메인부분(β-카테닌 arm)에 결합하는 단백질로서 얻어진 것이지만, β-카테닌 arm의 어느 부분이 B9L 단백질과 결합하는지를, 아래와 같이 하여 β-카테닌 arm의 부분단편을 발현시켜, B9L 단백질과 각각의 β-카테닌 부분단편의 결합을 조사하였다. β-카테닌 arm 거의 전체(마우스 β-카테닌의 아미노산서열의 141~664번째에 상당), β-카테닌 arm 전반(마우스 β-카테닌의 아미노산서열의 141~390번째, 아르마딜로 리피트 1~6에 상당), β-카테닌 arm 후반(마우스 β-카테닌의 아미노산서열의 391~664번째, 아르마딜로 리피트 7~12에 상당)을 코드하는 DNA를, 실시예 1에서 제작한 β-카테닌 arm의 베이트 플라스미드를 주형으로 하여, 각각 서열번호 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 센스 프라이머 및 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머, 서열번호 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 센스 프라이머 및 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머, 서열번호 15로 표시되는 염기서열을 갖는 센스 프라이머 및 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR에 의하여 증폭하고, 벡터 pGBT9에 삽입하여 각각의 베이트 플라스미드를 제작하였다.

각각의 베이트 플라스미드와 실시예 1에서 투하이브리드법에 의하여 얻어진 B9L cDNA 단편 발현클론과 효모 HF7C주에 도입하여, 형질전환체인 β-갈락토시다아제 활성의 유무에 의하여, B9L 단백질과 각각의 β-카테닌 부분단편의 결합을 조사하였다. 그 결과, β-카테닌 arm 거의 전체 및 β-카테닌 arm 전반(아르마딜로 리피트 1~6)과 B9L 단백질은 결합이 보였지만, β-카테닌 arm 후반(아르마딜로 리피트 7~12)과는 결합이 보이지 않았다. 따라서, B9L 단백질은 β-카테닌 arm 전반(아르마딜로 리피트 1~6)의 영역과 결합하는 것으로 생각되었다.

(2) B9L 단백질 중의 결합영역

실시예 1에 기재된 바와 같이, B9L 단백질의 아미노산서열을 표시하는 서열번호 2의 아미노산번호 245~564번째의 아미노산서열을 갖는 단백질이 β-카테닌 arm에 결합하는 단백질로서 얻어진 것으로부터, B9L 단백질은 β-카테닌 arm과 아미노산서열의 245~564번째의 영역에서 결합하는 것으로 추정된다. 따라서, 더욱이 이 중 어느 영역이 β-카테닌 arm과 결합하는지를, 아래와 같이 하여 투하이브리드법에 의하여 조사하였다. B9L 단백질의 아미노산서열을 표시하는 서열번호 2의 아미노산번호 245~291번째, 292~439번째, 440~564번째, 245~439번째, 292~564번째를 코드하는 DNA 단편을 PCR에 의하여 증폭하여 벡터 pGAD424(Clontech사제)에 삽입함으로써 각 B9L 단백질 부분단편을 GAL4 AD와의 융합단백질로서 발현하는 투하이브리드법용 발현 플라스미드를 제작하였다. 각각의 플라스미드를 실시예 1에서 제작한 β-카테닌 arm 베이트 플라스미드와 효모 HF7C주에 도입하여, 형질전환체인 β-갈락토시다아제 활성의 유무에 의하여, 각각의 B9L 단백질 부분단편과의 β-카테닌 arm의 결합을 조사하였다. 그 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열의 아미노산번호 292~439번째, 245~439번째 및 292~564번째의 B9L 단백질 부분단편은 β-카테닌 arm과 결합이 보였지만, 292~439번째의 서열을 포함하지 않는 아미노산서열의 245~291번째 및 440~564번째의 B9L 단백질 부분단편은 β-카테닌 arm과의 결합이 보이지 않았다. 따라서, B9L 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열 중의아미노산번호 292~439번째의 영역에서 β-카테닌 arm과 결합하는 것으로 생각되었다.

실시예 6 bc19 단백질과 β-카테닌의 결합성

실시예 5에서 β-카테닌과의 결합영역으로 특정된 B9L 단백질의 아미노산서열을 표시하는 서열번호 2의 아미노산번호 292~439번째의 영역은, 상동성을 갖는 단백질인 bc19 단백질의 아미노산서열의 244~410번째의 아미노산에 상당한다. 따라서, bc19 단백질의 이 영역이 β-카테닌 결합능을 갖는지의 여부를 실시예 5와 동일하게 하여 조사하였다.

