JP4565177B2 - β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物 - Google Patents
β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4565177B2 JP4565177B2 JP2004200261A JP2004200261A JP4565177B2 JP 4565177 B2 JP4565177 B2 JP 4565177B2 JP 2004200261 A JP2004200261 A JP 2004200261A JP 2004200261 A JP2004200261 A JP 2004200261A JP 4565177 B2 JP4565177 B2 JP 4565177B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- β3gn
- pharmaceutical composition
- cells
- cell
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３Ｇｎ−Ｔ６）タンパク質または当該タンパク質をコードする核酸を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物に関する。
癌細胞では、細胞表面の糖鎖合成の異常から正常細胞と比べて異なる糖鎖構造を発現することが知られている。こうした癌細胞表面の異常な糖鎖構造に基づいて、有用な糖鎖関連腫瘍マーカー（糖鎖抗原）が見出されてきた。例えば、シアリルＬｅａ（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）、およびシアリルＬｅｘ（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）エピトープは、既知の癌関連抗原であり、癌組織においてこれらエピトープが増加している。また、癌細胞の転移に関しては、シアリルＬｅａおよびＬｅｘエピトープによるセレクチンへの結合を介して転移が行われると言われている。転移する癌細胞の細胞膜表面に発現した糖鎖構造は、ムチン型（またはＯ結合型）糖鎖の非還元末端だけでなく、糖鎖の根幹構造においても変化していることが知られている。
ここで、ムチン型糖鎖は、Ｏ−グリカンを有する糖タンパク質の異種のグループを構成し、そのうちいくつかは、上皮細胞における膜関連糖タンパク質であり、他は細胞から分泌される。ムチン型糖鎖は、生体内において様々な現象、例えば、癌転移、細胞接着、炎症などに関与する重要な役割を果たしている（Ｂｒｅｓａｌｉｅｒら、１９９６； Ｃａｐｏｎら、２００１； Ｋｉｍ、１９９８； Ｌｉｌｌｅｈｏｊら、２００１； Ｍａｃｋら、１９９２； Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９３； Ｐｒａｋｏｂｐｈｏｌら、１９９９； Ｐｒａｋｏｂｐｈｏｌら、１９９８； Ｓｒｅｅｊａｙａｎら、２００１）。
ムチン型の糖タンパク質は、多くのＯ−グリカンのクラスターを有し、糖鎖合成は、多様なＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：ポリペプチドＧａｌＮＡｃ転移酵素（ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ）によって開始される（図１）。ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−ＴによるＧａｌＮＡｃ残基のセリンおよび／またはスレオニン残基への転移後に、このＧａｌＮＡｃ残基にさらに糖残基が転移され、Ｏ−グリカンが形成される。Ｏ−グリカンは、各種のコア構造に従って分類することができる。コア１構造（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−セリン／スレオニン）は、多くの細胞に見られるＯ−グリカンの主要構造である。コア３構造（ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−セリン／スレオニン）は、結腸のような分化した組織由来のムチンに限定される（Ｉｗａｉら、２００２）。コア２構造（Ｇａｌβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃα１−セリン／スレオニン）、及びコア４構造（ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃα１−セリン／スレオニン）は、それぞれ、コア１及びコア３上のＧａｌＮＡｃにβ１，６結合でＧｌｃＮＡｃの付加によって形成される。各種のコア構造は、細胞及び組織の分化や悪性への形質転換に関連して発現する（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎら、１９９５； Ｆｕｋｕｄａ、１９９６； Ｐｉｌｌｅｒら、１９８８； Ｙａｎｇら、１９９４； Ｙｏｕｓｅｆｉら、１９９１）。例えば、正常の結腸組織では、コア３構造が主要である（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎら、１９８５； Ｃａｐｏｎら、２００１； Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、１９８５ａ、１９８５ｂ）。これとは対照的に、結腸癌組織および結腸癌細胞株においては、コア３構造の発現は下方制御され、代わってコア１構造およびコア２構造の発現が上方制御される（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ、１９９９； Ｋｉｍ、１９９８）。さらに、コア３シンターゼの活性は、これらの結腸癌組織および細胞株において検出できないレベルまで減少する（Ｖａｖａｓｓｅｕｒら、１９９４； Ｖａｖａｓｓｅｕｒら、１９９５）。これらの結果は、コア３シンターゼの発現の下方制御が、癌組織および癌細胞株におけるコア３構造の消失を引き起こす可能性があることを示唆している。また、Ｏ−グリカンのコア構造の合成に関与する多くの酵素は、基質としてのムチン上のＧａｌＮＡｃに集積する。コア１およびコア３シンターゼは、ＧａｌまたはＧｌｃＮＡｃをそれぞれβ１，３−結合でＧａｌＮＡｃ残基に転移する。
最近、発明者らのグループは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ペプチド β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３Ｇｎ−Ｔ６）をクローニングすることに成功し、基質特異性、反応産物の結合様式、遺伝子発現プロフィールに基づき、β３Ｇｎ−Ｔ６がコア３シンターゼの最も有力な候補となることを突き止めた（国際公開ＷＯ０３／０３３７１０）。また、β３Ｇｎ−Ｔ６に結合する新規なモノクローナル抗体（Ｇ８−１４４）を作製し、免疫組織化学的分析を行った。その結果、正常な胃および結腸では、β３Ｇｎ−Ｔ６は上皮組織のゴルジ領域において顕著に発現していた。対照的に、胃及び結腸の癌組織では、β３Ｇｎ−Ｔ６の発現は抑制されていた。また、家族性大腸ポリオーシス（ＦＡＰ）の患者においては、β３Ｇｎ−Ｔ６の発現と形成異常／腫瘍形成の程度との間に明らかな相関関係があることを見出した。具体的には、ＦＡＰの組織の異型度から５つのグループに分類した場合に、悪性腫瘍と擬制されるか、または悪性腫瘍であるグループ４および５において、β３Ｇｎ−Ｔ６の発現が完全に消失していた（国際公開ＷＯ０３／０３３７１０）。しかしながら、β３Ｇｎ−Ｔ６の生体内における機能はさらに解明する必要があった。
国際公開ＷＯ０３／０３３７１０
Ｂｒｅｓａｌｉｅｒ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１０，１３５４−１３６７（１９９６）
Ｃａｐｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３５８，６５７−６６４（２００１）
Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．，Ｋｅｉｏ Ｊ．Ｍｅｄ．，４７，１０−１８（１９９８）
Ｌｉｌｌｅｈｏｊ，Ｅ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８０，Ｌ１８１−１８７（２００１）
Ｍａｃｋ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０２，１１９９−１２１１（１９９２）
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ Ｅｓｓｅｎｔ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ，４８，４２３−４２８（１９９３）
Ｐｒａｋｏｂｐｈｏｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，６８１７−６８２５（１９９９）
Ｐｒａｋｏｂｐｈｏｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，４９１６−４９２７（１９９８）
Ｓｒｅｅｊａｙａｎ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８０：Ｇ１０４３−１０４８（２００１）
Ｉｗａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，１２８０２−１２８０９（２００２）
Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，２３３，６０７−６１７（１９９５）
Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，２２３７−２２４４（１９９６）
Ｐｉｌｌｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１５１４６−１５１５０（１９８８）
Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，４，８７３−８８４（１９９４）
Ｙｏｕｓｅｆｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１７７２−１７８２（１９９１）
Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，１８６６−１８７４（１９８５）
Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，８２６２−８２７１（１９８５ａ）
Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１５５１０−１５５１５（１９８５ｂ）
Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４７３，６７−９５（１９９９）
Ｖａｖａｓｓｅｕｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．，２２２，４１５−４２４（１９９４）
Ｖａｖａｓｓｅｕｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，３５１−３５７（１９９５）
ここで、ムチン型糖鎖は、Ｏ−グリカンを有する糖タンパク質の異種のグループを構成し、そのうちいくつかは、上皮細胞における膜関連糖タンパク質であり、他は細胞から分泌される。ムチン型糖鎖は、生体内において様々な現象、例えば、癌転移、細胞接着、炎症などに関与する重要な役割を果たしている（Ｂｒｅｓａｌｉｅｒら、１９９６； Ｃａｐｏｎら、２００１； Ｋｉｍ、１９９８； Ｌｉｌｌｅｈｏｊら、２００１； Ｍａｃｋら、１９９２； Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９３； Ｐｒａｋｏｂｐｈｏｌら、１９９９； Ｐｒａｋｏｂｐｈｏｌら、１９９８； Ｓｒｅｅｊａｙａｎら、２００１）。
ムチン型の糖タンパク質は、多くのＯ−グリカンのクラスターを有し、糖鎖合成は、多様なＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：ポリペプチドＧａｌＮＡｃ転移酵素（ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ）によって開始される（図１）。ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−ＴによるＧａｌＮＡｃ残基のセリンおよび／またはスレオニン残基への転移後に、このＧａｌＮＡｃ残基にさらに糖残基が転移され、Ｏ−グリカンが形成される。Ｏ−グリカンは、各種のコア構造に従って分類することができる。コア１構造（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−セリン／スレオニン）は、多くの細胞に見られるＯ−グリカンの主要構造である。コア３構造（ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−セリン／スレオニン）は、結腸のような分化した組織由来のムチンに限定される（Ｉｗａｉら、２００２）。コア２構造（Ｇａｌβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃα１−セリン／スレオニン）、及びコア４構造（ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃα１−セリン／スレオニン）は、それぞれ、コア１及びコア３上のＧａｌＮＡｃにβ１，６結合でＧｌｃＮＡｃの付加によって形成される。各種のコア構造は、細胞及び組織の分化や悪性への形質転換に関連して発現する（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎら、１９９５； Ｆｕｋｕｄａ、１９９６； Ｐｉｌｌｅｒら、１９８８； Ｙａｎｇら、１９９４； Ｙｏｕｓｅｆｉら、１９９１）。例えば、正常の結腸組織では、コア３構造が主要である（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎら、１９８５； Ｃａｐｏｎら、２００１； Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、１９８５ａ、１９８５ｂ）。これとは対照的に、結腸癌組織および結腸癌細胞株においては、コア３構造の発現は下方制御され、代わってコア１構造およびコア２構造の発現が上方制御される（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ、１９９９； Ｋｉｍ、１９９８）。さらに、コア３シンターゼの活性は、これらの結腸癌組織および細胞株において検出できないレベルまで減少する（Ｖａｖａｓｓｅｕｒら、１９９４； Ｖａｖａｓｓｅｕｒら、１９９５）。これらの結果は、コア３シンターゼの発現の下方制御が、癌組織および癌細胞株におけるコア３構造の消失を引き起こす可能性があることを示唆している。また、Ｏ−グリカンのコア構造の合成に関与する多くの酵素は、基質としてのムチン上のＧａｌＮＡｃに集積する。コア１およびコア３シンターゼは、ＧａｌまたはＧｌｃＮＡｃをそれぞれβ１，３−結合でＧａｌＮＡｃ残基に転移する。
最近、発明者らのグループは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ペプチド β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３Ｇｎ−Ｔ６）をクローニングすることに成功し、基質特異性、反応産物の結合様式、遺伝子発現プロフィールに基づき、β３Ｇｎ−Ｔ６がコア３シンターゼの最も有力な候補となることを突き止めた（国際公開ＷＯ０３／０３３７１０）。また、β３Ｇｎ−Ｔ６に結合する新規なモノクローナル抗体（Ｇ８−１４４）を作製し、免疫組織化学的分析を行った。その結果、正常な胃および結腸では、β３Ｇｎ−Ｔ６は上皮組織のゴルジ領域において顕著に発現していた。対照的に、胃及び結腸の癌組織では、β３Ｇｎ−Ｔ６の発現は抑制されていた。また、家族性大腸ポリオーシス（ＦＡＰ）の患者においては、β３Ｇｎ−Ｔ６の発現と形成異常／腫瘍形成の程度との間に明らかな相関関係があることを見出した。具体的には、ＦＡＰの組織の異型度から５つのグループに分類した場合に、悪性腫瘍と擬制されるか、または悪性腫瘍であるグループ４および５において、β３Ｇｎ−Ｔ６の発現が完全に消失していた（国際公開ＷＯ０３／０３３７１０）。しかしながら、β３Ｇｎ−Ｔ６の生体内における機能はさらに解明する必要があった。
