JP2005065687A - β1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミン転移酵素タンパク質及びそれをコードする核酸、並びにそれを用いた癌化検定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本N−アセチル−D−ガラクトサミン転移酵素タンパク質は、N−アセチル−D−ガラクトサミンをN−アセチル−D−グルコサミンにβ1,3結合で転移することを特徴とし、好ましくは特定の2種のアミノ酸配列を有する。本癌化検定方法は、特定の2種の塩基配列、又は少なくともその一方に相補的な塩基配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする測定用核酸を利用する。
【選択図】 なし
Description
ルグルコサミン(以下、「GlcNAc」とも記述する)」へ転移する酵素は知られていない。
GalNAcとGlcNAcとがβ1,3で結合した糖鎖構造は、節足動物であるハエの中性糖脂質上の糖鎖中に確認されたとの報告(非特許文献5)はあるが、そもそも、哺乳動物、特にヒトにおいてそのような糖鎖構造は存在しないものと信じられていた。
ン残基を供与体基質とし、N−アセチル−D−グルコサミン残基を受容体基質とする。そして、本明細書の実施例2で詳述するように、そのアミノ酸配列中に、β1,3の結合形式で種々の糖(例えば、ガラクトース、N−アセチル−D−グルコサミン)を転移させる酵素ファミリーに良く保存されている3つのモチーフを保持していた。これらの観点から、G34タンパク質は、意外なことに、哺乳動物、特にヒトでは従来報告例がない新規な糖鎖構造「GalNAc-β1,3-GlcNAc」を合成する転移活性を有すると考えられた。その結合形式は実際にNMRによって確認された。
(a)受容体基質の特異性
オリゴ糖を受容体基質とする場合、Bz-β-GlcNAc、GlcNAc-β1-4-GlcNAc-β-Bz、Gal-β1-3 (GlcNAc-β1-6) GalNAc-α-pNp、GlcNAc-β1-3 GalNAc-α-pNp、及びGlcNAc-β1-6GalNAc-α-pNpへの転移活性を示す(「GlcNAc」はN−アセチル−D−グルコサミン残基を示し、「GalNAc」はN−アセチル−D−ガラクトサミン残基を示し、「Bz」はベンジル基を示し、「pNp」はパラニトロフェニル基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式中の数字はグリコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示し、「α」及び「β」は糖環1位のグリコシド結合のアノマーを示し、5位CH2OH又はCH3との位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す)。
(b)反応pH
pH6.2〜6.6の領域での活性が、他のpH領域での活性と比較して低い;及び
(c)二価イオンの要求性
前記活性は、少なくともMn2+、Co2+、又はMg2+の存在下で増強されるが、Mn2+による活性の増強はCu+との共存下でほぼ完全に消失する;
の少なくとも一つを有するか、又はそれら性質をあらゆる組み合わせで有し得る。
(A)配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(B)配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つN−アセチル−D−ガラクトサミンをN−アセチル−D−グルコサミンにβ1,3結合で転移するポリペプチド;
を含む。
本発明のタンパク質をコードする核酸の好ましい態様は、配列番号1又は3に記載の塩基配列又は少なくともその何れかに相補的な塩基配列からなる核酸である。より好ましくは、ヒト由来では配列番号1に記載の塩基番号565〜1503の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸、最も好ましくは、配列番号1に記載の塩基番号106〜1503の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸であり、マウス由来では配列番号3に記載の塩基番号103〜1512の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸である。
さらに本発明は、前記いずれかの核酸を含むベクター、該ベクターを含む形質転換体をも提供する。
他方において、本発明者は、上記G34の発見に伴い、そのmRNAの発現量が癌化した組織及び細胞株において有意に上昇していることを明らかにした。
本発明の測定用核酸の好ましい態様には、配列番号16に記載の塩基配列、又はそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、並びに、下記(1)又は(2)の塩基配列からなるプライマーセット:
(1)配列番号14と配列番号15に記載の一組の塩基配列;
(2)配列番号17と配列番号18に記載の一組の塩基配列;
が含まれる。
さらに本発明は、生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a)上記いずれかの核酸を使用して、生物試料における該核酸についての転写レベルを測定し;そして
(b)該測定値が、健常生物試料についての測定値と比較して有意に上回るか否かを判断すること;
を含む方法をも提供する。
本発明の癌化検定方法の更なる側面において、癌治療に関する処置の有効性を検定する方法であって、上記いずれかの核酸を使用して、癌治療のための処置が施される生物試料における該核酸についての転写レベルを測定し、該測定値がその処置前又は未処置の場合と比較して有意に下回るか否かを判断することを含む方法が提供される。
(1)本発明のG34酵素タンパク質をコードする核酸
本発明者等は、上述の発見に基づき、該核酸にコードされているG34酵素タンパク質を
発現させ、これを単離及び精製し、さらにその酵素活性を特定した。ここで、目的の酵素活性を有するアミノ酸配列が特定されたという事実に着目すれば、配列番号1又は3の塩基配列は、当該酵素活性を有する単離ポリペプチドをコードする核酸の一態様である。すなわち、本発明の核酸には、有限数ではあるが、当該G34酵素タンパク質のアミノ酸配列へ縮重するような、該同一のアミノ酸配列をコードし得るあらゆる核酸が含まれる。
まず、GenBank No.AX285201の公知配列又はその一部を利用し、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いてcDNAライブラリーから常法に従って核酸増幅反応を行い、これにより本発明の核酸をクローニングすることができる。その核酸は、例えば、PCR産物として約1.5kbpのDNA断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりDNA断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離することができる。
40%の同一性を有し、また最もホモロジーの高い公知のβ1,3Gal転移酵素の核酸配列とも40%の同一性を有する(上記非特許文献2)。これらの観点から、本発明の相同タンパク質をコードする好適な核酸配列は、典型的には配列番号1又は3中の全塩基配列、好ましくは配列番号1の塩基番号106〜1503からなる部分塩基配列、好ましくは配列番号3の塩基番号103〜1512からなる部分塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列のいずれかに対し、40%を超える同一性、より好ましくは少なくとも50%の同一性、特に好ましくは少なくとも60%の同一性を有する。
本発明によれば、上記核酸を含む組換えベクターが提供される。プラスミド等のベクターに該核酸のDNA断片を組込む方法としては、例えば、Sambrook, J.ら,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.1 (2001)に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット(例えば、宝酒造製等)を用いるとよい。
ク質(例えば糖鎖が付加された態様など)が得られると考えられる。この観点からは、宿主細胞として真核細胞、特に哺乳類細胞を選択することが好ましい。具体的な哺乳類細胞としては、マウス由来、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。また、宿主細胞としての大腸菌、酵母又は昆虫細胞は、具体的には、大腸菌(DH5α、M15、JM109、BL21等)、酵母(INVSc1(サッカロマイセス属)、GS115、KM71(以上ピキア属)など)、昆虫細胞(Sf21、BmN4、カイコ幼虫等)などが例示される。
後述の実施例で例証されるとおり、例えば、配列番号1又は3の塩基配列を有する核酸を発現ベクターに組み込み、それを発現させることで、新規な酵素活性を有するポリペプチドを単離及び精製することができる。
「N−アセチル−D−ガラクトサミン(GalNAc)」を、その供与体基質から「N−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)」を含む受容体基質へ転移させることができる。そのアミノ酸配列中のモチーフ配列に関する検討から、当該N−アセチルガラクトサミンとN−アセチルグルコサミンとの間の結合形式は、β1,3グリコシド結合である(実施例2参照)。
前記N−アセチル−D−ガラクトサミン供与体基質には、N−アセチルガラクトサミンを有する糖ヌクレオチド、例えば、ウリジン二リン酸−N−アセチルガラクトサミン(UDP−GalNAc)アデノシン二リン酸−N−ガラクトサミン(ADP−GalNAc)、グアノシン二リン酸−N−アセチルガラクトサミン(GDP−GalNAc)、及びシチジン二リン酸−N−アセチルガラクトサミン(CDP−GalNAc)等が含まれる。典型的な供与体基質は、UDP−GalNAcである。
UDP−GalNAc + GlcNAc−R → UDP + GalNAc-β1,3-GlcNAc−R
(Rは、当該GlcNAc残基を有する糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖、又は多糖等である)
前記GalNAcの受容体基質は、N−アセチル−D−グルコサミンであり、典型的には、糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖、又は多糖等のN−アセチル−D−グルコサミン残基である。
ヒトG34タンパク質に関する検討によると、至適緩衝液としては、MES(2-モルフォリノエタンスルホン酸)緩衝液、カコジル酸ナトリウム緩衝液、又はHEPES(N-[2-hydroxyethl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid])緩衝液のいずれにおいても上記触媒作用を有する。
ヒトG34タンパク質の活性は、二価の金属イオン、特にMn2+、Co2+、又はMg2+の存在下で増強される。各金属イオン濃度の活性への影響は、Mn2+とCo2+によると5.0 nM付近まで濃度依存的に上昇しそれ以降でほぼプラトーとなり、Mg2+によると2.5 nM付近まで濃度依存的に上昇しそれ以降でほぼプラトーとなる。但し、Mn2+による活性の増強はCu+との共存下では完全に消失する。
本発明の酵素タンパク質は、以下の方法により単離・精製することができる。
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養し生育させて、その培養物ないし生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。本発明の酵素タンパク質も、例えば、本発明の核酸を組み込んだ発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することによって発現(産生)させることができる。
本発明により、G34酵素タンパク質に免疫反応性である抗体が提供される。こうした抗体は、(非特異的結合と対照的に)抗体の抗原結合部位を介して、該酵素タンパク質に特異的に結合し得る。具体的には、配列番号2又は4のアミノ酸配列を有するタンパク質、又はその断片、変異体若しくは融合タンパク質などを、それぞれに免疫反応性である抗体を産生するための免疫原として使用することが可能である。
本発明者は、上述したG34酵素タンパク質の発見に伴い、このタンパク質をコードするmRNAが癌化組織及び細胞株において広く認められ、特にその発現量が癌化組織において有意に上昇していることを確認した。したがって、G34核酸は、転写産物を含む生物試料を対象とした癌診断等に有用な癌マーカーとして有用である。この側面において、本発明は、配列番号1又は3に記載の塩基配列により定義される核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る測定用核酸を提供する。
本発明の測定用核酸の好ましい態様は、配列番号1又は3の塩基配列を有する核酸又は少なくともその何れか一方の相補鎖を標的としたプローブであって、これら塩基配列から選ばれる少なくとも十数個、好ましくは15塩基以上、好ましくは17塩基以上、より好ましくは20塩基以上のオリゴヌクレオチド若しくはそれらの相補鎖、或いは、そのORF領域全長のcDNA若しくはその相補鎖が含まれる。
本発明の癌化検定用核酸から得られるプライマーの好ましい態様は、オリゴヌクレオチドプライマーである。オリゴヌクレオチドプライマーの製造に当たっては、配列番号1又は3の塩基配列のORF領域から以下の条件を満たすように2つの領域を選択するとよい。
a)各領域の長さが数十塩基以上、特に15塩基以上、好ましくは17塩基以上、より好ましくは20塩基以上であり、且つ50塩基以下であること;さらに
b)各領域中のG+Cの割合が40〜70%であること;
実際には、上記のように選択した2つの領域と同じ塩基配列若しくはそれらに相補的な塩基配列を有する一本鎖DNAとして製造してもよいし、それら塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した一本鎖DNAを製造してもよい。本発明のプライマーは、選択された標的配列と完全に相補的な配列を有することが好ましいが、1または2塩基の不一致があっても差し支えない。
既に述べた通り、本発明のG34核酸は、癌化した生物試料中の発現量(すなわち当該遺伝子のゲノムからmRNAへの転写レベル)が、その健常生物試料よりも有意に上昇していることが確認された。少なくとも大腸癌又は肺癌の癌化検定に有用であることが明らかにされた(実施例3参照)。
(A)ハイブリダイゼーション検定法
本検定法の態様には、例えば、本発明の核酸から得られるプローブを使用したサザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット、又はコロニーハイブリダイゼーション法等のような当業者に周知である各種ハイブリダイゼーション検定を用いた方法が含まれる。さらに検出シグナルの増幅や定量が必要とされる場合、それらを免疫学的検定法と組み合わせてもよい。
本発明の癌化検定法の好ましい態様には、本発明のプライマーでの核酸増幅反応を利用したPCR法も含まれる。PCRの詳細は、既に説明した通りである。ここではPCRを利用した本検定法の具体的態様を説明する。
本発明の癌化検定法の他の態様として、癌の治癒ないし緩和の効果を判断するための検定も挙げられる。例えば、検定の対象には、抗癌剤の投与、放射線治療等のあらゆる処置が含まれ、それら処置の対象には、癌患者又は発癌実験モデル動物由来のin vitro癌細胞や癌組織が含まれる。
既に述べたように、本発明者によりマウスG34の存在とその核酸配列(配列番号3)が突き止められた。本発明は、受精卵やES細胞を用いた各種遺伝子変換技術に基づく動物個体レベルでのG34の発現・機能解析の手段、典型的にはG34遺伝子を導入したトランスジェニック動物、及びマウスG34を欠損させたノックアウトマウスの作製等にも関する。
本明細書において、核酸についての転写レベルの「測定値」又は「発現量」というときは、一定量の生物試料由来の転写産物中に存在する当該核酸の量、すなわち当該核酸濃度を示す。また本発明の検定法は、それらの測定値を比較することに依拠するのであるから、核酸が定量のためにPCR等によって増幅されたり、プローブ標識からのシグナルが増幅された場合にも、それら増幅された値について相対的な対比が可能である。したがって、「核酸についての測定値」とは増幅後の量又は増幅後のシグナルレベルとして把握されることもできる。
β3ガラクトース転移酵素6(β3GalT6)をクエリーとしてBLAST検索を行った結果、ホモロジーを有する核酸配列(配列番号1)が見出された。該核酸配列から予測されるオープンリーディングフレーム(ORF)は1503 bp、アミノ酸配列にして500アミノ酸(配列番号2)からなる。これら核酸配列及びアミノ酸配列がコードする生成物をヒトG34と命名した。
活性を確認するには配列番号1の少なくともβ3GalT6と比較的ホモロジーが保たれている189番アミノ酸からC末端までの活性領域を発現させれば十分であると考えられるが、本実施例では36番アミノ酸からC末端までの活性領域を発現させることとした。
G34の36番アミノ酸からC末端までの活性領域をFLAG Protein Expression System(シグマアルドリッチ社)により哺乳動物由来細胞株発現ベクターpFLAG-CMV3に遺伝子導入した。pFLAG-CMV3を使用すれば、マルチクローニングサイトを有しており、目的遺伝子及びpFLAG-CMV3を制限酵素処理した後、ライゲーション反応を行うことで目的遺伝子をpFLAG-CMV3に導入できる。
G34の36番アミノ酸からC末端までの活性領域をGATEWAYシステム(インビトロジェン社)のpFastBac(インビトロジェン社製)に組込み、さらにBac-to-Bacシステム(インビトロジェン社)によるバクミドを作成した。
Kidneyから得られたcDNA(クロンテック社製、Marathon-ready cDNA)を鋳型とし5'プライマー(G34-GW-F1:配列番号7)と3'プライマー(G34-GW-R1:配列番号8)を用いてPCR反応を行い、目的のDNA断片を得た。PCR法は98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 2分を25回繰り返す条件で行った。そしてPCR産物をアガロースゲル電気泳動を行い、ゲル切り出し法でゲルを切り出して定法により単離した。
上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるattLを持つもので、LRクロナーゼ(ラムダファージの組換酵素Int、IHF、Xisを混合したもの)とデステイネーションベクターと混合することで、挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。具体的工程は以下のとおりである。
続いてBac-to-Bacシステム(インビトロジェン社)を用いて上記pFBIF-とpFastBacとの間で組換えを行わせ、昆虫細胞中で増殖可能なバクミド(Bacmid)にG34その他の配列を挿入した。
上記白コロニーから得られたバクミドに目的配列が挿入していることを確認した後、このバクミドを昆虫細胞Sf21(インビトロジェン社より市販)に導入した。
上記四次ウイルス液のpFLAG-G34上清10mlにNaN3(0.05 %)、NaCl (150 mM)、CaCl2 (2mM)、抗FLAG-M1レジン(Sigma 社)(100 μl)を混合し、4℃で一夜攪拌した。翌日遠心して(3000 rpm 5分、4℃)ペレットを回収し、2 mMのCaCl2・TBSを900μl加えて再度遠心分離(2000 rpm 5分、4℃)し、ペレットを200 μl の1 mM CaCl2・TBS に浮遊させ活性測定のサンプル(G34酵素液)とした。この一部をSDS-PAGEによる電気泳動について抗FLAG M2-ペルオキシダーゼ(SIGMA社製)を用いてウエスタンブロッテイングを行い、目的とするG34タンパク質の発現を確認した。その結果約60kDaの位置を中心としてブロードに複数のバンド(糖鎖などの翻訳後修飾の違いによるものと考えられる)が検出、発現が確認された。
(1)GalNAc転移活性のスクリーニング
G34タンパク質のβ1,3−N−アセチルガラクトサミン転移活性について、基質特異性、至適緩衝液、至適pH、二価イオン要求性について検討を行った。
下記反応液の受容体基質には、pNp-α-Gal、oNp-β-Gal、Bz-α-GlcNAc、pNp-β-GlcNAc、Bz-α-GalNAc、pNp-β-GalNAc、pNp-α-Glc、pNp-β-Glc、pNp-β-GlcA、pNp-α-Fuc、pNp-α-Xyl、pNp-β-XylおよびpNp-α-Man(すべてSigma社)を各々10 nmolとして用いた。ここで「Gal」とはD−ガラクトース残基を示し、「Xyl」とはD−キシロース残基を示し、「Fuc」とはD−フコース残基を示し、「Man」とはD−マンノース残基を示す。「GlcA」はグルクロン酸残基を示す。
G34酵素タンパク質により合成される糖鎖構造について、その結合形式をNMRにより解析した。
見られたためにAがベンジルの結合した残基であると分かる。d)N-アセチルのメチルの信号が2つあり、2つの残基がN-アセチル化された糖であることが分かる。e)NOESYにB1-A3のNOEが存在する。
図5は、G34タンパク質の推定アミノ酸配列(配列番号2)と各種のヒトβ1-3Gal転移酵素(β3Gal-T1〜T6)のアミノ酸配列との対比を示す。図5中、枠で囲まれた部分はGal転移酵素に共通するモチーフを示すが、そのうち、M1〜3の枠で囲まれた3つのモチーフはβ1,3結合性糖転移酵素に共通するモチーフである。また同図中の*印は、比較された配列間で保存されているアミノ酸残基を示す。
以下の反応系を用いて、G34のGalNAc転移活性における至適緩衝液および至適pHについて検討した。受容体基質はpNp-β-GlcNAcを用いた。
反応液(カッコ内は最終濃度)は、基質(10 nmol)、HEPES緩衝液(pH 7.4、14 mM)、Triton CF-54(商品名) (0.3 %)、UDP-GalNAc (2 mM)およびUDP-[14C]GlcNAC (40 nCi)、G34酵素液5 μl加えた。これにMnCl2、MgCl2またはCoCl2を2.5 mM、5 mM、10 mM、20 mMおよび40 mM添加し、さらにH2Oを加えて全量20μlとした。
以下の反応系を用いてオリゴ糖に関する受容体基質特異性について検討した。受容体基質はpNp-α-Gal、oNp-β-Gal、Bz-α-GlcNAc、Bz-β-GlcNAc、Bz-α-GalNAc、pNp-β-GalNAc、pNp-α-Glc、pNp-β-Glc、pNp-β-GlcA、pNp-α-Fuc、pNp-α-Xyl、pNp-β-Xyl、pNp-α-Man、ラクトシド-Bz、Lac-セラミド、Gal-セラミド、パラグロボシド、グロボシド、Gal-β1-4 GalNAc-α-pNp、Gal-β1-3 GlcNAc-β-pNp、GlcNAc-β1-4 GlcNAc β-Bz、pNp-core1(Gal-β1-3 GalNAc-α-pNp)、pNp-core2 (Gal-β1-3 (GlcNAc-β1-6) GalNAc-α-pNp)、pNp-core3 (GlcNAc-β1-3 GalNAc-α-pNp)およびpNp-core6 (GlcNAc-β1-6 GalNAc-α-pNp)を用いた。なお「Lac」とはD−ラクトース残基を示す。
糖残基供与体基質としてウリジン二リン酸−N−アセチルガラクトサミン(UDP-GalNAc:シグマ-アルドリッチ社)、糖残基受容体基質としてBz-β-GlcNAcを使用して、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるG34の酵素活性の分析を行った。
(3)質量分析法による反応生成物の分析
上述のピークを回収し、質量分析法による反応生成物の分析を行った。マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間質量分析(MALDI-TOF-MS)はReflex IV(ブルッカーダルトニクス社)を使用して行った。MALDI-TOF-MS用の試料は10 pmolの試料を乾燥させ、1 μlの蒸留水に溶解して使用した。
この結果からも、G34酵素タンパク質は、Bz-β-GlcNAcに対しGalNAcを転移することが明らかとなった。
(1)各種ヒト正常組織における発現量
定量的リアルタイムPCR法を用いてヒト正常組織内のG34のmRNA発現量を比較した。ここで定量的リアルタイムPCR法とは、PCRにおいてセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーに加え、蛍光標識されたプローブを組合わせる方法である。PCRにより増幅する際、プローブの蛍光標識が外れて蛍光を示す。蛍光強度が遺伝子の増幅に相関して増幅するためこれを指標として定量が行われる。
上述の定量的リアルタイムPCR法を用いて各種癌由来のヒト細胞株内でのG34のmRNA発現量を比較した。各ヒト細胞株の細胞を回収した後、RNAをRNeasy Mini Kit(キアゲン社製)で抽出し、Super-Script First-Strand Synthesis System(インビトロジェン社製)を用いたoligo (dT)法によりsingle strand DNAとした。このDNAを鋳型として用いて5'プライマー(配列番号14)と3'プライマー(配列番号15)及びTaqMan プローブ(配列番号16)を用いてABI PRISM 7700(アプライドバイオシステムズジャパン社製)により定量的リアルタイムPCRを行った。PCRの条件は50℃ 2分、95℃ 10分で反応させた後、95℃ 15秒、60℃ 1分を50回繰り返した。
上述の定量的リアルタイムPCR法を用いて大腸癌及び肺癌の患者由来の癌組織及びその周辺の正常組織におけるG34のmRNA発現量を比較した。
実施例1で得られたヒトG34の配列をクエリーとしてアプライドバイオシステムズ社のマウス遺伝子配列serelaに対して検索を行った結果、高いホモロジーを有する対応核酸配列を見出した。この核酸配列から予測されるオープンリーディングフレーム(ORF)は1515 bp(配列番号3)、アミノ酸配列にして504アミノ酸(配列番号4)からなり、N末端に糖転移酵素の特徴である疎水アミノ酸領域を有する。ヒトG34(配列番号1及び2)との相同性は核酸配列で86%、アミノ酸配列で88%である(図10参照)。また、β3GalTファミリーが保持している3つのモチーフ全てを保持している。我々は、配列番号3の核酸配列及び配列番号4のアミノ酸配列がコードするものをマウスG34(mG34)と命名した。
以下の反応系を用い、マウスG34のβ1,3−N−アセチルガラクトサミン転移活性における基質特異性について検討した。下記反応液の「受容体基質」には、pNp-α-Gal、oNp-β-Gal、Bz-α-GlcNAc、Bz-β-GlcNAc、Bz-α-GalNAc、pNp-β-GalNAc、pNp-α-Glc、pNp-β-Glc、pNp-β-GlcA、pNp-α-Fuc、pNp-α-Xyl、pNp-β-Xyl、pNp-α-Man、ラクトシド-Bz、Lac-セラミド、Gal-セラミド、Gb3、グロボシド、Gal-β1-4GalNAc-α-pNp、Galβ1-3GlcNAc-β-Bz、GlcNAc-β1-4-GlcNAc-β-Bz、core1-pNp、core2-pNp、core3-pNpおよびcore6-pNp(すべてSigma社)を各々10 nmolとして用いた。
マウス精巣由来の試料にmG34を使用したin situハイブリダイゼーションを行い、マウス精巣試料におけるmG34の発現を確認した(図11参照)。
ノックアウトしたい遺伝子(mG34)の活性化ドメインを含むexon(mG34の場合にはORF部分の3番目から12番目のexon(1242 bp))を含む約10 kb断片を中心とした染色体断片(約10 kb)をpBluescript II SK(-)(TOYOBO製)に挿入したターゲティングベクター(pBSK-mG34-KOneo)を作製する。pBSK-mG34-KOneoには薬物耐性遺伝子としてneo(ネオマイシン耐性遺伝子)をmG34の予測されるGalNAc転移活性領域である7番目から9番目のexonに導入する。その結果、mG34の7番目から9番目のexonが欠失し、この部分がneoで置換される。こうして得られたpBSK-mG34-KOneoを制限酵素であるNotIにて直鎖状とした後、80 μgをES細胞(E14 / 129Svマウス由来)にトランスフェクション(エレクトロポレーション等)し、G418耐性のコロニーを選択する。G418耐性コロニーを24ウェルプレートに移し、培養を行う。細胞の一部を凍結保存した後、残りのES細胞からDNAを抽出し、PCRにより組み換えが起こっているクローンを120コロニー程度選択する。さらに、サザンブロッティング等により組み換えが予定通り起こっているかの確認を行い、最終的に組み換え体を10クローン程度選択する。選択したうちの2クローンのES細胞をC57BL/6マウスの胚盤胞内に注入する。ES細胞を注入したマウス胚を仮親マウスの子宮内へ移植してキメラマウスを誕生させる。その後、ジャームトランスミッションによりヘテロノックアウトマウスを得ることができる。
Claims (16)
- N−アセチル−D−ガラクトサミンをN−アセチル−D−グルコサミンにβ1,3結合で転移するβ1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミン転移酵素タンパク質。
- 下記の性質(a)−(c):
(a)受容体基質の特異性
オリゴ糖を受容体基質とする場合、Bz-β-GlcNAc、GlcNAc-β1-4-GlcNAc-β-Bz、Gal-β1-3-(GlcNAc-β1-6) GalNAc-α-pNp、GlcNAc-β1-3-GalNAc-α-pNp、及びGlcNAc-β1-6-GalNAc-α-pNpへの転移活性を示す(「GlcNAc」はN−アセチル−D−グルコサミン残基を示し、「GalNAc」はN−アセチル−D−ガラクトサミン残基を示し、「Bz」はベンジル基を示し、「pNp」はパラニトロフェニル基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式中の数字はグリコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示し、「α」及び「β」は糖環1位のグリコシド結合のアノマーを示し、5位CH2OH又はCH3との位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す);
(b)反応pH
pH6.2〜6.6の領域での活性が、他のpH領域での活性と比較して低い;又は、(c)二価イオンの要求性
前記活性は、少なくともMn2+、Co2+、又はMg2+の存在下で増強されるが、Mn2+による活性の増強はCu+との共存下でほぼ完全に消失する;
の少なくとも一つを有する、請求項1に記載の糖転移酵素タンパク質。 - 下記(A)又は(B)のポリペプチドを含む糖転移酵素タンパク質
(A)配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は
(B)配列番号2又は4に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つN−アセチル−D−ガラクトサミンをN−アセチル−D−グルコサミンにβ1,3結合で転移するポリペプチド。 - 前記(A)のポリペプチドが、配列番号2に記載のアミノ酸番号189〜500のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる、請求項3に記載の糖転移酵素タンパク質。
- 前記(A)のポリペプチドが、配列番号2に記載のアミノ酸番号36〜500のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる、請求項3に記載の糖転移酵素タンパク質。
- 配列番号2に記載のアミノ酸番号189〜500又は配列番号4に記載のアミノ酸番号35〜504のアミノ酸配列と少なくとも30%を超える同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる、請求項3に記載の糖転移酵素タンパク質。
- 請求項3〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
- 配列番号1又は3に記載の塩基配列又は、少なくともその何れかに相補的な塩基配列からなる、請求項7に記載の核酸。
- 配列番号1に記載の塩基番号565〜1503の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、請求項7に記載の核酸。
- 配列番号1に記載の塩基番号106〜1503の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、請求項7に記載の核酸。
- 配列番号3に記載の塩基番号103〜1512の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、請求項7に記載の核酸。
- DNAであることを特徴とする、請求項7〜11のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項7〜12のいずれか1項に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項13に記載のベクターを含む形質転換体。
- β1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミン転移酵素タンパク質の製造方法であって、請求項14に記載の形質転換体を生育させ、前記糖転移酵素タンパク質を発現させ、該形質転換体から該糖転移酵素タンパク質を回収することを含む製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のβ1,3−N−アセチル−D−ガラクトサミン転移酵素タンパク質を認識する抗体。
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