즉, 인간 bc19 단백질의 아미노산서열의 244~410번째를 코드하는 DNA 단편을 PCR에 의하여 증폭하여 벡터 pGAD424(Clontech사제)에 삽입하여 bc19 단백질(244~410) 부분단편을 GAL4 AD와의 융합단백질로서 발현하는 투하이브리드법용 발현 플라스미드를 제작하여, 이 플라스미드를 실시예 1에서 제작한 β-카테닌 arm 베이트 플라스미드와 효모 HF7C주에 도입하였다. 그 결과, 형질전환체에서 β-갈락토시다아제 활성이 확인된 것으로부터 bc19 단백질은 β-카테닌과 아미노산서열의 244~410번째의 영역에서 결합하는 것을 알 수 있었다. bc19 단백질에는 핵 이행 시그널 유사 서열이 있는 것으로부터, bc19 단백질도 β-카테닌과 결합하여 핵에 국재시키는 작용을 갖는 단백질인 것으로 추정되었다. 따라서, bc19 단백질, bc19 단백질을 코드하는 DNA, bc19 단백질을 인식하는 항체, bc19 단백질을 코드하는 DNA의 부분 염기서열로 된 올리고뉴클레오티드도 B9L 단백질, B9L 단백질을 코드하는 DNA, B9L 단백질을 인식하는 항체, B9L 단백질을 코드하는 DNA의 부분 염기서열로 된 올리고뉴클레오티드와 동일한 목적에 사용할 수 있는 것으로 생각된다. bc19 단백질은 B세포 전구체의 급성 림프아구성 백혈병 환자로부터 수립된 세포주 CEMO-1에서의 비정상적인 높은 발현이 보고되어 있어[Willis T. G. et al., Blood,91, 1871(1998)], bc19 단백질이 B9L 단백질과 동일하게 β-카테닌의 핵으로의 국재를 일으켜, β-카테닌/TCF에 의한 전사활성화를 항진시킴으로써 암의 발증에 관여하고 있다는 가설을 뒷받침하는 것이다.

본 발명에 의하여, 신규한 β-카테닌 핵 국재화 단백질 및 상기 단백질을 코드하는 DNA가 제공되고, β-카테닌 핵 국재화 단백질 및 상기 단백질을 코드하는 DNA를 이용하여, 암 등의 β-카테닌 핵 국재화에 관련된 질환의 진단약 및 치료약을 개발할 수 있다.

「서열표 프리 텍스트」

서열번호 13-인공서열의 설명: 5'말단에MunI 인식서열을 갖는 마우스 β-카테닌의 아르마딜로 리피트 1(141번째의 Asn 잔기의 하류)에 대한 센스 프라이머

서열번호 14-인공서열의 설명: 5'말단에SalI 인식서열을 갖는 마우스 β-카테닌의 아르마딜로 리피트 6(390번째의 Asp 잔기의 상류)에 대한 안티센스 프라이머

서열번호 15-인공서열의 설명: 5'말단에MunI 인식서열을 갖는 마우스 β-카테닌의 아르마딜로 리피트 7(391번째의 Ala 잔기의 하류)에 대한 센스 프라이머

서열번호 16-인공서열의 설명: 5'말단에SalI 인식서열을 갖는 마우스 β-카테닌의 아르마딜로 리피트 12(664번째의 Glu 잔기의 상류)에 대한 안티센스 프라이머

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산서열의 아미노산번호 292~439로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 단백질.
제1항에 있어서, 단백질이 서열번호 2 또는 4로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질.
서열번호 10으로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 단백질.
서열번호 10 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산서열을 포함하는 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단백질이 갖는 아미노산서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 아미노산서열로 되고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단백질이 갖는 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로 되고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질.
제3항 또는 제4항에 있어서, 단백질이 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열로 되고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질인 단백질.
서열번호 12로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단백질이 갖는 아미노산서열 중 연속된 5~60 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단백질 또는 폴리펩티드를 코드하는 DNA.
서열번호 1로 표시되는 염기서열의 염기번호 874~1317로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA.
제11항에 있어서, DNA가 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA.
아래의 [1] 또는 [2]의 염기서열을 포함하고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