本発明の目的は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶＩ（β３Ｇｎ−Ｔ６）タンパク質、またはそれをコードする核酸を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、本発明の医薬組成物を利用することにより、癌細胞の転移を抑制し、および／または癌細胞を分化した状態へと誘導することにある。なお、本明細書中において「β３Ｇｎ−Ｔ６」は、特に言及しない限りβ３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質、または当該タンパク質をコードする核酸、あるいは、タンパク質と核酸の双方を示す。
前述したように、細胞膜表面に発現する糖タンパク質の糖鎖構造は、癌細胞の腫瘍マーカーとなるばかりでなく、癌細胞の転移と密接に関連している。そこで、本発明の医薬組成物を用いることにより、癌細胞に発現する糖鎖構造を改変させ、癌細胞の転移を抑制することが可能となる。また、本発明の医薬組成物により、癌細胞を分化した状態へと誘導することも可能となる。したがって、本発明は、糖鎖の発現、糖鎖構造の改変に関与する糖転移酵素を含む医薬組成物を提供することによって、医療分野における癌細胞の転移抑制、および癌細胞の分化誘導を目的とした癌治療を援助する。
本発明者らは、癌細胞に糖転移酵素をコードする遺伝子を組み込み、癌細胞表面に発現する糖鎖構造を改変することによって、癌細胞の移動活性、および転移活性を抑制することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶＩ（β３Ｇｎ−Ｔ６）を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質を直接使用してもよいし、あるいは、β３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸を例えば適切な発現ベクターに挿入したものを使用してもよい。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、あるいは該配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、このようなアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有することが好ましい。
あるいは本発明の一態様によれば、β３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物に使用される核酸は、好ましくは、配列番号２の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってもよい。前記核酸は、好ましくは、配列番号２の塩基配列中の第１番目−第１１５２番目の塩基を有する核酸である。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、癌細胞の細胞移動活性を抑制するために使用することができる。癌細胞は、好ましくは、胃、結腸、直腸、食道、肺、肝臓、血液（例えば、骨髄、Ｂ細胞、Ｔ細胞）、または脳由来であり、より好ましくは、胃、結腸、直腸、食道由来であり、最も好ましくは、胃、結腸由来である。前記癌細胞による転移が抑制される転移先の臓器は、好ましくは、肺、肝臓、腹膜、より好ましくは、肺、肝臓であり、最も好ましくは、肺である。
本発明の医薬組成物は、細胞分化を誘導するために使用することができる。
あるいは、β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質または当該タンパク質をコードする核酸の、細胞分化のマーカーとしての使用も提供される。
本発明の医薬組成物は、コア３構造の発現と競合させることによって、コア１構造の発現を抑制することができる。
本発明によれば、配列番号１に記載されたアミノ酸配列、この配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列、あるいはこれら配列において少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝子発現が、一部または完全に抑制されていることを特徴とするノックアウト動物が提供される。
本発明者らは、癌細胞に糖転移酵素をコードする遺伝子を組み込み、癌細胞表面に発現する糖鎖構造を改変することによって、癌細胞の移動活性、および転移活性を抑制することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶＩ（β３Ｇｎ−Ｔ６）を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質を直接使用してもよいし、あるいは、β３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸を例えば適切な発現ベクターに挿入したものを使用してもよい。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、あるいは該配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、このようなアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有することが好ましい。
あるいは本発明の一態様によれば、β３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物に使用される核酸は、好ましくは、配列番号２の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってもよい。前記核酸は、好ましくは、配列番号２の塩基配列中の第１番目−第１１５２番目の塩基を有する核酸である。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、癌細胞の細胞移動活性を抑制するために使用することができる。癌細胞は、好ましくは、胃、結腸、直腸、食道、肺、肝臓、血液（例えば、骨髄、Ｂ細胞、Ｔ細胞）、または脳由来であり、より好ましくは、胃、結腸、直腸、食道由来であり、最も好ましくは、胃、結腸由来である。前記癌細胞による転移が抑制される転移先の臓器は、好ましくは、肺、肝臓、腹膜、より好ましくは、肺、肝臓であり、最も好ましくは、肺である。
本発明の医薬組成物は、細胞分化を誘導するために使用することができる。
あるいは、β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質または当該タンパク質をコードする核酸の、細胞分化のマーカーとしての使用も提供される。
本発明の医薬組成物は、コア３構造の発現と競合させることによって、コア１構造の発現を抑制することができる。
本発明によれば、配列番号１に記載されたアミノ酸配列、この配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列、あるいはこれら配列において少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝子発現が、一部または完全に抑制されていることを特徴とするノックアウト動物が提供される。
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
（１）β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３Ｇｎ−Ｔ６）
本発明者らのグループは、既に、β３Ｇｎ−Ｔ６をコードする遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列および推定アミノ酸配列を決定している（国際公開ＷＯ０３／０３３７１０）。β３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸の塩基配列、推定アミノ酸配列、β３Ｇｎ−Ｔ６の酵素としての基質特異性、β３Ｇｎ−Ｔ６に対するモノクローナル抗体、および組織における発現分布に関しては、国際公開ＷＯ０３／０３３７１０に開示される。
本明細書においては、本発明の理解のために、本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６を以下に説明する。なお、本明細書において、ヒトβ３Ｇｎ−Ｔ６をコードしている核酸を配列表の配列番号２に記載し、該核酸がコードする推定アミノ酸配列を配列番号１に記載する。
本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６は、次の性質を有する酵素である。
触媒反応
Ｎ−アセチルガラクトサミニル（ＧａｌＮＡｃ）基にＮ−アセチルグルコサミンをβ１，３結合で転移する（ＥＣ２．４．１．１４７、Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌ−Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｔａ−１，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。触媒する反応を反応式で記載すると、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル−Ｒ ＋ ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン → Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル−Ｒ ＋ ＵＤＰ （ＧａｌＮＡｃ−Ｒ ＋ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ → ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ + ＵＤＰ）となる。
受容体基質特異性
受容体基質は、本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６がＮ−アセチル−Ｄ−グルコース供与体基質からＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を転移し得る基質である限り特に限定されないが、好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、例えばＮ−アセチルガラクトサミンα１−Ｒ（Ｒは、タンパク質中のセリンやスレオニン等の側鎖の水酸基やｐ−ニトロフェノール等の水酸基とエーテル結合した残基）である。
本発明によれば、β３Ｇｎ−Ｔ６を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物が提供される。ここで、β３Ｇｎ−Ｔ６は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は限定されない。即ち、β３Ｇｎ−Ｔ６は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現されたタンパク質、または化学合成タンパク質の何れでもよい。
本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６は、典型的には、配列番号１に記載したアミノ酸残基３８４個からなるアミノ酸配列を有する。しかしながら、天然のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生体型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「変異タンパク質」とは、配列番号１に示されたアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する機能を有するタンパク質等を意味する。ここで、「複数個」とは、好ましくは１−２００個、より好ましくは１−１００個、最も好ましくは１−５０個である。限定されるわけではないが、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性は保存される程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、一般的には、好ましくは１−１０個である。
本発明の医薬組成物に使用されるヒトβ３Ｇｎ−Ｔ６は、好ましくはクローニングされた核酸の塩基配列からの推定に基づいて配列番号１のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特徴を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。同一性は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
本明細書において、アミノ酸配列のパーセント同一性は、重複部分と同一性を最大化する一方で、配列ギャップを最小化するように並列した場合のタンパク質（またはポリペプチド）のアミノ酸配列を比較することによって決定される。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。当業者により使用される配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにより使用が可能なＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．２．７）が使用可能である。プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳説されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（保存的置換）（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の保存的変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の医薬組成物に使用することができる。
本発明の医薬組成物に使用されるβ３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質は、例えば、後述の実施例１に従って、本発明の核酸による配列番号２の核酸（好ましくはＤＮＡ）を大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入および発現させることにより大量に得ることができる。
本明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２（１９９７））に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、あるいはＰｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２４４４−２４４８（１９８８））に記載されているＦＡＳＴＡを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた使用可能である。
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、後述する実施例１−３に記載したように、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する機能を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。
（２）β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする核酸
本発明によれば、β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする核酸を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物が提供される。上記核酸は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ、およびそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組合せが含まれる。使用する核酸としては、ＤＮＡが好ましい。本明細書において、ある特定の塩基配列について記載する場合、特に言及しない限り、その相補鎖も含む。
