JP4689047B2 - 新規ポリペプチド - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、シアリルルイスａ糖鎖を発現している大腸癌細胞、膵臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、シアリルルイスａ糖鎖等のタイプ１糖鎖の合成に関与するβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドを用いたタイプ１糖鎖含有糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法、該組換え体ベクターを保有する形質転換体を用いたタイプ１糖鎖含有糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法に関する。
背景技術
糖鎖は、発生・分化、細胞認識といった生命現象に関与しているほか、炎症、癌、感染症、自己免疫疾患、およびその他多くの病気の発生、進行に深く関係していると考えられている〔木幡陽・箱守仙一郎・永井克孝編，グリコバイオロジーシリーズ▲１▼〜▲６▼，講談社，（１９９３年）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３，９７（１９９３）〕。
糖鎖は、タンパク質や脂質に付加して、糖タンパク質、プロテオグリカン、または糖脂質として存在するほか、オリゴ糖としても存在する。
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖鎖はタイプ１糖鎖と呼ばれ、ルイス式血液型抗原や癌関連糖鎖抗原の骨格糖鎖を構成している。ルイス式血液型抗原としては、ルイスａ糖鎖（Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ）およびルイスｂ糖鎖〔Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕が存在する。シアリルルイスａ糖鎖〔ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕およびシアリルルイスｃ糖鎖（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）は、主に大腸癌や膵臓癌等の消化器巣の癌において高頻度に検出される癌関連糖鎖であり、シアリルルイスａ糖鎖およびシアリルルイスｃ糖鎖に対する抗体は癌の血清診断に利用されている。
白血球の炎症部位への集積やリンパ球のリンパ節へのホーミングには、接着分子セレクチン（Ｅ−、Ｐ−、およびＬ−セレクチン）とその糖鎖リガンド（シアリルルイスｘ糖鎖またはその関連糖鎖）の接着が関与していることが明らかとなっている。
シアリルルイスｘ糖鎖〔ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕の構造異性体であるシアリルルイスａ糖鎖はセレクチンと結合することから、シアリルルイスａ糖鎖は癌の転移に関与すると考えられている。また、大腸癌や膵臓癌におけるシアリルルイスａ糖鎖の発現量が、癌の予後の悪さと相関しているという報告もある。
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造は、ＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素によって合成される。これまでに３種類のＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３）の遺伝子がクローン化され、それぞれの酵素の受容基質特異性が解析されている〔特開平６−１８１７５９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，５８−６５（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，４３３−４４０（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）〕。また、基質特異性の異なる別のβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ４）の遺伝子がクローン化されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２４７９４−２４７９９（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）〕。β３Ｇａｌ−Ｔ４はガングリオシドＧＡ１、ＧＭ１またはＧＤ１ｂを合成するが、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造は合成しない。
大腸癌や膵臓癌等の消化器系の癌において、癌関連糖鎖であるシアリルルイスａ糖鎖およびシアリルルイスｃ糖鎖の合成に関与するＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素が同定できれば、該酵素または該酵素遺伝子の発現量を調べることにより、より正確な癌の診断が可能になると推定される。また、該酵素活性、または該酵素遺伝子の転写・翻訳を抑制することにより、癌転移の抑制が可能になると期待される。しかし、これまでに該酵素または該酵素遺伝子は同定されていない。大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５からＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素が部分精製されているが、該酵素の単離、該酵素のアミノ酸配列の決定、ならびに該酵素遺伝子の単離には至っていない〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１５６４９−１５６５８（１９８７）、Ａｒｃｈｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７０，６３０−６４６（１９８９）、Ａｒｃｈｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７４，１４−２５（１９８９）〕。
セレクチンに強い結合能を有する糖鎖は、セレクチンアンタゴニストとして、炎症や癌転移の治療および予防に有用である。従って、大腸癌や膵臓癌等の消化器系の癌においてシアリルルイスａ糖鎖の合成に関与しているβ１，３−ガラクトース転移酵素は、セレクチンアンタゴニストの効率的合成にも利用可能と推定される。
ヒトの乳中には、様々なオリゴ糖が存在することが知られている〔Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ，８２，９０３（１９９３）〕。ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｇｌｃ）は、ヒト乳中に多く含まれ、乳児がウイルスや微生物に感染するのを防いでいると考えられている。また、ラクト−Ｎ−テトラオースには良性の腸内細菌であるビフィズス菌の増殖を促す活性もある。一方、ウシやマウス等の動物の乳中に存在するオリゴ糖の種類は少なく、大部分がラクトースであり３糖以上のオリゴ糖はほとんど存在しない〔Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ，８２，９０３（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２９５１５（１９９５）〕。
ラクト−Ｎ−テトラオースを母核とする様々なオリゴ糖、あるいはそれらが含まれたミルクを効率よく生産することができれば、産業上非常に有用と思われる。したがって、これまでにクローン化されたＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素に比較して、ラクト−Ｎ−テトラオースを合成する活性のより高い酵素の開発は産業上重要な課題である。
発明の開示
本発明は、新規なβ１，３−ガラクトース転移酵素を有するポリペプチドを利用し、抗炎症、抗感染症、または癌転移抑制等の医薬品、乳製品等の食品、タンパク質の改善法、および癌等の疾患の診断法を提供することを目的とする。
本発明は、以下の（１）〜（４７）に関する。
（１） シアリルルイスａ糖鎖を発現している大腸癌細胞に存在する、シアリルルイスａ糖鎖の合成に関与するβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチド。
上記本発明の新規β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドは、シアリルルイスａ糖鎖を発現している大腸癌細胞のみならずシアリルルイスｃ糖鎖、ルイスａ糖鎖、ルイスｂ糖鎖等のタイプ１糖鎖を発現している大腸癌細胞、膵臓癌細胞等の消化器系癌細胞にも存在する。また、これら消化器系癌細胞に存在するタイプ１糖鎖の効率的合成に関与するβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドも、本発明のポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、公知のβ３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２およびβ３Ｇａｌ−Ｔ３とは異なる新規なβ１，３−ガラクトース転移酵素である。
（２） 以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群より選ばれるポリペプチド：
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列の３１〜３１０番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を合成可能なβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチド。
上記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該ポリペプチドの有するＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を合成可能なβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明のポリペプチドがＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を合成可能なβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するためには、配列番号１記載のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−９８（１９９０）〕等を用いて計算したときに（相同性の％を定義するための計算手段・方法等を記載する）、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
上記の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を合成可能なβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドは、公知のβ３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２およびβ３Ｇａｌ−Ｔ３とは異なる新規なβ１，３−ガラクトース転移酵素である。
（３） β１，３−ガラクトース転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，３結合でガラクトースを転移する活性である上記（１）または（２）記載のポリペプチド。
（４） β１，３−ガラクトース転移酵素活性が、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基、またはＮ−アセチルグルコサミン単糖にβ１，３結合でガラクトースを転移する活性である、上記（１）または（２）記載のポリペプチド。
（５） 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群より選ばれるＤＮＡ：
（ａ）上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列の４０２〜１３３１番目の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列の４９２〜１３３１番目の塩基配列を有するＤＮＡ、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）いずれかに記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を合成可能なβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−９８（１９９０）〕等を用いて計算したときに（相同性の％を定義するための計算手段・方法等を記載する）、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。該ＤＮＡのコードするＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を合成可能なβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドは、公知のβ３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２およびβ３Ｇａｌ−Ｔ３とは異なる新規なβ１，３−ガラクトース転移酵素である。
（６） 上記（５）記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（７） 組換え体ＤＮＡが、プラスミドｐＡＭｏ−３ＧＴ５またはプラスミドｐＢＳ−３ＧＴ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６４５）である、上記（６）記載の組換え体ＤＮＡ。
（８） 上記（５）に記載のＤＮＡ、（６）記載の組換え体ＤＮＡ、または（７）記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（９） 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、非ヒトトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物からなる群より選ばれる形質転換体である、上記（８）記載の形質転換体。
（１０） 微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、上記（９）記載の形質転換体。
（１１） 動物細胞が、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細胞から選ばれる動物細胞である、上記（９）記載の形質転換体。
（１２） 昆虫細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞からなる群より選ばれる昆虫細胞である、上記（９）記載の形質転換体。
（１３） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（１４） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（１５） 生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、上記（１４）記載の製造法。
（１６） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（１７） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳系により該ポリペプチドを合成することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（１８） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドを酵素源として用い、
（ａ）該酵素源、
（ｂ）ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、
ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン残基を非還元末端に有するオリゴ糖および
ｉｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン残基を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質、および
（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，３結合でガラクトースが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該反応産物の製造法。
（１９） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドを酵素源として用い、
（ａ）該酵素源、
（ｂ）ｉ）グルコース、
ｉｉ）グルコース残基を非還元末端に有するオリゴ糖および
ｉｉｉ）グルコース残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質からなる群より選ばれる受容基質、および
（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のグルコースまたはグルコース残基にβ１，３結合でガラクトースが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該反応産物の製造法。
（２０） 上記（９）記載の微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞由来の形質転換体からなる群より選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中に、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または該複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または該複合糖質の製造法。
（２１） 上記（９）記載の非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該糖鎖または該複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または該複合糖質の製造法。
（２２） 上記（９）記載のトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該糖鎖または該複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または該複合糖質の製造法。
（２３） 複合糖質が、糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、およびステロイド化合物等に糖鎖が結合した配糖体からなる群より選ばれる複合糖質である、上記（１８）〜（２２）のいずれか１つに記載の製造法。
（２４） 生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、上記（２１）記載の製造法。
（２５） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
（２６） 上記（５）に記載のＤＮＡまたは配列番号２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、およびこれらオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から選ばれるＤＮＡ。
（２７） オリゴヌクレオチド誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体からなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、上記（２６）記載のオリゴヌクレオチド。
（２８） 配列番号２０または２１で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
（２９） 上記（２６）〜（２８）のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
（３０） 上記（２５）または（２９）記載の方法を用いた癌または癌転移の検出法。