[1] 서열번호 9로 표시되는 염기서열

[2] 서열번호 9 및 11로 표시되는 염기서열
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
DNA가 서열번호 9 및 11로 표시되는 염기서열을 포함하는 DNA이고, 또한 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 염기서열로 된 DNA이며, 또한 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
서열번호 11로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA를 벡터에 삽입하여 얻어지는 재조합 DNA.
제17항의 재조합 DNA를 숙주세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체.
제18항의 형질전환체를 배양액 중에서 배양하고, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단백질 또는 폴리펩티드를 상기 배양물 중에 생성 축적시켜, 상기 배양물중으로부터 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단백질 또는 폴리펩티드의 제조방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA의 염기서열 중 연속된 10~60 염기의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 그들 올리고뉴클레오티드의 유도체.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA 또는 제20항의 올리고뉴클레오티드 또는 그들 올리고뉴클레오티드의 유도체를 사용하여, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 발현량을 mRNA 레벨에서 검출 또는 정량하는 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA 또는 제20항의 올리고뉴클레오티드 또는 그들 올리고뉴클레오티드의 유도체를 사용하여, 신체가 건강한 정상인과 피검자가 갖는 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 발현량을 mRNA 레벨에서 측정 비교하여, 신체가 건강한 정상인에 비하여 상기 단백질의 발현량이 증가 또는 감소하고 있는 질환을 판정하는 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA 또는 제20항의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 함유하는, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 발현량을 mRNA 레벨에서 측정 비교하여, 신체가 건강한 정상인에 비하여상기 단백질의 발현량이 증가 또는 감소하고 있는 질환의 진단약.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA 또는 제20항의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 사용하여, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 유전자의 변이를 검출하는 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA 또는 제20항의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 사용하여, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 유전자에 변이를 갖는 질환을 판정하는 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA 또는 제20항의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 함유하는, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 유전자에 변이를 갖는 질환의 진단약.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA 또는 제20항의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체를 사용하여, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 발현을 전사단계에서 억제하는 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA 또는 제20항의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체, bc19 단백질을 코드하는 DNA, bc19 단백질을코드하는 DNA의 염기서열 중 연속된 10~60 염기의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 그들 올리고뉴클레오티드의 유도체로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 또는 DNA를 사용하여 β-카테닌의 핵 국재화를 저해하는 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA, 제20항의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 유도체, bc19 단백질을 코드하는 DNA, 또는 bc19 단백질을 코드하는 DNA의 염기서열의 연속된 10~60 염기의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 그들 올리고뉴클레오티드의 유도체로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 또는 DNA를 함유하는 암 치료약.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA를 함유하는 유전자 치료용 벡터.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA를 도입함으로써 제작한 비인간 트랜스제닉 동물.
제31항의 비인간 트랜스제닉 동물 또는 bc19 단백질을 코드하는 DNA를 도입함으로써 제작한 비인간 트랜스제닉 동물을 발암 모델 동물로서 사용하는 방법.
제31항의 트랜스제닉 동물 또는 bc19 단백질을 코드하는 DNA를 도입함으로써 제작한 트랜스제닉 동물을 사용하여 암 치료약을 평가하는 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DNA의 전부 또는 일부가 결손되어, β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 활성을 갖는 단백질의 기능이 상실 또는 저하된 유전자 결손 비인간 동물.
[1] 피검시료 비존재하에서의 bc19 단백질과 β-카테닌의 결합과, [2] 피검시료 존재하에서의 bc19 단백질과 β-카테닌의 결합을 비교하여, 피검시료로부터 bc19 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는, bc19 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질의 스크리닝 방법.
[1] 피검시료 비존재하에서의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질과 β-카테닌의 결합과, [2] 피검시료 존재하에서의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질과 β-카테닌의 결합을 비교하여, 피검시료로부터 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질과 β-카테닌의 결합을 저해하는 물질의 스크리닝 방법.
제35항 또는 제36항의 스크리닝 방법에 의하여 얻어지는 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염.
제37항의 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 암 치료약.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단백질 또는 폴리펩티드를 인식하는 항체.
제39항의 항체를 사용한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질을 면역학적으로 검출 또는 정량하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질과 결합하여, 상기 단백질이 갖는 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 저해하는 중화항체.
bc19 단백질과 결합하여, bc19 단백질이 갖는 β-카테닌과 결합하여 β-카테닌을 핵내로 국재시키는 작용을 저해하는 중화항체.
제39항의 항체를 사용하여 신체가 건강한 정상인과 피검자가 갖는 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 발현량을 정량 비교하여, 신체가 건강한 정상인에 비하여 상기 단백질량이 증가 또는 감소하고 있는 질환을 판별하는 방법.
제39항의 항체를 함유하는, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 발현량이 신체가 건강한 정상인과 비교하여 증가 또는 감소하고 있는 질환의 진단약.
제41항의 항체를 사용하여 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 기능을 저해함으로써, β-카테닌과 Lef/Tcf 패밀리에 속하는 전사인자와의 복합체에 의한 전사의 활성화를 저해하는 방법.
제42항의 항체를 사용하여 bc19 단백질의 기능을 저해함으로써, β-카테닌과 Lef/Tcf 패밀리에 속하는 전사인자와의 복합체에 의한 전사의 활성화를 저해하는 방법.
제41항 또는 제42항의 항체를 함유하는 암 치료약.