本発明の医薬組成物に使用する核酸は、好ましくは配列番号１に示されるヒトのアミノ酸配列をコードする核酸（その相補体を含む）である。典型的には、配列番号２の塩基配列（その相補体を含む）を有する。天然の核酸の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。使用可能な核酸は、配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸に限定されるわけではなく、β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする全ての核酸を包含する。本発明の医薬組成物に使用する核酸は、好ましくは、配列番号２の塩基配列の第１番目−第１１５２番目の塩基を有する。
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも ７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ Ｄ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９）； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２２（１９９０）； Ｂａｒａｎｙ Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９３（１９９１））および転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））およびＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，ｐ．１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号２に示される塩基配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定されれ；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｂｉａｓｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
（３）組換えベクターと形質転換体
プラスミド等のベクターにβ３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする核酸のＤＮＡ断片を組込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、大腸菌ＤＨ５α、ＤＨ１０ＢＡＣ、ＴＢ１、ＬＥ３９２、ＸＬ−ＬＥ３９２、またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１６．１（２００１）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
ベクターは、簡単には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＴＡＰｌｕｓ、ｐＤｒｉｖｅ、ｐＥＴＢｌｕｅ−１等が例示されるが、これらに限定されない。
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、β３Ｇｎ−Ｔ６を発現させたい宿主細胞に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように発現ベクターは、β３Ｇｎ−Ｔ６が目的の宿主細胞中で発現し得るように遺伝子発現に関与する領域（プロモーター領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらにβ３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。また、発現ベクターの構築は、制限処理および連結作業を必要としない、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を用いても行うことができる。Ｇａｔｅｗａｙシステムとは、ＰＣＲ産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、ＤＮＡ断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、ＰＣＲ産物およびドナーベクターから部位特異的な組換え酵素であるＢＰクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるＬＢクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにＰＣＲ産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間のかかるサブクローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
発現ベクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０等が好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２、ｐＡＵＲ１２３（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡ０８１５（以上ピキア属）、昆虫細胞用発現ベクターとしてｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、哺乳類細胞用発現ベクターとしてｐＤＥＳＴ１２．２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３、ｐＤＯＮ−ＡＩなどが好ましい。
上記発現ベクターを宿主細胞に組み込み、形質転換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。該形質転換体を得るための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト（例えば、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０、２９３、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）等由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
ところで、β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする核酸は、ヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、真核細胞を形質転換体の宿主細胞として用いることより天然物に近い性質を有したβ３Ｇｎ−Ｔ６が得られる（例えば、糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、宿主細胞としては真核細胞、特に哺乳類細胞を選択することが好ましい。哺乳類細胞としては、具体的には、ヒト由来、マウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、またはサル由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。また、宿主細胞としての大腸菌、酵母または昆虫細胞は、具体的には、大腸菌（ＤＨ５α、ＤＨ１０ＢＡＣ、Ｍ１５Ｍ、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（Ｓｆ２１、Ｓｆ９、ＢｍＮ４、カイコ幼虫等）などが例示される。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを含んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
発現べクタ−において、好ましい開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好ましいプラスミドとしては、大腸菌ではプラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２若しくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばジェネティシン（Ｇ−４１８）、テトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン若しくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション（連結）等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｒの場合は、例えばHinnenらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８））やリチウム法（Ｊ．Ｂ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５））、エレクトロポレ−ション法（Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６））によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３））、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３））によってそれぞれ形質転換することができる。なお、組換えベクターの構築およびそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が実施例１に詳述されている。
（４）タンパク質の単離・精製
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させて、その培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６は、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源若しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源若しくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、β３Ｇｎ−Ｔ６が大量に生産されるように適宜選択される。
β３Ｇｎ−Ｔ６は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、β３Ｇｎ−Ｔ６が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば、濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液であり、ｐＨは用いる緩衝液によって異なるがｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、β３Ｇｎ−Ｔ６が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、β３Ｇｎ−Ｔ６の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、イオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
β３Ｇｎ−Ｔ６はまた、精製および同定を容易にするために添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれるが、これらに限定さるものではない。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３））であり、該ペプチドは非常に抗原性であり、そしてそれぞれに特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。また、４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
具体的には、β３Ｇｎ−Ｔ６を発現する発現ベクターにＦＬＡＧタグのｃＤＮＡを挿入し、標識したβ３Ｇｎ−Ｔ６を発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてβ３Ｇｎ−Ｔ６の発現を確認することができる。
（５）細胞アッセイ
本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６による細胞への効果については、いかなる適切なアッセイによって試験してもよい。細胞アッセイには、癌細胞の移動活性測定、転移測定、および分化測定が含まれる。
細胞移動活性測定は、従来記述されているインビトロ侵入アッセイ（Ｏｋａｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１２，３０５−３１（１９９４））に準じて行うことができる。具体的には、後述する実施例１に記載したように、ラミニンまたは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコートした、ポアサイズが直径８μｍである多孔性ポリカーボネートメンブレンを有するチャンバーを用いて行うことができる。後述する実施例１に示すように、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞およびＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞をそれぞれチャンバーに播種し、該細胞がポアを通過した場合の細胞数によって細胞移動活性を比較することができ、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞における細胞移動活性は、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞と比べて約１／３に抑制された。
細胞の転移測定は、実験動物に細胞を投与し、該細胞が所定の臓器に着床した後に形成した腫瘍を検出することによって行うことができる。本明細書において「転移」というときは、癌（または腫瘍）細胞が原発腫瘍から剥離して血管またはリンパ管を通って遠隔の単一のまたは複数の臓器や組織に移行し、着床、増殖して原発巣と同一病変を発現させることをいう。原発腫瘍から血管またはリンパ管に至るまでの細胞移動、あるいは血管またはリンパ管から遠隔臓器や組織までの浸潤による細胞移動が含まれる。また、癌細胞の原発臓器は、好ましくは胃、結腸、直腸、食道、肺、肝臓、血液（例えば、骨髄、Ｂ細胞、Ｔ細胞）、脳、より好ましくは胃、結腸、直腸、食道、最も好ましくは胃、結腸である。また、転移先の臓器は、好ましくは肺、肝臓、腹膜、より好ましくは肺、肝臓、最も好ましくは肺である。これらの原発臓器と転移先の臓器の組合せは、好ましくは胃−肺、結腸−肺、直腸−肺、食道−肺、結腸−肝臓、直腸−肝臓、胃−腹膜、肝臓−肝臓（肝内転移）、より好ましくは胃−肺、結腸−肺、直腸−肺、食道−肺、最も好ましくは胃−肺、結腸−肺である。腫瘍の検出には、限定されるわけではないが、視覚による観察、組織化学的な観察、蛍光または放射線標識した細胞の生体における分布の観察、臓器の重量測定が例示される。具体的には、後述する実施例２に記載したように、マウスの尾静脈にＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞またはＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞を注入し、所定時間後の該細胞による肺における腫瘍を検出することによって行うことができる。実施例２に示すように、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞による肺への転移は、１００％抑制された。
細胞分化の状態を測定するアッセイでは、細胞特異的な分化マーカーを指標に測定することが可能である。分化マーカーは、限定されるわけではないが、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、アルカリホスファターゼが例示される。本明細書において「分化」というときは、細胞が特定の機能を発現することをいう。例えば、細胞間タイトジャンクションの構成や各種トランスポーターの発現といった小腸上皮様の機能を獲得したり、刷子縁（Ｂｒｕｓｈ ｂｏｒｄｅｒ）を獲得すること、ＤＰＰ−ＩＶ活性が上昇することをいい、細胞の増殖活性が抑制されてもよく、あるいは増殖活性は維持されていてもよい。従来記述される分化状態を測定するアッセイ（Ｎａｇａｔｓｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４，４６６−４７６（１９７６））に準じて、細胞における分化マーカーを定量することによって分化状態を測定することができる。具体的には、実施例３に記載したように、Ｃａｃｏ−２細胞をコンフルエントになるまで培養した後に、該細胞の分化マーカーとして知られるＤＰＰ−ＩＶの活性とβ３Ｇｎ−Ｔ６の転写物の発現レベルを経時的に観察すると、分化マーカーの活性とβ３Ｇｎ−Ｔ６の転写物の発現とは相関（または連動）することが判明した。
