JP2000189168A - 新規転写伸長抑制因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ｍＲＮＡの転写でのｐｏｌＩＩ伸長反応にお
いて、そのＤＲＢ感受性に関与し、しかもｐｏｌＩＩの
伸長反応の抑制に関わる新規な蛋白質因子を明らかにす
ることにより、ｐｏｌＩＩの伸長反応の制御機構を解明
することが求められている。 【解決手段】 本発明によれば、真核生物の細胞におけ
るｐｏｌＩＩ伸長反応を制御することが可能で、癌治療
に有効と考えられるＮＥＬＦ、該ＮＥＬＦを構成するサ
ブユニット蛋白質、該サブユニット蛋白質をコードする
ＤＮＡ、該サブユニット蛋白質を認識する抗体を提供す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本文中で用いる略号および該略号の意味を
以下に記載する。 ＣＴＤ：Ｃ−ターミナルドメイン（C-terminal domai
n） ＤＥＡＥ：ディエチルアミノエチル（diethylaminoethy
l） ＤＲＢ：5,6-dichloro-β-D-ribofuranosylbenzimidazo
le（図１参照） ＤＳＩＦ：ＤＲＢ sensitivity-inducing factor ｄＴＴ：ジチオトレイトール（dithiothreitol） ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminet
etraacetic acid） ＥＳＴ：イクスプレスド シークエンス タグ（expres
sed sequence tag） ＨＥＰＥＳ：N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane
sulfonic acid ＨＩＶ：ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficien
cy virus） ＩＰＴＧ：isopropyl-1-thio-β-D-galactoside ＬＴＲ：long terminal repeat ＭＥＭ：minimal essential medium ＮＥＬＦ：negative elongation factor ＮＴＰ：ヌクレオシド三リン酸 ＯＲＦ：open reading frame ＰＢＳ：リン酸緩衝塩類溶液（phosphate-bufferd sali
ne） ＰＣＲ：polymerase chain reaction ＲＡＣＥ：rapid amplification of ｃＤＮＡ ends ＲＴ−ＰＣＲ：reverse transcription-ＰＣＲ ＰＭＳＦ：phenylmethylsulfonylfluoride ｐｏｌ ＩＩ：ＲＮＡポリメラーゼII Ｐ−ＴＥＦｂ：positive transcription elongation fa
ctor b ＰＶＤＦ：polyvinylidene difluoride ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodesyl sul
fate） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis） ＴＡＲ配列：trans-activation responsive region ＴＦＩＩ：transcription factor II Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
〔tris (hydroxymethyl)aminomethane〕 dhfr：ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate redu
ctase）

【０００２】

【発明の属する技術分野】本発明は、ｍＲＮＡの転写反
応におけるｐｏｌ ＩＩの伸長反応をＤＳＩＦとともに
抑制し、その伸長反応のＤＲＢ感受性に関与する蛋白
質、該蛋白質を構成するサブユニット蛋白質、該サブユ
ニット蛋白質をコードするＤＮＡ、該サブユニット蛋白
質を認識する抗体に関する。

【０００３】

【従来の技術】蛋白質をコードする遺伝子は一つの生物
の中に非常に多種類存在し、ヒトでは１０万種類にも及
ぶと考えられるが、真核生物においてこのような各遺伝
子からのｍＲＮＡの転写反応は、普遍的にｐｏｌ ＩＩ
により行われている。

【０００４】ｐｏｌ ＩＩは、基本転写因子とプロモー
ター上で複合体を形成した後、転写産物の合成を開始
し、開始とともにプロモーターから離れ、遺伝子の塩基
配列に対応した転写産物の伸長反応を行う。ｐｏｌ Ｉ
Ｉと直接相互作用し、伸長反応を促進する「基本伸長因
子」が発見されたこと、伸長反応を標的とする転写調節
因子が報告されたことなどから、上記伸長反応は、ｐｏ
ｌ ＩＩだけの単純な反応ではなく、複雑に制御された
反応であることが分かってきた。

【０００５】ヌクレオシド類似体ＤＲＢは、ｐｏｌ Ｉ
Ｉによる伸長反応に特異的な阻害剤である〔Genes to C
ells, 3, 9 (1998)〕。ＤＲＢは、in vivoでの転写や低
い精製度の細胞抽出物を用いたin vitro転写系において
は転写の伸長反応を強く阻害するが、ｐｏｌ ＩＩおよ
びある程度精製した基本転写因子から再構成されたinvi
tro転写系では阻害活性を示さない〔J. Biol. Chem., 2
64, 2250 (1989）〕。このことから、ＤＲＢが直接阻害
する標的は、ｐｏｌ ＩＩや基本転写因子ではなく、未
同定な別の因子であることが予想されていた。また、Ｄ
ＲＢは遺伝子の種類に関係なくｍＲＮＡの転写を普遍的
に阻害することから、このＤＲＢの標的因子も、ｐｏｌ
ＩＩの伸長反応に普遍的な役割を果たす因子と考えら
れた。

【０００６】最近、ＤＲＢの伸長反応の阻害作用に関わ
る2つの因子、Ｐ−ＴＥＦｂとＤＳＩＦが同定された。
Ｐ−ＴＥＦｂは伸長反応を促進する「正」の因子であ
り、伸長反応をＤＲＢ感受性に誘導する因子であること
から、ＤＲＢの直接の標的だと考えられた。その後、Ｐ
−ＴＥＦｂはｃｙｃｌｉｎ Ｔ１とＣｄｋ９からなる蛋
白質リン酸化酵素であり、Ｐ−ＴＥＦｂがｐｏｌ ＩＩ
のＣＴＤをＤＲＢ感受性リン酸化することが判明した
〔J. Biol. Chem., 271, 27176 (1996)、Genes & Devel
opment, 11, 2622 (1997)〕。以前から転写産物の合成
の開始から伸長反応にかけて、ｐｏｌ ＩＩのＣＴＤは
高度にリン酸化されることが知られており、Ｐ−ＴＥＦ
ｂはＣＴＤのリン酸化を介して伸長反応を促進すると考
えられているが、その機構は不明である。

【０００７】一方ＤＳＩＦも伸長反応のＤＲＢ感受性を
誘導する蛋白性因子であるが、伸長反応を抑制する
「負」の因子である。ＤＳＩＦはｐ１６０とｐ１４とい
う２つのサブユニットから構成され、これらのサブユニ
ットはヒトｃＤＮＡクローニングの結果、それぞれ酵母
の転写因子Ｓｐｔ５、Ｓｐｔ４のホモログであることが
判明した〔Genes & Development, 12, 343 (1998)、Gen
es & Development, 12, 357 (1998)〕。しかしながら、
ＤＳＩＦ単独ではｐｏｌ ＩＩの伸長反応を抑制するこ
とができないため、ｐｏｌ ＩＩの伸長反応のＤＲＢ感
受性に関与し、かつｐｏｌ ＩＩの伸長反応の抑制に関
わる他の因子の存在が示唆されていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ｍＲＮＡの転写でのｐ
ｏｌ ＩＩ伸長反応において、そのＤＲＢ感受性に関与
し、しかもｐｏｌ ＩＩの伸長反応の抑制に関わる新規
な蛋白質因子を明らかにすることにより、ｐｏｌ ＩＩ
の伸長反応の制御機構を解明することが求められてい
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、精製した各
種基本転写因子およびｐｏｌ ＩＩを用いて、in vitro
で真核生物の転写系を再構成した系を用いて、転写反応
のＤＲＢ感受性を解析することにより、ＤＳＩＦ、Ｐ−
ＴＥＦｂ以外にｐｏｌ ＩＩの伸長反応におけるＤＲＢ
感受性に関与する細胞中の蛋白質因子の存在を発見し、
細胞抽出液より該蛋白質を精製することにより発明を完
成させた。

【００１０】即ち、本発明は以下の（１）〜（１５）に
関する。 （１）ｐｏｌ ＩＩが関与する遺伝子の転写反応におい
て、ｐｏｌ ＩＩの伸長反応をＤＳＩＦ存在下で抑制す
る活性を有する蛋白質（negative elongation factor：
以下、ＮＥＬＦと略す）。

【００１１】（２）蛋白質が、サブユニット蛋白質で構
成された蛋白質である、上記（１）記載の蛋白質。 （３）サブユニット蛋白質が、配列番号１０〜２３のい
ずれかに記載のアミノ酸配列を含む、上記（２）記載の
蛋白質。

【００１２】（４）サブユニット蛋白質が、配列番号
２、４、６および８記載のアミノ酸配列から選ばれるア
ミノ酸配列を有する蛋白質または該蛋白質の変異体であ
る、上記（２）記載の蛋白質。 ここで、配列番号２、４、６および８記載のアミノ酸配
列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質の変異体と
は、該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮ
ＥＬＦを構成する他のサブユニット蛋白質と共同するこ
とによりＮＥＬＦの有する活性を有する蛋白質を構成す
ることのできる蛋白質を意味する。

【００１３】上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加
は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により
実施することができる。かかる１若しくは数個のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有す
るポリペプチドは、Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, SecondEdition, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press (1989)（以下、モレキュラークローニング 第
２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biolo
gy, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-199
7)（以下、カレント プロトコルイン モレキュラ バイ
オロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487
(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(198
2)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research,
13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 4
88 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,5662 (19
84)、Science, 224, 1431 (1984)、PCT WO85／00817(19
85) 、Nature, 316, 601 (1985)等に記載の方法に準じ
て調製することができる。

【００１４】（５）サブユニット蛋白質が、上記（４）
記載の蛋白質のＮ末端にFlagタグペプチドを付加した蛋
白質である、上記（２）記載の蛋白質。 （６）サブユニット蛋白質が、配列番号９記載のアミノ
酸配列を有する蛋白質である、上記（５）記載の蛋白
質。

【００１５】（７）配列番号１０〜２３のいずれかに記
載のアミノ酸配列を含む蛋白質。 （８）配列番号２、４、６および９記載のアミノ酸配列
から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質または配列番
号２、４、６および８記載のアミノ酸配列から選ばれる
アミノ酸配列を有する蛋白質の変異体。

【００１６】上記の蛋白質の変異体は、上記（４）の蛋
白質の変異体と同義である。 （９）上記（７）または（８）記載の蛋白質をコードす
るＤＮＡ。 （１０）配列番号１、３および５記載の塩基配列から選
ばれる塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの変異
体。

【００１７】ここで、配列番号１、３および５記載の塩
基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡの変異体と
は、該塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ該ＤＮＡ
のコードする蛋白質が、ＮＥＬＦを構成する他のサブユ
ニット蛋白質と共同することにより、ＮＥＬＦの有する
活性を有する蛋白質を構成することのできる蛋白質とな
ることを意味する。

【００１８】上記の「ストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡ」とは、上記（９）記載ＤＮＡ、
または配列番号１、３および５記載の塩基配列から選ば
れる塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニ
ー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダ
イゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼ
ーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味
し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮ
Ａを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍ
のＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを
行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium
citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５
０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム
よりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄す
ることにより同定できるＤＮＡをあげることができる。

【００１９】ハイブリダイゼーションは、モレキュラー
クローニング 第２版、カレントプロトコル イン モレ
キュラ バイオロジー、ＤＮＡ Cloning 1: Core Techni
ques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford
University Press (1995)（以下、ＤＮＡクローニング
１と略す）等の実験書に記載されている方法に準じて行
うことができる。

【００２０】ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的
には、配列番号１、３および５記載の塩基配列から選ば
れる塩基配列を有するＤＮＡと少なくとも８０％以上の
相同性を有するＤＮＡ、好ましくは９５％以上の相同性
を有するＤＮＡをあげることができる。

【００２１】（１１）上記（９）または（１０）記載の
ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮ
Ａ。 （１２）上記（１１）記載の組換え体ＤＮＡを保有する
形質転換体。 （１３）上記（１２）記載の形質転換体を培養液中で培
養し、上記（７）または（８）記載の蛋白質を該培養物
中に生成・蓄積させ、該培養物中より該蛋白質を採取す
ることを特徴とする、該蛋白質の製造法。

【００２２】（１４）上記（７）または（８）記載の蛋
白質を認識する抗体。 （１５）上記（１４）記載の抗体を用いた、上記
（１）、（７）または（８）記載の蛋白質を免疫学的に
検出あるいは定量する方法。以下、本発明を詳細に説明
する。

【００２３】

【発明の実施の形態】なお、分子生物学的実験手法は、
断らない限りモレキュラー クローニング 第２版に記載
の方法に準じて行うことができる。 １．ＮＥＬＦの精製 本発明のＮＥＬＦは、ＤＲＢ、精製した各種基本転写因
子およびｐｏｌ ＩＩを用いて、in vitroで真核生物の
転写系を再構成した系（転写再構成系）を構築し、該系
に試験試料（例えば、細胞抽出液あるいは該細胞抽出液
からの精製産物）およびＤＳＩＦを添加してｐｏｌ Ｉ
Ｉ伸長反応のＤＲＢ感受性を解析することにより取得す
ることができる。

【００２４】転写再構成系に用いるｐｏｌ ＩＩおよび
各種基本転写因子は、真核生物の細胞核抽出液から精製
したもの、あるいは遺伝子組換え法により大腸菌あるい
は動物細胞等で生産させ精製したものを用いることがで
きる。遺伝子組換え法により生産させた蛋白質の場合
は、それぞれの基本転写因子としての活性が保持されて
いるものを用いる。遺伝子組換え法により大腸菌で生産
させ精製した転写因子として、具体的には、Genes & De
velopment, 12, 343 (1998)に記載の方法で取得された
ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦをあげることがで
きる。

【００２５】試験試料が細胞抽出液の場合、用いること
の出来る細胞抽出液として、ｐｏｌＩＩによるｍＲＮＡ
の転写が行われている真核生物の細胞由来のものであれ
ば、いずれの細胞由来のものを用いることができ、例え
ば、ヒトの細胞由来のものをあげることができる。ヒト
の細胞として、具体的にはＨｅＬａ細胞（ATCC No.CCL-
2）あげることができる。

【００２６】ＮＥＬＦの精製は、通常の蛋白質の精製法
に準じて行うことができる。例えば、ＨｅＬａ細胞抽出
液由来のＮＥＬＦは、ホスホセルロースカラムに通塔
後、０．３Ｍ ＫＣｌ濃度で溶出される画分に見出すこ
とができる。該画分をＤＥＡＥセファロースカラムに通
塔後、０．２２５Ｍ ＫＣｌで溶出することにより、Ｎ
ＥＬＦをＤＳＩＦと分離することができる。該溶出液を
さらに、HiTrap Heparinカラム、monoQカラム、フェニ
ルスーパーロースカラム、Mono S PCカラム等用いるこ
とにより、ほぼ純粋なＮＥＬＦを取得することができ
る。

【００２７】このようにして精製されたＮＥＬＦをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを用いて解析することにより、ＮＥＬＦが
数種類のサブユニットから構成されていることを確認す
ることができる。例えば、ＨｅＬａ細胞抽出液由来のＮ
ＥＬＦは、６６ｋＤａ、６１ｋＤａ、５９ｋＤａ、５８
ｋＤａ、４６ｋＤａの５種類のサブユニット蛋白質から
構成されていることがわかる。

【００２８】２．ＮＥＬＦの各サブユニットのアミノ酸
配列の決定 精製したＮＥＬＦサブユニット蛋白質の部分アミノ酸配
列は、以下のようにして決定することができる。上記の
方法で精製したＮＥＬＦ蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
け、各サブユニット蛋白質を分離し、それぞれのサブユ
ニット蛋白質を含むゲルを切り出し、該ゲルより各サブ
ユニットを単離する。

【００２９】得られた各サブユニット蛋白質を気相法プ
ロテインシークエンサーにかけることにより、Ｎ末端が
アミノ酸修飾によりブロックされてなければ、Ｎ末端か
らのアミノ酸配列を順次得ることができる。また、Ｎ末
端よりも内部のアミノ酸配列は、リジルエンドペプチダ
ーゼやトリプシン等の特異的切断点をもつエンドプロテ
アーゼで処理したり、臭化シアンによるメチオニンのＣ
末側のペプチド結合の切断等の方法により、ＮＥＬＦサ
ブユニット蛋白質が切断して生じたペプチド鎖を逆相Ｈ
ＰＬＣにより精製し、該ペプチド鎖のアミノ酸配列を同
様に気相法プロテインシークエンサーで解析することに
より、得ることができる。

【００３０】これらの部分アミノ酸配列の情報を用い
て、PIR、SwissProt等のアミノ酸配列データベース、ア
ミノ酸配列に変換したGenBank等の塩基配列データベー
スについてBlast、FastA、FrameSearch等の検索法を用
いて相同性検索を行なうことにより、該蛋白質が、既
知、新規あるいは相同性の高い蛋白質であるか確認する
ことができる。

【００３１】例えば、ＨｅＬａ細胞抽出液由来のＮＥＬ
Ｆを構成している６６ｋＤａ、６１ｋＤａ、５９ｋＤ
ａ、５８ｋＤａ、４６ｋＤａの５種類のサブユニットに
おいて、４６ｋＤａのサブユニットがＲＤ蛋白質と同一
の蛋白質であり、他のサブユニットは新規であることを
確認することができる。

【００３２】上記で得られたアミノ酸配列情報を用い、
それぞれのＮＥＬＦサブユニット蛋白質をコードするＤ
ＮＡを、以下の方法でクローニングすることができる。 ３．ＮＥＬＦサブユニット蛋白質をコードするＤＮＡの
調製 （１）ＥＳＴの塩基配列を利用したＲＴ−ＰＣＲによる
ｃＤＮＡのクローン化 新規なＮＥＬＦサブユニット蛋白質の部分アミノ酸配列
に対応する塩基配列を有するいくつかのＥＳＴを塩基配
列データベース中より検索する。該検索により相応する
ＥＳＴが見いだされ場合には、該ＥＳＴの配列から５’
側と３’側のプライマーをそれぞれデザインし、ＮＥＬ
Ｆを取得した細胞由来のｍＲＮＡ、例えば、ＨｅＬａ細
胞由来のｍＲＮＡをもとにして、ＲＴ−ＰＣＲ〔ＰＣ
Ｒ, A practical Approach, Oxford University Press
(1991)〕を行なうことによりｃＤＮＡを増幅することが
できる。

【００３３】ｍＲＮＡはチオシアン酸グアニジン−トリ
フルオロ酢酸セシウム法〔Methodsin Enzymol., 154, 3
(1987)〕、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール
・クロロホルム法〔Analytical Biochemistry, 162, 15
6 (1987)〕などの方法により全ＲＮＡを調製し、この全
ＲＮＡからオリゴ(ｄＴ)セルロース法（モレキュラーク
ローニング 第２版）等によりポリ(A)⁺ ＲＮＡとしてｍ
ＲＮＡを調製する。

【００３４】あるいは、ファストトラックｍＲＮＡ単離
キット〔Fast Track ｍＲＮＡ Isolation Kit；インビ
トロジェン（Invitrogen）社〕、クイックプレップｍＲ
ＮＡ精製キット〔Quick Prep ｍＲＮＡ Purification K
it；ファルマシア社〕等のキットを用いてＮＥＬＦを取
得した細胞から直接ｍＲＮＡを調製することもできる。

【００３５】増幅したｃＤＮＡは、pBluescript II SK
(+)（ストラタジーン社製）、pUC18（宝酒造社製）等の
クローニング用プラスミドにクローン化することができ
る。 （２）完全長ｃＤＮＡのクローン化 一般にＥＳＴの塩基配列のもとになったｃＤＮＡクロー
ンの多くは非完全長ｃＤＮＡクローンであるので、上記
のようにして得られたｃＤＮＡ断片も完全長でなく、完
全長のｃＤＮＡはさらに5'側および3'側に延長部分があ
ることが充分考えられる。完全長のｃＤＮＡはＲＡＣＥ
法〔Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 85, 8998 (1988)〕ある
いはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより調製
することができる。

【００３６】ＲＡＣＥ法は、ｍＲＮＡから通常のオリゴ
ｄＴプライマーで２本鎖ｃＤＮＡを合成後、ｃＤＮＡの
両端にアダプターを付加する。このアダプターの塩基配
列に対応するプライマーと、ＲＴ−ＰＣＲにより得られ
たｃＤＮＡの５’側および３’側の塩基配列をもとにし
たプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりさらに
５’側および３’側のｃＤＮＡ断片を取得する方法であ
る。

【００３７】得られた断片についてＤＮＡシークエンサ
ーを用いて塩基配列を決定した後、５’側ｃＤＮＡ断片
の５’端の塩基配列と３’側ｃＤＮＡ断片の３’端の塩
基配列は、完全長ｃＤＮＡの５’端および３’端の塩基
配列と考えられるので、この塩基配列をもとにしたプラ
イマーを設計し、ＮＥＬＦを取得した細胞のｍＲＮＡか
ら再度ＲＴ−ＰＣＲすることで、全長ｃＤＮＡを増幅す
ることができる。この増幅断片はpBluescript II SK(+)
等のクローニング用プラスミドにクローン化することが
できる。

