WO2004065605A1 - β１，３－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン転移酵素タンパク質及びそれをコードする核酸、並びにそれを用いた癌化検定方法 - Google Patents

β１，３－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン転移酵素タンパク質及びそれをコードする核酸、並びにそれを用いた癌化検定方法 Download PDF

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WO2004065605A1
WO2004065605A1 PCT/JP2004/000608 JP2004000608W WO2004065605A1 WO 2004065605 A1 WO2004065605 A1 WO 2004065605A1 JP 2004000608 W JP2004000608 W JP 2004000608W WO 2004065605 A1 WO2004065605 A1 WO 2004065605A1
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WO
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seq
nucleic acid
protein
amino acid
glcnac
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Application number
PCT/JP2004/000608
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hisashi Narimatsu
Akira Togayachi
Niro Inaba
Toru Hiruma
Yasuko Ishizuka
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Fujirebio Inc.
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)

Definitions

  • the present invention relates to a ⁇ 1, 3-diacetyl-D-galactosamine transferase protein, a nucleic acid encoding the same, and a method for assaying canceration using the same.
  • the present invention relates to a novel ⁇ 1,3-p-acetyl-D-galactosamine transferase protein, a nucleic acid encoding the same, a method for assaying canceration using the same, and the like.
  • sugar chains and glycoconjugates in vivo.
  • the factors that determine blood type are glycoproteins, and those that are involved in the functioning of the nervous system are glycolipids, and enzymes that function to combine sugar chains are various sugars. It is a very important clue in analyzing the physiological activity provided by chains.
  • ⁇ -acetyl-D-galactosamine (hereinafter also referred to as rGalNAcj) is a component of glycosaminoglycans and is present in various sugar chain structures such as glycosphingolipids and mucin-type bran chains. It is a sugar residue. Therefore, the enzyme that transfers GalNAc is a very important tool for analyzing the function of bran chains that work in various tissues in the body.
  • Non-patent Documents 1 to 4 there are some reports on glycosyltransferases having an activity of transferring GalNAc (Non-patent Documents 1 to 4).
  • an enzyme that transfers Gal NAc by “1,4 bond” is known (Non-patent Document 1).
  • “/ 31, 3” or “3” refers to the ⁇ -hydroxyl group at the 1-position of the sugar residue of the acceptor substrate, which binds to the ⁇ -hydroxyl group.
  • an enzyme using “galatatose” as its receptor substrate is known (Non-Patent Document 2).
  • GalNAc N-acetylacetylchocosamine
  • Non-Patent Document 5 It was believed that such a carbohydrate structure did not exist in mammals, especially in humans.
  • Patent Document 1
  • Non-Patent Document 1 Cancer Res. 1993 Nov 15; 53 (22): 5395-400: Yamashiro S, Ruan S,
  • Furukawa K Tai T, Lloyd K0, Shiku H, Furukawa K. Genetic and enzymatic basis for the differential expression of GM2 and uD2 gangliosides in human cancer cell lines.
  • the present invention relates to glycosyltransferases derived from mammals, particularly humans, wherein Gal NAc is ⁇ 1,
  • the object of the present invention is to provide a polypeptide having a novel transfer activity of transferring to GlcNAc by three bonds, and a nucleic acid encoding such a polypeptide. Furthermore, the present invention also solves the problems of providing a transformant that expresses the nucleic acid in a host cell, a method for producing and recovering the protein by causing the transformant to produce the protein, and an antibody that recognizes the protein. I do.
  • the present invention is useful for canceration assays and the like by analyzing and comparing the transcription level of such a protein, which fluctuates in association with canceration or malignancy, at the tissue or cell lineage level. It also provides simple methods and criteria.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between “+” and “G34 1 ⁇ 3? Protein shell B ⁇ F ⁇ ) ⁇ - ⁇ ⁇ ) ⁇ ': ⁇ ⁇ :':::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: '
  • FIG. 2D is a view showing a result of NMR measurement for analyzing a chain structure synthesized by the G34 enzyme protein according to the present example.
  • FIG. 2B is an enlarged view of a part of the marauding R measurement result of FIG. 2A.
  • FIG. 3 is a table showing N0E at ⁇ R in FIG.
  • Figure 4 is a table showing the relevant data (provisional N0E) for each of the viranoses in Figure 2 (s: strong, m: middle, w: weak, vw: very weak, A: GlcNAc, B: GalNAc)
  • FIG. 5 is a diagram for comparing amino acid sequences between the G34 enzyme protein of the present example and a known ⁇ 3 Gal transferase.
  • FIG. 6 is a diagram for comparing motifs relating to 3-binding activity between the G34 enzyme protein of this example and various known ⁇ 3-linked glycosyltransferases.
  • “B3” represents a] 3 1-3 bond
  • “GnJ represents GlcNAc.
  • FIG. 7 is a diagram showing the pH dependence of the activity of the G34 enzyme protein according to the present example.
  • FIG. 8 is a diagram showing the ionic requirement of the activity of the G34 enzyme protein according to the present example.
  • FIG. 9 is a graph showing the expression level of the G34 enzyme protein according to the present example in a human cell line.
  • FIG. 10 is a diagram in which the amino acid sequence IJ of mouse G34 (upper) in this example is aligned with the amino acid sequence of human G34 (lower).
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of in situ hybridization of a mouse testis sample using the mG34 nucleic acid according to the present example.
  • the present inventors attempted to isolate and purify a nucleic acid of interest, which seems to have high sequence identity, based on the base sequence of an enzyme gene having an action similar to that of the target enzyme.
  • a BLAST search was performed using the sequence of a known glycosyltransferase, [33] galactosyltransferase 6 (jS3GalT6) as a query, and as a result, a sequence having homology was found ( GenBank No. AX285201).
  • this salt was known as the sequence of SEQ ID NO: 106 described in International Publication No. 0 179 556 (Patent Document 1), but its activity was unknown.
  • the present inventors independently cloned the above gene by PCR, determined its base sequence (SEQ ID NO: 1) and its deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2), and obtained the polynucleotide encoded by the nucleic acid.
  • the inventors have succeeded in determining the specific biological activity of the peptide and completed the present invention.
  • a mouse gene was searched using the sequence as a query, and as a result, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and its deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) were found.
  • the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are designated as human G34, and the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 The mouse was named G34.
  • the G34 protein uses an N-acetyl-D-galatatosamine residue as a donor substrate and an N-acetyl-D-darcosamine residue as an acceptor substrate. Then, as described in detail in Example 2 of the present specification, various sugars (for example, galactose, diacetyl-D-darcosamine) are transferred into the amino acid sequence in a ⁇ 1,3 linkage form. It retained three motifs that were well conserved in the enzyme family. From these viewpoints, it is surprising that G34 protein has a transposition activity to synthesize a novel sugar chain structure ⁇ GalNAc-1,3-GlcNAc '' which has not been reported previously in mammals, especially in humans. it was thought. Its binding form was actually confirmed by NMR.
  • various sugars for example, galactose, diacetyl-D-darcosamine
  • the present invention relates to a ⁇ 1,3'-acetyl-D-galactosamine transferase protein which transfers N-acetyl-D-galactosamine to N-acetyl-D-dalcosamine by ⁇ 1,3 bond.
  • the enzyme protein of a preferred embodiment of the present invention has the following properties (a)-(c): (a) specificity of a receptor substrate
  • the numbers in the formula indicates the carbon number of the sugar ring is present glycosidic bonds, " ⁇ " and “i3” represents a Anoma glycosidic bond the 1-position of the sugar ring, the positional relationship between the 5-position CH 2 0H or CH 3 Indicates the transformer's one by “c3 ⁇ 4J, and the cis' one by [] 3”).
  • Said activity is enhanced in the presence of at least Mn 2+ , Co 2 ⁇ or Mg 2+ , but the enhancement of activity by Mn 2+ is almost completely abolished in the presence of Cu + ;
  • the glycosyltransferase protein of the present invention is a polypeptide of the following (A) or (B):
  • the peptide is the amino acid of SEQ ID NO: 2. It is a bran transferase protein comprising a polypeptide having an amino acid sequence of acid numbers 189 to 500. Further, a more preferred embodiment of the bran transferase protein is that the polypeptide of the above (A) has the sequence No. 2 is a glycosyltransferase protein comprising a polypeptide having the amino acid sequence of amino acids 36 to 500.
  • the amino acid of amino acids 189 to 500 of SEQ ID NO: 2 or the amino acid of amino acids 35 to 504 of SEQ ID NO: 4 Includes proteins consisting of polypeptides having at least 30% identical amino acid sequence, preferably at least 40% identical amino acid sequence, more preferably at least 50% identical amino acid sequence to the sequence It is.
  • the present invention provides a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding any of the above polypeptides or a nucleotide sequence complementary thereto.
  • a preferred embodiment of the nucleic acid encoding the protein of the present invention is a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 or a nucleotide sequence complementary to at least either of them. More preferably, from a human, a nucleic acid consisting of the nucleotide sequence of base numbers 565 to 1503 described in SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence complementary thereto, most preferably, the nucleic acid consisting of base number 1 described in SEQ ID NO: 1 It is a nucleic acid consisting of a base sequence of 06 to 1503 or a base sequence complementary thereto, and derived from a mouse, the base sequence of base numbers 103 to 1512 of SEQ ID NO: 3 or a base sequence complementary thereto. Nucleic acid consisting of various base sequences.
  • Embodiments of the nucleic acid according to the present invention include DNA.
  • the present invention also provides a vector containing any of the above nucleic acids, and a transformant containing the vector.
  • the present invention provides a method for producing i31,3-N-acetyl-D-galactosamine transferase protein, comprising: growing the transformant; expressing the glycosyltransferase protein; It is intended to provide a production method comprising recovering the glycosyltransferase protein from a grown body.
  • the present invention provides an antibody that recognizes any one of the aforementioned ⁇ 1, 3-di-acetyl-D-galactosamine transferase proteins.
  • the present invention provides a nucleic acid useful as an indicator of canceration or malignancy, which comprises a nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3, or a nucleotide sequence complementary to at least one of the nucleotide sequences, Also provided are nucleic acids for measurement that hybridize under unique conditions.
  • the nucleic acid for measurement of the present invention can be composed of at least a dozen or more continuous nucleotide sequences in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, or a nucleotide sequence complementary thereto.
  • a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 or a nucleotide sequence complementary thereto, and a primer comprising the nucleotide sequence of the following (1) or (2) Set :
  • nucleic acid for measurement of the present invention can be used as a cancer marker.
  • the present invention relates to a method for assaying canceration of a biological sample
  • a method comprising:
  • the measurement of the transcription level includes a hybridization method or a PCR method using any one of the nucleic acids described above, for the biological sample.
  • Said biological sample can be in particular a sample from the colon or lung.
  • the present inventors have determined that the G34 enzyme tag encoded by the nucleic acid The protein was expressed, isolated and purified, and its enzymatic activity identified.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 corresponds to one of the nucleic acids encoding the isolated polypeptide having the enzyme activity. It is an aspect. That is, the nucleic acid of the present invention includes any nucleic acid capable of encoding the same amino acid sequence, which is definite but degenerate to the amino acid sequence of the G34 enzyme protein.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding a full-length polypeptide or a fragment thereof comprising the novel amino acid sequence as described above.
  • a typical nucleic acid encoding such a novel polypeptide has a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 or a nucleotide sequence complementary to at least one of them.
  • the nucleic acids of the present invention also include both single-stranded and double-stranded DNA, and their RNA complements.
  • DNA includes, for example, naturally occurring DNA, recombinant DNA, chemically bonded DNA, DNA amplified by PCR, and combinations thereof. However, DNA is preferable from the viewpoint that it is stable at the time of preparing vectors and transformants.
  • the nucleic acid of the present invention can be prepared, for example, by the following method.
  • a nucleic acid amplification reaction is carried out from a cDNA library according to a conventional method using a basic method of genetic engineering such as hybridization and nucleic acid amplification reaction.
  • the nucleic acids of the invention can be cloned.
  • a DNA fragment of about 1.5 kbp is obtained as a PCR product, which is separated by a method such as agarose gel electrophoresis, in which the DNA fragment is sieved based on molecular weight, to cut out a specific band. It can be isolated according to the method.
  • T measurement of prematurely separated nucleic acid; no acid K. ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 2 ⁇ According to U, it is predicted to have a hydrophobic transmembrane domain at the JM terminus.
  • nucleic acid amplification reaction examples include a polymerase chain reaction (PCR) [Saiki RK, et al., Science, 230, 1350-1354 (1985)], a ligase chain reaction (LCR) [Wu DY, et al., Genomi cs, 4, 560-569 (1989); Barringer KJ, et al., Gene, 89, 117-122 (1990); Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 189-193 ( 1991)] and transcription-based amplification [Kwoh DY, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • NASABA Based Amplificat ion
  • a target enzyme protein can be expressed as described later, and a probe antisense primer can be provided for the purpose of medical research or gene therapy.
  • nucleic acid equivalent to the sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 by preparing a nucleic acid consisting of a base sequence having a certain homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. it can.
  • the homologous nucleic acids of the present invention include one hundred and one-hundred s T times in SEQ ID NO: 2 or 4 and an anole-JJ one-fat domin in i-
  • a nucleic acid encoding a protein having an activity of transferring to acetyl-D-darcosamine by ⁇ 1,3 bond may be included.
  • a suitable nucleic acid sequence encoding the homologous protein of the present invention is typically a whole nucleotide sequence in SEQ ID NO: 1 or 3, preferably a portion consisting of nucleotide numbers 106 to 1503 in SEQ ID NO: 1. More than 40% identity, more preferably at least 50%, to any of the base sequence, preferably a partial base sequence consisting of base numbers 103 to 152 of SEQ ID NO: 3, or a base sequence complementary thereto. % Identity, particularly preferably at least 60% identity.
  • nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 have 86% identity.
  • a suitable nucleic acid sequence encoding the homologous protein of the present invention may be any of the entire nucleotide sequence in SEQ ID NO: 1, preferably any of nucleotide numbers 106 to 1503, or a nucleotide sequence complementary thereto. May be defined as having at least 86%, preferably 90%, identity.
  • the above percent identity can be determined by visual inspection or mathematical calculation.
  • the percent identity of two nucleic acid sequences is described in Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984, and is available from the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) GAP Combiner program, version 6.0.
  • Preferred default parameters for the GAP program include: (1) a single comparison matrix for nucleotides (including values of 1 for identical and 0 for non-identical), and supervision of Schwartz and Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and structure, pp. 353-358, National Biomedical Research Foundation, 1979, Oyotsuna, Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986. 2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap; and (3) no penalty for the terminal gap.
  • Other programs for sequence comparison used by those skilled in the art, can also be used.
  • the other nucleic acid homologous as the structural gene of the present invention typically comprises the nucleotide sequence in SEQ ID NO: 1 or 3, preferably the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 from 106 to 1503.
  • Base string consisting of base numbers 103 to 1512 of SEQ ID NO: 3, or a nucleotide consisting of a base sequence complementary thereto, under stringent conditions, and N-acetyl-D-
  • the stringent conditions means that hybridization occurs under moderate or high stringency conditions.
  • moderately stringent conditions can be readily determined by one of ordinary skill in the art, for example, based on DNA length.
  • the basic conditions are set forth in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Vol.
  • High stringency conditions can also be readily determined by one skilled in the art, for example, based on DNA length. Generally, such conditions include hybridization and washing or washing at higher temperatures and / or lower salt concentrations than moderately stringent conditions, e.g., hybridization conditions as described above, and approximately 68 ° C,
  • Examples of the method for incorporating the DNA fragment of the nucleic acid into the vector of the present invention include the method described in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.1 (2001). No.
  • a commercially available ligation kit for example, Takara Shuzo may be used.
  • the recombinant vector (eg, recombinant plasmid) obtained as described above is introduced into a host cell (eg, Escherichia coli DH5a, TBI, LE392, or XL-LE392 or XL-lBlue).
  • a host cell eg, Escherichia coli DH5a, TBI, LE392, or XL-LE392 or XL-lBlue.
  • Methods for introducing a plasmid into a host cell include the calcium chloride method described in Sambrook, J., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), and the old Spring Harbor Laboratory, 16.1 (2001). Examples include a rubidium chloride method, an electoral poration method, an electroinjection method, a method using a chemical treatment such as PEG, and a method using a gene gun.
  • a usable vector can be simply prepared by ligating a desired gene to a recombination vector (for example, plasmid DNA or the like) available in the art by a conventional method.
  • a recombination vector for example, plasmid DNA or the like
  • Specific examples of the vector to be used include, but are not limited to, pDONR201, pBluescript, pUC18, pUC19, and pBR322 as plasmids derived from Escherichia coli.
  • Those skilled in the art can appropriately select the restriction end so as to be compatible with the expression vector.
  • Those skilled in the art can appropriately select an expression vector suitable for the host cell in which the enzyme of the present invention is to be expressed, and the gene is involved in gene expression so that the nucleic acid can be expressed in the target host cell. It is preferable that regions (promoter region, enhancer region, operator region, etc.) are appropriately arranged and constructed so that the nucleic acid is appropriately expressed.
  • the type of expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing a desired gene in various host cells of prokaryotic cells and / or eukaryotic cells and producing a desired protein.
  • E. coli expression vector pQE - 30, P QE - 60, pMAL - C2, pMAL -. p2, is preferable, pSE420, as an expression vector for yeast pYES2 (.
  • Saccharomyces genus Saccharomyces genus
  • pPIC3 5K Saccharomyces genus
  • pPIC9K pA0815 (above Pichia)
  • insect expression vectors pFastBac, pBacPAK8 / 9, pBK283, pVL1392, pBlueBac4.5 are preferred. .
  • the Gateway system is a system that uses site-specific recombination that enables cloning while maintaining the orientation of the PCR product and allows subcloning into an expression vector with an appropriately modified DNA fragment.
  • an entry clone is created from the PCR product and the donor vector using BP clonase, a site-specific recombination enzyme, which can then be recombined with this clone and another recombination enzyme, LR clonase.
  • LR clonase a site-specific recombination enzyme
  • a transformant for producing the polypeptide of the present invention By incorporating the expression vector containing the nucleic acid of the present invention into a host cell, a transformant for producing the polypeptide of the present invention can be obtained.
  • the host cell for obtaining the transformant may generally be a eukaryotic cell (mammalian cell, yeast, insect cell, etc.) or a prokaryotic cell (E. coli, Bacillus subtilis, etc.).
  • cultured cells derived from humans eg, HeLa, 293T, SH—S ⁇ 5Y
  • mice eg, Neuro2a, NIH3T3
  • All of these host cells are known and are commercially available (for example, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) or available from public research institutions (for example, RIKEN Cell Bank).
  • embryos, organs, tissues or non-human individuals can be used.
  • the G34 enzyme protein of the present invention having properties closer to those of a natural product by using a eukaryotic cell as a host cell (for example, a sugar chain attached thereto). It is considered that a mashed form) can be obtained. From this viewpoint, it is preferable to select eukaryotic cells, particularly mammalian cells, as host cells. Specific mammalian cells include mouse-derived cells, and animal cells include mouse-derived cells, African algae-derived, rat-derived, hamster-derived, monkey-derived or human-derived cells, or cultured cell lines established from these cells. It is exemplified.
  • Escherichia coli, yeast or insect cells as host cells are specifically Enterobacteria (DH5 o; M15, JM109, BL21, etc.), yeasts (INVScl (genus Saccharomyces), GS115, KM71 (above Pichia), etc.), insect cells (Sf21, BraN4, silkworm larva, etc.), etc. .
  • an expression vector can be prepared by linking at least a promoter, an initiation codon, a gene encoding a desired protein, a termination codon, and a terminator region to an appropriate replicable unit in a continuous and circular manner. It can.
  • an appropriate DNA fragment for example, linker, other restriction enzyme site, etc.
  • a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase.
  • an expression vector When a bacterium, particularly Escherichia coli, is used as a host cell, an expression vector generally comprises at least a promoter Z operator region, an initiation codon, a gene encoding a desired protein, a stop codon, a terminator, and at least one replicable unit. .
  • the expression vector When using yeast, plant cells, animal cells, or insect cells as host cells, the expression vector generally includes at least a promoter, an initiation codon, a gene encoding a desired protein, a stop codon, and a terminator. Is preferred. It may also contain a signal peptide. It may optionally contain DNA, an enhancer sequence, an untranslated region on the 5 'side or 3' side of the desired gene, a selective binding region, or a replicable unit.
  • a replicable unit is a DNA capable of replicating its entire DNA sequence in a host cell, and is composed of natural plasmids, artificially modified plasmids (prepared from natural plasmids). Plasmid) and synthetic plasmid. Suitable plasmids include plasmid pQE30, pET or pCAL or a modified product thereof (a DNA fragment obtained by treating pQE30, pET or pCAL with an appropriate restriction enzyme) in E. coli, and plasmid in yeast. pYES2 or PPIC91 (but insect cells include plasmid pBacPAK8 / 9).
  • a preferred initiation codon of the vector of the present invention is, for example, methionine codon (ATG).
  • the stop codon include common stop codons (eg, TAG, TGA, TAA, etc.).
  • the enhancer sequence and the terminator sequence those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, can be used.
  • the selection marker a commonly used marker can be used by a conventional method. Examples thereof include tetracycline, ampicillin, or an antibiotic resistance gene such as kanamycin or neomycin, hygromycin, or spectinomycin.
  • Introduction (also referred to as transformation or transfection) of the expression vector according to the present invention into a host cell can be performed using a conventionally known method.
  • bacteria E. coli, Bacillus subtilis, etc.
  • Cohen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)
  • the protoplast method Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)
  • the Combinent method J. Mol. Biol., 56, 209 (1971)].
  • Saccharorayces cerevisiae for example, the method of Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad.
  • the transformation can be performed by the method of Summer et al. [Mol. Cell Biol. '3, 2156-2165 (1983)].
  • nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 is incorporated into an expression vector and expressed, whereby a polypeptide having a novel enzyme activity is isolated and purified. can do.
  • a typical embodiment of the protein of the present invention is an isolated G34 enzyme protein consisting of the deduced amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • This Jun-Qin protein specifically has the following activities.
  • N-Acetyl-D-galactosamine (GalNAc) J can be transferred from its donor substrate to an acceptor substrate containing“ N-acetyl-D-darcosamine (GlcNAc) ”. From the examination of the motif sequence in the amino acid sequence, the binding form between the N-acetylgalactosamine and the N-acetyldarcosamine is ⁇ It is a 1,3-glycosidic bond (see Example 2).
  • the N-acetyl-D-galactosamine donor substrate includes a sugar nucleotide having N-acetylgalactosamine, for example, peridine diphosphate-N-acetylgalactosamine (UDP-GalNAc) adenosine diphosphate-N-galactosamine ( ADP-GalNAc), guanosine diphosphate mono-N-acetylgalactosamine (GDP-GalNAc), and cytidine diphosphate mono-N-acetylgalactosamine (CDP-GalNAc).
  • a typical donor substrate is UDP-GalNAc.
  • the G34 enzyme protein of the present invention catalyzes the following reaction. ⁇ UDP— GalNAc + GlcNAc-R ⁇ UDP + GalNAc- ⁇ 1, 3-GlcNAc- R
  • R is a glycoprotein, glycolipid, oligosaccharide, polysaccharide, or the like having the GlcNAc residue
  • the GalNAc acceptor substrate is N-acetyl-D-darcosamine, typically an N-acetyl-D-glucosamine residue such as a glycoprotein, a glycolipid, an oligosaccharide, or a rice bran.
  • the human G34 protein (typically having a region from amino acid number 36 of SEQ ID NO: 2 to its C-terminus) obtained in Example 1 described below is obtained by using an oligosaccharide as a receptor substrate.
  • the mouse G34 protein (typically having an active region from amino acid number 35 in SEQ ID NO: 4 to its C-terminus) obtained in Example 4 below is Bz-j3-GlcNAc, pNp- j8 -Glc s GlcNAc- 1-4-GlcNAc- ⁇ -Bz pNp— core2, pNp-core3 And transfer activity to pNp-core6.
  • the transfer activity was highest for Bz- / 3-GlcNAc and the highest for core2—pNp ⁇ core6-pNp, core3-pNp, pNp- ⁇ -Glc, GlcNAc- ⁇ 1 -4- GlcNAc- ⁇ -Bz decreases transcription activity in order.
  • GlcNAc indicates an N-acetyl-D-dalcosamine residue
  • GalNAc indicates a ⁇ [1-acetyl-D-galactosamine residue
  • Glc indicates a dalcosamine residue
  • Bz indicates "PNp” represents a paranitrophenyl group
  • oNp represents an orthonitrophenyl group
  • one represents a glycosidic bond.
  • the number in the formula indicates the carbon number of the sugar ring where the glycosidic bond exists.
  • “hi” and “J3” represent anomers of the glycosidic bond at the 1-position of the sugar ring, and 5 ⁇ j when the positional relationship with CH 2 0H or CH 3 at the 5-position is ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ j, and ).
  • the optimal buffer was MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) buffer, sodium sodium codylate buffer, or HEPES (N- [2-hydroxyethl] piperazine-N -[2-ethanesulfonic acid]) It has the above-mentioned catalytic action in any buffer solution.
  • the pH dependence of the activity in each buffer was the highest in the MES buffer at least around pH 5.50-pH 5.78, followed by the highest activity near pH 6.75;
  • the activity increases as the pH decreases from around pH 6.2 to around pH 5.0, and the activity is highest at around pH 5.0, and from around pH 6.2 to pH 7
  • the activity increases in a pH-dependent manner up to around 0 and becomes almost plateau around pH 7.4; in HEPES buffer, the activity is highest from around pH 7.4 to around 7.5.
  • HEPES buffer showed the strongest activity at pH of about 7.4 to about 7.5. However, the activity is lower than that in other pH regions.
  • the G34 enzyme protein of the present invention can transfer a GalNAc residue to a GlcNAc residue through a ⁇ 1-3 glycosidic bond under the above-mentioned predetermined enzyme reaction conditions, and can be used for glycoproteins, glycolipids, oligo bran, Or it is useful for such a sugar chain synthesis or modification reaction to a polysaccharide or the like.