（６）医薬組成物
本発明において、β３Ｇｎ−Ｔ６は、癌細胞の移動活性、転移、および／または分化を調節する効果を有することが明らかになった。したがって、本発明の医薬組成物は、細胞移動活性および／または細胞分化を調節することができる。ここで「調節」には、抑制、減少、増強、消失、維持のいずれもが包含される。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物によって、癌細胞の移動活性は、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／３以下、さらに好ましくは１／５以下、さらにより好ましくは１／１０以下、最も好ましくは１／２０以下に抑制される。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物によって、癌細胞の転移は、好ましくは約１０％、より好ましくは約３０％、さらに好ましくは約５０％、さらにより好ましくは約８０％、最も好ましくは約１００％抑制される。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、癌細胞の分化を誘導することができる。分化誘導する細胞数は、好ましくは約２倍、より好ましくは約３倍、さらに好ましくは約５倍、さらにより好ましくは約８倍、最も好ましくは約１０倍増加する。
本発明の医薬組成物に含まれるβ３Ｇｎ−Ｔ６ンパク質または当該タンパク質をコードする核酸は、細胞分化のマーカーとしての使用することができる。β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質を細胞分化のマーカーとして定量する場合には、例えば、該タンパク質を免疫原として作成した国際公報ＷＯ０３／０３３７１０に開示されるモノクローナル抗体を用いることができる。抗体を利用したタンパク質の定量方法としては、当該技術分野における周知な方法、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法を使用することが可能である。また、本発明の糖転移酵素タンパク質の活性を利用することによって、定量することもできる。前記定量値の比は、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上、最も好ましくは３．５倍以上である。β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする核酸を細胞分化のマーカーとして定量する場合には、当該核酸の発現量は、例えば、当該核酸の一部を例えばプライマーとして使用するＰＣＲ法を用いて定量することができる。ＰＣＲ法では、定量的ＰＣＲ法の使用が好ましく、キネティックス分析のためのＲＴ−ＰＣＲ法、定量的リアルタイムＰＣＲ法が例示される。本発明によれば、核酸の定量には、これらに限定されるものではなく、ノーゼンブロット、ドットブロット、ＤＮＡマイクロアレイを使用することも可能である。一方、同一組織等に広く一般的に存在する遺伝子の核酸、例えばグリセルアルデヒド−３リン酸−脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、β−アクチンをコードする核酸を対照として利用することができる。細胞が分化していると判断されるシグナルの定量比は、好ましくは１．５以上、より好ましくは２以上、さらに好ましくは３以上、最も好ましくは３．５以上である。
本発明の医薬組成物は、薬学的に受容可能な担体との混合物中に、β３Ｇｎ−Ｔ６を治療上有効な量を含む。本発明の医薬組成物は、全身的にまたは局所的に、好ましくは静脈内、皮下内、筋肉内に非経口的に投与し得る。非経口的に投与可能なβ３Ｇｎ−Ｔ６の溶液の調剤は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術範囲内において行い得る。
本発明の医薬組成物の用量用法は、薬剤の作用、例えば、患者の症状の性質および／若しくは重度、体重、性別、食餌、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定され得る。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の組成物の用量を決定することができる。
あるいは、β３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸を組込んだ発現ベクターを作製し、生体内の標的部位で発現させるか、あるいは当該発現ベクターを組込んだ細胞を標的部位に輸送させることにより、標的部位の細胞移動活性および／または細胞分化を調節することも可能である。
（７）コア１構造の発現とコア３構造の発現との競合
本発明によれば、本発明の医薬組成物を用いることによって、癌細胞の膜表面に発現する糖鎖構造を改変させることができる。糖鎖構造の改変を検出し、改変した糖鎖の発現を定量的に測定するためには、糖鎖に特異的に結合するレクチンを使用することができる。具体的には、後述する実施例４に記載したように、結腸癌細胞の膜表面に主に発現するコア１構造は、癌細胞へのβ３Ｇｎ−Ｔ６を組み込んだ発現ベクターの導入によって、コア３構造の発現との競合により、顕著に消失した。コア１構造の消失は、好ましくは約１０％以上、より好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上、さらにより好ましくは約７０％以上、最も好ましくは約１００％である。
（８）ノックアウト動物
本発明によりβ３Ｇｎ−Ｔ６の発現が癌細胞の移動、転写、および分化に関与していることが明らかとなったので、実験動物においてβ３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする遺伝子の発現を一部または完全に抑制することによって、インビボにおける詳細な癌転移メカニズの解明に使用されるノックアウト動物を調製することも可能である。ノックアウト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどの哺乳動物が好ましく、ノックアウト動物調製の手法がある程度確立していることから、マウス又はラットが最も好ましいが、これに限定はされない。例えば、ノックアウトマウスは、「ジーンターゲティングの最新技術」（八木健編集、羊土社、２０００年）、ジーンターゲティング（野田哲生監訳、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、１９９５年）などの記載に従って行うことができる。また、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ法（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０１−５５３（２００２））などの「遺伝子発現を抑制する方法」でもノックアウトマウスを作製することができる。
（１）β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３Ｇｎ−Ｔ６）
本発明者らのグループは、既に、β３Ｇｎ−Ｔ６をコードする遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列および推定アミノ酸配列を決定している（国際公開ＷＯ０３／０３３７１０）。β３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸の塩基配列、推定アミノ酸配列、β３Ｇｎ−Ｔ６の酵素としての基質特異性、β３Ｇｎ−Ｔ６に対するモノクローナル抗体、および組織における発現分布に関しては、国際公開ＷＯ０３／０３３７１０に開示される。
本明細書においては、本発明の理解のために、本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６を以下に説明する。なお、本明細書において、ヒトβ３Ｇｎ−Ｔ６をコードしている核酸を配列表の配列番号２に記載し、該核酸がコードする推定アミノ酸配列を配列番号１に記載する。
本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６は、次の性質を有する酵素である。
触媒反応
Ｎ−アセチルガラクトサミニル（ＧａｌＮＡｃ）基にＮ−アセチルグルコサミンをβ１，３結合で転移する（ＥＣ２．４．１．１４７、Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌ−Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｔａ−１，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。触媒する反応を反応式で記載すると、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル−Ｒ ＋ ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン → Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル−１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミニル−Ｒ ＋ ＵＤＰ （ＧａｌＮＡｃ−Ｒ ＋ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ → ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ + ＵＤＰ）となる。
受容体基質特異性
受容体基質は、本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６がＮ−アセチル−Ｄ−グルコース供与体基質からＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を転移し得る基質である限り特に限定されないが、好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、例えばＮ−アセチルガラクトサミンα１−Ｒ（Ｒは、タンパク質中のセリンやスレオニン等の側鎖の水酸基やｐ−ニトロフェノール等の水酸基とエーテル結合した残基）である。
本発明によれば、β３Ｇｎ−Ｔ６を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物が提供される。ここで、β３Ｇｎ−Ｔ６は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は限定されない。即ち、β３Ｇｎ−Ｔ６は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現されたタンパク質、または化学合成タンパク質の何れでもよい。
本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６は、典型的には、配列番号１に記載したアミノ酸残基３８４個からなるアミノ酸配列を有する。しかしながら、天然のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生体型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「変異タンパク質」とは、配列番号１に示されたアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する機能を有するタンパク質等を意味する。ここで、「複数個」とは、好ましくは１−２００個、より好ましくは１−１００個、最も好ましくは１−５０個である。限定されるわけではないが、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性は保存される程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、一般的には、好ましくは１−１０個である。
本発明の医薬組成物に使用されるヒトβ３Ｇｎ−Ｔ６は、好ましくはクローニングされた核酸の塩基配列からの推定に基づいて配列番号１のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特徴を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。同一性は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である。
本明細書において、アミノ酸配列のパーセント同一性は、重複部分と同一性を最大化する一方で、配列ギャップを最小化するように並列した場合のタンパク質（またはポリペプチド）のアミノ酸配列を比較することによって決定される。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。当業者により使用される配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにより使用が可能なＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．２．７）が使用可能である。プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳説されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（保存的置換）（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の保存的変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の医薬組成物に使用することができる。
本発明の医薬組成物に使用されるβ３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質は、例えば、後述の実施例１に従って、本発明の核酸による配列番号２の核酸（好ましくはＤＮＡ）を大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入および発現させることにより大量に得ることができる。
本明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２（１９９７））に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、あるいはＰｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２４４４−２４４８（１９８８））に記載されているＦＡＳＴＡを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた使用可能である。
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、後述する実施例１−３に記載したように、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する機能を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。
（２）β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする核酸
本発明によれば、β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする核酸を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物が提供される。上記核酸は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ、およびそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組合せが含まれる。使用する核酸としては、ＤＮＡが好ましい。本明細書において、ある特定の塩基配列について記載する場合、特に言及しない限り、その相補鎖も含む。