【００３８】ｃＤＮＡライブラリーは、ＮＥＬＦを取得
した細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞からｃＤＮＡを調製
し、適当なベクターに組み込み、宿主細胞に導入するこ
とにより作製することができる。具体的なｃＤＮＡライ
ブラリー作製法としては、モレキュラー クローニング
第２版、ＤＮＡクローニング１等に記載された方法、あ
るいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid Syst
em for ｃＤＮＡ Synthesis and Plasmid Cloning（ラ
イフ・テクノロジーズ社製）やZAP-ｃＤＮＡ Synthesis
Kit〔ストラタジーン社〕を用いる方法等をあげること
ができる。

【００３９】ｃＤＮＡライブラリーを作成するためのク
ローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立
複製できるファージベクター、プラスミドベクターを使
用することができる。具体的には、pBluescript II SK
(-)〔ストラタジーン社〕、Lambda ZAP II（ストラタジ
ーン社製）、λgt11〔ＤＮＡ Cloning, A Practical Ap
proach, 1, 49 (1985)〕等をあげることができる。

【００４０】宿主微生物としては、大腸菌Escherichia
coliに属する微生物であればいずれも用いることができ
る。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue MRF'〔ス
トラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、Esch
erichia coli Y1090〔Science, 222, 778 (1983)〕等を
用いることができる。

【００４１】以上のように調製したｃＤＮＡライブラリ
ーに対して、ＲＴ−ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡを放射性
同位体やジゴキシゲニン等で標識したものをプローブと
してコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラーク
ハイブリダイゼーションを行うことより完全長ｃＤＮＡ
をクローン化することができる。

【００４２】（３）ｃＤＮＡの塩基配列の決定と相同性
解析 （１）（２）の方法で得られたｃＤＮＡクローンは、Ｄ
ＮＡシークエンサーを用いて全塩基配列を決定すること
ができる。該塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することに
より該ｃＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列を決
定することができる。該アミノ酸配列中に精製したサブ
ユニット蛋白質のアミノ酸配列が存在すれば、取得した
ｃＤＮＡクローンがサブユニット蛋白質のｃＤＮＡクロ
ーンであることを確認することができる。

【００４３】得られたｃＤＮＡの塩基配列あるいはコー
ドする蛋白質のアミノ酸配列について、GenBank、EMBL
等の塩基配列データベースあるいはPIR、GenPept、Swis
sProt等のアミノ酸配列データベースを検索することに
より、既知、新規あるいは相同性のある遺伝子であるか
確認することができる。

【００４４】４．ＮＥＬＦサブユニット蛋白質の生産 ３．で調製した本発明のＮＥＬＦサブユニット蛋白質の
ＤＮＡを宿主細胞中で発現させ、製造するために、モレ
キュラー クローニング 第２版、ＤＮＡクローニング１
等に記載された方法を用いることができる。

【００４５】即ち、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質のＤＮ
Ａを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した
組換え体ベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導
入することにより、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質を発現
する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養すること
により、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質を製造することが
できる。

【００４６】発現ベクターとしては、宿主細胞において
自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、宿主
細胞中でサブユニット蛋白質のＤＮＡからｍＲＮＡを転
写できるプロモーターを含有しているものが用いられ
る。宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆
虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるも
のであればいずれも用いることができる。また、動物個
体や植物個体を用いることができる。

【００４７】動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベ
クターとしては、宿主動物細胞で転写を行なうプロモー
ター、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質のＤＮＡ、転写の終
止と転写物のポリアデニル化のシグナルの配列を含有し
ているものが用いられる。またベクターの作製や維持を
容易にするため、E. coli内でも自律複製と遺伝子導入
マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが望ま
しい。プロモーターとしては、動物細胞中で転写を行な
えるものであればいずれも用いることができるが、SV40
の初期プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CM
V）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーターお
よびエンハンサー、ラウス肉腫ウイルス、ヒトＴ細胞白
血病ウイルスＩ、モロニーマウス白血病ウイルス等レト
ロウイルスのロング・ターミナル・リピート（long ter
minal repeat）などのウイルス由来の配列、あるいはメ
タロチオネイン遺伝子やβ−アクチン遺伝子、伸長因子
−１などの動物細胞由来の遺伝子のプロモーター等をあ
げることができる。

【００４８】宿主染色体ＤＮＡにＮＥＬＦサブユニット
蛋白質のＤＮＡが組み込まれた恒常的なＮＥＬＦサブユ
ニット蛋白質発現細胞は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン
等の薬剤に対する耐性遺伝子を発現できる配列を含むＮ
ＥＬＦサブユニット蛋白質発現ベクターを宿主細胞に導
入し、薬剤の存在下で培養することにより選択すること
ができる。また、宿主細胞中でのＮＥＬＦサブユニット
蛋白質の生産量を上昇させるために、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ（dhfr）遺伝子を発現できるような配列を含む
ＮＥＬＦサブユニット蛋白質恒常的発現ベクターを宿主
細胞に導入し、dhfr阻害剤であるメトトレキセート（me
thotrexate）の濃度を段階的に上げながら培養すること
により、dhfr遺伝子とともにＮＥＬＦサブユニット蛋白
質のＤＮＡのコピー数を増幅させることもできる。この
dhfr遺伝子を用いた遺伝子増幅を行なう場合の宿主細胞
としては、dhfr遺伝子が機能していない細胞、例えばCH
O/dhfr-（ATCC:CRL-9096）などを用いる。

【００４９】上記のＮＥＬＦサブユニット蛋白質発現ベ
クターの作製に用いられる具体的なベクターとして、例
えば、pAGE107〔特開平3-22979、Cytotechnology, 3, 1
33,(1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8〔Natu
re, 329, 840, (1987)〕、pｃＤＮＡ3.1(+)（インビト
ロジェン社製）、pREP4（インビトロジェン社製）、pBK
-RSV（ストラタジーン社製）、pSVK3（アマシャム・フ
ァルマシア・バイオテク社製）、pｃＤＮＡ1.1/Amp（イ
ンビトロジェン社製）、pAMo〔J. Biol. Chem., 268, 2
2782 (1993)〕等があげられる。

【００５０】宿主細胞としては、ヒト細胞であるＨｅＬ
ａ細胞やNamalwa細胞、SP2/0、NS0等のマウス・ミエロ
ーマ細胞、YB2/0等のラット・ミエローマ細胞、COS-1、
COS-7等のアフリカミドリザル腎臓細胞、293等のヒト胎
児腎臓細胞、ハムスターの細胞であるCHO細胞、BHK細胞
等をあげることができる。

【００５１】組換えベクターの導入方法としては、動物
細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いるこ
とができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytote
chnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特
開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることがで
きる。

【００５２】昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合は、
バキュロウイルス発現系〔Baculovirus Expression Vec
tors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Compa
ny,New York (1992)、Bio/Technology, 6, 47 (1988)〕
が用いられる。即ち、トランスファーベクターと呼ばれ
るベクターにＮＥＬＦサブユニット蛋白質のＤＮＡを挿
入した後、該ベクターとバキュロウイルスを昆虫細胞に
同時に導入し、強力なプロモーターであるポリヘドリン
遺伝子プロモーター下にＮＥＬＦサブユニット蛋白質の
ＤＮＡが挿入された組換えバキュロウイルスを相同組換
えによって作製した後、この組換えバキュロウイルスを
再度昆虫細胞に感染させることにより、ＮＥＬＦサブユ
ニット蛋白質を発現することができる。

【００５３】バキュロウイルスとしてはAutographa cal
ifornica 核多角体病ウイルス、カイコ核多角体病ウイ
ルス等が用いられる。昆虫細胞としてはSpodoptera fru
giperdaの細胞であるSf9およびSf21〔Baculovirus Expr
ession Vectors, A Laboratory Manual, New York (199
2)〕、Trichoplusia niの細胞であるHigh 5（インビト
ロジェン社製）等を用いることができる。また、カイコ
幼虫体をそのまま用いることもできる。トランスファー
ベクターには、ポリヘドリンプロモーターおよび相同組
換えを起こさせるためのバキュロウイルス由来の配列、
ベクターの維持・増殖や外来遺伝子の組み込み等の遺伝
子操作を大腸菌内で行なうための配列（大腸菌での自律
複製可能な配列および薬剤耐性遺伝子）が含まれてお
り、具体的にはpVL1392、pVL1393、pBlueBac4（ともに
インビトロジェン社製）等があげられる。

【００５４】動物個体を用いてＮＥＬＦサブユニットを
生産することもできる。例えば、公知の方法〔American
Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996)、A
merican Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1
996)、Bio/Technology, 9, 830 (1991)〕に準じて、Ｎ
ＥＬＦサブユニット蛋白質のＤＮＡを導入した動物中に
ＮＥＬＦサブユニット蛋白質を生産することができる。

【００５５】プロモーターとしては、動物で発現できる
ものであればいずれも用いることができるが、例えば、
乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモ
ーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリン
プロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が
好適に用いられる。

【００５６】植物細胞または植物個体を宿主として用い
る場合には、公知の方法〔組織培養, 20 (1994)、組織
培養, 21 (1995)、Trends in Biotechnology, 15, 45
(1997)〕に準じてＮＥＬＦサブユニット蛋白質を生産す
ることができる。ＮＥＬＦサブユニット蛋白質のＤＮＡ
の発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で遺
伝子を発現できるものであればいずれも用いることがで
き、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の
35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあ
げることができる。また、プロモーターと発現させるＮ
ＥＬＦサブユニット蛋白質のＤＮＡとの間に、トウモロ
コシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を
挿入することにより、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質のＤ
ＮＡの発現効率をあげることもできる。

【００５７】宿主細胞としては、ポテト、タバコ、トウ
モロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、小麦、大
麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあ
げることができる。組換えベクターの導入方法として
は、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも
用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agro
bacterium）、エレクトロポレーション法〔Cytotechnol
ogy, 3, 133 (1990)〕、パーティクルガン（遺伝子銃）
を用いる方法等をあげることができる。

【００５８】ＮＥＬＦサブユニット蛋白質のＤＮＡを導
入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用
いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した
植物細胞を再分化させることにより、ＮＥＬＦサブユニ
ット蛋白質のＤＮＡが導入された植物個体（トランスジ
ェニック植物）を造成することもできる。

【００５９】細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる
場合は、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質発現ベクターは宿
主原核生物中で自律複製可能であり、リボソーム結合配
列を有するプロモーターの下流にＮＥＬＦサブユニット
蛋白質のＤＮＡが配置されたものを用いる。リボソーム
結合配列と開始コドンとの間は適当な距離（例えば、大
腸菌宿主のベクターの場合６〜１８塩基）に調節されて
いることが好ましい。

【００６０】必ずしも必要ではないが、ＮＥＬＦサブユ
ニット蛋白質のＤＮＡの直下に転写終結配列を配置する
方が好ましい。また、形質転換体の選択のため、薬剤耐
性遺伝子等のマーカーとなる遺伝子を発現する配列を含
むようにする。プロモーターとしては、宿主細胞中で発
現できるものであればいかなるものでもよい。例えば大
腸菌を宿主とした場合は、trpプロモーター（Ｐtrp）、
lacプロモーター（Ｐlac）、P_Lプロモーター、T7プロモ
ーター、Ｐ_Rプロモーター等の、大腸菌やファージ等に
由来するプロモーター等をあげることができる。またＰ
trpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ｘ２）、tac
プロモーター、T7lacプロモーター、let Iプロモーター
のように人為的に設計改変されたプロモーター等も用い
ることができる。枯草菌を宿主とした場合は、枯草菌の
ファージであるSPO1やSPO2のプロモーター、PenPプロモ
ーター等をあげることができる。

【００６１】発現ベクターとしては、例えば、pSE280
（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社
製）、pQE-8（キアゲン社製）、pKYP200〔Agric. Biol.
Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Che
m., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-)
（ストラタジーン社製）、pKK223-3（アマシャム・ファ
ルマシア・バイオテク社製）、pGEX-5X-3（アマシャム
・ファルマシア・バイオテク社製）、pET14（ノバジェ
ン社製）等を例示することができる。

【００６２】宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラ
チア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス
属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-B
lue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli D
H1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY32
76、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM10
9、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.4
9、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、
Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liq
uefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtili
s、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammm
oniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC1406
8、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Coryn
ebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium g
lutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum AT
CC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC1387
0、Microbacterium ammoniaphilumATCC15354、Pseudomo
nas sp. D-0110等をあげることができる。

【００６３】組換えベクターの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Nu
cleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、カルシウムイ
オンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,
2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-248394
2）、Gene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Gen
etics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることが
できる。

【００６４】酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベ
クターとしては、宿主酵母で転写を行なうプロモータ
ー、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質のＤＮＡ、転写の終止
配列および酵母での形質転換マーカーとなる遺伝子、た
とえば薬剤耐性遺伝子やTRP1、HIS3、LEU2等のアミノ酸
合成系の遺伝子を発現できる配列を含有しているものが
用いられる。また、発現ベクターの作製や維持を容易に
するため、E. coli内でも自律複製と遺伝子導入マーカ
ーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが望ましい。

【００６５】プロモーターとしては、酵母中で転写を行
なえるものであればいずれのものを用いてもよく、例え
ばSaccharomyces cerevisiaeのアルコールデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子ADH1やガラクトキナーゼ遺伝子GAL1、GAL10
等のプロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモータ
ー、GAPプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモー
ター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター、Pichia
pastorisのアルコールオキシダーゼ遺伝子AOX1のプロモ
ーター等が用いられる。

【００６６】宿主細胞としては、サッカロマイセス属、
シゾサッカロマイセス属、ピヒア属等に属する酵母菌株
をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cere
visiae、Schizosaccharomyces pombe、Pichia pastoris
等をあげることができる。組換えベクターの導入方法と
しては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも
用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法
〔Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプ
ラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81, 4889 (198
4)〕、酢酸リチウム法〔Journal of Bacteriology, 15
3, 163 (1983)〕等をあげることができる。

【００６７】本発明のＮＥＬＦサブユニット蛋白質のＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、
動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常
の培養方法に従って培養し、ＮＥＬＦサブユニット蛋白
質を生成蓄積させ、該培養物よりＮＥＬＦサブユニット
蛋白質を採取することにより、ＮＥＬＦサブユニット蛋
白質を製造することができる。

【００６８】動物細胞を宿主とした形質転換体を培養す
る培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地
〔The Journal of the American Medical Association,
199,519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 5
01 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、
199培地〔Proceeding of the Society for the Biologi
cal Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎
児血清等を添加した培地等を用いることができる。必要
に応じてペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質
を培地に添加してもよい。

【００６９】培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、
５％ＣＯ₂存在下等の条件下で１〜７日間行う。昆虫細
胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地
としては、一般に使用されているTNM-FH培地〔ファーミ
ンジェン（Pharmingen）社製〕、Sf-900II SFM培地（ラ
イフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405
〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ（JRH Bioscien
ces）社製〕、Grace's Insect Medium〔Nature, 195, 7
88 (1962)〕等を用いることができる。

【００７０】培養条件は、ｐＨ６〜７、培養温度２５〜
３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。ま
た、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質
を培地に添加してもよい。形質転換体が動物個体または
植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽
培し、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質を生成蓄積させ、該
動物個体または植物個体よりＮＥＬＦサブユニット蛋白
質を採取することにより、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質
を製造することができる。

【００７１】即ち、動物個体の場合、例えば、ＮＥＬＦ
サブユニット蛋白質のＤＮＡを保有する非ヒトトランス
ジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードす
るＮＥＬＦサブユニット蛋白質を該動物中に生成・蓄積
させ、該動物中よりＮＥＬＦサブユニット蛋白質を採取
することにより、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質を製造す
ることができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、
例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。

【００７２】植物個体の場合、例えば、ＮＥＬＦサブユ
ニット蛋白質のＤＮＡを保有するトランスジェニック植
物を栽培し、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質を該植物中に
生成蓄積させ、該植物中よりＮＥＬＦサブユニット蛋白
質を採取することにより、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質
を製造することができる。

【００７３】大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核
生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地と
しては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類
等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地で
あれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

【００７４】炭素源としては、該生物が資化し得るもの
であればよく、グルコース、フラクトース、スクロー
ス、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン
加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機
酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を
用いることができる。

【００７５】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム
塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌
体、およびその消化物等を用いることができる。

【００７６】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的
条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養期
間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０
〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の
酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア
などを用いて行う。必要に応じて、培養期間中にアンピ
シリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加し
てもよい。

【００７７】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
ときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加し
てもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベ
クターで形質転換した微生物を培養するときにはＩＰＴ
Ｇ等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形
質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリ
ル酸等を培地に添加してもよい。

【００７８】上記形質転換体の培養物中に蓄積したＮＥ
ＬＦサブユニット蛋白質を単離精製するには、以下のよ
うな通常の蛋白質の単離精製法を用いればよい。ＮＥＬ
Ｆサブユニット蛋白質が細胞外に分泌される場合には、
培地中にＮＥＬＦサブユニット蛋白質が蓄積する。従っ
て培養終了後、遠心分離等の手法により細胞を含まない
培地のみを回収する。該培地から、通常の蛋白質の単離
精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩
法、有機溶媒による沈殿法、DEAEセファロース、DIAION
HPA-75（三菱化成社製）、Mono-Q（アマシャム・ファ
ルマシア・バイオテク社製）等のレジンを用いた陰イオ
ン交換クロマトグラフィー法、SPセファロース（アマシ
ャム・ファルマシア・バイオテク社製）等のレジンを用
いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファ
ロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水
性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、
アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォー
カシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を
単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることが
できる。。

【００７９】ＮＥＬＦサブユニット蛋白質が、形質転換
体の細胞内に蓄積する場合には、培養終了後の培養物か
ら、形質転換体の細胞を遠心分離等の手法により回収
し、緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス
等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。ＮＥＬＦ
サブユニットが細胞内で溶解状態で存在する場合には、
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清
から、上記の培地からの精製単離と同様にして精製標品
を得ることができる。また、ＮＥＬＦサブユニット蛋白
質が細胞内に不溶体を形成して存在する場合は、該無細
胞抽出液を遠心分離後、沈殿画分としてＮＥＬＦサブユ
ニット蛋白質の不溶体を回収する。このＮＥＬＦサブユ
ニット蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化した後、
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質
変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に
希釈あるいは透析し、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質を正
常な立体構造に復元させた後、上記と同様の単離精製法
により精製標品を得ることができる。

【００８０】また、公知の方法〔J. Biomolecular NM
R， 6,129-134、Science,242,1162-1164、J.Biochem.,
110, 166-168 (1991)〕に準じて、in vitro転写・翻訳
系を用いてＮＥＬＦサブユニット蛋白質を生産すること
ができる。精製したＮＥＬＦサブユニット蛋白質の構造
解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝
子クローニングのための蛋白質構造解析（平野久著、東
京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施
可能である。

【００８１】５．ＮＥＬＦサブユニット蛋白質を認識す
る抗体の調製 （１）ポリクローナル抗体の調製 上記４．に記載の方法により取得したＮＥＬＦサブユニ
ット蛋白質の全長または部分断片ポリペプチドを抗原と
して用い、動物に投与することによりポリクローナル抗
体を作製することができる。

【００８２】投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラッ
ト、マウス、ハムスター等を用いることができる。該抗
原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好まし
い。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘ
モシアニン（keyhole limpet haemocyanin）や牛チログ
ロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原
とするのが望ましい。

【００８３】該抗原の投与は、1 回目の投与の後１〜２
週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼
底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応
することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ELISA
法）：医学書院刊 1976年、Antibodies-A Laboratory M
anual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (198
8)〕等で確認する。

【００８４】免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な
抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血
清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取
得することができる。分離、精製する方法としては、遠
心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩
析、カプリル酸沈殿〔Antibodies,A Laboratory Manua
l,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、または
ＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、
プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム
等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合
わせて処理する方法があげられる。

【００８５】（２）モノクローナル抗体の調製 (2-1)抗体産生細胞の調製 上記(1)において、免疫に用いた抗原に対し、その血清
が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源
として供する。

【００８６】該抗体価を示したラットに抗原物質を最終
投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭ
ＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほ
ぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清
を捨てる。

【００８７】得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化
アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理
し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得ら
れた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。 (2-2)骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した
株化細胞を使用する。