  • the enzyme protein of the present invention is not limited to only the protein consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 2 and 4 deduced from the nucleotide sequence of the cloned nucleic acid, As explained below, for example, an amino acid sequence--a protein consisting of an incompletely-length polypeptide partially deleted at the terminal end or the like, or a protein homologous to the amino acid sequence, It is intended to include proteins having the native properties of the proteins.
  • the human G34 enzyme protein of the present invention is preferably an amino acid sequence from amino acid number 189 to the C-terminus of SEQ ID NO: 2, more preferably an amino acid sequence obtained in Examples described later. It may have an amino acid sequence from number 36 to the C-terminus.
  • the mouse G34 enzyme protein of the present invention may preferably have an amino acid sequence from amino acid number 35 to SEQ ID NO: 4 to the C-terminal.
  • a protein having a physiological activity such as an enzyme
  • one or more amino acids in the amino acid sequence are substituted or deleted, or one or more amino acids are substituted in the amino acid sequence.
  • the physiological activity can be maintained even when an amino acid is inserted or added.
  • some naturally occurring proteins due to differences in varieties of the species producing them, gene mutations due to differences in ecotype, or the presence of similar isozymes, etc. ⁇ It is also known that there is a mutant protein having multiple amino acid mutations 0608
  • the protein of the present invention may have one or more amino acids substituted or deleted in each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, or one or more amino acids in the amino acid sequence.
  • Mutant proteins having an amino acid sequence in which a certain amino acid is inserted or added, and having an activity of transferring a GalNAc residue to a GlcNAc residue by a ⁇ 1-3 glycosidic bond under the above-mentioned predetermined enzyme reaction conditions are also included. It is.
  • one or several amino acids are substituted or deleted in each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, or one or several amino acids are substituted in the amino acid sequence. Those having an amino acid sequence in which an acid is inserted or added are particularly preferred.
  • the term "plurality” is preferably 1 to 200, more preferably 1 to 100, still more preferably 1 to 50, and most preferably 1 to 20.
  • the number of amino acids that can be substituted is preferably 1 to 10 so that the activity of the original protein is maintained. It is.
  • the modified proteins of the present invention also include modified proteins obtained by substitution between amino acids having similar properties. That is, in general, substitution of amino acids having similar properties (for example, substitution of one hydrophobic amino acid for another hydrophobic amino acid, substitution of one hydrophilic amino acid for another hydrophilic amino acid, A method for producing a recombinant protein having a desired mutation by introducing amino acid into another acidic amino acid, or from a basic amino acid to another basic amino acid) is known to those skilled in the art. And the modified protein thus obtained often has properties similar to the original protein. From this viewpoint, the modified protein having such an amino acid substitution is also included in the present invention. '
  • modified protein of the present invention is a glycoprotein having a sugar chain bound to the polypeptide, as long as it has the amino acid sequence as described above and has an intrinsic enzyme activity for the target enzyme. There may be.
  • the amino acid sequence suitable as the homologous protein of the present invention has an identity of more than 30%, more preferably at least 4% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4. It is particularly preferred that they have at least 50% identity.
  • amino acid sequences described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 have 88% identity.
  • an amino acid sequence suitable as the homologous protein of the present invention may be defined as having at least 88%, more preferably 90% identity to the amino acid sequence in SEQ ID NO: 2. it can.
  • GENETYX is a genetic information processing software for nucleic acid analysis and protein analysis, and can perform signal homology analysis, multi-alignment analysis, signal peptide prediction, promoter site prediction, and secondary structure prediction. is there.
  • the homology analysis program used in this specification is based on the Lipman-Pearson method (Lipman, D.J ". & Pearson, WR, Science, 277, 1435-1441, which is frequently used as a high-speed and high-sensitivity method.
  • the percent identity is determined, for example, by the BLAST program described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25. 3389-3402 (1997)). Natl. Acad. Sci.
  • an antibody against the isolated protein of the present invention can be prepared by administering the isolated protein to an animal as an immunogen as described below. Using such an antibody, the enzyme can be measured and quantified by immunoassay. 0608
  • the present invention is also useful for producing such an immunogen.
  • the protein of the present invention includes polypeptide fragments, mutants, fusion proteins and the like of the protein containing an antigenic determinant or an epitope for eliciting antibody formation;
  • the enzyme protein of the present invention can be isolated and purified by the following methods.
  • a genetic engineering technique a technique has been established in which a transformant is cultured and grown, and a target substance is isolated and purified from the culture or grown product.
  • the enzyme protein of the present invention can also be expressed (produced) by, for example, culturing a transformant containing an expression vector into which the nucleic acid of the present invention has been incorporated in a nutrient medium.
  • the nutrient medium for the transformant preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant). Examples of the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, sucrose, and methanol.
  • inorganic nitrogen source or the organic nitrogen source examples include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like.
  • other nutrients eg, inorganic salts (eg, sodium chloride, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride)
  • vitamins eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.
  • antibiotics eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.
  • the culturing is performed by a method known in the art. Culture conditions, for example, temperature, pH of the medium, and culture time are appropriately selected so that the protein of the present invention is produced in large quantities.
  • the enzyme protein of the present invention should be recovered from the above culture or grown product as follows. 3 3 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ Ma is collected by centrifugation or filtration, etc., and the host cells are collected in an appropriate buffer (for example, if the concentration is Buffers such as about 100 to 100 mM Tris buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, MES buffer, etc. The pH varies depending on the buffer used, but the pH is 5.0 to 9.0. After the suspension, the cells are disrupted by a method suitable for the host cell to be used, and the contents of the host cell are obtained by centrifugation.
  • Buffers such as about 100 to 100 mM Tris buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, MES buffer, etc.
  • the pH varies depending on the buffer used, but the pH is 5.0 to 9.0.
  • the target protein When the quality is secreted out of the host cells, the culture medium is separated from the host cells by centrifugation or filtration to obtain a culture filtrate.
  • the host cell-disrupted liquid or the culture filtrate can be used for isolation and purification of the protein as it is or after ammonium sulfate precipitation and dialysis.
  • Methods for isolating and purifying the target protein include the following methods. That is, when a tag such as 6X histidine, GST, or maltose binding protein is attached to the protein, a method using affinity chromatography that is generally suitable for each tag can be used. On the other hand, when the protein according to the present invention is produced without such a tag, for example, a method using ion exchange chromatography can be mentioned. In addition, a method combining gel filtration, hydrophobic chromatography, isoelectric focusing, or the like may be used.
  • an expression vector that facilitates isolation and purification.
  • an expression vector is constructed so as to express in the form of a fusion protein of a polypeptide having enzyme activity and a labeled peptide, and the enzyme protein is prepared by genetic engineering, isolation and purification are easy. is there.
  • the above-mentioned discriminating peptide include, when the enzyme of the present invention is prepared by genetic recombination, expression of the discriminating peptide and a polypeptide having an enzymatic activity as a fusion protein, whereby the transformant is obtained. It is a peptide having a function of facilitating secretion / separation / purification or detection of the enzyme of the present invention from a grown product.
  • discriminating peptides include, for example, signal peptides (a 15-30 amino acid residue that is located at the ⁇ -terminus of many proteins and that functions in cells to select proteins in the intracellular membrane permeation mechanism).
  • signal peptides a 15-30 amino acid residue that is located at the ⁇ -terminus of many proteins and that functions in cells to select proteins in the intracellular membrane permeation mechanism.
  • peptide consisting of groups: for example 0RapA, etc.
  • signanole peptide protein kinase A, protein A, gnoretathion S transferase, His tag, myc tag, FLAG peptide, T7 tag, S tag, HSV tag, pelB or HA tag
  • the expression and purification of the enzyme according to the present invention by an engineering technique are preferred because it is easier, and it is particularly preferable to obtain a fusion protein with the FLAG peptide (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). It is preferable because it is extremely excellent in handling.
  • the FLAG peptide is highly antigenic and provides an epitope to which a specific monoclonal antibody reversibly binds, allowing for rapid access and easy purification of the expressed recombinant protein.
  • the murine hybridoma designated 4E11
  • 4E11 has been described in U.S. Pat. No. 5,011,912, which is hereby incorporated by reference into the present disclosure to identify the presence of certain divalent metal cations.
  • a monoclonal antibody is produced that binds to the FLAG peptide.
  • the 4Eli hybridoma cell line has been deposited with the American Type Culture Collection under the deposit number HB 9259.
  • Monoclonal antibodies that bind to the FLAG peptide are available from Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division ⁇ New Haven, CO.
  • a fusion protein that can be expressed in mammalian cells and is fused with the above-mentioned FLAG peptide 4 000608
  • a basic vector from which the enzyme protein of the present invention can be obtained as a quality is, for example, pFLAG-CMV-1 (Sigma).
  • a vector that can be expressed in insect cells include pFBIF (a vector in which a region encoding a FLAG peptide is incorporated into pFastBac (Invitro Jardin): see Examples described later).
  • pFBIF a vector in which a region encoding a FLAG peptide is incorporated into pFastBac (Invitro Jardin): see Examples described later.
  • pFBIF a vector in which a region encoding a FLAG peptide is incorporated into pFastBac (Invitro Jardin): see Examples described later.
  • Those skilled in the art can select an appropriate basic vector based on the host cell used for the expression of the enzyme, restriction enzymes, identification peptides, and the like.
  • the present invention provides antibodies that are immunoreactive with the G34 enzyme protein.
  • Such an antibody may specifically bind to the enzyme protein via the antibody's antigen binding site (as opposed to non-specific binding).
  • a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, or a fragment, mutant, or fusion protein thereof can be used as an immunogen for producing an antibody that is immunoreactive with the protein. It is.
  • proteins, fragments, mutants, fusion proteins and the like contain antigenic determinants or epitopes that elicit antibody formation, but these antigenic determinants or epitopes may be linear or higher order.
  • the structure may be used.
  • the antigenic determinant or epitope can be identified by any method known in the art. Therefore, the present invention also relates to the antigenic epitope of the G34 enzyme protein. Such epitopes are useful in generating antibodies, particularly monoclonal antibodies, as described in more detail below.
  • the epitopes of the invention purify antibodies that specifically bind in Atsushi and from substances such as polyclonal sera or supernatants from cultured hybridomas.
  • Antibodies of all aspects can be induced by the enzyme protein of the present invention, which can be used or by using recombinant DNA technology, wherein all or part of the polypeptide of the protein or the epitope is isolated. If you use Both polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared using standard techniques. See, for example, Kennet et al. (Supervised), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyzes, Plenum Press, New York, 1980.
  • hybridoma cell line that produces a mono'clonal antibody specific to the G34 enzyme protein.
  • hybridomas can be produced and identified by conventional techniques.
  • One method for producing such a hybridoma cell line is to immunize an animal with the enzyme protein of the present invention, collect spleen cells from the immunized animal, fuse the spleen cells with a myeloma cell line, This involves generating hybridoma cells and identifying a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody that binds to the enzyme.
  • Monoclonal antibodies can be recovered by conventional techniques.
  • the monoclonal antibodies of the present invention include chimeric antibodies, for example, humanized forms of murine monoclonal antibodies. Such humanized antibodies have the advantage of being administered to humans to reduce immunogenicity.
  • an antigen-binding fragment of the above antibody there is also provided an antigen-binding fragment of the above antibody.
  • antigen-binding fragments that can be produced by conventional techniques include, but are not limited to, Fab and F (ab ') 2 fragments.
  • Antibody fragments and derivatives that can be produced by genetic engineering techniques are also provided.
  • the antibody of the present invention can be used as an assay for detecting the presence of the G34 enzyme protein of the present invention or a polypeptide fragment thereof both in vitro and in vivo.
  • the antibody of the present invention can also be used for purifying the G34 enzyme protein or its polypeptide fragment by immunoabsorption chromatography.
  • the antibodies of the present invention may be provided as blocking antibodies capable of blocking the binding of the glycosyltransferase protein to a binding partner, eg, a receptor substrate, and such binding may result in the biological activity of the enzyme. Can be inhibited.
  • blocking antibodies can be identified using any suitable assay, including testing the antibody for its ability to inhibit the binding of the protein to specific cells expressing the receptor substrate. Can be.
  • Blocking antibodies can also be identified in Atsey for their ability to inhibit biological effects resulting from the enzyme protein binding to the binding partner of the target cell. Such antibodies can be used in in vitro methods or administered in vivo to inhibit a biological activity mediated by the entity that produced the antibody. Thus, according to the present invention, there can also be provided antibodies for treating disorders caused or exacerbated by direct or indirect interaction between a G34 enzyme protein and a binding partner. Such therapy would involve administering to the mammal an in vivo amount of a blocking antibody effective to inhibit the binding partner-mediated biological activity. Generally, monoclonal antibodies are preferred for use in such therapies, and in one embodiment, antigen-binding antibody fragments are used.
  • the present inventors have found that, with the discovery of the G34 enzyme protein described above, mRNA encoding this protein is widely observed in cancerous tissues and cell lines, and particularly, its expression level is significantly increased in cancerous tissues. confirmed. Therefore, G34 nucleic acids are useful as cancer markers useful for cancer diagnosis and the like for biological samples containing transcripts.
  • the present invention provides a measurement nucleic acid capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid defined by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • nucleic acid for measurement of the present invention targets a G34 nucleic acid in a biological sample, and is a primer or a probe having a base sequence selected from the base sequences of SEQ ID NOS: 1 and 3.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is derived from the mRNA encoding the structural gene, and includes the entire open reading frame (0RF) of the G34 gene. A full length of 1 or 3 or almost the same length is found.
  • the primer or probe according to the present invention can be used to prepare a desired partial sequence selected from each nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 (whether it should be homologous or complementary to the selected sequence depends on the method of use).
  • a typical primer or probe includes a natural DNA fragment derived from a nucleic acid having at least a part of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, and synthesized to have at least a part of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. DNA fragments or their complementary strands.
  • the target nucleic acid in a biological sample can be detected and / or quantified as described below.
  • the nucleic acid of the present invention may be used as an antisense primer for medical research or gene therapy.
  • a preferred embodiment of the nucleic acid for measurement of the present invention is a nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, or a probe targeting at least one of the complementary strands thereof, and at least one selected from these nucleotide sequences.
  • the nucleic acid for measurement of the present invention has a length of more than 10 bases, for example, 15 bases, and preferably about 17 bases, and can specifically bind to its target nucleic acid under stringent conditions. It is understood that it can be hybridized. That is, those skilled in the art should select an appropriate partial sequence of at least 15 to 20 bases from the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 according to various known strategies for designing oligonucleotide probes. Can be. In this case, the amino acid sequence information of SEQ ID NO: 2 or 4 is useful for selecting a unique sequence that is considered suitable as a probe.
  • the probe of the present invention for the purpose of medical research is: A nucleic acid consisting of 50 to 500 bases, more preferably 60 to 300 bases, selected from the respective base sequences of SEQ ID NOs: 1 and 3 is exemplified.
  • the above-mentioned stringent conditions are medium or high as described above. Indicates a stringent condition.
  • a person skilled in the art can easily find a moderate or high stringent condition suitable for the selected probe, based on the well-known techniques and empirical rules regarding various probe design methods and hybridization conditions. , Can be implemented.
  • the relatively short oligonucleotide probe is one or several bases in comparison with the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. In particular, even if there is a mismatch of about 1 or 2 bases, it can function as a probe. In addition, the relatively long cDNA probe functions as a probe even if there is a mismatch of 50% or less, preferably 20% or less with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary nucleotide sequence. Can play.
  • the probe of the present invention designed as described above is used as a labeled probe labeled with a fluorescent label, a radioactive label, a biotin label, or the like, in order to detect or confirm a hybrid with the target sequence in G34. Can be done.
  • the labeled probe of the present invention can be used to confirm or quantify a PCR amplification product from a G34 nucleic acid.
  • a probe that targets the base sequence in a region located between a pair of primer sequences used for PCR is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 (corresponding to the complementary strand of nucleotide numbers 525 to 556 in SEQ ID NO: 1) (Example 3).
  • the probe of the present invention may be incorporated in a diagnostic DNA probe kit or the like, or may be fixed on a chip such as a DNA microarray.
  • a preferred embodiment of the primer obtained from the nucleic acid for canceration assay of the present invention is an oligonucleotide primer.
  • two regions may be selected from the ORF region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 so as to satisfy the following conditions.
  • each region is several tens of bases or more, particularly 15 or more bases, preferably 17 or more bases, more preferably 20 or more bases, and 50 or less bases; and b) each region
  • the percentage of G + C in the composition is 40 to 70%; In practice, it may be produced as a single-stranded DNA having the same nucleotide sequence as the two regions selected as described above or a nucleotide sequence complementary thereto, and does not lose the binding specificity to those nucleotide sequences.
  • a single-stranded DNA modified as described above may be produced.
  • the primer of the present invention preferably has a sequence completely complementary to the selected target sequence, but may have a mismatch of 1 or 2 bases.
  • Examples of a pair of primers according to the present invention include, for human G34, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 (sequences of base numbers 48 1-501 and SEQ ID NO: 56 2 in SEQ ID NO: 1 respectively). And a pair of oligonucleotides consisting of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 (respectively, base number 4 81 in SEQ ID NO: 3) in mouse G34. (Corresponding to the sequence of -501 and the complementary chain of base numbers 562-581)).
  • the G34 nucleic acid of the present invention has a significantly increased expression level (ie, the level of transcription of the gene from the genome to mRNA) in a cancerous biological sample as compared to a healthy biological sample.
  • a significantly increased expression level ie, the level of transcription of the gene from the genome to mRNA
  • the transcript extracted from a biological sample or a nucleic acid library derived therefrom is used as a test sample, and the amount of the G34 nucleic acid is determined using the above-described probe or primer. (Typically the amount of mRNA) and determine whether this measurement significantly exceeds that of a healthy biological sample.
  • the test biological sample is determined to be cancerous or malignant.
  • the reference value for a healthy biological sample serving as a control is the same as that for the control part 1 'in the same tissue of the same patient, which is positively suspended from the control section.
  • a bridge value may be used, or a value generalized based on known data obtained from a control site or the like, for example, an average value of mRNA amount in healthy tissue may be used.
  • human G34 showed a high level of expression in normal regions of brain, skeletal muscle, spleen, adrenal gland, testis, and prostate, and At relatively low levels but significant expression .
  • the expression of human G34 is widely observed in various tissues in general, and the expression level of human G34 is significantly increased even in tissues having relatively low expression levels such as colon and lung tissues. It has been found.
  • the criteria set according to the malignancy to be judged can be judged. For example, to detect highly aggressive tissues, to set a lower reference value to be positive, or to comprehensively detect test samples that have no or no sign of canceration
  • the criterion can be arbitrarily set according to the purpose, for example, by setting a higher reference value to be positive.
  • the following describes the canceration detection method of the present invention, taking the hybridization method and the PCR method as examples.
  • aspects of the assay include, for example, various hybrids known to those skilled in the art, such as Southern blot, Northern blot, dot plot, or co-needle hybridization using a probe obtained from the nucleic acid of the present invention. Includes a method using a hybridization assay. If further amplification or quantification of the detection signal is required, they may be combined with an immunoassay.
  • a test nucleic acid or an amplified product thereof extracted from a biological sample is immobilized, hybridized with a labeled probe under stringent conditions, washed, and bound to a solid phase. The label is measured.
  • Extraction and purification of transcripts from biological samples can be performed using any method known to those of skill in the art.
  • Preferred embodiments of the canceration assay of the present invention also include a PCR method utilizing a nucleic acid amplification reaction with the primer of the present invention.
  • the details of the PCR are as described above.
  • a specific embodiment of the present assay using PCR will be described.
  • the G34 mRNA in the transcript to be tested is a predetermined region selected from its nucleotide sequence.
  • the nucleic acid in a healthy tissue can be measured in the same manner.
  • Nucleic acids of genes that are widely and commonly present in the same tissue etc.> For example, glyceraldehyde 3-phosphate monodehydrogenase (GAPDH), nucleic acid encoding] 3-actin is used as a control to determine individual differences. Should be removed. The measured value of the G34 transcript level is compared to determine the presence or absence of cancer, as described above, to test the degree of malignancy.
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphate monodehydrogenase
  • the nucleic acid sample to be subjected to the PCR method may be either an entire mRNA extracted from a biological sample such as a test tissue or a cell, or an entire cDNA reverse-transcribed from the mRNA.
  • the NASBA method 3SR method, TMA method
  • the primer pair of the present invention Since the NASBA method itself is well known, and a kit therefor is commercially available, it can be easily carried out using the primer pair of the present invention.
  • Detection or quantification of the above amplification products can be carried out by electrophoresis of the reaction solution after amplification and staining the band with ethidium bromide, or by immobilizing the amplification products after electrophoresis to a solid phase such as a nylon membrane. It can be carried out by hybridizing a labeled probe (for example, having a base sequence of SEQ ID NO: 16) that specifically hybridizes with the test nucleic acid, washing, and detecting the label.
  • a labeled probe for example, having a base sequence of SEQ ID NO: 16
  • Suitable PCR methods for this assay include quantitative PCR, particularly RT-PCR for kinetic analysis and quantitative real-time PCR.
  • the quantitative real-time RT-PCR method targeting the mRNA library is suitable from the viewpoint that the measurement target can be directly purified from a biological sample and directly reflects the transcription level.
  • the quantification of nucleic acids in this assay is not limited to quantitative PCR, and other known methods such as Northern plots, dot plots, and DNA microarrays using the above-described probes can be used for PCR products. Apply DNA quantification method 2004/000608
  • kits for quantitative RT-PCR are commercially available, so it can be easily performed.
  • semiquantify the target nucleic acid based on the intensity of the electrophoresis band.
  • Another embodiment of the canceration assay method of the present invention includes an assay for determining the effect of curing or alleviating cancer.
  • the subject of the assay includes all treatments such as administration of an anticancer drug, radiation therapy, and the like, and the subject of the treatment includes in vitro cancer cells and cancer tissues derived from a cancer patient or an animal model of carcinogenesis.
  • the transcription level of G3 nucleic acid in the biological sample decreases due to the treatment.
  • the therapeutic effect of the treatment on cancer can be known.
  • the present invention is not limited to the determination of whether or not the transcription level is reduced, and may be evaluated as effective when the increase is significantly suppressed.
  • the comparison of the transcript level may be not only a comparison with untreated tissue, but also a time course after treatment.
  • the cancer therapeutic effect assay according to the present invention includes, for example, whether or not the anticancer drug candidate is effective on cancerous tissue and whether or not resistance has been formed to the anticancer drug being administered to the cancer patient. This includes determination as to whether or not it is effective.
  • the test tissues of the experimental model animals include not only in vitro but also in vivo or ex vivo samples.
  • the present inventors have determined the presence of mouse G34 and its nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 3).
  • the present invention provides a means for analyzing G34 expression and function at the animal individual level based on various gene conversion techniques using fertilized eggs and ES cells, typically a transgenic animal into which the G34 gene has been introduced, (4) Also relates to production of knockout mice lacking mouse G34.
  • knockout mice can be produced in accordance with a conventional method in the technical field (the latest technology of gene targeting, edited by Ken Yagi, Yodosha: Gene Targeting, translated by Tetsuo Noda, Medical 'Science' International) Please refer to the company. That is, those skilled in the art can use the mouse G34 nucleic acid sequence information disclosed in the present application to obtain a G3 homologous recombination ES cell according to a known gene targeting method, and use this to transform a G34 knockout mouse. It can be fabricated (see Example 7).
  • G34 knockout mouse is not only related to the involvement of the G34 ⁇ gene in specific biological phenomena, ie, information on the duplication of the gene, but also the deficiency of the gene and the phenotype at the individual level (motor, intelligence) And any type of abnormalities related to sensory functions), as well as the function of the gene in the life cycle of the individual, such as development, growth and aging. More specifically, detection of carriers of sugar chains synthesized by G34 and mG34, physiological functions, association with diseases, and the like can be examined using knockout mice obtained by the above method.
  • glycoproteins and glycolipids from each tissue extracted from knockout mice and comparing them with wild-type mice using proteomics or other techniques (eg, two-dimensional electrophoresis, two-dimensional thin-layer chromatography, mass spectrometry, etc.)
  • proteomics or other techniques eg, two-dimensional electrophoresis, two-dimensional thin-layer chromatography, mass spectrometry, etc.
  • the carrier of the synthesized sugar chain can be identified.
  • by comparing the expression systems of knockout mice and wild-type mice for example, fetal formation, developmental processes, spontaneous motility, etc.
  • the term "measured value” or "expression J" of the transcription level of a nucleic acid refers to the amount of the nucleic acid present in a certain amount of a transcript derived from a biological sample, that is, the nucleic acid. Since the assay method of the present invention relies on comparing these measured values, nucleic acids were amplified by PCR or the like for quantification, or signals from probe labels were amplified. In this case, it is also possible to make a relative comparison between the amplified values, so that the “measured value for nucleic acid” can be understood as the amount after amplification or the signal level after amplification. .
  • target nucleic acid refers to not only G34 mRNA but also any type of nucleic acid obtained by converting the mRNA into a type, whether in vivo or in vitro. Is included.
  • base sequence includes sequences complementary thereto unless otherwise specified.
  • biological sample refers to organs, tissues and cells, as well as organs, tissues and cells derived from experimental animals, but is preferably a tissue or cells.
  • tissues include brain, fetal brain, cerebellum, medulla, submandibular gland, thyroid, trachea, lungs, heart, skeletal muscle, esophagus, duodenum, small intestine, large intestine, rectum, colon, liver, fetal liver, fetal liver
  • the kidney, adrenal gland, thymus, bone marrow, spleen, testis, prostate, mammary gland, ovary, and placenta are more preferably large intestine and lung.
  • the term “measurement” or “assay” includes any of detection, amplification, quantification, and semi-quantitation.
  • the assay method according to the present invention relates to an assay for canceration of a biological sample as described above, and can be applied to the diagnosis and treatment of cancer in the medical field.