本発明の医薬組成物に使用する核酸は、好ましくは配列番号１に示されるヒトのアミノ酸配列をコードする核酸（その相補体を含む）である。典型的には、配列番号２の塩基配列（その相補体を含む）を有する。天然の核酸の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。使用可能な核酸は、配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸に限定されるわけではなく、β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする全ての核酸を包含する。本発明の医薬組成物に使用する核酸は、好ましくは、配列番号２の塩基配列の第１番目−第１１５２番目の塩基を有する。
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも ７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ Ｄ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９）； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２２（１９９０）； Ｂａｒａｎｙ Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９３（１９９１））および転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））およびＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，ｐ．１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号２に示される塩基配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定されれ；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｂｉａｓｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
（３）組換えベクターと形質転換体
プラスミド等のベクターにβ３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする核酸のＤＮＡ断片を組込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、大腸菌ＤＨ５α、ＤＨ１０ＢＡＣ、ＴＢ１、ＬＥ３９２、ＸＬ−ＬＥ３９２、またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１６．１（２００１）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
ベクターは、簡単には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＴＡＰｌｕｓ、ｐＤｒｉｖｅ、ｐＥＴＢｌｕｅ−１等が例示されるが、これらに限定されない。
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、β３Ｇｎ−Ｔ６を発現させたい宿主細胞に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように発現ベクターは、β３Ｇｎ−Ｔ６が目的の宿主細胞中で発現し得るように遺伝子発現に関与する領域（プロモーター領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらにβ３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。また、発現ベクターの構築は、制限処理および連結作業を必要としない、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を用いても行うことができる。Ｇａｔｅｗａｙシステムとは、ＰＣＲ産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、ＤＮＡ断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、ＰＣＲ産物およびドナーベクターから部位特異的な組換え酵素であるＢＰクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるＬＢクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにＰＣＲ産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間のかかるサブクローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
発現ベクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０等が好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２、ｐＡＵＲ１２３（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡ０８１５（以上ピキア属）、昆虫細胞用発現ベクターとしてｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、哺乳類細胞用発現ベクターとしてｐＤＥＳＴ１２．２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３、ｐＤＯＮ−ＡＩなどが好ましい。
上記発現ベクターを宿主細胞に組み込み、形質転換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。該形質転換体を得るための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト（例えば、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０、２９３、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）等由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
ところで、β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする核酸は、ヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、真核細胞を形質転換体の宿主細胞として用いることより天然物に近い性質を有したβ３Ｇｎ−Ｔ６が得られる（例えば、糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、宿主細胞としては真核細胞、特に哺乳類細胞を選択することが好ましい。哺乳類細胞としては、具体的には、ヒト由来、マウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、またはサル由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。また、宿主細胞としての大腸菌、酵母または昆虫細胞は、具体的には、大腸菌（ＤＨ５α、ＤＨ１０ＢＡＣ、Ｍ１５Ｍ、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（Ｓｆ２１、Ｓｆ９、ＢｍＮ４、カイコ幼虫等）などが例示される。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを含んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
発現べクタ−において、好ましい開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好ましいプラスミドとしては、大腸菌ではプラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２若しくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばジェネティシン（Ｇ−４１８）、テトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン若しくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション（連結）等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｒの場合は、例えばHinnenらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８））やリチウム法（Ｊ．Ｂ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５））、エレクトロポレ−ション法（Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６））によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３））、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３））によってそれぞれ形質転換することができる。なお、組換えベクターの構築およびそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が実施例１に詳述されている。
（４）タンパク質の単離・精製
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させて、その培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６は、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源若しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源若しくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、β３Ｇｎ−Ｔ６が大量に生産されるように適宜選択される。
β３Ｇｎ−Ｔ６は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、β３Ｇｎ−Ｔ６が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば、濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液であり、ｐＨは用いる緩衝液によって異なるがｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、β３Ｇｎ−Ｔ６が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、β３Ｇｎ−Ｔ６の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、イオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
β３Ｇｎ−Ｔ６はまた、精製および同定を容易にするために添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれるが、これらに限定さるものではない。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３））であり、該ペプチドは非常に抗原性であり、そしてそれぞれに特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。また、４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
具体的には、β３Ｇｎ−Ｔ６を発現する発現ベクターにＦＬＡＧタグのｃＤＮＡを挿入し、標識したβ３Ｇｎ−Ｔ６を発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてβ３Ｇｎ−Ｔ６の発現を確認することができる。
（５）細胞アッセイ
本発明の医薬組成物に使用するβ３Ｇｎ−Ｔ６による細胞への効果については、いかなる適切なアッセイによって試験してもよい。細胞アッセイには、癌細胞の移動活性測定、転移測定、および分化測定が含まれる。
細胞移動活性測定は、従来記述されているインビトロ侵入アッセイ（Ｏｋａｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１２，３０５−３１（１９９４））に準じて行うことができる。具体的には、後述する実施例１に記載したように、ラミニンまたは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコートした、ポアサイズが直径８μｍである多孔性ポリカーボネートメンブレンを有するチャンバーを用いて行うことができる。後述する実施例１に示すように、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞およびＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞をそれぞれチャンバーに播種し、該細胞がポアを通過した場合の細胞数によって細胞移動活性を比較することができ、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞における細胞移動活性は、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞と比べて約１／３に抑制された。
細胞の転移測定は、実験動物に細胞を投与し、該細胞が所定の臓器に着床した後に形成した腫瘍を検出することによって行うことができる。本明細書において「転移」というときは、癌（または腫瘍）細胞が原発腫瘍から剥離して血管またはリンパ管を通って遠隔の単一のまたは複数の臓器や組織に移行し、着床、増殖して原発巣と同一病変を発現させることをいう。原発腫瘍から血管またはリンパ管に至るまでの細胞移動、あるいは血管またはリンパ管から遠隔臓器や組織までの浸潤による細胞移動が含まれる。また、癌細胞の原発臓器は、好ましくは胃、結腸、直腸、食道、肺、肝臓、血液（例えば、骨髄、Ｂ細胞、Ｔ細胞）、脳、より好ましくは胃、結腸、直腸、食道、最も好ましくは胃、結腸である。また、転移先の臓器は、好ましくは肺、肝臓、腹膜、より好ましくは肺、肝臓、最も好ましくは肺である。これらの原発臓器と転移先の臓器の組合せは、好ましくは胃−肺、結腸−肺、直腸−肺、食道−肺、結腸−肝臓、直腸−肝臓、胃−腹膜、肝臓−肝臓（肝内転移）、より好ましくは胃−肺、結腸−肺、直腸−肺、食道−肺、最も好ましくは胃−肺、結腸−肺である。腫瘍の検出には、限定されるわけではないが、視覚による観察、組織化学的な観察、蛍光または放射線標識した細胞の生体における分布の観察、臓器の重量測定が例示される。具体的には、後述する実施例２に記載したように、マウスの尾静脈にＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞またはＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞を注入し、所定時間後の該細胞による肺における腫瘍を検出することによって行うことができる。実施例２に示すように、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞による肺への転移は、１００％抑制された。
細胞分化の状態を測定するアッセイでは、細胞特異的な分化マーカーを指標に測定することが可能である。分化マーカーは、限定されるわけではないが、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、アルカリホスファターゼが例示される。本明細書において「分化」というときは、細胞が特定の機能を発現することをいう。例えば、細胞間タイトジャンクションの構成や各種トランスポーターの発現といった小腸上皮様の機能を獲得したり、刷子縁（Ｂｒｕｓｈ ｂｏｒｄｅｒ）を獲得すること、ＤＰＰ−ＩＶ活性が上昇することをいい、細胞の増殖活性が抑制されてもよく、あるいは増殖活性は維持されていてもよい。従来記述される分化状態を測定するアッセイ（Ｎａｇａｔｓｕ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４，４６６−４７６（１９７６））に準じて、細胞における分化マーカーを定量することによって分化状態を測定することができる。具体的には、実施例３に記載したように、Ｃａｃｏ−２細胞をコンフルエントになるまで培養した後に、該細胞の分化マーカーとして知られるＤＰＰ−ＩＶの活性とβ３Ｇｎ−Ｔ６の転写物の発現レベルを経時的に観察すると、分化マーカーの活性とβ３Ｇｎ−Ｔ６の転写物の発現とは相関（または連動）することが判明した。