（３１） 上記（５）、（２６）〜（２８）記載のＤＮＡおよび配列番号２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡから得らばれるＤＮＡを用い、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
（３２） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドを認識する抗体。
（３３） 上記（３２）記載の抗体を用いる、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
（３４） 上記（３２）記載の抗体を用い、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリペプチドを検出することを特徴とする免疫組織染色法。
（３５） 上記（３２）記載の抗体を含有する免疫組織染色剤。
（３６） 上記（３２）記載の抗体を含有する、癌または癌転移の診断薬。
（３７） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有する活性を変動させる化合物のスクリーニング法。
（３８） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、抗シアリルルイスａ抗体、抗ルイスａ抗体、抗ルイスｂ抗体または抗シアリルルイスｃ抗体を用い、シアリルルイスａ糖鎖、ルイスａ糖鎖、ルイスｂ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
（３９） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、上記（３２）記載の抗体を用い、該ポリペプチド含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
（４０） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を司るプロモーターＤＮＡ。
（４１） プロモーターＤＮＡが、小腸細胞、大腸細胞、膵臓細胞、胃細胞、大腸癌細胞、膵癌細胞および胃癌細胞からなる群より選ばれる細胞で機能しているプロモーターである、上記（４０）記載のプロモーターＤＮＡ。
（４２） プロモーターＤＮＡが、ヒトまたはマウス由来のプロモーターＤＮＡである、上記（４０）または（４１）記載のプロモーターＤＮＡ。
（４３） プロモーターＤＮＡが配列番号３で表される塩基配列の１〜５０００番目の塩基配列中の連続する５０〜５０００ｂｐのＤＮＡ配列を有する、上記（４０）〜（４２）のいずれか１つに記載のプロモーターＤＮＡ。
（４４） 上記（４０）〜（４３）のいずれか１つに記載のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを用いて動物細胞を形質転換し、該形質転換体と被験試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物含量を測定することを特徴とする、該プロモータによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング法。
（４５） レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子より選ばれる遺伝子である、上記（４４）記載のスクリーニング法。
（４６） 上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異させたノックアウト動物。
（４７） ノックアウト動物がマウスである、上記（４６）記載のノックアウト動物。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のシアリルルイスａ糖鎖等のタイプ１糖鎖を合成可能なβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する新規ポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、新規β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子と略すこともある）の取得、ならびに該ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドの製造
シアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖を発現している、大腸癌細胞または膵臓癌細胞等の消化器系癌細胞より、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．（１９８９）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）社製〕やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ストラタジーン社製〕を用いる方法等があげられる。
シアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖を発現している大腸癌細胞または膵臓癌細胞等の消化器系癌細胞としては、例えば、シアリルルイスａ糖鎖を発現しているヒト大腸癌細胞株であるＣｏｌｏ２０５、Ｃｏｌｏ２０１、ＳＷ１１１６等、あるいはシアリルルイスａ糖鎖を発現しているヒト膵臓癌細胞株であるＣａｐａｎ−２等を用いることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための、クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。
具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、λＺＡＰ ＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕等をあげることができる。
宿主微生物としては、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＯＬＲ^ＴＭ Ｓｔｒａｉｎ〔ストラタジーン社より市販〕、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いることができる。
ｃＤＮＡライブラリーとして、例えば、以下のようにして作製したｃＤＮＡライブラリーをあげることができる。
ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５由来のｍＲＮＡよりＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製のｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）キットを用いてｃＤＮＡを合成する。
該ＤＮＡの両末端にＳｆｉＩリンカーを付与した後、クローニングベクターｐＡＭｏのＳｆｉＩ部位に挿入したプラスミドを作製する。
該プラスミドを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを作製する。
作製したｃＤＮＡライブラリーより目的とするＤＮＡを含むクローンを以下の方法で選択する。
上記で作製したｃＤＮＡライブラリーから、常法あるいはキィアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製のプラスミド調製キットである／ｐｌａｓｍｉｄ／ｍａｘｉ ｋｉｔ（商品番号４１０３１）等のキットを用いてプラスミドを調製する。
既知の４種のβ１，３−ガラクトース転移酵素のアミノ酸配列を比較することにより、４種のβ１，３−ガラクトース転移酵素でアミノ酸配列がよく保存されている領域を２ヶ所以上見出す。
公知の方法〔Ｃａｒｌ Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｇａｂｒｉｅｌａ Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，”ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．（１９９５）、井上純一郎・仙波憲太郎編，ザ・プロトコールシリーズ「ｃＤＮＡクローニング」，羊土社，（１９９６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，４２（１９８８）〕に従って各領域のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を有するｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーを設計し、上記で調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、ＰＣＲと略記する）〔モレキュラー・クローニング第２版およびＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕を行い、増幅断片を適当なプラスミドにサブクローニングする。
ＰＣＲ増幅断片のサブクローニングは、増幅ＤＮＡ断片をそのまま、あるいは制限酵素やＤＮＡポリメラーゼで処理後、常法によりベクターに組み込むことにより行うことができる。
ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（いずれもＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，６０６９（１９９０）〕、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，６２６４（１９９２）〕、ｐＴ７Ｂｌｕｅ〔Ｎｏｖａｇｅｎ社製〕、ｐＣＲ ＩＩ〔インビトロジェン社製、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６５７（１９９１）〕、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ〔Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ社製〕、ｐＮｏＴＡ_Ｔ７（５’→３’社製）等をあげることができる。
サブクローン化されたＰＣＲ増幅断片の塩基配列を決定することにより、既知のβ１，３−ガラクトース転移酵素のアミノ酸配列とホモロジーを有するが完全には一致しないアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を選択する。塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製〕等の塩基配列分析装置を用いて決定することができる。
上記で作製したｃＤＮＡライブラリーに対して、該ＤＮＡ断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、既知のβ１，３−ガラクトース転移酵素とホモロジーを有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡを取得することができる。プローブとしては、該ＤＮＡ断片をアイソトープあるいはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）標識したものを使用することができる。
上記の方法により取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素等で切断後、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社製〕等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
該方法により取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１で表されるポリペプチドをコードするＤＮＡ等をあげることができ、具体的には、配列番号２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
配列番号２のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、後述の実施例に記載したｐＡＭｏ−３ＧＴ５、ｐＢＳ−３ＧＴ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６４５）をあげることができる。
上記のようにして取得したＤＮＡを発現ベクターに組み込み、発現プラスミドを構築する。得られた発現プラスミドを適当な動物細胞に導入後、抗シアリルルイスａ糖鎖抗体または抗シアリルルイスｃ糖鎖抗体を用いたフルオレッセンス・アクティベーテッド・セル・ソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ；以下、ＦＡＣＳと略記する）解析により、該ＤＮＡがシアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖の合成に関与するβ１，３−ガラクトース転移酵素をコードするかどうかを調べることができる。
該発現ベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいかなるものでも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平０５−３３６９６３）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）等を用いることができる。
ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを、目的とするｃＤＮＡを選択可能な動物細胞に導入し、形質転換細胞を取得する。
該発現ベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等の方法をあげることができる。
動物細胞としては、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞のサブラインであるＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、大腸癌細胞株であるＨＣＴ−１５等をあげることができ、好ましくは、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞またはＨＣＴ−１５をあげることができる。
得られた形質転換細胞を常法により培養する。
具体的には、以下の形質転換体の培養方法をあげることができる。
形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
該培養により得られた細胞を、抗シアリルルイスａ糖鎖抗体または抗シアリルルイスｃ糖鎖抗体を用いて蛍光染色した後、ＦＡＣＳを用いて解析することにより、該発現プラスミドを導入した細胞においてシアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖量が増加するかどうか検討する。シアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖量が増加していれば、該ＤＮＡはシアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖の合成に関与する新規β１，３−ガラクトース転移酵素をコードしていると考えることができる。
シアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖と反応する抗体であればいかなるものでも、抗シアリルルイスａ糖鎖抗体または抗シアリルルイスｃ糖鎖抗体として用いることができ、例えば、抗シアリルルイスａ糖鎖抗体である１９−９（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ社製）やＫＭ２３１（Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｅｘ社製）、あるいは抗シアリルルイスｃ糖鎖抗体であるＤＵ−ＰＡＮ−２（Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｅｘ社製）をあげることができる。
以上のようにして、大腸癌細胞、膵臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、シアリルルイスａ糖鎖等のタイプ１糖鎖に属する癌関連糖鎖の合成に関与する、β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する新規ポリペプチドをコードするＤＮＡを取得することができる。
また、上記方法で取得したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択することにより、配列番号１記載のアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする目的のＤＮＡを取得することができる。
即ち、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、ウシ、サル等由来のｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングを行うことにより、目的のＤＮＡを取得することができる。
決定された新規β１，３−ガラクトース転移酵素ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても目的のＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。
また、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。
上述の方法で取得した本発明のＤＮＡおよびＤＮＡ断片を用いて、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法、あるいはＤＮＡ合成機により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号２または３で表される塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。具体的には、配列番号２０，２１等に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
（２）新規β１，３−ガラクトース転移酵素ポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドともいう）の製造
本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させ、製造することができる。
本発明のポリペプチドをコードする全長ＤＮＡを基にして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
また、該ポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは該ポリペプチドの生産率を向上させるうえで有用である。
該ＤＮＡ断片、または全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡ（組換えベクター）を作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、新規β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、新規β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、新規β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社）、ｐＧＥＭＥＸ−１〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕、ｐＱＥ−８（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター、Ｐ_ＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ ｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平０５−３３６９６３）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞またはＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ： ＣＲＬ−１５７３）等、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）〕、モレキュラー・バイオロジー ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（すべてインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じてポリペプチドを生産することができる。
発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、ニンジン、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。
培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された植物個体（トランスジェニック植物）を造成することもできる。
動物個体を用いて本発明のポリペプチドを生産することもできる。例えば、公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて、遺伝子を導入した動物中に本発明のポリペプチドを生産することができる。
プロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成・蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成・蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、新規β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドを該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、新規β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成・蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。
培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が昆虫細胞である場合、該細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
遺伝子の発現方法としては、ポリペプチド全長を発現させる以外に、β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する領域を含む部分ポリペプチドとして発現させることもできる。糖転移酵素は、一般にタイプ２型の膜タンパク質のトポロジーを有し、Ｎ末端の数から数十アミノ酸からなる細胞質領域、疎水性の高いアミノ酸配列を有する膜結合領域、数から数十アミノ酸からなる幹領域（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ）、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなっている。幹領域と触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分は、ゴルジ体内腔に露出していると考えられる。幹領域と触媒領域の境界は、Ｎ末端を欠失させたポリペプチドを作製し、どこまで欠失させると活性がなくなるかを検討することにより、実験的に求めることができる。一方、幹領域と触媒領域に関する知見のある類似の糖転移酵素とアミノ酸配列を比較することにより、幹領域と触媒領域を予想することもできる。
本発明の新規β１，３−ガラクトース転移酵素の構造も、他の糖転移酵素と同様の構造を有している。
例えば、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドの場合、Ｎ末端の７アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く１９アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも４アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなる。他のβ１，３−ガラクトース転移酵素とのアミノ酸配列上の相同性の比較、ならびに他のβ１，３−ガラクトース転移酵素の幹領域と触媒領域に関する知見〔特開平６−１８１７５９〕を基に、幹領域は少なくとも４アミノ酸からなると予想される。従って、３１番目から３１０番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、触媒領域を含むと考えられる。 上記のポリペプチド全長またはβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する領域（触媒領域）を含む部分ポリペプチドは、直接発現させる以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌タンパク質または融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、および任意の抗体のエピトープ等があげられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
具体的には、触媒部位を含むと考えられる３１番目から３１０番目までのアミノ酸配列を有するポリペプチドの手前に、シグナルペプチドを付加して発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができると考えられる。さらに、シグナルペプチドと触媒領域を含むポリペプチドの間、または触媒領域を含むポリペプチドのＣ末端に、精製・検出用のタグを付加することもできる。精製・検出用のタグとしては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、および任意の抗体のエピトープ等があげられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明ポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。
例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
細胞外に該ポリペプチドが分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、上記無細胞抽出液上清からの単離精製法と同様の手法により、該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
また、通常の糖転移酵素の精製方法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８〕に準じて精製できる。
また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。
更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
本発明のポリペプチドは、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，１６６−１６８（１９９１）〕に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる。
上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても本発明のポリペプチドを製造することができる。また、アドバンスト・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）社、パーキン・エルマー社、ファルマシアバイオテク社、プロテイン・テクノロジー・インストゥルメント（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）社、シンセセル・ベガ（Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ）社、パーセプティブ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
本発明のポリペプチドのβ１，３−ガラクトース転移酵素活性は、公知の測定法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，９８９３−９８９８（１９８３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１５６４９−１５６５８（１９８７）、Ａｒｃｈｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７０，６３０−６４６（１９８９）、Ａｒｃｈｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７４，１４−２５（１９８９）、特開平０６−１８１７５９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，５８−６５（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，４３３−４４０（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）〕に準じて測定することができる。
（３）ガラクトースがβ１，３結合で、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造
上記（２）で取得した微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞由来の形質転換体からなる群より選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中に、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または該複合糖質を採取することにより、該糖鎖または該複合糖質を製造することができる。
ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン残基に付加した構造を含有する糖鎖として、シアリルルイスａ構造を含有する糖鎖、シアリルルイスｃ構造を含有する糖鎖、ルイスａ構造を含有する糖鎖、ルイスｂ構造を含有する糖鎖、Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を含有する糖鎖、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を含有する糖鎖、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を含有する糖鎖等をあげることができる。
培養は上記（２）に準じて行うことができる。
上記形質転換体において、本発明のポリペプチドと任意の組換え糖タンパク質（例えば医薬用組換え糖タンパク質）を、糖鎖合成可能な形質転換体中で同時に生産させることにより、該組換え糖タンパク質に、ガラクトースがβ１，３結合で、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖を付加することができる。
また、上記（２）で取得した動物個体または植物個体を用い、上記（２）の方法に準じて、ガラクトースがβ１，３結合で、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該生成物を採取することにより、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該生産物を採取することにより、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
上記（２）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、水性媒体中で、糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基またはＮ−アセチルグルコサミン単糖にβ１，３結合でガラクトースが付与された反応産物を、以下の方法で製造することができる。
即ち、Ｎ−アセチルグルコサミン単糖、Ｎ−アセチルグルコサミン残基を非還元末端に有するオリゴ糖、またはＮ−アセチルグルコサミン残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質を受容基質として、上記（２）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、該受容基質、該酵素源およびウリジン−５’−二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，３結合でガラクトースが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することにより、該反応産物を製造することができる。
上記（２）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、水性媒体中で、糖鎖の非還元末端に存在するグルコース残基またはグルコース単糖にβ１，３結合でガラクトースが付与された反応産物を、以下の方法で製造することができる。
即ち、グルコース単糖、グルコース残基を非還元末端に有するオリゴ糖、またはグルコース残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質を受容基質として、上記（２）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、該受容基質、該酵素源およびＵＤＰ−Ｇａｌを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のグルコースまたはグルコース残基にβ１，３結合でガラクトースが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することにより、該反応産物を製造することができる。
酵素源は、アガラクトラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ａｇａｌａｃｔ ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ，ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を基質として、３７℃で１分間に１μモルのラクト−Ｎ−テトラオース（ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、０．１ｍＵ／ｌ〜１０，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリス等の緩衝液、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、アセトアミド等のアミド類等をあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。更に、上記（２）記載の培養により得られた形質転換体の培養液、上記（２）記載の非ヒトトランスジェニック動物より得られたミルクを水性媒体として用いることもできる。
水性媒体に、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）等の非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）等のカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネート等のアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）等の三級アミン類等、Ｇａｌ含有糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。
界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチル等が挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
ＵＤＰ−Ｇａｌとしては、市販品の他、微生物等の活性を利用して生成した反応液あるいは該反応液から精製したものを用いることができる。該ＵＤＰ−Ｇａｌは０．１〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いることができる。
上記において、Ｎ−アセチルグルコサミン残基を非還元末端に有するオリゴ糖としては、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−６ＧａｌＮＡｃ、またはこれらオリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有するオリゴ糖等をあげることができる。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質としては、上記オリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有する糖鎖を含有する複合糖質、あるいはアシアロアガラクト複合型Ｎ結合型糖鎖を含有する複合糖質等をあげることができる。
受容基質は０．０１〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いることができる。
該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ_２等の無機塩、β−メルカプトエタノール、ポリエチレングリコール等を添加することができる。
生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。
上記方法により生産される糖鎖または複合糖質より、公知の酵素的手法または化学的手法により糖鎖の一部を切り出すことができる〔日本生化学会編，続生化学実験講座，第４巻，複合糖質研究法Ｉ，ＩＩ，東京化学同人，（１９８６年）、谷口直之・鈴水明身・古川清・菅原和幸監修，グリコバイオロジー実験プロトコール，秀潤社，（１９９６年）〕。
（４）本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
上述（２）の方法により取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明のポリペプチドの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊 １９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血清より、下記方法によりポリクローナル抗体を分離、精製することができる。
抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。
例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０^−５ｍｏｌ／ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０^７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸−カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０^８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０^−４ｍｏｌ／ｌ）、チミジン（１．５×１０^−５ｍｏｌ／ｌ）およびアミノプテリン（４×１０^−７ｍｏｌ／ｌ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディズ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４（１９８８）〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させる。さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行なう。本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のポリペプチドの抗ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明のポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０^６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。抗体のクラスとは抗体のアイソタイプのことで、ヒトでは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥがあげられる。サブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、１ｇＧ３、１ｇＧ４があげられる。
抗体のタンパク質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（５）本発明のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを用いた疾患の治療や診断等への利用
本発明のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕あるいはトリプル・ヘリックス技術〔Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）〕を用いた癌転移抑制等の疾病の治療、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いたそれら癌の診断に利用することが可能である。
例えば、上記（１）記載の本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を投与することにより、本発明のポリペプチドの生産を抑制することができる。
即ち、本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を用いて、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写の抑制、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の抑制を行うことが可能である。
また、本発明のＤＮＡあるいは該ＤＮＡより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量することができる。
更に、本発明のＤＮＡをプローブとして、公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得することが可能である。
現在、多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録されている。したがって、本発明のポリペプチドをコードするヒトｃＤＮＡの配列と、データベースに登録されてるヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、本発明のポリペプチドをコードするヒト染色体遺伝子を同定し、該遺伝子の構造を明らかにできる可能性がある。ｃＤＮＡの配列と一致する染色体遺伝子配列が登録されていれば、ｃＤＮＡの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、エクソンおよびイントロン構造を決定することができる。
プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域があげられる。例えば、ヒト大腸癌細胞あるいはヒト膵臓癌細胞で、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するプロモータ領域をあげることができる。具体的には、例えば、配列番号３で表される塩基配列の１〜５０００番目の塩基配列中の連続する５０〜５０００ｂｐの配列を有するプロモーターＤＮＡをあげることができる。該プロモーターは後述のスクリーニング法に利用することができる。
糖転移酵素遺伝子には多型や変異が存在することが知られている。例えば、ＡＢＯ式血液型の決定に関与する糖転移酵素に関しては、遺伝子多型に基づくアミノ酸配列の違いにより以下の３種の酵素が生成される。
Ａ型抗原の合成に関与するα１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｂ型抗原の合成に関与するα１，３−ガラクトース転移酵素、およびＯ（Ｈ）型糖鎖の生成に関与する活性を持たない酵素〔Ｎａｔｕｒｅ，３４５，２２９−２３３（１９９０）〕。
またルイス式血液型の決定に関与するα１，３−フコース転移酵素（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ）の場合も、遺伝子多型に基づくアミノ酸配列の違いにより、活性が低下または消失した酵素が生成することが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２９２７１−２９２７８（１９９４）、Ｂｌｏｏｄ，８２，２９１５−２９１９（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２０９８７−２０９９４（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２１９９４−２１９９８（１９９７）〕。
Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ遺伝子の多型は、大腸癌における癌関連糖鎖抗原であるシアリルルイスａ糖鎖の発現と密接な関係があることが知られている〔Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，３３０−３３８（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８，５１２−５１８（１９９８）〕。
従って、Ｆｕｃ−ＴＩＩＩの多型を調べることにより、病気の診断や予後の予測を行うことができると考えられる。
本発明の新規β１，３−ガラクトース転移酵素は、大腸癌や膵臓癌においてシアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖の合成に関与することから、本遺伝子の多型を調べることにより、大腸癌や膵臓癌の診断や予後の予測に利用できる。
また、本遺伝子の多型と、本遺伝子が発現している臓器（胃、空腸、大腸、膵臓など）における疾患との関連を調べることにより、他の疾患の診断にも利用できる。
本遺伝子の多型解析は、本遺伝子の遺伝子配列情報を用いて行うことができる。具体的には、サザンブロット法、ダイレクトシークエンス法、ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ法などを用いて遺伝子多型を解析することができる〔臨床検査，４２，１５０７−１５１７（１９９８）、臨床検査，４２，１５６５−１５７０（１９９８）〕。
（６）本発明のポリペプチドの利用
（ａ）本発明の抗体作製への利用
本発明のポリペプチドを用い、上記（４）の方法により本発明の抗体を作製することができる。
（ｂ）本発明のポリペプチドを用いる糖鎖、複合糖質製造への利用
本発明のポリペプチドを用い、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
（ｃ）本発明のポリペプチドの活性に関与する物質のスクリーニングへの利用
本発明のポリペプチドは、下記（８）の（ａ）の方法により、該ポリペプチドの活性を増強または阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
（７）本発明の抗体の利用
（ａ）本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの免疫学的検出および定量
本発明のポリペプチドの免疫学的検出法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等をあげることができる。
免疫学的定量法としては、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、^１２６Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドを認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等をあげることができる。
上記検出あるいは定量法は、大腸癌、膵臓癌等の診断に利用することができる。
（ｂ）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、医薬、例えば大腸癌、膵臓癌等の疾患の治療薬として用いることができる。
本発明の抗体を含有する医薬は、治療薬として該化合物単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
（８）スクリーニング法への応用
本発明の新規β１，３−ガラクトース転移酵素ポリペプチドは、大腸癌細胞や膵臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、シアリルルイスａ糖鎖、シアリルルイスｃ糖鎖、ルイスａ糖鎖、ルイスｂ糖鎖等のタイプ１糖鎖の合成に関与することから、該ポリペプチドの活性を増強または阻害する化合物を用いて、細胞におけるタイプ１糖鎖の合成量を増加または低下させることが可能である。
また、該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写過程、あるいは転写産物からタンパク質への翻訳過程を促進または抑制する化合物は、該ポリペプチドの発現を制御し、細胞におけるタイプ１糖鎖の合成量を制御することが可能である。
タイプ１糖鎖の合成量を抑制する化合物は、癌転移抑制に有用と考えられる。一方、タイプ１糖鎖の合成量を増加させる化合物は、タイプ１糖鎖の合成に有用と考えられる。
上記の化合物は、以下（ａ）〜（ｅ）に示す方法により取得可能である。
（ａ）上記（２）で記載した方法を用いて調製した本発明の新規β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチド（精製物あるいは該ポリペプチドを発現する形質転換体の細胞抽出液または培養上清）を酵素として用い、被験試料の存在下、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，９８９３−９８９８（１９８３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１５６４９−１５６５８（１９８７）、Ａｒｃｈｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７０，６３０−６４６（１９８９）、Ａｒｃｈｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７４，１４−２５（１９８９）、特開平０６−１８１７５９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，５８−６５（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，４３３−４４０（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）〕を用いてβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を測定し、β１，３−ガラクトース転移酵素活性を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する細胞または上記（２）で記載した形質転換体を、被験試料の存在下、上記（２）の培養法で２時間から１週間培養後、細胞表面のシアリルルイスａ糖鎖、シアリルルイスｃ糖鎖、ルイスａ糖鎖、ルイスｂ糖鎖等のタイプ１糖鎖の量を、それぞれの糖鎖に対する抗体を用いて測定し、該糖鎖量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
上記抗体を用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法をあげることができる。
（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を、被験試料の存在下、上記（２）の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリペプチド量を、上記（４）で記載した本発明の抗体を用いて測定し、該ポリペプチド量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
本発明の抗体を用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法をあげることができる。
（ｄ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を、被験試料の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の量を、上記（５）で記載したノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法等の方法を用いて測定し、該転写産物量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
（ｅ）上記（４）で取得したプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだプラスミドを公知の方法により作製し、上記（２）記載の動物細胞に、上記（２）記載の方法に準じて導入し、形質転換体を取得する。該形質転換体を、被験試料の存在下、上記（２）記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を、公知の方法〔東京大学医科学研究所制癌研究部編，新細胞工学実験プロトコール，秀潤社（１９９３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，９１４（１９９６）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９，４５３（１９９６）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０，４４８（１９９５）、細胞工学，１６，５８１（１９９７）〕を用いて測定し、該発現量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子またはグリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子等をあげることができる。
（９）ノックアウト非ヒト動物の作製
本発明のＤＮＡを含むベクターを用い、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウス等の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）において染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを公知の相同組換えの手法〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等〕により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３５０，６３１５，２４３（１９９１）〕。
このようにして作成した胚性幹細胞クローンと、非ヒト動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）を用い、注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。
該キメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに任意の変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体（ノックアウト非ヒト動物）を得ることができる。
このようにして動物個体において、染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳領域中への塩基置換、欠失、挿入等の変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。
またその発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性等を改変させることも可能である。さらにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。
このような例として、脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例〔Ｃｅｌｌ，８７，７，１３１７（１９９６）〕やＣｒｅを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５，（１９９７）〕が知られている。
従って染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡについてもこのように任意の時期や組織で発現を制御できる、または任意の挿入、欠失、置換をその翻訳領域や、発現制御領域に有するノックアウト非ヒト動物を作製することが可能である。
このようなノックアウト非ヒト動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。
従って、本発明のノックアウト非ヒト動物は、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬、また機能性食品、健康食品等の評価用モデルとして非常に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下実施例を示す。遺伝子操作的手法として、断らない限りモレキュラー・クローニング第２版に記載された方法を用いた。
実施例１ 各種細胞株におけるタイプ１糖鎖の発現量と既知β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子の発現量の測定
各種ヒト癌細胞株におけるタイプ１糖鎖（シアリルルイスａ糖鎖、ルイスａ糖鎖、ルイスｂ糖鎖）の発現量と既知のヒトβ１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子の発現量を測定することにより、大腸癌細胞株あるいは膵臓癌細胞株でタイプ１糖鎖の合成に関与するβ１，３−ガラクトース転移酵素の同定を試みた。
各種細胞株におけるタイプ１糖鎖（シアリルルイスａ糖鎖、ルイスａ糖鎖、ルイスｂ糖鎖）の発現量の測定は、抗シアリルルイスａ糖鎖抗体、抗ルイスａ糖鎖抗体、または抗ルイスｂ糖鎖抗体を用いた蛍光抗体染色後、ＦＡＣＳを用いて解析することにより行った（第１図のＡ）。
各種ヒト細胞株における既知β１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３、β３Ｇａｌ−Ｔ４）遺伝子の転写物の定量は、ＲＴ−ＰＣＲ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８７，２７２５（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，２６７２９（１９９８）〕を用いて行った。各種細胞株における各β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子転写産物の量は、いずれの細胞においても同程度発現していると考えられるβ−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として表示した（第１図のＢ）。
（１）各種細胞株におけるタイプ１糖鎖（シアリルルイスａ糖鎖、ルイスａ糖鎖、ルイスｂ糖鎖）の発現量の測定
細胞株としては、大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、Ｃｏｌｏ２０１、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０、ＨＴ２９、ＷｉＤｒ、ＨＣＴ−１５、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０）、膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２）、胃癌細胞株（ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４）、肺癌細胞株（ＰＣ−１）、神経芽細胞腫細胞株（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）、リンパ腫細胞株（Ｎａｍａｌｗａ、Ｊｕｒｋａｔ）、前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）を用いた。
Ｃｏｌｏ２０５、Ｃｏｌｏ２０１、ＬＳ１８０、ＨＴ２９、ＷｉＤｒ、ＨＣＴ−１５、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、ＰＣ−１、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｎａｍａｌｗａ、ＰＣ−３はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）より入手した。また、ＳＷ１１１６（ＡＴＣＣより入手可能）およびＪｕｒｋａｔ（理研ジーンバンク；ＲＩＫＥＮ ＧＥＮＥ ＢＡＮＫより入手可能）は愛知県がんセンターの高橋博士より入手した。
上記の細胞をそれぞれの細胞に適した培地で培養後、各細胞を抗シアリルルイスａ糖鎖抗体（１９−９）、抗ルイスａ糖鎖抗体（７ＬＥ）、または抗ルイスｂ糖鎖抗体（Ｎｅｏｋｏｋｕｓａｉ社製）を用いて蛍光抗体染色し、ＦＡＣＳを用いて解析した。
具体的方法を以下に示す。
各細胞（約１×１０^６）をマイクロチューブ（１．５ｍｌ：エッペンドルフ社製）にとり、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により細胞を集めた。
該細胞を０．９ｍｌの０．１％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液ＰＢＳ（Ａ−ＰＢＳ：８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ、１．１５ｇ／ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４（無水）、０．２ｇ／ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１％アジ化ナトリウム）で洗浄した後、該洗浄細胞にＡ−ＰＢＳで約１０μｇ／ｍｌに希釈した上記抗糖鎖抗体を２０μｌ加えて懸濁し、４℃で１時間反応させた。
反応後、細胞を０．９ｍｌのＡ−ＰＢＳで１回洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光標識した抗マウスＩｇＭ／ＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）をＡ−ＰＢＳで１６倍希釈した溶液を２０μｌ加えて懸濁し、４℃で３０分間反応させた。
反応後、細胞を０．９ｍｌのＡ−ＰＢＳで１回洗浄した後、０．６ｍｌのＡ−ＰＢＳに懸濁し、フルオレッセンス・アクティベーティド・セル・ソーター〔エピックス・エリート・フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ〕；コールター（ＣＯＵＬＴＥＲ）社製〕を用いて解析を行なった。また対照実験として、抗糖鎖抗体の代わりにＡ−ＰＢＳを用いて同様の解析を行なった。
結果を第１図のＡに示す。大腸癌細胞株であるＣｏｌｏ２０５、Ｃｏｌｏ２０１、ＳＷ１１１６、および膵臓癌細胞株であるＣａｐａｎ−２においてタイプ１糖鎖が多く発現していること確認した。
（２）各種ヒト細胞株における既知β１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３、β３Ｇａｌ−Ｔ４）遺伝子の転写物の定量
（ａ）各種細胞株由来一本鎖ｃＤＮＡの調製
上記（１）記載の細胞株から酸グアニジウム チオシアネート フェノール−クロロホルム法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９〕により全ＲＮＡを抽出した。
全ＲＮＡ各々６μｇに、デオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を５単位／ｍｌずつ添加し、室温で５分間反応させた。反応後、６５℃で１５分間加熱することにより、酵素を失活させた。
得られた全ＲＮＡ各々について、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ^ＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によりｃＤＮＡを合成した。反応は２０μｌで行い、反応後の溶液を水で５０倍希釈し、使用するまで−８０℃で保管した。
（ｂ）スタンダードと内部コントロールの調製
検量線の作成に用いるスタンダードとしては、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ３、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ４の各ｃＤＮＡをｐＵＣ１１９またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）に組み込んだプラスミド（ｐＵＣ１１９−３ＧＴ１、ｐＢＳ−３ＧＴ２、ｐＢＳ−３ＧＴ３、ｐＢＳ−３ＧＴ４）を、各ｃＤＮＡ部分を切り出す適当な制限酵素で切断し、直鎖状ＤＮＡに変換したものを用いた。
ｐＵＣ１１９−３ＧＴ１は、特開平６−１８１７５９記載のプラスミドｐＵＣ１１９−ＷＭ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０１１）と同じものである。ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ３およびヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ４の各ｃＤＮＡの取得は、以下のように行った。
各ｃＤＮＡの配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより各ｃＤＮＡの断片を取得した。
取得された各ｃＤＮＡ断片をプローブとして用いて、コロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、それぞれのｃＤＮＡを取得した。ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ３およびヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ４の塩基配列を、ＬＩ−ＣＯＲ社のＤＮＡシークエンサー（ｄＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ）またはパーキンエルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７と、各シークエンサー用の反応キットを用いて決定し、それぞれヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ３、ならびにヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ４をコードすることを確認した。各ｃＤＮＡは公知の配列をもとにしたＰＣＲによっても得ることができる。
β−アクチンの転写産物定量用のスタンダードとしては、ｐＵＣ１１９−ＡＣＴをｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８）で切断して直鎖状ＤＮＡに変換したものを用いた〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９〕。
内部コントロールとしては、下記のようにして調製したプラスミド（ｐＢＳ−３ＧＴ１ｄ、ｐＢＳ−３ＧＴ２ｄ、ｐＢＳ−３ＧＴ３ｄ、ｐＢＳ−３ＧＴ４ｄ）を、各ｃＤＮＡを切り出す適当な制限酵素で切断し、直鎖状ＤＮＡに変換したものを用いた。
ｐＵＣ１１９−３ＧＴ１において、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ１ｃＤＮＡ中のＢａｎＩＩ−ＥｃｏＲＶ間２１２ｂｐを欠失させることによりｐＵＣ１１９−３ＧＴ１ｄを作製した。
ｐＢＳ−３ＧＴ２において、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ２ｃＤＮＡ中のＡｆｌＩＩ−ＢｓｔＥＩＩ間２５８ｂｐを欠失させることによりｐＢＳ−３ＧＴ２ｄを作製した。
ｐＢＳ−ＧＴ３において、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ３ｃＤＮＡ中のＳｔｙＩ−ＳｔｙＩ間１８３ｂｐを欠失させることによりｐＢＳ−３ＧＴ３ｄを作製した。
ｐＢＳ−３ＧＴ４において、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ４ｃＤＮＡ中のＡｃｃＩＩＩ−ＳｔｙＩ間２５３ｂｐを欠失させることによりｐＢＳ−３ＧＴ４ｄを作製した。
β−アクチンの転写産物定量用の内部コントロールとしては、ｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄをｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８）で切断して直鎖状ＤＮＡに変換したものを用いた〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９〕。
（ｃ）ＲＴ−ＰＣＲによる転写量の定量
上記各組織由来のｃＤＮＡ １０μｌおよび内部コントロール用プラスミド １０μｌ（１０ｆｇ）を含む５０μｌの反応溶液〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．２μｍｏｌ／ｌ 遺伝子特異的プライマー〕で、ＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ^ＴＭ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてＰＣＲを行った。
各遺伝子特異的プライマーの塩基配列を第１表に示した。また、β３Ｇａｌ−Ｔ１遺伝子特異的プライマーの塩基配列を配列番号４、５に、β３Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子特異的プライマーの塩基配列を配列番号６、７に、β３Ｇａｌ−Ｔ３遺伝子特異的プライマーの塩基配列を配列番号８、９に、β３Ｇａｌ−Ｔ４遺伝子特異的プライマーの塩基配列を配列番号１０、１１に、β−アクチン特異的プライマーの塩基配列を配列番号１２、１３に示した。

上記プライマーのセットにより、各遺伝子転写産物および各スタンダードからは、第１表のターゲットのところに示したサイズのＤＮＡ断片を増幅させることができる。一方、上記プライマーのセットにより、各内部コントロールからは、第１表のコンペティターのところに示したサイズのＤＮＡ断片を増幅させることができる。
ＰＣＲは、９５℃で１１分間の加熱後、９５℃で１分間、各遺伝子に適した第１表に記載のアニーリング温度で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子群については４２サイクル、β−アクチンについては２４サイクルの条件で行った。
ＰＣＲ後の溶液のうち１０μｌを１％のアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、写真を撮影した。写真をＮＩＨイメージシステムによりスキャニングすることにより増幅した断片の染色の強さを測定し、増幅量とした。
細胞由来ｃＤＮＡのかわりに上記で調製したスタンダードプラスミドを１．２５ｆｇ、２．５ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、２０ｆｇ、４０ｆｇ用いて、ＰＣＲを行い、増幅断片の増幅量を測定し、ｃＤＮＡの量と断片の増幅量をプロットして検量線を作成した。
この検量線と各細胞由来ｃＤＮＡでの断片の増幅量から、各細胞でのｃＤＮＡの量を計算し、これを各細胞でのｍＲＮＡ転写量すなわち遺伝子の発現量とした。なお、β−アクチンは各細胞で普遍的に発現している遺伝子と考えられるため、どの細胞においてもその発現量は同程度と考えられる。従って、各細胞におけるβ−アクチン遺伝子の発現量の差は、ｃＤＮＡ合成反応の効率の差と考えられるためβ１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子の発現量を比較する際にβ−アクチンの発現量も考慮した。
各種細胞株における各β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子転写産物の量を、β−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として表示した（第１図のＢ）。
β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２およびβ３Ｇａｌ−Ｔ３はＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を合成する活性を有しているが、タイプ１糖鎖を多く発現している大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、Ｃｏｌｏ２０１、ＳＷ１１１６）および膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−２）ではほとんど発現していなかった。一方、β３Ｇａｌ−Ｔ４は大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、Ｃｏｌｏ２０１、ＳＷ１１１６）および膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−２）で発現がみられたが、この酵素はＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を合成する活性を有していないことが明らかになっている。
以上の結果から、これらの細胞株においてタイプ１糖鎖の合成に関与しているβ１，３−ガラクトース転移酵素は、新規の酵素であることが明らかになった。
実施例２ 大腸癌細胞または膵臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、シアリルルイスａ糖鎖等のタイプ１糖鎖の合成に関与する、新規β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）のクローン化
（１）ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５からのｍＲＮＡの取得
ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５より、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製のｍＲＮＡ抽出キットであるＯｌｉｇｏｔｅｘ^ＴＭ−ｄＴ３０＜ｓｕｐｅｒ＞を用いて、約３０μｇのｍＲＮＡを取得した。
具体的試薬および方法は、キットに添付されている説明書に従った。
（２）ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５由来ｃＤＮＡのライブラリーの作製
上記（１）で取得したヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５由来のｍＲＮＡ ８μｇ、およびＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製のキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用い、オリゴｄＴをプライマーとして２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
これら二本鎖ｃＤＮＡの両末端に以下の方法でＳｆｉＩリンカーを付与した。〔ＳｆｉＩリンカーの付与〕
配列番号１４で示された一本鎖ＤＮＡおよび配列番号１５で示された一本鎖ＤＮＡをアプライド・バイオシステムズ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該合成一本鎖ＤＮＡをそれぞれ５０μｇずつ、別々に５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ_２、５ｍｍｏｌ／ｌ ジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略記する）、０．１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡおよび１ｍｍｏｌ／ｌ ＡＴＰを含む緩衝液（以下、Ｔ４キナーゼ緩衝液と略記する）５０μｌに溶解し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）３０単位を加えて、３７℃で１６時間リン酸化反応を行ない、１１塩基および８塩基のリンカーを取得した。
１１塩基のリンカー４μｇ、８塩基のリンカー２．９μｇおよび上記で合成した２本鎖ｃＤＮＡをＴ４リガーゼ緩衝液４５μｌに溶解後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１０５０単位を加え、１６℃で１６時間反応させ、該二本鎖ＤＮＡ各々にＳｆｉＩリンカーを付与した。
得られた反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ｋｂ以上のＤＮＡ断片を回収した。
直接発現クローニングベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕２４μｇを、１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ_２、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、６ｍｍｏｌ／ｌ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液（以下、Ｙ−５０緩衝液と略記する）５９０μｌに溶解後、８０単位のＳｆｉＩ（宝酒造社製、以下、特に断らないかぎり制限酵素は宝酒造社製のものを用いた）を加え、３７℃で１６時間消化反応を行なった。
該反応液に４０単位のＢａｍＨＩを加え、３７℃で２時間消化反応を行なった。該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約８．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
上記で調製したＳｆｉＩリンカーを付与したＤＮＡ（ｍＲＮＡ ８μｇ由来分）をＴ４リガーゼ緩衝液２５０μｌに溶解後、それぞれの溶解液に、該約８．８ｋｂのＤＮＡ断片２μｇおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ２０００単位を加えて、１６℃で１６時間結合反応を行なった。
反応後、それぞれの反応液にトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）５μｇを添加し、エタノール沈殿後、１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸ナトリウム）からなる緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液と略記する）２０μｌに溶解した。
該反応液を用い、エレクトロポーレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕により大腸菌ＬＥ３９２株〔モレキュラー・クローニング第２版〕を形質転換し、約１００万個のアンピシリン耐性を有する形質転換体を取得し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
更に、該ｃＤＮＡライブラリー（大腸菌）および、キィアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製のプラスミド調製キットである／ｐｌａｓｍｉｄ／ｍａｘｉ ｋｉｔ（商品番号４１０３１）を用い、ｃＤＮＡを含有するプラスミドを調製した。
（３）ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーを用いた新規β１，３−ガラクトース転移酵素ｃＤＮＡ断片の取得
既知の４種のβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３、β３Ｇａｌ−Ｔ４）のアミノ酸配列を比較することにより、４種のβ１，３−ガラクトース転移酵素でアミノ酸配列がよく保存されている領域を３ヶ所以上見出した。該３領域をＮ末端側から順にモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３と呼ぶ。上記４種のβ１，３−ガラクトース転移酵素における各モチーフのアミノ酸配列と各モチーフの最初のアミノ酸のＮ末端からの番号を第２表に示す。

公知の方法〔Ｃａｒｌ Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｇａｂｒｉｅｌａ Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，”ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．（１９９５）、井上純一郎・仙波憲太郎編，ザ・プロトコールシリーズ「ｃＤＮＡクローニング」，羊土社，（１９９６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，４２（１９８８）〕に従って、各モチーフのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーを設計した。フォワードプライマーとしてモチーフ１とモチーフ２に対応する２種の合成ＤＮＡ（それぞれの配列を配列番号１６と配列番号１７に示す）を合成した。また、リバースプライマーとして、モチーフ２とモチーフ３に対応する２種の合成ＤＮＡ（それぞれの配列を配列番号１８と配列番号１９に示す）を合成した。
配列番号１６記載のＤＮＡと配列番号１８記載のＤＮＡをプライマー、上記（２）で調製したｃＤＮＡライブラリー（プラスミド）を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅断片の末端をＤＮＡポリメラーゼ クレノー断片を用いて平滑末端に変換した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングした。また、配列番号１７記載のＤＮＡと配列番号１９記載のＤＮＡをプライマー、上記（２）で調製したｃＤＮＡライブラリー（プラスミド）を鋳型としてＰＣＲを行い、増幅断片の末端をＤＮＡポリメラーゼ クレノー断片を用いて平滑末端に変換した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングした。
上記（２）で調製したｃＤＮＡライブラリー（プラスミド１００ｎｇ）を含む５０μｌの反応溶液〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．２μｍｏｌ／ｌ プライマー〕に、１ＵのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ^ＴＭ（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を添加し、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９５℃で１１分間の加熱後、９５℃で３０秒間、３５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、４５サイクルの条件で行った。
サブクローニングしたＰＣＲ増幅断片の塩基配列は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社のキット（ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ ＥＸＣＥＬ ＩＩ Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ−ＡＬＦ：ＣａｔａｌｏｇＮｏ．ＳＥ８３０１Ａ）とＡＬＦ ＤＮＡシークエンサー（アマーシャム ファルマシア バイオテック社製）を用いて決定した。
その結果、配列番号１６記載のＤＮＡと配列番号１８記載のＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲにより、既知のβ１，３−ガラクトース転移酵素のアミノ酸配列とホモロジーを有するが完全には一致しないアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を１種取得した。
該ＤＮＡ断片のプライマー部分を除く配列は、配列番号２記載のＤＮＡの６４３番目から８５１番目の塩基配列と一致していた。
また、配列番号１７記載のＤＮＡと配列番号１９記載のＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲにより、既知のβ１，３−ガラクトース転移酵素のアミノ酸配列とホモロジーを有するが完全には一致しないアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を１種取得した。
該ＤＮＡ断片のプライマー部分を除く配列は、配列番号２記載のＤＮＡの８７６番目から１１２４番目の塩基配列と一致していた。
（４）新規β１，３−ガラクトース転移酵素ｃＤＮＡの取得
上記（３）で取得した２種のＰＣＲ増幅断片を混合後、マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）を用いて^３２Ｐで標識し、プローブを作製した。
該プローブを用いて、上記（２）で作製したｃＤＮＡライブラリーの内の５×１０^５クローンについてコロニーハイブリダイゼーションを行った。
該ハイブリダイゼーションにおいて、フィルターを、２倍濃度のＳＳＰＥ〔１倍濃度のＳＳＰＥの組成は、１８０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ リン酸二水素ナトリウム、１ｍｍｏｌ／ｌ エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）よりなる（ｐＨ７．４）〕、０．１％ＳＤＳよりなる緩衝液中で６５℃、１０分間振とうする条件で２回、１倍濃度のＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中で６５℃、１５分間振とうする条件で１回、０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中で６５℃、１０分間振とうする条件で２回洗浄した。
該コロニーハイブリダイゼーションの結果、ハイブリダイズする２個の独立したプラスミドが得られた。
（５）プラスミドｐＡＭｏ−３ＧＴ５中に挿入されているｃＤＮＡの塩基配列の決定
上記（４）で得られたプラスミドの１つであるｐＡＭｏ−３ＧＴ５が含むｃＤＮＡの全塩基配列を、以下の方法で決定した。
ｐＡＭｏベクター中の配列に特異的なプライマーを用いて、該ｃＤＮＡの５’側および３’側の配列を決定した。
決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。
該操作を繰り返すことにより、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。
塩基配列の決定には、ＬＩ−ＣＯＲ社のＤＮＡシークエンサー（ｄＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ）と反応キット（Ｓｅｑｕｉｔｈｅｒｍ ＥＸＣＥＬ ＩＩ^ＴＭ Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ^ＴＭ ＤＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ−Ｌｃ：エア・ブラウン）、またはパーキンエルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ^ＴＭ ＢｉｇＤｙｅ^ＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。
ｐＡＭｏ−３ＧＴ５が含むｃＤＮＡの全塩基配列（２７７５ｂｐ）を配列番号２に示した。
該ｃＤＮＡは、糖転移酵素に特徴的な構造を有する３１０アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。
該ポリペプチドはこれまでにクローン化された４種のヒトβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３、β３Ｇａｌ−Ｔ４）とアミノ酸レベルで２８％〜３７％の相同性を示したことから、新規なβ１，３−ガラクトース転移酵素であると考えられた。該アミノ酸配列のホモロジー解析は、配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１（ソフトウエア開発株式会社）を用いて行った。一致したアミノ酸残基数をβ３Ｇａｌ−Ｔ５のアミノ酸残基数で割ることにより、ホモロジー（％）を算出した。
該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に示した。
該ポリペプチドは、Ｎ末端の７アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く１９アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも４アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。他のβ１，３−ガラクトース転移酵素とのアミノ酸配列上の相同性の比較、ならびに他のβ１，３−ガラクトース転移酵素の幹領域と触媒領域に関する知見〔特開平６−１８１７５９〕を基に、幹領域は少なくとも４アミノ酸からなると予想された。したがって、３１番目から３１０番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、触媒領域を含むと考えられる。
以下、該ｃＤＮＡをヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５ ｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドをヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５と呼ぶ。
ｐＡＭｏ−３ＧＴ５をＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断することによりヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５ ｃＤＮＡを切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩサイト間に組み込むことにより、ｐＢＳ−３ＧＴ５を造成した（第２図）。
ｐＢＳ−３ＧＴ５を含む大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＭ２９４／ｐＢＳ−３ＧＴ５は、平成１１年２月１０日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号 郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６６４５として寄託されている。
（６）ヒトβ３ｃａｌ−Ｔ５発現プラスミドを導入したヒト培養細胞におけるタイプ１糖鎖の合成
コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）およびヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５発現プラスミド（ｐＡＭｏ−３ＧＴ５）をそれぞれ、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕によりＮａｍａｌｗａ細胞に導入し、形質転換細胞を得た。
１．６×１０^６細胞あたり４μｇのプラスミドを導入した後、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地〔７．５％ ＮａＨＣＯ_３を１／４０量、２００ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、５０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を０．５％添加したＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）〕８ｍｌに懸濁し、ＣＯ_２インキュベーターで３７℃で２４時間培養した。
培養後、Ｇ４１８（ギブコ社製）を０．８ｍｇ／ｍｌになるように添加し、更に１４日間培養し安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＲＰＭＩ１６４０で継代した。
該形質転換細胞について、抗シアリルルイスｄ糖鎖抗体（ＤＵ−ＰＡＮ−２：Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｅｘ社製）を用いて間接蛍光抗体染色を行なった。
間接蛍光抗体染色は、実施例１の（１）に記載した方法に従って行った。その結果、ｐＡＭｏ−３ＧＴ５を導入した細胞においては、ｐＡＭｏを導入した細胞に比較して、抗シアリルルイスｃ糖鎖抗体（ＤＵ−ＰＡＮ−２）への反応性が大幅に増加していた（第３図のＡ）。
また、コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）およびヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５発現プラスミド（ｐＡＭｏ−３ＧＴ５）を上記と同様の方法により、タイプ１糖鎖を発現していない大腸癌細胞株であるＨＣＴ−１５に導入し、安定形質転換細胞を得た。次いで、限界希釈法を用いて該形質転換細胞からシングルクローン（ＨＣＴ−３ＧＴ５ＬおよびＨＣＴ−３ＧＴ５Ｈ）を取得した。ＨＣＴ−３ＧＴ５Ｌにおけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５転写物の量は、ＨＣＴ−３ＧＴ５Ｈにおけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５転写物の量に比較して少ない（実施例４および第３表参照）。該シングルクローンは、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＲＰＭＩ１６４０で継代した。
取得したシングルクローン（ＨＣＴ−３ＧＴ５Ｈ）について、抗シアリルルイスａ糖鎖抗体（１９−９）、抗シアリルルイスｃ糖鎖抗体（ＤＵ−ＰＡＮ−２：Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｅｘ社製）、抗ルイスａ糖鎖抗体（７ＬＥ）、または抗ルイスｂ糖鎖抗体（ネオ国際社製）を用いて間接蛍光抗体染色を行なった。
間接蛍光抗体染色は、実施例１の（１）に記載した方法に従って行った。その結果、ｐＡＭｏ−３ＧＴ５を導入した細胞においては、ｐＡＭｏを導入した細胞に比較して、４種の抗体全てへの反応性が大幅に増加していることが明らかになった（第３図のＢ）。
以上の結果から、β３Ｇａｌ−Ｔ５は形質転換細胞中で、タイプ１糖鎖（シアリルルイスａ糖鎖、シアリルルイスｃ糖鎖、ルイスａ糖鎖およびルイスｂ糖鎖）を合成可能であることが示された。
またこの結果は、β３Ｇａｌ−Ｔ５を細胞で発現させることにより、タイプ１糖鎖（シアリルルイスａ糖鎖、シアリルルイスｃ糖鎖、ルイスａ糖鎖およびルイスｂ糖鎖等）を含有する糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質を新たに合成できることを意味している。
以上のことより、β３Ｇａｌ−Ｔ５を発現させた細胞を宿主として、有用な糖タンパク質を分泌生産することにより、分泌生産される糖タンパク質にタイプ１糖鎖（シアリルルイスａ糖鎖、シアリルルイスｃ糖鎖、ルイスａ糖鎖およびルイスｂ糖鎖等）を付与することが可能である。
（７）各種ヒト細胞株におけるヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５遺伝子の転写物の定量
実施例１の（２）の方法に従って、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５遺伝子の転写物の定量を行った。
鋳型として用いる各種細胞株由来一本鎖ｃＤＮＡは、実施例１（１）で調製したものを使用した。
検量線の作成に用いるスタンダードとしては、上記（５）で造成したヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）に組み込んだプラスミド（ｐＢＳ−３ＧＴ５）を、ｃＤＮＡ部分を切り出す適当な制限酵素で切断し、直鎖状ＤＮＡに変換したものを用いた。
内部コントロールとしては、下記のようにして調製したプラスミド（ｐＢＳ−３ＧＴ５ｄ）を、ｃＤＮＡを切り出す適当な制限酵素で切断し、直鎖状ＤＮＡに変換したものを用いた。
ｐＢＳ−３ＧＴ５において、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡ中のＥｃｏ８１Ｉ−ＸｃｍＩ間１４４ｂｐを欠失させることによりｐＢＳ−３ＧＴ５ｄを作成した。
ＲＴ−ＰＣＲによる転写量の定量は、β３Ｇａｌ−Ｔ５特異的プライマーを用いて、実施例１の（２）と同様にして行った。β３Ｇａｌ−Ｔ５特異的プライマーの塩基配列を第１表ならびに配列番号２０、２１に示した。
β３Ｇａｌ−Ｔ５特異的プライマーにより、β３Ｇａｌ−Ｔ５遺伝子転写産物およびスタンダードからは、第１表のターゲットのところに示したサイズ（５５４ｂｐ）のＤＮＡ断片を増幅させることができる。一方、上記プライマーにより、内部コントロールからは、第１表のコンペティターのところに示したサイズ（４１０ｂｐ）のＤＮＡ断片を増幅させることができる。
ＰＣＲは、９５℃で１１分間の加熱後、９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、４２サイクル繰り返す条件で行った。
各種細胞株におけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５遺伝子転写産物の量を、β−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として表示した（第４図のＡ）。
β３Ｇａｌ−Ｔ５転写産物は、タイプ１糖鎖を多く発現している大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、Ｃｏｌｏ２０１、ＳＷ１１１６）および膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−２）で発現していることが判明した。また、β３Ｇａｌ−Ｔ５転写産物の発現は、タイプ１糖鎖の発現（第１図参照）とよく相関していた。
以上の結果と上記（５）および（６）の結果を総合すると、β３Ｇａｌ−Ｔ５は、大腸癌細胞または膵臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、シアリルルイスａ糖鎖やシアリルルイスｃ糖鎖等のタイプ１糖鎖の合成に関与する、新規β１，３−ガラクトース転移酵素であると結論される。
（８）各種ヒト細胞株におけるＣＡ１９−９抗原含有タンパク質の発現
抗シアリルルイスａ抗体（１９−９）を用いたウエスタン・ブロッティング解析を行うことにより、大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、Ｃｏｌｏ２０１、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０、ＨＴ２９、ＷｉＤｒ、ＨＣＴ−１５、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０）、膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２）、胃癌細胞株（ＫＡＴＯＩＩＩ、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４）におけるシアリルルイスａ糖鎖含有タンパク質の発現について検討した。
１９−９は大腸癌や膵臓癌における癌関連糖鎖の検出に利用されており、１９−９で検出されるシアリルルイスａ糖鎖抗原は、ＣＡ１９−９抗原と呼ばれている。
各細胞（１×１０^７個）を、溶液〔２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２％ＴｒｉｒｏｎＸ−１００〕に懸濁後、短時間超音波にかけて細胞溶解液を調製した。
該細胞溶解液のタンパク質濃度を、マイクロＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（ＰＩＥＲＣＥ社）により測定し、１０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。
電気泳動後、Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ ＳＤ ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、ゲル上のタンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に移した。
該膜をブロッキング溶液（５％のスキムミルクを含むＰＢＳ）で４℃で終夜処理することによりブロッキングした。
ブロッキング後、該膜をブロッキング溶液で希釈した１０μｇ／ｍｌの抗シアリルルイスａ抗体（１９−９）を用いて、室温で２時間処理した。
処理後、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて該膜を処理することにより、１９−９が結合したタンパク質の検出を行った。方法はキットの説明書に従った。
結果を第４図のＢに示した。
ＣＡ１９−９含有糖タンパク質の発現は、上記（７）で測定したβ３Ｇａｌ−Ｔ５転写産物の発現（図４のＡ参照）とよく一致していた。一方、他のＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３）の転写物の発現は、ＣＡ１９−９含有糖タンパク質の発現と相関していなかった。また、他のＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３）は、ＣＡ１９−９含有糖タンパク質を高発現しているＣｏｌｏ２０５やＣｏｌｏ２０１で発現していなかった（第１図参照）。
以上の結果は、β３Ｇａｌ−Ｔ５は大腸癌や膵臓癌等における癌関連抗原ＣＡ１９−９の合成に関与するβ１，３−ガラクトース転移酵素であることを示している。更に、β３Ｇａｌ−Ｔ５が糖タンパク質も基質として使用できることを示している。
実施例３ ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
実施例２で取得したヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡがコードするヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を以下のようにして調べた。
他の既知のβ１，３−ガラクトース転移酵素と活性を比較するため、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ３、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ４の各ｃＤＮＡをｐＡＭｏに組み込んだ発現プラスミド（ｐＡＭｏ−３ＧＴ１、ｐＡＭｏ−３ＧＴ２、ｐＡＭｏ−３ＧＴ３、ｐＡＭｏ−３ＧＴ４）を造成した。
ｐＡＭｏ−３ＧＴ１は、特開平６−１８１７５９記載のプラスミドｐＵＣ１１９−ＷＭ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０１１）を構築するために用いたプラスミドｐＡＭｏＰＲＷＭ１と同じものである。
コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）または５種のβ１，３−ガラクトース転移酵素発現プラスミド（ｐＡＭｏ−３ＧＴ１、ｐＡＭｏ−３ＧＴ２、ｐＡＭｏ−３ＧＴ３、ｐＡＭｏ−３ＧＴ４、またはｐＡＭｏ−３ＧＴ５）を、実施例３に記載の方法と同様の方法によりＮａｍａｌｗａ細胞に導入し、各形質転換細胞を得た。
実施例１の（２）と同様にして、該形質転換細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、５種のβ１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子の転写量を測定した。
結果を第３表に示す。

発現プラスミドを導入した細胞では、対応するβ１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子の転写量が、ベクターのみを導入した細胞に比較して増加していることが確認された。
一方、該形質転換細胞を溶液〔２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００〕に懸濁後、短時間超音波にかけて細胞溶解液を調製した。
該細胞溶解液のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（ＰＩＥＲＣＥ社）により測定した。
該細胞溶解液を用いて、β１，３−ガラクトース転移酵素活性を測定した。
ピリジルアミノ化した糖鎖基質の調製や活性測定は、既知の方法〔特開平６−１８１７５９、特開平０６−８２３０２１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０−１４７３７（１９９４）〕に準じて行った。
具体的には、活性測定は、１０μｌのアッセイ溶液〔１４ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、７５μｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−Ｇａｌ（ＳＩＧＭＡ社）、１１μｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ_２、、０．０１％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、２５μｍｏｌ／ｌ ピリジルアミノ化糖鎖基質、上記細胞溶解液〕中で３７℃、２時間反応後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により生産物を同定することにより行った。
基質としては、アミノピリジンで蛍光標識したラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下、ＬＮｎＴと略記する）をβ−ガラクトシダーゼ処理して末端のガラクトース残基を除去したもの（アガラクトＬＮｎＴ，ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を使用した。
アガラクトＬＮｎＴは、約６０ｎｍｏｌのアミノピリジンで蛍光標識したＬＮｎＴに対し、１００ミリユニットのβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製）を加え、３７℃で１６時間反応後、１００℃で５分間の熱処理によりβ−ガラクトシダーゼを失活させることにより調製した。
スタンダードとしては、アミノピリジンで蛍光標識したＬＮｎＴまたはアミノピリジンで蛍光標識したラクト−Ｎ−テトラオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下、ＬＮＴと略記する）を用いた。ＬＮｎＴおよびＬＮＴはオックスフォード・グライコシステムズ社から購入した。オリゴ糖の蛍光標識は、常法〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，２１６９（１９９０）〕に従って行った。
ＵＤＰ−Ｇａｌ（糖供与体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いて反応を行った後、ＨＰＬＣで解析し、ＵＤＰ−Ｇａｌを含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。
反応が終了したアッセイ溶液は、１００℃で３分間処理後、１０，０００×ｇで５分間遠心して上清を取得し、その一部をＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣは、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（４．６×３００ｍｍ；東ソー社製）を使用し、溶出液として０．０２ｍｏｌ／ｌ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）を用い、溶出温度２５℃、流速１ｍｌ／分の条件で行った。
生成物の検出は、蛍光スペクトルフォトメーターＦＰ−９２０（日本分光社製）を用いて行った（励起波長３２０ｎｍ、放射波長４００ｎｍ）。
生成物の同定は、スタンダードの糖鎖と溶出時間が一致することを指標とした。
生成物の定量は、アミノピリジル化したラクトースをスタンダードとして用い、蛍光強度を比較することにより行った。
ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５の活性を１００とした時の、各β１，３−ガラクトース転移酵素の相対活性を第３表に示す。
ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５を発現させた細胞では明らかなβ１，３−ガラクトース転移酵素活性（ＬＮＴ合成活性）が検出されたが、他のβ１，３−ガラクトース転移酵素を発現させた細胞では活性は検出されなかった。なお、コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）を導入した細胞でも活性は検出されなかった。
各β１，３−ガラクトース転移酵素発現プラスミドを導入した細胞において、各β１，３−ガラクトース転移酵素転写物は同程度発現していることから（第３表）、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５のＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性（ＬＮＴ合成活性）は他のＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素（ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ３）に比較して強いことが判明した。なお、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ４に関しては、ＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性はなく、ＧａｌＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性を有することが知られている。
以上の結果、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５はＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素であることが証明された。また、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５の活性は他のＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素（ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ３）に比較して強いことから、ＬＮＴ等のタイプ１糖鎖の合成に有用であることが示された。
また、β３Ｇａｌ−Ｔ５転写産物の発現量とＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性（ＬＮＴ合成活性）が相関するかを検討するために、実施例２で取得したβ３Ｇａｌ−Ｔ５発現プラスミドを導入したＨＣＴ−１５細胞（ＨＣＴ−３ＧＴ５ＬおよびＨＣＴ−３ＧＴ５Ｈ）、ならびに実施例１で使用した大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ１１１６、ＨＣＴ−１５）、膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−２）、胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）および肺癌細胞株（ＰＣ−１）について、β３Ｇａｌ−Ｔ５転写産物の発現量とＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性（ＬＮＴ合成活性）を測定した。
各細胞におけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５転写産物の発現量は、実施例１または実施例２の（７）で記載した方法を用いて行った。ＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性（ＬＮＴ合成活性）の測定は、上記の方法に従った。
結果を第３表に示す。
その結果、β３Ｇａｌ−Ｔ５転写産物の発現量とＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性（ＬＮＴ合成活性）が相関することが判明した。例えば、ＨＣＴ−３ＧＴ５Ｈにおけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５転写物量は、ＨＣＴ−３ＧＴ５Ｌの約３倍であったが、ＨＣＴ−３ＧＴ５ＨにおけるＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性（ＬＮＴ合成活性）もＨＣＴ−３ＧＴ５Ｌの約３倍であった。
一方、ＰＣ−１ではβ３Ｇａｌ−Ｔ１を多く発現していたが、ＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性（ＬＮＴ合成活性）は検出されなかった。また、ＭＫＮ４５ではβ３Ｇａｌ−Ｔ３を多く発現していたが、ＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性（ＬＮＴ合成活性）は検出されなかった。
以上の結果は、β３Ｇａｌ−Ｔ１およびβ３Ｇａｌ−Ｔ３のＧｌｃＮＡｃ β１，３−ガラクトース転移酵素活性（ＬＮＴ合成活性）は、β３Ｇａｌ−Ｔ５に比較して弱いことを示しており、上記のＮａｍａｌｗａ細胞を用いた結果と一致した。
実施例４ β３Ｇａｌ−Ｔ５遺伝子の各種臓器での発現
実施例２の（７）と同様にして、ＲＴ−ＰＣＲを用いてヒト各組織（脳、肺、食道、胃（体）、胃（洞）、空腸、大腸、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、副腎、子宮、抹消リンパ球におけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５転写物の定量を行った。各組織におけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５遺伝子転写産物の量を、β−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として表示した（第５図）。
β３Ｇａｌ−Ｔ５転写物は、胃（体）、胃（洞）、空腸、大腸、膵臓で有意に発現していることが明らかになった。また、脳、食道、腎臓、子宮でも少し発現がみられた。一方、肺、肝臓、脾臓、副腎、抹消リンパ球では発現はみられなかった。
実施例５ β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子の構造解析
現在、多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録されている。したがって、本発明のポリペプチドをコードするヒトｃＤＮＡの配列と、データベースに登録されてるヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、本発明のポリペプチドをコードするヒト染色体遺伝子を同定し、その構造を明らかにできる可能性がある。ｃＤＮＡの配列と一致する染色体遺伝子配列が登録されていれば、ｃＤＮＡの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、エクソンおよびイントロン構造を決定することができる。
β３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡの塩基配列（配列番号２）とＧｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａｂａｓｅに登録されているＤＮＡ配列を比較した結果、登録番号ＡＦ０６４８６０の配列の一部に、β３Ｇａｌ−Ｔ５のｃＤＮＡの配列が含まれていたことより、β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子はヒト染色体２１ｑ２２．３に位置することが分かった。
β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子のプロモーター領域を明らかにする目的で、５’ＲＡＣＥ法を用いて、Ｃｏｌｏ２０５細胞よりβ３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡの５’末端領域の取得を行った。５’ＲＡＣＥ法はキット（ＧＩＢＣＯ社製５’ＲＡＣＥシステム、バージョン２．０）に従って行った。
Ｃｏｌｏ２０５細胞由来のｍＲＮＡ（１μｇ）を鋳型、配列番号２２および配列番号２３に示す配列を有する２種の合成ＤＮＡをプライマーとして、まず一本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成後、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、該ｃＤＮＡの３’末端にオリゴｄＣを付加した後、キットに添付されているｄＧテイルを有する合成ＤＮＡをフォワードプライマー、配列番号２４に示す配列を有する合成ＤＮＡをリバースプライマーとして、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９７℃で１１分間の加熱後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、４２サイクル繰り返す条件で行った。
増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩで消化後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩ間にサブクローン化した。このようにして得られた５種のプラスミドについて塩基配列を決定した結果、Ｃｏｌｏ２０５細胞におけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子の転写開始点は上記の登録番号ＡＦ０６４８６０の配列上８５１５３番目の塩基であることが明らかになった。
したがって、これより上流の領域は、少なくともＣｏｌｏ２０５細胞において機能しているプロモーター領域であることが判明した。
β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子のプロモーター領域（転写制御領域を含む）は、転写開始点の上流の５ｋｂ（配列番号３で表される塩基配列の１〜５０００番）と推定される。
転写開始点の上流１ｋｂ（配列番号３で表される塩基配列の４００１〜５０００番）について、転写因子の結合配列のコンセンサス配列の存在について、ＴＦＳＥＡＲＣＨ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｉｔｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｓｅａｒｃｈ）プログラム（Ａｋｉｙａｍａ，Ｙ．，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｗｃｐ．ｏｒ．ｊｐ／ｌａｂ／ｐｄａｐｐｌ／ｐａｐｉａ．ｈｔｍｌ）を用いて解析した。
転写開始点の上流にＴＡＴＡボックスは存在しなかったが、転写開始点の上流１５０ｂｐ中に、２つのＣｄｘＡサイト、１つのＡＰ−１サイト、１つのＭＺＦ−１（ｍｙｅｌｏｉｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ １ ｐｒｏｔｅｉｎ）サイトが存在すると推定された。
該領域の下流にレポーター遺伝子を連結したプラスミドを、β３Ｇａｌ−Ｔ５を発現している細胞に導入し、レポーター遺伝子が発現するかどうかを検討することにより、プロモーター領域を実験的に特定することもできる。
β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子のエクソン領域とイントロン領域をさらに詳しく解析するために、ＰＣＲ法を用いてβ３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡのアイソフォームが存在するかどうかについて検討した。
実施例１で調製したＣｏｌｏ２０５細胞由来の１本鎖ｃＤＮＡを鋳型、配列番号２２と配列番号２５に示す配列を有する２種の合成ＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９７℃で１１分間の加熱後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、４２サイクル繰り返す条件で行った。
増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＨｉｎｄＩＩＩサイトにサブクローン化した。このようにして得られたプラスミドについて塩基配列を決定した結果、Ｃｏｌｏ２０５細胞において少なくとも５種類のβ３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡアイソフォームが存在することが明らかとなった（第６図）。
各アイソフォームに相当するＰＣＲ増幅断片の量を比較することにより、各アイソフォームの発現量の比を求めたところ、アイソフォーム１が５０％、アイソフォーム２が５０％、アイソフォーム３、４、５はそれぞれ１％以下であった。各アイソフォームに相当するＰＣＲ増幅断片は、増幅断片の大きさと制限酵素処理（ＸｂａＩ処理またはＢｓｍＩ処理）により特定した。
以上の結果、β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子は４つのエクソンと３つのイントロンよりなることが明らかとなった。β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子のプロモーター領域（転写制御領域を含む）とβ３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子の配列を合わせて配列番号３に示した。β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子のプロモーター領域（転写制御領域を含む）の配列は、配列番号３の１〜５０００ｂｐである。β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子の配列は、配列番号３の５００１〜１０５６２ｂｐである。β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子のエクソンとイントロンの位置を配列番号３の番号を用いて第４表に示した。第４表中において、大文字で示した塩基配列はエクソン部分、小文字で示した塩基配列はイントロン部分を示している。
β３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子の構造（エクソン領域とイントロン領域の位置と配列）と染色体上の位置、ならびにβ３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子のプロモーター領域の位置と配列は、本研究によってβ３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡの構造と機能が明らかになることにより、初めて特定できたものである。

産業上の利用可能性
本発明により、大腸癌細胞または膵臓癌細胞等の消化器系癌細胞において、タイプ１糖鎖の合成に関与するβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法および免疫染色法、該ポリペプチドを用いたタイプ１糖鎖含有糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法、該組換え体ベクターを保有する形質転換体を用いたタイプ１糖鎖含有糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質のスクリーニング法、該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質のスクリーニング法、該ＤＮＡあるいは該抗体を用いた大腸癌、膵臓癌、胃癌等の疾患の診断法、該ＤＮＡ、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質あるいは該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質を用いた大腸癌、膵臓癌、胃癌等の疾患の治療法を提供することができる。
「配列表フリーテキスト」
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図 第１図のＡは、各種ヒト癌細胞株におけるタイプ１糖鎖（シアリルルイスａ糖鎖、ルイスａ糖鎖、ルイスｂ糖鎖）の発現量を測定した結果を示した図である。各細胞を抗シアリルルイスａ糖鎖抗体（１９−９）、抗ルイスａ糖鎖抗体（７ＬＥ）、または抗ルイスｂ糖鎖抗体（Ｎｅｏｋｏｋｕｓａｉ）で蛍光抗体染色した後、ＦＡＣＳを用いて解析した。各抗体との反応性が強い順に＋＋＋、＋＋、＋、±、−で示した。−は抗体との反応性がなかったことを示している。ＮＴは解析していないことを意味している。
第１図のＢは、定量的ＰＣＲ法を用いて、各種ヒト癌細胞株におけるヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ３およびヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ４の転写産物の量を定量した結果を示した図である。各種細胞株における各β１，３−ガラクトース転移酵素遺伝子転写産物の量は、いずれの細胞においても同程度発現していると考えられるβ−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として表示した。
第２図 第２図は、プラスミドｐＢＳ−３ＧＴ５の造成工程を示した図である。
第３図 第３図のＡは、コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）を導入したＮａｍａｌｗａ細胞［Ｎａｍａｌｗａ（ｍｏｃｋ）］、あるいはヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５発現プラスミド（ｐＡＭｏ−３ＧＴ５）を導入したＮａｍａｌｗａ細胞（Ｎａｍａｌｗａ−３ＧＴ５）について、抗シアリルルイスｃ糖鎖抗体（ＤＵ−ＰＡＮ−２）を用いて間接蛍光抗体染色を行なった後、ＦＡＣＳを用いて解析した結果を示した図である。影をつけたヒストグラムは、ＤＵ−ＰＡＮ−２の代わりにＡ−ＰＢＳを用いた時の結果である。
第３図のＢは、コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）を導入したＨＣＴ−１５細胞［ＨＣＴ１５（ｍｏｃｋ）］、あるいはヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５発現プラスミド（ｐＡＭｏ−３ＧＴ５）を導入したＨＣＴ−１５細胞（ＨＣＴ−３ＧＴ５Ｈ）について、抗シアリルルイスａ糖鎖抗体（１９−９）、抗シアリルルイスｃ糖鎖抗体（ＤＵ−ＰＡＮ−２）、抗ルイスａ糖鎖抗体（７ＬＥ）または抗ルイスｂ糖鎖抗体（Ｎｅｏｋｏｋｕｓａｉ）を用いて間接蛍光抗体染色を行なった後、ＦＡＣＳを用いて解析した結果を示した図である。影をつけたヒストグラムは、ＤＵ−ＰＡＮ−２の代わりにＡ−ＰＢＳを用いた時の結果である。
第４図 第４図のＡは、定量的ＰＣＲ法を用いて、各種ヒト癌細胞株におけるヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５の転写産物の量を定量した結果を示したずである。各種細胞株におけるヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５の転写産物の量は、いずれの細胞においても同程度発現していると考えられるβ−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として表示した。
第４図のＢは、ウエスタン・ブロッティング解析により、各種ヒト癌細胞株におけるＣＡ１９−９抗原含有タンパク質の発現を調べた結果を示した図である。第５図 第５図は、定量的ＰＣＲ法を用いて、各種ヒト組織におけるヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５の転写産物の量を定量した結果を示した図である。各組織におけるヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５の転写産物の量は、いずれの細胞においても同程度発現していると考えられるβ−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として表示した。
第６図 第６図のＡは、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５染色体遺伝子の構造を示した図である。４つのエクソンは四角で、イントロンは線で示してある。エクソン２中にはＸｂａＩサイトが、エクソン３中にはＢｓｍＩサイトが存在している。コーディング領域（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）は、斜線で示してある。ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡのアイソフォームの解析に使用したプライマー（ｓｉ−１、ｓｉ−２、ｓｉ−３、ｓｉ−４）の位置を矢印で示した。
第６図のＢは、ヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡのアイソフォームの構造を示した図である。存在比は、Ｃｏｌｏ２０５細胞における各アイソフォームの発現量をパーセンテイジで示したものである。
第６図のＣは、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、Ｃｏｌｏ２０５細胞におけるヒトβ３Ｇａｌ−Ｔ５ｃＤＮＡの各アイソフォームの発現量を調べた結果を示した図である。図６Ａに示したプライマーの組み合わせでＲＴ−ＰＣＲを行った後、第６図中に示した制限酵素（ＸｂａＩまたはＢｓｍＩ）で切断してアイソフォームの特定を行った。ｎｏｎｅは制限酵素処理をしないことを意味している。左のレーンは分子量マーカー（１００ｂｐラダー）である。

Claims (36)

1. 以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群より選ばれるポリペプチド。
   （ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
   （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列の３１〜３１０番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
   （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつGalβ1-3GlcNAc構造を合成可能なβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチド
2. β１，３−ガラクトース転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，３結合でガラクトースを転移する活性である、請求項１記載のポリペプチド。
3. β１，３−ガラクトース転移酵素活性が、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcの非還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基、またはＮ−アセチルグルコサミン単糖にβ１，３結合でガラクトースを転移する活性である、請求項１記載のポリペプチド。
4. 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群より選ばれるＤＮＡ。
   （ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ
   （ｂ）配列番号２で表される塩基配列の４０２〜１３３１番目の塩基配列を有するＤＮＡ
   （ｃ）配列番号２で表される塩基配列の４９２〜１３３１番目の塩基配列を有するＤＮＡ
   （ｄ）（ａ）〜（ｃ）いずれかに記載のＤＮＡと９５％以上の同一性を有するＤＮＡであり、かつGalβ1-3GlcNAc構造を合成可能なβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
5. 請求項４記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
6. 組換え体ＤＮＡが、プラスミドｐＡＭｏ−３ＧＴ５またはプラスミドｐＢＳ−３ＧＴ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６４５）である、請求項５記載の組換え体ＤＮＡ。
7. 請求項４に記載のＤＮＡ、請求項５記載の組換え体ＤＮＡ、または請求項６記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
8. 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、非ヒトトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物からなる群より選ばれる形質転換体である、請求項７記載の形質転換体。
9. 微生物が、Escherichia属に属する微生物である、請求項８記載の形質転換体。
10. 動物細胞が、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、CHO細胞、BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Namalwa細胞、Namalwa KJM-1細胞、ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細胞からなる群より選ばれる動物細胞である、請求項８記載の形質転換体。
11. 昆虫細胞が、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞から選ばれる昆虫細胞である、請求項８記載の形質転換体。
12. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
13. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
14. 生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項１３記載の製造法。
15. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
16. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、in vitroでの転写・翻訳系により該ポリペプチドを合成することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
17. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを酵素源として用い、
    （ａ）該酵素源、
    （ｂ）i)Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）、
    ii)Ｎ−アセチルグルコサミン残基を非還元末端に有するオリゴ糖および
    iii)Ｎ−アセチルグルコサミン残基を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質、および
    （ｃ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，３結合でガラクトースが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該反応産物の製造法。
18. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを酵素源として用い、
    （ａ）該酵素源、
    （ｂ）i)グルコース、
    ii)グルコース残基を非還元末端に有するオリゴ糖および
    iii)グルコース残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質からなる群より選ばれる受容基質、および
    （ｃ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のグルコースまたはグルコース残基にβ１，３結合でガラクトースが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することを特徴とする、該反応産物の製造法。
19. 請求項８記載の微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞由来の形質転換体からなる群より選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中に、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または該複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または該複合糖質の製造法。
20. 請求項８記載の非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該糖鎖または該複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または該複合糖質の製造法。
21. 請求項８記載のトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、ガラクトースがβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコースまたはグルコース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該糖鎖または該複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または該複合糖質の製造法。
22. 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、およびステロイド化合物に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、請求項１７〜２１のいずれかに記載の製造法。
23. 生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項２０記載の製造法。
24. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡの連続した２３〜６０塩基と同じ配列を有する断片を用い、invitroでのハイブリダイゼーション法により、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
25. 請求項４に記載のＤＮＡまたは配列番号２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡの有する塩基配列中の連続した２３〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、およびこれらオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体であって、これらからなる群より選ばれるＤＮＡ。
26. 配列番号２０または２１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
27. 請求項２５または２６に記載のオリゴヌクレオチドを用い、in vitroでのポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
28. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体。
29. 請求項２８記載の抗体を用い、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドをin vitroで検出することを特徴とする、免疫学的検出法。
30. 請求項２８記載の抗体を用い、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドをin vitroで検出することを特徴とする、免疫組織染色法。
31. 請求項２８記載の抗体を含有する、免疫組織染色剤。
32. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有する活性を変動させる化合物のスクリーニング法。
33. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、抗シアリルルイスa抗体、抗ルイスa抗体、抗ルイスｂ抗体または抗シアリルルイスｃ抗体を用い、シアリルルイスa糖鎖、ルイスa糖鎖、ルイスｂ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖含量を測定することを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
34. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、請求項２８記載の抗体を用い、該ポリペプチド含量を測定することを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
35. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異させたノックアウト非ヒト動物。
36. ノックアウト非ヒト動物がマウスである、請求項３５記載のノックアウト非ヒト動物。

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