  • the term “assay for canceration” includes an assay for whether a biological sample is carcinogenic and an assay for whether or not the malignancy is high.
  • the term “cancer” typically includes malignant tumors in general and includes disease states caused by the malignant tumors.
  • the subject of the assay according to the present invention is not particularly limited, but neuroblastoma, glioma, lung cancer, esophagus cancer, stomach cancer, Tengler cancer, liver cancer, kidney cancer, duodenal cancer, small intestine cancer Colorectal cancer, rectal cancer, colon cancer, leukemia, preferably colon cancer, lung cancer.
  • Example 1 Cloning and expression of human G34 gene and purification of expressed protein
  • a nucleic acid sequence having homology (SEQ ID NO: 1) was found.
  • the open reading frame (0RF) predicted from the nucleic acid sequence is 1503 bp, and has an amino acid sequence of 500 amino acids (SEQ ID NO: 2).
  • the product encoded by these nucleic acid and amino acid sequences was designated as human G34.
  • At the N-terminal of the amino acid sequence of G34 there is a hydrophobic amino acid region characteristic of glycosyltransferase.
  • the homology with the i33GalT6 is 47% in the nucleic acid sequence and 28% in the amino acid sequence. It also retains all three motifs in the i3 3GalT family.
  • G34 in mammalian cells was confirmed, and G34 was expressed in insect cells in order to examine the details of its activity.
  • the active region from G36 amino acid to the C-terminus of G34 was transfected into a mammalian cell line expression vector pFLAG-CMV3 by FLAG Protein in Expression System (Sigma Aldrich). If pFLAG-CMV3 is used, it has a multiple cloning site, and the target gene and pFLAG-CMV3 can be introduced into pFLAG-CMV3 by performing a ligation reaction after treating them with restriction enzymes.
  • PCR reaction was performed using the DNA to obtain a target DNA fragment.
  • the PCR method is 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 12. This was performed under the condition that the same 2 minutes were repeated 25 times.
  • the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the gel was excised by gel excision and isolated by a standard method. This PCR product has HindII I on the 5 side and BamHI on the 3 'side as restriction enzyme sites.
  • Human kidney cell-derived cell line 293T cells (2 ⁇ 10 6 cells) were suspended in 10 ml of DMEM medium (Invitrogen) containing 10% fetal serum without antibiotics, and seeded on a 10 cm dish. and cultured in C0 2 incubator at time 37 ° C.
  • 20 n of pFLAG_CMV3-G34A and 30 ⁇ l of Lipofectamin 2000 (Invitrogen) were mixed with 1.5 ml of 0PTI-MEM (Invitrogen), respectively, and incubated at room temperature for 5 minutes. Further, the two solutions were mixed gently and incubated at room temperature for 20 minutes. This mixed solution was added dropwise to the di V shoe, and cultured in C0 2 in Kyubeta at 48 hours 37 ° C.
  • the active region from amino acid 36 to the C-terminus of G34 was incorporated into pFastBac (manufactured by Invitrogen) of the GATEWAY system (manufactured by Invitrogen). .
  • This product was incorporated into pD0NR201 (manufactured by Invitrogen) by a BP clonase reaction to prepare an “entry clone”.
  • the reaction was carried out by incubating the target DNA fragment 51, pD0NR20111 (I50ng), reaction buffer 21 and BP clonase mix 21 at 25 ° C for 1 hour. 1 plus proteinase K 37. The reaction was terminated every 10 minutes of C. Then, add the above reaction solution 1
  • the above-mentioned entry clone has attL which is a recombination site when lambda phage is cut out from E. coli on both sides of the insertion site, and LR clonase (a mixture of lambda phage recombination enzymes Int, IHF and Xis) ) And the destination vector, the insertion site is transferred to the destination vector and the expression clone is created.
  • the specific steps are as follows.
  • pFBIF is pFastBac 1 containing an Ig / c signal sequence (SEQ ID NO: 9) and a FLAG peptide for purification (SEQ ID NO: 10) .
  • the IgK signal sequence is used to make the expressed protein a secretory form.
  • FLAG peptide was purchased for purification.
  • the FLAG peptide had 0T3 (SEQ ID NO: 11) as the ⁇ type, and the DNA fragment obtained by the primers 0T20 (SEQ ID NO: 12) and 0T21 (SEQ ID NO: 13) was inserted with Bam HI and Eco R1. .
  • the Gateway Vector Conversion System (Nytrogen) to enter the conversion cassette;
  • This system uses a Tn7 recombination site and introduces pFastBac with the target gene inserted into bacmid-containing Escherichia coli (DH10BAC, manufactured by Invitrogen).
  • DH10BAC Bacmid-containing Escherichia coli
  • Bacmid also contains the lacZ gene and can be selected using classical blue (no insertion) and white colonies (with insertion).
  • the above-mentioned purified vector (pFBIH-G34A) was transformed into a competent cell (E. coli).
  • DH10BAC DH10BAC
  • heat-shocking inoculate on LB plate containing kanamycin, gentamicin, tetracycline, Bluogal, and IPTG, further culture single white colonies the next day, and collect bacmid did.
  • the bacmid was introduced into insect cell Sf21 (available from Invitrogen).
  • the culture solution was aspirated from the cells, the diluted ipid-DNA complexes solution was added to the cells, and the mixture was incubated at 27 ° C for 5 hours. Thereafter, the transfusion mixture was removed, and 2 ml of an Sf-900 SFM culture solution containing an antibiotic was added, followed by incubation at 27 ° C for 72 hours. After 72 hours from the transfection, the cells were detached by pipetting, and the cells and the culture solution were collected. This was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was stored in another tube (this supernatant becomes the primary virus solution).
  • G34 protein ⁇ 1,3-1-acetylgalatatosamine transfer activity was examined for substrate specificity, optimal buffer solution, optimal ⁇ , and divalent ion requirement.
  • the receptor-substrate specificity of GalNAc transfer activity was examined.
  • acceptor substrates of the following reaction solutions include pNp-a-Gal, oNp-jS-Gal, Bz-a_GlcNAc, pNp-j3-GlcNAc ⁇ Bz- ⁇ -GalNAc ⁇ pNp-j8-GalNAc, pNp-h-Glc ⁇ pNp-j3-Glc ⁇ pNp- ⁇ -GlcA, pNp-ichi-Fuc, pNp- ⁇ ; Xyl, pNp-Xyl and pNp- ⁇ -Man (all Sigma) as 10 nmol each Was.
  • Gal indicates a D-galactose residue
  • rxylj indicates a D-xylose residue
  • Fluc indicates a D-fucosyl residue
  • Man indicates a D- Indicates a mannose residue
  • GlcA indicates a dalc acid residue.
  • the reaction solution (final concentration in Kakko) is substrate (10 nmol), MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) (pH 6.5, 50 mM), MnCl 2 (10 mM) Triton X-100 (trade name) ( 0.1%), was mixed with UDP-GalNAc (2 mM) and UDP- [ "C] GlcNAc (40 nCi), this is the G34 enzyme solution 5 mu. 1 in addition to further Eta 2 0 was added The total volume was 20 ⁇ l (see Table 1).
  • the reaction mixture was reacted at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction was completed, 200 / zl of H 20 was added, and the mixture was lightly centrifuged to obtain a supernatant. After washing once with 1 ml of methanol, passed through a supernatant to 1 ml of H 2 0 twice washed and equilibrated Sep- Pak plus C18 Cartridge (manufactured by Waters Corporation), a substrate in the supernatant Oyo ⁇ The product was adsorbed on the cartridge. After washing the cartridge twice with 1 ml of 0, the adsorbed substrate product was eluted with 1 ral of methanol.
  • the eluate was mixed with 5 ml of liquid scintillator ACSII (manufactured by Amersham Bioscience), and the amount of radiation was measured using a scintillation counter (manufactured by Beckman Co., Ltd.).
  • ACSII liquid scintillator
  • the G34 protein was found to be a GalNAc transferase having an activity of transferring GalNAc to pNp-; 3-GlcNAc.
  • the enzyme activity increased linearly with the reaction time of at least 0 to 16 hours when UDP-GlcNAc was used as the donor substrate and Bz-jS-GlcNAc was used as the acceptor substrate (Table 2 and FIG. 1). See).
  • the binding format was analyzed by NMR.
  • the reaction solution (final concentration in Kakko) was HEPES buffer (pH 7.4, 1 mM) using ⁇ -GlcNAc (640 plates ol) as the acceptor substrate, and Triton. -54 (trade name) (0 ⁇ 3, UDP - .. GalNAc (2 mM), MnCl 2 (10 mM) and were added G34 enzyme solution 500 mu 1 to make a total volume of 2 ml addition of more Eta 2 0 reaction The solution was reacted for 16 hours at 37 ° C. The reaction was stopped by heating the reaction solution at 95 ° C. for 5 minutes, followed by filtration and purification using Ultrafree-MC (Millipore).
  • the first-order signals of the two residues both have a piston coupling constant of 8.4 Hz, and the two pyranoses are of the i3 type.
  • the spin coupling constants are shown in Fig. 3, where A shows the spin coupling constant characteristic of Darcos, and B shows the spin coupling constant characteristic of galactose.
  • N0E was observed between the methylene and A1 protons of benzyl, indicating that A was a benzyl-bonded residue. d) There are two N-acetyl methyl signals, indicating that the two residues are N-acetylated sugars. e) N0E of B1-A3 exists in N0ESY.
  • FIG. 5 shows a comparison between the deduced amino acid sequence of the G34 protein (SEQ ID NO: 2) and the amino acid sequences of various human ⁇ -3Gal transferases (j33Gal-T1 to T6).
  • the boxed area shows the motifs common to Gal transferases.
  • the 3 motifs boxed in the Ml to 3 frames are common to ⁇ 1,3-linked glycosyltransferases. Motif.
  • * marks indicate amino acid residues conserved between the compared sequences.
  • Figure 6 shows the ⁇ 1,3 bond formation ability between various ⁇ l-3GlcNAc transferases ( ⁇ 3Gn- ⁇ 2- ⁇ 5) and human Gal transferases T1-T3, ⁇ 5, ⁇ 6.
  • the comparison is shown for three motifs (corresponding to the above-mentioned ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 to 3 motifs in FIG. 5).
  • the asterisks in the figure indicate amino acid residues conserved between the compared sequences.
  • the amino acid sequence of the G34 protein Species j31 conserveed enough to say that it has all the motifs (Ml-3) related to the / 31,3 bond in comparison with the amino acid sequence of the 1,3-linked glycosyltransferase I understood.
  • the optimal buffer and optimal pH for G34 GalNAc transfer activity were examined.
  • the receptor substrate used was pNp-] 3-GlcNAc.
  • Buffer (final concentration in Kakko) is MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) buffer (pH 5.5, 5.78, 6.0, 6.5 and 6.75, 50 mM), power Sodium codylate buffer (pH 5.0, 5.6, 6.0, 6.2, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4 and 7.5, 25 mM) and N- [2-Hydroxityl] pidazine-N '-[2-Ethanthnorefonic acid (HEPES) buffer (pH 6.75, 7.00, 7.30, 7.40 and 7.50) , 14 mM).
  • the reaction mixture was reacted at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction was completed, H 20 was added to 200 ⁇ 1, and the mixture was lightly centrifuged to obtain a supernatant. The supernatant was passed through a Sep-Pak plus C18 Cartridge (Waters) equilibrated after washing once with 1 ml of methanol and then 2 times with 1 ml of 0, and the substrate and product in the supernatant were washed. Was adsorbed on the cartridge. After washing the cartridge twice with 1 ml of H 2 0, to elute the substrate and product adsorbed with 1 ml of methanol.
  • the eluate was mixed with 5 ml of a liquid scintillator ACSII (manufactured by Amersham Bioscience), and the amount of radiation was measured using a scintillation counter (manufactured by Beckman Coulter Inc.).
  • ACSII liquid scintillator
  • the requirements for divalent ions were studied using the following reaction system.
  • the receptor substrate is
  • the reaction solution (final concentration in Kakko) is substrate (10 nmol), HEPES buffer (pH 7.4, 14 mM), Triton CF-54 (trade name) (0.3 ° /.), UDP- GalNAc (2 mM), UDP- [C] GlcNAC (40 nCi), and 5 ⁇ l of G34 enzyme solution were added.
  • This MnCl 2, M g and Cl 2 or CoCl 2 2.
  • 5 mM, 5 mM , 10 raM, and 20 mM and 40 mM ⁇ Ka ⁇ to make a total volume of 20 mu 1 further addition of H 2 0.
  • the above reaction mixture was reacted at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction was completed, 200 ⁇ l of H 20 was added, and the mixture was lightly centrifuged to obtain a supernatant. After washing once with 1 ml of methanol, passed through a supernatant to 1 ml of H 2 0 Sep- washed and equilibrated twice with Pak plus C18 Cartri dge (manufactured by Waters Corporation), a substrate in the supernatant Contact The product was adsorbed on the cartridge. After washing the cartridge twice with 1 ml of H 2 0, substrate and product adsorbed with 1 ml of methanol PT / JP2004 / 000608
  • the eluate was mixed with 5 ml of a liquid scintillator ACSII (manufactured by Amersham Bioscience), and the amount of radiation was measured using a scintillation counter (manufactured by Beckman's Coulter).
  • ACSII liquid scintillator
  • Receptor substrates are pNp- ⁇ -Gal, oNp-jS-Gal, ⁇ - ⁇ -GlcNAc, Bz- ⁇ -GlcNAc, Bz- ⁇ -GalNAc ⁇ Np- ⁇ -GalNAc, pNp-H-Glc, pNp- / 3 -Glc ⁇ pNp-j3-GlcA, Np- -Fuc, pNp -hi-Xyl, pNp-] 3-Xyl, pNp- ⁇ -Man, ratatoside-Bz, Lac-ceramide, Gal-ceramide, paragloboside, Guroposhido, Gal-) 31-4 GalNAc-a- pNp, Gal-] 31- 3 GlcNAc- ⁇ -pNp s GlcNAc - j3 DOO 4 Glc
  • GalNAc- ⁇ - ⁇ GalNAc- ⁇ - ⁇
  • pNp-core2 GalNAc- ⁇ 1-3 (GlcNAc-j31-6) GalNAc -hi pNp
  • pNp-core3 GalNAc- j31-3 GalNAc- a- pNp
  • pNp-core6 GlcNAc- j31-6 GalNAc-hy-pNp was used.
  • “Lac” indicates a D-lactose residue.
  • the reaction solution (final concentration in Kakko) was substrate (50 nmol), HEPES buffer (pH 7.4, 14 mM), Triton CF-54 (trade name) (0.3 ° /.), UDP-GalNAc ( 2 mM), MnCl 2 (10 mM), 5 ⁇ l of UDP- [ 3 H] GlcNAc and G34 enzyme solutions. Make a total volume of 20 mu 1 further adding Eta 2 0.
  • the above reaction mixture was reacted at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction was completed, 200 ⁇ 1 of H 20 was added, and the mixture was lightly centrifuged to obtain a supernatant. After washing once with 1 ml of methanol, pass the supernatant through Sep-Pak plus C18 Cartridge (Waters) equilibrated by washing twice with 1 ral 3 ⁇ 40 and equilibrate the substrate in the supernatant. The product was adsorbed on the cartridge. After washing the cartridge twice with 1 ml of 0, the adsorbed substrate and product were eluted with 1 ml of methanol.
  • the eluate was mixed with 5 ml of a liquid scintillator ACSII (manufactured by Amersham Bioscience), and the amount of radiation was measured with a scintillation counter (manufactured by Beckman Coulter, Inc.).
  • ACSII liquid scintillator
  • the reaction mixture (Katsuko the final concentration), ⁇ - - GlcNAc (10 nmol) , HEPES buffer (P H 7. 4, 14 mM ), Triton CF - 54 ( trade name) (0. 3%), UDP -GalNAc (2 mM), MnCl 2 (10 raM) and 10 ⁇ l of G34 enzyme solution were added. Make a total volume of 20 mu 1 further adding Eta 2 0. This reaction solution was reacted at 37 ° C. for 16 hours. The reaction was stopped by adding 100 ⁇ of H 20 to the reaction mixture, and the mixture was purified by filtration with Ultrafree-MC (Millipore).
  • MALDI-TOF-MS Matrix-assisted laser ionization-time-of-flight mass spectrometry
  • G34 mRNA expression levels in normal human tissues were compared using quantitative real-time PCR.
  • the quantitative real-time PCR method This is a method that combines a fluorescent probe with a fluorescent marker. When amplifying by PCR, the fluorescent label of the probe is removed and shows fluorescence. Fluorescence intensity is amplified in correlation with gene amplification. Quantification is performed using this as an index. RNA from each normal human tissue (Clontech) is extracted with the RNeasy Mini Kit (Qiagen), and is extracted using Suner-Script First. -Strand Synthesis System (manufactured by Invitrogen) was used as the single strand DNA by the oligo (dT) method.
  • the minute was repeated 50 times.
  • the calibration curve was prepared by performing PCR according to the above-mentioned method using plasmid DNA obtained by introducing a partial sequence of G34 into pFLAG-CMV3 (Invitrogen) as type III.
  • RNA from normal tissue of the same patient as the cancer tissue was extracted with the RNeasy Mini Kit (Qiagen) and converted into single strand DNA by oligo (dT) using Super-Script First-Strand Synthesis System (Invitrogen). .
  • ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) was obtained using the 5 'primer (SEQ ID NO: 14), the 3' primer (SEQ ID NO: 15) and the TaqMan probe (SEQ ID NO: 16). Japan Co., Ltd.).
  • the PCR conditions were as follows: a reaction was performed at 50 ° C for 2 minutes and 95 ° C for 10 minutes, and then 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute were repeated 50 times. The obtained numerical values were divided by 0-actin, which was quantified using a kit manufactured by Applied Biosystems Japan, as an internal standard gene in order to correct variations among individuals, and a comparison was made.
  • G34 in a mammal-derived cell line in order to examine the activity of mG3 in which the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 were named mouse G34 (mG34).
  • the active region from the amino acid at position 35 to the C-terminus of mG34 was expressed using a FLAG Protein Expression System (Sigma-Aldrich) to express a mammalian cell line. The gene was introduced into pFLAG-CMV3.
  • Mouse tissues (brain, thymus, stomach, small intestine, large intestine, liver, kidney, spleen, kidney, testis, and skeletal muscle) were type I, and 5 'primer (mG34-CMV-F1: SEQ ID NO: 17) and 3' A PCR reaction was performed using a primer (mG34-CMV-R1: SEQ ID NO: 18).
  • the PCR method was performed under the conditions of repeating 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes 25 times.
  • the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a band of about 1500 bp was confirmed. As a result, as shown in Table 10, expression was highest in the testis, followed by expression in the order of spleen and skeletal muscle.
  • a PCR reaction was performed using a 5 'primer (mG34-CMV-F1: SEQ ID NO: 17) and a 3' primer (raG34-CMV-R1: SEQ ID NO: 18).
  • the desired DNA fragment was obtained.
  • the PCR method was performed under the conditions of repeating 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes 25 times.
  • the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the gel was cut out by gel cutting out and isolated by a standard method.
  • This PCR product has HindIII on the 5 'side and Notl on the 3' side as restriction enzyme sites.
  • the target DM was confirmed by direct PCR on the colonies obtained the next day. To ensure the DNA sequence, the DNA sequence was confirmed by sequencing, and the vector (pFLAG-CMV3-raG34A) was extracted and purified.
  • Human kidney cell-derived cell line 293T cells 2 ⁇ 10 6 cells were suspended in 10 ral of DMEM medium (Invitrogen) containing 10% fetal serum serum without antibiotics, and seeded on a 10 cm dish. and cultured in C0 2 incubator at time 37 ° C.
  • 20 ng of pFLAG_CMV3-mG34A and 30 ⁇ l of Lipofectarain 2000 (Invitrogen) were mixed with 1.5 ml of 0 ⁇ - ⁇ (Invitro Jadin), respectively, and incubated at room temperature for 5 minutes. Further, the two solutions were mixed gently and incubated at room temperature for 20 minutes. This mixed solution was added dropwise to the dish, and cultured in C0 2 incubation. Over data at 48 hours 37 ° C.
  • the following reaction system was used to examine the substrate specificity of mouse G34 in the / 31,3-N-acetylgalactosamine transfer activity.
  • the ⁇ acceptor substrate '' of the following reaction solution includes ⁇ - ⁇ -Gal, oNp-jS-Gal, Bz- ⁇ -GlcNAc, Bz-) S-GlcNAc, Bz-a_Ga, cNp- ⁇ -GalNAc, pNp- ⁇ -Glc ⁇ pNp-j8-Glc, pNp--GlcA, pNp-a-Fuc, pNp-a-Xyl, pNp-j3-Xyl, pNp-a-an lactoside-Bz, Lac-ceramide, Gal-ceramide, Gb3, globoside, Ga-II-4GalNAc-a-pNp, Gal ⁇ l-3GlcNAc- ⁇ -Bz, GlcNAc
  • the reaction solution (final concentration in Kakko) was substrate (10 nmol), HEPES (N— [2-hydroxyshethyl] piperazine-N '— [2-ethanesulfonic acid]) (pH 7.4, 14 mM ), MnCl 2 (10 mM) Triton CF-54 (trade name) (0.3%), UDP-GalNAc (2 mM) and UDP- [ 14 C] GlcNAC (40 nCi) were mixed, and mouse G34 the enzyme solution 5 1 added to make a total volume of 20 1 in addition to H 2 0.
  • the reaction mixture was reacted at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction was completed, 200 ⁇ l of 0 was added, and the mixture was lightly centrifuged to obtain a supernatant. Washed once with 1 ml of methanol, 1 ml of washed H 2 0 twice through upper cleanse the equilibrated Sep- Pak plus C18 Cartridge (manufactured by Waters Corporation), a substrate in the supernatant and production The object was adsorbed on the cartridge. After washing the cartridge twice with 1 ml of 0, the adsorbed substrate and product were eluted with 1 ml of methanol. The eluate was mixed with 5 ml of a liquid scintillator ACSII (manufactured by Amersham Bioscience), and the amount of radiation was measured using a scintillation counter (Beckman Co., Ltd.).
  • ACSII liquid scintillator
  • a chromosome fragment (approximately 10 kb) containing an exon containing the activation domain of the gene (mG34) to be knocked out 10 kb) of pBluescript II SK (-) (to prepare a targeting te queuing vector inserted into TOYOBO Ltd.) (P BSK-mG34-K0neo ).
  • neo neomycin resistance gene
  • neo neomycin resistance gene
  • a restriction enzyme 80 was transfected into ES cells (derived from E14 I 129Sv mouse) (e.g., electoral poration) and G418 resistant. Select colonies. Transfer the G418 resistant colony to a 24-well plate and incubate. After cryopreservation of a part of the cells, DNA is extracted from the remaining ES cells, and about 120 clones in which recombination has occurred are selected by PCR. In addition, confirm that the recombination has occurred as planned by Southern blotting, etc., and finally select about 10 clones of the recombinant.
  • Two of the selected ES cells are injected into blastocysts of C57BL / 6 mice.
  • the mouse embryo into which the ES cells have been injected is transplanted into the offspring of the foster mother mouse to produce a chimeric mouse. Thereafter, a hetero knockout mouse can be obtained by germ transmission.

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Abstract

　本発明のＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン転移酵素タンパク質は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンをＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンにβ１，３結合で転移することを特徴とし、好ましくは配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列を有する。本発明による癌化検定方法は、配列番号１又は３に記載の塩基配列、又は少なくともその一方に相補的な塩基配列に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする測定用核酸を利用する。

Description

明細書
β 1 , 3— Ν—ァセチル一 D—ガラク トサミン転移酵素タンパク質及びそれをコ 一ドする核酸、 並びにそれを用いた癌化検定方法 技術分野
本発明は、 新規な β 1 , 3—Ν—ァセチルー D—ガラク トサミン転移酵素タ ンパク質及びこれをコードする核酸、 並びにそれを用いた癌化検定方法等に関す る。
背景技術..' ' .
近年、'.生体内での糖鎖や複合糖質の働きが注目されている。 例えば、 血液型を 決定する因子は糖タンパク質であり、 また神経系の働きに関与しているのは糖脂 質である^ つて、 糖鎖を合^する働きのある酵素は、. 様々な糖鎖がもたらす生 理活性を.解析する上で極めて重要な手がかりとなる。
例えば、. Ν—ァセチルー D—ガラク トサミン （以下、 rGalNAcj とも記述す る） 等はグリコサミノグリカンの構成成分であると共に、 スフインゴ糖脂質、 ム チン型糠鎖と様々な糖鎖構造に存在する糖残基である。 従って、 GalNAcを転移 する酵素は、 生体内の様々な組織で働く糠鎖の働きを解析する上で極めて重要な ツールとなる。
上述のように生体内での糖鎖の働きが注目されているが、 生体内での糖鎖合成 の解析は十^に進んでいると'は言えない。 糖鎖合成のメカニズム、 生体内での糖 合成の局在が充分に解析されていないことも一因である。 糖鎖合成のメカニズム を解析するに当たっては、 糖鎖合成酵素、 特に糖転移酵素を解析し、 その酵素を 使っていかなる糖鎖が合成されるのかを分析する必要がある。 そのために新たな 耱早 s移醇茶を探索し、 その幾能を解祈することについての要請は咼い。
ところで、 GalNAcを転移する活性を有する糖転移酵素については幾つか報告 例があ'る （非特許文献 1〜4 ) 。 例えば、 ヒ トの Gal NAc転移酵素の中で、 Gal NAcを 「 1 , 4結合」 で転移する酵素は公知であり （非特許文献 1 ) 、 また 、 Gal NAcを ]3 1 , 3結合 （本明細書において 「 /3 1 , 3」 ないし 「 3」 と は、 受容体基質が有する糖残基 1位の α—水酸基と、 そこに転移して結合する 糖残基 3位の水酸基との間のグリコシド結合を示す） で転移する酵素としては、 「ガラタトース」 をその受容体基質とする酵素が公知である （非特許文献 2 ) 。 他方で、 ヒトのような高等生物において、 Gal NAcを 「]3 1， 3結合」 で 「N ーァセチルダルコサミン （以下、 「GlcNAc」 とも記述する） 」 へ転移する酵素 は知られていない。
Gal NAcと GlcNAcとが 1 , 3で結合した糖鎖構造は、 節足動物であるハエ の中性糖脂質上の糖鎖中に確認されたとの報告 （非特許文献 5 ) はあるが、 そも そも、 哺乳動物、 特にヒ トにおいてそのような糖鎖構造は存在しないものと信じ られていた。
特許文献 1
国際特許出願公開第 0 1ノ 7 9 5 5 6号公報
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Substrate specificities of three members of the human, UDP - N- acetyl- alpha-D-galactosamine： Polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase family, GalNAc- Tl， _T2, and - T3.