（６）医薬組成物
本発明において、β３Ｇｎ−Ｔ６は、癌細胞の移動活性、転移、および／または分化を調節する効果を有することが明らかになった。したがって、本発明の医薬組成物は、細胞移動活性および／または細胞分化を調節することができる。ここで「調節」には、抑制、減少、増強、消失、維持のいずれもが包含される。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物によって、癌細胞の移動活性は、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／３以下、さらに好ましくは１／５以下、さらにより好ましくは１／１０以下、最も好ましくは１／２０以下に抑制される。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物によって、癌細胞の転移は、好ましくは約１０％、より好ましくは約３０％、さらに好ましくは約５０％、さらにより好ましくは約８０％、最も好ましくは約１００％抑制される。
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、癌細胞の分化を誘導することができる。分化誘導する細胞数は、好ましくは約２倍、より好ましくは約３倍、さらに好ましくは約５倍、さらにより好ましくは約８倍、最も好ましくは約１０倍増加する。
本発明の医薬組成物に含まれるβ３Ｇｎ−Ｔ６ンパク質または当該タンパク質をコードする核酸は、細胞分化のマーカーとしての使用することができる。β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質を細胞分化のマーカーとして定量する場合には、例えば、該タンパク質を免疫原として作成した国際公報ＷＯ０３／０３３７１０に開示されるモノクローナル抗体を用いることができる。抗体を利用したタンパク質の定量方法としては、当該技術分野における周知な方法、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法を使用することが可能である。また、本発明の糖転移酵素タンパク質の活性を利用することによって、定量することもできる。前記定量値の比は、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上、最も好ましくは３．５倍以上である。β３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする核酸を細胞分化のマーカーとして定量する場合には、当該核酸の発現量は、例えば、当該核酸の一部を例えばプライマーとして使用するＰＣＲ法を用いて定量することができる。ＰＣＲ法では、定量的ＰＣＲ法の使用が好ましく、キネティックス分析のためのＲＴ−ＰＣＲ法、定量的リアルタイムＰＣＲ法が例示される。本発明によれば、核酸の定量には、これらに限定されるものではなく、ノーゼンブロット、ドットブロット、ＤＮＡマイクロアレイを使用することも可能である。一方、同一組織等に広く一般的に存在する遺伝子の核酸、例えばグリセルアルデヒド−３リン酸−脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、β−アクチンをコードする核酸を対照として利用することができる。細胞が分化していると判断されるシグナルの定量比は、好ましくは１．５以上、より好ましくは２以上、さらに好ましくは３以上、最も好ましくは３．５以上である。
本発明の医薬組成物は、薬学的に受容可能な担体との混合物中に、β３Ｇｎ−Ｔ６を治療上有効な量を含む。本発明の医薬組成物は、全身的にまたは局所的に、好ましくは静脈内、皮下内、筋肉内に非経口的に投与し得る。非経口的に投与可能なβ３Ｇｎ−Ｔ６の溶液の調剤は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術範囲内において行い得る。
本発明の医薬組成物の用量用法は、薬剤の作用、例えば、患者の症状の性質および／若しくは重度、体重、性別、食餌、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定され得る。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の組成物の用量を決定することができる。
あるいは、β３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸を組込んだ発現ベクターを作製し、生体内の標的部位で発現させるか、あるいは当該発現ベクターを組込んだ細胞を標的部位に輸送させることにより、標的部位の細胞移動活性および／または細胞分化を調節することも可能である。
（７）コア１構造の発現とコア３構造の発現との競合
本発明によれば、本発明の医薬組成物を用いることによって、癌細胞の膜表面に発現する糖鎖構造を改変させることができる。糖鎖構造の改変を検出し、改変した糖鎖の発現を定量的に測定するためには、糖鎖に特異的に結合するレクチンを使用することができる。具体的には、後述する実施例４に記載したように、結腸癌細胞の膜表面に主に発現するコア１構造は、癌細胞へのβ３Ｇｎ−Ｔ６を組み込んだ発現ベクターの導入によって、コア３構造の発現との競合により、顕著に消失した。コア１構造の消失は、好ましくは約１０％以上、より好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上、さらにより好ましくは約７０％以上、最も好ましくは約１００％である。
（８）ノックアウト動物
本発明によりβ３Ｇｎ−Ｔ６の発現が癌細胞の移動、転写、および分化に関与していることが明らかとなったので、実験動物においてβ３Ｇｎ−Ｔ６タンパク質をコードする遺伝子の発現を一部または完全に抑制することによって、インビボにおける詳細な癌転移メカニズの解明に使用されるノックアウト動物を調製することも可能である。ノックアウト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどの哺乳動物が好ましく、ノックアウト動物調製の手法がある程度確立していることから、マウス又はラットが最も好ましいが、これに限定はされない。例えば、ノックアウトマウスは、「ジーンターゲティングの最新技術」（八木健編集、羊土社、２０００年）、ジーンターゲティング（野田哲生監訳、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、１９９５年）などの記載に従って行うことができる。また、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ法（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０１−５５３（２００２））などの「遺伝子発現を抑制する方法」でもノックアウトマウスを作製することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１ インビトロ細胞移動活性
（１）哺乳動物の培養細胞におけるβ３Ｇｎ−Ｔ６の安定発現のためのベクタープラスミドの構築
テンプレートとしてヒトの胃組織のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、β３Ｇｎ−Ｔ６をコードするＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）のフラグメントをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、ＬＡＰＣＲ（商標）キット（ＴＡＫＡＲＡ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を用い、製品に添付されたマニュアルに従って行った。フォワード及びリバースプライマー配列をそれぞれａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２で隣接するようにし、組換え部位を作製した。フォワードプライマーは、５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＧ−３’（配列番号４）（ヌクレオチド３２−５２は、配列番号２のヌクレオチド１−２１に相当し、配列番号１のアミノ酸１−７に対応する）であり、リバースプライマーは、５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧ−３’（配列番号５）（ヌクレオチド３９−５０は、配列番号２のヌクレオチド１１５２−１１４１に相当し、配列番号１のアミノ酸３８４−３８１に対応する）であった。増幅したフラグメントは、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１エントリーベクターのａｔｔＰ１とａｔｔＰ２部位との間に挿入し、その後、インサートをＧＡＴＥＷＡＹシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＤＥＳＴ１２．２哺乳動物用の発現ベクターに移した。プラスミドをｐＤＥＳＴ１２．２−β３Ｇｎ−Ｔ６と命名した。
（２）細胞培養とトランスフェクション
ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０細胞は、ヒト線維肉腫細胞の非常に転移性の変異株であり、細胞移動活性に使用した。リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、上記で調製したｐＤＥＳＴ１２．２−β３Ｇｎ−Ｔ６発現プラスミドをＨＴ１０８０ ＦＰ−１０細胞にトランスフェクトした。細胞培養では、ＭＥＭ培地に１０％熱不活化ウシ胎児血清、１％ＭＥＭ−非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および２０ｍＭ ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルフォネート（ＨＥＰＥＳ）を添加した培地を用いた。ジェネティシン（１．０ｍｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、上記発現プラスミドが導入された細胞を選択した。Ｇ−４１８を含む培地で３週間培養後、トリプシンで細胞を剥がし、連続してジェネティシンで選択し、９６ウェルプレート中で限界希釈によってクローニングした。β３Ｇｎ−Ｔ６を安定に発現するクローン細胞株（ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６−１）、およびクローン模擬（ｍｏｃｋ）対照細胞株（ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ）を確立した。
インビトロでの細胞移動アッセイは、以前にインビトロ侵入アッセイ（Ｏｋａｄａら、１９９４）として記載した方法より簡略したシステムで行った。ラミニン（ＴＡＫＡＲＡ）または細胞外マトリックス（ＥＣＭ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＭＡ）でコートした８μｍの多孔性ポリカーボネートメンブレンを有する滅菌チャンバーを２４ウェル組織培養プレートに配置した。ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０形質転換細胞（８×１０４細胞／ウェル）をメンブレン上に播種し、１８時間培養した。多孔性メンブレンの穴を通過した細胞をカウントすることによって細胞移動活性を測定した。
ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞の細胞移動活性の結果を図２に示した。ラミニンおよびＥＣＭの両方の基質において、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞の移動活性は、対照のＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞と比較して、明らかに約１／３まで減少していた。図２のパネルＡは、ラミニンを細胞の培養基質とした場合における細胞移動活性の比較を示す。対照であるＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞では、培養１８時間後においてメンブレンを通過した細胞数は約１７，６００個であり、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞では約５，２００個であった（図２Ａ）。一方、ＥＣＭを培養基質とした場合においては、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞では約２０，７００個であり、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞では約８，２００個であった（図２Ｂ）。なお、これらの細胞の継代培養において、細胞増殖率に顕著な相違はなかった（データ示さず）。
実施例２ 癌転移抑制
実施例１で調製したＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞とＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞のインビボ転写活性を比較した。具体的には、７週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃＡ ｎｕ／ｎｕマウスをＣｌｅａ Ｊａｐａｎ Ｉｎｃ．（Ｔｏｋｙｏ）から入手し、本実験に使用した。２×１０６細胞（ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０細胞、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞、又はＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞）をそれぞれ０．５ｍｌのＭＥＭ培地に懸濁させ、各８匹のマウスの尾静脈に注射（ｉ．ｖ．）した。対照として、０．５ｍｌのＭＥＭ培地をマウスの尾静脈に注射した。４８時間後にマウスを屠殺し、肺の重量を測定した。その後、転移の小瘤を視覚化するために、Ｂｏｕｉｎ溶液に浸した（表１）。
対照であるＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞を尾静脈に投与した場合には、８匹のマウス全部において肺への転移が観察された。これに対して、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞を投与した場合においては、肺へ転移したマウスはなかった。また、各実験群の８匹のマウスの肺の重量を測定した場合、対照のＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞を投与した場合には平均０．３８ｇであり、これに対してＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞を投与した場合には平均０．１５ｇであった。これは、ＭＥＭ培地のみ投与した場合と同様の測定値であった。
また、各実験群のマウスにおける肺の立体顕微鏡による観察結果を図３に示す。図３のパネルＡおよびＢは、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞を投与したマウスの肺であり、パネルＡは肺の正面、パネルＢは肺の裏面を示す。該細胞を投与した場合では、典型的な癌の小瘤が観察された。一方、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞（パネルＣおよびＤ）、およびＭＥＭ培地のみ（パネルＥおよびＦ）を投与した場合には、癌の小瘤は全く観察されなかった。
これらの結果は、β３Ｇｎ−Ｔ６発現によって、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０細胞による肺への転写活性が抑制されたことを示している。
実施例３ 細胞分化の誘導