【００８８】例えば、8-アザグアニン耐性マウス（BALB
/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)〔Curr. Top
ics Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978)、Eur. J. Imm
unol.,6, 511 (1976)〕、SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 2
76, 269 (1978)〕、P3-X63-Ag8653(653)〔J. Immunol.,
123, 1548 (1979)〕、P3-X63-Ag8(X63)〔Nature, 256,
495 (1975)〕等を用いることができる。これらの細胞
株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地
にグルタミン（1.5ｍＭ）、２−メルカプトエタノール
（５×１０^-5Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍ
ｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０
％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに
８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で
継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養
し、融合には該細胞を２×１０⁷個以上用いる。

【００８９】(2-3)ハイブリドーマの作製 (2-1)で取得した抗体産生細胞と(2-2)で取得した骨髄腫
細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム
１．８３ｇ、リン酸一カリウム ０．２１ｇ、食塩 ７．
６５ｇ、蒸留水 １リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄
し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：
１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分
離した後、上清を捨てる。

【００９０】得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、
該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０⁸抗体産生
細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（Ｐ
ＥＧ−１０００） ２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を
０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地
１〜２ｍｌを数回添加する。

【００９１】添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍ
ｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５
分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細
胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込
み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキ
サンチン（１０^-4Ｍ）、チミジン（１．５×１０^-5Ｍ）
およびアミノプテリン（４×１０^-7Ｍ）を加えた培地〕
１００ｍｌ中に懸濁する。

【００９２】該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００
μｌ／穴ずつ分注し、５％ ＣＯ₂インキュベーター中、
３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一
部をとりアンチボディイズ〔Antibodies-A LaboratoryM
anual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapte
r14 (1988)〕等に述べられている酵素免疫測定法によ
り、上記抗体産生細胞を取得するために、免疫に用いた
抗原に特異的に反応するハイブリドーマを選択する。

【００９３】酵素免疫測定法の具体的例として、以下の
方法をあげることができる。免疫の際、抗原に用いた本
発明のポリペプチドの全長または部分断片精製標品を適
当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もし
くは後述の(2-4)で得られる精製抗体を第一抗体として
反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学
発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットイ
ムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた
反応を行ない、本発明のポリペプチドに特異的に反応す
るものを本発明のポリペプチドに対するモノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。

【００９４】該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法に
よりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地
（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回
目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認
められたものを本発明のポリペプチドに対するモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ株として選択す
る。

【００９５】(2-4)モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Pristane）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２
週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌード
マウスに、(2-3)で取得した本発明のポリペプチドに対
するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞
５〜２０×１０⁶細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜
２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。

【００９６】該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、
３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去す
る。得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と
同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得すること
ができる。

【００９７】抗体のサブクラスの決定は、マウスモノク
ローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクロー
ナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、
ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出す
る。６．ＮＥＬＦサブユニット蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、ＮＥＬＦサブユニット蛋白質、ＮＥＬＦ蛋白質、Ｎ
ＥＬＦあるいはＮＥＬＦサブユニット蛋白質を認識する
抗体の利用 （１）ＮＥＬＦサブユニット蛋白質のＤＮＡを用いてＮ
ＥＬＦサブユニット蛋白質のｍＲＮＡを検出、定量する
ことができる。

【００９８】具体的には、ヒト組織や細胞からＲＮＡを
調製し、このＲＮＡに対して、標識したＮＥＬＦサブユ
ニット蛋白質のＤＮＡをプローブとしたノーザンブロッ
トハイブリダイゼーションや、ＮＥＬＦサブユニット蛋
白質のＤＮＡの塩基配列に基づいたオリゴヌクレオチド
をプライマーにしたＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、Ｎ
ＥＬＦサブユニット蛋白質の発現している組織や発現時
期の検出・定量および種々の刺激によるＮＥＬＦサブユ
ニット蛋白質の発現誘導の有無等を調べることができ
る。

【００９９】（２）ＮＥＬＦサブユニット蛋白質のＤＮ
Ａを用い、４．に記載した方法により、ＮＥＬＦサブユ
ニット蛋白質を生産し取得することができる。細胞から
各サブユニット蛋白質を精製する場合に比べ、他のサブ
ユニット蛋白質や因子の混入がない、より純粋なＮＥＬ
Ｆサブユニット蛋白質を調製できるため、in vitroでＮ
ＥＬＦを再構成する系を作製できる。この系を用いるこ
とにより、個々のサブユニットの機能をより明確に調べ
ることが可能となる。

【０１００】（３）癌発生にはｃ−Ｍｙｃなどの癌遺伝
子の異常な高発現が関与している場合が多い。ｃ−Ｍｙ
ｃの発現には転写伸長段階の制御が重要であるとの報告
もある〔EMBO J., 11, 1085 (1992)、Genes Dev., 9, 5
59 (1995)〕。ＮＥＬＦはｐｏｌ ＩＩの伸長反応を普遍
的に抑制することから、ＮＥＬＦとＤＳＩＦを発現でき
るような遺伝子治療用ベクターを癌細胞に特異的に導入
することができれば、癌細胞の増殖を抑制することがで
き、癌の治療を行うことができる。

【０１０１】（４）ＤＲＢはＴａｔによるＨＩＶの転写
活性化を阻害することが報告されている。従って、ＤＲ
Ｂの作用に関わるＮＥＬＦもまた、Ｔａｔの作用に関与
している可能性があるため、ＮＥＬＦ蛋白質あるいはＮ
ＥＬＦを発現する遺伝子治療用ベクターはＨＩＶをはじ
めとするウイルスの増殖を抑制する可能性がある。

【０１０２】また、ＮＥＬＦの発現量を、（１）の方法
によりｍＲＮＡレベルあるいは、５．記載の抗体を用い
て蛋白レベルで測定することにより、ウイルスの増殖状
態を診断できる可能性がある。 （５）ＮＥＬＦサブユニット蛋白質を抗原として用い、
５．に記載の方法によりＮＥＬＦサブユニット蛋白質お
よびＮＥＬＦを認識する抗体を製造することができる。

【０１０３】（６）５．記載の抗体を用いてＮＥＬＦあ
るいはＮＥＬＦサブユニットを検出することができる。
具体的にはマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳ
Ａ法や蛍光抗体法、イムノブロット法、免疫組織染色等
の検出法をあげることができる。

【０１０４】（７）５．記載の抗体を用いてＮＥＬＦあ
るいはＮＥＬＦサブユニットを定量することができる。
具体的には、ＮＥＬＦの定量の場合、液相中でＮＥＬＦ
と反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノ
クローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、
¹²⁵I等の放射性同位体で標識したＮＥＬＦとＮＥＬＦを
認識する抗体を用いるラジオイムノアッセイ法等をあげ
ることができる。

【０１０５】（８）５．記載の抗体を用いて、ＮＥＬＦ
の精製を容易に行うことができる。即ち、液相中でＮＥ
ＬＦと反応する抗体をカラムに固定化したアフィニティ
ーカラムを作製し、精製に利用する。 （９）配列番号９に示した、ＦｌａｇタグペプチドをＮ
末に付加したＲＤ蛋白質を動物細胞に発現させることに
より、活性を保持したままＮＥＬＦをＦｌａｇタグペプ
チドで標識することができ、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるこ
とにより、細胞からＮＥＬＦを非常に容易に精製でき
る。

【０１０６】（１０）ＮＥＬＦとＤＳＩＦはｐｏｌ Ｉ
Ｉを直接抑制する活性を持っているので、ｐｏｌ ＩＩ
の伸長反応を制御するツールとなる。 （１１）ＮＥＬＦ蛋白質を用いたin vitro転写再構成系
は、ＮＥＬＦ蛋白質に作用し、ｐｏｌ ＩＩの伸長反応
に影響する薬剤のスクリーニングに用いることができ
る。

【実施例】

【０１０７】実施例１ ＤＲＢ感受性を誘導する因子Ｎ
ＥＬＦの存在の発見 精製した分子からなるin vitro転写再構成系を確立し、
そのＤＲＢ感受性を解析することによりＤＲＢ感受性の
分子的な解明を行なった。in vitro転写再構成系は、Ｈ
ｅＬａ細胞の核抽出液を材料として和田らの方法〔Gene
s & Development, 12, 343 (1998)〕に従って以下のよ
うにして構築した。

【０１０８】（１）ＨｅＬａ細胞の核抽出液からの各基
本転写因子およびｐｏｌ ＩＩの調製 ＨｅＬａ細胞の核抽出液をDignamらの論文〔Nucleic Ac
ids Res., 11, 1475 (1983)〕の方法に従って調製し、
ホスホセルロースカラムＰ１１に通塔し、素通り画分
（以降、Ｐ．１と呼ぶ。）を回収後、０．３ＭのＫＣｌ
ついで１．０ＭのＫＣｌを用い段階溶出を行い、それぞ
れの溶出画分（以降、それぞれＰ．３、Ｐ１．０と呼
ぶ。）を回収した。上記論文で記載のように、ＤＳＩＦ
はＰ．１およびＰ．３に回収され、ほとんどの基本転写
因子とｐｏｌ ＩＩはＰ１．０に回収された。

【０１０９】Ｐ１．０を、ＨＧＥ緩衝液〔２０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、２０％ グリセロール、０．
２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ ＤＴＴよりなる〕に
０．１Ｍ ＫＣｌを添加した緩衝液〔以下、ＨＧＥ．１
と呼ぶ。同様にＨＧＥにｘ ＭのＫＣｌを添加した緩衝
液をＨＧＥｘ（ｘはＫＣｌのモル濃度を表す数字）と呼
ぶ。〕に対して透析した。

【０１１０】得られた透析液を、予めＨＧＥ．１で平衡
化した６０ｍｌのDEAE Sepharose FFカラム（アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテク社製)に通塔した。該カ
ラムをＨＧＥ．１で洗浄後、ＨＧＥ.3、ＨＧＥ1.0を用
いて蛋白質の溶出を行った。

【０１１１】ＨＧＥ.3で溶出された画分を１．０Ｍ 硫
酸アンモニウムを含んだＨＧＥ緩衝液に対して透析し、
得られた透析液を、フェニルスーパーロース（Phenyl S
uperose）HR5/5カラム（アマシャム・ファルマシア・バ
イオテク社製；容量１．０ｍｌ）に通塔し、素通り画分
（以下、φＦＴと呼ぶ。）を回収した。

【０１１２】通塔後、１．０Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウム
直線勾配のＨＧＥ緩衝液１５ｍｌを用いて蛋白質を溶出
し、該溶出液を分画しながら回収した。各画分に対し、
基本転写因子それぞれに対する抗体を用いたイムノブロ
ッティングを行なうことにより、該画分に含まれる基本
転写因子の分布を追跡した。

【０１１３】ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＨおよびｐｏｌ Ｉ
ＩはφFTに、ＴＦＩＩＥあるいはＴＦＩＩＦは硫酸アン
モニウム直線勾配のＨＧＥ溶出画分にそれぞれ検出され
た。 （２）遺伝子組換え法によるＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＥお
よびＴＦＩＩＦの調製精製された基本転写因子を得るた
め、和田らの方法〔Genes & Development, 12, 343 (19
98)〕に従い大腸菌で遺伝子組換え法によりＴＦＩＩ
Ｂ、ＴＦＩＩＥおよびＴＦＩＩＦを生産させ、調製し
た。

【０１１４】これらの遺伝子組換え法で調製した基本転
写因子を以下、ｒＴＦＩＩＢ、ｒＴＦＩＩＥおよびｒＴ
ＦＩＩＦと呼ぶ。 （３）ＤＳＩＦの調製 （１）で得られたＰ．１とＰ．３を１２ｍｌずつ混合
し、固体の硫酸アンモニウムを飽和するまで加えて４℃
で一晩放置し、蛋白質を塩析させた後、４℃、１３，６
００×ｇで３０分遠心することにより、蛋白質を塩析沈
降させた。

【０１１５】該沈降物を３ｍｌの０．５×ＨＧＥ．０５
（ＨＧＥ．０５を２倍に希釈した緩衝液）に溶解し、
０．５×ＨＧＥ．０５に対して透析し、粗精製ＤＳＩＦ
標品を調製した。このＤＳＩＦ標品を以下、粗ＤＳＩＦ
と呼ぶ。より精製されたＤＳＩＦ標品を得るため、ＤＳ
ＩＦのサブユニットであるｐ１６０とｐ１４を以下のよ
うに遺伝子組換えを用いて生産し、調製した。

【０１１６】ノバジェン（Novagen）社製のｐＥＴシス
テムを用い、ノバジェン社のマニュアルに従って、以下
の方法で、Ｎ末側にＨｉｓタグを付加したｐ１６０およ
びｐ１４を大腸菌で生産させ、精製した。Ｈｉｓタグを
Ｎ末端側に付加する発現用ベクターｐＥＴ１４（ノバジ
ェン社製）にｐ１６０ ｃＤＮＡあるいはｐ１４ ｃＤＮ
Ａを導入し、大腸菌発現用プラスミドｐＥＴ−ｐ１６０
およびｐＥＴ−ｐ１４を作製した。

【０１１７】作製したｐＥＴ−ｐ１６０およびｐＥＴ−
ｐ１４をそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジ
ェン社製）に導入し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを
含んだＬＢ液体培地で３７℃で培養した。６００ｎｍに
おける濁度が０．６になった時点で、プロモーターの誘
導剤であるＩＰＴＧを終濃度が１ｍＭとなるように加
え、さらに４時間培養した。

【０１１８】得られた培養液を４℃、３，０００×ｇで
１５分遠心し、菌体を回収した。回収菌体をＰＢＳで２
回洗浄し、培養液に対して１／５０容の１×Bindingバ
ッファー（ノバジェン社製）に懸濁させた。これら懸濁
液を用い、断続的に３０分、超音波破砕処理を行った
後、これら処理液を４℃、１３，６００×ｇで３０分遠
心し、穴径０．４５μｍのフィルターに通すことにより
溶解液を調製した。

【０１１９】得られた溶解液をＮｉ²⁺カラムＨｉｓ−Ｂ
ｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（ノバジェン社製）に通塔し、Ｈｉ
ｓタグの付加した組換え蛋白質を吸着させた後、ノバジ
ェン社のマニュアルに従って精製した。ｐ１４は効率よ
く、高純度で精製できたが、ｐ１６０は大部分が素通り
画分に回収され、また、溶出画分には多くの分解産物が
含まれていた。

【０１２０】ｐ１６０を含む画分をさらにディスク・プ
レパラティブ電気泳動装置（日本エイドー）にかけ、分
解していない全長のｐ１６０を分取した。取得したｐ１
６０およびｐ１４をアセトン沈澱処理し、得られた沈殿
物を６Ｍグアニジン塩酸塩にそれぞれ溶解した。

【０１２１】得られた溶解液をＨＧＥ．１に対してそれ
ぞれ透析することにより、精製されたｐ１６０およびｐ
１４を取得した。このｐ１６０とｐ１４を１０：１の割
合で混合したものを遺伝子組換えＤＳＩＦ標品（以下、
ｒＤＳＩＦと呼ぶ。）として用いた。

【０１２２】（４）in vitro転写反応系の構築とＤＲＢ
感受性の解析 スーパーコイル形態のプラスミドpTF3-6(C₂AT)〔J. Vir
ol., 65, 557 (1991)〕およびpMLd(C₂AT)〔EMBO J., 9,
841 (1990)〕を転写の鋳型として用いた。これらはア
デノウイルスのＥ４および主要後期遺伝子プロモーター
の支配下で、３８０および３００塩基のグアニン塩基を
含まない転写産物を合成できるプラスミドである。

【０１２３】これらのプラスミド〔pTF3-6(C₂AT) ２５
ｎｇ、pMLd(C₂AT) ２２５ｎｇ〕に（１）〜（３）で調
製した画分を添加し、in vitro転写反応系を構築した。
in vitro再構成系としては、φＦＴ（５μｌ）、ｒＴＦ
ＩＩＢ（３０ｎｇ）、ｒＴＦＩＩＥ（ａ ５ｎｇ、ｂ
３ｎｇ）、ｒＴＦＩＩＦ（ＲＡＰ７４ １５ｎｇ、ＲＡ
Ｐ３０ １５ｎｇ）を混合し、場合によりＰ−ＴＥＦｂ
画分（６μｌ）およびＤＳＩＦとして粗ＤＳＩＦ（２μ
ｌ）あるいはｒＤＳＩＦ（ｐ１６０ ３０ｎｇおよびｐ
１４ ３ｎｇの混合物）を添加したものに鋳型用プラス
ミドを加えたもの（以下、転写再構成系と呼ぶ。）を用
いた。該転写再構成系の対照用の系として、未精製の各
種細胞成分を含む分画していないＰ１．０濃縮画分２μ
ｌに鋳型用プラスミドを加えた系（以下、未精製系と呼
ぶ。）も用いた。

【０１２４】各反応系の容量は２０μｌとし、文献１
〔Genes & Development, 12, 343 (1998)〕記載の方法
に従い、３０℃で４５分間プレインキュベーションした
後、³²Ｐ標識ヌクレオチドを添加して１０分間反応させ
た後、尿素−ＰＡＧＥにより解析した。

【０１２５】再構成系あるいは未精製系に２種類のＤＳ
ＩＦ標品を加えてＤＲＢ感受性を比較した。結果を図２
Ｂに示した。未精製系（レーン１〜６）では、どちらの
ＤＳＩＦ標品もＤＲＢ感受性を誘導し（レーン３〜
６）。これは文献１の結果と一致した。一方、転写再構
成系（レーン７〜１０）においては粗ＤＳＩＦはＤＲＢ
感受性を誘導した（レーン７、８）が、rＤＳＩＦはＤ
ＲＢ感受性を誘導できなかった（レーン９、１０）。

【０１２６】該結果より、粗ＤＳＩＦ中に、ＤＲＢ依存
的な転写阻害に必要な、ＤＳＩＦ以外の因子が含まれて
いると考えられた。そこで、転写再構成系にrＤＳＩＦ
を加え、さらに濃縮していないＰ．１あるいはＰ．３を
加えて転写反応のＤＲＢ感受性を調べた。

【０１２７】Ｐ．３を加えた検討した結果を図２Ｃに示
した。Ｐ．３の量依存的に顕著にＤＲＢ感受性が誘導さ
れた(レーン１１〜１８）。なお、ｒＤＳＩＦを除いた
場合はＤＲＢ感受性が失われた（レーン３〜１０）。
Ｐ．１にはこのような活性は認められなかった。Ｐ．３
に含まれるＤＲＢ感受性を担うＤＳＩＦ以外の因子をne
gative elongation factor；ＮＥＬＦと名付けた。

【０１２８】実施例２ ＮＥＬＦの精製 上記でその存在を見出したＮＥＬＦの構造を明らかにす
るため、その蛋白質を以下のようにして精製した。な
お、各精製段階においては、ＮＥＬＦの活性を、実施例
１（４）記載の再構成系に試料をrＤＳＩＦと共に添加
し、ＤＲＢ添加時と非添加時の転写量を比較することに
より、転写のＤＲＢ感受性を誘導する活性として測定し
た（以下、この測定系をＮＥＬＦ活性アッセイ系と呼
ぶ。）実施例１（１）と同様にしてＨｅＬａ核抽出液１
２０ｍｌ（蛋白量として約８４０ｍｇ）より調製した
Ｐ．３画分（蛋白量として約２００ｍｇ、ＫＣｌ濃度
０．３Ｍ）を、ＨＧＥを用いてＫＣｌ濃度が０．１５Ｍ
になるよう希釈し、これをＨＧＥ．１５で平衡化したDE
AE Sepharose FFカラム（６０ｍｌ）に通塔した。

【０１２９】該カラムをＨＧＥ．１５で洗浄し、ＨＧ
Ｅ．２２５、ＨＧＥ．３およびＨＧＥ１．０を用いて蛋
白質を段階溶出し、該溶出液を分画しながら回収し
た。。各溶出画分について、サブユニットであるｐ１６
０に対する抗体を用いたイムノブロッティングによるＤ
ＳＩＦの検出、およびＮＥＬＦ活性の測定を行った。

【０１３０】ＤＳＩＦは０．３Ｍの画分に検出され、Ｎ
ＥＬＦ活性は０．２２５Ｍ ＫＣｌの溶出画分に認めら
れ、ＮＥＬＦとＤＩＳＦを分離することができた。０．
２２５Ｍ ＫＣｌ溶出画分を蛋白質量として１０ｍｇず
つ、ＨＧＥ．２２５で平衡化したHiTrap Heparinカラム
（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製；容量５
ml）に通塔し、吸着させた。

【０１３１】該カラムをＨＧＥ.225で洗浄後、ＨＧＥ.3
およびＨＧＥ1.0を用いて段階溶出し、ＮＥＬＦ活性は
０．３Ｍ ＫＣｌ画分に認められた。該画分（蛋白量と
して約５ｍｇ）を、ＨＧＥを用いてＫＣｌ濃度が０．２
５Ｍになるよう希釈し、mono Q HR5/5カラム（アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテク社製；容量１．０ｍｌ）
に通塔し、吸着させた。