非特許文献 5
J. Biochem. (Tokyo) 1990 June ; 107 (6)； 899 - 903 : Sugita M. Inagaki F, Naito H, Hori T. , Stadies on glycosphingol ipids in larvae of the green-bottle fly, Lucilia caesar： two neutral glycosphingolipids having large straight oligosaccaride chains with eight and nine sugars.
発明の開示
本発明は、 哺乳類、 特にヒ ト由来の糖転移酵素であって、 Gal NAcを β 1 ,
3結合で GlcNAcへ転移する新規な転移活性を有するポリぺプチド、 及びをその ようなポリぺプチ.ドをコードする核酸等を提供するという課題を解決する。 更に本発明は、 該核酸を宿主細胞内で発現する形質転換体、 及び当該形質転換 体に当該タンパク質を産生させて回収するその製造方法、 並びに該タンパク質を 認識する抗体を提供するという課題も解決する。
他方、 糖鎖合成は癌化に伴って変化する場合があることから、 そのような糠鎖 合成酵素の同定と発現解析は癌診断などに有用な指標を提供すると期待される。 本発明は、 癌化や悪性度に相関して変動するそのようなタンパク質の転写レベル につレ、て組織や細胞系統レベルで解析及ぴ比較を行うことにより、 癌化検定等に 役立つ具体的な手法と判断基準をも提供する。
図面の簡単な説明
図 1は、 ノ +、実施倒に係る G34 1^3?タン ヽク貝の反ノ心 B¾F \ ) 对 -·<) る ίΒΊ生'^:' 1 ^ 示す線図である。
図 2 Αは、 本実施例に係る G34酵素タンパク質が合成した瑭鎖構造を解析す るための NMR測定の結果を示す図である。
図 2 Bは、 図 2 Aの匪 R測定結果の一部を拡大して示す図である。 図 3は、 図 2の丽 Rにおける N0Eを示す表である。 テーブル 1のデータに関 する諸条件は次の通り ： 1· 08ιΛ、 298K、 D20,無参照のものは CH2 (高） = 4 . 557ppm, *印のものは化学シフトは I Dスペク トルより、 CH2 (低） = 4 . 778ppra、 フエエノレ (オルト） =7. 265ppm、 フエ二ノレ （メタ） = 7. 354ppm、 フエ ニル （パラ） =7. 320ppmである。
図 4は、 図 2の に関して各ビラノースの関連データ （暫定 N0E) を示す表 である （s ：強い、 m： 中間、 w：弱い、 v w：非常に弱い、 A : GlcNAc、 B : GalNAc)
図 5は、 本実施例の G34酵素タンパク質と公知の β 3 Gal転移酵素との間で 、 アミノ酸配列を比較するための図である。
図 6は、 本実施例の G34酵素タンパク質と公知の各種 β 3結合糖転移酵素と の間で、 3結合活性に関するモチーフを比較するための図である。 「b3」は ]3 1-3結合を示し、「GnJは GlcNAcを示す。
図 7は、 本実施例に係る G34酵素タンパク質の活性の pH依存性を示す線図で ある。
図 8は、 本実施例に係る G34酵素タンパク質の活性のィオン要求性を示す線 図である。
図 9は、 本実施例に係る G34酵素タンパク質のヒ ト細胞株における発現量を 示すグラフである。
図 1 0は、 本実施例のマウス G34のァミノ.酸配歹 IJ (上段) をヒ ト G34のアミ ノ酸配列 （下段） とァライメントさせた図である。
図 1 1は、 本実施例に係る mG34核酸を用いたマウス精巣試料に对する in situハイプリダイゼーションの結果を示す図である。
牟 ·¾- j UJ gキし 、 §G¾
上記課題を解決するために本発明者等は、 目的の酵素と類似した作用を有する 酵素遺伝子の塩基配列を基に、 配列同一性が高いと思われる目的とする核酸の単 離と精製を試みた。 具体的には、 まず、 公知の糖転移酵素である ]3 3ガラク ト ース転移酵素 6 ( jS 3GalT6) の配列をクエリーとして BLAST検索を行い、 その 結果、 相同性を有する配列を見出した （GenBank No. AX285201) 。 なお、 この塩 基配列は、 国際公開第 0 1 7 9 5 5 6号公報 （上記特許文献 1 ) に記載の配列番 号 1 0 0 6の配列として公知であつたが、 その活性は不明であった。
先ず本発明者等は、 独きに PCRで上記遺伝子をクローユングし、 その塩基配 列 （配列番号 1 ) 及び推測アミノ酸配列 （配列番号 2 ) を決定し、 そして、 当該 核酸によりコードされるポリぺプチドの特定の生物活性を突き止めることに成功 し、 本発明を完成した。 さらに、 その配列をクエリーとしてマウス遺伝子の検索 を行つた結果、 配列番号 3の塩基配列及びその推測ァミノ酸配列 （配列番号 4 ) を発見した。
配列番号 1の塩基配列を有する遺伝子及ぴ配列番号 2のァミノ酸配列を有する タンパク質をヒ ト G34と命名し、 配列番号 3の塩基配列を有する遺伝子及び配 列番号 4のアミノ酸配列を有するタンパク質をマウス G34と命名した。
本発明者等の検討によれば、 上記 G34タンパク質は、 N—ァセチルー D—ガ ラタトサミン残基を供与体基質とし、 N—ァセチル一 D—ダルコサミン残基を受 容体基質とする。 そして、 本明細書の実施例 2で詳述するように、 そのアミノ酸 配列中に、 β 1， 3の結合形式で種々の糖 （例えば、 ガラク トース、 Ν—ァセチ ル一D—ダルコサミン) を転移させる酵素ファミリーに良く保存されている 3つ のモチーフを保持していた。 これらの観点から、 G34タンパク質は、 意外なこと に、 哺乳動物、 特にヒ トでは従来報告例がない新規な糖鎖構造 「GalNAc- 1, 3 - Gl c NAc」 を合成する転移活性を有すると考えられた。 その結合形式は実際に NMRによって確認された。
すなわち、 本発明は、 N—ァセチル一D—ガラク トサミンを N—ァセチルー D —ダルコサミンに β 1， 3結合で転移する β 1 , 3一 Ν—ァセチルー D—ガラ ク トサミン転移酵素タンパク質に関する。
本発明の好ましい態様の酵素タンパク質は、 下記の性質 ( a ) - ( c ) ： ( a ) 受容体基質の特異性
オリゴ糖を受容体基質とする場合、 Bz - j8 - Gl cNAc、 GlcNAc- jS 1- 4- Gl cNAc- j8 - Bzヽ Gal- j3 1-3 (Gl cNAc- 13 1-6) Ga lNAc - α - pNpヽ Gl cNAc- j3 1-3 GalNAc -ひ - pNp 、 及び Gl cNAc - i3 l-6GalNAc- o; -pNpへの転移活性を示す （ 「Gl cNAc」 は N—ァ セチルー D—ダルコサミン残基を示し、 「GalNAc」 は N—ァセチル一 D—ガラ クトサミン残基を示し、 「Bz」 はベンジル基を示し、 「pNp」 はパラニトロフエ 二ル基を示し、 「一」 はグリコシド結合を示す。 式中の数字はグリコシド結合が 存在する糖環の炭素番号を示し、 「α」 及び 「i3」 は糖環 1位のグリコシド結合 のァノマーを示し、 5位 CH20H又は CH3との位置関係がトランスのものを 「c¾J 、 シスのものを 「]3」 で示す） 。
但し、 好ましくは、 Bz-ひ- GlcNAc及ぴ Gal β 1-3 GlcNAc- -ρΝρへの転移活 性を実質的に示さない；
(b) 反応 pH
pH6. 2〜 6. 6の領域での活性が、 他の p H領域での活性と比較して低い； 及び
( c ) 二価イオンの要求性
前記活性は、 少なくとも Mn2+、 Co2\ 又は Mg2+の存在下で増強されるが、 Mn2+ による活性の増強は Cu+との共存下でほぼ完全に消失する ；
の少なくとも一つを有するか、 又はそれら性質をあらゆる組み合わせで有し得る 。
また、 前記糖転移酵素タンパク質の好ましい態様は、 本発明の糖転移酵素タン パク質は、 下記 （A) 又は （B) のポリペプチド：
(A) 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
(B) 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミ ノ酸が置換、 欠失、 又は挿入したアミノ酸配列を有し、 且つ N—ァセチルー D— ガラクトサミンを N—ァセチルー D—ダルコサミンに β 1, 3結合で転移する ポリぺプチド；
を含む。
^ /こ、 B Sd 平 Β子 ク ン ζヽン '貝 ンよ ソ ナ 3； し V 'RS1'求 fよ、 Ά) (；>4ヽ ソ 、 プチドが、 配列番号 2に記載のァミノ酸番号 1 8 9〜 500のァミノ酸配列を有 するポリぺプチドからなる糠転移酵素タンパク質である。 また前記糠転移酵素タ ンパク質のさらに好ましい態様は、 前記 （A) のポリペプチドが、 配列番号 2に 記載のアミノ酸番号 36〜500のアミノ酸配列を有するポリぺプチドからなる 糖転移酵素タンパク質である。 加えて、 本発明の糖転移酵素タンパク質の他の態様には、 配列番号 2に記載の アミノ酸番号 1 8 9 〜 5 0 0又は配列番号 4に記載のアミノ酸番号 3 5 - 5 0 4 のァミノ酸配列と少なくとも 3 0 %を超える同一のァミノ酸配列、 好ましくは少 なくとも 4 0 %同一のァミノ酸配列、 より好ましくは少なくとも 5 0 %同一のァ ミノ酸配列を有するポリペプチドからなるタンパク質も含まれる。
本発明は、 他の側面において、 上記いずれかのポリペプチドをコードする塩基 配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸を提供する。
本発明のタンパク質をコードする核酸の好ましい態様は、 配列番号 1又は 3に 記載の塩基配列又は少なくともその何れかに相補的な塩基配列からなる核酸であ る。 より好ましくは、 ヒト由来では配列番号 1に記載の塩基番号 5 6 5 〜 1 5 0 3の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸、 最も好ましくは、 配列 番号 1に記載の塩基番号 1 0 6 〜 1 5 0 3の塩基配列又はそれに相補的な塩基配 列からなる核酸であり、 マウス由来では配列番号 3に記載の塩基番号 1 0 3 〜 1 5 1 2の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸である。
本発明による前記核酸の態様には DNAが含まれる。
さらに本発明は、 前記いずれかの核酸を含むベクター、 該ベクターを含む形質 転換体をも提供する。
更なる他の側面において本発明は、 i3 1 , 3— N—ァセチルー D—ガラクトサ ミン転移酵素タンパク質の製造方法であって、 前記形質転換体を生育させ、 前記 糖転移酵素タンパク質を発現させ、 該生育体から該糖転移酵素タンパク質を回収 することを含む製造方法を提供する。
更なる他の側面において本発明は、 前記いずれかの β 1 , 3— Ν—ァセチル — D—ガラク トサミン転移酵素タンパク質を認識する抗体を提供する。
†0i力 t お 、 、 6 <6 よ、 ェ ϋύ (/ジ 兄 ' I干 v、、 てリン 1T1 Κ1ΝΛ ン ·9Β J ¾3 化した組織及ぴ細胞株において有意に上昇していることを明らかにした。
したがって、 本発明は、 癌化又は悪性度の指標として有用な核酸であって、 配 列番号 1又は 3に記載の塩基配列、 又は少なくともその何れか一方に相補的な塩 基配列に対し、 ストリンジ ントな条件下でハイプリダイズする測定用核酸をも 提供する。 本発明の測定用核酸は、 典型的には、 配列番号 1又は 3に記載の塩基配列中の 少なくとも十数個の連続する塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなること ができる。
本発明の測定用核酸の好ましい態様には、 配列番号 1 6に記載の塩基配列、 又 はそれに相補的な塩基配列からなるプローブ、 並びに、 下記 （1 ) 又は （2 ) の 塩基配列からなるプライマーセット ：
( 1 ) 配列番号 1 4と配列番号 1 5に記載の一組の塩基配列；
( 2 ) 配列番号 1 7と配列番号 1 8に記載の一組の塩基配列；
が含まれる。
また、 本発明の測定用核酸は、 癌マーカーとして利用されることができる。 さらに本発明は、 生物試料の癌化を検定する方法であって、
( a ) 上記いずれかの核酸を使用して、 生物試料における該核酸についての転 写レベルを測定し；そして
( b ) 該測定値が、 健常生物試料についての測定値と比較して有意に上回るか 否かを判断すること ；
を含む方法をも提供する。
本発明の癌化検定方法の好ましい態様は、 前記転写レベルの測定が、 上記生物 試料を対象とし、 上記いずれかの核酸を使用したハイブリダィゼーション法又は PCR法を含む。
本発明の癌化検定方法の更なる側面において、 癌治療に関する処置の有効性を 検定する方法であって、 上記いずれかの核酸を使用して、 癌治療のための処置が 施される生物試料における該核酸についての転写レベルを測定し、 該測定値がそ の処置前又は未処置の場合と比較して有意に下回るか否かを判断することを含む =l i
m^^ DE'^ 4し <3 0
前記生物試料は、 特に大腸又は肺に由来する試料であることができる。
発明の実施形態
以下、 本発明の実施形態を詳細に説明する。
( 1 ) 本発明の G34酵素タンパク質をコードする核酸
本発明者等は、 上述の発見に基づき、 該核酸にコードされている G34酵素タ ンパク質を発現させ、 これを単離及び精製し、 さらにその酵素活性を特定'した。 ここで、 目的の酵素活性を有するァミノ酸配列が特定されたという事実に着目す れば、 配列番号 1又は 3の塩基配列は、 当該酵素活性を有する単離ポリぺプチド をコードする核酸の一態様である。 すなわち、 本発明の核酸には、 有限数ではあ るが、 当該 G34酵素タンパク質のアミノ酸配列へ縮重するような、 該同一のァ ミノ酸配列をコードし得るあらゆる核酸が含まれる。
また、 本発明は、 上記のような新規なアミノ酸配列からなるポリペプチド全長 またはその断片をコードする核酸を提供する。 そのような新規ポリペプチドをコ 一ドする典型的な核酸は、 配列番号 1又は 3に記載の塩基配列又は少なくともそ の何れか一方に相補的な塩基配列を有する。
また、 本発明の核酸は、 一本鎖及び二本鎖型両方の DNA、 及びその RNA相補体 も含む。 DNAには、 例えば、 天然由来の DNA、 組換え DNA、 化学結合した DNA、 PCRによって増幅された DNA、 及びそれらの組み合わせが含まれる。 但し、 べク ターや形質転換体の調製時に安定であるとの観点から、 DNAであることが好まし い。
本発明の核酸は、 例えば以下の方法により調製することができる。
まず、 GenBank No. AX285201の公知配列又はその一部を利用し、 ハイブリダィ ゼーションゃ核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて cDNAライブラ リーから常法に従って核酸増幅反応を行い、 これにより本発明の核酸をクロー二 ングすることができる。 その核酸は、 例えば、 PCR産物として約 1. 5kbpの DNA 断片が得られるので、 これを例えばァガロースゲル電気泳動等の分子量により DNA断片を篩い分ける方法で分離し、 特定のバンドを切り出す方法等の常法に従 つて単離することができる。
ま: Tこ、 早離され Γこ核酸の ¾測 ； ノ酸 Kタリ Κタリ资亏 2乂は U によれは、 JM 末端に疎水性膜貫通領域を有すると予測されるので、 この膜貫通領域を有しない ポリぺプチドをコ一ドする塩基配列の領域を調製することにより、 可溶化形態の ポリペプチドをコードする本発明の核酸も得ることができる。
本願に開示された核酸の塩基配列に基づき、 当業者であれば目的の核酸又は調 製すべきその一領域の、 両端に位置する塩基配列を基に適宜プライマーを作成し 8
、 それを用いた核酸増幅反応によって目的の領域を増幅して調製することが容易 である。
上記核酸増幅反応には、 例えば、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) [Saiki R. K. , et al. , Sci ence, 230， 1350-1354 (1985) ] 、 ライゲース連鎖反応 （ LCR) [Wu D. Y. , et al. , Genomi cs, 4, 560-569 (1989)； Barringer K. J. , et al. , Gene, 89, 117 - 122 (1990) ; Barany F. , Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 88, 189-193 (1991) ] 及ぴ転写に基づく増幅 [Kwoh D. Y.， et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86， 1173-1177 (1989) ] 等の温度循環を必要と する反応、 並びに鎖置換反応 （SDA) [Walker G. T. , et al . , Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 89, 392 - 396 (1992)； Walker G. T.， et al . , Nuc. Aci ds Res. , 20, 1691-1696 (1992) ] 、 自己保持配列複製 (3SR) [Guatel l i J. ， Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 87， 1874-1878 (1990) ] および Q j3 レプリカ一 ゼシステム [リザイルディら、 BioTechnology 6, p. 1197 - 1202 (1988) ] 等の恒 温反応が含まれる。 また、 欧州特許第 0525882号に記載されている標的核酸と 変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅 （Nucleic Acid Sequence
Based Amplificat ion : NASABA) 反応等も利用可能である。 好ましくは PCR法で ある。
本発明の核酸を利用することによって、 後述のように目的の酵素タンパク質を 発現させることもできるし、 医学研究又は遺伝子治療等の目的でプローブゃァン チセンスプライマーを提供することもできる。
また当業者であれば、 配列番号 1又は 3の塩基配列と一定の相同性を有する塩 基配列からなる核酸を調製することにより、 配列番号 1又は 3の配列と同等に有 用な核酸を取得できる。 例えば、 本発明の相同な核酸には、 配列番号 2又は 4に 百 ΰ の/" ノ酸 タリに对し 十 s问 T王 し、 且つ i 一 でアノレ— JJ一刀フク 卜 ΤΓ ミンを N—ァセチル一D—ダルコサミンに β 1 , 3結合で転移する活性を有す るタンパク質をコードする核酸が含まれ得る。
本発明のそのような相同タンパク質をコードする核酸の範囲を特定するに当た り、 本発明の配列番号 1又は 3に記載の核酸配列について同一性検索を行うと、 該核酸酸配列は、 最もホモロジ一の高い公知の j8 1， 4GalNAc転移酵素 （上記非 特許文献 1) の核酸配列とは 40%の同一性を有し、 また最もホモロジ一の高い 公知の 01， 3Gal転移酵素の核酸配列とも 40 %の同一性を有する （上記非特許 文献 2) 。 これらの観点から、 本発明の相同タンパク質をコードする好適な核酸 配列は、 典型的には配列番号 1又は 3中の全塩基配列、 好ましくは配列番号 1の 塩基番号 1 06〜 1 503からなる部分塩基配列、 好ましくは配列番号 3の塩基 番号 1 03〜 1 51 2からなる部分塩基配列、 又はそれらに相捕的な塩基配列の いずれかに対し、 40%を超える同一性、 より好ましくは少なくとも 50%の同 一性、 特に好ましくは少なく とも 60 %の同一性を有する。
また、 配列番号 1と配列番号 3とに記載の塩基配列同士では 86%の同一性を 有する。 この観点から、 本発明の相同タンパク質をコードする好適な核酸配列は 、 配列番号 1中の全塩基配列、 好ましくは塩基番号 1 06〜 1 503、 又はそれ • らに相補的な塩基配列のいずれかに対し、 少なくとも 86 %、 好ましくは 90% の同一性を有すると定義することもできる。
上記の同一性パーセントは、 視覚的検査おょぴ数学的計算によって決定するこ とが可能である。 あるいは、 2つの核酸配列の同一性パーセントは、 Devereux ら， Nucl. Acids Res. 12: 387， 1984に記載され、 そしてウィスコンシン大学 遺伝学コンピューターグループ （UWGCG) より入手可能な GAPコンビユー タープログラム、 バージョン 6.0を用いて、 配列情報を比較することによって 、 決定可能である。 GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには： (1) ヌクレオチドに関する単一 (unary) 比較マトリ ックス (同一に対し 1お よび非同一に対し 0の値を含む) 、 並びに Schwartz及ぴ Dayhoff 監修, Atlas of Protein Sequence and structure, pp.353 - 358， National Biomedical Research Foundation, 1979に 载され Oよつな、 Gribskov及び Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986のカロ里 j:じ早乂マトリ ックス ； (2) 各ギヤッ プに対する 3.0のペナルティおよび各ギヤップ中の各記号に対しさらに 0.10の ペナルティ ；及び (3) 末端ギヤップに対するペナルティなし、 が含まれる。 当 業者に用いられる、 配列比較の他のプログラムもまた、 使用可能である。
また、 本発明の構造遺伝子として相同な他の核酸には、 典型的には配列番号 1 又は 3中の塩基配列、 好ましくは配列番号 1の塩基番号 1 06〜 1 503からな る塩基配列、 好ましくは配列番号 3の塩基番号 103〜1512からなる塩基配 歹 lj、 又はそれらに相補的な塩基配列からなるヌクレオチドにストリンジェントな 条件下でハイブリダィズし、 且つ N—ァセチル一 D—ガラク トサミンを N—ァセ チルー D—ダルコサミンに β 1， 3結合で転移する活性を有するポリペプチド をコードする核酸も含まれる。
ここでストリンジ工ントな条件下とは、 中程度又は高程度のストリンジェント 条件下でハイブリダイズすることを意味する。 具体的には、 中程度のストリンジ ェントな条件は、 例えば、 DNAの長さに基づき、 一般の技術を有する当業者によ つて、 容易に決定することが可能である。 基本的な条件は、 Sambrookら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 3版、 Vol.1、 7.42-7.45 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、 そして二トロセノレロースフ ィルターに関し、 5XSSC、 0.5% SDS、 1.0 mM EDTA (pH8.0)の前洗浄溶液、 約 40— 50°Cでの、 約 50%ホルムアミ ド、 2XSSC— 6XSSC (又は約 42°Cでの約 50 %ホノレムアミ ド中の、 スターク溶液 (Stark's solution) などの他の同様のノ、 イブリダイゼーション溶液） のハイプリダイゼーション条件、 および約 60°C、
0.5XSSC、 0.1% SDSの洗浄条件の使用が含まれる。 高ストリンジェントな条件 もまた、 例えば DNAの長さに基づき、 当業者によって、 容易に決定することが 可能である。 一般的に、 こうした条件は、 中程度にストリンジヱントな条件より も高い温度及び/又は低い塩濃度でのハイブリダィゼーション及びノ又は洗浄を 含み、 例えば上記のようなハイブリダィゼーション条件、 及びおよそ 68°C、
0.2XSSC、 0.1% SDSの洗浄を伴うと定義される。 当業者は、 温度おょぴ洗浄溶 液塩濃度は、 塩基配列の長さ等の要因に従って、 必要に応じて調整可能であるこ とを認識するであろう。
J PDW ckソにョ ' ΰ Αし 、 ョ ^CIWJ ' J ¾r 、' ' 、 'ム rス n ノヽつ ノ ソ ク ' -ヒ一 シヨン条件に関する技術常識、 並びに通常用いられる実験手段を通じて得られる であろう経験則を基に、 適切に中程度又は高程度であるス トリンジユントな条件 を容易に設定し、 実施することができる。
(2) 本発明のベクター及び形質転換体
本発明によれば、 上記核酸を含む組換えベクターが提供される。 プラスミ ド等 2004/000608
のベクターに該核酸の DNA断片を組込む方法としては、 例えば、 Sambrook, J. ら， Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition) , Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 1 (2001)に記載の方法などが挙げられる。 簡便には、 市 販のライゲーシヨンキット （例えば、 宝酒造製等） を用いるとよい。
上記のようにして得られた組換えベクター （例えば、 組換えプラスミ ド） は、 宿主細胞 （例えば、 大腸菌 DH5 a、 TBI, LE392、 又は XL- LE392又は XL- lBlue 等） に導入される。 プラスミ ドを宿主細胞に導入する方法としては、 Sambrook, J. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition) , し old Spring Harbor Laboratory, 16. 1 (2001)に記載の塩化カルシウム法または塩化 カルシウム/塩化ルビジウム法、 エレク ト口ポレーシヨン法、 エレク トロインジ ヱクシヨン法、 P E Gなどの化学的な処理による方法、 遺伝子銃などを用いる方 法などが挙げられる。
使用可能なベクターは、 簡単には当業界において入手可能な組換え用ベクター (例えば、 プラスミ ド DNA等) に所望の遺伝子を常法により連結することによ つて調製することができる。 用いられるベクターの具体例としては、 大腸菌由来 のプラスミ ドとして、 例えば、 pDONR201、 pBluescript, pUC18、 pUC19、 pBR322 等が例示されるが、 これらに限定されない。
当業者であれば、 制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択すること が可能である。 発現ベクターは、 本発明の酵素を発現させたい宿主細胞に適した ものを当業者であれば適宜選択することができ、 上記核酸が目的の宿主細胞中で 発現しうるように遺伝子発現に関与する領域 （プロモータ領域、 ェンハンサー領 域、 オペレーター領域等） が適切に配列されて、 該核酸が適切に発現するように 構築されていることが好ましい。
発現べクタ一の種類は、 原核細胞及び/又は真核細胞の各種の宿主細胞中で所 望の遺伝子を発現し、 所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特 に限定されないが、 例えば、 大腸菌用発現べクターとして、 pQE - 30、 PQE - 60、 pMAL - C2、 pMAL - p2、 pSE420などが好ましく、 酵母用発現ベクターとして pYES2 (サッカロマイ.セス属） 、 pPIC3. 5K、 pPIC9K、 pA0815 (以上ピキア属） 、 昆虫 用発現ベクターとして pFastBac、 pBacPAK8/9、 pBK283、 pVL1392、 pBlueBac4. 5 などが好ましい。 .