β３Ｇｎ−Ｔ６の発現が分化の進行の過程で上方制御されるかを評価するために、ヒト結腸腺癌細胞株であるＣａｃｏ−２細胞のインビトロ分化システムを用いて行った。Ｃａｃｏ−２細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２９２ｍｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミンを添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、５％ ＣＯ２下、３７℃で増殖させた。培養液を一日おきに取り替えた。Ｃａｃｏ−２細胞は、２ｍＭ 酪酸ナトリウム（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｏｓａｋａ）を培地に添加することによってコンフルエントにし分化させた。コンフルエント後、０、７、１４、２１、２８、及び３５日目に細胞を回収した。細胞を０．２５％ トリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、ＰＢＳで２回洗浄後、２つのアリコートに分割した。アリコートの１つを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２で０．２５Ｍ ショ糖でホモジナイズした。細胞溶解物を使用まで−８０℃で保存した。分化状態は、前述のように（Ｎａｇａｔｓｕら、１９７６）、分化マーカーとしてジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）の酵素活性を測定することによって確認した。もう１つのアリコートは、β３Ｇｎ−Ｔ６転写物を定量解析するために使用した。
細胞分化の誘導およびβ３Ｇｎ−Ｔ６の転写物量の測定結果を図４に示した。図４中の折れ線グラフは、ＤＰＰ−ＩＶの酵素活性（ｍＵ／ｍｇタンパク質）の経時的変化を示す。Ｃａｃｏ−２細胞がコンフルエントになった後（０日目）、ＤＰＰ−ＩＶの酵素活性は経時的に増加し、培養２８日目で最大に達した。また、図４中の棒グラフは、β３Ｇｎ−Ｔ６転写物の発現を経時的に示したものであり、培養０日目を１とした変化率を示す。培養０日目では、β３Ｇｎ−Ｔ６転写物のほんの数コピーが未分化のＣａｃｏ−２細胞で検出された。β３Ｇｎ−Ｔ６転写物の発現レベルは経時的に増加し、培養開始後２８日目で最大に達した。このように、Ｃａｃｏ−２細胞の分化の過程で、ＤＰＰ−ＶＩの酵素活性の増加とβ３Ｇｎ−Ｔ６転写物の発現レベルの増加は連動し、相関していることが示された。
実施例４ コア１構造の発現とコア３構造の発現との競合
上述したように、コア１構造とコア３構造は、Ｔｎ抗原を基質として、それぞれＣ１Ｇａｌ−Ｔおよびβ３Ｇｎ−Ｔ６の機能によって調整される（図１）。そこで、上記で調製したＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞においては、β３Ｇｎ−Ｔ６が優位に発現し、細胞膜表面にコア３構造を発現するのかを検討した。具体的には、コア１構造（Ｔ抗原）に特異的に結合するピーナッツアグルチニンレクチン（ＰＮＡレクチン；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．、ＣＡ）を用いて、フローサイトメトリーによりコア１構造の発現を指標に測定した。予めＰＮＡレクチンをＦＩＴＣで標識し、また、上記細胞をノイラミニダーゼ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）で処理した。培養細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）でフローサイトメトリー解析に供した。
フローサイトメトリーの結果を図５に示す。ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞の結果は太線で示され、蛍光強度として３×１０１−９×１０２に細胞が集積している。これに対して、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞（細線）では、４×１０２−７×１０３に細胞が集積している。即ち、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞におけるコア１構造の細胞表面での発現は、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞と比較して、約１／１０に減少していた。以上の結果は、Ｏ−グリカンのコア構造合成の経路（図１）を考慮すると、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ（コア１ β３Ｇａｌ−Ｔ）によって仕向けられたコア１構造の合成は、β３Ｇｎ−Ｔ６（コア３ β３Ｇｎ−Ｔ）によって仕向けられたコア３構造の合成によって妨げられたものと考えられる。これは、コア１構造の発現の減少がβ３Ｇｎ−Ｔ６の過剰発現によって起こり、そして、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔおよびβ３Ｇｎ−Ｔ６が細胞中でＴｎ抗原に対して確かに競合することを強く示している。
実施例５ ノックアウトマウスの作製
マウスβ３Ｇｎ−Ｔ６のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は１つのエキソン上に存在しているので、このエキソンを含む染色体断片（約１０ｋｂ）を挿入したターゲティングベクターを作製した。マウスβ３Ｇｎ−Ｔ６は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、該タンパク質をコードする核酸の塩基配列を配列番号７に示す。直鎖状ターゲティングベクター（２０μｇ×４回分）をＥＳ細胞（Ｅ１４／１２９Ｓｖマウス由来）にトランスフェクト（エレクトロポレート）し、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択する。Ｇ４１８耐性コロニーを２４ウェルプレートに移し培養する。細胞の一部を凍結保存した後、残りのＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより組換えが起こっているクローンを選択する。サザンブロッティングにより組換えが予定通りに起こっていることを確認し、最終的に組換え体を５クローン程度選択する。選択したうちの２クローンのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞内に注入する（注入は２回行うため合計４クローンを使用する）。ＥＳ細胞を注入したマウス胚を仮親マウスの子宮内へ移植してキメラマウスを誕生させる。その後、ジャームライントランスミッションによりヘテロノックアウトマウスを得る。さらに、ヘテロノックアウトマウスを交配させ、ホモノックアウトマウスを得る。
実施例１ インビトロ細胞移動活性
（１）哺乳動物の培養細胞におけるβ３Ｇｎ−Ｔ６の安定発現のためのベクタープラスミドの構築
テンプレートとしてヒトの胃組織のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、β３Ｇｎ−Ｔ６をコードするＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）のフラグメントをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、ＬＡＰＣＲ（商標）キット（ＴＡＫＡＲＡ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を用い、製品に添付されたマニュアルに従って行った。フォワード及びリバースプライマー配列をそれぞれａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２で隣接するようにし、組換え部位を作製した。フォワードプライマーは、５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＧ−３’（配列番号４）（ヌクレオチド３２−５２は、配列番号２のヌクレオチド１−２１に相当し、配列番号１のアミノ酸１−７に対応する）であり、リバースプライマーは、５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＴＧ−３’（配列番号５）（ヌクレオチド３９−５０は、配列番号２のヌクレオチド１１５２−１１４１に相当し、配列番号１のアミノ酸３８４−３８１に対応する）であった。増幅したフラグメントは、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１エントリーベクターのａｔｔＰ１とａｔｔＰ２部位との間に挿入し、その後、インサートをＧＡＴＥＷＡＹシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＤＥＳＴ１２．２哺乳動物用の発現ベクターに移した。プラスミドをｐＤＥＳＴ１２．２−β３Ｇｎ−Ｔ６と命名した。
（２）細胞培養とトランスフェクション
ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０細胞は、ヒト線維肉腫細胞の非常に転移性の変異株であり、細胞移動活性に使用した。リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、上記で調製したｐＤＥＳＴ１２．２−β３Ｇｎ−Ｔ６発現プラスミドをＨＴ１０８０ ＦＰ−１０細胞にトランスフェクトした。細胞培養では、ＭＥＭ培地に１０％熱不活化ウシ胎児血清、１％ＭＥＭ−非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および２０ｍＭ ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルフォネート（ＨＥＰＥＳ）を添加した培地を用いた。ジェネティシン（１．０ｍｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、上記発現プラスミドが導入された細胞を選択した。Ｇ−４１８を含む培地で３週間培養後、トリプシンで細胞を剥がし、連続してジェネティシンで選択し、９６ウェルプレート中で限界希釈によってクローニングした。β３Ｇｎ−Ｔ６を安定に発現するクローン細胞株（ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６−１）、およびクローン模擬（ｍｏｃｋ）対照細胞株（ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ）を確立した。
インビトロでの細胞移動アッセイは、以前にインビトロ侵入アッセイ（Ｏｋａｄａら、１９９４）として記載した方法より簡略したシステムで行った。ラミニン（ＴＡＫＡＲＡ）または細胞外マトリックス（ＥＣＭ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＭＡ）でコートした８μｍの多孔性ポリカーボネートメンブレンを有する滅菌チャンバーを２４ウェル組織培養プレートに配置した。ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０形質転換細胞（８×１０４細胞／ウェル）をメンブレン上に播種し、１８時間培養した。多孔性メンブレンの穴を通過した細胞をカウントすることによって細胞移動活性を測定した。
ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞の細胞移動活性の結果を図２に示した。ラミニンおよびＥＣＭの両方の基質において、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞の移動活性は、対照のＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞と比較して、明らかに約１／３まで減少していた。図２のパネルＡは、ラミニンを細胞の培養基質とした場合における細胞移動活性の比較を示す。対照であるＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞では、培養１８時間後においてメンブレンを通過した細胞数は約１７，６００個であり、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞では約５，２００個であった（図２Ａ）。一方、ＥＣＭを培養基質とした場合においては、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞では約２０，７００個であり、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞では約８，２００個であった（図２Ｂ）。なお、これらの細胞の継代培養において、細胞増殖率に顕著な相違はなかった（データ示さず）。
実施例２ 癌転移抑制
実施例１で調製したＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞とＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞のインビボ転写活性を比較した。具体的には、７週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃＡ ｎｕ／ｎｕマウスをＣｌｅａ Ｊａｐａｎ Ｉｎｃ．（Ｔｏｋｙｏ）から入手し、本実験に使用した。２×１０６細胞（ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０細胞、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞、又はＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞）をそれぞれ０．５ｍｌのＭＥＭ培地に懸濁させ、各８匹のマウスの尾静脈に注射（ｉ．ｖ．）した。対照として、０．５ｍｌのＭＥＭ培地をマウスの尾静脈に注射した。４８時間後にマウスを屠殺し、肺の重量を測定した。その後、転移の小瘤を視覚化するために、Ｂｏｕｉｎ溶液に浸した（表１）。
また、各実験群のマウスにおける肺の立体顕微鏡による観察結果を図３に示す。図３のパネルＡおよびＢは、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞を投与したマウスの肺であり、パネルＡは肺の正面、パネルＢは肺の裏面を示す。該細胞を投与した場合では、典型的な癌の小瘤が観察された。一方、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞（パネルＣおよびＤ）、およびＭＥＭ培地のみ（パネルＥおよびＦ）を投与した場合には、癌の小瘤は全く観察されなかった。
これらの結果は、β３Ｇｎ−Ｔ６発現によって、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０細胞による肺への転写活性が抑制されたことを示している。
実施例３ 細胞分化の誘導
β３Ｇｎ−Ｔ６の発現が分化の進行の過程で上方制御されるかを評価するために、ヒト結腸腺癌細胞株であるＣａｃｏ−２細胞のインビトロ分化システムを用いて行った。Ｃａｃｏ−２細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．２９２ｍｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミンを添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、５％ ＣＯ２下、３７℃で増殖させた。培養液を一日おきに取り替えた。Ｃａｃｏ−２細胞は、２ｍＭ 酪酸ナトリウム（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｏｓａｋａ）を培地に添加することによってコンフルエントにし分化させた。コンフルエント後、０、７、１４、２１、２８、及び３５日目に細胞を回収した。細胞を０．２５％ トリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、ＰＢＳで２回洗浄後、２つのアリコートに分割した。アリコートの１つを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２で０．２５Ｍ ショ糖でホモジナイズした。細胞溶解物を使用まで−８０℃で保存した。分化状態は、前述のように（Ｎａｇａｔｓｕら、１９７６）、分化マーカーとしてジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）の酵素活性を測定することによって確認した。もう１つのアリコートは、β３Ｇｎ−Ｔ６転写物を定量解析するために使用した。