【０１３２】該カラムを洗浄後、０．２５〜０．４Ｍ
ＫＣｌの直線濃度勾配のＨＧＥ緩衝液１５ｍｌを用いて
蛋白質を溶出し、該溶出液を分画しながら回収した。Ｎ
ＥＬＦ活性の認められた０．３０Ｍ付近に溶出される活
性画分を集め、０．７５Ｍ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を含んだＨ
ＧＥ緩衝液に対して透析した。

【０１３３】該透析液(蛋白量として約０．８ｍｇ）をP
henyl Superose HR5/5カラムに通塔し、０．５〜０Ｍ
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の直線濃度勾配のＨＧＥ緩衝液１５ｍ
ｌを用いて蛋白質を溶出し、該溶出液を分画しながら回
収した。ＮＥＬＦ活性の認められた画分を集め、ＨＧ
Ｅ．１に対して透析した。

【０１３４】該透析液をmono S PC 1.6/5カラム（アマ
シャム・ファルマシア・バイオテク社製；容量０．１ｍ
ｌ）に通塔し、０．１〜０．３５Ｍ ＫＣｌの直線濃度
勾配のＨＧＥ緩衝液１．５ｍｌを用いて蛋白質を溶出
し、該溶出液を分画しながら回収した。

【０１３５】ＮＥＬＦ活性は０．２３Ｍ ＫＣｌ濃度付
近に認められた。上記精製の過程で、精製段階が進むに
つれ回収されるＮＥＬＦ活性の低下が認められたため、
ＮＥＬＦ活性アッセイ系について、イムノブロッティン
グ法により、ＤＳＩＦと共にＤＲＢ感受性に関与する因
子であるＰ−ＴＥＦｂの検出を行なった。

【０１３６】該検出の結果、Ｐ−ＴＥＦｂはアッセイ系
にほとんど含まれていないことがわかった。従って、Ｎ
ＥＬＦ活性の低下は、実際にＮＥＬＦの活性が低下して
いるためではなく、ＮＥＬＦ画分中の不純物として系に
存在していたＰ−ＴＥＦｂが、精製段階が進むにつれて
反応系に不足してくるためと判断された。

【０１３７】Ｐ−ＴＥＦｂの不足を補うために、以後、
以下の方法でＨｅＬａ核抽出液から部分精製したＰ−Ｔ
ＥＦｂをＮＥＬＦ活性アッセイ系に添加した。ＨｅＬａ
核抽出液のホスホセルロースＰ１１カラムの溶出画分に
ついてＰ−ＴＥＦｂのＣｄｋ９サブユニットに対する抗
体（Santa Cruz社製）を用いたイムノブロッティングに
よりＰ−ＴＥＦｂを追跡し、Ｐ−ＴＥＦｂは大部分がＰ
１．０に含まれていることを確認した。

【０１３８】Ｐ１．０をフェニルスーパーロースHR5/5
カラムに通塔後、ＨＧＥ緩衝液で溶出される画分につい
て同様にイムノブロッティングでＰ−ＴＥＦｂ検出する
ことにより、Ｐ−ＴＥＦｂを含む画分を集めて回収し、
該画分をアッセイ系に添加した。

【０１３９】該アッセイ系を用いた、mono S PC 1.6/5
カラムの各溶出画分のＮＥＬＦ活性測定結果を図３Ｂに
示した。溶出画分２０〜２４にＮＥＬＦ活性が存在して
いた。これらの画分に含まれる蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後銀染色した結果を図３Ｂに示したが、ＮＥＬＦ活性
画分には分子量６６、６１、５９、５８および４６ｋＤ
ａの蛋白質が存在した。

【０１４０】該ＮＥＬＦ活性画分を、ＨＧＥ．１で平衡
化したSuperdexゲルろ過カラム（アマシャム・ファルマ
シア・バイオテク社製；容量２．４ｍｌ）に通塔した。
ＮＥＬＦ活性は分子量約３００ｋＤａの位置に溶出され
た。該画分に含まれる蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後銀染
色で分析したところ、上記の５種類の分子量の蛋白質は
挙動をともにしており、ＮＥＬＦのサブユニットとして
複合体を形成していることが示唆された。そこで、これ
らの蛋白質をそれぞれＮＥＬＦｐ６６（分子量６６ｋＤ
ａ）、ＮＥＬＦｐ６１（分子量６１ｋＤａ）、ＮＥＬＦ
ｐ５９（分子量５９ｋＤａ）、ＮＥＬＦｐ５８（分子量
５８ｋＤａ）、ＮＥＬＦｐ４６（分子量４６ｋＤａ）と
名付けた。最終的に８４０ｍｇの蛋白質を含むＨｅＬａ
核抽出液より２〜３μｇの各ＮＥＬＦサブユニット蛋白
質を取得した。

【０１４１】実施例３ ＮＥＬＦによる転写伸長反応の
抑制活性の性質 （１）ＤＳＩＦとの関係 実施例１で構築した転写再構成系（Ｐ−ＴＥＦｂ非添
加、ＤＲＢ非添加）において、rＤＳＩＦあるいは実施
例２で精製したＮＥＬＦを添加した場合の結果を図４Ａ
に示した。

【０１４２】ＤＳＩＦ単独(レーン１〜４）あるいはＮ
ＥＬＦ単独（レーン１、５、９）ではどちらの因子もほ
とんど転写に影響しないのに対し、ＮＥＬＦとＤＳＩＦ
の両者を加えると（レーン５〜12）転写抑制が観察さ
れ、同時に短い転写産物の蓄積が観察された。

【０１４３】該結果より、ＮＥＬＦとＤＳＩＦは協調的
に働いて転写を抑制することが分かった。なお、実施例
２で示したように、Ｐ−ＴＥＦｂ非存在下ではＤＲＢ感
受性は誘導されなかった（図３Ｄレーン１〜６）。 （２）Ｐ−ＴＥＦｂとの関係 実施例１で構築した再構成系にｒＤＳＩＦを一定量加え
た系において、実施例２で精製したＮＥＬＦあるいはＰ
−ＴＥＦｂを添加し、Ｐ−ＴＥＦｂとＮＥＬＦが転写お
よびＤＲＢ感受性におよぼす影響を調べた。

【０１４４】（１）で示したようにＰ−ＴＥＦｂ非存在
下でＮＥＬＦを加えると、ＤＲＢとは無関係に著しく転
写を抑制した（図３Ｄレーン１〜６）が、Ｐ−ＴＥＦｂ
を加えると、この抑制は解除され転写が回復した。また
回復した転写はＤＲＢ感受性であった（レーン７〜１
２）。

【０１４５】該結果より、ＤＳＩＦ存在下ではＮＥＬＦ
は転写を抑制するが、Ｐ−ＴＥＦｂはこのＮＥＬＦの転
写抑制活性を打ち消すことがわかった。 （３）伸長反応におけるｐｏｌ ＩＩへの直接作用 ＮＥＬＦ、ＤＳＩＦあるいはＰ−ＴＥＦｂが、ｐｏｌ
ＩＩに直接作用するか否か、プラスミドのかわりにオリ
ゴｄＣテンプレート（２本鎖ＤＮＡの３’末端にデオキ
シシトシンが数十塩基付加したもの）を鋳型として用い
た再構成系により検討した。

【０１４６】通常、ｐｏｌ ＩＩは基本転写因子なしに
プロモーターを認識することはできないが、このオリゴ
ｄＣテンプレートの場合はｐｏｌ ＩＩ単独で効率よく
認識し、転写反応が行われる。オリゴｄＣテンプレート
ｄＣ３．８は北嶋らの論文〔J. Biol. Chem., 269, 299
70 (1994)〕の方法により調製した。

【０１４７】ｄＣ３．８（１００ｎｇ）、ｐｏｌ ＩＩ
〔EMBO J., 10, 2305 (1991)に記載の方法で調製したも
の；０．５〜１．５μｌ〕および６ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含
む０．５×ＨＧＥ．０５を基本の反応液とし、場合によ
りＮＥＬＦ、ＤＳＩＦ、Ｐ−ＴＥＦｂ等の因子を添加し
た反応液を調製した。

【０１４８】２０μｌの反応液を３０℃、２０分間プレ
インキュベーションした後、３μｌの³²Ｐ標識ＮＴＰ溶
液（５０μＭ ＡＴＰ／ＣＴＰ／ＧＴＰ、１０μＭ ＵＴ
Ｐ、１μＣｉ ［α−³²Ｐ］ＵＴＰ）を加えて、伸長反
応を開始した。反応２、４、８および１６分後に、反応
液をそれぞれ５μｌ分取し、フェノール・クロロホルム
抽出を行い反応を停止させた。転写産物をエタノール沈
澱により回収し、８％尿素を含むポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により解析した。

【０１４９】図４Ｂに示すように、因子を何も添加しな
い場合、伸長反応が観察された（レーン１〜４)。この
反応系にＤＳＩＦあるいはＮＥＬＦを単独で加えても、
ほとんど効果は観察されなかった（レーン５〜１２）。
しかし、両者を共存させるとｐｏｌ ＩＩの伸長反応が
著しく抑制された（レーン１３〜１６）。以上の結果か
ら、ＤＳＩＦとＮＥＬＦはｐｏｌ ＩＩに直接作用して
伸長反応を抑制することが判明した。

【０１５０】（４）ｐｏｌ ＩＩ ＣＴＤのリン酸化の影
響 P-TEFbはＣＴＤのリン酸化を介して伸長反応を促進する
のではないかと示唆されているため、ＣＴＤの有無およ
びそのリン酸化状態がＮＥＬＦとＤＳＩＦの伸長反応抑
制活性に及ぼす影響を調べた。

【０１５１】リン酸化型のｐｏｌ ＩＩ (ｐｏｌ ＩＩo)
と非リン酸化型のｐｏｌ ＩＩ (ｐｏｌ ＩＩa) を、そ
れぞれKimとDahmus〔J. Biol. Chem., 263, 18880 (198
8)〕およびLuら〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10
004 (1991)〕に記載の方法で分離、調製した。なお、
（３）で用いたｐｏｌ ＩＩは、大部分が非リン酸化型
である。また、BuratowskiとSharp (1991) の方法〔Mo
l. Cell. Biol., 10, 5562 (1990)〕に従い、ｐｏｌ Ｉ
Ｉaを３０℃で３０分、０．２５μｇ／ｍｌのキモトリ
プシンで限定分解することにより、ＣＴＤを欠失したｐ
ｏｌ ＩＩbを調製した。

【０１５２】これら3種類のｐｏｌ ＩＩを用いて、
（３）と同様のオリゴｄＣテンプレートの転写再構成系
の反応を、Ｐ−ＴＥＦｂ非存在下で行なった。ＤＳＩＦ
およびＮＥＬＦ非存在下では、どのタイプのｐｏｌ Ｉ
Ｉも同様の活性を示した（図５のレーン１〜４、９〜１
２、１７〜２０）。よってＣＴＤの有無、あるいはリン
酸化状態はｐｏｌ ＩＩの伸長反応に直接影響しないこ
とが分かった。

【０１５３】ＤＳＩＦとＮＥＬＦを添加すると、ｐｏｌ
ＩＩaとｐｏｌ ＩＩbの伸長反応は著しく抑制されたの
に対し（図５のレーン１３〜１６、２１〜２４）、ｐｏ
ｌＩＩoの伸長反応はまったく抑制効果を受けなかった
（図５のレーン５〜８）。ＣＴＤを持たないｐｏｌ Ｉ
Ｉbがｐｏｌ ＩＩaと同様に抑制されたことから、ＣＴ
ＤはＤＳＩＦとＮＥＬＦによる伸長反応の抑制には必要
ないことが分かった。また、ｐｏｌ ＩＩｏは全く抑制
を受けないことから、ＣＴＤのリン酸化はＤＳＩＦとＮ
ＥＬＦによる伸長反応の抑制を打ち消す働きを持つこと
が分かった。

【０１５４】実施例４ 各ＮＥＬＦサブユニット蛋白質
の解析と該蛋白質をコードするｃＤＮＡの単離 実施例２と同様に精製した約５μｇのＮＥＬＦサブユニ
ットを含むＮＥＬＦ画分をアセトン沈澱し、７．５％の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。

【０１５５】ＮＥＬＦｐ６６、ＮＥＬＦｐ６１、ＮＥＬ
Ｆｐ５９、ＮＥＬＦｐ５８、ＮＥＬＦｐ４６の各バンド
を切り出して単離し、ゲル中でLysyl-Cエンドペプチダ
ーゼ（和光純薬製）と反応させることにより、各サブユ
ニット蛋白質を切断した。切断により得られたペプチド
を逆相ＨＰＬＣによって分離し、自動エドマン分解によ
り各ペプチドのアミノ酸配列を決定した。

【０１５６】（１）ＮＥＬＦｐ６６ ＮＥＬＦｐ６６のバンドから、配列番号１０〜１２に示
される３つのアミノ酸配列が検出された。これらのアミ
ノ酸配列をアミノ酸配列データベースおよび塩基配列デ
ータベースに対して相同性検索した。なお塩基配列デー
タベースは翻訳領域のアミノ酸配列あるいはＥＳＴ（ex
pressed sequence tag）等の翻訳領域が不明な塩基配列
については強制的に３フレームでアミノ酸配列に変換し
たものに対して相同性検索を行なった。

【０１５７】該検索の結果、複数のヒト由来のＥＳＴお
よびゲノムＤＮＡの塩基配列と一致することが判明し
た。見出されたＥＳＴの塩基配列をもとにＤＮＡプライ
マーを合成し、ＨｅＬａ細胞のmＲＮＡを鋳型としてＲ
Ｔ−ＰＣＲを行うことによってＮＥＬＦｐ６６のｃＤＮ
Ａ断片を増幅した。

【０１５８】得られたｃＤＮＡ断片が完全長でないこと
が充分考えられたため、増幅されたｃＤＮＡの５’側お
よび３’側の塩基配列をもとに、ＲＡＣＥ法を用いて、
さらに５’側および３’側のｃＤＮＡ断片を取得し、塩
基配列を決定した。ＲＡＣＥ法により得られた５’側ｃ
ＤＮＡ断片の５’端の塩基配列と３’側ｃＤＮＡ断片の
３’端の塩基配列は、完全長ｃＤＮＡの５’端および
３’端の塩基配列と考えられるので、この塩基配列をも
とにしたプライマーを設計し、ＨｅＬａ細胞のｍＲＮＡ
から再度ＲＴ−ＰＣＲすることで、ＮＥＬＦｐ６６の全
長ｃＤＮＡを増幅し、プラスミドpBluescript II SK(+)
（ストラタジーン社）の制限酵素SmaI部位に挿入し、ク
ローン化した。

【０１５９】該プラスミドで形質転換した大腸菌Escher
ichia coli DH5α/pBS-NELF-Aは、ＦＥＲＭ ＢＰ−６
６０１として、平成１０年１２月１６日付けで工業技術
院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１
丁目３番（郵便番号305-0046）に寄託されている。

【０１６０】クローン化されたｃＤＮＡの塩基配列を決
定し、配列番号１に示した。該ｃＤＮＡは１８８８ｂｐ
からなり、配列番号２に示された５２８アミノ酸からな
る蛋白質をコードしていた。該アミノ酸配列は、配列番
号１０〜１２に示される３つのアミノ酸配列をすべて含
んでおり、ＮＥＬＦｐ６６のアミノ酸配列であると確認
された。

【０１６１】ＮＥＬＦｐ６６のアミノ酸配列およびその
ｃＤＮＡの塩基配列を、アミノ酸配列データベースおよ
び塩基配列データベースに対して相同性検索を行なった
が、最初に見出されたＥＳＴおよびゲノムＤＮＡの塩基
配列以外に一致あるいは他の動物のホモログと考えられ
るほど高い相同性を示す配列はなく、新規な蛋白質であ
ることが明らかになった。

【０１６２】（２）ＮＥＬＦｐ６１ ＮＥＬＦｐ６１のバンドから、配列番号１３〜１５に示
される３つのアミノ酸配列が検出された。これらのアミ
ノ酸配列をＮＥＬＦｐ６６と同様にしてアミノ酸配列デ
ータベースおよび塩基配列データベースに対して相同性
検索した結果、複数のヒト由来のＥＳＴ配列と一致する
ことが判明した。

【０１６３】ＮＥＬＦｐ６６と同様にしてこのＥＳＴの
塩基配列をもとにしたＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡ断片
を増幅し単離した。この増幅断片を単離しプローブとし
て用い、ＨｅＬａ ｃＤＮＡライブラリー（クローンテ
ック社製）のスクリーニングを行い、ＮＥＬＦｐ６１全
長ｃＤＮＡクローンを単離した。

【０１６４】該全長ｃＤＮＡを、プラスミドpBluescrip
t II SK+ の制限酵素ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、大腸菌D
H5α株に形質転換した。該プラスミドで形質転換した大
腸菌Escherichia coli DH5α/pBS-NELF-Bは、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６０２として、平成１０年１２月１６日付け
で工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つ
くば市東１丁目３番（郵便番号305-0046）に寄託されて
いる。

【０１６５】クローン化されたｃＤＮＡの塩基配列を決
定し、配列番号３に示した。該ｃＤＮＡは全長２４５７
ｂｐからなり、配列番号４に示す５８０アミノ酸のから
なる蛋白質をコードしていた。このアミノ酸配列は、配
列番号１３〜１５に示される３つのアミノ酸配列をすべ
て含んでおり、ＮＥＬＦｐ６１のアミノ酸配列であると
確認された。

【０１６６】ＮＥＬＦｐ６１のアミノ酸配列およびその
ｃＤＮＡの塩基配列を、アミノ酸配列データベースおよ
び塩基配列データベースに対して相同性検索を行なった
が、最初に見出されたＥＳＴの塩基配列以外に一致ある
いは他の動物のホモログと考えられるほど高い相同性を
示す配列はなく、新規な蛋白質であることが明らかにな
った。

【０１６７】（３）ＮＥＬＦｐ５９およびＮＥＬＦｐ５
８ 上記同様、ＮＥＬＦｐ５９およびＮＥＬＦｐ５８の部分
アミノ酸配列を決定した結果、ＮＥＬＦｐ５９について
は配列番号１６〜１９、ＮＥＬＦｐ５８については配列
番号２０〜２３に示されるそれぞれ４種類の配列が検出
された。

【０１６８】配列番号１６と２０、１９と２３で示され
るようにＮＥＬＦｐ５９とＮＥＬＦｐ５８で共通の部分
アミノ酸配列が存在することから同一の遺伝子（以下、
ＮＥＬＦｐ５９／ｐ５８遺伝子と呼ぶ。）由来の蛋白質
である可能性が示唆された。これらのアミノ酸配列をＮ
ＥＬＦｐ６６と同様にしてアミノ酸配列データベース塩
基配列データベースに対して相同性検索した結果、複数
のヒト由来のＥＳＴ配列と一致することが判明した。

【０１６９】ＮＥＬＦｐ６６と同様にしてこのＥＳＴの
塩基配列をもとにしたプライマーを用いてＨｅＬａ細胞
mＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡ断片を増幅し
単離した後、ＲＡＣＥ法によりさらに５’側および３’
側のｃＤＮＡ断片を取得し、塩基配列を決定した。

【０１７０】該ＲＡＣＥ法により得られた５’側ｃＤＮ
Ａ断片の５’端の塩基配列と３’側ｃＤＮＡ断片の３’
端の塩基配列はもとにしたプライマーを設計し、ＨｅＬ
ａ細胞のmＲＮＡから再度ＲＴ−ＰＣＲすることで、Ｎ
ＥＬＦｐ５９／ｐ５８遺伝子の全長ｃＤＮＡを増幅し、
プラスミドpBluescript II SK(+)の制限酵素ＳｍａＩ部
位に挿入し、クローン化した。

【０１７１】該プラスミドで形質転換した大腸菌Escher
ichia coli DH5α/pBS-NELF-C/Dは、ＦＥＲＭ ＢＰ−
６６０３として、平成１０年１２月１６日付けで工業技
術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東
１丁目３番（郵便番号305-0046）に寄託されている。

【０１７２】クローン化されたｃＤＮＡの塩基配列を決
定し、配列番号５に示した。該ｃＤＮＡは全長２２１１
ｂｐからなり、配列番号６に示す５８１アミノ酸のから
なる蛋白質をコードしていた。該アミノ酸配列は、配列
番号１６〜２３に示される８つのアミノ酸配列をすべて
含んでいた。

【０１７３】該ｃＤＮＡを用いて大腸菌でＮＥＬＦｐ５
９／ｐ５８遺伝子産物を生産させたところ、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上での分子量はＮＥＬＦｐ５９と一致した。した
がってこのｃＤＮＡはＮＥＬＦｐ５９をコードしている
ｃＤＮＡであり、ＮＥＬＦｐ５８は、ＮＥＬＦｐ５９／
ｐ５８遺伝子からのｍＲＮＡの選択的スプライシングま
たは翻訳後のプロセシングによって生じると考えられ
た。

【０１７４】ＮＥＬＦｐ５９ ｃＤＮＡの塩基配列をお
よびそれがコードするアミノ酸配列を塩基配列データベ
ースおよびアミノ酸配列データベースに対して相同性検
索を行なったが、最初に見出されたＥＳＴの塩基配列以
外に一致あるいは他の動物のホモログと考えられるほど
高い相同性を示す配列はなく、新規な蛋白質であること
が明らかになった。

【０１７５】（４）ＮＥＬＦｐ４６のアミノ酸配列の解
析 上記同様ＮＥＬＦｐ４６の部分アミノ酸配列を決定した
結果、配列番号２４および２５に示される２種類の配列
が検出された。これらのアミノ酸配列をＮＥＬＦｐ６６
と同様にしてアミノ酸配列データベースおよび塩基配列
データベースに対して相同性検索した結果、ヒトＲＤの
アミノ酸配列の一部と完全に一致した。ヒトＲＤは３８
０アミノ酸からなる蛋白質で、その名前の由来となって
いるアルギニン（Ｒ）とアスパラギン酸（Ｄ）を基本と
する塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸が交互に約６０アミ
ノ酸並んだＲＤモチーフと呼ばれる領域が存在し、Ｃ末
端側にはＲＮＡ recognition モチーフ（ＲＲＭ）と呼
ばれるＲＮＡ結合ドメイン様の配列が、Ｎ末端側にはロ
イシン残基が７アミノ酸ごとに繰り返されたロイシンジ
ッパー様構造が存在する〔Biochem. J., 294, 589 (199
3)〕。ＲＤの生体内での実際の機能は全く不明であり、
ｍＲＮＡの伸長反応への関与も知られていなかった。報
告されているＲＤ ｃＤＮＡ〔Biochem. J., 294, 589
(1993)〕のＯＲＦ部分の塩基配列をもとにしたプライマ
ーを用いてＨｅＬａ mＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲを行なう
ことにより、ＲＤのＯＲＦ部分のｃＤＮＡを増幅した。 実施例５ ＮＥＬＦサブユニットの発現パターン ヒトの各組織よりmＲＮＡを調製し、各ＮＥＬＦサブユ
ニットの遺伝子発現を

【０１７６】実施例４で得られたそれぞれのｃＤＮＡを
プローブに用いてノーザンブロッティングにより解析し
た。その結果、いずれのＮＥＬＦサブユニットも心臓、
脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓と、調べたす
べての組織において普遍的に発現していた。

【０１７７】実施例６ 抗ＮＥＬＦｐ４６サブユニット
（ＲＤ）抗体の調製とＲＤの検出 （１）抗RD抗体の調製 抗原として、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）と融合させたヒトＲＤ蛋白質（ＧＳＴ−ＲＤ）を調
製するため、実施例４で増幅したヒトＲＤ ｃＤＮＡの
ＯＲＦ部分をプラスミドpGEX-5X-3（アマシャム・ファ
ルマシア・バイオテク社製）に挿入した。

【０１７８】挿入したＲＤ ｃＤＮＡの塩基配列はＤＮ
Ａシークエンサー（パーキン・エルマー社製）により確
認した。ＧＳＴ−ＲＤを大腸菌DH5α株で発現させ、グ
ルタチオン・セファロース４Ｂカラム（アマシャム・フ
ァルマシア・バイオテク社製）を用いて、該カラムの取
り扱い説明書に従って精製した。

【０１７９】該精製ＧＳＴ−ＲＤを完全フロインド・ア
ジュバンドと共にラットに注射し、免疫を行なった。3
回に渡る免疫の後、Antibodies: A Laboratory Manual,
ColdSpring Harbor Laboratory Press (1988)に記載さ
れた方法により抗血清を調製し、以下の実験で抗ＲＤ抗
体として用いた。

【０１８０】（２）抗ＲＤ抗体を用いたＲＤの検出 （１）で作製した抗ＲＤ抗体を用いて、以下のようにし
てイムノブロッティングを行なった。 即ち、実施例１と同様にして調製したＨｅＬａ細胞の核
抽出液を試料にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分離した
蛋白質をＰＶＤＦフィルター上に転写した。

【０１８１】該フィルターをブロッキング後、一次抗体
として抗ＲＤ抗体（１：２００希釈）とインキュベーシ
ョンした。該フィルターを洗浄後、二次抗体としてホー
スラディッシュ・パーオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ
抗体〔ダコ（Dako）社製、１：２０００希釈〕とインキ
ュベーションした。

【０１８２】該フィルターを洗浄後、ＥＣＬキット（ア
マシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて抗
ＲＤ抗体と結合した蛋白質のバンドを検出した。結果を
図７に示す。ほぼ単一の約５０ｋＤａのバンドが検出さ
れ、抗ＲＤ抗体によりＲＤを特異的に検出できることが
わかった（図７Ａレーン１）。また、実施例２で精製し
たＮＥＬＦ画分を用い同様の実験を行った場合にも、は
っきりとＲＤのバンドが検出され（図７Ａレーン２）、
ＮＥＬＦ中にＲＤが含まれていることが、抗体によって
も確認された。

【０１８３】実施例７ ＲＤ除去核抽出液の伸長反応の
解析 （１）抗ＲＤ抗体による核抽出液からのＲＤ除去 抗ＲＤ抗体を用いて、ＲＤをＨｅＬａ細胞の核抽出液か
ら除去することを試みた。

【０１８４】抗ＲＤ抗体として実施例６の抗ＲＤ抗血清
１０μｌを、２０μｌのプロテインＧセファロースCL-6
B（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）と４
℃で１時間混合し、抗体を担体粒子に固定化した。該抗
ＲＤ抗体固定化粒子をＮＥＴＮ緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１％ ノニデット（Nonidet）Ｐ−４０〕を用い
て３回、さらにＨＧＥ．１を用いて１回洗浄した後、２
００μｌのＨｅＬａ核抽出液を加えて４℃で２時間混合
し、核抽出液中のＲＤを抗ＲＤ抗体固定化粒子に結合さ
せた。

【０１８５】結合後の上清を回収し、該上清と該新たな
抗ＲＤ抗体固定化粒子を同様に混合し結合反応を行なわ
せた。この操作を繰り返し行い、抗ＲＤ抗体固定化粒子
と２回あるいは４回結合反応を行なった核抽出液を調製
した。対照として抗ＲＤ抗血清のかわりに免疫していな
いラット血清を用いて同様の操作を行なった。

【０１８６】上記のように調製したＨｅＬａ核抽出液そ
れぞれ２μｌを用いて、実施例６と同様にしてイムノブ
ロッティングを行い、核抽出液中のＲＤを検出した。４
回結合反応を行わせることにより、抽出液よりほぼ完全
にＲＤが除かれることが分かった（図７Ｂ）。免疫して
いないラット血清を用いて調製した核抽出液ではＲＤの
量に変化はなかった。

【０１８７】実施例１と同様にしてＤＳＩＦ（ｐ１６
０）、Ｐ−ＴＥＦｂ、ｐｏｌ ＩＩを認識する抗体を用
いたイムノブロッティングにより、ＲＤ以外のこれらの
因子を検出したところ、いずれも量の変化は認められ
ず、ＲＤのみが特異的に除去されたことが分かった。

【０１８８】これらの核抽出液を用いて実施例１と同様
にしてそのin vitro転写活性を調べたところ、基本レベ
ルの転写活性には、ほとんど変化なかった（図７Ｃ）。
しかしＤＲＢ感受性は、ＲＤを除去した核抽出液におい
て著しく損なわれていた。該核抽出液に実施例２で調製
したＮＥＬＦ画分を添加したところ、ＤＳＩＦを含まな
い粗ＮＥＬＦ画分（Ｄ．２２５）、精製ＮＥＬＦのいず
れの場合も、転写活性にはほとんど影響することなく、
ＤＲＢ感受性が復活した（図７Ｄ）。上記結果より、Ｒ
ＤがＮＥＬＦ活性の一部を担っていることが確認され
た。

【０１８９】実施例８ Ｆｌａｇ−ＮＥＬＦの免疫精製 （１）Ｆｌａｇ−ＮＥＬＦの調製 ＮＥＬＦの精製および検出を行ないやすくするため、Ｆ
ｌａｇタグペプチド（配列番号９の１〜９番目に記載の
アミノ酸配列を有する）をＮ末に付加したヒトＲＤ（Ｆ
ｌａｇ−ＲＤ）を動物細胞内で遺伝子組換え法により発
現させ、内在性ＲＤのかわりにＦｌａｇ−ＲＤがサブユ
ニットとして会合したＦｌａｇタグで標識されたＮＥＬ
Ｆ（Ｆｌａｇ−ＮＥＬＦ）を、以下の方法により細胞内
で形成させた。

【０１９０】５’側のプライマー〔Ｆｌａｇタグペプチ
ドをコードする塩基配列を付加した、ヒトＲＤのＮ末端
部分の塩基配列をもつプライマー〕および３’側のプラ
イマー〔ヒトＲＤＣ末端部分の塩基配列と相補的な塩基
配列のプライマー〕を用いて、ヒトＲＤ ｃＤＮＡを鋳
型にしてＰＣＲを行なうことにより、Ｆｌａｇ−ＲＤを
コードするＤＮＡを増幅した。これを動物細胞発現用ベ
クターｐＣＡＧＧＳ〔Gene, 108, 193 (1991)〕に挿入
することでＦｌａｇ−ＲＤ動物細胞発現用プラスミドpC
MV-Flag-RDを作製した。

【０１９１】宿主とするＨｅＬａ Ｓ３細胞（ATCC No.
CCL-2.2）は、１０％牛胎児血清（Cansera Internation
al社製）およびＬ−グルタミンを含んだ培地ＭＥＭ（ニ
ッスイ製薬）を用いて、組織培養用ディッシュ上で維持
した。リン酸カルシウム法により、pCMV-Flag-RD（10μ
g）を、薬剤ネオマイシン（＝Geneticin）耐性遺伝子発
現プラスミドpSV2-neo〔J. Mol. Appl. Genet. 1, 327
(1982)〕０．５μｇとともに、２×１０⁶個のＨｅＬａ
細胞にトランスフェクションした。

【０１９２】トランスフェクションの２４時間後に細胞
を希釈して撒き直し、４００μｇ／ｍｌ Geneticin〔ラ
イフ・テクノロジーズ（Life Technologies）社〕を含
んだ培地中で2週間、培養した。この間、3日ごとに培地
交換した。得られたGeneticin耐性コロニーを単離し、
Ｆｌａｇ−ＲＤの発現を抗Ｆｌａｇ Ｍ２モノクローナ
ル抗体（Kodak IBI社製）を用いたイムノブロッティン
グにより調べた。

【０１９３】Ｆｌａｇ−ＲＤの発現が検出されたコロニ
ーのいくつかをそれぞれＦｌａｇ−ＲＤを構成的に発現
する細胞株として、１００μｇ／ｍｌ Geneticinの存在
下で維持した。このようなＦｌａｇ−ＲＤを構成的に発
現するＨｅＬａ Ｓ３細胞株からクローン＃１５を選択
し、以下のようにして大量に培養後、細胞からアフィニ
ティーカラムを用いてＦｌａｇ−ＮＥＬＦを精製した。

【０１９４】クローン＃１５を増殖させ、５％ 馬血清
（Moregate社製）を含んだＭＥＭを用いて、大規模なス
ピナー培養に適応させた。該スピナー培養液３０Ｌから
遠心分離（４℃、２０００×ｇ）により細胞約２×１０
¹⁰個を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。これ以降の操作
はすべて４℃で行った。

【０１９５】該細胞のペレットを２５０ｍｌの高塩濃度
緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）、５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１％ ノニデットＰ−４０、１ｍＭ ＰＭ
ＳＦ〕に懸濁し、ダウンス型ホモジナイザーを用いて破
砕した。該破砕液を用い、ゲノムＤＮＡを分断するため
に軽く超音波破砕処理した後、１３，６００×ｇで２０
分遠心し、得られた上清を再度、同条件下で遠心した。

【０１９６】得られた上清を穴径０．４５μｍのフィル
ターに通したものを細胞溶解液として用いた。該細胞溶
解液４０ｍｌを、実施例７（１）と同様にして作製した
抗ＦｌａｇＭ２抗体固定化カラム（Kodak IBI社製；容
量１ml）に流速０．４ｍｌ／時の条件で通塔し、Ｆｌａ
ｇ−ＮＥＬＦを結合させた。

【０１９７】素通り画分を回収し、該カラムに再度通塔
した。該カラムを１０ｍｌの高塩濃度緩衝液で２回洗浄
し、５ｍｌのＨＧＥ．１で１回洗浄した。該カラムの出
口を止め、過剰（１００μｇ）のＦｌａｇタグペプチド
(Kodak IBI社)を含んだＨＧＥ．１を１mlカラムに加え
て、レジンを懸濁し、5分間放置することによりＦｌａ
ｇ−ＮＥＬＦをカラムから溶出させた。

【０１９８】該溶出液を回収し、該操作をさらに４回繰
り返した。得られた素通り画分、洗浄液および溶出液を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。結果を図８Ａに示し
た。

【０１９９】細胞溶解液中の大部分の蛋白質は最初の素
通り画分あるいは１回目の洗浄液中に存在し、溶出液に
はＦｌａｇ−ＲＤに加えて４種類のＮＥＬＦサブユニッ
ト（ＮＥＬＦｐ６６、ＮＥＬＦｐ６１、ＮＥＬＦｐ５
９、ＮＥＬＦｐ５８）が特異的に共精製された。即ち、
ＲＤは細胞内で他の４つのサブユニットと非常に安定な
複合体を形成していることが確認された。

【０２００】（２）Ｆｌａｇ−ＮＥＬＦの活性 Ｆｌａｇ−ＮＥＬＦがＮＥＬＦ活性を有しているか否
か、実施例３（３）と同様にオリゴｄＣテンプレートを
用いた転写再構成系により検討した。結果を図８Ｂに示
した。

【０２０１】Ｆｌａｇ−ＮＥＬＦは、実施例３（３）の
精製ＮＥＬＦ画分と同様にＤＳＩＦに依存してｐｏｌ
ＩＩの伸長反応を抑制し、Ｆｌａｇ−ＮＥＬＦがＮＥＬ
Ｆ活性を有していることを確認した。また、ＲＤを始め
とする５つのサブユニットだけでＮＥＬＦ活性を有する
と考えられた。

【０２０２】実施例９ ＮＥＬＦと他の因子との相互作
用 ＮＥＬＦの作用機構を明らかにするため、ＮＥＬＦと他
の因子との物理的な相互作用を検討した（図９）。Ｆｌ
ａｇ−ＲＤを構成的に発現する細胞株と宿主のＨｅＬａ
Ｓ３細胞株より核抽出液を調製し、抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗
体固定化カラムを用いてＦｌａｇ−ＮＥＬＦの精製を行
った。その際、変性剤を含まないより緩やかな条件で洗
浄することによりＮＥＬＦと相互作用する因子が結合画
分に残るようにした。

【０２０３】抗ＲＤ抗体を用い、インプット、素通り画
分および結合画分についてイムノブロッティングにより
Ｆｌａｇ−ＲＤの検出を行った結果、Ｆｌａｇ−ＲＤは
ほとんど結合画分に回収され、内在性ＲＤは素通り画分
に回収された。他の因子（ＤＳＩＦ、Ｐ−ＴＥＦｂ、ｐ
ｏｌ ＩＩ）について、それぞれの因子に対する抗体を
用いたイムノブロッティングにより、検出を行った結
果、ＤＳＩＦのｐ１６０サブユニットとｐｏｌ ＩＩの
一部が結合画分に回収され、ＮＥＬＦと共精製されるこ
とが分かった。一方、Ｐ−ＴＥＦｂは有意な結合を示さ
なかった。

【０２０４】以上のことから、ＤＳＩＦおよびｐｏｌ
ＩＩがＮＥＬＦと相互作用することが明かとなった。ｐ
ｏｌ ＩＩのイムノブロッティングに用いてきた抗ｐｏ
ｌ ＩＩ抗体８ＷＧ１６は本来、ｐｏｌ ＩＩｏとｐｏｌ
ＩＩａの双方を認識し得るが、核抽出液にはｐｏｌ Ｉ
Ｉｏがほとんど含まれていないため、ｐｏｌ ＩＩａの
バンドのみが検出される。従って、ｐｏｌ ＩＩｏがＮ
ＥＬＦと相互作用するか調べるために、ｐｏｌ ＩＩｏ
に特異的な抗体Ｂ３を用いてイムノブロッティングを行
った。

【０２０５】該イムノブロッティング解析の結果、ｐｏ
ｌ ＩＩｏは全く結合画分には検出されなかったため、
ＮＥＬＦとｐｏｌ ＩＩの相互作用はＣＴＤのリン酸化
によって制御されていることが判明した。以上の実験結
果より、以下の可能性が示唆された。

【０２０６】ＤＳＩＦとＮＥＬＦはｐｏｌ ＩＩに直接
結合し、協調的にその伸長反応を抑制する。しかし通常
はＰ−ＴＥＦｂがｐｏｌ ＩＩのＣＴＤをリン酸化し、
ＤＳＩＦとＮＥＬＦをｐｏｌ ＩＩから遊離させること
で、抑制効果を打ち消す。ＤＲＢはＰ−ＴＥＦｂの「抗
抑制」反応を阻害し、ＤＳＩＦとＮＥＬＦの抑制効果を
維持することで、伸長反応を阻害する。実施例３（４）
で調べたようにＣＴＤはＤＳＩＦとＮＥＬＦによる抑制
の局面には不必要である。即ち、、ＤＳＩＦとＮＥＬＦ
はＣＴＤ以外の部分を介してｐｏｌ ＩＩに結合すると
思われる。また、ＮＥＬＦはＲＤサブユニットを介して
転写産物に結合し、この３者の複合体を安定化している
可能性がある。

【０２０７】

【発明の効果】本発明により、真核生物の細胞における
ｐｏｌ ＩＩ伸長反応を制御することが可能で、癌治療
に有効と考えられるＮＥＬＦ、該ＮＥＬＦを構成するサ
ブユニット蛋白質、該サブユニット蛋白質をコードする
ＤＮＡ、該サブユニット蛋白質を認識する抗体を提供す
ることができる。

【０２０８】「配列表フリーテキスト」配列番号９−fl
agタグペプチドをヒトＲＤ蛋白質のＮ末端に融合

【０２０９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD Hiroshi, Handa <120> negative elongation factor NELF <130> <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0

【０２１０】 <210> 1 <211> 1888 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (14)..(1597) <400> 1 gctttccccc aag atg gcg tcc atg cgg gaa aac gac acg ggc ctg tgg 49 Met Ala Ser Met Arg Glu Asn Asp Thr Gly Leu Trp 1 5 10 ctg cac aac aag ctg ggg gcc acg gac gag ctg tgg gcg ccg ccc agc 97 Leu His Asn Lys Leu Gly Ala Thr Asp Glu Leu Trp Ala Pro Pro Ser 15 20 25 atc gcg tcc ctg ctc acg gcc gcg gtc atc gac aac atc cgt ctc tgc 145 Ile Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ala Val Ile Asp Asn Ile Arg Leu Cys 30 35 40 ttc cat ggc ctc tcg tcg gca gtg aag ctc aag ttg cta ctc tgg acg 193 Phe His Gly Leu Ser Ser Ala Val Lys Leu Lys Leu Leu Leu Trp Thr 45 50 55 60 ctg cac ctc ccg cgc cgc acg gtg gac gag atg aag ggc gcc cta atg 241 Leu His Leu Pro Arg Arg Thr Val Asp Glu Met Lys Gly Ala Leu Met 65 70 75 gag atc atc cag ctc gcc agc ctc gac tcg gac ccc tgg gtg ctc atg 289 Glu Ile Ile Gln Leu Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val Leu Met 80 85 90 gtc gcc gac atc ttg aag tcc ttt ccg gac aca ggc tcg ctt aac ctg 337 Val Ala Asp Ile Leu Lys Ser Phe Pro Asp Thr Gly Ser Leu Asn Leu 95 100 105 gag ctg gag gag cag aat ccc aac gtt cag gat att ttg gga gaa ctt 385 Glu Leu Glu Glu Gln Asn Pro Asn Val Gln Asp Ile Leu Gly Glu Leu 110 115 120 aga gaa aag gtg ggt gag tgt gaa gcg tct gcc atg ctg cca ctg gag 433 Arg Glu Lys Val Gly Glu Cys Glu Ala Ser Ala Met Leu Pro Leu Glu 125 130 135 140 tgc cag tac ttg aac aaa aac gcc ctg acg acc ctc gcg gga ccc ctc 481 Cys Gln Tyr Leu Asn Lys Asn Ala Leu Thr Thr Leu Ala Gly Pro Leu 145 150 155 act ccc ccg gtg aag cat ttt cag tta aag cgg aaa ccc aag agc gcc 529 Thr Pro Pro Val Lys His Phe Gln Leu Lys Arg Lys Pro Lys Ser Ala 160 165 170 acg ctg cgg gcg gag ctg ctg cag aag tcc acg gag acc gcc cag cag 577 Thr Leu Arg Ala Glu Leu Leu Gln Lys Ser Thr Glu Thr Ala Gln Gln 175 180 185 ttg aag cgg agc gcc ggg gtg ccc ttc cac gcc aag ggc cgg ggg ctg 625 Leu Lys Arg Ser Ala Gly Val Pro Phe His Ala Lys Gly Arg Gly Leu 190 195 200 ctg cgg aag atg gac acc acc acc cca ctc aaa ggc atc ccg aag cag 673 Leu Arg Lys Met Asp Thr Thr Thr Pro Leu Lys Gly Ile Pro Lys Gln 205 210 215 220 gcg ccc ttc aga agc ccc acg gcg ccc agc gtc ttc agc ccc aca ggg 721 Ala Pro Phe Arg Ser Pro Thr Ala Pro Ser Val Phe Ser Pro Thr Gly 225 230 235 aac cgg acc ccc atc ccg cct tcc agg acg ctg ctg cgg aag gaa cga 769 Asn Arg Thr Pro Ile Pro Pro Ser Arg Thr Leu Leu Arg Lys Glu Arg 240 245 250 ggt gtg aag ctg ctg gac atc tct gag ctg gat atg gtt ggc gct ggc 817 Gly Val Lys Leu Leu Asp Ile Ser Glu Leu Asp Met Val Gly Ala Gly 255 260 265 cga gag gcg aag cgg aga agg aag act ctc gat gcg gag gtg gtg gag 865 Arg Glu Ala Lys Arg Arg Arg Lys Thr Leu Asp Ala Glu Val Val Glu 270 275 280 aag ccg gcc aag gag gaa acg gtg gtg gag aac gcc acc ccg gac tac 913 Lys Pro Ala Lys Glu Glu Thr Val Val Glu Asn Ala Thr Pro Asp Tyr 285 290 295 300 gca gcc ggc ctg gtg tcc acg cag aaa ctt ggg tcc ctg aac aat gag 961 Ala Ala Gly Leu Val Ser Thr Gln Lys Leu Gly Ser Leu Asn Asn Glu 305 310 315 cct gcg ctg ccc tcc acg agc tac ctt ccc tcc acg ccc agc gtg gtt 1009 Pro Ala Leu Pro Ser Thr Ser Tyr Leu Pro Ser Thr Pro Ser Val Val 320 325 330 ccc gcc tcc tcc tac atc ccc agc tcc gag acg ccc cca gcc cca tct 1057 Pro Ala Ser Ser Tyr Ile Pro Ser Ser Glu Thr Pro Pro Ala Pro Ser 335 340 345 tcc cgg gaa gcc agc cgc cca cca gag gag ccc agc gcc ccg agc ccc 1105 Ser Arg Glu Ala Ser Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ser Ala Pro Ser Pro 350 355 360 acg ttg cca gcg cag ttc aag cag cgg gcg ccc atg tac aac agc ggc 1153 Thr Leu Pro Ala Gln Phe Lys Gln Arg Ala Pro Met Tyr Asn Ser Gly 365 370 375 380 ctg agc cct gcc aca ccc acg cct gcg gcg ccc acc tcg cct ctg aca 1201 Leu Ser Pro Ala Thr Pro Thr Pro Ala Ala Pro Thr Ser Pro Leu Thr 385 390 395 ccc acc aca cct ccg gct gtc gcc cct acc act cag aca ccc ccg gtt 1249 Pro Thr Thr Pro Pro Ala Val Ala Pro Thr Thr Gln Thr Pro Pro Val 400 405 410 gcc atg gtg gcc ccg cag acc cag gcc cct gct cag cag cag cct aag 1297 Ala Met Val Ala Pro Gln Thr Gln Ala Pro Ala Gln Gln Gln Pro Lys 415 420 425 aag aac ctg tcc ctc acg aga gag cag atg ttc gct gcc cag gag atg 1345 Lys Asn Leu Ser Leu Thr Arg Glu Gln Met Phe Ala Ala Gln Glu Met 430 435 440 ttc aag acg gcc aac aaa gtc acg cgg ccc gag aag gcc ctc atc ctg 1393 Phe Lys Thr Ala Asn Lys Val Thr Arg Pro Glu Lys Ala Leu Ile Leu 445 450 455 460 ggc ttc atg gcc ggc tcc cga gag aac ccg tgc cag gag cag ggg gac 1441 Gly Phe Met Ala Gly Ser Arg Glu Asn Pro Cys Gln Glu Gln Gly Asp 465 470 475 gtg atc cag atc aag ctg agc gag cac acg gag gac ctg ccc aag gcg 1489 Val Ile Gln Ile Lys Leu Ser Glu His Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala 480 485 490 gac ggc cag ggt agc aca acc atg ctg gtg gac aca gtg ttt gag atg 1537 Asp Gly Gln Gly Ser Thr Thr Met Leu Val Asp Thr Val Phe Glu Met 495 500 505 aac tat gcc acg ggc cag tgg acg cgc ttc aag aag tac aag ccc atg 1585 Asn Tyr Ala Thr Gly Gln Trp Thr Arg Phe Lys Lys Tyr Lys Pro Met 510 515 520 acc aat gtg tcc tagaaccacc tgcctcacag ctggccgtca cttgtggggg 1637 Thr Asn Val Ser 525 tccacgggac gatggctttg ccagcttaaa gtaaccggat ggcggacacc tggcccccga 1697 ggtcccccgg ccgccgccat gctgctgacc cagcctgttt taagttctgg atgcatttct 1757 ctggggtatt tggggcttat ttttaaaatt ttaatatggg ttcttttttg tgtgatttaa 1817 gccacttttt ggacacaacg ttacattttt gaatgtagta agtaaattaa ccaaaaaagt 1877 tacaacttcc t 1888

【０２１１】 <210> 2 <211> 528 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser Met Arg Glu Asn Asp Thr Gly Leu Trp Leu His Asn Lys 1 5 10 15 Leu Gly Ala Thr Asp Glu Leu Trp Ala Pro Pro Ser Ile Ala Ser Leu 20 25 30 Leu Thr Ala Ala Val Ile Asp Asn Ile Arg Leu Cys Phe His Gly Leu 35 40 45 Ser Ser Ala Val Lys Leu Lys Leu Leu Leu Trp Thr Leu His Leu Pro 50 55 60 Arg Arg Thr Val Asp Glu Met Lys Gly Ala Leu Met Glu Ile Ile Gln 65 70 75 80 Leu Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val Leu Met Val Ala Asp Ile 85 90 95 Leu Lys Ser Phe Pro Asp Thr Gly Ser Leu Asn Leu Glu Leu Glu Glu 100 105 110 Gln Asn Pro Asn Val Gln Asp Ile Leu Gly Glu Leu Arg Glu Lys Val 115 120 125 Gly Glu Cys Glu Ala Ser Ala Met Leu Pro Leu Glu Cys Gln Tyr Leu 130 135 140 Asn Lys Asn Ala Leu Thr Thr Leu Ala Gly Pro Leu Thr Pro Pro Val 145 150 155 160 Lys His Phe Gln Leu Lys Arg Lys Pro Lys Ser Ala Thr Leu Arg Ala 165 170 175 Glu Leu Leu Gln Lys Ser Thr Glu Thr Ala Gln Gln Leu Lys Arg Ser 180 185 190 Ala Gly Val Pro Phe His Ala Lys Gly Arg Gly Leu Leu Arg Lys Met 195 200 205 Asp Thr Thr Thr Pro Leu Lys Gly Ile Pro Lys Gln Ala Pro Phe Arg 210 215 220 Ser Pro Thr Ala Pro Ser Val Phe Ser Pro Thr Gly Asn Arg Thr Pro 225 230 235 240 Ile Pro Pro Ser Arg Thr Leu Leu Arg Lys Glu Arg Gly Val Lys Leu 245 250 255 Leu Asp Ile Ser Glu Leu Asp Met Val Gly Ala Gly Arg Glu Ala Lys 260 265 270 Arg Arg Arg Lys Thr Leu Asp Ala Glu Val Val Glu Lys Pro Ala Lys 275 280 285 Glu Glu Thr Val Val Glu Asn Ala Thr Pro Asp Tyr Ala Ala Gly Leu 290 295 300 Val Ser Thr Gln Lys Leu Gly Ser Leu Asn Asn Glu Pro Ala Leu Pro 305 310 315 320 Ser Thr Ser Tyr Leu Pro Ser Thr Pro Ser Val Val Pro Ala Ser Ser 325 330 335 Tyr Ile Pro Ser Ser Glu Thr Pro Pro Ala Pro Ser Ser Arg Glu Ala 340 345 350 Ser Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ser Ala Pro Ser Pro Thr Leu Pro Ala 355 360 365 Gln Phe Lys Gln Arg Ala Pro Met Tyr Asn Ser Gly Leu Ser Pro Ala 370 375 380 Thr Pro Thr Pro Ala Ala Pro Thr Ser Pro Leu Thr Pro Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Ala Val Ala Pro Thr Thr Gln Thr Pro Pro Val Ala Met Val Ala 405 410 415 Pro Gln Thr Gln Ala Pro Ala Gln Gln Gln Pro Lys Lys Asn Leu Ser 420 425 430 Leu Thr Arg Glu Gln Met Phe Ala Ala Gln Glu Met Phe Lys Thr Ala 435 440 445 Asn Lys Val Thr Arg Pro Glu Lys Ala Leu Ile Leu Gly Phe Met Ala 450 455 460 Gly Ser Arg Glu Asn Pro Cys Gln Glu Gln Gly Asp Val Ile Gln Ile 465 470 475 480 Lys Leu Ser Glu His Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Asp Gly Gln Gly 485 490 495 Ser Thr Thr Met Leu Val Asp Thr Val Phe Glu Met Asn Tyr Ala Thr 500 505 510 Gly Gln Trp Thr Arg Phe Lys Lys Tyr Lys Pro Met Thr Asn Val Ser 515 520 525

【０２１２】 <210> 3 <211> 2444 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (91)..(1830) <400> 3 ggacgcgcgc ggagtcgcgc ggcgggcggg acctggccga gctggagggc gccggggagc 60 ggggctcggg cggtggccgg ggcctcggcc atg ttc gcg ggg ctg cag gac ctg 114 Met Phe Ala Gly Leu Gln Asp Leu 1 5 ggc gtg gcc aac ggc gag gac ctg aag gag acc ctg acc aac tgc acg 162 Gly Val Ala Asn Gly Glu Asp Leu Lys Glu Thr Leu Thr Asn Cys Thr 10 15 20 gag ccg ctc aag gcc atc gag cag ttc cag aca gag aat ggt gtg ctg 210 Glu Pro Leu Lys Ala Ile Glu Gln Phe Gln Thr Glu Asn Gly Val Leu 25 30 35 40 ctg cca tct ctt cag tca gcc ctc ccc ttc ttg gac ctg cac ggg acg 258 Leu Pro Ser Leu Gln Ser Ala Leu Pro Phe Leu Asp Leu His Gly Thr 45 50 55 ccg cgg ctg gag ttc cac cag tcg gta ttc gat gag ctg cgg gac aag 306 Pro Arg Leu Glu Phe His Gln Ser Val Phe Asp Glu Leu Arg Asp Lys 60 65 70 ctg ctg gag cga gtg tca gcc atc gct tcg gag ggg aag gct gag gaa 354 Leu Leu Glu Arg Val Ser Ala Ile Ala Ser Glu Gly Lys Ala Glu Glu 75 80 85 agg tac aag aag ctg gaa gac ctt ctg gag aag agc ttt tct ctg gtg 402 Arg Tyr Lys Lys Leu Glu Asp Leu Leu Glu Lys Ser Phe Ser Leu Val 90 95 100 aag atg ccg tcc ctg cag ccc gtg gtg atg tgc gtc atg aag cac ctg 450 Lys Met Pro Ser Leu Gln Pro Val Val Met Cys Val Met Lys His Leu 105 110 115 120 ccc aag gtt ccg gag aaa aaa ctg aag ctg gtt atg gct gac aag gag 498 Pro Lys Val Pro Glu Lys Lys Leu Lys Leu Val Met Ala Asp Lys Glu 125 130 135 ctg tat cga gcc tgc gcc gtg gag gtg aag cgg cag atc tgg caa gac 546 Leu Tyr Arg Ala Cys Ala Val Glu Val Lys Arg Gln Ile Trp Gln Asp 140 145 150 aac cag gcc ctc ttc ggg gac gag gtt tcc cca ctc ctg aag cag tac 594 Asn Gln Ala Leu Phe Gly Asp Glu Val Ser Pro Leu Leu Lys Gln Tyr 155 160 165 atc ctg gag aag gag agc gct ctc ttc agt aca gag ctc tct gtc ctg 642 Ile Leu Glu Lys Glu Ser Ala Leu Phe Ser Thr Glu Leu Ser Val Leu 170 175 180 cac aac ttt ttc agt cct tcc ccc aag acc agg cgc cag ggc gag gtg 690 His Asn Phe Phe Ser Pro Ser Pro Lys Thr Arg Arg Gln Gly Glu Val 185 190 195 200 gtg cag cgg ctg acg cgg atg gtg ggg aag aac gtg aag ctg tac gac 738 Val Gln Arg Leu Thr Arg Met Val Gly Lys Asn Val Lys Leu Tyr Asp 205 210 215 atg gtg ctg cag ttt ctg cgc acg ctc ttc ctg cgc acg cgg aat gtg 786 Met Val Leu Gln Phe Leu Arg Thr Leu Phe Leu Arg Thr Arg Asn Val 220 225 230 cac tac tgc acg ctg cgg gct gag ctg ctc atg tcc ctg cac gac ctg 834 His Tyr Cys Thr Leu Arg Ala Glu Leu Leu Met Ser Leu His Asp Leu 235 240 245 gac gtg ggt gaa atc tgc acc gtg gac ccg tgc cac aag ttc acc tgg 882 Asp Val Gly Glu Ile Cys Thr Val Asp Pro Cys His Lys Phe Thr Trp 250 255 260 tgc ctg gac gcc tgc atc cga gag cgg ttc gtg gac agc aag agg gcg 930 Cys Leu Asp Ala Cys Ile Arg Glu Arg Phe Val Asp Ser Lys Arg Ala 265 270 275 280 cgg gag ctg cag ggg ttt ctc gat ggc gtc aag aag ggc cag gag cag 978 Arg Glu Leu Gln Gly Phe Leu Asp Gly Val Lys Lys Gly Gln Glu Gln 285 290 295 gtg ctg ggg gac ctg tcc atg atc ctg tgt gac ccc ttc gcc atc aac 1026 Val Leu Gly Asp Leu Ser Met Ile Leu Cys Asp Pro Phe Ala Ile Asn 300 305 310 acg ctg gca ctg agc aca gtc agg cac ctg cag gag ctg gtc ggc cag 1074 Thr Leu Ala Leu Ser Thr Val Arg His Leu Gln Glu Leu Val Gly Gln 315 320 325 gag aca ctg ccc agg gac agc ccc gac ctc ctg ctg ctg ctc cgg ctg 1122 Glu Thr Leu Pro Arg Asp Ser Pro Asp Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu 330 335 340 ctg gcg ctg ggc cag gga gcc tgg gac atg atc gac agc cag gtc ttc 1170 Leu Ala Leu Gly Gln Gly Ala Trp Asp Met Ile Asp Ser Gln Val Phe 345 350 355 360 aag gag ccc aag atg gag gta gag ctc atc acc agg ttc ctc ccg atg 1218 Lys Glu Pro Lys Met Glu Val Glu Leu Ile Thr Arg Phe Leu Pro Met 365 370 375 ctc atg tcc ttc ctg gtg gat gac tac act ttc aat gtg gat cag aaa 1266 Leu Met Ser Phe Leu Val Asp Asp Tyr Thr Phe Asn Val Asp Gln Lys 380 385 390 ctt ccg gct gag gag aaa gcc cca gtc tca tat cca aac aca ctt ccc 1314 Leu Pro Ala Glu Glu Lys Ala Pro Val Ser Tyr Pro Asn Thr Leu Pro 395 400 405 gaa agc ttc act aag ttt ctg cag gag cag cgc atg gcc tgc gag gtg 1362 Glu Ser Phe Thr Lys Phe Leu Gln Glu Gln Arg Met Ala Cys Glu Val 410 415 420 ggg ctg tac tac gtc ctg cac atc acc aag cag agg aac aag aac gcg 1410 Gly Leu Tyr Tyr Val Leu His Ile Thr Lys Gln Arg Asn Lys Asn Ala 425 430 435 440 ctc ctc cgc ctg ctg ccc ggg ctg gtg gag acc ttt ggc gac ttg gcc 1458 Leu Leu Arg Leu Leu Pro Gly Leu Val Glu Thr Phe Gly Asp Leu Ala 445 450 455 ttt ggc gac atc ttc ctc cac ctg ctc acg ggc aac ctt gcg ctg ctg 1506 Phe Gly Asp Ile Phe Leu His Leu Leu Thr Gly Asn Leu Ala Leu Leu 460 465 470 gcc gac gaa ttt gcc ctt gag gac ttc tgc agc agc ctc ttc gat ggc 1554 Ala Asp Glu Phe Ala Leu Glu Asp Phe Cys Ser Ser Leu Phe Asp Gly 475 480 485 ttc ttc ctc acc gcc tct cca agg aag gag aac gtg cac cgg cac gcg 1602 Phe Phe Leu Thr Ala Ser Pro Arg Lys Glu Asn Val His Arg His Ala 490 495 500 ctg cgg ctc ctc att cac ctg cac ccc agg gtg gcc cca tct aag ctg 1650 Leu Arg Leu Leu Ile His Leu His Pro Arg Val Ala Pro Ser Lys Leu 505 510 515 520 gag gcg ttg cag aag gcc ctg gag cct aca ggc cag agc gga gag gca 1698 Glu Ala Leu Gln Lys Ala Leu Glu Pro Thr Gly Gln Ser Gly Glu Ala 525 530 535 gtg aag gag ctt tac tcc cag ctc ggc gag aag ctg gaa cag ctg gat 1746 Val Lys Glu Leu Tyr Ser Gln Leu Gly Glu Lys Leu Glu Gln Leu Asp 540 545 550 cac cgg aag ccc agc ccg gca cag gct gcg gag acg ccg gcc ctg gag 1794 His Arg Lys Pro Ser Pro Ala Gln Ala Ala Glu Thr Pro Ala Leu Glu 555 560 565 ctg ccc ctc ccc agc gtg ccc gcc cct gcc ccg ctc tgagggccct 1840 Leu Pro Leu Pro Ser Val Pro Ala Pro Ala Pro Leu 570 575 580 ccagacctgc tcgggtgctg gggccatgcc gagtcgcggc cctgctcagc cggaagaggc 1900 tcccggacct ggatgtacag ggcagtctct cttcccgggg ctatggctgg gcctgtcctg 1960 ccgtcatggc cccctgcttc ctgctccttg gagctggctc ccggaccttg cccaccatcc 2020 atgcagtggc tcccagggca gagcctctcc ttgtactttg gcagccatag aaagcgtgct 2080 cattttctgt tttcctgtgt taggaaaaaa ccacctgttt tccaagggga gagggcgggg 2140 cctgagggtg ggggcggggc ctcttcattg gcccagcttg gcgaaagcga ggcacactgc 2200 ttactgcctt ggggttgtgg agatggaccc gtgacctcgt ggaggccgtg tgggggcagc 2260 agcctggcct gtgccatggt gggtgtcctg gggcctgtgc ggagggagcc acctcaccct 2320 gcagcccagg ttgcaggtgt ggccttgttt ctccttgccc agcagtgctg ccttcagcgg 2380 ccgtgacggg gccagctgga cacacggtga gattttctcg tatgtaaata aaaggcaatt 2440 tggt 2444

【０２１３】 <210> 4 <211> 580 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Phe Ala Gly Leu Gln Asp Leu Gly Val Ala Asn Gly Glu Asp Leu 1 5 10 15 Lys Glu Thr Leu Thr Asn Cys Thr Glu Pro Leu Lys Ala Ile Glu Gln 20 25 30 Phe Gln Thr Glu Asn Gly Val Leu Leu Pro Ser Leu Gln Ser Ala Leu 35 40 45 Pro Phe Leu Asp Leu His Gly Thr Pro Arg Leu Glu Phe His Gln Ser 50 55 60 Val Phe Asp Glu Leu Arg Asp Lys Leu Leu Glu Arg Val Ser Ala Ile 65 70 75 80 Ala Ser Glu Gly Lys Ala Glu Glu Arg Tyr Lys Lys Leu Glu Asp Leu 85 90 95 Leu Glu Lys Ser Phe Ser Leu Val Lys Met Pro Ser Leu Gln Pro Val 100 105 110 Val Met Cys Val Met Lys His Leu Pro Lys Val Pro Glu Lys Lys Leu 115 120 125 Lys Leu Val Met Ala Asp Lys Glu Leu Tyr Arg Ala Cys Ala Val Glu 130 135 140 Val Lys Arg Gln Ile Trp Gln Asp Asn Gln Ala Leu Phe Gly Asp Glu 145 150 155 160 Val Ser Pro Leu Leu Lys Gln Tyr Ile Leu Glu Lys Glu Ser Ala Leu 165 170 175 Phe Ser Thr Glu Leu Ser Val Leu His Asn Phe Phe Ser Pro Ser Pro 180 185 190 Lys Thr Arg Arg Gln Gly Glu Val Val Gln Arg Leu Thr Arg Met Val 195 200 205 Gly Lys Asn Val Lys Leu Tyr Asp Met Val Leu Gln Phe Leu Arg Thr 210 215 220 Leu Phe Leu Arg Thr Arg Asn Val His Tyr Cys Thr Leu Arg Ala Glu 225 230 235 240 Leu Leu Met Ser Leu His Asp Leu Asp Val Gly Glu Ile Cys Thr Val 245 250 255 Asp Pro Cys His Lys Phe Thr Trp Cys Leu Asp Ala Cys Ile Arg Glu 260 265 270 Arg Phe Val Asp Ser Lys Arg Ala Arg Glu Leu Gln Gly Phe Leu Asp 275 280 285 Gly Val Lys Lys Gly Gln Glu Gln Val Leu Gly Asp Leu Ser Met Ile 290 295 300 Leu Cys Asp Pro Phe Ala Ile Asn Thr Leu Ala Leu Ser Thr Val Arg 305 310 315 320 His Leu Gln Glu Leu Val Gly Gln Glu Thr Leu Pro Arg Asp Ser Pro 325 330 335 Asp Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu Leu Ala Leu Gly Gln Gly Ala Trp 340 345 350 Asp Met Ile Asp Ser Gln Val Phe Lys Glu Pro Lys Met Glu Val Glu 355 360 365 Leu Ile Thr Arg Phe Leu Pro Met Leu Met Ser Phe Leu Val Asp Asp 370 375 380 Tyr Thr Phe Asn Val Asp Gln Lys Leu Pro Ala Glu Glu Lys Ala Pro 385 390 395 400 Val Ser Tyr Pro Asn Thr Leu Pro Glu Ser Phe Thr Lys Phe Leu Gln 405 410 415 Glu Gln Arg Met Ala Cys Glu Val Gly Leu Tyr Tyr Val Leu His Ile 420 425 430 Thr Lys Gln Arg Asn Lys Asn Ala Leu Leu Arg Leu Leu Pro Gly Leu 435 440 445 Val Glu Thr Phe Gly Asp Leu Ala Phe Gly Asp Ile Phe Leu His Leu 450 455 460 Leu Thr Gly Asn Leu Ala Leu Leu Ala Asp Glu Phe Ala Leu Glu Asp 465 470 475 480 Phe Cys Ser Ser Leu Phe Asp Gly Phe Phe Leu Thr Ala Ser Pro Arg 485 490 495 Lys Glu Asn Val His Arg His Ala Leu Arg Leu Leu Ile His Leu His 500 505 510 Pro Arg Val Ala Pro Ser Lys Leu Glu Ala Leu Gln Lys Ala Leu Glu 515 520 525 Pro Thr Gly Gln Ser Gly Glu Ala Val Lys Glu Leu Tyr Ser Gln Leu 530 535 540 Gly Glu Lys Leu Glu Gln Leu Asp His Arg Lys Pro Ser Pro Ala Gln 545 550 555 560 Ala Ala Glu Thr Pro Ala Leu Glu Leu Pro Leu Pro Ser Val Pro Ala 565 570 575 Pro Ala Pro Leu 580

【０２１４】 <210> 5 <211> 2211 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (27)..(1769) <400> 5 gggcgggggc cgtgccggac gccatc atg gac gag gac tac tac ggg agc gcg 53 Met Asp Glu Asp Tyr Tyr Gly Ser Ala 1 5 gcc gag tgg ggc gac gag gct gac ggc ggc cag cag gag gat gat tct 101 Ala Glu Trp Gly Asp Glu Ala Asp Gly Gly Gln Gln Glu Asp Asp Ser 10 15 20 25 gga gaa gga gag gat gat gcg gag gtt cag caa gaa tgc ctg cat aaa 149 Gly Glu Gly Glu Asp Asp Ala Glu Val Gln Gln Glu Cys Leu His Lys 30 35 40 ttt tcc acc cgg gat tat atc atg gaa ccc tcc atc ttc aac act ctg 197 Phe Ser Thr Arg Asp Tyr Ile Met Glu Pro Ser Ile Phe Asn Thr Leu 45 50 55 aag agg tat ttt cag gca gga ggg tct cca gag aat gtt atc cag ctc 245 Lys Arg Tyr Phe Gln Ala Gly Gly Ser Pro Glu Asn Val Ile Gln Leu 60 65 70 tta tct gaa aac tac acc gct gtg gcc cag act gtg aac ctg ctg gcc 293 Leu Ser Glu Asn Tyr Thr Ala Val Ala Gln Thr Val Asn Leu Leu Ala 75 80 85 gag tgg ctc att cag aca ggt gtt gag cca gtg cag gtt cag gaa act 341 Glu Trp Leu Ile Gln Thr Gly Val Glu Pro Val Gln Val Gln Glu Thr 90 95 100 105 gtg gaa aat cac ttg aag agt ttg ctg atc aaa cat ttt gac ccc cgc 389 Val Glu Asn His Leu Lys Ser Leu Leu Ile Lys His Phe Asp Pro Arg 110 115 120 aaa gca gat tct att ttt act gaa gaa gga gag acc cca gcg tgg ctg 437 Lys Ala Asp Ser Ile Phe Thr Glu Glu Gly Glu Thr Pro Ala Trp Leu 125 130 135 gaa cag atg att gca cat acc acg tgg cgg gac ctt ttt tat aaa ctg 485 Glu Gln Met Ile Ala His Thr Thr Trp Arg Asp Leu Phe Tyr Lys Leu 140 145 150 gct gaa gcc cat cca gac tgt ttg atg ctg aac ttc acc gtt aag ctt 533 Ala Glu Ala His Pro Asp Cys Leu Met Leu Asn Phe Thr Val Lys Leu 155 160 165 att tct gac gca ggg tac cag ggg gag atc acc agt gtg tcc aca gca 581 Ile Ser Asp Ala Gly Tyr Gln Gly Glu Ile Thr Ser Val Ser Thr Ala 170 175 180 185 tgc cag cag cta gaa gtg ttc tcg aga gtg ctc cgg acc tct cta gct 629 Cys Gln Gln Leu Glu Val Phe Ser Arg Val Leu Arg Thr Ser Leu Ala 190 195 200 aca att tta gat gga gga gaa gaa aac ctt gaa aaa aat ctc cct gag 677 Thr Ile Leu Asp Gly Gly Glu Glu Asn Leu Glu Lys Asn Leu Pro Glu 205 210 215 ttt gcc aag atg gtg tgc cac ggg gag cac acg tac ctg ttt gcc cag 725 Phe Ala Lys Met Val Cys His Gly Glu His Thr Tyr Leu Phe Ala Gln 220 225 230 gcc atg atg tcc gtg ctg gcc cag gag gag cag ggg ggc tcc gct gtg 773 Ala Met Met Ser Val Leu Ala Gln Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ala Val 235 240 245 cgc agg atc gcc cag gaa gtg cag cgc ttt gcc cag gag aaa ggt cat 821 Arg Arg Ile Ala Gln Glu Val Gln Arg Phe Ala Gln Glu Lys Gly His 250 255 260 265 gac gcc agt cag atc aca cta gcc ttg ggc aca gct gcc tcc tac ccc 869 Asp Ala Ser Gln Ile Thr Leu Ala Leu Gly Thr Ala Ala Ser Tyr Pro 270 275 280 agg gcc tgc cag gct ctc ggg gcc atg ctg tcc aaa gga gcc ctg aac 917 Arg Ala Cys Gln Ala Leu Gly Ala Met Leu Ser Lys Gly Ala Leu Asn 285 290 295 cct gct gac atc acc gtc ctg ttc aag atg ttc aca agc atg gac cct 965 Pro Ala Asp Ile Thr Val Leu Phe Lys Met Phe Thr Ser Met Asp Pro 300 305 310 cct ccg gtt gaa ctt atc cgc gtt cca gcc ttc ctg gac ctg ttc atg 1013 Pro Pro Val Glu Leu Ile Arg Val Pro Ala Phe Leu Asp Leu Phe Met 315 320 325 cag tca ctc ttt aaa cca ggg gct cgg atc aac cag gac cac aag cac 1061 Gln Ser Leu Phe Lys Pro Gly Ala Arg Ile Asn Gln Asp His Lys His 330 335 340 345 aaa tac atc cac atc ttg gcg tac gca gca agc gtg gtt gag acc tgg 1109 Lys Tyr Ile His Ile Leu Ala Tyr Ala Ala Ser Val Val Glu Thr Trp 350 355 360 aag aag aac aag cga gtg agc atc aat aaa gat gag ctg aag tca acg 1157 Lys Lys Asn Lys Arg Val Ser Ile Asn Lys Asp Glu Leu Lys Ser Thr 365 370 375 tca aaa gct gtc gaa acc gtt cac aat ttg tgt tgc aac gag aac aaa 1205 Ser Lys Ala Val Glu Thr Val His Asn Leu Cys Cys Asn Glu Asn Lys 380 385 390 ggg gcc tct gaa cta gtg gca gaa ttg agc aca ctt tat cag tgt att 1253 Gly Ala Ser Glu Leu Val Ala Glu Leu Ser Thr Leu Tyr Gln Cys Ile 395 400 405 agg ttt cca gtg gta gca atg ggt gtg ctg aag tgg gtg gat tgg act 1301 Arg Phe Pro Val Val Ala Met Gly Val Leu Lys Trp Val Asp Trp Thr 410 415 420 425 gta tca gaa cca agg tac ttt cag ctg cag act gac cat acc cct gtc 1349 Val Ser Glu Pro Arg Tyr Phe Gln Leu Gln Thr Asp His Thr Pro Val 430 435 440 cac ctg gcg ttg ctg gat gag atc agc acc tgc cac cag ctc ctg cac 1397 His Leu Ala Leu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Cys His Gln Leu Leu His 445 450 455 ccc cag gtc ctg cag ctg ctt gtt aag ctt ttt gag act gag cac tcc 1445 Pro Gln Val Leu Gln Leu Leu Val Lys Leu Phe Glu Thr Glu His Ser 460 465 470 cag ctg gac gtg atg gag cag ctt gag ttg aag aag aca ctg ctg gac 1493 Gln Leu Asp Val Met Glu Gln Leu Glu Leu Lys Lys Thr Leu Leu Asp 475 480 485 agg atg gtt cac ctg ctg agt cga ggt tat gta ctt cct gtt gtc agt 1541 Arg Met Val His Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Val Leu Pro Val Val Ser 490 495 500 505 tac atc cga aag tgt ctg gag aag ctg gac act gac att tca ctc att 1589 Tyr Ile Arg Lys Cys Leu Glu Lys Leu Asp Thr Asp Ile Ser Leu Ile 510 515 520 cgc tat ttt gtc act gag gtg ctg gac gtc att gct cct cct tat acc 1637 Arg Tyr Phe Val Thr Glu Val Leu Asp Val Ile Ala Pro Pro Tyr Thr 525 530 535 tct gac ttc gtg caa ctt ttc ctc ccc atc ctg gag aat gac agc atc 1685 Ser Asp Phe Val Gln Leu Phe Leu Pro Ile Leu Glu Asn Asp Ser Ile 540 545 550 gca ggt acc atc aaa acg gaa ggc gag cat gac cct gtg acg gag ttt 1733 Ala Gly Thr Ile Lys Thr Glu Gly Glu His Asp Pro Val Thr Glu Phe 555 560 565 ata gct cac tgc aaa tct aac ttc atc atg gtg aac taatttagag 1779 Ile Ala His Cys Lys Ser Asn Phe Ile Met Val Asn 570 575 580 catcctccag agctgaagca gaacattcca gaacccgttg tggaaaaacc ctttcaagaa 1839 gctgttttaa gaggctctgg cagcgtcttg aaaatgggca ccgctgggag gaggtggatg 1899 acttctttac aaaggaaaat ggtagcagct tcagtgagaa actgccctta caaacagtcc 1959 cttctctgct gtcaatccaa tactgctccc aaatcctgtt ttcagtgttc atttccctca 2019 aggcaggcgc tgggctccca cgacccctca ggacagatct ggccgtcaag cgcgggccgc 2079 tgggaactcc actcggggaa ctcctttcca agctgacctc agttttctca caagaaccca 2139 gttagctgat gttttattgt aattgtctta atttgctaag aacaagtaat aagtaaattt 2199 ttaaaaagcc tt 2211

【０２１５】 <210> 6 <211> 581 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Asp Glu Asp Tyr Tyr Gly Ser Ala Ala Glu Trp Gly Asp Glu Ala 1 5 10 15 Asp Gly Gly Gln Gln Glu Asp Asp Ser Gly Glu Gly Glu Asp Asp Ala 20 25 30 Glu Val Gln Gln Glu Cys Leu His Lys Phe Ser Thr Arg Asp Tyr Ile 35 40 45 Met Glu Pro Ser Ile Phe Asn Thr Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Ala Gly 50 55 60 Gly Ser Pro Glu Asn Val Ile Gln Leu Leu Ser Glu Asn Tyr Thr Ala 65 70 75 80 Val Ala Gln Thr Val Asn Leu Leu Ala Glu Trp Leu Ile Gln Thr Gly 85 90 95 Val Glu Pro Val Gln Val Gln Glu Thr Val Glu Asn His Leu Lys Ser 100 105 110 Leu Leu Ile Lys His Phe Asp Pro Arg Lys Ala Asp Ser Ile Phe Thr 115 120 125 Glu Glu Gly Glu Thr Pro Ala Trp Leu Glu Gln Met Ile Ala His Thr 130 135 140 Thr Trp Arg Asp Leu Phe Tyr Lys Leu Ala Glu Ala His Pro Asp Cys 145 150 155 160 Leu Met Leu Asn Phe Thr Val Lys Leu Ile Ser Asp Ala Gly Tyr Gln 165 170 175 Gly Glu Ile Thr Ser Val Ser Thr Ala Cys Gln Gln Leu Glu Val Phe 180 185 190 Ser Arg Val Leu Arg Thr Ser Leu Ala Thr Ile Leu Asp Gly Gly Glu 195 200 205 Glu Asn Leu Glu Lys Asn Leu Pro Glu Phe Ala Lys Met Val Cys His 210 215 220 Gly Glu His Thr Tyr Leu Phe Ala Gln Ala Met Met Ser Val Leu Ala 225 230 235 240 Gln Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ala Val Arg Arg Ile Ala Gln Glu Val 245 250 255 Gln Arg Phe Ala Gln Glu Lys Gly His Asp Ala Ser Gln Ile Thr Leu 260 265 270 Ala Leu Gly Thr Ala Ala Ser Tyr Pro Arg Ala Cys Gln Ala Leu Gly 275 280 285 Ala Met Leu Ser Lys Gly Ala Leu Asn Pro Ala Asp Ile Thr Val Leu 290 295 300 Phe Lys Met Phe Thr Ser Met Asp Pro Pro Pro Val Glu Leu Ile Arg 305 310 315 320 Val Pro Ala Phe Leu Asp Leu Phe Met Gln Ser Leu Phe Lys Pro Gly 325 330 335 Ala Arg Ile Asn Gln Asp His Lys His Lys Tyr Ile His Ile Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Ala Ser Val Val Glu Thr Trp Lys Lys Asn Lys Arg Val Ser 355 360 365 Ile Asn Lys Asp Glu Leu Lys Ser Thr Ser Lys Ala Val Glu Thr Val 370 375 380 His Asn Leu Cys Cys Asn Glu Asn Lys Gly Ala Ser Glu Leu Val Ala 385 390 395 400 Glu Leu Ser Thr Leu Tyr Gln Cys Ile Arg Phe Pro Val Val Ala Met 405 410 415 Gly Val Leu Lys Trp Val Asp Trp Thr Val Ser Glu Pro Arg Tyr Phe 420 425 430 Gln Leu Gln Thr Asp His Thr Pro Val His Leu Ala Leu Leu Asp Glu 435 440 445 Ile Ser Thr Cys His Gln Leu Leu His Pro Gln Val Leu Gln Leu Leu 450 455 460 Val Lys Leu Phe Glu Thr Glu His Ser Gln Leu Asp Val Met Glu Gln 465 470 475 480 Leu Glu Leu Lys Lys Thr Leu Leu Asp Arg Met Val His Leu Leu Ser 485 490 495 Arg Gly Tyr Val Leu Pro Val Val Ser Tyr Ile Arg Lys Cys Leu Glu 500 505 510 Lys Leu Asp Thr Asp Ile Ser Leu Ile Arg Tyr Phe Val Thr Glu Val 515 520 525 Leu Asp Val Ile Ala Pro Pro Tyr Thr Ser Asp Phe Val Gln Leu Phe 530 535 540 Leu Pro Ile Leu Glu Asn Asp Ser Ile Ala Gly Thr Ile Lys Thr Glu 545 550 555 560 Gly Glu His Asp Pro Val Thr Glu Phe Ile Ala His Cys Lys Ser Asn 565 570 575 Phe Ile Met Val Asn 580

【０２１６】 <210> 7 <211> 1140 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1140) <400> 7 atg ttg gtg ata ccc ccc gga ctg agc gag gaa gag gag gct ctg cag 48 Met Leu Val Ile Pro Pro Gly Leu Ser Glu Glu Glu Glu Ala Leu Gln 1 5 10 15 aag aaa ttc aac aag ctc aag aaa aag aaa aag gca ttg ctg gct ctg 96 Lys Lys Phe Asn Lys Leu Lys Lys Lys Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu 20 25 30 aag aag caa agt agc agc agc aca acc agc caa ggt ggt gtc aaa cgc 144 Lys Lys Gln Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ser Gln Gly Gly Val Lys Arg 35 40 45 tca cta tca gag cag cct gtc atg gac aca gcc aca gca aca gag cag 192 Ser Leu Ser Glu Gln Pro Val Met Asp Thr Ala Thr Ala Thr Glu Gln 50 55 60 gca aag cag ctg gtg aag tca gga gcc atc agt gcc atc aag gct gag 240 Ala Lys Gln Leu Val Lys Ser Gly Ala Ile Ser Ala Ile Lys Ala Glu 65 70 75 80 acc aag aac tca ggc ttc aag cgt tct cga acc ctt gag ggg aag tta 288 Thr Lys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Ser Arg Thr Leu Glu Gly Lys Leu 85 90 95 aag gac ccc gag aag gga cca gtc ccc act ttc cag ccg ttc cag agg 336 Lys Asp Pro Glu Lys Gly Pro Val Pro Thr Phe Gln Pro Phe Gln Arg 100 105 110 agc ata tct gct gat gat gac ctg caa gag tca tcc aga cgt ccc cag 384 Ser Ile Ser Ala Asp Asp Asp Leu Gln Glu Ser Ser Arg Arg Pro Gln 115 120 125 agg aaa tct ctg tat gag agc ttt gtg tct tct agt gat cga ctt cga 432 Arg Lys Ser Leu Tyr Glu Ser Phe Val Ser Ser Ser Asp Arg Leu Arg 130 135 140 gaa cta gga cca gat gga gaa gag gca gag ggc cca ggg gct ggt gat 480 Glu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Glu Ala Glu Gly Pro Gly Ala Gly Asp 145 150 155 160 ggt ccc cct cga agc ttt gac tgg ggc tat gaa gaa cgc agt ggt gcc 528 Gly Pro Pro Arg Ser Phe Asp Trp Gly Tyr Glu Glu Arg Ser Gly Ala 165 170 175 cac tcc tca gcc tcc cct ccc cga agc cgc agc cgg gac cgc agc cat 576 His Ser Ser Ala Ser Pro Pro Arg Ser Arg Ser Arg Asp Arg Ser His 180 185 190 gag agg aac cgg gac aga gac cga gat cgg gag cgg gat cga gac cgg 624 Glu Arg Asn Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg 195 200 205 gat cga gac aga gac aga gag cgg gac agg gat cgg gat cgg gat cga 672 Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg 210 215 220 gat cga gac cgg gaa cgg gac agg gat cgg gag cgg gat cga gac cga 720 Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg 225 230 235 240 gac cga gag ggt cct ttc cgc agg tcg gat tca ttc cct gaa cgg cga 768 Asp Arg Glu Gly Pro Phe Arg Arg Ser Asp Ser Phe Pro Glu Arg Arg 245 250 255 gcc cct agg aaa ggg aat act ctc tat gta tat gga gaa gac atg aca 816 Ala Pro Arg Lys Gly Asn Thr Leu Tyr Val Tyr Gly Glu Asp Met Thr 260 265 270 ccc acc ctt ctc cgt ggg gcc ttc tct cct ttt gga aac atc att gac 864 Pro Thr Leu Leu Arg Gly Ala Phe Ser Pro Phe Gly Asn Ile Ile Asp 275 280 285 ctc tcc atg gac cca ccc aga aac tgt gcc ttc gtc acc tat gaa aag 912 Leu Ser Met Asp Pro Pro Arg Asn Cys Ala Phe Val Thr Tyr Glu Lys 290 295 300 atg gag tca gca gat cag gcc gtt gct gag ctc aac ggg acc cag gtg 960 Met Glu Ser Ala Asp Gln Ala Val Ala Glu Leu Asn Gly Thr Gln Val 305 310 315 320 gag tct gta cag ctc aaa gtc aac ata gcc cga aaa cag ccc atg ctg 1008 Glu Ser Val Gln Leu Lys Val Asn Ile Ala Arg Lys Gln Pro Met Leu 325 330 335 gat gcc gct act ggc aag tct gtc tgg ggc tcc ctc gct gtc cag aac 1056 Asp Ala Ala Thr Gly Lys Ser Val Trp Gly Ser Leu Ala Val Gln Asn 340 345 350 agc cct aag ggt tgc cac cgg gac aag agg acc cag att gtc tac agt 1104 Ser Pro Lys Gly Cys His Arg Asp Lys Arg Thr Gln Ile Val Tyr Ser 355 360 365 gat gac gtc tac aag gaa aac ctt gtg gat ggc ttc 1140 Asp Asp Val Tyr Lys Glu Asn Leu Val Asp Gly Phe 370 375 380

【０２１７】 <210> 8 <211> 380 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Leu Val Ile Pro Pro Gly Leu Ser Glu Glu Glu Glu Ala Leu Gln 1 5 10 15 Lys Lys Phe Asn Lys Leu Lys Lys Lys Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu 20 25 30 Lys Lys Gln Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ser Gln Gly Gly Val Lys Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Glu Gln Pro Val Met Asp Thr Ala Thr Ala Thr Glu Gln 50 55 60 Ala Lys Gln Leu Val Lys Ser Gly Ala Ile Ser Ala Ile Lys Ala Glu 65 70 75 80 Thr Lys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Ser Arg Thr Leu Glu Gly Lys Leu 85 90 95 Lys Asp Pro Glu Lys Gly Pro Val Pro Thr Phe Gln Pro Phe Gln Arg 100 105 110 Ser Ile Ser Ala Asp Asp Asp Leu Gln Glu Ser Ser Arg Arg Pro Gln 115 120 125 Arg Lys Ser Leu Tyr Glu Ser Phe Val Ser Ser Ser Asp Arg Leu Arg 130 135 140 Glu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Glu Ala Glu Gly Pro Gly Ala Gly Asp 145 150 155 160 Gly Pro Pro Arg Ser Phe Asp Trp Gly Tyr Glu Glu Arg Ser Gly Ala 165 170 175 His Ser Ser Ala Ser Pro Pro Arg Ser Arg Ser Arg Asp Arg Ser His 180 185 190 Glu Arg Asn Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg 195 200 205 Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg 210 215 220 Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg 225 230 235 240 Asp Arg Glu Gly Pro Phe Arg Arg Ser Asp Ser Phe Pro Glu Arg Arg 245 250 255 Ala Pro Arg Lys Gly Asn Thr Leu Tyr Val Tyr Gly Glu Asp Met Thr 260 265 270 Pro Thr Leu Leu Arg Gly Ala Phe Ser Pro Phe Gly Asn Ile Ile Asp 275 280 285 Leu Ser Met Asp Pro Pro Arg Asn Cys Ala Phe Val Thr Tyr Glu Lys 290 295 300 Met Glu Ser Ala Asp Gln Ala Val Ala Glu Leu Asn Gly Thr Gln Val 305 310 315 320 Glu Ser Val Gln Leu Lys Val Asn Ile Ala Arg Lys Gln Pro Met Leu 325 330 335 Asp Ala Ala Thr Gly Lys Ser Val Trp Gly Ser Leu Ala Val Gln Asn 340 345 350 Ser Pro Lys Gly Cys His Arg Asp Lys Arg Thr Gln Ile Val Tyr Ser 355 360 365 Asp Asp Val Tyr Lys Glu Asn Leu Val Asp Gly Phe 370 375 380

【０２１８】 <210> 9 <211> 388 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flag tag peptide is fused to N-terminus of human RD protein <400> 9 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Leu Val Ile Pro Pro Gly Leu 1 5 10 15 Ser Glu Glu Glu Glu Ala Leu Gln Lys Lys Phe Asn Lys Leu Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Lys Lys Gln Ser Ser Ser Ser Thr 35 40 45 Thr Ser Gln Gly Gly Val Lys Arg Ser Leu Ser Glu Gln Pro Val Met 50 55 60 Asp Thr Ala Thr Ala Thr Glu Gln Ala Lys Gln Leu Val Lys Ser Gly 65 70 75 80 Ala Ile Ser Ala Ile Lys Ala Glu Thr Lys Asn Ser Gly Phe Lys Arg 85 90 95 Ser Arg Thr Leu Glu Gly Lys Leu Lys Asp Pro Glu Lys Gly Pro Val 100 105 110 Pro Thr Phe Gln Pro Phe Gln Arg Ser Ile Ser Ala Asp Asp Asp Leu 115 120 125 Gln Glu Ser Ser Arg Arg Pro Gln Arg Lys Ser Leu Tyr Glu Ser Phe 130 135 140 Val Ser Ser Ser Asp Arg Leu Arg Glu Leu Gly Pro Asp Gly Glu Glu 145 150 155 160 Ala Glu Gly Pro Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Arg Ser Phe Asp Trp 165 170 175 Gly Tyr Glu Glu Arg Ser Gly Ala His Ser Ser Ala Ser Pro Pro Arg 180 185 190 Ser Arg Ser Arg Asp Arg Ser His Glu Arg Asn Arg Asp Arg Asp Arg 195 200 205 Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg 210 215 220 Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg 225 230 235 240 Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Gly Pro Phe Arg Arg 245 250 255 Ser Asp Ser Phe Pro Glu Arg Arg Ala Pro Arg Lys Gly Asn Thr Leu 260 265 270 Tyr Val Tyr Gly Glu Asp Met Thr Pro Thr Leu Leu Arg Gly Ala Phe 275 280 285 Ser Pro Phe Gly Asn Ile Ile Asp Leu Ser Met Asp Pro Pro Arg Asn 290 295 300 Cys Ala Phe Val Thr Tyr Glu Lys Met Glu Ser Ala Asp Gln Ala Val 305 310 315 320 Ala Glu Leu Asn Gly Thr Gln Val Glu Ser Val Gln Leu Lys Val Asn 325 330 335 Ile Ala Arg Lys Gln Pro Met Leu Asp Ala Ala Thr Gly Lys Ser Val 340 345 350 Trp Gly Ser Leu Ala Val Gln Asn Ser Pro Lys Gly Cys His Arg Asp 355 360 365 Lys Arg Thr Gln Ile Val Tyr Ser Asp Asp Val Tyr Lys Glu Asn Leu 370 375 380 Val Asp Gly Phe 385

【０２１９】 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Ser Glu His Thr Glu Asp Leu Pro Lys 1 5

【０２２０】 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Ser Ala Gly Val Pro Phe His Ala Lys 1 5

【０２２１】 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE 9,16 <400> 12 Glu Glu Thr Val Val Glu Asn Ala Xaa Pro Asp Tyr Ala Ala Gly Xaa 1 5 10 15 Val

【０２２２】 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Pro Val Ser Tyr Pro Asn Thr Leu Pro Glu Ser Phe Thr 1 5 10

【０２２３】 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Glu Gln Leu Asp His Arg Lys Pro Ser Pro Ala Gln 1 5 10

【０２２４】 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Ser Ala Leu Phe Ser Thr Glu Leu Ser Val Leu His Asn 1 5 10

【０２２５】 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE <400> 16 His Phe Asp Pro Arg Lys 1 5

【０２２６】 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Asn Leu Pro Glu Phe Ala Lys 1 5

【０２２７】 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Tyr Ala Ala Xaa Val Val Glu Thr Trp Lys 1 5

【０２２８】 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE 15 <400> 19 Leu Phe Glu Thr Glu His Ser Gln Leu Asp Val Met Glu Gln Xaa Glu 1 5 10 15

【０２２９】 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 His Phe Asp Pro Arg Lys 1 5

【０２３０】 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Ala Leu Asn Pro Ala Asp Ile Thr Val Leu Phe Lys 1 5 10

【０２３１】 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE 3, 6 <400> 22 Ala Asp Xaa Ile Phe Xaa Glu Glu 1 5

【０２３２】 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE 7 <400> 23 Leu Phe Glu Thr Glu His Xaa Gln Leu Asp 1 5

【０２３３】 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE 13,15 <400> 24 Arg Ser Leu Ser Glu Gln Pro Val Met Asp Thr Ala Xaa Ala Xaa Glu 1 5 10 15 Gln Ala

【０２３４】 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Arg Thr Gln Ile Val Tyr Ser Asp Asp Val Tyr Lys 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はＤＲＢの構造式を示す図である。

【図２】 図２のＡはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写再構成系の
作製のための、ＨｅＬａ細胞核抽出液からの各成分（ｐ
ｏｌ ＩＩ、基本転写因子、ＤＳＩＦ）の精製フローを
示す図である。Ｂは未精製系（左６レーン）および転写
再構成系（右４レーン）におけるＤＲＢ感受性を示す図
である。＋、−はそれぞれの成分あるいは薬剤の添加／
非添加の条件を示す。Ｐ．１／Ｐ．３ ｃｏｎｃは、実
施例中１（３）の粗精製ＤＳＩＦ標品を表わす。Ｃは転
写再構成系における、各成分の添加（＋）／非添加
（−）条件でのＤＲＢ感受性を示す図である。Ｐ．１／
Ｐ．３ｃｏｎｃは粗精製ＤＳＩＦ標品を、Ｐ．３ ｄｉ
ｌは濃縮していないＰ．３を表わす。

【図３】 図３のＡはＨｅＬａ細胞核抽出液からのＮＥ
ＬＦの精製フローを示す図である。Ｂは上段の２つは、
Ｐ−ＴＥＦｂ添加（＋）／非添加（−）条件下での、mo
no Sカラムから溶出したＮＥＬＦ含有画分（１６〜２
６）、カラム通塔前の標品（ＩＮ）のＮＥＬＦ活性アッ
セイの結果を示す図である。−はＮＥＬＦ試料非添加の
コントロールである。下段は、mono Sカラム精製時の各
画分（ＩＮは通塔前、ＦＴは素通り画分、１４〜３２は
分取した溶出画分を表す）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を
示す図である。右の矢印はＮＥＬＦの各サブユニットを
示す。ＣはSuperdexゲルろ過カラム通塔時の各画分（Ｉ
Ｎは通塔前、２〜１１は分取した溶出画分を表す）のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。右の矢印はＮＥ
ＬＦの各サブユニットを、下の矢印は分子量マーカーの
溶出時を示す）。Ｄは精製したＮＥＬＦの添加量（μ
ｌ）を変えたときの、転写再構成系（ＤＳＩＦ添加）に
おける転写量およびＤＲＢ感受性を、Ｐ−ＴＥＦｂ ８
μｌ添加（左６レーン）／非添加（右６レーン）で比較
した図である。

【図４】 図４のＡはＮＥＬＦおよびＤＳＩＦの添加量
を変えたときの転写再構成系（Ｐ−ＴＥＦｂ、ＤＲＢ非
添加）の結果を示す図である。Ｅ４はアデノウイルスＥ
４遺伝子、ＭＬは主要後期遺伝子のそれぞれのプロモー
ターからの転写量を示す。右下の太い線は蓄積した短い
転写産物の位置を示す。ＢはＮＥＬＦおよびＤＳＩＦ各
２μｌをそれぞれ添加／非添加の条件での、オリゴｄＣ
テンプレートを用いたｐｏｌ ＩＩの伸長反応（反応時
間２、４、８、１６分）の結果を示す図である。

【図５】 図５はＤＳＩＦおよびＮＥＬＦを添加（＋）
／非添加（−）条件での、ＣＴＤリン酸化型ｐｏｌ Ｉ
Ｉ（ｐｏｌ ＩＩｏ）、ＣＴＤ非リン酸化型ｐｏｌＩＩ
（ｐｏｌ ＩＩａ）、ＣＴＤ欠失型ｐｏｌ ＩＩ（ｐｏｌ
ＩＩｂ）の各ｐｏｌ ＩＩについて、オリゴｄＣテンプ
レートを用いた伸長反応（反応時間２、４、８、１６
分）の結果を示す図である。

【図６】 図６はＲＤ蛋白質のアミノ酸配列を示す図で
ある。星印はロイシンジッパー様構造でのロイシン残基
の位置を表わす。ＲＤ repeatsはＲＤモチーフ、ＲＲＭ
はＲＮＡ recognitionモチーフの位置を表わす。アンダ
ーラインはＮＥＬＦｐ４６のアミノ酸配列の解析の結果
得られた、２種類の部分ペプチドの位置を表わす。

【図７】 図７のＡはＨｅＬａ細胞核抽出液（ＨｅＬａ
ＮＥ）、精製ＮＥＬＦ（purified ＮＥＬＦ）に対す
る、抗ＲＤ抗体を用いたイムノブロットの結果を示す図
である。Ｂは固定化抗ＲＤ抗体により処理したＨｅＬａ
細胞核抽出液中のＲＤ蛋白質（α−ＲＤ）、ＤＳＩＦ
（α−ｐ１６０）、Ｐ−ＴＥＦｂ（α−Ｃｄｋ９）、ｐ
ｏｌ ＩＩ（α−ＣＴＤ）の各成分をイムノブロットに
より検出した結果を示す図である。ＮＥは処理前のＨｅ
Ｌａ細胞核抽出液、ＲＤ×２／ＲＤ×４はそれぞれ抗Ｒ
Ｄ抗体で２回／４回処理後のＨｅＬａ細胞核抽出液、ｃ
ｔｒｌ×２／ｃｔｒｌ×４はそれぞれ対照用の非免疫血
清で２回／４回処理後のＨｅＬａ細胞核抽出液での結果
を表わす。ＣはＢと同じ試料について転写再構成系のＤ
ＲＢ感受性を示す図である。Ｄは抗ＲＤ抗体処理ＨｅＬ
ａ細胞核抽出液（ＲＤ×４）について、粗精製ＮＥＬＦ
（Ｄ．２２５）あるいは精製ＮＥＬＦ（purifiedＮＥＬ
Ｆ）を添加したときのＤＲＢ感受性を示す図である。ｃ
ｔｒｌ×４は対照用の非免疫血清処理ＨｅＬａ細胞核抽
出液を表す。

【図８】 図８のＡはＦｌａｇ−ＲＤ発現ＨｅＬａ細胞
からのＦｌａｇ−ＮＥＬＦ精製時の各画分のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの結果を示す図である。矢印はＦｌａｇ−ＮＥＬ
Ｆの各サブユニットを示す。ｉｎｐｕｔは抗Flag M2抗
体固定化カラム通塔前の細胞溶解液を、ＦＴは素通り画
分、１は１回目、２は１の再度通塔時、Ｗａｓｈ １、
２は高塩濃度緩衝液、Ｗａｓｈ ３はＨＧＥ．１で洗浄
時の洗浄液画分、ＥｌｕａｔｅはＨＧＥ．１による溶出
画分をあらわす。ＢはＦｌａｇ−ＮＥＬＦを用いたとき
のＤＳＩＦ添加（＋）／非添加（−）での、オリゴｄＣ
テンプレートを用いたｐｏｌ ＩＩの伸長反応（反応時
間２、４、８、１６分）の結果を示す図である。左はＦ
ｌａｇ−ＮＥＬＦ非添加、中央はＦｌａｇ−ＮＥＬＦ４
μｌ、右はＦｌａｇ−ＮＥＬＦ８μｌ添加時の結果であ
る。

【図９】 図９はＦｌａｇ−ＲＤ発現ＨｅＬａ細胞およ
び対照用のＨｅＬａ細胞の核抽出液を、固定化抗Ｆｌａ
ｇＭ２抗体で処理した際の、各画分（Ｉｎｐｕｔは処理
前の核抽出液、Ｓｕｐは抗体に結合しなかった上清、Ｐ
ｐｔは抗体と結合した画分をあらわす）中のＲＤおよび
Ｆｌａｇ−ＲＤ（α−ＲＤ）、Ｐ−ＴＥＦｂ（α−Ｃｄ
ｋ９）、ＤＳＩＦ（α−ｐ１６０）、非リン酸化型ｐｏ
ｌ ＩＩ（８ＷＧ１６）、リン酸化型ｐｏｌ ＩＩ（Ｂ
３）のイムノブロットによる検出結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高木 敏行 神奈川県川崎市宮前区鷺沼４−１−50 (72)発明者 和田 忠士 神奈川県横浜市緑区長津田４−23−２− 407 (72)発明者 長谷川 純 茨城県土浦市右籾2340−７ (72)発明者 古谷 安希子 東京都町田市旭町３丁目６番６号 協和醗 酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者 杉本 整治 東京都町田市旭町３丁目６番６号 協和醗 酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者 矢野 敬一 東京都町田市旭町３丁目６番６号 協和醗 酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者 花井 陳雄 東京都町田市旭町３丁目６番６号 協和醗 酵工業株式会社東京研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA04 CA07 CA20 DA03 DA06 EA04 GA11 GA18 GA27 HA03 HA13 HA14 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA41 DA55 DA75 EA50 FA74 GA01 GA15 GA26

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＲＮＡポリメラーゼII（以下、ｐｏｌ
   ＩＩと略す）が関与する遺伝子の転写反応において、ｐ
   ｏｌ ＩＩの伸長反応をＤＲＢ感受性誘導因子（5,6-dic
   hloro-β-D-ribofuranosylbenzimidazole sensitivity-
   inducing factor）存在下で抑制する活性を有する蛋白
   質。
2. 【請求項２】 蛋白質が、サブユニット蛋白質で構成さ
   れた蛋白質である、請求項１記載の蛋白質。
3. 【請求項３】 サブユニット蛋白質が、配列番号１０〜
   ２３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項２
   記載の蛋白質。
4. 【請求項４】 サブユニット蛋白質が、配列番号２、
   ４、６および８記載のアミノ酸配列から選ばれるアミノ
   酸配列を有する蛋白質または該蛋白質の変異体である、
   請求項２記載の蛋白質。
5. 【請求項５】 サブユニット蛋白質が、請求項４記載の
   蛋白質のＮ末端にFlagタグペプチドを付加した蛋白質で
   ある、請求項２記載の蛋白質。
6. 【請求項６】 サブユニット蛋白質が、配列番号９記載
   のアミノ酸配列を有する蛋白質である、請求項５記載の
   蛋白質。
7. 【請求項７】 配列番号１０〜２３のいずれかに記載の
   アミノ酸配列を含む蛋白質。
8. 【請求項８】 配列番号２、４、６および９記載のアミ
   ノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質また
   は配列番号２、４、６および８記載のアミノ酸配列から
   選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質の変異体。
9. 【請求項９】 請求項７または８記載の蛋白質をコード
   するＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 配列番号１、３および５記載の塩基配
    列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡ
    の変異体。
11. 【請求項１１】 請求項９または１０記載のＤＮＡをベ
    クターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載の組換え体ＤＮＡを保
    有する形質転換体。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の形質転換体を培養液
    中で培養し、請求項７または８記載の蛋白質を該培養物
    中に生成・蓄積させ、該培養物中より該蛋白質を採取す
    ることを特徴とする、該蛋白質の製造法。
14. 【請求項１４】 請求項７または８記載の蛋白質を認識
    する抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１４記載の抗体を用いた、請求
    項１、７または８記載の蛋白質を免疫学的に検出あるい
    は定量する方法。