発現ベクターの構築は、 制限処理及ぴ連結作業を必要としない Gatewayシス テム （インビトロジェン社） を用いるとよレ、。 Gatewayシステムとは、 P C R産 物の方向性を維持したままクローニングができ、 また、 D N A断片を適切に改変 した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用し たシステムである。 具体的には、 P C R産物とドナーベクターとから部位特異的 な組換え酵素である B Pクロナーゼによってェントリ一クローンを作成し、 その 後、 このクローンと別の組換え酵素である L Rクロナーゼによって組換え可能な デスティネーションベクタ一に p C R産物を移入することにより、 発現系に対応 した発現クローンを調製するものである。 最初にエントリークローンを作成すれ ば、 制限酵素ゃリガーゼで作業する手間の係るサブクローニングステップが不要 である点を特徴の一つとする。
本発明の核酸を含む上記発現ベクターを宿主細胞に組み込めば、 本発明のポリ ぺプチドを産生するための形質転換体を得ることができる。 形質転換体を得るた めの宿主細胞は、 一般に真核細胞 （哺乳類細胞、 酵母、 昆虫細胞等） でもよいし 、 原核細胞 （大腸菌、 枯草菌等） でもよい。 また、 ヒ ト （例えば、 H e L a、 2 9 3 T、 S H— S Υ 5 Y) 、 マウス （例えば、 N e u r o 2 a、 N I H 3 T 3 ) 等由来の培養細胞でもよい。 これら宿主細胞はいずれも公知であり、 市販されて いるか （例えば、 大日本製薬社） 、 あるいは公共の研究機関 （例えば、 理研セル バンク） より入手可能である。 あるいは、 胚、 器官、 組織若しくは非ヒ ト個体も 使用可能である。
ところで、 本発明の核酸はヒ トゲノムライブラリーから発見されものであるか ら、 真核細胞を宿主細胞として用いることより天然物に近い性質を有する本発明 の G34酵素タンパク質 （例えぱ糖鎮が付カ卩された態様など) が得られると考え られる。 この観点からは、 宿主細胞として真核細胞、 特に哺乳類細胞を選択する ことが好ましい。 具体的な哺乳類細胞としては、 マウス由来、 動物細胞としては マウス由来、 アフリカッメガエル由来、 ラット由来、 ハムスター由来、 サル由来 またはヒ ト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示 される。 また、 宿主細胞としての大腸菌、 酵母又は昆虫細胞は、 具体的には、 大 腸菌 （DH5 o;、 M15、 JM109、 BL21等） 、 酵母 （INVScl (サッカロマイセス属） 、 GS115、 KM71 (以上ピキア属） など） 、 昆虫細胞 （Sf21、 BraN4、 カイコ幼虫等） などが例示される。
一般に発現ベクターは、 少なくとも、 プロモーター、 開始コドン、 所望のタン パク質をコードする遺伝子、 終止コドン、 およびターミネータ一領域を連続的か つ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。 ま たこの際、 所望により制限酵素での消化や T4 DNAリガーゼを用いるライゲーシ ヨン等の常法により適当な DNAフラグメント （例えば、 リンカ一、 他の制限酵 素部位など） を用いることができる。 宿主細胞として細菌、 特に大腸菌を用いる 場合、 一般に発現ベクターは、 少なく とも、 プロモーター Zオペレーター領域、 開始コドン、 所望のタンパク質をコードする遺伝子、 終止コドン、 ターミネータ 一おょぴ複製可能単位から構成される。 宿主細胞として酵母、 植物細胞、 動物細 胞または昆虫細胞を用いる場合、 一般に発現ベクターは、 少なく とも、 プロモー ター、 関始コドン、 所望のタンパク質をコードする遺伝子、 終止コドン、 ターミ ネーターを合んでいることが好ましい。 またシグナルペプチドをコードする. DNA 、 ェンハンサー配列、 所望の遺伝子の 5 ' 側おょぴ 3 ' 側の非翻訳領域、 選択マ 一力一領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
複製可能単位とは、 宿主細胞中でその全 DNA配列を複製することができる能 力をもつ DNAを意味し、 天然のプラスミ ド、 人工的に修飾されたプラスミ ド （ 天然のプラスミ ドから調製されたプラスミ ド） および合成プラスミ ド等が含まれ る。 好適なプラスミ ドとしては、 E. coliではブラスミ ド pQE30、 pET又は pCAL 若しくはそれらの人工的修飾物 （pQE30、 pET又は pCALを適当な制限酵素で処理 して得られる DNAフラグメント） 、 酵母ではプラスミ ド pYES2若しくは PPIC91 (が、 また昆虫細胞ではプラスミ ド pBacPAK8/9等があげられる。
本発明のベクタ一の好適な開始コドンとしては、 メチォニンコ ドン （A T G ) が例示される。 また、 終止コドンとしては、 常用の終止コドン （例えば、 T A G 、 T G A、 T A Aなど） が例示される。 まだ、 ェンハンサー配列、 ターミネータ 一配列については、 例えば、 それぞれ S V 4 0に由来するもの等、 当業者におい て通常使用されるものを用いることができる。 選択マーカーとしては、 通常使用されるものを常法により用いることができる 。 例えばテトラサイクリン、 アンピシリン、 またはカナマイシンもしくはネオマ ィシン、 ハイグロマイシンまたはスぺクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子な どが例示される。
本発明による発現ベクターの宿主細胞への導入 （形質転換又は形質移入とも称 される） は、 従来公知の方法を用いて行うことができる。 細菌 （E. col i , Baci l lus subti l is等） の場合、 例えば Cohenらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 69, 2110 (1972) ] 、 プロ トプラスト法 [Mol. Gen. Genet. , 168, 111 (1979) ] やコンビテント法 [J. Mol . Biol.， 56， 209 (1971) ] によって、 Saccharorayces cerevisiaeの場合は、 例えば Hinnenらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 75, 1927 (1978) ] やリチウム法 [J. B. Bacteriol . , 153, 163 (1983) ] によってそれぞれ形質転換することができる。 植物細胞の場合は 、 例えばリーフディスク法 [Sci ence, 227, 129 (1985) ] 、 エレク ト口ポレー シヨン法 [Nature, 319， 791 (1986) ] によって、 動物細胞の場合は、 例えば Grahamの方法 [Virology, 52， 456 (1973) ] 、 昆虫細胞の場合は、 例えば
Summerらの方法 [Mol. Cel l Biol . ' 3, 2156-2165 (1983) ] によってそれぞれ 形質転換することができる。
( 3 ) 本発明の G34酵素タンパク質
後述の実施例で例証されるとおり、 例えば、 配列番号 1又は 3の塩基配列を有 する核酸を発現ベクターに組み込み、 それを発現させることで、 新規な酵素活性 を有するポリペプチドを単離及び精製することができる。
第 1に、 上記の観点から、 本発明のタンパク質の典型的な態様は、 配列番号 2 又は 4の推定ァミノ酸配列からなる単離された G34酵素タンパク質である。 こ の醇秦タンパク質は、 具体的には下記の活性を有する。
触媒反応
「N—ァセチル一 D—ガラク トサミン (GalNAc) J を、 その供与体基質から 「N—ァセチルー D—ダルコサミン （GlcNAc) 」 を含む受容体基質.へ転移させ ることができる。 そのアミノ酸配列中のモチーフ配列に関する検討から、 当該 N —ァセチルガラク トサミンと N—ァセチルダルコサミンとの間の結合形式は、 β 1， 3グリコシド結合である （実施例 2参照） 。
供与体基質特異性：
前記 N—ァセチルー D—ガラク トサミン供与体基質には、 N—ァセチルガラク トサミンを有する糖ヌクレオチド、 例えば、 ゥリジン二リン酸一N—ァセチルガ ラク トサミン (UDP-GalNAc) アデノシン二リン酸一 N—ガラク トサミン (ADP -GalNAc) 、 グアノシン二リン酸一 N—ァセチルガラク トサミン (GDP-GalNAc ) 、 及ぴシチジンニリン酸一 N—ァセチルガラク トサミン (CDP— GalNAc) 等が 含まれる。 典型的な供与体基質は、 UDP— GalNAcである。
すなわち、 本発明の G34酵素タンパク質は、 次式の反応を触媒する。 · UDP— GalNAc + GlcNAc - R → UDP + GalNAc- β 1, 3-GlcNAc- R
(Rは、 当該 GlcNAc残基を有する糖タンパク質、 糖脂質、 オリゴ糖、 又は多糖 等である）
受容体基質特異性：
前記 GalNAcの受容体基質は、 N—ァセチルー D—ダルコサミンであり、 典型 的には、 糖タンパク質、 糖脂質、 オリゴ糖、 又は多糠等の N—ァセチルー D—グ ルコサミン残基である。
また、 下記実施例 1で得られたヒ ト G34タンパク質 （典型的には、 配列番号 2のアミノ酸番号 3 6からその C末端までの領域を有する） は、 オリゴ糖を受 容体基質とする場合、 Bz- jS - GlcNAc、 GlcNAc- β 1-4-GlcNAc- β -Βζ, pNp-core2 (core2 = Gal- j3 1-3- (GlcNAc - j3 1-6) GalNAc- α - pNp；以下同様）、 Np-core3 (core3 = GlcNAc- ;3 1-3 GalNAc- a -pNp；以下同様）及ぴ pNp - coreS (core6 = GlcNAc- β卜 6 - GalNAc - a -pNp；以下同様）への転移活性を示す。 好ましくは、 Βζ - a - GlcNAc及ぴ Ga!L- iQ [- 3 GlcNAc - -pNpへの転移活性を示さない。 更にそ Iiり？ 5 "'ぼ J¾早乂一 3 Oご、 pJMp-core 反 υ、 ΰζ~ ρ— ij丄 CJ½C VJ ΤΞ'Ϊ±' 7J ^ W ¾'に尚 く、 特に pNp-core2への転移活性が最も高い。 GlcNAc- jS 1-4- GlcNAc- β - Βζ、 pNp-core3及び pNp- core6への転移活性は比較的低い。
また、 下記実施例 4で得られたマウス G34タンパク質 （典型的には、 配列番 号 4中のアミノ酸番号 3 5からその C末端までの活性領域を有する） は、 Bz - j3 -GlcNAc, pNp- j8 -Glcs GlcNAc- 1-4-GlcNAc- β -Bz pNp— core2、 pNp一 core3 及び pNp- core6への転移活性を示す。 それら活性を比較すると、 Bz- /3 - GlcNAc につレヽて転移活' I生カ最も高く、 つレヽで core2— pNpヽ core6-pNp, core3— pNp、 pNp- β - Glc、 GlcNAc- β 1-4- GlcNAc- β - Bzの順に転写活性が下がる。
なお本明細書において、 「GlcNAc」 は N—ァセチルー D—ダルコサミン残基 を示し、 「GalNAc」 は^[一ァセチルー D—ガラク トサミン残基を示し、 「Glc」 はダルコサミン残基、 「Bz」 はベンジル基を示し、 「pNp」 はパラニトロフエ二 ル基を示し、 「oNp」 はオルトニトロフヱニル基を示し、 「一」 はグリコシド結 合を示す。 式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示す。 また 「ひ」 及び 「J3」 は糖環 1位の前記グリコシド結合のァノマーを示し、 5位 CH20H又は CH3との位置関係がトランスのものを Γ α j 、 シスのものを 「 で 示す） 。
至適緩衝液及び至適 P H (表 3及び図 4 ) ：
ヒ ト G34タンパク質に関する検討によると、 至適緩衝液としては、 MES (2-モ ルフォリノエタンスルホン酸） 緩衝液、 力コジル酸ナトリウム緩衝液、 又は HEPES (N- [2-hydroxyethl] piperazine-N - [2-ethanesulfonic acid] ) 緩 ¾液 のいずれにおいても上記触媒作用を有する。
各緩衝液における活性の p H依存性は、 MES緩衝液において、 少なくとも pH 5. 50〜pH 5. 78付近で最も活性が高く、 次いで pH 6. 75付近の活性が高い；力コ ジル酸ナトリゥム緩衝液においては、 pH 6. 2付近から pH 5. 0付近まで pHが小 さくなるのに伴って活性が上昇し pH5. 0付近で最も活性が高く、 また pH 6. 2付 近から pH 7. 0付近まで pH依存的に活性が上昇し pH 7. 4付近でほぼブラトーと なる ； HEPES緩衝液においては、 pH 7. 4付近から 7. 5付近までの活性が最も高 い。 これらの中では、 HEPES緩衝液の pH約 7. 4〜約 7. 5で最も強い活性を示す いずれの緩衝液の場合も、 p H 6 . 2— 6 . 6の領¾での活 T生が、 他の p H領 域での活性と比較して低い。
二価イオンの要求性 (表 4及び図 5 ) ：
ヒ ト G34タンパク質の活性は、 二価の金属イオン、 特に Mn2+、 Co2+、 又は Mg 2+ の存在下で増強される。 各金属イオン濃度の活性への影響は、 Mn2+と Co2+による と 5. 0 nM付近まで濃度依存的に上昇しそれ以降でほぼブラトーとなり、 Mg2+に よると 2. 5 nM付近まで濃度依存的に上昇しそれ以降でほぼブラトーとなる。 伹 し、 Mn2+による活性の増強は Cu+との共存下では完全に消失する。
上述のように本発明の G34酵素タンパク質は、 上記所定の酵素反応条件下で GalNAc残基を GlcNAc残基に β 1-3グリコシド結合で転移させることができ、 糖 タンパク質、 糖脂質、 オリゴ糠、 又は多糖等へのそのような糖鎖合成ないし修飾 反応に有用である。
第 2に、 本明細書において、 上記酵素タンパク質の 1次構造を代表する配列番 号 2及び 4に記載のァミノ酸配列が開示されたことで、 これらァミノ酸配列に基 づき当該技術分野の周知の遺伝子工学的手法により産生され得るあらゆるタンパ ク質 （以下、 「変異タンパク質」 ないし 「修飾タンパク質」 とも記述する） が提 供される。 すなわち、 本発明の酵素タンパク質は、 当該技術分野の技術常識によ れば、 クローニングされた核酸の塩基配列から推定される配列番号 2及び 4のァ ミノ酸配列からなるタンパク質のみに限定されず、 下記で説示されるように、 例 えば、 ァミノ酸配列 Ν末端側等が部分的に欠失した不完全長のポリぺプチドか らなるタンパク質、 或いはそれらァミノ酸配列に相同なタンパク質であって、 当 該タンパク質の生来的な特性を有するタンパク質をも含まれると意図される。 先ず、 本発明のヒ ト G34酵素タンパク質は、 好ましくは、 配列番号 2に記载 のアミノ酸番号 1 8 9から C末端までのアミノ酸配列、 より好ましくは、 後述の 実施例で得られたようなアミノ酸番号 3 6から C末端までのアミノ酸配列を有す るものであり得る。 また本発明のマウス G34酵素タンパク質は、 好ましくは配 列番号 4に記載のアミノ酸番号 3 5から C末端までのアミノ酸配列を有するもの であり得る。
また、 一般に酵素のような生理活性を有するタンパク質においては、 上記アミ ノ酸配列のうち、 1若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、 若しく は該ァミノ酸配列に 1若しくは複数個のァミノ酸が挿入され若しくは付加された 場合であっても、 該生理活性が維持され得ることは周知である。 また、 天然産の タンパク質の中には、 それを生産する生物種の品種の違いや、 生態型 （ecotype ) の違いによる遺伝子の変異、 あるいはよく似たアイソザィムの存在等に起因し て、 1個〜複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することも知ら 0608
れている。 この観点から、 本発明のタンパク質には、 配列番号 2又は 4に示され る各ァミノ酸配列において 1若しくは複数個のァミノ酸が置換し若しくは欠失し 、 若しくは該ァミノ酸配列に 1若しくは複数個のァミノ酸が挿入され若しくは付 加されたァミノ酸配列を有し、 上記所定の酵素反応条件下で GalNAc残基を GlcNAc残基に β 1-3グリコシド結合で転移する活性を有する変異タンパク質も 含まれる。 さらに、 前記修飾タンパク質としては、 配列番号 2又は 4に示される 各ァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が置換し若しくは欠失し、 若 しくは該ァミノ酸配列に 1若しくは数個のァミノ酸が挿入され若しくは付加され たアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。
上記において 「複数個」 とは、 好ましくは 1〜2 0 0個、 より好ましくは 1〜 1 0 0個、 さらにより好ましくは 1〜5 0個、 最も好ましくは 1〜2 0個である 。 一般的には、 部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、 元々の タンパク質が有する活性は保持される程度に置換が可能なァミノ酸の個数は、 好 ましくは 1〜1 0個である。
また、 本発明の修飾タンパク質には、 同様の性質を有するアミノ酸同士の置換 で得られる修飾タンパク質が含まれる。 すなわち、 一般に同様の性質を有するァ ミノ酸同士の置換 （例えば、 ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置 換、 ある親水性ァミノ酸から別の親水性ァミノ酸への置換、 ある酸性ァミノ酸か ら別の酸性アミノ酸への置換、 あるいはある塩基性ァミノ酸から別の塩基性ァミ ノ酸への置換） を導入して所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法 は当業者に周知であり、 そのようにして得られた修飾タンパク質は元来のタンパ ク質と同様の性質を有することが多い。 この観点から、 そのようにアミノ酸置換 された修飾タンパク質も本発明に含まれる。 '
また、 本発明の修飾タンパク質は、 上述した通りのァミノ酸配列を有し且つ目 的酵素に生来的な酵素活性を有するものであれば、 当該ポリぺプチドに糖鎖が結 合した糖タンパク質であってもよい。
また、 本発明の相同タンパク質の範囲を特定するに当たり、 本発明の配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列について G E N E T Υ Χ (ゼネティックス社） に よる同一性検索を行うと、 該アミノ酸配列は、 最もホモロジ一の高い公知の β 1, 4GalNAc転移酵素 （上記非特許文献 1 ) とは 1 4 %の同一性を有し、 また最 もホモロジ一の高い公知の 1，3Gal転移酵素とは 3 0 %の同一性を有する （上 記非特許文献 2 ) 。 これらの観点力 ら、 本発明の相同タンパク質として好適なァ ミノ酸配列は、 配列番号 2又は 4に示されるァミノ酸配列と 3 0 %を超える同一 性、 より好ましくは少なくとも 4◦ %の同一性、 特に好ましくは少なくとも 5 0 %の同一性を有することが好ましい。
また、 配列番号 2と配列番号 4とに記載のアミノ酸配列同士では 8 8 %の同一 性を有する。 この観点から、 本発明の相同タンパク質として好適なァミノ酸配列 は、 配列番号 2中のァミノ酸配列に対し、 少なく とも 8 8 %、 より好ましくは 9 0 %の同一性を有すると定義することもできる。
なお、 前記 GENETYXは、 核酸解析、 タンパク質解析用の遺伝情報処理ソフト ウェアであって、 通常のホモロジ一解析やマルチアラインメント解析の他、 シグ ナルペプチド予測やプロモーター部位予測、 二次構造予測が可能である。 また、 本明細書で用いたホモロジ一解析プログラムは、 高速 ·高感度な方法として多用 されている Lipman - Pearson法 (Lipman, D. J". & Pearson, W. R. , Science, 277, 1435-1441 (1985) )を採用している。 本願明細書において、 同一性のパーセント は、 例えば、 Altschul ら（Nucl. Acids. Res. , 25. 3389-3402 (1997) )に記載さ て /ヽる BLASTプログラム、 あるレヽ ίま Pearsonら（Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 2444-2448 (1988) )に記載されている FASTAを用いて配列情報と比較し決 定することが可能である。 当該プログラムは、 インターネット上で National Center for Biotechnology Infommation (NCBI)、めるいは DNA Data Bank of Japan (DDBJ)のウェブサイ トから利用することが可能である。 各プログラムに よる同一性検索の各種条件 レ、。ラメ一ター） は同サイ トに詳しく記载されており 、 一部の設定を適宜変更することが可能である^、 検索は通'吊ァフオノレト慨を用 いて行う。 なお、 当業者に用いられる、 配列比較の他のプログラムもまた使用可 能である。
第 3に、 本発明の単離されたタンパク質は、 後述のように、 これを免疫原とし て動物に投与することによって該タンパク質に対する抗体を作製することができ る。 そのような抗体を用いて免疫測定法により当該酵素を測定、 定量することが 0608
できる。 従って、 本発明は、 そのような免疫原の作製にも有用である。 この観点 からは、 本発明のタンパク質には、 抗体形成を引き出すための抗原決定基又はェ ピトープを含む、 該タンパク質のポリペプチド断片、 変異体、 融合タンパク質な ども含ま; る。
( 4 ) 本発明の G34酵素タンパク質の単離及ぴ精製
本発明の酵素タンパク質は、 以下の方法により単離 ·精製することができる。 近年、 遺伝子工学的手法として、 形質転換体を培養し生育させて、 その培養物 ないし生育物から目的物質を単離 ·精製する手法が確立されている。 本発明の酵 素タンパク質も、 例えば、 本発明の核酸を組み込んだ発現ベクターを含む形質転 換体を栄養培地で培養することによって発現 （産生） させることができる。 形質転換体の栄養培地としては、 宿主細胞 （形質転換体） の生育に必要な炭素 源、 無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。 炭素源として は、 たとえばグルコース、 デキストラン、 可溶性デンプン、 ショ糖、 メタノール などが、 例示される。 無機窒素源もしくは有機窒素源としては、 例えばアンモニ ゥム塩類、 硝酸塩類、 アミノ酸、 コーンスチープ ' リカー、 ペプトン、 カゼイン 、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などが例示される。 また、 所望により他 の栄養素 （例えば無機塩 （例えば、 塩化ナトリウム、 塩化カルシウム、 リン酸二 水素ナトリウム、 塩化マグネシウム） 、 ビタミン類、 抗生物質 （例えばテトラサ イクリン、 ネオマイシン、 アンピシリン、 カナマイシン等） など） を含んでいて もよい。 培養は、 当業界において知られている方法により行われる。 培養条件、 例えば温度、 培地の p H及び培養時間は、 本発明に係るタンパク質が大量に生産 されるように適宜選択される。
本発明の酵素タンパク質は、 上記培養物ないし生育物から以下のようにして取 待す こと 'さ 。 Τな 3つり、 日ば、」クンハク'具 7 佰土柳肥 Πに ¾孭 ~m aに は、 遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、 これを適当な緩衝液 （例 えば濃度が 1 0〜 1 0 0 mM程度のトリス緩衝液、 リン酸緩衝液、 H E P E S緩 衝液、 ME S緩衝液などの緩衝液。 p Hは用いる緩衝液によって異なるが、 p H 5 . 0〜9 . 0の範囲が望ましい） に懸濁した後、 用いる宿主細胞に適した方法 で細胞を破壊し、 遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。 一方、 目的タンパク 質が宿生細胞外に分泌される場合には、 遠心分離やろ過などの操作により宿主細 胞と培地を分離し、 培養ろ液を得る。 宿主細胞破壊液、 あるいは培養ろ液はその まま、 または硫安沈殿と透析を行なった後に、 そのタンパク質の単離 '精製に供 することができる。
目的タンパク質の単離 ·精製の方法としては、 以下の方法を挙げることができ る。 すなわち、 当該タンパクに 6 Xヒスチジンや G S T、 マルトース結合タンパ クといったタグを付けている場合には、 一般に用いられるそれぞれのタグに適し たァフィ二ティークロマトダラフィ一による方法を挙げることができる。 —方、 そのようなタグを付けずに本発明に係るタンパク質を生産した場合には、 例えば イオン交換クロマトグラフィ一による方法を挙げることができる。 また、 これに 加えて、 ゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、 等電点クロマトグラフィーなど を組み合わせる方法でもよい。
また単離 .精製が容易となるような発現ベクターを構築するとよい。 特に、 酵 素活性 有するポリぺプチドと標識ぺプチドとの融合タンパク質の形態で発現す るように発現ベクターを構築し、 遺伝子工学的に当該酵素タンパク質を調製すれ ば、 単離 .精製も容易である。 上記識別ペプチドの例としては、 本発明に係る酵 素を遺伝子組み換えによって調製する際に、 該識別べプチドと酵素活性を有する ポリペプチドとが結合した融合タンパク質として発現させることにより、 形質転 換体の生育物から本発明に係る酵素の分泌 ·分離 ·精製又は検出を容易にするこ とを可能とする機能を有したぺプチドである。
そのような識別べプチドとしては、 例えばシグナルぺプチド (多くのタンパク 質の Ν末端に存在し、 細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために 細胞内では機能している 15〜30アミノ酸残基からなるぺプチド：例えば 0rapA、 0mpTN Dsb等) 、 プロアインキナ―ゼ A、 プロァっ ン' Λ 、«色ン rソ： ¾'く ffl謂ガ包 2£ の構成成分で分子量約 42， 000のタンパク質) 、 ダルタチオン S転移酵素、 His タグ （ヒスチジン残基を 6乃至 10個並べて配した配列） 、 mycタグ （cMycタン パク質由来の 1 3ァミノ酸配列） 、 FLAGぺプチド （8ァミノ酸残基からなる分 析用マーカー） 、 T7タグ （genelOタンパク質の最初の 11アミノ酸残基からな る） 、 Sタグ （滕臓 RNaseA由来の 15アミノ酸残基からなる） 、 HSVタグ、 pelB (大腸菌外膜タンパク質 pelBの 22ァミノ酸配列） 、 HAタグ （へマグルチニン 由来の 10アミノ酸残基からなる） 、 Trxタグ （チォレドキシン配列） 、 CBPタ グ （カルモジュリン結合べプチド） 、 CBDタグ （セルロース結合ドメイン） 、 CBRタグ （コラーゲン結合ドメイン） 、 jS- lac/blu (β ラクタマーゼ) 、 β- gal (β ガラク トシダーゼ) 、 luc (ルシフェラーゼ） 、 HP-Thio (His- patchチ ォレドキシン) 、 HSP (熱ショックペプチド） 、 Lnv (ラミニン γ ペプチド） 、 Fn (フイブロネクチン部分ペプチド） 、 GFP (緑色蛍光ペプチド） 、 YFP (黄 色蛍光ペプチド） 、 CFP (シアン蛍光ペプチド） 、 BFP (青色蛍光ペプチド） 、 DsRed、 DsRed2 (赤色蛍光ペプチド） 、 MBP (マルトース結合ペプチド） 、 LacZ' (ラク トースオペレーター) 、 IgG (免疫グロブリン G) 、 アビジン、 プロティ ン G等のぺプチドが挙げられ、 何れの識別ペプチドであっても使用することが 可能である。
そ^ Iらの中でも特にシグナノレペプチド、 プロティンキナーゼ A、 プロテイン A 、 グノレタチオン S転移酵素、 Hisタグ、 mycタグ、 FLAGぺプチド、 T7タグ、 Sタ グ、 HSVタグ、 pelB又は HAタグが、 遺伝子工学的手法による本発明に係る酵素 の発現、 精製がより容易となることから好ましく、 特に FLAGペプチド (Asp— Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) との融合タンパク質として得るのが、 取 扱面で極めて優れているため好ましい。 上記 FLAGぺプチドは非常に抗原性であ り、 そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するェピトープを提供し 、 発現された組換えタンパク質の迅速なアツセィおよび容易な精製を可能にする 。 4E11 と称されるネズミハイブリ ドーマは、 米国特許第 5, 011， 912 (これを参 照することにより本願明細書の開示に組み込む） に記載されるように、 特定の二 価金属陽イオンの存在下で、 FLAGぺプチドに結合するモノクローナル抗体を産 生する。 4Eliハイブリ ドーマ細胞株は、 寄託番号 HB 9259下に、 アメリカン ' タイプ ·力ノレチヤ一 · コレクション (American Type Culture Collection) に 寄託されている。 FLAGペプチドに結合するモノクローナル抗体は、 Eastman Kodak Co. , Scientific Imaging Systems Division^ コ テカツ卜州ニューへ ブンより入手可能である。
哺乳類細胞で発現可能であって、 かつ上述の FLAGぺプチドとの融合タンパク 4 000608
質として本発明の酵素タンパク質を得ることができる基本ベクターとしては、 例 えば pFLAG - CMV- 1 (シグマ社） がある。 また、 昆虫細胞で発現可能なベクターと しては、 pFBIF (pFastBac (インビト口ジヱン社） に FLAGぺプチドをコ ドす る領域を組み込んだベクター：後述の実施例参照） 等が例示されるが、 これらに 限定されない。 当業者であれば、 当該酵素の発現に使用する宿主細胞、 制限酵素 、 識別べプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能であ る。
( 5 ) 本発明の G34酵素タンパク質を認識する抗体
本発明により、 G34酵素タンパク質に免疫反応性である抗体が提供される。 こ うした抗体は、 （非特異的結合と対照的に） 抗体の抗原結合部位を介して、 該酵 素タンパク質に特異的に結合し得る。 具体的には、 配列番号 2又は 4のアミノ酸 配列を有するタンパク質、 又はその断片、 変異体若しくは融合タンパク質などを 、 それぞれに免疫反応性である抗体を産生するための免疫原として使用すること が可能である。
より具体的には、 タンパク質、 断片、 変異体、 融合タンパク質などは、 抗体形 成を引き出す抗原決定基またはェピトープを含むが、 これら抗原決定基またはェ ピトープは、 直鎖でもよいし、 より高次構造 （断続的） でもよい。 なお、 該抗原 決定基またはェピトープは、 当該技術分野に知られるあらゆる方法によって同定 できる。 したがって、 本発明は、 G34酵素タンパク質の抗原性ェピトープにも関 する。 こうしたェピトープは、 以下により詳細に記載されるように、 '抗体、 特に モノクローナル抗体を作成するのに有用である。
本発明のェピトープは、 アツセィにおいて、 そしてポリクローナル血清または 培養ハイプリ ドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製する
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レ ijt ) sョ め ς? し/ ι、ーノ s; /n よて ン¾¾：共 " Mよ 、 固相合成、 タンパク質の化学的または酵素的切断などの当該技術分野において 公知の技術を用いて、 あるいは組換え DNA技術を用いて産生することができる 本発明の酵素タンパク質によってあらゆる態様の抗体が誘導される。 該タンパ ク質のポリぺプチド全部若しくは一部又はェピトープが単離されていれば、 慣用 的技術を用いてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも調製可 能である。 例えば、 Kennet ら （監修） ， Monoclonal Antibodies, Hybridomas : A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, 1980 を参照されたい。
本発明によれば、 G34酵素タンパク質に特異的なモノ'クローナル抗体を産生す るハイプリ ドーマ細胞株も提供される。 こうしたハイプリ ドーマは、 慣用的技術 によって産生し、 そして同定することが可能である。 こうしたハイプリ ドーマ細 胞株を産生するための 1つの方法は、 動物を本発明の酵素タンパク質で免疫し、 免疫された動物から脾臓細胞を採取し、 該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、 それによりハイプリ ドーマ細胞を生成し、 そして該酵素に結合するモノクローナ ル抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞株を同定することを含む。 モノクローナル 抗体は、 慣用的技術によって回収可能である。
本発明のモノクローナル抗体には、 キメラ抗体、 例えば、 ネズミモノクローナ ル抗体のヒ ト化型が含まれる。 こうしたヒ ト化型抗体は、 ヒ トに投与されて免疫 原性を減少させるという利点を有する。
また本発明によれば、 上記抗体の抗原結合断片も提供される。 慣用的技術によ つて産生可能な抗原結合断片の例には、 F a bぉょびF ( a b ' ) 2断片が含ま れるが、 これらに限定されない。 遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片お よび誘導体もまた提供される。
本発明の抗体は、 in vitro及ぴ in vivoのいずれにおいても、 本発明の G34 酵素タンパク質又はそのポリぺプチド断片の存在を検出するためのァッセィに使 用可能である。 また本発明の抗体は、 免疫アブイ二ティークロマトグラフィーに よって G34酵素タンパク質又はそのポリぺプチド断片を精製することにも使用 ご 、.さ o。
さらに本発明の抗体は、 結合パートナー、 例えば受容体基質への前記糖転移酵 素タンパク質の結合を遮断することが可能な遮断抗体として提供されてもよく、 そのような結合により当該酵素の生物活性を阻害可能である。 こうした遮断抗体 は、 受容体基質を発現している特定の細胞への該タンパク質の結合を阻害する能 力に関して抗体を試験するなど、 あらゆる適切なアツセィ法を用いて同定するこ とができる。
また遮断抗体は、 標的細胞の結合パートナーに結合している該酵素タンパク質 から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアツセィにおいても同定可能で ある。 こうした抗体は、 in vitro法で使用するか又は in vivoで投与して、 抗 体を生成した実体によって仲介される生物活性を阻害し得る。 従って、 本発明に よれば、 G34酵素タンパク質と結合パートナーとの間の直接又は間接的な相互作 用に起因して引き起こされるか又は悪化する障害を治療するための抗体も提供さ れ得る。 こうした療法は、 結合パートナー仲介生物学的活性を阻害するのに有効 な量の遮断抗体を哺乳動物に in vivo投与することを含むであろう。 一般にこ うした療法の使用にはモノクローナル抗体が好ましく、 1つの態様として抗原結 合抗体断片が使用される。
( 6 ) 癌化検定のための本癸明の核酸
本発明者は、 上述した G34酵素タンパク質の発見に伴い、 このタンパク質を コードする mRNAが癌化組織及び細胞株において広く認められ、 特にその発現量 が癌化組織において有意に上昇していることを確認した。 したがって、 G34核酸 は、 転写産物を含む生物試料を対象とした癌診断等に有用な癌マーカーとして有 用である。 この側面において、 本発明は、 配列番号 1又は 3に記載の塩基配列に より定義される核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得る測定用 核酸を提供する。
本発明の測定用核酸の一態様は、 生物試料中の G34核酸を標的とするもので 、 配列番号 1又は 3の塩基配列から選ばれる塩基配列を有するプライマー又はプ ローブである。 特に配列番号 1の塩基配列は構造遺伝子をコードする mRNA由来 のもので、 当該 G34遺伝子のオープンリーディングフレーム (0RF) 全域を含む ことから、 通常、 生物試料に由来する転写産物中には、 配列番号 1又は 3の全長 ないしそれに近い大部分長が見出される。 この観点から、 本発明によるプライマ 一又はプローブは、 配列番号 1又は 3の各塩基配列から選択される所望の部分配 列 （当該選択配列と相同であるか相補的であるべきかは使用方法に依存して決定 される） 有し、 このようにして当該標的配列に特異的にハイブリダィズできる核 酸として提供できる。 典型的なプライマー又はプローブには、 配列番号 1又は 3の少なく とも一部の 塩基配列を有する核酸に由来する天然の D N Aフラグメント、 配列番号 1又は 3 の少なくとも一部の塩基配列を有するように合成された D N Aフラグメント、 又 はそれらの相補鎖が挙げられる。
上記のようなプライマー又はプローブを用いて、 後述のように生物試料中の該 標的核酸を検出及び/又は定量することができる。 また、 ゲノム上の配列も標的 となり得るので、 本発明の核酸は、 医学研究用又は遺伝子治療用のアンチセンス プライマーとして使用してもよい。
(A) 本発明のプローブ
本発明の測定用核酸の好ましい態様は、 配列番号 1又は 3の塩基配列を有する 核酸又は少なく ともその何れか一方の相補鎖を標的としたプローブであって、 こ れら塩基配列から選ばれる少なくとも十数個、 好ましくは 1 5塩基以上、 好まし くは 1 7塩基以上、 より好ましくは 2 0塩基以上のオリゴヌクレオチド若しくは それらの相補鎖、 或いは、 その 0RF領域全長の cDNA若しくはその相補鎖が含ま れる。
オリゴヌクレオチドプローブとする場合、 本発明の測定用核酸は、 十数塩基、 例えば 1 5塩基、 好ましくは 1 7塩基ほどの長さもあれば、 ストリンジェントな 条件下でその標的核酸に対し特異的にハイプリダイズし得ると理解される。 すな わち、 当業者であれば、 オリゴヌクレオチドプローブ設計に関する公知の各種ス トラテジ一に従い、 配列番号 1又は 3の塩基配列から少なくとも 1 5塩基〜 2 0 塩基の適切な部分配列を選択することができる。 この場合に配列番号 2又は 4の ァミノ酸配列情報は、 プローブとして適切と思われるユニークな配列を選定する のに役立つ。
また、 cDNAプローブとする場合、 例えば、 一般に医学研究用の試薬又は診断 薬としてのプローブは、 大きい分子量のものは取り扱い難いので、 この見地から 、 医学研究を目的とした本発明のプローブとしては、 配列番号 1又は 3の各塩基 配列から選ばれる 5 0〜 5 0 0塩基、 より好ましくは 6 0〜 3 0 0塩基からなる 核酸が例示される。
上記ストリンジヱントな条件下とは、 既に説明したような中程度又は高程度な ス トリンジユント条件を意味する。 当業者であれば、 公知の各種プローブ設計法 及びハイプリダイゼーション条件に関する技術常識並び経験則を基に、 選択した プローブにとって適切な中程度又は高程度にストリンジユントな条件を容易に見 つけ出し、 実施することができる。
また、 選択される塩基長及び適用されるハイブリダィズ条件等に依存するが、 比較的短鎖のォリゴヌクレオチドプローブは、 配列番号 1又は 3の塩基配列と比 較して 1又は数個の塩基、 特に 1又は 2塩基程度の不一致があってもプローブと しての機能を果たし得る。 また.、 比較的長鎖の c D N Aプローブは、 配列番号 1 の塩基配列又はその相補的な塩基配列と 5 0 %以下、 好ましくは 2 0 %以下の不 一致があっても、 プローブとしての機能を果たし得る。
上記のようにして設計される本発明のプローブは、 G34中の標的配列とのハイ ブリ ツドを検出または確認するために、 蛍光標識、 放射標識、 ビォチン標識等の 標識を付した標識プローブとして使用されることができる。
例えば、 本発明の標識プ口一ブは、 G34核酸からの PCR増幅産物を確認又は定 量するために使用することができる。 この場合、 PCRに使用される一対のプライ マー配列の間に位置する領域の当該塩基配列を標的としたプローブを使用すると よい。 そのようなプローブの一例は、 配列番号 1 6に記載の塩基配列 （配列番号 1中の塩基番号 5 2 5 - 5 5 6の相補鎖に相当する） からなるオリゴヌクレオチ ドが挙げられる （実施例 3参照） 。
また、 本発明のプローブは、 診断用 D N Aプローブキット等に組み込まれても よいし、 D N Aマイクロアレイ等のチップ上に固定されてもよい。
( B ) 本発明のプライマー
本発明の癌化検定用核酸から得られるプライマーの好ましい態様は、 オリゴヌ クレオチドプライマ一である。 オリゴヌクレオチドプライマ一の製造に当たって は、 配列番号 1又は 3の塩基配列の O R F領域から以下の条件を満たすように 2 つの領域を選択するとよい。
a ) 各領域の長さが数十塩基以上、 特に 1 5塩基以上、 好ましくは 1 7塩基以上 、 より好ましくは 2 0塩基以上であり、 且つ 5 0塩基以下であること ； さらに b ) 各領域中の G + Cの割合が 4 0〜7 0 %であること ； 実際には、 上記のように選択した 2つの領域と同じ塩基配列若しくはそれらに 相補的な塩基配列を有する一本鎖 DNAとして製造してもよいし、 それら塩基配 列に対する結合特異性を失わないように修飾した一本鎖 DNAを製造してもよい 。 本発明のプライマーは、 選択された標的配列と完全に相補的な配列を有するこ とが好ましいが、 1または 2塩基の不一致があっても差し支えない。
本発明による一対のプライマーの例としては、 ヒト G34では配列番号 1 4と 配列番号 1 5 (それぞれ、 配列番号 1中の塩基番号 4 8 1 - 5 0 1の配列及ぴ塩 基番号 5 6 2 - 5 8 1の相捕鎖に相当する） からなる一組のオリゴヌクレオチド が挙げられ、 また、 マウス G34では配列番号 1 7と配列番号 1 8 (それぞれ、 配列番号 3中の塩基番号 4 8 1 - 5 0 1の配列及び塩基番号 5 6 2— 5 8 1の相 補鎖に相当する） からなる一組のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
( 7 ) 本発明による癌化検定方法
既に述べた通り、 本発明の G34核酸は、 癌化した生物試料中の発現量 （すな わち当該遺伝子のゲノムから mRNAへの転写レベル） が、 その健常生物試料より も有意に上昇していることが確認された。 少なくとも大腸癌又は肺癌の癌化検定 に有用であることが明らかにされた （実施例 3参照） 。
本発明の癌化検定方法の具体的態様によれば、 生物試料から抽出された転写産 物又はそれに由来する核酸ライブラリ一を被検試料として、 上述のプローブ又は プライマーを用いて当該 G34核酸の量 （典型的には mRNA量） を測定し、 そして 、 この測定値が健常生物試料のそれを有意に上回るか否かを判断する。 ここで、 被検生物試料の測定値が健常生物試料の基準値を有意に上回る場合に、 その被検 生物試料は癌化している或いは悪性度が髙いと判断される。
本発明の癌化検定法において、 対照となる健常生物試料についての基準値は、 同一患者の同一組織における対照部 1'立 勺には正'吊' y£ p \ \iL) についての 」'疋' 値を利用してもよいし、 対照部位から得られた既知のデータ等を基に一般化され た値、 例えば健常組織における mRNA量の平均値を利用してもよい。
なお、 本発明の測定用核酸を使用した発現量の測定によると、 ヒト G34は正 常部位では脳、 骨格筋、 薛臓、 副腎、 精巣、 及び前立腺において高いレベルの発 現が認められ、 他の部位でも比較的低いレベルであるが有意な発現が認められる 。 このようにヒ ト G34の発^は各種組織全般に広く認められ、 そして、 大腸及 び肺の組織のような比較的発現レベルの低い組織でも、 ヒ ト G34の発現量は有 意に上昇することが判明した。 これらのデータが提供されることによって、 当業 者は、 本発明の測定用核酸の具体的な有用性と効果を認識するであろう。
本検定法において、 被検試料についての測定値が健常試料と比較して有意に上 回るかは、 当該検定に必要とされる精度 （陽性率） や判定すべき悪性度に従って 設定される基準で判断されることができる。 例えば、 悪性度の高い組織の検出を 目的として、 陽性とすべき基準値をより低く設定したり、 或いは癌化の兆候ない し可能性がある被検試料を網羅的に検出することを目的として、 陽性とすべき基 準値をより高く設定するなど、 目的に応じて任意に判定基準を設けることができ る。
以下では、 ハイブリダイゼーシヨン法と PCR法を例に挙げ、 本発明の癌化検 定法を説明する。
(A) ハイブリダイゼーション検定法
本検定法の態様には、 例えば、 本発明の核酸から得られるプローブを使用した サザンブロット、 ノ一ザンブロット、 ドットプロット、 又はコ口ニーハイブリダ ィゼーション法等のような当業者に周知である各種ハイプリダイゼーシヨン検定 を用いた方法が含まれる。 さらに検出シグナルの増幅や定量が必要とされ.る場合 、 それらを免疫学的検定法と組み合わせてもよい。
典型的なハイブリダイゼーション検定法によれば、 生物試料から抽出された検 核酸またはその増幅物が固相化され、 標識プローブとストリンジェントな条件下 でハイブリダィズさせ、 洗浄後、 固相に結合された標識が測定される。
生物試料からの転写産物の抽出及ぴ精製は、 当業者に知られているあらゆる方 法を 1 用して行うことができる。
( B ) PCR検定法
本発明の癌化検定法の好ましい態様には、 本発明のプライマーでの核酸増幅反 応を利用した PCR法も含まれる。 PCRの詳細は、 既に説明した通りである。 ここ では PCRを利用した本検定法の具体的態様を説明する。
検定すべき転写産物中の G34の mRNAは、 その塩基配列から選ばれる所定領域 の両端に位置する一対のプライマーを使用した PCRにより増幅することができ る。 この工程において、 検体中に G34核酸が僅かでも存在すると、 それらが鐃 型となりプライマー対間の核酸領域が次々と複製され増幅される。 PCRでの所定 サイクル数の繰り返しによって、 鎵型とされた核酸は、 所望の濃度まで増幅され る。 同じ増幅反応条件であれば、 検体中に存在した G34の mRNA量に比例した増 幅産物が得られる。 そして、 当該増幅領域を標的とする上記プローブ等を使用し て増幅産物が目的の核酸であるか確認し、 それを定量することができる。 また、 健常組織中の当該核酸も同様にして測定される得る。 なお、 同一組織等に広く一 般的に存在する遺伝子の核酸 > 例えばグリセルアルデヒ ドー 3リン酸一脱水素酵 素 (GAPDH) 、 ]3—ァクチンをコードする核酸を対照として利用し、 個体差を除 去するとよい。 前記 G34の転写レベルについての測定値は、 上述したように癌 化の有無なレ、し悪性度を検定するために対比される。
PCR法に供される核酸試料は、 被検組織又は細胞などの生物試料から抽出され た mRNA総体でも、 mRNAから逆転写した c DNA総体でもよレ、。 mRNAを増幅す る場合には、 既述のプライマー対を用いた NASBA法（3SR法、 TMA法）を採用して もよい。 NASBA法自体は周知であり、 且つそのためのキットも市販されているの で、 本発明のプライマー対を用いて容易に実施することができる。
上記増幅産物の検出又は定量は、 増幅後の反応溶液を電気泳動し、 パンドをェ チジゥムブロミ ド等で染色する方法や、 電気泳動後の増幅産物をナイ口ン膜等の 固相に不動化し、 被検核酸と特異的にハイブリダィズする標識プローブ （例えば 、 配列番号 1 6の塩基配列を有する） をハイブリダィズさせ、 洗浄後、 該標識を 検出することにより行うことができる。
また、 本検定法に好適な PCR法としては、 定量的 PCR法、 特にキネティック ス分析のための RT- PCR法、 定量的リァルタィム PCR法が挙げられる。 特に m R Aライブラリ一を対象とする定量的リアルタイム RT-PCR法は、 測定対象が生 物試料から直接に精製でき且つ転写レベルを直接反映しているという観点から好 適である。 但し、 本検定法における核酸の定量は、 定量的 PCR法に限定される ものではなく、 PCR産物に対して、 上述のプローブを用いたノーザンプロット、 ドットプロット、 D N Aマイクロアレイのような公知の他の DNA定量法を適用 2004/000608
し得る。
また、 クェンチヤ一蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いた定量的 RT-PCRを 行うことにより、 検体中の標的核酸の量を定量することも可能である。 特に定量 的 RT - PCR用のキットが市販されているので、 容易に行うことができる。 さらに 、 電気泳動パンドの強度に基づいて標的核酸を半定量することも可能である。
( C ) 癌治療効果に関する検定法
本発明の癌化検定法の他の態様として、 癌の治癒ないし緩和の効果を判断する ための検定も挙げられる。 例えば、 検定の対象には、 抗癌剤の投与、 放射線治療 等のあらゆる処置が含まれ、 それら処置の対象には、 癌患者又は発癌実験モデル 動物由来の in vitro癌細胞や癌組織が含まれる。
この検定法によれば、 生物試料に或る処置が施された場合、 当該生物試料中の G3 核酸の転写レベルが当該処置に起因して低下するか否かを判断することによ り、 当該処置の癌への治療効果を知ることができる。 また、 転写レベルが低下す るか否かの判断に限らず、 上昇が有意に抑制される場合に有効であると評価して' もよい。 転写レベルの比較は、 未処置組織との比較だけでなく、 処置後おける経 時的追跡でもよい。
本発明による癌治療効果検定には、 例えば、 癌化組織に抗癌剤候補物質が効く か否か、 癌患者に投与中の抗癌剤に対して耐性が形成されているか否力 実験モ デル動物の病変組織等に効くか否か等の判断が含まれる。 実験モデル動物の被検 組織は、 in vitroに限らず in vivo 又は ex vivo試料も含まれる。
( 8 ) 遺伝子操作動物の作製
既に述べたように、 本発明者によりマウス G34の存在とその核酸配列 （配列 番号 3 ) が突き止められた。 本発明は、 受精卵や ES細胞を用いた各種遺伝子変. 換技術に基づく動物個体レベルでの G34の発現，機能解析の手段、 典型的には G34遺伝子を導入したトランスジヱニック動物、 及ぴマウス G34を欠損させたノ ックァゥトマウスの作製等にも関する。
例えば、 ノックアウトマウスの作製は、 当該技術分野における常法に従って行 うことができる （ジーンターゲティングの最新技術 八木健編集 羊土社： ジー ンターゲティング 野田哲生監訳 メディカル 'サイエンス 'インターナショナ ル社等を参照すればよい） 。 すなわち、 当業者であれば、 本願において開示され たマウス G34核酸配列情報を利用し、 公知のジーンターゲティング法に従って G3 の相同組換え ES細胞を取得することができ、 これを用いて G34ノックァゥ トマウスを作製することができる （実施例 7参照） 。
また、 最近では small interfering RNA法により遺伝子発現を抑制する方法 が開発されており （T. R. Bru讓 elkamp et al. , Science, 296, 550-553 (2002) ) 、 このような公知の方法に従い G34ノックアウトマウスを作製するこ ともできる。
G34ノックァクトマウスを提供することは、 特定の生命現象への G34遗伝子の 関与、 すなわち、 当該遺伝子の重複性に関する情報のほか、 当該遺伝子欠損と個 体レベルでの表現型 （運動、 知能、 感覚機能に関するあらゆるタイプの異常が含 まれる） との関係、 さらには発生、 成長、 老化といった個体のライフサイクルに おける当該遗伝子の機能の解明に役立つであろう。 より詳細には、 上記の方法に より得られるノックァゥトマウスを用いて G34および mG34が合成する糖鎖のキ ャリアの検出おょぴ生理的機能、 疾患との関連等について検討することができる 。 例えば、 ノックアウトマウスより摘出した各組織より糖蛋白質および糖脂質を 抽出し、 プロテオミックス等の技法 （例えば二次元電気泳動、 二次元薄層クロマ トグラフィ、 質量分析等） により野生型マウスと比較することで、 合成された糖 鎖のキャリアを同定できる。 また、 ノックアウトマウスと野生型マウスの表現系 (例えば、 胎児形成、 発育過程、 自発行動等） を比較することにより生理的機能 や疾患との関連を推定することができる。
用語の定義
本明細書において、 核酸についての転写レベルの 「測定値」 又は 「発現量 J と いうときは、 一定量の生物試科由来の転写産物中に存在する当該核酸の量、 すな わち当該核酸濃度を示す。 また本発明の検定法は、 それらの測定値を比較するこ とに依拠するのであるから、 核酸が定量のために PCR等によって増幅されたり 、 プローブ標識からのシグナルが増幅された場合にも、 それら増幅された値につ いて相対的な対比が可能である。 したがって、 「核酸についての測定値」 とは増 幅後の量又は増幅後のシグナルレベルとして把握されることもできる。 本明細書において 「標的核酸」 又は 「当該核酸」 というときは、 in vivo又は in vitroのいずれかを問わず、 G34の mRNAはもちろんのこと、 その mRNAを鎳 型にして得られるあらゆるタイプの核酸が含まれる。 なお本明細書において 「塩 基配列」 とレ、うときは、 特に断らない限り、 それに相補的な配列も包含される。 本明細書において、 「生物試料」 とレヽうときは、 器官、 組織及び細胞、 並びに 実験動物由来の器官、 組織及び細胞等を示すが、 好ましくは組織又は細胞である 。 例えば、 組織には、 脳、 胎児脳、 小脳、 延髄、 顎下腺、 甲状腺、 気管、 肺、 心 臓、 骨格筋、 食道、 十二指腸、 小腸、 大腸、 直腸、 結腸、 肝臓、 胎児肝臓、 滕臓 、 腎臓、 副腎、 胸腺、 骨髄、 脾臓、 精巣、 前立腺、 乳腺、 子宫、 胎盤が、 より好 ましくは大腸及び肺である。
本明細書において 「測定」 又は 「検定」 という用語には、 検出、 増幅、 定量、 および半定量のいずれもが包含される。 特に本発明による検定法は、 上記の通り 、 生物試料の癌化の検定に関するものであり、 医療分野における癌の診断や治療 等に応用することができる。 ここで 「癌化の検定」 という用語には、 生物試料が 発癌しているか否かについての検定のほか、 悪性度が高いか否かについての検定 も含まれる。 本明細書において 「癌」 という用語には、 典型的には悪性腫瘍全般 を含み、 該悪性腫瘍による疾病状態を含む。 従って、 本発明による検定法の対象 は、 特に限定されるわけではないが、 神経芽腫、 神経膠腫、 肺癌、 食道癌、 胃癌 、 滕臓癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 十二指腸癌、 小腸癌、 大腸癌、 直腸癌、 結腸癌、 白 血病、 好ましくは大腸癌、 肺癌である。
以下、 本発明を実施例により更に具体的に説明する。
[実施例]
実施例 1 ： ヒ ト G34遺伝子のクローニングと発現、 並びに発現タンパク質の 精製
β 3ガラク トース転移酵素 6 ( β 3GalT6) をクエリーとして BLAST検索を行 つた結果、 ホモロジ一を有する核酸配列 (配列番号 1 ) が見出された。 該核酸配 列から予測されるオープンリーディングフレーム (0RF) は 1503 bp、 アミノ酸 配列にして 500アミノ酸 （配列番号 2 ) からなる。 これら核酸配列及びアミノ 酸配列がコードする生成物をヒ ト G34と命名した。 G34のァミノ酸配列 N末端には、 糖転移酵素の特徴である疎水ァミノ酸領域が あり、 前記 i3 3GalT6との相同性は核酸配列で 47%、 ァミノ酸配列で 28%である 。 また、 i3 3GalTファミリーに保持されている 3つのモチーフ全てを保持してい る。
本実施例では、 哺乳動物細胞での G34の発現を確認したほか、 その活性の詳 細を調べるために G34を昆虫細胞内で発現させた。
活性を確認するには配列番号 1の少なくとも i3 3GalT6と比較的ホモ口ジ一が 保たれている 1 8 9番アミノ酸から C末端までの活性領域を発現させれば十分 であると考えられるが、 本実施例では 36番アミノ酸から C末端までの活性領域 を発現させることとした。
ヒ ト G34遺伝子の哺乳動物細胞での発現の確?忍 '
G34の 36番ァミノ酸から C末端までの活性領域を FLAG Prote in Expre ss i on System (シグマアルドリツチ社) により哺乳動物由来細胞株発現ベクター pFLAG- CMV3に遺伝子導入した。 pFLAG - CMV3を使用すれば、 マルチクローニング サイトを有しており、 目的遺伝子及び pFLAG- CMV3を制限酵素処理した後、 ライ ゲーション反応を行うことで目的遺伝子を pFLAG - CMV3に導入できる。
腎から得られた cDNA (クロンテック社製、 Marathon-ready cDNA) を鎳型と し 5 ' プライマー（G34-CMV - F1：配列番号 5 )と 3 ' プライマー （G34 - CMV-R1 ： 配列番号 6 ) を用いて PCR反応を行い、 目的の DNA断片を得た。 PCR法は 98°C 10秒、 55°C 30秒、 12。じ 2分を 25回繰り返す条件で行った。 そして PCR産物を ァガロースゲル電気泳動を行い、 ゲル切り出し法でゲルを切り出して定法により 単離した。 この PCR産物は制限酵素サイ トとして 5， 側に HindII I、 3 '側に BamHIを有する。
この DNA断片と pFLAG- CMV3を各々制限酵素である Hindl l l及ぴ BamHIにて処 理した後、 反応液を混合し、 ライゲーション反応を行うことで pFLAG-CMV3に導 入した。 反応液をエタノール沈殿法により精製した後、 コンビテントセル （大腸 菌 DH5 α ) と混合し、 ヒートショック法 (42°C、 30秒) を行い、 アンピシリン を含む LB寒天培地に播いた。
翌日得られたコロニーを、 直接 PCRで目的 DNAを確認した。 さらに確実を期 すためシーケンシングにより DNA配列の確認をした後、 ベクター （ FLAG- CMV3- G34A) を抽出 ·精製した。 '
ヒ ト腎臓細胞由来細胞株 293T細胞 2 X 106個を抗生物質を含まない 10%ゥシ胎 児血清入りの DMEM培地 （インビトロジヱン社） 10 mlにて懸濁し、 10 cmディ ッシュに播き、 16時間 37°Cにて C02インキュベータにて培養した。 pFLAG_CMV3 - G34Aの 20 n 及び Lipofectamin 2000 (ィンビトロジェン社） 30 μ 1を 0PTI - MEM (インビトロジェン社） 1. 5 mlと各々混和し、 室温にて 5分間インキュベー シヨンした。 更に二つの液を緩やかに混和し、 室温にて 20分間インキュベーシ ョンした。 この混合液をディ Vシュに滴下し、 48時間 37°Cにて C02イン キュベータにて培養した。
上清 10mlに NaN3 (0. 05 %) 、 NaCl (150 mM)、 CaCl, (2 mM)、 抗 FLAG- Ml レ ジン （S igma 社） （100 μ 1 )を混合し、 4°Cで一夜攪拌した。 翌日遠心して （ 3000 rpm 5分、 4°C) ペレツトを回収し、 2 mMの CaCl2 · TBSを 900 μ 1カ卩えて 再度遠心分離 （2000 rpm 5分、 4°C) し、 ペレットを 200 μ 1 の 1 mM CaCl2 - TBS に浮遊させ活性測定のサンプル (G34酵素液) とした。 この一部を SDS- PAGEによる電気泳動について抗 FLAG M2-ペルォキシダーゼ （SIGMA社製） を用 いてウェスタンブロッティングを行い、 目的とする G34タンパク質の発現を確 認した。
その結果、 約 60kDaの位置にバンドが検出、 発現が確認された。
ヒ ト G34遺伝子の昆虫細胞発現べクタ一^■の揷入
G34の 36番ァミノ酸から C末端までの活性領域を GATEWAYシステム (ィンビ ト口ジェン社） の pFastBac (ィンビトロジェン社製） に組込み、 さらに Bac- to- Bacシステム （インビトロジェン社） によるパクミ ドを作成した。
(1)エントリークローンの作成
Kidneyから得られた cDNA (クロンテック社製、 Marathon-ready cDNA) を铸 型とし 5， プライマー（G34-GW - F1：配列番号 7 )と 3， プライマー （G34- GW-R1 ：配列番号 8 ) を用いて PCR反応を行い、 目的の DNA断片を得た。 PCR法は 98°C 10秒、 55°C 30秒、 72°C 2分を 25回繰り返す条件で行った。 そして PCR 産物をァガロースゲル電気泳動を行い、 ゲル切り出し法でゲルを切り出して定法 により単離した。
この産物を BPクロナーゼ反応によって pD0NR201 (インビトロジェン社製） へ 組込み、 「エントリークローン」 を作成した。 反応は目的とする DNA断片 5 1 、 pD0NR2011 μ 1 (I50ng) 、 反応緩衝液 2 1、 BPクロナーゼ mix 2 1を 25°Cで 1時間インキュベートして行った。 プロティナーゼ Kを 1 加えて 37。C10分おき反応を終了させた。 その後上記反応液 1 1をコンビテントセル
(大腸菌 DH5 (¾、 T0Y0B0社製） 100 1 と混合し、 ヒートショック法の後、 カナ マイシンを含む LBプレートにまいた。
翌日コロニーをとり、 直接 PCRで目的 DNAを確認した。 さらに確実を期すた めシーケンシングにより DNA配列の確認をした後、 ベクター (PD0NR-G34A) を 抽出 ·精製した。
(2)発現クローンの作成
上記ェントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り 出される際の組換部位である attLを持つもので、 LRクロナーゼ (ラムダファー ジの組換酵素 Int、 IHF、 Xisを混合したもの) とデスティネーションベクター と混合することで、 挿入部位がデスティネ一ションべクターに移り、 発現クロー ンが作成される。 具体的工程は以下のとおりである。
まずエントリークローン 1 μ 1、 pFBIFを 0.5μ 1 (75ng) 、 LR反応緩衝液 2μ 1、 TE4.5/ l、 LR クロナーゼ mix 2μ 1を 25°Cで 1時間反応させ、 プロティ ナーゼ Kを Ιμ ΐ加えて 37°C10分インキュベートして反応を終了させた (この 組換え反応で p FBIF-G34Aが生成される) 。 pFBIF は、 pFastBac 1に Ig/c シ グナル配列 （配列番号 9 ) と精製用の FLAGぺプチド （配列番号 1 0 ) を入れた もので、 Ig K シグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、 FLAGぺプチ ドは精製のため揷入したものである。 FLAGぺプチドは 0T3 (配列番号 1 1 ) を鍀型とし、 プライマー 0T20 (配列番号 1 2) と、 0T21 (配列番号 1 3 ) によ つて得られた DNA断片を Bam HIと Eco R1で挿入した。 さらに、 Gateway配列 を挣入するにめ、 Gateway Vector Conversion System ( ンヒ 卜ロジェン社) ¾ί用レヽて Conversion cassette 入 ;?17こ。
その後、 上記混合液全量 （11 z l) をコンビテントセル （大腸菌 DH5 Q:) 100 μ ΐ と混合し、 ヒートショック法の後、 アンピシリンを含む LBプレートにま いた。 翌日コロニーをとり、 直接 PCRで目的 DNAを確認し、 ベクター （p FBIF- G34A) を抽出 .精製した。
(3) Bac-to-Bacシステムによるバクミ ドの作成
続いて Bac-to-Bacシステム （インビトロジヱン社） を用いて上記 p FBIF -と pFastBacとの間で組換えを行わせ、 昆虫細胞中で増殖可能なバクミ ド（Bacmid) に G34その他の配列を挿入した。
このシステムは、 Tn7の組換部位を利用して、 バクミ ドを含む大腸菌 ( DH10BAC、 インビトロジェン社製） に目的遺伝子を挿入させた pFastBacを導入 するだけで、 ヘルパープラスミ ドから産生される組換タンパク質によって目的と する遺伝子がバクミ ドへ取り込まれるというものである。 またバクミ ドには lacZ遺伝子が含まれており、 古典的な青 （挿入なし） 一白コロニー （挿入あり ) による選択が可能である。
即ち、 上記精製ベクター ( p FBIH- G34A) をコンビテントセル （大腸菌
DH10BAC) 50 μ 1 と混合し、 ヒートショック法の後、 カナマイシン、 ゲンタマィ シン、 テトラサイクリン、 Bluo- gal、 及ぴ IPTGを含む LBプレートに播き、 翌 日白い単独コロニーをさらに培養し、 バクミ ドを回収した。
ヒ ト G34遺伝子を含むバクミ ドの昆虫細胞への導入
上記白コロニーから得られたバクミ ドに目的配列が揷入していることを確認し た後、 このバクミ ドを昆虫細胞 Sf21 (インビトロジヱン社より巿販） に導入し た。
即ち 35画のシャーレに Sf21 細胞 9x105 細胞 /2 ml (抗生物質を含む Sf - 900SFM (インビトロジェン社製） を加え、 27°Cで 1時間培養して細胞を接着し た。 （溶液 A) 精製した パクミ ド DNA 5 μ 1に抗生物質を含まない Sf- 900SFM 100 μ 1加えた。 (溶液 B) CellFECTIN Reagent (インビトロジェン社製） 6 μ 1に抗生物質を含まない Sf- 900SFM 100 μ 1加えた。 その後、 溶液 Αおよび溶 液 Bを丁寧に混合して 45分間、 室温でインキュベートした。 細胞が接着したこ とを確認して、 培養液を吸引して抗生物質を含まない Sf - 900SFM 2 mlを加えた 。 溶液 Aと溶液 Bを混合して作製した溶液（lipid-DNA complexes)に抗生物質を 含まない Sf900II 800 μ 1を加えて丁寧に混和した。 細胞から培養液を吸引し 、 希釈した l ipid- DNA complexes溶液を細胞に加え、 27°Cで 5時間ィンキュベ ーシヨンした。 その後、 トランスフヱクシヨン混合物を除き、 抗生物質を含む Sf - 900SFM培養液 2 mlを加えて 27°Cで 72時間ィンキュベーションした。 トラ ンスフヱクシヨンから 72時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、 細胞と 培養液を回収した。 これを 3000 rpm， 10分間遠心し、 上清を別のチューブに保 存した （この上清が一次ウィルス液となる） 。
T75培養フラスコに Sf21細胞 1 X 107 細胞 /20ml Sf- 900SFM (抗生物質入り） を入れて、 27°Cで 1時間ィンキュベートした。 細胞が接着したら一次ウィルス を 800 μ 1を添加して、 27°Cで 48時間培養した。 48時間後にピぺッティング により細胞を剥がし、 細胞と培養液を回収した。 これを 3000 rpm， 10分間遠心 し、 上淸を別のチューブに保存する' (この上淸を二次ウィルス液とした) 。
さらに、 T75培養フラスコに Sf21細胞 1 X 107 細胞 /20ml Sf- 900SFM (抗生物 質入り） を入れて、 27°Cで 1時間インキュベートした。 細胞が接着したら二次 ウィルス液 100 μ 1を添加して、 27°Cで 72時間培養した。 培養後にピベッティ ングにより細胞を剥がし、 細胞と培養液を回収した。 これを 3000 rpm, 10分間 遠心し、 上清を別のチューブに保存した (この上淸を三次ウィルス液とした) 。 加えて、 100 ml用スピナ一フラスコに Sf21細胞 6 X 105細胞/ ml濃度で Ί00 · ml を入れ、 三次ウィルス液を 1 ml添加して 27°Cで約 96時間培養した。 培養後に 、 細胞及び培養液を回収した。 これを 3000 rpm, 10分間遠心し、 上清を別のチ ユーブに保存した （この上清を四次ウィルス液とした）
G34のレジン精製
上記四次ウィルス液の pFLAG- G34上清 lOralに NaN3 (0. 05 %) 、 NaCl (150 mM)、 CaCl2 (2mM)、 抗 FLAG- Ml レジン （Sigma社） （100 μ i )を混合し、 4°Cで —夜攪拌した。 翌日遠心して (3000 rpm 5分、 °C) ペレツトを回収し、 2 ηι の CaCl2 · TBSを 900 μ 1加えて再度遠心分離 （2000 rpm 5分、 4°C) し、 ペレ ットを 200 μ 1 の 1 mM CaCl2 - TBS に浮遊させ活性測定のサンプル （G34酵素 液） とした。 この一部を SDS-PAGEによる電気泳動について抗 FLAG M2 -ペルォキ シダーゼ (SIGMA社製) を用いてウェスタンブロッテイングを行い、 目的とする G34タンパク質の発現を確認した。 その結果約 60kDaの位置を中心としてブロー ドに複数のバンド （糖鎖などの翻訳後修飾の違いによるものと考えられる） が検 出、 発現が確認された。
■ 実施例 2 ： ヒ ト G34タンパク質の糖転移活性の探索
(1) GalNAc転移活性のスクリ一ユング
G34タンパク質の β 1 ， 3— Ν—ァセチルガラタ トサミン転移活性について 、 基質特異性、 至適緩衝液、 至適 ρΗ、 二価イオン要求性について検討を行った 以下の反応系を用いて、 G34酵素タンパク質の GalNAc転移活性における受容 体基質特異性について検討した。
下記反応液の受容体基質には、 pNp- a - Gal、 oNp- jS - Gal、 Bz- a _GlcNAc、 pNp - j3 - GlcNAcヽ Bz - α - GalNAcヽ pNp - j8 - GalNAc、 pNp -ひ - Glcヽ pNp - j3 - Glcヽ pNp- β -GlcA, pNp一ひ一 Fuc、 pNp一 ο;一 Xyl、 pNp一 — Xylおよぴ pNp一 α— Man (すべ て Sigma社) を各々 10 nmol として用いた。 ここで 「Gal」 とは D—ガラク トー ス残基を示し、 rxylj とは D—キシロース残基を示し、 「Fuc」 とは D—フコ ース残基を示し、 「Man」 とは D—マンノース残基を示す。 「GlcA」 はダルク口 ン酸残基を示す。
反応液 （カツコ内は最終濃度） は、 基質（10 nmol) , MES (2-モルフオリノエ タンスルホン酸） （pH 6. 5、 50mM) 、 MnCl2 (10 mM) Triton X- 100 (商品名） (0. 1 %)、 UDP-GalNAc (2 mM) および UDP- ["C] GlcNAc (40 nCi)を混和し、 こ れに G34酵素液を 5 μ. 1加えて、 さらに Η20を加えて全量 20 μ 1 とした (表 1 参照） 。
表 1 反応液の組成（iU l)
E (+), D (+) X8 ： E (-), D (+)： E (+), D (-)
酵素液 5 40： 0： 5
140 mM HEPES pH7.4 2 16: 2： 2
100 mM UDP-GalNAc 0.5 4： 0.5： 0
200 mM MnCI2 1 8： 1： 1
10% Triton CF-54 0.6 4.8： 0.6： 0.6
H20 5.9 47.2： 10.9： 6.4
10 nmol/ul Acceptor 5 40： 5: 5
Total 20 ！ 20： 20 4 000608
上記反応混合液を 37°Cで 16時間反応させ、 反応終了後、 H20を 200 /z l 加え 、 軽く遠心後上清を取得した。 1 mlのメタノールで 1回洗浄後、 1 mlの H20で 2回洗浄して平衡化した Sep- Pak plus C18 Cartridge (Waters社製） に該上清 を通し、 上清中の基質おょぴ生成物をカートリッジに吸着させた。 1 mlの 0 にて 2回カートリッジを洗浄後、 1 ral のメタノールで吸着した基質おょぴ生成 物を溶出した。 溶出液を 5 mlの液体シンチレ一ター ACSII (アマシャムバイオ サイエンス社製） と混和し、 シンチレーシヨンカウンター (ベックマン . コ一ノレ タ一社製） にて放射線の量を測定した。
その結果、 G34タンパク質は、 pNp- ;3 - GlcNAcに GalNAcを転移させる活性を 有する GalNAc転移酵素であることが判明した。 また、 当該酵素活性は、 UDP- GlcNAcを供与体基質とし Bz - jS - GlcNAcを受容体基質とした.とき、 少なくとも 0 〜16時間の反応時間経過に伴いリニアに上昇した （表 2及び図 1参照） 。
表 2 '
Figure imgf000043_0001
結合形式の決定 . .
G34酵素タンパク質により合成される糖鎖構造について、 その結合形式を NMR により解析した。
先ず反応液 （カツコ内は最終濃度） は Βζ- - GlcNAc (640 皿 ol)を受容体基質 として、 HEPES緩衝液 （pH 7. 4、 1 mM) 、 Triton じ？-54 (商品名） （0· 3 、 UDP - GalNAc (2 mM)、 MnCl2 (10 mM)及び G34酵素液 500 μ 1加えた。 さらに Η20を加えて全量 2 ml とした。 この反応液を 37°Cにて 16時間反応させた。 反応 液を 5分間、 95°Cで加温することで反応を停止し、 Ultrafree- MC (ミリポア社 ) によりろ過精製した。
—回の展開に 50 μ ΐのろ液を逆相カラム ODS- 80Ts QA (4. 6 X 250 匪、 東ソ P T/JP2004/000608
一株式会社） を用いて高速液体クロマトグラフィー （HPLC) で分析した。 展開 溶媒として 9%ァセトニトリル- 0. 1%トリフルォロ酢酸水溶液を用いた。 溶出条件 は 1 ml/分、 40°Cとした。 溶出ピークの検出は 210 nmにおける吸光度を指標と し、 SPD-10Avp (島津製作所） を使用した。 その結果、 対照にはみられなかった 新たな溶出ピークが認められた。 このピークを分取し、 凍結乾燥後、 醒 Rの試科 として用いた。
NMRは DMX750 (ブルッカーダルト二タス社) を用いて行った。 その結果、 試 料は GalNAcと GlcNAc - 1 - 0- Bzが 1 - 3結合したものであると判断された （図 2 A及ぴ図 2 B参照） 。 このように判断した根拠として以下の点が挙げられる （ 図 2 A及び図 2 Bと共に図 3及ぴ 4を参照されたい） 。 a ) 2つの残基 （A、 B とする） の一位の信号のピス トン結合定数が共に 8. 4 Hzであり、 2つのピラノ ースは i3 型である。 b ) 図 3中にスピン結合定数が示されるが、 Aはダルコ一 スに特徴的なスピン結合定数を示し、 Bはガラク トースに特徴的なスピン結合定 数を示す。 c ) ベンジルのメチレンプロ トンと A 1プロ トンの間に N0E 見られたために Aがベンジルの結合した残基であると分かる。 d ) N -ァセチル のメチルの信号が 2つあり、 2つの残基が N -ァセチル化された糖であることが 分かる。 e ) N0ESYに B1-A3の N0Eが存在する。
他方、 上記酵素活性に関与するモチーフ配列についての検討も行った。
図 5は、 G34タンパク質の推定アミノ酸配列 （配列番号 2 ) と各種のヒ ト ΐ - 3Gal転移酵素 （ j3 3 Gal- T 1〜T 6 ) のアミノ酸配列との対比を示す。 図 5 中、 枠で囲まれた部分は Gal転移酵素に共通するモチーフを示すが、 そのうち 、 M l ~ 3の枠で囲まれた 3つのモチーフは β 1 , 3結合性糖転移酵素に共通す るモチーフである。 また同図中の *印は、 比較された配列間で保存されているァ ミノ酸残基を示す。
図 6は、 各種 β l-3GlcNAc転移酵素 （ β 3 Gn- Τ2〜Τ5) 及ぴヒ ト Gal転移酵素 T 1〜T3, Τ5, Τ6との間で、 β 1 , 3結合形成能に関与する 3つのモチーフ （図 5の前記 Μ 1〜 3のモチーフに相当する) における対比を示している。 同図中の *印は、 比較された配列間で保存されているアミノ酸残基を示す。
図 5及び図 6で示されるように、 G34タンパク質のアミノ酸配列は、 公知の各 種 j3 1， 3結合性糖転移酵素のァミノ酸配列との対比において、 /3 1 , 3結合 に関するモチーフ （M l〜3 ) をすベて有すると言えるだけの保存性を有してい ることが分かった。
かくして、 G34タンパク質が GlcNAcに GalNAcを β 1 , 3のダリコシド結合 で転移する活性を有するとの結論はモチーフに関する検討からも支持された。
至適緩衝液および至適 PH
以下の反応系を用いて、 G34の GalNAc転移活性における至適緩衝液および至 適 pHについて検討した。 受容体基質は pNp- ]3 - GlcNAcを用いた。
緩衝液 （カツコ内は最終濃度） は MES (2 -モルフオリノエタンスルホン酸） 緩 衝液 （pH 5. 5、 5. 78、 6. 0、 6. 5および 6. 75、 50 mM) 、 力コジル酸ナトリウム 緩衝液 （pH 5. 0、 5. 6、 6. 0、 6. 2、 6. 6、 6. 8、 7. 0、 7. 2、 7. 4およぴ 7. 5、 25 mM ) および N— [ 2—ヒ ドロキシェチル] ピぺラジン一 N' - [ 2—エタンスノレホ ン酸 （HEPES) 緩衝液 (pH 6. 75, 7. 00, 7. 30、 7. 40および 7. 50、 14 mM) のい ずれかを用いた。 基質（10 nmol)、 MnCl2 (10 mM) 、 Triton 0?-54 (商品名) (0. 3%)、 UDP - GalNAc (2 mM) および UDP - [14C] GlcNAC (40 nCi)これに G34酵素 液を 5 μ 1加えて、 さらに Η20を加えて全量 20 μ 1 とした。
上記反応混合液を 37°Cで 16時間反応させ、 反応終了後、 H20を 200 ^ 1 加え 、 軽く遠心後上清を取得した。 1 mlのメタノールで 1回洗浄後、 1 mlの 0で 2回洗浄して平衡化した Sep- Pak plus C18 Cartri dge (Waters社製）に該上清 を通し、 上清中の基質および生成物をカートリッジに吸着させた。 1 mlの H20 にて 2回カートリッジを洗浄後、 1 mlのメタノールで吸着した基質および生成 物を溶出した。 溶出液を 5 mlの液体シンチレ一ター ACSII (アマシャムバイオ サイエンス社製） と混和し、 シンチレーシヨンカウンター (ベックマン ' コール タ一社製） にて放射線の量を測定した。
その結果 （表 3及ぴ図 7参照） から、 MES緩衝液においては検討した範囲では pH 5. 50と pH 5. 78で同等の強い活性を示し、 pH 6. 5まで pH依存的に低下し、 pH 6. 75で強い活性を示した。 力コジル酸ナトリウム緩衝液において検討した範 囲では pH 5. 0で最も活性が高く、 pH 6. 2まで pH依存的に活性が低下し、 さら に pH 7. 0まで pH依存的に強くなり、 pH 7. 4までプラトーとなった。 HEPES緩 衝液においては検討した範囲では pH依存的に活性が増強し、 pH7. 4ないし 7. 5 で最も強い活性を示した。 これらの中で HEPES緩衝液 pH 7. 4ないし 7. 5が最も 強い活性を示した,。
表 3
Figure imgf000046_0001
以下の反応系を用いて二価イオンの要求性について検討した。 受容体基質は
Bz- ]3 - GlcNAcを用いた。
反応液 （カツコ内は最終濃度） は、 基質（10 nmol) 、 HEPES緩衝液 （pH 7. 4、 14 mM) 、 Tri ton CF - 54 (商品名) (0. 3 °/。）、 UDP-GalNAc (2 mM)および UDP- [ C] GlcNAC (40 nCi ) 、 G34酵素液 5 μ 1加えた。 これに MnCl2、 MgCl2または CoCl2を 2. 5 mM、 5 mM、 10 raM、 20 mMおよび 40 mM添カ卩し、 さらに H20を加え て全量 20 μ 1 とした。
上記反応混合液を 37°Cで 16時間反応させ、 反応終了後、 H20を 200 μ 1 加え 、 軽く遠心後上清を取得した。 1 mlのメタノールで 1回洗浄後、 1 mlの H20で 2回洗浄して平衡化した Sep- Pak plus C18 Cartri dge (Waters社製） に該上清 を通し、 上清中の基質おょぴ生成物をカートリッジに吸着させた。 1 mlの H20 にて 2回カートリッジを洗浄後、 1 mlのメタノールで吸着した基質および生成 P T/JP2004/000608
物を溶出した。 溶出液を 5 mlの液体シンチレ一ター ACSII (アマシャムバイオ サイエンス社製） と混和し、 シンチレーシヨンカウンター （ベックマン ' コール ター社製） にて放射線の量を測定した。
その結果 （表 4及び図 8参照） から、 各二価イオン添加により活性は増強し、 G3 タンパク質は二価イオン要求性の酵素であることが確認された。 その活性は Mnおよび Coで 5 nM以上、 Mgで 10 nM以上の濃度でほぼプラトーであった。 ま た、 Mnによる活性の増強は Cuの添加により完全に消失した。
表 4
R1ァ'ソセィ（二価イオン要求性）
Figure imgf000047_0001
オリゴ糖に対する基質特異性
以下の反応系を用いてオリゴ糖に関する受容体基質特異性について検討した。 受容体基質は pNp - α - Gal、 oNp - jS - Gal、 Βζ- α - GlcNAc、 Bz- β -GlcNAc, Bz - α - GalNAcヽ Np- β - GalNAc、 pNp -ひ- Glc、 pNp - /3- Glcヽ pNp - j3 - GlcA、 Np- -Fuc 、 pNp -ひ - Xyl、 pNp - ]3 - Xyl、 pNp- α-Man, ラタ トシド- Bz、 Lac-セラミ ド、 Gal - セラミ ド、 パラグロボシド、 グロポシド、 Gal- )31-4 GalNAc-a-pNp、 Gal— ]31- 3 GlcNAc- β -pNps GlcNAc - j3ト 4 GlcNAc ]3- Bz、 pNp-corel (Gal- j31-3
GalNAc-α-ρΝρ), pNp-core2 (Gal- ^ 1-3 (GlcNAc - j31-6) GalNAc -ひ pNp)、 pNp-core3 (GlcNAc- j31-3 GalNAc- a- pNp)および pNp-core6 (GlcNAc- j31-6 GalNAc -ひ- pNp)を用いた。 なお 「Lac」 とは D—ラクトース残基を示す。
反応液 （カツコ内は最終濃度） は基質（50 nmol)、 HEPES緩衝液 （pH 7. 4、 14 mM) 、 Triton CF-54 (商品名） (0. 3 °/。）、 UDP-GalNAc (2 mM)、 MnCl2 (10 mM) 、 UDP - [3H] GlcNAcおよび G34酵素液 5 μ 1加えた。 さらに Η20を加えて全量 20 μ 1とした。
上記反応混合液を 37°Cで 2時間反応させ、 反応終了後、 H20を 200 ^ 1 加え、 軽く遠心後上清を取得した。 1 mlのメタノールで 1回洗浄後、 1 ralの ¾0で 2 回洗浄して平衡化した Sep- Pak plus C18 Cartri dge (Waters社製） に該上清を 通し、 上清中の基質おょぴ生成物をカートリッジに吸着させた。 1 mlの 0に て 2回カートリッジを洗浄後、 1 mlのメタノールで吸着した基質および生成物 を溶出した。 溶出液を 5 mlの液体シンチレ一ター ACSII (アマシャムバイオサ ィエンス社製） と混和し、 シンチレーシヨンカウンター (ベックマン . コールタ 一社製） にて放射線の量を測定した。
その結果を Bz - /3 - GlcNAcを基質に用いたときの放射活性を 100%とし、 比較し た （表 5参照） 。 pNp - core2を基質としたときに最も放射活性の上昇が認められ た。 ついで Bz- jS -GlcNAc、 GlcNAc- β 1-4-GlcNAc- jS -Bz, pNp - core6、 pNp- core3の順に放射活性の上昇が認められた。 その他の基質には放射活性の上昇は 認められなかった。
Figure imgf000049_0001
(2) HPLC分析法による活性の確認
糖残基供与体基質としてゥリジン二リン酸— N—ァセチルガラク トサミン （ UDP-GalNAc： シグマ -アルドリツチ社) 、 糖残基受容体基質として Bz- ]3 - GlcNAc を使用して、 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) による G34の酵素活性の分 析を行った。
反応液 （カツコ内は最終濃度） は、 Βζ- - GlcNAc (10 nmol)、 HEPES緩衝液 (PH 7. 4、 14 mM) 、 Triton CF - 54 (商品名) (0. 3 %)、 UDP-GalNAc (2 mM)、 MnCl2 (10 raM)及び G34酵素液 10 μ 1を加えた。 さらに Η20を加えて全量 20 μ 1 とした。 この反応液を 37°Cにて 16時間反応させた。 反応液に H20を 100 μ ΐ 加えることで反応を停止し、 Ultrafree- MC (ミリポア社） によりろ過精製した
10 μ 1のろ液を逆相カラム 0DS- 80Ts QA (4. 6 X 250 ram、 東ソー株式会社） を 用いて高速液体クロマトグラフィー （HPLC) で分析した。 展開溶媒として 9%ァ セトニトリル- 0. 1%トリフルォロ酢酸水溶液を用いた。 溶出条件は 1 ml/分、 40°Cとした。 溶出ピークの検出は 210 nmにおける吸光度を指標とし、 SPD - 10A vp (島津製作所） を使用した。
その結果、 対照にはみられなかった新たな溶出ピークが認められた。
(3)質量分析法による反応生成物の分析
上述のピークを回収し、 質量分析法による反応生成物の分析を行つた。 マトリ ックス支援レーザーイオン化一飛行時間質量分析 （MALDI- T0F-MS) は Reflex IV (プルッカ一ダルトニクス社） を使用して行った。 MALDI- T0F- MS用の試料は 10 pmolの試料を乾燥させ、 1 / 1の蒸留水に溶解して使用した。
その結果、 538. 194 m/ のピークが観察された。 このピークは GalNAc - GlcNAc-Bz (ナトリゥム塩） の分子量に相当していた。
この結果からも、 G34酵素タンパク質は、 Bz- -GlcNAcに対し GalNAcを転移 することが明らかとなった。
実施例 3 ： ヒ ト G34の mRNA発現量の測定
(1)各種ヒ ト正常組織における発現量
定量的リアルタイム PCR法を用いてヒ ト正常組織内の G34の mRNA発現量を比 較した。 ここで定量的リアルタイム PCR法とは、 PCRにおいてセンスプライマー
Figure imgf000050_0001
マ一に加え、 蛍光標識されたプ口ーブを組合わせる方 法である。 PCRにより増幅する際、 プローブの蛍光標識が外れて蛍光を示す。 蛍 光強度が遺伝子の増幅に相関して増幅するためこれを指標として定量が行われる 各ヒ ト正常組織の RNA (クロンテック社） を RNeasy Mini Kit (キアゲン社製 ) で抽出し、 Suner-Script First-Strand Synthesis System 、インヒ トロシェ ン社製) を用いた ol igo (dT)法により single strand DNAとした。 この DNAを 鎵型として用いて 5 ' プライマー （配列番号 1 4 ) と 3 ' プライマー （配列番号 1 5 ) 及ぴ TaqMan プローブ （配列番号 1 6 ) を用いて ABI PRISM 7700 (アブ ライ ドバイォシステムズジャパン社製) により定量的リアルタイム PCRを行つ た。 PCRの条件は 50°C 2分、 95°C 10分で反応させた後、 95°C 15秒、 60°C 1 JP2004/000608
分を 50回繰り返した。 検量線は pFLAG- CMV3 (ィンビトロジェン社） に G34の部 分配列を導入したプラスミ ド DNAを鎳型として用い、 上述の方法により PCRを 行って作成した。
その結果から、 精巣で特異的に高い発現が確認され、 次いで骨格筋、 前立腺の 順に高い発現が認められた （表 6 ) 。 ヒ卜正常組織における G34の mRNA発現量
Figure imgf000051_0001
(2)ヒ ト癌細胞株における発現量,，
上述の定量的リアルタイム PCR法を用いて各種癌由栾のヒ ト細胞株内での G34 の mRNA発現量を比較した。 各ヒ ト細胞株の細胞を回収した後、 RNAを RNeasy Mini Ki t (キアゲン社製) で抽出し、 Super-Script First-Strand Synthes i s System (インビトロジェン社製） を用いた oligo (dT)法により single strand DNAとした。 この DNAを鎳型として用いて 5， プライマー （配列番号 1 4 ) と 3 ' プライマー (配列番号 1 5 ) 及び TaqMan プローブ （配列番号 1 6 ) を用い て ABI PRISM 7700 (アプライ ドバイオシステムズジャパン社製） により定量的 リアルタイム PCRを行った。 PCRの条件は 50°C 2分、 95°C 10分で反応させた 後、 95°C 15秒、 60°C 1分を 50回繰り返した。
その結果、 全てのヒト細胞株で発現が認められた （表 7、 図 9 )
ヒ卜細胞銖における G34の mRNA発現量
(3)癌化
Figure imgf000052_0001
上述の定量的リアルタイム PCR法を用いて大腸癌及び肺癌の患者由来の癌組 織及びその周辺の正常組織における G34の mRNA発現量を比較した。 癌組織と同一患者の正常組織の RNAを RNeasy Mini Kit (キアゲン社製） で抽 出し、 Super— Script First-Strand Synthesis System (インビトロジェン社製 ) を用いた oligo (dT)法により single strand DNAとした。 この DNAを铸型と して用いて 5' プライマー （配列番号 1 4 ) と 3' プライマー （配列番号 1 5 ) 及ぴ TaqMan プローブ （配列番号 1 6 ) を用いて ABI PRISM 7700 (アプライ ド バイオシステムズジャパン社製） により定量的リアルタイム PCRを行った。 PCR の条件は 50°C 2分、 95°C 10分で反応させた後、 95°C 15秒、 60°C 1分を 50回 繰り返した。 得られた数値は個体間のばらつきを補正するため内標準遺伝子とし てアプライ ドバイオシステムズジャパン社製のキットを用いて定量した 0 - actinにより除し、 比較を行った。
その結果、 それら癌化組織内では G34遺伝子の mRNA発現量が有意に増加して いることが明らかとなった （表 8、 表 9 ) 。
大腸癌患者組織における G34の mRNA発現量
Figure imgf000053_0001
コピー数 （X 1 0 0 0 0/ ig, 総 R N A) 表 9
肺癌患者組織における G34の mRNA発現量
Figure imgf000054_0001
コピー数 （X 1 0 0 0 O / g,総 R N A) 実施例 4 ：マウス G34遺伝子のクローニングと発現 ·
実施例 1で得られたヒ ト G34の配列をクエリーとしてアプライ ドバイオシス テムズ社のマウス遺伝子配列 serelaに対して検索を行った結果、 高いホモロジ 一を有する対応核酸配列を見出した。 この核酸配列から予測されるオープンリー デイングフレーム (0RF) は 1515 bp (配列番号 3 ) 、 アミノ酸配列にして 504 アミノ酸 （配列番号 4 ) からなり、 N末端に糠転移酵素の特徴である疎水アミノ 酸領域を有する。 ヒ ト G34 (配列番号 1及び 2 ) との相同性は核酸配列で 86。ん アミノ酸配列で 88%である （図 1 0参照） 。 また、 3GalTファミリーが保持し ている 3つのモチーフ全てを保持している。 我々は、 配列番号 3の核酸配列及ぴ 配列番号 4のアミノ酸配列がコードするものをマウス G34 (mG34) と命名した mG3 の活性を調べるために G34を哺乳類由来細胞株で発現させた。 本実施例 では、 mG34の 35番ァミノ酸から C末端までの活性領域を FLAG Protein Expression System (シグマアルドリッチ社） により哺乳類由来細胞株発現べク ター pFLAG- CMV3に遺伝子導入した。
マウス組織における発現を PCR法により確認した。 マウス組織 （脳、 胸腺、 胃、 小腸、 大腸、 肝臓、 瞵臓、 脾臓、 腎臓、 精巣及び骨格筋） を鎳型とし、 5 ' プライマー （mG34- CMV-F1：配列番号 1 7 ) と 3 ' プライマー （mG34- CMV- R1 ： 配列番号 1 8 ) を用いて PCR反応を行った。 PCR法は 98°C 10秒、 55°C 30秒、 72°C 2分を 25回繰り返す条件で行った。 PCR産物をァガロースゲル電気泳動を 行い、 約 1500 bpのバンドを確認した。 その結果、 表 1 0に示されるように、 精巣での発現が最も高く、 ついで脾臓及び骨格筋の順に発現が認められた。
表 1 0 マゥス組織における mG34の mRNA発現量
Figure imgf000055_0001
マウス精巣から得られた cDNAを鍩型とし 5 ' プライマー（mG34 - CMV - F1：配列番 号 1 7 )と 3 ' プライマー (raG34- CMV-R1 :配列番号 1 8 ) を用いて PCR反応を行 い目的の DNA断片を得た。 PCR法は 98°C 10秒、 55°C 30秒、 72°C 2分を 25回 繰り返す条件で行った。 そして PCR産物をァガロースゲル電気泳動し、 ゲル切 り出し法でゲルを切り出して定法により単離した。 この PCR産物は制限酵素サ イトとして 5 ' 側に HindIII、 3 ' 側に Notlを有する。
この DNA断片と pFLAG-CMV3を、 各々制限酵素である Hindi II及び Notlにて 処理した後、 反応液を混合し、 ラィゲーション反応を行うことで pFLAG - CMV3に 導入した。 反応液をエタノール沈殿法により精製した後、 コンビテントセル （大 腸菌 DH5 a ) と混合し、 ヒートショック法 （42°C、 30秒） を行い、 アンピシリ ンを含む LB寒天培地に播いた。
翌日得られたコロニーを、 直接 PCRで目的 DMを確認した。 さらに確実を期 すためシーケンシングにより DNA配列の確認をした後、 ベクター （pFLAG- CMV3 - raG34A) を抽出 ·精製した。
ヒ ト腎臓細胞由来細胞株 293T細胞 2 X 106個を抗生物質を含まない 10%ゥシ胎 児血清入りの DMEM培地 （インビトロジヱン社） 10 ralにて懸濁し、 10 cmディ ッシュに播き、 16時間 37°Cにて C02インキュベータにて培養した。 pFLAG_CMV3- mG34Aの 20 ng及ぴ Lipof ectarain 2000 (インビトロジェン社） 30 μ 1を 0ΡΤΙ- ΜΕΜ (インビト口ジヱン社) 1. 5 ml と各々混和し、 室温にて 5分間インキュベー シヨンした。 更に二つの液を緩やかに混和し、 室温にて 20分間インキュベーシ ヨンした。 この混合液をディッシュに滴下し、 48時間 37°Cにて C02インキュベ . ータにて培養した。
上清 10mlに NaN3 (0. 05 %) 、 NaCl (150 mM)、 CaCl2 (2 mM)、 抗 Ml レジン ( Sigma 社） （100 μ 1 )を混合し、 4°Cで一夜攪拌した。 翌日遠心して （3000 rpm 5分、 4°C) ペレットを回収し、 2 mMの CaCl2 · TBSを 900 1加えて再度遠心分 離 （2000 rpm 5分、 4°C) し、 ペレットを 200 1の 1 raM CaCl2 · TBSに浮遊 させ活性測定のサンプル （マウス G34酵素液） とした。 この一部を SDS- PAGEに よる電気泳動について抗 FLAG M2-ペルォキシダーゼ (SIGMA社製) を用いてゥ エスタンブロッティングを行い、 目的とする raG34タンパク質の発現を
確認した。 その結果、 約 60kDaの位置にパンドが検出、 発現が確認された。
実施例 5 ：マウス G34の糠転移活性の探索
以下の反応系を用い、 マウス G34の /3 1 , 3— N—ァセチルガラク トサミン転移 活性における基質特異性について検討した。 下記反応液の 「受容体基質」 には、 ρΝρ- α -Gal , oNp- jS -Gal , Bz - α - GlcNAc、 Bz - ) S - GlcNAc、 Bz - a _Ga通 c、 pNp- β -GalNAc, pNp - α - Glcゝ pNp - j8 - Glc、 pNp - - GlcA、 pNp- a - Fuc、 pNp - a - Xyl 、 pNp - j3 - Xyl、 pNp- a - an ラク トシド- Bz、 Lac-セラミ ド、 Gal-セラミ ド、 Gb3、 グロボシド、 Ga卜 ΐ- 4GalNAc- a - pNp、 Gal β l-3GlcNAc- β -Bz, Gl cNAc- 1-4 - GlcNAc - j3 - Bz、 coreト pNp、 core2 - pNp、 core3 - pNpおよび core6 - pNp ( すべて Sigroa社） を各々 10 nmol として用いた。
反応液 （カツコ内は最終濃度） は基質（10 nmol)、 HEPES (N— [ 2 -ヒ ドロキ シェチル] ピぺラジン一 N' — [ 2—エタンスルホン酸] ) (pH 7. 4、 14 mM) 、 MnCl2 (10 mM) Triton CF- 54 (商品名） （0. 3 %)、 UDP - GalNAc (2 mM) および UDP- [14C]GlcNAC (40 nCi)を混和し、 これにマウス G34酵素液を 5 1加えて 、 さらに H20を加えて全量 20 1 とした。
上記反応混合液を 37°Cで 16時間反応させ、 反応終了後、 0を 200 μ 1 加え 、 軽く遠心後上清を取得した。 1 mlのメタノールで 1回洗浄後、 1 mlの H20で 2回洗浄して平衡化した Sep- Pak plus C18 Cartridge (Waters社製）に該上淸 を通し、 上清中の基質および生成物をカートリッジに吸着させた。 1 mlの 0 にて 2回カートリッジを洗浄後、 1 mlのメタノールで吸着した基質および生成 物を溶出した。 溶出液を 5 mlの液体シンチレータ一 ACSII (アマシャムバイオ サイエンス社製） と混和し、 シンチレーシヨンカウンター (ベックマン . コ一ノレ ター社） にて放射線の量を測定した。
その結果は、 Bz- ]3 - GlcNAcを基質に用いたときの放射活性を 100%として比較 した （表 1 1 ) 。 Bz - GlcNAcを基質としたときに最も放射活性の上昇が認め られた。 つレヽで core2 - pNpゝ core6 - pNp、 core3 - pNp、 pNp - j3 - Glcゝ GlcNAc- j3 1- 4 - GlcNAc- β -Bzの順に高い放射活性が認められた。 その他の基質には放射活性 の上昇は認められなかった。
Figure imgf000058_0001
実施例 6 ：マウス精巣に対する in situハイブリダイゼ——ンョン
マウス精巣由来の試料に mG34を使用した in situハイブリダイゼーションを 行い、 マウス精巣試料における mG34の発現を確認した （図 1 1参照） 。
実施例 7 ： G34ノックアウ トマウスの作製
ノックアウ トしたい遺伝子 (mG34) の活性化ドメィンを含む exon (mG34の場 合には 0RF部分の 3番目から 12番目の exon (1242 bp) ) を含む約 10 kb斷片 を中心とした染色体断片 (約 10 kb) を pBluescript II SK (-) (TOYOBO製) に 挿入したターゲテイングベクター (PBSK-mG34-K0neo) を作製する。 pBSK-raG34- KOneoには薬物耐性遺伝子として neo (ネオマイシン耐性遺伝子） を mG34の予 測される GalNAc転移活性領域である 7番目から 9番目の exonに導入する。 そ の結果、 mG34の 7番目から 9番目の exonが欠失し、 この部分が neoで置換され る。 こうして得られた pBSK-mG34 - KOneoを制限酵素である Notlにて直鎖状とし た後、 80 を ES細胞 （E14 I 129Svマウス由来） にトランスフエクシヨン （ エレク ト口ポレーシヨン等） し、 G418耐性のコロニーを選択する。 G418耐性コ ロニーを 24ゥュルプレートに移し、 培養を行う。 細胞の一部を凍結保存した後 、 残りの ES細胞から DNAを抽出し、 PCRにより組み換えが起こっているクロー ンを 120コロニー程度選択する。 さらに、 サザンブロッテイング等により組み 換えが予定通り起こっているかの確認を行い、 最終的に組み換え体を 10クロー ン程度選択する。 選択したうちの 2クローンの ES細胞を C57BL/6マウスの胚盤 胞內に注入する。 ES細胞を注入したマウス胚を仮親マウスの子宫内へ移植して キメラマウスを誕生させる。 その後、 ジャームトランスミッションによりへテロ ノックァゥトマウスを得ることができる。

Claims

請求の範囲
1. N—ァセチル一 D—ガラク トサミンを N—ァセチルー D—ダルコサミン に β 1, 3結合で転移する ]3 1 , 3— Ν—ァセチルー D—ガラク トサミン転 移酵素タンパク質。
2. 下記の性質 （a) — （c) ：
(a) 受容体基質の特異性
オリゴ糠を受容体基質とする場合、 Βζ- - GlcNAc、 GlcNAc- 1-4 - GlcNAc - β - Bz、 Gal- β 1-3- (GlcNAc- β 1-6) GalNAc- a _pNp、 GlcNAc - ]3ト 3- GalNAc - α-ρΝρ, 及び GlcNAc- j31-6- GalNAc- α-ρΝρへの転移活性を示す （ 「GlcNAc」 は N—ァセチルー D—ダルコサミン残基を示し、 「GalNAc」 は N—ァセチル —D—ガラク トサミン残基を示し、 「Bz」 はベンジル基を示し、 「pNp」 はパ ラニトロフエ二ル基を示し、 「一」 はグリコシド結合を示す。 式中の数字は グリコシド結合が存在する糠環の炭素番号を示し、 「α」 及び 「 」 は糖環 1位のグリコシド結合のァノマーを示し、 5位 CH20H又は CH3との位置関係が トランスのものを 「ひ」 、 シスのものを Γ β J で示す） ；
(b) 反応 pH
pH6. 2〜6. 6の領域での活性が、 他の pH領域での活性と比較して 低い；又は、 （c) 二価イオンの要求性
前記活性は、 少なくとも Mn2+、 Co2 又は Mg2+の存在下で増強されるが、
Μη2+による活性の増強は Cu+との共存下でほぼ完全に消失する ；
の少なくとも一つを有する、 請求項 1に記載の糖転移酵素タンパク質。
3. 下記 （A) 又は （B) のポリペプチドを含む糠転移酵素タンパク質
(A) 配列番号 2又は 4に記載のァミノ酸配列を有するポリぺプチド；又は (B) 配列番号 2又は 4に記載のァミノ酸配列において 1若しくは複数個の アミノ酸が置換、 欠失、 又は挿入したアミノ酸配列を有し、 且つ N—ァセチ ルー D—ガラク トサミンを N—ァセチル一 D—ダルコサミンに jS 1 , 3結合 で転移するポリぺプチド。
4. 前記 （A) のポリペプチドが、 配列番号 2に記載のアミノ酸番号 1 89 〜500のアミノ酸配列を有するポリべプチドからなる、 請求項 3に記載の 糠転移酵素タンパク質。
5. 前記 （A) のポリペプチドが、 配列番号 2に記載のアミノ酸番号 3 6〜 500のァミノ酸配列を有するポリぺプチドからなる、 請求項 3に記載の糖 転移酵素タンパク質。
6. 配列番号 2に記載のァミノ酸番号 1 8 9〜 500又は配列番号 4に記载 のァミノ酸番号 35〜 504のァミノ酸配列と少なくとも 30 %を超える同 一のアミノ酸配列を有するポリぺプチドからなる、 請求項 3に記載の糖転移 酵素タンパク質。
7. 請求項 3〜6のいずれか 1項に記載のポリぺプチドをコ一ドする塩基配 列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
8. 配列番号 1又は 3に記載の塩基配列又は、 少なくともその何れかに相補 的な塩基配列からなる、 請求項 7に記載の核酸。
9. 配列番号 1に記載の塩基番号 56 5〜 1 503の塩基配列又はそれに相 補的な塩基配列からなる、 請求項 7に記載の核酸。
10. 配列番号 1に記載の塩基番号 1 06〜 1 503の塩基配列又はそれに相 補的な塩基配列からなる、 請求項 7に記載の核酸。
1 1. 配列番号 3に記載の塩基番号 103〜 1 5 1 2の塩基配列又はそれに相 捕的な塩基配列からなる、 請求項 7に記載の核酸。
1 2. DNAであることを特徴とする、 請求項 7〜 1 1のいずれか 1項に記載の 核酸。
1 3. 請求項 7〜 1 2のいずれか 1項に記載の核酸を含むベタター。
14. 請求項 1 3に記載のベクタ一を含む形質転換体。
1 5. β 1 , 3—Ν—ァセチルー D—ガラクトサミン転移酵素タンパク質の製 造方法であって、 請求項 14に記載の形質転換体を生育させ、 前記糠転移酵 素タンパク質を発現させ、 該形質転換体から該糖転移酵素タンパク質を回収 することを含む製造方法。
6 . 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の 1 , 3— Ν—ァセチルー D—ガ ラクトサミン転移酵素タンパク質を認識する抗体。
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