細胞分化の誘導およびβ３Ｇｎ−Ｔ６の転写物量の測定結果を図４に示した。図４中の折れ線グラフは、ＤＰＰ−ＩＶの酵素活性（ｍＵ／ｍｇタンパク質）の経時的変化を示す。Ｃａｃｏ−２細胞がコンフルエントになった後（０日目）、ＤＰＰ−ＩＶの酵素活性は経時的に増加し、培養２８日目で最大に達した。また、図４中の棒グラフは、β３Ｇｎ−Ｔ６転写物の発現を経時的に示したものであり、培養０日目を１とした変化率を示す。培養０日目では、β３Ｇｎ−Ｔ６転写物のほんの数コピーが未分化のＣａｃｏ−２細胞で検出された。β３Ｇｎ−Ｔ６転写物の発現レベルは経時的に増加し、培養開始後２８日目で最大に達した。このように、Ｃａｃｏ−２細胞の分化の過程で、ＤＰＰ−ＶＩの酵素活性の増加とβ３Ｇｎ−Ｔ６転写物の発現レベルの増加は連動し、相関していることが示された。
実施例４ コア１構造の発現とコア３構造の発現との競合
上述したように、コア１構造とコア３構造は、Ｔｎ抗原を基質として、それぞれＣ１Ｇａｌ−Ｔおよびβ３Ｇｎ−Ｔ６の機能によって調整される（図１）。そこで、上記で調製したＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞においては、β３Ｇｎ−Ｔ６が優位に発現し、細胞膜表面にコア３構造を発現するのかを検討した。具体的には、コア１構造（Ｔ抗原）に特異的に結合するピーナッツアグルチニンレクチン（ＰＮＡレクチン；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．、ＣＡ）を用いて、フローサイトメトリーによりコア１構造の発現を指標に測定した。予めＰＮＡレクチンをＦＩＴＣで標識し、また、上記細胞をノイラミニダーゼ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）で処理した。培養細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）でフローサイトメトリー解析に供した。
フローサイトメトリーの結果を図５に示す。ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞の結果は太線で示され、蛍光強度として３×１０１−９×１０２に細胞が集積している。これに対して、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞（細線）では、４×１０２−７×１０３に細胞が集積している。即ち、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／β３Ｇｎ−Ｔ６細胞におけるコア１構造の細胞表面での発現は、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０／ｍｏｃｋ細胞と比較して、約１／１０に減少していた。以上の結果は、Ｏ−グリカンのコア構造合成の経路（図１）を考慮すると、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ（コア１ β３Ｇａｌ−Ｔ）によって仕向けられたコア１構造の合成は、β３Ｇｎ−Ｔ６（コア３ β３Ｇｎ−Ｔ）によって仕向けられたコア３構造の合成によって妨げられたものと考えられる。これは、コア１構造の発現の減少がβ３Ｇｎ−Ｔ６の過剰発現によって起こり、そして、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔおよびβ３Ｇｎ−Ｔ６が細胞中でＴｎ抗原に対して確かに競合することを強く示している。
実施例５ ノックアウトマウスの作製
マウスβ３Ｇｎ−Ｔ６のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は１つのエキソン上に存在しているので、このエキソンを含む染色体断片（約１０ｋｂ）を挿入したターゲティングベクターを作製した。マウスβ３Ｇｎ−Ｔ６は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、該タンパク質をコードする核酸の塩基配列を配列番号７に示す。直鎖状ターゲティングベクター（２０μｇ×４回分）をＥＳ細胞（Ｅ１４／１２９Ｓｖマウス由来）にトランスフェクト（エレクトロポレート）し、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択する。Ｇ４１８耐性コロニーを２４ウェルプレートに移し培養する。細胞の一部を凍結保存した後、残りのＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより組換えが起こっているクローンを選択する。サザンブロッティングにより組換えが予定通りに起こっていることを確認し、最終的に組換え体を５クローン程度選択する。選択したうちの２クローンのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞内に注入する（注入は２回行うため合計４クローンを使用する）。ＥＳ細胞を注入したマウス胚を仮親マウスの子宮内へ移植してキメラマウスを誕生させる。その後、ジャームライントランスミッションによりヘテロノックアウトマウスを得る。さらに、ヘテロノックアウトマウスを交配させ、ホモノックアウトマウスを得る。
本発明のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶＩ（β３Ｇｎ−Ｔ６）を含む医薬組成物を用いることによって、細胞移動活性および／または細胞分化を調節することができた。したがって、本発明の医薬組成物により、癌細胞の移動、転写を抑制することが可能となった。
Claims (11)
- β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＶＩ（β３Ｇｎ−Ｔ６）を含む、癌転移の抑制用のおよび／または結腸腺癌の細胞分化の誘導用の医薬組成物。
- β３Ｇｎ−Ｔ６が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、あるいは該配列において１−１０個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列において１−１０個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１に記載の医薬組成物。
- β３Ｇｎ−Ｔ６が、配列番号２において少なくとも９５％の同一性を有する核酸によりコードされるタンパク質である、請求項２に記載の医薬組成物。
- β３Ｇｎ−Ｔ６が、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項２または３に記載の医薬組成物。
- 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のβ３Ｇｎ−Ｔ６をコードする核酸を含む、癌転移の抑制用のおよび／または結腸腺癌の細胞分化の誘導用の医薬組成物。
- 前記核酸が、配列番号２の塩基配列を有する核酸と高ストリンジェントな条件下（６５℃、０．２×ＳＳＣ）でハイブリダイズする、請求項５に記載の医薬組成物。
- 核酸が配列番号２の塩基配列の第１番目−第１１５２番目の塩基を有する、請求項５または６に記載の医薬組成物。
- 細胞移動活性を抑制する、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 転移が抑制される癌細胞が、胃、結腸、直腸、食道、肺、肝臓、血液、または脳由来である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
- 前記癌細胞による肺、肝臓、または腹膜への転移を抑制する、請求項９に記載の医薬組成物。
- Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−セリン／スレオニン（コア１構造）の発現を抑制する、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004200261A JP4565177B2 (ja) | 2004-07-07 | 2004-07-07 | β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004200261A JP4565177B2 (ja) | 2004-07-07 | 2004-07-07 | β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006022027A JP2006022027A (ja) | 2006-01-26 |
| JP4565177B2 true JP4565177B2 (ja) | 2010-10-20 |
Family
ID=35795565
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004200261A Expired - Fee Related JP4565177B2 (ja) | 2004-07-07 | 2004-07-07 | β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4565177B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009018999A (ja) * | 2007-07-10 | 2009-01-29 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 抗癌剤抵抗性の抑制剤 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002018602A1 (fr) * | 2000-09-01 | 2002-03-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau polypeptide |
| WO2003033710A1 (fr) * | 2001-10-16 | 2003-04-24 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Nouvelle n-acetylglucosamine transferase, acide nucleique codant cette enzyme, anticorps dirige contre cette enzyme et utilisation de l'enzyme pour diagnostiquer un cancer ou une tumeur |
-
2004
- 2004-07-07 JP JP2004200261A patent/JP4565177B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002018602A1 (fr) * | 2000-09-01 | 2002-03-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau polypeptide |
| WO2003033710A1 (fr) * | 2001-10-16 | 2003-04-24 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Nouvelle n-acetylglucosamine transferase, acide nucleique codant cette enzyme, anticorps dirige contre cette enzyme et utilisation de l'enzyme pour diagnostiquer un cancer ou une tumeur |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2006022027A (ja) | 2006-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kudo et al. | Expression cloning and characterization of a novel murine α1, 3-fucosyltransferase, mFuc-TIX, that synthesizes the Lewis x (CD15) epitope in brain and kidney | |
| JP2010154857A (ja) | 有用ポリペプチド | |
| US8278037B2 (en) | N-acetylgalactosamine transferases and nucleic acids encoding the same | |
| WO2000006708A1 (fr) | Nouveau polypeptide | |
| JP4565177B2 (ja) | β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を含む、細胞移動活性および／または細胞分化を調節する医薬組成物 | |
| US8431365B2 (en) | β1,3-N-acetyl-D-galactosamine transferase protein, nucleic acid encoding the same and method of examining canceration using the same | |
| US20090081668A1 (en) | Glycosyltransferase, nucleic acid encoding the glycosyltransferase and method of testing canceration using the nucleic acid | |
| JP5105261B2 (ja) | β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン転移酵素タンパク質及びそれをコードする核酸、並びにそれを用いた癌化検定方法 | |
| JP5083593B2 (ja) | 精巣に発現する糖鎖関連酵素調節因子ｏ−１６ | |
| JP4251402B2 (ja) | Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体 | |
| JP4911403B2 (ja) | グルコース転移酵素を含む糖転移作用剤 | |
| WO2004039976A1 (ja) | 糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を用いた癌組織の検出方法 | |
| JP2004267015A (ja) | 核酸及び該核酸を用いた癌化検定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061013 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20071113 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20071113 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091117 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100118 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100208 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100507 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100608 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100629 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100708 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100708 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130813 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |