WO2004039976A1 - 糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を用いた癌組織の検出方法 - Google Patents

糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を用いた癌組織の検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2004039976A1
WO2004039976A1 PCT/JP2003/013957 JP0313957W WO2004039976A1 WO 2004039976 A1 WO2004039976 A1 WO 2004039976A1 JP 0313957 W JP0313957 W JP 0313957W WO 2004039976 A1 WO2004039976 A1 WO 2004039976A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
acetyl
protein
seq
present
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/013957
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hisashi Narimatsu
Toru Hiruma
Akira Togayachi
Shoko Nishihara
Original Assignee
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Fujirebio Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology, Fujirebio Inc. filed Critical National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Priority to AU2003280655A priority Critical patent/AU2003280655A1/en
Publication of WO2004039976A1 publication Critical patent/WO2004039976A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91091—Glycosyltransferases (2.4)

Definitions

  • the present invention relates to a glycosyltransferase, a nucleic acid encoding the same, and a method for detecting a cancer tissue using the nucleic acid.
  • the present invention relates to a novel “glycosyltransferase” and a “nucleic acid” encoding the same, and also relates to a “tissue canceration detection method” based on an increase in the expression level of the nucleic acid in a cancerous tissue.
  • N-acetyl-D-darcosamine residue (GlcNAc) is a constituent component of glycosaminodalican and a sugar residue present in various glycan structures such as glycosphingolipids, mucin-type glycans. Therefore, enzymes that transfer GlcNAc are extremely important tools for analyzing the functions of sugar chains that work in various tissues in the body.
  • sugar chain synthesis in vivo Although the function of sugar chains in vivo is attracting attention, analysis of sugar chain synthesis in vivo is not sufficient. It cannot be said that it has advanced to. One reason is that the mechanism of sugar chain synthesis and the localization of sugar synthesis in vivo have not been sufficiently analyzed. In analyzing the mechanism of sugar chain synthesis, it is necessary to analyze sugar chain synthases, especially glycosyltransferases, and analyze what kind of sugar chains are produced using the enzymes. Therefore, there is an increasing demand for finding new glycosyltransferases and analyzing their functions.
  • the present invention provides a novel ⁇ 1,3, N-acetyl-D-darcosamine glycosyltransferase protein having an activity of transferring an N-acetyl-D-darcosamine residue to an N-acetyl-D-darcosamine receptor substrate.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant expressing the nucleic acid in a host cell, and a method for growing the transformant and isolating the protein.
  • the present invention provides a method for assaying for canceration of a biological sample using the expression of the nucleic acid or the glycosyltransferase protein as an indicator.
  • FIG. 1 is a graph showing the influence of the reaction PH, various divalent metal ions, and EDTA on the activity of the protein of the present invention.
  • Black triangles indicate manganese ions
  • black circles indicate cobalt ions
  • black squares indicate magnesium ions
  • white triangles indicate EDTA
  • white circles and diamonds indicate negative controls, respectively.
  • the vertical axis shows the amount of radioactivity (dpm)
  • the horizontal axis shows the reaction pH.
  • the present inventors have tried to isolate and purify an enzyme of interest, which is considered to have high sequence identity, based on the base sequence of an enzyme gene having a similar action to the enzyme of interest. Specifically, first, a BLAST search was performed using the nucleotide sequence of a known glycosyltransferase, 3glucuronyltransferase 7 ( ⁇ 3GnT7), as a result, and as a result, EST was found to be a homologous sequence. Sequence (GenBank Accession on No. BC004908) was found. Furthermore, the gene of the protein was successfully cloned by PCR, and its nucleotide sequence and deduced amino acids were determined.
  • the inventors have found that the protein encoded by the nucleic acid is a novel glycosyltransferase. Further, in a cancerous tissue, the nucleic acid The present inventors have found that the expression level is higher than that in healthy tissues, and applied this to a method for detecting canceration in tissues, thereby completing the present invention.
  • the present invention contributes to satisfying these various needs in the art by providing proteins having an activity to transfer N-acetyltilcosamine and nucleic acids encoding them.
  • the present invention is as follows.
  • 1,3-N-acetyl-D-darcosamine glycosyltransferase protein having the following properties:
  • Substrate specificity (1) GalNAc, (2) GlcNAc, (3) GaK (4) Xyl, (5) Fuc, (6) Man, (7) ManNAc, (8) Gal jS l—4Glc, and (9) ) Transfer N-acetyl-D-dalcosamine residue from N-acetyl-D-dalcosamine donor substrate to any N-acetyl-D-dalcosamine acceptor substrate of Gal j8 1-4GlcNAc.
  • GalNAc indicates an N-acetyl-D-galactosamine residue
  • GlcNAc indicates an N-acetyl-D-dalcosamine residue
  • Gal indicates a D-galactose residue
  • Xyl indicates a D-xylose residue
  • Fuc indicates a D-fucose residue
  • Man indicates a D-mannose residue
  • ManNAcJ is N-acetyl-D —Indicates a mannose residue
  • — indicates a glycosidic bond.
  • the number in the formula indicates the carbon number of the sugar where the glycosidic bond exists.
  • "" Indicates a Anoma of the glycoside linkage thereof the 1-position of the sugar ring, the positional relationship between the 5-position CH 2 0H or CH 3 shows those cis in "i3".
  • Metal ion requirement Divalent metal cation is required for enzyme reaction.
  • (B) The amino acid sequence consisting of amino acid numbers 56 to 402 described in SEQ ID NO: 2 Wherein one or more amino acids have a substituted, deleted, or inserted amino acid sequence, and the N-acetyl-D-dalcosamine acceptor substrate is converted from an N-acetyl-D-dalcosamine donor substrate to an N-acetyl-D- A polypeptide having an activity of transferring a dalcosamine residue.
  • glycosyltransferase protein according to (2) wherein the polypeptide of (2) has an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 56 to 402 of SEQ ID NO: 2.
  • glycosyltransferase protein according to (2) wherein the polypeptide of (2) has an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 1 to 402 of SEQ ID NO: 2.
  • glycosyltransferase according to any of (2) or (4), wherein the glycosyltransferase protein has an amino acid sequence at least 50% identical to the amino acid sequence consisting of amino acids 56 to 402 of SEQ ID NO: 2; protein.
  • a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the protein according to any one of (2) to (5) or a nucleotide sequence complementary thereto.
  • nucleic acid according to (6) comprising a base sequence consisting of base numbers 166 to 1206 of SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary thereto.
  • nucleic acid according to (6) comprising a base sequence consisting of base numbers 1 to 1206 of SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary thereto.
  • nucleic acid for measurement characterized in that it hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid according to any one of (6) to (9) or a nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the nucleic acid.
  • nucleic acid for measurement according to (10) comprising a base sequence consisting of base numbers 683 to 775 of SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary thereto.
  • nucleic acid for measurement according to any one of (10) to (12), wherein the nucleic acid for measurement is used as a cancer marker.
  • (22) (a-1) hybridizing a pair of primers selected from the nucleic acids for measurement according to (10) to the nucleic acids according to (6) in the biological sample;
  • the protein of the present invention is a glycosyltransferase having an activity of transferring a G1cNAc residue from a G1cNAc donor substrate to a G1cNAc acceptor substrate.
  • the “GlcNAc donor substrate” is preferably a sugar nucleotide having GlcNAc.
  • Such substances include, for example, adenosine diphosphate-N-acetyldarcosamine (ADP-GlcNAc), peridine diphosphate-N-acetyldarcosamine (UDP-GlcNAc), and guanosine diphosphate_N-a Cetyldarcosamine (GDP-GlcNAc), cytidine diphosphate-N-acetyldarcosamine (CDP-GlcNAc) and the like are exemplified, and UDP-GlcNAc is most preferred, but not particularly limited.
  • ADP-GlcNAc adenosine diphosphate-N-acetyldarcosamine
  • UDP-GlcNAc peridine diphosphate-N-acetyldarcosamine
  • CDP-GlcNAc cytidine diphosphate
  • the “GlcNAc acceptor substrate” is not particularly limited as long as the protein of the present invention is a compound capable of transferring GlcNAc from a GlcNAc donor substrate, but (1) GalNAc, (2) GlcNAc, (3) GaK (4 ) XyK (5) Fuc, (6) Man, (7) ManNAc, (8) Gall ⁇ 4Glc, and (9) 6 & 1) 31-461 ( ⁇ ); Furthermore, it is more preferable that any one of Bz, pNp, and oNp is bonded by, but not limited to, one or eight bonds at position 1 of the sugar ring of the sugar residue.
  • the acceptor substrate is GalNAcal-Bz, GalNAc
  • “ONp” is Ornitoni mouth
  • “1” indicates a glycosidic bond
  • the numbers in the formula indicate the carbon numbers of the sugar ring in which the glycosidic bond is present
  • “ ⁇ ” and “3” indicate the 1-position of the sugar ring. indicates Anoma of the preceding SL glycosidic linkage, the positional relationship between the 5-position CH 2 0H or CH 3 those trans “"”indicates those cis in" j3 ".
  • the activity of the GkNAc residue can be confirmed by using a radioisotope such as [ 14 C] or [3 ⁇ 4].
  • the “protein of the present invention” requires a “divalent metal cation” for the enzymatic reaction (this property is also described as “metal ion requirement”). That is, when the “divalent metal cation” is chelated with a chelating agent (for example, ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter abbreviated as “EDTA”) or the like), it has a property of substantially losing its activity.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • divalent metal cation examples include calcium ion (Ca 2+ ), cobalt ion (Co 2+ ), manganese ion (Mn 2+ ), and magnesium ion (Mg 2+ ).
  • Ca 2+ calcium ion
  • Co 2+ cobalt ion
  • Mn 2+ manganese ion
  • Mg 2+ magnesium ion
  • Mn M and Mg 2+ are particularly preferred.
  • reaction pH of the protein of the present invention is around neutral, preferably from pH 6.0 to pH 8.0.
  • the enzyme activity at pH 7.4 is stronger than the enzyme activity at pH 6.6 (all in a sodium buffer sodium codylate).
  • Such comparison of the intensity of the enzyme activity can be easily and accurately performed using a radioactive label, for example, by the method described in Example 2.
  • Such “protein of the present invention” more specifically includes, for example, the following polypeptides (A) to ( ⁇ ′′).
  • ( ⁇ ′) a polypeptide having an amino acid sequence consisting of amino acids 56 to 402 described in SEQ ID NO: 2;
  • the present invention also provides a glycosyltransferase in the form of a sugar polypeptide having a sugar chain bonded thereto. It is mentioned as one embodiment of protein.
  • the activity of the enzyme is generally maintained even when a mutation such as substitution, deletion, or insertion of one or more amino acids is present in the amino acid sequence.
  • a mutation such as substitution, deletion, or insertion of one or more amino acids is present in the amino acid sequence.
  • polypeptide As the above-mentioned "polypeptide” as long as it has “glycosyltransferase activity”.
  • polypeptides include, in addition to polymorphisms and mutations in the DNA encoding them, amino acid substitutions in the amino acid sequence thereof due to modification reactions in the cells of the produced polypeptide and during purification, and the like. It is known that some mutations such as deletions or insertions can occur, but nonetheless, there are substances which exhibit substantially the same physiological and biological activities as polypeptides having no mutation. Such a polypeptide having a slight difference in structure but no significant difference in its function is also included in the above “polypeptide”. The same applies to the case where the above-mentioned mutation is artificially introduced into the amino acid sequence of the polypeptide. In this case, it is possible to prepare a wider variety of “polypeptides having mutation”. Such mutations such as substitutions, deletions, and insertions include “transposition” and the movement of a part of a nucleic acid to another position, for example, the movement of a gene on a chromosome.
  • polypeptide in which a certain cystine residue is replaced with a serine residue in the amino acid sequence of human interleukin 2 retains the activity of IL-2 (Science , 224 (1984), ⁇ . 1431).
  • Certain polypeptides are known to have peptide regions that are not essential for activity. For example, signal peptides present in extracellularly secreted polypeptides or prosequences found in proteases precursors, etc., and these regions are mostly translated or translated into active polypeptides. Is removed upon conversion.
  • a polypeptide having a peptide region sequence that is not essential for such activity exists in a different form in terms of secondary structure, but ultimately has a function equivalent to that of the present invention. Invention tongue Such a sequence may also be linked to the “protein polypeptide”.
  • Such a “mutated polypeptide” can be easily prepared by a known method such as a “site-directed mutagenesis method”.
  • the term “plurality” is not particularly limited as long as it has a glycosyltransfer activity for transferring a GlcNAc residue from a GlcNAc donor substrate to a GlcNAc acceptor substrate.
  • the amino acid number is preferably 10 or less, more preferably about 5% or less of the total number of amino acids.
  • a polypeptide consisting of 347 amino acids for example, the polypeptide described in the above (A ')
  • it represents 35 or less, preferably 17 or less
  • a polypeptide consisting of 402 amino acids for example, In the case of (( ⁇ ′′)
  • the number is 40 or less, preferably 20 or less.
  • the glycosyltransferase protein of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 based on the deduction from the nucleotide sequence of the cloned nucleic acid, but is not limited to only the protein having the sequence. It is intended to include all homologous proteins as long as they have the properties described in the specification.
  • identity should be at least 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more. is there.
  • percent identity can be determined, for example, by the BLAST program described in Altschul et al. (Nuc. Acids Res., 25, p. 3389-3402, 1997), or by Pearson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, p.2444-2448, 1998) can be used for comparison with sequence information using FASTA.
  • the program can be used on the Internet from the website of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) or the DNA Data Bank of Japan (DDBJ).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • DDBJ DNA Data Bank of Japan
  • substitution between amino acids having similar properties for example, substitution of one hydrophobic amino acid with another hydrophobic amino acid, substitution of one hydrophilic amino acid with another hydrophilic amino acid, When a substitution of an amino acid with another acidic amino acid or a substitution of one basic amino acid with another basic amino acid), the resulting mutated protein often has the same properties as the original protein.
  • Techniques for producing a recombinant protein having such a desired mutation using gene recombination techniques are well known to those skilled in the art, and such a mutant protein is also included in the scope of the present invention.
  • the protein of the present invention can be obtained, for example, by transferring the nucleic acid of SEQ ID NO: 1 according to the nucleic acid of the present invention to an appropriate host cell, for example, Escherichia coli, yeast, insect, or animal cell according to Example 1 described below.
  • the protein can be obtained in a large amount by introducing and expressing using an expression vector that can be amplified by PCR.
  • the amino acid sequence of this protein and the DNA sequence encoding the same are disclosed, the sequence or a part thereof can be used to perform genetic engineering such as nucleic acid amplification reaction such as hybridization and PCR.
  • genetic engineering such as nucleic acid amplification reaction such as hybridization and PCR.
  • a gene encoding a protein having a similar physiological activity can be easily isolated from other species.
  • novel proteins encoded by those genes are also included in the scope of the present invention.
  • the protein of the present invention has the amino acid sequence as described above, and a sugar chain may be bound to the protein as long as the protein has the enzyme activity. More specifically, as described in Example 2 below, from the search for the receptor substrate of the protein of the present invention, the protein transfers N-acetyl-D-dalcosamine to N_acetyl-D-dalcosamine. It has activity. In particular, based on sequence homology, it is considered that the compound has 31,3-N-acetyl-D-darcosamine glycosyltransferase activity.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the full length or fragment of the novel glycosyltransferase protein of the present invention.
  • nucleic acid of the present invention for example, base numbers 683 to 7775 of SEQ ID NO: 1 A nucleic acid consisting of a base sequence consisting of: or a nucleic acid consisting of a base sequence complementary thereto (the nucleic acid of the present invention 1), base numbers 166-1206 of SEQ ID NO: 1 (amino acid residue 5 of SEQ ID NO: 2) A nucleic acid comprising the nucleotide sequence consisting of 6-402) (nucleic acid 2 of the present invention), nucleotide numbers 1 to 1206 (SEQ ID NO: 2 amino acid residues 1 to 402) of SEQ ID NO: 1 (Nucleic acid 3 of the present invention) or a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence complementary thereto. Nucleic acids encoding the same amino acid sequence by degeneracy as the amino acid sequence encoded by these nucleic acids are also included in the present invention.
  • nucleic acid 1 of the present invention is a nucleic acid suitable for use in, for example, the “detection method of the present invention” described below.
  • nucleic acid 2 of the present invention encodes a “polypeptide of an embodiment in which a transmembrane region (a region in which about 10 to 20 hydrophobic amino acids are consecutive) is deleted” among “polypeptides of the present protein”. Therefore, a polypeptide produced by expressing the nucleic acid can be referred to as a “soluble polypeptide”.
  • Nucleic acid 3 of the present invention encodes the entire sequence of “polypeptide of the present protein”.
  • nucleic acid 2 of the present invention and “Nucleic acid 3 of the present invention” contain a base sequence corresponding to a stop codon in protein synthesis
  • the "Nucleic acid 2 consisting of amino acid numbers 56 to 402 described in SEQ ID NO: 2" (A polypeptide described in the above ( ⁇ ′)) or a “polypeptide comprising an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 1 to 402” (a polypeptide described in the above ( ⁇ ′)) by genetic engineering.
  • SEQ ID NO: 2 A polypeptide described in the above ( ⁇ ′)
  • polypeptide comprising an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 1 to 402 a polypeptide described in the above ( ⁇ ′)
  • nucleic acid of the present invention also includes both single-stranded and double-stranded DNA, and their RNA complements.
  • DNA includes, for example, naturally-occurring DNA, recombinant MA, chemically-linked DNA, DNA amplified by PCR, and combinations thereof.
  • DNA is preferable because it is excellent in that it is used as a probe or the like in the “method for detecting canceration” described below and that it is stable when preparing vectors and transformants.
  • the nucleic acid having all or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can be used as a primer, a probe, or the like, for example, for examining the expression state of the ⁇ nucleic acid of the present invention '' in a living body. It is extremely useful as a reagent for medical research or a diagnostic agent. Nucleic acids as such probes are difficult to handle if the molecular weight is too large. Therefore, 40 bases to 1209 bases are exemplified, more preferably 50 bases to 500 bases, and most preferably 60 bases to 300 bases. When used as a probe or primer for a synthetic oligonucleotide, it is at least 10 bases or more, preferably 15 bases or more, more preferably 20 bases or more. Preferably it is 50 bases or less.
  • under stringent conditions means that hybridization occurs under moderate or high stringent conditions.
  • moderately stringent conditions can be readily determined by one of ordinary skill in the art, for example, based on the length of the MA. The basic conditions are given in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory ManuaK 3rd Edition, Vol.
  • such conditions include hybridization and / or washing at higher temperatures and Z or lower salt concentrations than moderately stringent conditions, e.g., hybridization conditions as described above. , And approximately 68 ° C, with 0.2XSSC, 0.1% SDS wash.
  • moderately stringent conditions e.g., hybridization conditions as described above.
  • 0.2XSSC 0.1% SDS wash.
  • the temperature and wash solution salt concentration can be adjusted as necessary according to factors such as the length of the probe.
  • nucleic acid of the present invention can be prepared, for example, by the following method.
  • nucleic acid of the present invention (for example, the DNA of the present invention) is prepared from a cDNA library or the like by using a basic technique of gene science such as hybridization or nucleic acid amplification reaction. can do.
  • Amino acid sequence encoded by the complementary sequence (SEQ ID NO: Since 2) is predicted to have a transmembrane region at the N-terminus, preparing a region of a nucleotide sequence encoding a polypeptide having no transmembrane region will produce a polypeptide that encodes a soluble form of the polypeptide.
  • An inventive nucleic acid "is obtained.
  • amino acid numbers 1 to 55 are transmembrane regions. Therefore, a polypeptide lacking all or a part of the region and a nucleic acid encoding the polypeptide are included in the present invention as “a polypeptide in a solubilized form or a nucleic acid thereof”.
  • an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 56 to 402 described in SEQ ID NO: 2 may be mentioned.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide in a solubilized form consisting of such an amino acid sequence “a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A nucleic acid having a base sequence of 66 to 1209 ".
  • the sequence described in SEQ ID NO: 3 can be prepared by adding 5 ′ primer (base No. 32—
  • nucleotide numbers 166 to 190 of SEQ ID NO: 1) corresponds to nucleotide numbers 166 to 190 of SEQ ID NO: 1
  • sequence described in SEQ ID NO: 4 corresponds to the 3 ′ primer (nucleotide numbers 31 to 55 of SEQ ID NO: 4 correspond to nucleotide numbers of SEQ ID NO: 1). 1209-1185), and can be prepared, for example, by subjecting a human genomic cDNA library to type I and performing a nucleic acid amplification reaction according to a conventional method.
  • the nucleic acid amplification reaction includes, for example, the polymerase chain reaction (PCR) [Saiki RK, et al., Science, 230, 1350-1354 (1985)], the ligase chain reaction (LCR) [Wu DY, et al., Genomics, 4, 560-569 (1989); Barringer KJ, et al., Gen e, 89, 117-122 (1990); Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 189-193. (1991)] and amplification based on transcription [Kwoh DY, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1173-1177 (1989)], etc., and strand displacement. Reaction (SDA) [Walker GT, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-39
  • NASABA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
  • a DNA fragment of about 1.lkbp is obtained as a PCR product.
  • the DNA fragment is separated by a method such as agarose gel electrophoresis, in which the DNA fragment is separated by sieving.
  • the "nucleic acid of the present invention” can be obtained by isolation according to a conventional method such as a method of cutting out a band.
  • Homologous nucleic acids cloned using the above-described hybridization, nucleic acid amplification reaction, etc. should be at least 50% or more, preferably at least 50%, based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It has an identity of 60% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • Percent identity can be determined by visual inspection and mathematical calculation. Alternatively, the percent identity between two nucleic acid sequences is described in Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984, and is available from the University of Wisconsin Genetics Computing Group (UWGCG), a GAP computer program. It can be determined by comparing sequence information using Lamb, version 6.0. Preferred default parameters for the GAP program include: (1) a unary comparison matrix for nucleotides (containing 1 for identical and 0 for non-identical), and supervision of Schwartz and Dayhoff, Atlas of Weighted comparison matrix of Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, as described in Protein Sequence and Structure, pp. 353-358, National Biomedical Research Foundation, 1979; (2) for each gap 3.0 penalty and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap; and (3) no penalty for terminal gaps. Other programs for sequence comparison, used by those skilled in the art, can also be used.
  • a recombinant vector containing the isolated “nucleic acid of the present invention containing the isolated “nucleic acid of the present invention”.
  • a method for incorporating the MA fragment of the nucleic acid of the present invention into a vector such as a plasmid include a method described in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.1 (2001). Is mentioned. Simple A commercially available ligation kit (for example, Takara Shuzo) can be used for the stool.
  • the resulting recombinant vector eg, a recombinant plasmid
  • a host cell for example, Escherichia coli DH5Q !, TB1, LE392, or XL-LE392 or XL-lBlue.
  • a calcium chloride method or calcium chloride Z rubidium chloride described in Sambrook, J. et al.
  • a method using chemical treatment such as a PEG method, an electro-injection method, an electoral injection method, a PEG, and a method using a gene gun.
  • the vector can be simply prepared by ligating a desired gene to a vector for recombination available in the art (for example, plasmid DNA) in a conventional manner.
  • a vector for recombination available in the art (for example, plasmid DNA)
  • Specific examples of the vector used include, but are not limited to, E. coli-derived plasmids such as PDONR20K pBluescript, pUC18, pUC19, and pBR322.
  • the expression vector of the present invention has appropriately arranged regions (promoter region, enhancer region, operator region, etc.) involved in gene expression so that the nucleic acid of the present invention can be expressed in a target host cell.
  • the nucleic acid of the present invention is constructed so as to be appropriately expressed.
  • the expression vector can be constructed using the Gateway system (Invitrogen), which does not require restriction and ligation.
  • the Gateway system uses site-specific recombination that allows cloning while maintaining the orientation of the PCR product and enables subcloning into an expression vector with an appropriately modified DNA fragment. It is a system that did. Specifically, an entry clone was created from the PCR product and the donor vector using BP clonase, a site-specific recombination enzyme, and then this clone and another recombination enzyme, LB clonase, were used. Then, by transferring the PCR product to a recombinable destination vector, an expression clone corresponding to the expression system is prepared. First One of the features is that if a single clone is created, the laborious sub-cloning step of working with restriction enzyme ⁇ ligase is unnecessary.
  • the type of expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing a desired gene in various host cells of prokaryotic cells and / or eukaryotic cells and producing a desired protein.
  • expression vectors for E. coli PQE-30, pQE_60, pMAL-C2, pMAL-p2, pSE420, etc. are preferable.
  • expression vectors for insects pFastBac, pBacPAK8 / 9, pBK283, pVL1392, pBlueBac4.5 and the like are preferable.
  • a transformant can be obtained by incorporating the above-mentioned "expression vector of the present invention” into a host cell.
  • Either eukaryotic cells (mammalian cells, yeast, insect cells, etc.) or prokaryotic cells (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.) can be used as the above-mentioned "host cells”.
  • the host cell for obtaining the transformant of the present invention is not particularly limited, and may also be a human cell (eg, HeLa, 293T, SH—SY5Y), a mouse (eg, Neuro 2a, Cultured cells derived from NI H3T3) and the like may be used. These are all known and commercially available (eg, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) or available from public research institutions (eg, RIKEN Cell Bank). Alternatively, embryos, organs, tissues or non-human individuals can be used.
  • nucleic acid of the present invention is a nucleic acid discovered from a human genomic library
  • a eukaryotic cell when used as a host cell of the transformant of the present invention, it has properties closer to a natural product. It is considered that an "inventive protein” is obtained (for example, an embodiment in which a sugar chain is added). Therefore, it is preferable to select a eukaryotic cell, particularly a mammalian cell, as the “host cell”.
  • mammalian cells include mouse-derived cells, and animal cells include mouse-derived, African algae-derived, rat-derived, hamster-derived, monkey-derived or human-derived cells, or cultured cell lines established from these cells.
  • Escherichia coli, yeast or insect cells as host cells include, for example, Escherichia coli (thigh c M15, JM109, BL21, etc.), yeasts (INVSc1 (Saccharomyces), GS115, KM71 (Pichia), etc.) ), Insect cells (Sf21, BmN4, silkworm larvae, etc.).
  • Escherichia coli, yeast or insect cells as host cells include, for example, Escherichia coli (thigh c M15, JM109, BL21, etc.), yeasts (INVSc1 (Saccharomyces), GS115, KM71 (Pichia), etc.) ), Insect cells (Sf21, BmN4, silkworm larvae, etc.).
  • the expression vector generally comprises at least a promoter operator region, an initiation codon, a gene encoding a desired protein, a stop codon, a terminator, and a replicable unit.
  • the expression vector When using yeast, plant cells, animal cells, or insect cells as cells, the expression vector generally includes at least a promoter, initiation codon, a gene encoding a desired protein, a stop codon, and a terminator. I like it. It may also contain, as appropriate, a DNA encoding a signal peptide, an enhancer sequence, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of the desired gene, a selectable marker region or a replicable unit.
  • a suitable initiation codon is, for example, methionine codon (ATG).
  • ATG methionine codon
  • Examples of the stop codon include commonly used stop codons (eg, TAG, TGA, TAA, etc.).
  • a replicable unit refers to a DM capable of replicating its entire DNA sequence in a host cell, and is a natural plasmid, an artificially modified plasmid (plasmid prepared from a natural plasmid). And synthetic plasmids.
  • Suitable plasmids include the plasmid pQE30, pET or pCAL or an artificially modified product thereof (a DNA fragment obtained by treating pQE30, pET or pCAL with an appropriate restriction enzyme) in E. coli, and yeast in E. coli.
  • Plasmid PYES2 or pPIC9K, and insect cells such as plasmid pBacPAK8 / 9.
  • enhancer sequence and the terminator sequence those commonly used by those skilled in the art, for example, those derived from SV40 can be used. Can be used. Examples thereof include tetracycline, ampicillin, or an antibiotic resistance gene such as kanamycin or neomycin, hygromycin, or spectinomycin.
  • the expression vector should contain at least the promoter, start codon, gene encoding the desired protein, stop codon, and one terminator region as described above. It can be prepared by linking to an appropriate replicable unit in one ring. At this time, if necessary, an appropriate DNA fragment (for example, a linker, another restriction enzyme site, etc.) can be used by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase.
  • an appropriate DNA fragment for example, a linker, another restriction enzyme site, etc.
  • Introduction of the expression vector of the present invention into a host cell [Transformation (transfection)] can be performed by a conventionally known method.
  • the protein of the present invention can be expressed (produced), for example, by culturing a transformant containing the expression vector prepared as described above in a nutrient medium.
  • the nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant).
  • the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, sucrose, methanol and the like.
  • the inorganic nitrogen source or organic nitrogen source include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and palais extract.
  • the culturing is performed by a method known in the art. Culture conditions, for example, temperature, pH of the medium, and culture time are appropriately selected so that the protein of the present invention is produced in large quantities.
  • the protein of the present invention can be obtained as follows from a culture obtained by the above culture.
  • the host cells are collected by centrifugation, filtration, or the like, and then collected in an appropriate buffer (for example, Tris having a concentration of about 10 to 100 mM). Buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, MES buffer, etc.
  • the pH varies depending on the buffer used, but the pH is preferably in the range of 5.0 to 9.0.
  • the cells are disrupted by a method suitable for the host cells to be used, and the contents of the host cells are obtained by centrifugation.
  • the culture medium is separated from the host cells by an operation such as centrifugation or filtration to obtain a culture filtrate.
  • the host cell-disrupted liquid or the culture filtrate can be used for isolation and purification of the protein of the present invention as it is, or after performing ammonium sulfate precipitation and dialysis.
  • the following methods can be mentioned as methods for isolation and purification. That is, when a tag such as 6X histidine, GST, or maltose binding protein is attached to the protein, an affinity chromatography method generally used for each tag generally used can be mentioned.
  • a method using ion exchange chromatography can be mentioned.
  • a method combining gel filtration, hydrophobic chromatography, isoelectric point chromatography, and the like can also be mentioned.
  • the protein of the present invention can be used for modifying a sugar chain of a glycoprotein or synthesizing a saccharide. Furthermore, by administering the protein of the present invention to an animal as an immunogen, an antibody against the protein can be prepared, and the protein can be measured by an immunoassay using the antibody. Therefore, the protein of the present invention and a nucleic acid encoding the protein are useful for producing such an immunogen.
  • the expression vector of the present invention is preferably constructed so as to facilitate the isolation and purification of the protein of the present invention.
  • the “protein of the present invention” is defined as a “fusion protein of a polypeptide having enzymatic activity (eg, the polypeptide described in ( ⁇ ), ( ⁇ ′)) or ( ⁇ ”) described above) and a “labeled peptide” It is preferable to produce the “protein of the present invention” by genetic engineering using the "expression vector of the present invention” constructed so as to be expressed in the form of "", since the isolation and purification are facilitated.
  • the “identification peptide” when the “protein of the present invention” is prepared by genetic recombination, it is expressed as a “fusion protein” in which the “identification peptide” and the “enzymatically active polypeptide” are bound.
  • the peptide has a function of facilitating secretion, separation, purification, or detection of the “protein of the present invention” from the grown product of the transformant.
  • identifying peptides include, for example, signal peptides (15-30 amino acid residues that are present at the ⁇ -terminal of many proteins and function in cells for the purpose of protein selection in the intracellular membrane permeation mechanism) A peptide consisting of: (kpA, 0 immediately 1 ⁇ Dsb, etc.), protein kinase A, protein A (a component of the cell wall of S.
  • aureus having a molecular weight of about 42,000 glutathione S-transferase, His tag (a sequence in which 6 to 10 histidine residues are arranged), myc tag (a 13 amino acid sequence derived from cMyc protein), FLAG peptide (an analytical marker consisting of 8 amino acid residues), T7 tag (genel O protein (consisting of the first 11 amino acid residues), S tag (consisting of 15 amino acid residues from Tengen RNaseA), HSV tag, pe IB (22 amino acid sequence of E.
  • HA tag Consisting of 10 amino acid residues derived from hemagglutinin
  • Trx tag thioredoxin sequence
  • CBP tag calmodulin binding peptide
  • CBD tag cellulose binding domain
  • CBR tag collagen binding domain
  • HA tag Consisting of 10 amino acid residues derived from hemagglutinin
  • Trx tag thioredoxin sequence
  • CBP tag calmodulin binding peptide
  • CBD tag cellulose binding domain
  • CBR tag collagen binding domain
  • HP-Thio His-patch thioredoxin
  • HSP thermo shock peptide
  • Ln r laminin peptide
  • Fn fibronectin partial peptide
  • GFP green fluorescent peptide
  • YFP yellow fluorescent peptide
  • CFP cyan fluorescent peptide
  • BFP blue fluorescent peptide
  • DsRed DsRed2 Peptides such as (red fluorescent peptide), MBP (mal!
  • ⁇ -Binding peptide LacZ (lactose operator), IgG (immunoglobulin G), avidin, and protein G Any discriminating peptide Can also be used.
  • signal peptides, protein kinases, protein darthion s-transferases, His tags, myc tags, FLAG peptides, T7 tags, S tags, HSV tags, pelB or HA tags are particularly useful in genetic engineering methods. It is preferable because the expression and purification of the protein of the present invention becomes easier.
  • FLAG peptide As a fusion protein with FLAG peptide (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) (SEQ ID NO: 6), It is preferable to obtain the “protein of the present invention” because it is extremely excellent in handling.
  • the FLAG peptide is highly antigenic and provides an epitope to which a specific monoclonal antibody reversibly binds, allowing for rapid access and easy purification of the expressed recombinant protein.
  • the murine hybridoma designated 4E11 binds to the FLAG peptide in the presence of certain divalent metal cations, as described in US Pat. No. 5,011,912, which is incorporated herein by reference.
  • the 4E11 hybridoma cell line has been deposited with the American Type Culture Collection under the deposit number HB9259.
  • Monoclonal antibodies that bind to the FLAG peptide are available from Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, CT.
  • Examples of basic vectors that can be expressed in mammalian cells and that can obtain the “protein of the present invention” as a fusion protein with the FLAG peptide described above include, for example, PF LAG-CMV-1 (Sigma), FBIF (pFastBac ( Invitrogen) into which a region encoding the FLAG peptide is incorporated: see Examples below) and the like, but those skilled in the art will recognize host cells, restriction enzymes, and identification of the "protein of the present invention”.
  • the present invention discloses the "base sequence of the nucleic acid of the present invention", those skilled in the art Prepare primers appropriately based on the nucleotide sequences at both ends of the ⁇ nucleic acid '' and the ⁇ partial region of the nucleic acid of the present invention '' to be prepared, and use them to amplify the target region by PCR or other methods It is easy to prepare by.
  • nucleic acid for measurement a nucleic acid that hybridizes with the nucleic acid of the present invention.
  • the nucleic acid for measurement of the present invention is typically a naturally-derived or synthesized fragment of the nucleic acid encoding the protein of the present invention, and includes, but is not limited to, a primer or a probe.
  • the term “measurement” as used herein includes any of detection, amplification, quantification, and semi-quantification.
  • the nucleic acid for measurement of the present invention is used as a primer for a nucleic acid amplification reaction
  • the nucleic acid for measurement of the present invention is an oligonucleotide
  • Two regions are selected from the nucleotide sequence of the gene encoding the protein shown in SEQ ID NO: 2 so as to satisfy the following conditions:
  • each region is 15 to 50 bases;
  • the oligonucleotide produced by the method comprising the steps of:
  • the primer of the present invention preferably has a sequence homologous to the partial region of the nucleic acid of the present invention, but may have a mismatch of 1 or 2 bases.
  • the primer of the present invention has at least 15 bases, preferably at least 18 bases, more preferably at least 21 bases, but not more than 50 bases.
  • the primer of the present invention typically comprises SEQ ID NO: 7 (corresponding to base numbers 683-701 of SEQ ID NO: 1) and SEQ ID NO: 8 (base numbers 775-75 of SEQ ID NO: 1). 5 (corresponding to 5), and can be used alone or as a primer pair.
  • the nucleic acid for measurement of the present invention When the nucleic acid for measurement of the present invention is used as a probe, the nucleic acid for measurement of the present invention preferably has a sequence homologous to the entire or partial region of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. New When the nucleic acid for measurement of the present invention is a cDNA probe, the number of bases is 10 bases or more, preferably 15 bases or more, and the longest is the entire length of the coding region, that is, the number of bases is 1209. is there. Even if there is a mismatch of 50% or less, preferably 20% or less with the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 or its complementary nucleotide sequence, it can function as a probe.
  • the number of bases is 15 bases or more, preferably 20 bases or more.
  • a synthetic oligonucleotide depending on the length, even if there is a mismatch of about 1 or 2 bases with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or its complementary base sequence, it can function as a probe.
  • the probe of the present invention has, for example, the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9. This corresponds to SEQ ID NO: 1 base numbers 707-724, and when a nucleic acid amplification reaction is performed using SEQ ID NOs: 7 and 8 as a primer, it can be detected by hybridizing to the amplification product. .
  • the probe of the present invention includes a labeled probe labeled with a fluorescent label, a radioactive label, a biotin label or the like in order to detect or confirm that the probe has hybridized with the target sequence.
  • nucleic acid amplification methods such as PCR are well known in the art, and reagent kits and devices therefor are commercially available, so that they can be easily performed.
  • the nucleic acid amplification method is performed using the above-described primer pair of the present invention and using the test nucleic acid as type I, the test nucleic acid is amplified, but when the test nucleic acid is not contained in the sample, Since amplification does not occur, it is possible to know whether or not the test nucleic acid is present in the sample by detecting the amplification product.
  • the amplification product can be detected by electrophoresis of the reaction solution after amplification and staining the band with ethidium bromide or by immobilizing the amplification product after electrophoresis on a solid phase such as nylon membrane.
  • the hybridization can be carried out by hybridizing with a labeled probe that specifically hybridizes with the test nucleic acid, washing, and detecting the label.
  • a labeled probe that specifically hybridizes with the test nucleic acid
  • washing, and detecting the label In addition, by performing quantitative RT-PCR using a quencher fluorescent dye and a repo overnight fluorescent dye, it is also possible to quantify the amount of the test nucleic acid in the sample. Kits for quantitative RT-PCR are also commercially available, making it easy to perform. You.
  • the test nucleic acid may be mRNA or cDNA reverse-transcribed from mRNA.
  • the N388 method 33-length method, TMA method
  • the NA SBA method itself is well known, and a kit therefor is commercially available, so that it can be easily carried out using the above-mentioned pair of primers.
  • the present inventors have found that the expression level of the novel (31,3-N-acetyl-D-darcosamine glycosyltransferase protein and / or nucleic acid of the present invention) is higher in cancer tissues than in normal tissues. . Therefore, by quantifying the protein or nucleic acid of the present invention in the biological sample of the present invention and comparing it with the corresponding amount in a control normal biological sample, canceration of the biological sample can be assayed. is there.
  • the present invention relates to a method for assaying canceration of a biological sample
  • the assay method of the present invention comprises:
  • an antibody prepared using the protein as an immunogen can be used.
  • Methods for quantifying proteins using antibodies include well-known methods in the art, for example, ELISA, Wes It is possible to use the Tan plot method.
  • it can be quantified by utilizing the activity of the glycosyltransferase protein of the present invention. The ratio of the quantitative values is
  • the assay method of the present invention comprises:
  • the nucleic acid that can be used in the assay method of the present invention is exemplified as the nucleic acid for measurement of the present invention, but is not particularly limited.
  • a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 1 to 1206 of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence complementary thereto Any sequence selected from various base sequences can be used. It is preferable to use a nucleic acid consisting of a base sequence consisting of base numbers 683 to 7775 shown in SEQ ID NO: 1 or a nucleic acid consisting of a base sequence complementary thereto (the nucleic acid 1 of the present invention).
  • the nucleic acid (especially mRNA) detected in the biological sample by the assay method of the present invention is preferably a nucleic acid containing a base sequence consisting of the base sequence numbers 683 to 775 of SEQ ID NO: 1.
  • a nucleic acid consisting of a base sequence consisting of base numbers 683 to 775 of SEQ ID NO: 1 and consisting of a base sequence consisting of base numbers 166 to 1209 of SEQ ID NO: 1 examples include a nucleic acid and a nucleic acid having a base sequence consisting of base numbers 1 to 1209 described in SEQ ID NO: 1.
  • the expression levels of these nucleic acids can be determined, for example, by PCR using the nucleic acid for measurement of the present invention. And can be quantified.
  • the use of a quantitative PCR method is preferable, and examples thereof include an RT-PCR method and a quantitative real-time PCR method for kinetic analysis.
  • the quantification of nucleic acids is not limited to these, and it is also possible to use a nosen blot, a dot plot, or a DNA microarray.
  • nucleic acids of genes widely and generally present in the same tissue and the like for example, nucleic acids encoding glyceraldehyde-3-phosphate monodehydrogenase (GAPDH) and 0-actin can be used as controls.
  • the quantitative ratio of the signal judged to be cancerous is 1.5 or more, preferably 2 or more, more preferably 3 or more, still more preferably 5 or more, even more preferably 10 or more, and most preferably. 20 or more.
  • biological sample refers to an organ, a tissue, or a cell, and is preferably a tissue, specifically, an esophagus, a stomach, a kidney, a liver, a kidney, a duodenum, a small intestine, a large intestine,
  • the rectum and the colon are exemplified.
  • the large intestine, the rectum, and the colon are preferred, and the colon is more preferred.
  • the assay method of the present invention is an assay for canceration of a biological sample, and can be applied to cancer diagnosis and treatment in medical treatment.
  • cancer typically refers to malignant tumors in general and includes disease states caused by the malignant tumors.
  • the assay method of the present invention includes, but is not limited to, esophageal cancer, stomach cancer, Teng kidney cancer, liver cancer, kidney cancer, duodenal cancer, small intestine cancer, large intestine cancer, rectal cancer, and colon cancer, preferably colon cancer , Rectal cancer and colon cancer, and more preferably suitable for colorectal cancer assay.
  • antibodies that are immunoreactive with the / 31,3-N-acetyl-D-darcosamine glycosyltransferase protein of the invention.
  • Such antibodies specifically bind to the glycosyltransferase protein via the antigen-binding site of the antibody (as opposed to non-specific binding). Therefore, the protein, fragment, mutant, fusion protein and the like of SEQ ID NO: 2 as described above can be used as “immunogen j” when producing an antibody that is immunoreactive therewith.
  • proteins, fragments, mutants, fusion proteins, etc. contain an antigenic determinant or epitope that elicits antibody formation. Including. These antigenic determinants or epitopes can be either linear or conformational (intermittent). In addition, the antigenic determinant or epitope may be identified by any method known in the art.
  • one aspect of the present invention relates to the antigenic epitope of the; 8 1,3-N-acetyl-D-darcosamine glycosyltransferase protein of the present invention.
  • Such epitopes are useful for generating antibodies, particularly monoclonal antibodies, as described in more detail below.
  • the) 31,3-N-acetyl-D-glucosamine glycosyltransferase protein epitopes of the present invention specifically bind in Atssei and from substances such as polyclonal serum or supernatant from cultured hybridomas. It can be used as a research reagent for purifying antibodies.
  • Such epitopes or variants thereof may be produced using techniques known in the art, such as solid phase synthesis, chemical or enzymatic cleavage of proteins, or using recombinant DNA techniques. Is possible.
  • polyclonal antibodies and monoclonal antibodies are Both can be prepared by conventional techniques. See, for example, Kennet et al., Supervised, Monoclonal Ant ibodies, Hybridomas: A New Dimensions in Biological Analyzes, Pienum Press, New York, 1980.
  • Hybridoma cell lines that produce monoclonal antibodies specific for the / 31,3-N-acetyl-D-darcosamine glycosyltransferase protein of the present invention are also contemplated herein. Such hybridomas can be produced and identified by conventional techniques.
  • One method for producing such a hybridoma cell line is to immunize an animal with the glycosyltransferase protein; collect spleen cells from the immunized animal; fuse the spleen cell to a myeloma cell line. Producing eight hybridoma cells; and identifying a hybridoma cell line that produces a monoclonal antibody that binds to the protein. Monoclonal antibodies can be recovered by conventional techniques.
  • the monoclonal antibodies of the present invention include chimeric antibodies, for example, murine monoclonals. Humanized forms of antibodies. Such humanized antibodies may be prepared by known techniques and provide the advantage of reduced immunogenicity when the antibody is administered to humans.
  • Antigen-binding fragments of an antibody that can be produced by conventional techniques are also included in the invention.
  • Examples of such fragments include, but are not limited to, the & ⁇ (ab ') 2 fragment.
  • Antibody fragments and derivatives produced by genetic engineering techniques are also provided.
  • the antibodies of the present invention can be used in assays to detect the presence of the glycosyltransferase protein or fragment either in vitro or in vivo.
  • Antibodies can also be used in purifying polypeptides or fragments of the invention by immunoaffinity chromatography.
  • binding partners such as antibodies capable of blocking the binding of a protein of the invention to its receptor substrate
  • binding partners can be used to block the biological activity resulting from such binding.
  • blocking antibodies can be identified using any suitable assay method, such as by testing the antibody for its ability to inhibit the binding of the protein to specific cells expressing the receptor substrate. Good.
  • blocking antibodies can be identified in an assay for their ability to inhibit a biological effect resulting from a protein of the invention bound to a binding partner of a target cell.
  • Such antibodies can be used in vitro or administered in vivo to inhibit a biological activity mediated by the entity that produced the antibody. Accordingly, disorders caused (directly or indirectly) or exacerbated by the interaction of the / 31,3-N-acetyl-D-darcosamine glycosyltransferase protein of the present invention with a binding partner. Can be treated.
  • the therapy involves administering to the mammal an in vivo amount of a blocking antibody effective to inhibit binding partner-mediated biological activity.
  • monoclonal antibodies are preferred for use in such therapies.
  • an antigen-binding antibody fragment is used.
  • a BLAST search was performed using the base sequence of 33 glucuronyltransferase 7 (i3 3GnT7) (GenBank Accession No. AK 000770) (SEQ ID NO: 10) as a query.
  • i3 3GnT7 GenBank Accession No. AK 000770
  • SEQ ID NO: 10 the complementary sequence of EST (GenBank Accession No. BC004908) had homology with i33GnT7.
  • the complementary sequence was as shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by this nucleotide sequence is predicted to have a transmembrane region at the N-terminus, and a region of the nucleotide sequence encoding a protein having no transmembrane region was prepared.
  • the preparation was performed by using the Gateway system (Invitrogen) to incorporate the gene into pFBIF, a derivative of pFastBac (Invitrogen), and creating a bacmid using the Bac-to-Bac system (Inpitrogen). I went.
  • a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 as the 5 'primer base numbers 32 to 56 of SEQ ID NO: 3 is the nucleotide number 1 66 of SEQ ID NO: 1) (Corresponding to 190)
  • a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 as the 3 'primer base numbers 31 to 55 of SEQ ID NO: 4 are the nucleotide numbers of 1209 to SEQ ID NO: 1) (Corresponding to 1185)).
  • the PCR method was performed under the conditions of 30 cycles of 96 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 1 minute.
  • PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the gel was excised by gel excision and isolated by a conventional method.
  • the PCR product thus isolated was incorporated into PD0NR201 (trademark) (manufactured by Impitogen) by a BP clonase reaction to prepare an “entry clone”.
  • the reaction was performed using the PCR product 21 above, PDONR201 11 (150 ng), BP reaction buffer 2 and Tris-EDTA buffer (PH8.0: hereafter also abbreviated as “TE”) 3 zl, BP clonase mix ⁇ at 25 ° C. Incubation was performed for 1 hour at C.
  • the above-mentioned entry clone has at tL which is a recombination site when ⁇ phage is excised from E. coli at both ends of the insertion site, and LR clonase (recombinant enzyme of ⁇ phage Int, IHF, By mixing Xis and a destination vector (having atR), the insertion site is transferred to the destination vector and an expression clone is created.
  • tL is a recombination site when ⁇ phage is excised from E. coli at both ends of the insertion site
  • LR clonase recombinant enzyme of ⁇ phage Int, IHF
  • pFBIF is obtained by inserting an Igc signal sequence (SEQ ID NO: 5) and a FLAG peptide for purification (SEQ ID NO: 6) into pFastBaCl (manufactured by Invitrogen) according to a conventional method. Further, in order to insert a Gateway sequence (atR) into pFBIF, a conversion cassette was inserted using Gateway Vector Control System (Invitrogen).
  • This conversion cassette is a cassette for converting an expression vector into a destination vector, and includes a attR recombination site, a chloramphenicol resistance gene, and a ccdB gene encoding a protein that inhibits E. coli DNA gyrase. Having.
  • the Ig / signal sequence was inserted to make the expressed protein secretory, and the FLAG tag was inserted to facilitate purification.
  • the target gene (G26A) is incorporated into bacmid by a recombinant protein produced from E. coli.
  • Bacmid also contains the LacZ gene, which allows selection by classical colony color (blue (no insertion), white (with insertion)).
  • the above purified vector (PFBIF-G26A) 501 was mixed with a competent cell (Escherichia coli DHlOBac), transformed by the heat shock method, and then kanamycin, gentamicin, tetracycline, 5-bromoindolyl J3
  • the cells were plated on LB medium containing -D-galactopyranoside (Bluo_gal) and isopropyl 3-D-thiogalactopyranoside (IPTG). After 24 hours, a white independent colony containing the DNA of interest in bacmid was collected. After further culturing, bacmid was recovered according to a conventional method.
  • the target DM was introduced into the collected bacmid according to a conventional method, and the bacmid was introduced into insect cells (Sf21: manufactured by Invitrogen). That is, Sf900 SFM medium (manufactured by Invitrogen) containing an antibiotic was added to 9 ⁇ 10 5 Sf21 cells / 2 ml to a 35 thigh dish, and the cells were allowed to adhere for 1 hour at 27 ° C. After confirming that the cells have adhered, the culture solution was aspirated, and the lipid-DNA comp lexes solution (A solution (a mixture of 100 ⁇ 1 Sf-900SFM and the above-mentioned pacmid 5 ⁇ 1) was added).
  • Sf900 SFM medium manufactured by Invitrogen
  • the cells were released by pipetting, the cells and the culture solution were collected, centrifuged at l OOO X g for 10 minutes, and the supernatant was collected (this supernatant was referred to as “primary virus solution”). Further, 1 ⁇ 10 7 Sf21 cells / 20 ml Sf-900SFM (containing an antibiotic) were added to a T75 culture flask, and the mixture was incubated at 27 ° C. for 1 hour. After the cells had adhered, the primary virus solution (8OOI) was added, and the cells were cultured at 27 ° C for 48 hours. After the culture, the cells were released by pipetting, and the cells and the culture solution were collected. This was centrifuged with lOOOXg for 10 minutes, and the supernatant was collected (this supernatant was referred to as “secondary virus solution”).
  • G26 is / 31,3-N-acetyl- It was suggested that it was classified into D_darcosamine transferases. Therefore, the enzyme activity of the G26 enzyme solution was confirmed using UDP_GlcNAc as a GlcNAc donor substrate.
  • GlcNAc receptor substrates include GalNAcal-Bz, GalNAc / 31-pNp, GlcNAcal-Bz, GlcNAc) 31-Bz, Gal al-pNp, Gal
  • the reaction solution was prepared with 6.6, 7.0, and 7.4 experimental solutions of sodium codylate buffer 11 having a final concentration of 50 mM), Triton (trademark) CF-54 (manufactured by Sigma) having a final concentration of 0.4%, A total of 201 containing UDP-GlcNAc at a final concentration of 480 ⁇ ⁇ , UDP- [ 14 C] GlcNAc at 175 nCi, MgCl 2 , CoCl 2 or CuCl 2 at a final concentration of 20 mM, a 026 enzyme solution at 10.11, and distilled water was used. .
  • the reaction mixture was incubated at 37 ° C for 16 hours, then 200 ⁇ 1 of distilled water was added, and the insoluble fraction was removed by centrifugation (100Xg, 10 minutes) to collect the supernatant fraction. Pass through Sep-Pak plus C18 Cartrige (Waters: equilibrated after washing once with 1 ml of methanol and then twice with 1 ml of distilled water), and GlcNAc receptor contained in the supernatant. Substrate and reaction products were adsorbed. The column was washed twice with 1 ml of distilled water, and the GlcNAc receptor substrate and the reaction product adsorbed on the column were eluted with 1 ml of methanol. The eluate was mixed with 5 ml of liquid scintillator (manufactured by Amersham Bioscience), and the radioactivity was measured using a scintillation counter (FIG. 1).
  • RNA from human colorectal cancer tissue and healthy colorectal tissue is extracted with the RNeasy Mini Kit (Qiagen) and single strand by the oligo (dT) method using the Super-Script First-Strand Synthesis System (Impitrogen). DNA.
  • RNA from human colorectal cancer tissue and healthy colorectal tissue is extracted with the RNeasy Mini Kit (Qiagen) and single strand by the oligo (dT) method using the Super-Script First-Strand Synthesis System (Impitrogen). DNA.
  • RNA as a type I primer (5 'primer: SEQ ID NO: 7 (corresponding to nucleotides 683-701 of SEQ ID NO: 1)
  • 3' primer ABI using SEQ ID NO: 8 (corresponding to base Nos. 775 to 755 of SEQ ID NO.
  • the present invention provides a novel glycosyltransferase, a nucleic acid encoding the same, and a novel assay for canceration of tissue.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　新規な糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに組織の癌化の新規な検定方法を提供する。本発明の新規な糖転移酵素は、１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素であって、配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド、を含むことを特徴とする。

Description

明細書
糖転移酵素及びそれをコードする核酸、 並びに該核酸を用いた 癌組織の検出方法 技術分野
本発明は新規な 「糖転移酵素」 及びそれをコードする 「核酸」 に関連し、 また 癌化した組織における前記核酸の発現量が増加することに基づく 「組織の癌化検 出方法」 に関する。 背景技術
近年、 生体内での糖鎖や複合糖質の働きが注目されている。 例えば、 血液型を 決定する因子は糖タンパク質であり、 また神経系の働きに関与しているのは糖脂 質である。 従って、 糖鎖を合成する働きのある酵素は、 様々な糖鎖がもたらす生 理活性を解析する上で極めて重要な手がかりとなる。
糖の中で N—ァセチルー D—ダルコサミン残基 （GlcNAc) はグリコサミノダリ カンの構成成分であると共に、 スフインゴ糖脂質、 ムチン型糖鎖と様々な糖鎖構 造に存在する糖残基である。 従って、 GlcNAcを転移する酵素は、 生体内の様々な 組織で働く糖鎖の働きを解析する上で極めて重要なツールとなる。
これまで、 Gl cNAcを転移する活性を有する N—ァセチルダルコサミン酵素は、 少なくとも 1 9種類知られており （表 1 )、 各々、 受容体基質特異性が異なる。
式名称結合式正形
m
お
Figure imgf000004_0001
発明の開示
生体内での糖鎖の働きが注目されているが、 生体内での糖鎖合成の解析は十分 に進んでいるとは言えない。 糖鎖合成のメカニズム、 生体内での糖合成の局在が 充分に解析されていないことも一因である。 糖鎖合成のメカニズムを解析するに 当たっては、 糖鎖合成酵素、 特に糖転移酵素を解析し、 その酵素を使ってどの様 な糖鎖が生成されるのかを分析する必要である。 そのために新たな糖転移酵素を 見つけだし、 その機能を解析することに対する要請が高まっている。
従って、 本発明は、 N—ァセチルー D—ダルコサミン受容体基質に N—ァセチ ル—D—ダルコサミン残基を転移する活性を有する新規な^ 1 , 3— N—ァセチ ルー D—ダルコサミン糖転移酵素タンパク質、'及びそれをコードする核酸を提供 することを目的とする。 また、 本発明、 該核酸を宿主細胞内で発現する形質転換 体、 さらに、 当該形質転換体を生育させて、 当該タンパク質を単離する方法を提 供することを目的とする。 さらにまた、 本発明は、 該核酸または該糖転移酵素夕 ンパク質の発現を示標に、 生物試料の癌化を検定する方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明タンパク質の活性への反応 PH、 各種二価金属イオン、 及び EDTA の影響を示す図である。 黒塗りの三角はマンガンイオン、 黒塗りの丸はコバルト イオン、 黒塗りの正方形はマグネシウムイオンを各々示し、 白抜きの三角は EDTA 、 白抜きの丸と菱形は陰性対照を各々示す。 縦軸は放射能の量 （dpm) を示し、 横 軸は反応 pHを示す。 発明の詳細な説明
本発明者等は、 目的とする酵素と類似した作用を有する酵素遺伝子の塩基配列 を基に、 配列同一性が高いと思われる目的とする酵素を単離及び精製を試みた。 具体的には、 まず、 公知の糖転移酵素である 3グルクロン酸転移酵素 7 ( β 3 G n T 7 ) の塩基配列をクエリーとして BLAST検索を行い、 その結果、相同性を有 する配列として E S T配列 （GenBank Access i on No. BC004908) を見出した。 さ らに、 PCRでタンパク質の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定 アミノ酸を決定した。 これにより、 当該核酸がコードするタンパク質が新規な糖 転移酵素であることを見い出した。 また、 更に癌化した組織において、 前記核酸 の発現量が健常組織における発現量よりも高まっていることを発見し、 これを組 織の癌化検出方法に応用することで本発明を完成した。
本発明は、 N—ァセチルダルコサミンを転移する活性を有するタンパク質及び これらをコードする核酸を提供することにより、 当該技術分野におけるこれらの 多様な必要性を満たすのに貢献する。
すなわち本発明は以下の通りである。
( 1 ) 下記の性質を有する 1， 3—N—ァセチルー D—ダルコサミン糖転移 酵素タンパク質。
活性： N—ァセチル— D—ダルコサミン供与体基質から N—ァセチル— D—グ ルコサミン受容体基質に N—ァセチルー D—ダルコサミン残基を転移する。
基質特異性： (1) GalNAc, (2) GlcNAc、 (3) GaK (4) Xyl、 (5) Fuc、 (6) Man 、 (7) ManNAc、 (8) Gal jS l— 4Glc、及び（9) Gal j8 1— 4GlcNAcの何れかの N—ァセ チルー D—ダルコサミン受容体基質に、 N—ァセチルー D—ダルコサミン供与体 基質から N—ァセチルー D一ダルコサミン残基を転移する。
ここで 「GalNAc」 とは N—ァセチルー D—ガラクトサミン残基を示し、 「GlcNA c」 とは N—ァセチル— D—ダルコサミン残基を示し、 「Gal」 とは D—ガラク卜一 ス残基を示し、 「Xyl」 とは D—キシロース残基を示し、 「Fuc」 とは D—フコース 残基を示し、 「Man」とは D—マンノース残基を示し、 「ManNAcJとは N—ァセチル —D—マンノース残基を示し、 「―」はグリコシド結合を示す。式中の数字は前記 グリコシド結合が存在する糖の炭素番号を示す。 「 」は糖環 1位の前記グリコシ ド結合のァノマーを示し、 5位 CH20H又は CH3との位置関係がシスのものを 「i3」 で 示す。
金属イオン要求性： 二価金属陽イオンを酵素反応に必要とする。
反応 pH : 中性近辺である。
( 2 ) 以下の （A) 又は （B ) のポリペプチドを含む ]3 1 , 3— N—ァセチル 一 D—ダルコサミン糖転移酵素タンパク質。
(A) 配列番号 2記載のアミノ酸番号 5 6乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列を有 するポリペプチド；
( B ) 配列番号 2記載のアミノ酸番号 5 6乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列にお いて、 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、 欠失、 又は挿入したアミノ酸配列を 有し、 且つ N—ァセチルー D—ダルコサミン受容体基質に、 N—ァセチルー D— ダルコサミン供与体基質から N—ァセチルー D—ダルコサミン残基を転移する活 性を有するポリペプチド。
(3) (2) (A) のポリペプチドが、 配列番号 2記載のアミノ酸番号 56乃至 402からなるアミノ酸配列からなる、 （2) 記載の糖転移酵素タンパク質。
(4) (2) (A) のポリペプチドが、 配列番号 2記載のアミノ酸番号 1乃至 4 02からなるアミノ酸配列からなる、 （2) 記載の糖転移酵素タンパク質。
(5) 糖転移酵素タンパク質が、 配列番号 2のアミノ酸番号 56乃至 402か らなるアミノ酸配列と少なくとも 50 %同一のアミノ酸配列を有する、 （2)ない し （4) のいずれか記載の糖転移酵素タンパク質。
(6) (2) 乃至 （5) 何れか記載のタンパク質をコードする塩基配列又はそ れに相補的な塩基配列からなる核酸。
( 7 ) 配列番号 1記載の塩基番号 166乃至 1206からなる塩基配列又はそ れに相補的な塩基配列からなる、 （6) に記載の核酸。
(8) 配列番号 1記載の塩基番号 1乃至 1206からなる塩基配列又はそれに 相補的な塩基配列からなる、 （6) に記載の核酸。
(9) DNAであることを特徴とする （6) 乃至 （8) 何れか記載の核酸。
(10) (6) 乃至 （9) 何れか記載の核酸、 又は当該核酸の塩基配列と相補 的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイプリダイズするこ とを特徴とする測定用核酸。
(11) 配列番号 1記載の塩基番号 683乃至 775からなる塩基配列又はそ れに相補的な塩基配列を含む、 （10) に記載の測定用核酸。
(12) 測定用核酸が、 プロ一ブ、 プライマーとして使用される、 （10) 又は (11) 記載の測定用核酸。
(13) 測定用核酸が、 癌マ一カーとして使用される、 （10) 乃至 （12) 何 れか記載の測定用核酸。
(14) DNAであることを特徴とする （10) 乃至 （13) 何れか記載の測定用 核酸。 (15) (6) 乃至 （14) 何れか記載の核酸を含むベクター。
(16) (15) 記載のベクターを含む形質転換体。
(17) (15) 記載の形質転換体を生育させ、 31, 3— N—ァセチルー D ―ダルコサミン糖転移酵素タンパク質を発現させ、 その生育物から前記糖転移酵 素を回収する、 ことを含む、 前記糖転移酵素タンパク質の製造方法。
(18) (1) 乃至 （5) 何れか記載の) 31, 3— N—ァセチルー D—ダルコ サミン糖転移酵素タンパク質を認識する抗体。
(19) 生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a) 生物試料中の （1) ないし （5) の何れか記載の ]31, 3— N—ァセチ ルー D—ダルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量し；そして
(b) 生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、 対照の正常な生物 試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の 1. 5倍以上である場合には癌化 していると判断する
工程を含む、 前記方法。
(20) (18) 記載の抗体を用いて j31， 3— N—ァセチルー D—ダルコサ ミン糖転移酵素タンパク質を定量する、 （19) 記載の検定方法。
(21) 生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a) 生物試料中の （6) 記載の核酸を定量し；そして
(b) 生物試料中の （6) 記載の核酸の定量値が、 対照の正常な生物試料中の 前記核酸の定量値の 1. 5倍以上である場合には癌化していると判断する 工程を含む、 前記方法。
(22) (a- 1) 生物試料中の （6) 記載の核酸に （10) 記載の測定用核 酸から選択される一対のプライマーをハイブリダィズさせ；
(a— 2) (6) 記載の核酸を増幅させ；
(a— 3) 前記増幅産物を定量し；そして
(b) 前記定量値が、 対照の正常な生物試料中の対応する定量値の 1. 5倍以 上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、 （21) 記載の方法。
(23) 配列番号 1記載の塩基番号 683— 775からなる塩基配列又はそれ に相補的な塩基配列を含む核酸を定量する、 （2 1) 又は （2 2) に記載の方法。 (24) 前記生物試料が、 大腸由来の試料である、 （2 1) 乃至 (2 3) 何れか 記載の方法。 発明を実施するための形態
以下、 本発明を発明の実施の形態により詳説する。
( 1) 本発明タンパク質
本発明タンパク質は G 1 cNAc受容体基質に、 G 1 cNAc供与体基質から G 1 cNAc残基を 転移する活性を有する糖転移酵素である。
ここで 「GlcNAc供与体基質」 とは、 GlcNAcを有する糖ヌクレオチドであること が好ましい。 そのような物質としては、 例えば、 アデノシン二リン酸— N—ァセ チルダルコサミン （ADP— GlcNAc)、 ゥリジン二リン酸一 N—ァセチルダルコサミ ン (UDP- GlcNAc), グアノシン二リン酸 _N—ァセチルダルコサミン (GDP-Glc NAc)、 シチジン二リン酸— N—ァセチルダルコサミン（CDP— GlcNAc)等が例示さ れ、 UDP— GlcNAcが最も好ましいが特に限定はされない。
「GlcNAc受容体基質」 は本発明タンパク質が GlcNAc供与体基質から GlcNAcを転 移することができる化合物である限り特に限定はされないが、 （1) GalNAc, (2) GlcNAc, (3) GaK (4) XyK (5) Fuc、 (6) Man, (7) ManNAc, (8) Gal l~4Glc 、 及び（9) 6&1)31—461じ^(；の何れかでぁることが好ましぃ。 さらに、 上記糖残基 の糖環 1位にひ又は ;8結合で、 これに限定されるわけではないが、 Bz、 pNp、 oNp の何れかが結合していることがより好ましい。 最も好ましい GlcNAc受容体基質は 、 GalNAcal-Bz, GalNAc |S 1 -pNp, GlcNAc αΐ— Βζ、 GlcNAc i31—Βζ、 Gal αΐ-ρ Np、 Gal /31— oNp、 Xyl ]S 1— Np FUC CK卜 pNp、 Manal— Bz、 ManNAc al—BZ Ga li31— 4GlcjSl—Bz、 Gal /31— 4GlcNAc 1—pNpの何れかである。 ここで、 「Bz」 は ベンジル基を示し、 「pNp」 はパラニトロフエ二ル基を示し、 「oNp」 はオルトニト 口フエ二ル基を示す。 また、 「一」 はグリコシド結合を示し、式中の数字は前記グ リコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示す。 「α」及び「 3」 は糖環 1位の前 記グリコシド結合のァノマ一を示し、 5位 CH20H又は CH3との位置関係がトランスの ものを 「《」、 シスのものを 「j3」 で示す。 これらの 「Gl cNAc受容体基質」 の何れかの化合物へ 「Gl cNAc残基」 を転移する 活性の確認は、 例えば [14C]又は [¾]などの放射性同位元素で GkNAc残基を放射能 標識した 「Gl cNAc供与体基質」 と、 上記 「Gl cNAc受容体基質」 で例示した各化合 物とを混合し、 そこに「本発明タンパク質」 の存在下で酵素反応させ、 「反応生成 物」 を 「Gl cNAc供与体基質」 と分離して 「反応生成物の放射能」 を測定する方法 で行うことができる。 このような方法としては具体的には後述の実施例 2記載の 方法が例示される。
「本発明タンパク質」 は酵素反応に 「二価金属陽イオン」 を必要とする （この 性質を 「金属イオン要求性」 とも記載する）。 すなわち、 「二価金属陽イオン」 を キレート剤 （例えばエチレンジァミン四酢酸 （以下 「EDTA」 とも略記する） 等） でキレートすると、 活性を実質的に失う性質を有する。
「二価金属陽イオン」 としては、 例えばカルシウムイオン （Ca2+)、 コバルトィ オン (Co2+)、 マンガンイオン (Mn2+)、 マグネシウムイオン (Mg2+) 等が挙げられ る。 好ましくは、 Mn2+、 Mg2+が 2. 5mMから 40mMの濃度で共存する条件下では酵素活 性の増強が確認される。 MnM、 Mg2+が特に好ましい。
「本発明タンパク質の反応 pH」 は中性近辺、 好ましくは、 pH6. 0から pH8. 0であ る。 例えば、 20mMの Mn2+共存下で、 pH7. 4での酵素活性の方が pH6. 6での酵素活性 よりも強い （何れも力コジル酸ナトリウム緩衝液中） という特徴を有する。 この ような酵素活性の強さの比較は、 例えば実施例 2記載の方法により、 放射能標識 を用いて容易且つ正確に行うことができる。
このような 「本発明タンパク質」 は、 より具体的には、 例えば、 以下の （A) 乃至 （Α ' ' ) のポリペプチドを含む。
(Α) 配列番号 2記載のアミノ酸番号 5 6乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列を有 するポリペプチド
(Α ' )配列番号 2記載のアミノ酸番号 5 6乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列から なるポリべプチド；
(Α " ) 配列番号 2記載のアミノ酸番号 1乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列から なるポリペプチド
また、 それらに糖鎖が結合した糖ポリぺプチドの形態の糖転移酵素も本発明夕 ンパク質の一態様として挙げられる。
なお、 一般にアミノ酸配列に 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、 欠失、 又は 挿入等の変異が存在していても、 酵素の活性が維持されることは当業者にとって は理解されうるところであり、 上記配列番号 2記載のアミノ酸番号 5 6乃至 4 0 2からなるァミノ酸配列からなるポリべプチド又は配列番号 2記載のアミノ酸番 号 1乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドの当該アミノ酸配列 に於いても 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 又は挿入等の変異が存在し ていても 「糖転移酵素活性」 を有する限りにおいて上記 「ポリペプチド」 として 使用することができる。
すなわち、天然に存在するポリペプチドには、それをコードする DNAの多型や変 異の他、 生成後のポリペプチドの細胞内及び精製中の修飾反応などによってその アミノ酸配列中にアミノ酸の置換、 欠失、 又は挿入等の変異が起こりうるが、 そ れにも拘わらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、 生物学的活 性を示す物があることが知られている。 このように構造的に若干の相違があって もその機能については大きな違いが認められないものも、 上記 「ポリペプチド」 に包含される。 人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記の様な変異を導入し た場合も同様であり、 この場合には更に多種多様の 「変異を有するポリペプチド 」 を作成することが可能である。 なお、 このような置換、 欠失、 又は挿入等の変 異には、 「転位」、 核酸中の一部分の別位置への移動、 例えば、 染色体上の遺伝子 移動も含む。
例えば、 ヒトインターロイキン 2 (IL-2) のアミノ酸配列中の、 あるシスティ ン残基をセリン残基に置換したポリぺプチドが IL- 2の活性を保持することが知ら れている (Sc ience, 224 (1984) , ρ. 1431)。 またある種のポリペプチドは、活性に は必須でないペプチド領域を有していることが知られている。 例えば、 細胞外に 分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、 プロテア一ゼの前駆体 等に見られるプロ配列などがこれに当たり、 これらの領域のほとんどは翻訳後、 又は活性型ポリぺプチドへの転換に際して除去される。 このような活性に必須で ないペプチド領域の配列を有するポリペプチドは、 二次構造上は異なった形で存 在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドであり、 「本発明タン パク質のポリペプチド」 もそのような配列が連結していても良い。 このような 「 変異を有するポリペプチド」 は 「部位特異的変異法」 などの公知の方法により容 易に作成することが可能である。
なお、 ここで 「複数個」 とは、 GlcNAc供与体基質から GlcNAc受容体基質に GlcN Ac残基を転移する糖転移活性を有する限りに於いて 「複数個」 とは特に限定はさ れないが、好ましくは全ァミノ酸数の 10 以下、より好ましくは 5%以下程度のアミ ノ酸数を示す。例えば 347個のアミノ酸からなるポリペプチド （例えば上述の（A ') 記載のポリペプチド） に於いては 35個以下、 好ましくは 17個以下を示し、 また 402個のアミノ酸からなるポリペプチド （例えば上述の （Α'')記載のポリべプチ ド） に於いては 40個以下、 好ましくは 20個以下を示す。
本発明の糖転移酵素タンパク質は、 クローニングされた核酸の塩基配列からの 推定に基づいて、 配列番号 2のアミノ酸配列を有するが、 その配列を有するタン パク質のみに限定されるわけではなく、 本明細書中に記載した特性を有する限り 全ての相同タンパク質を含むことが意図される。
本発明タンパク質について、 BLASTによる同一性検索を行うと、 最も似て いる ]33 GnT 7とは 46%の同一性である。 従って、 本発明タンパク質は新規 な酵素であると考えられる。 よって、 同一性は、 少なくとも 50%以上、 好まし くは 60%以上、 より好ましくは 70%以上、 さらに好ましくは 80%以上、 さ らになお好ましくは 90 %以上、 最も好ましくは 95%以上である。
本願明細書において、 同一性のパーセントは、 例えば、 Altschulら （Nuc. Aci ds Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されている BLASTプログラム、あるいは Pearsonら （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, p.2444-2448, 1998) に記載されてい る FASTAを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは 、 インターネッ卜上で National Center for Biotechnology Information (NCBI) 、あるいは DNA Data Bank of Japan (DDBJ)のウェブサイトから利用することが可 能である。 各プログラムによる同一性検索の各種条件 （パラメーター） は同サイ 卜に詳しく記載されており、 一部の設定を適宜変更することが可能であるが、 検 索は通常デフォルト値を用いて行う。 なお、 当業者に用いられる、 配列比較の他 のプログラムもまた、 使用可能である。 一般的に、 同様の性質を有するアミノ酸同士の置換 （例えば、 ある疎水性アミ ノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、 ある親水性アミノ酸から別の親水性アミ ノ酸への置換、 ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、 あるいはある 塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換） を導入した場合、 得られる変 異タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。 遺伝子組換 え技術を使用して、 このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作成する 手法は当業者に周知であり、 このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれ る。
本発明のタンパク質は、 例えば、 後述する実施例 1に従って、 本発明の核酸に よる配列番号 1に記載の核酸を適当な宿主細胞、 例えば、 大腸菌、 酵母、 昆虫、 又は動物細胞に、 それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入し、 発 現させることにより、 当該タンパク質を大量に得ることができる。
本発明によって、このタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする DNA配列 が開示されれば、 当該配列又はその一部を利用して、ハイブリダィゼーシヨン、 P CR等の核酸増幅反応等の遺伝子工学的手法を用いて、 他の生物種から同様の生理 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。 こ のような場合、 それらの遺伝子がコードする新規タンパク質も本発明の範囲に含 まれる。 '
なお、 本発明タンパク質は、 そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、 前記酵素活性を有するものであれば、 タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。 より具体的には、 後述する実施例 2に記載したように、 本発明タンパク質にお ける受容体基質の探索から、 該タンパク質は、 N _ァセチルー D—ダルコサミン に N—ァセチルー D—ダルコサミンを転移する活性を有するものである。 特に、 配列相同性より、 3 1， 3—N—ァセチル— D—ダルコサミン糖転移活性を有す ると考えられる。
( 2 ) 本発明核酸
本発明はまた、 本発明の新規糖転位酵素タンパク質の全長または断片をコード する核酸を提供する。
「本発明核酸」 としては、 例えば配列番号 1記載の塩基番号 6 8 3乃至 7 7 5 からなる塩基配列からなる核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸 （本発 明核酸 1 )、配列番号 1記載の塩基番号 1 6 6乃至 1 2 0 6 (配列番号 2のァミノ 酸残基 5 6— 4 0 2をコードする） からなる塩基配列からなる核酸 （本発明核酸 2 )、配列番号 1記載の塩基番号 1乃至 1 2 0 6 (配列番号 2のアミノ酸残基 1一 4 0 2をコードする） からなる塩基配列からなる核酸 （本発明核酸 3 ) 又はそれ らに相補的な塩基配列からなる核酸が例示される。 これらの核酸がコードするァ ミノ酸配列と縮重により同一のアミノ酸配列をコードする核酸も本発明に含まれ る。
上記 「本発明核酸 1」 は、 例えば後述の 「本発明検出法」 への利用に適した核 酸である。
上記 「本発明核酸 2」 は、 「本発明タンパク質のポリペプチド」 のうち、 「膜貫 通領域 （疎水性アミノ酸が 10乃至 20個程度連続した領域） を欠失した態様のポリ ペプチド」 をコードするので、 当該核酸を発現させることによって生成されるポ リペプチドを 「可溶性ポリペプチド」 とすることができる。 また 「本発明核酸 3 」 は、 「本発明タンパク質のポリペプチド」 の全配列をコードする。 特に 「本発明 核酸 2」 や 「本発明核酸 3」 等は、 タンパク質合成における終始コドンに相当す る塩基配列を含むため、 「配列番号 2記載のアミノ酸番号 56乃至 402からなるアミ ノ酸配列からなるポリペプチド」 （上記 （Α ' ) 記載のポリペプチド） や 「ァミノ 酸番号 1乃至 402からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」 （上記（Α ' ' )記載 のポリペプチド） を遺伝子工学的に調製するためにも使用することができる。
「本発明核酸」 は、 一本鎖及び二本鎖型両方の DNA、 及びその RNA相補体も含む 。 DNAには、 例えば、 天然由来の DNA、 組換え MA、 化学結合した DNA、 PCRによって 増幅された DNA、 及びそれらの組み合わせが含まれる。後述の 「癌化検出方法」 に プローブ等として使用する場合や、 ベクターや形質転換体の調製時に安定である 点で優れるため、 DNAであることが好ましい。
特に配列番号 1記載の塩基配列の全部又は一部を有する核酸は、 例えば 「本発 明核酸」 の生体内での発現状況などを検査するための、 プライマー、 プローブ等 として使用することができ、 医学研究用の試薬又は診断薬として極めて有用であ る。 このようなプローブとしての核酸はあまりに分子量が大きいと取扱が困難と なるため、 40塩基乃至 1209塩基が例示され、 より好ましくは 50塩基乃至 500塩基、 最も好ましくは 60塩基乃至 300塩基が例示される。合成オリゴヌクレオチドのプロ ーブ又はプライマーとして利用する場合には、 少なくとも 10塩基以上、 好まし くは、 1 5塩基以上、 より好ましくは 20塩基以上である。 好ましくは 50塩基 以下である。
なお、 ここで 「ストリンジエンドな条件下」 とは、 中程度又は高程度なス卜リ ンジェントな条件においてハイブリダィズすることを意味する。 具体的には、 中 程度のストリンジェントな条件は、 例えば、 MAの長さに基づき、 一般の技術を有 する当業者によって、 容易に決定することが可能である。 基本的な条件は、 Samb rookら、 Molecular Cloning: A Laboratory ManuaK 第 3版、 Vol. K 7.42-7.45 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、そしてニトロセルロース フィル夕一に関し、 5XSSC、 0.5¾ SDS、 1.0 mM EDTA (pH8.0)の前洗浄溶液、 約 4 0— 50°Cでの、 約 50%ホルムアミド、 2XSSC-6XSSC (又は約 42°Cでの約 50%ホル ムアミド中の、 スターク溶液 （Stark's solution) などの他の同様のハイブリダ ィゼーシヨン溶液） のハイブリダィゼ一シヨン条件、 および約 60°C、 0.5XSSC, 0 .1% SDSの洗浄条件の使用が含まれる。 高ストリンジェントな条件もまた、 例え ば DNAの長さに基づき、 当業者によって、容易に決定することが可能である。一般 的に、 こうした条件は、 中程度にストリンジェン卜な条件よりも高い温度及び Z 又は低い塩濃度でのハイブリダィゼーシヨン及び 又は洗浄を含み、 例えば上記 のようなハイブリダィゼーシヨン条件、 及びおよそ 68°C、 0.2XSSC, 0.1% SDSの 洗浄を伴うと定義される。 当業者は、 温度および洗浄溶液塩濃度は、 プローブの 長さ等の要因に従って、 必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
「本発明核酸」 は例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知の) 33グルクロン酸転移酵素 7 ()33GnT7) の塩基配列（GenBank Accession NO.AK000770) (配列番号 1 0 ) をクエリーとして塩基配列の検索を行ない、 EST( GenBank Accession No. BC004908)の相補配列を得ることができた。この相補配列 又はその一部を利用して、 ハイブリダィゼーシヨンや核酸増幅反応等の遺伝子ェ 学の基本的手法を用いて cDNAライブラリーなどから本発明核酸 （例えば本発明 DN A) を調製することができる。上記相補配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号 2)は N末端に膜貫通領域を有することが予測されるので、 この膜貫通領域を有し ないポリペプチドをコードする塩基配列の領域を調製すると、 可溶化形態のポリ ペプチドをコードする 「本発明核酸」 が得られる。
配列番号 2のァミノ酸配列より、 ァミノ酸番号 1乃至 55が膜貫通領域である 。 よって、 当該領域の全部又は一部を欠如したポリペプチド及び当該ポリべプチ ドをコ一ドする核酸は、 「可溶化形態のポリぺプチドまたはその核酸」として本発 明に含まれる。 例えば 「配列番号 2記載のアミノ酸番号 56乃至 402からなる アミノ酸配列」 が挙げられ、 このようなアミノ酸配列からなる可溶化形態のポリ ペプチドをコードする核酸としては、 「配列番号 1記載の塩基番号 1 66乃至 1 209からなる塩基配列からなる核酸」 が例示される。 このような核酸の調製は 、 例えば配列番号 3記載の配列を 5 ' プライマ一 （配列番号 3の塩基番号 32—
56は、配列番号 1の塩基番号 166— 1 90に対応する）、配列番号 4記載の配 列を 3 ' プライマ一 （配列番号 4の塩基番号 3 1— 55は、 配列番号 1の塩基番 号 1 209— 1 185に対応する） として使用し、 例えばヒトゲノム cDNAライブ ラリーを铸型として常法に従つて核酸増幅反応を行うことで調製することができ る。
ここで、 核酸増幅反応は、 例えば、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) [Saiki R.K. ， et al.， Science, 230, 1350-1354 (1985)]、 ライゲース連鎖反応 (LCR) [Wu D. Y.， et al., Genomics, 4, 560-569 (1989)； Barringer K. J., et al.， Gen e， 89, 117-122 (1990)； Barany F. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88， 189—19 3 (1991)] 及び転写に基づく増幅 [Kwoh D. Y. , et al., Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 86, 1173-1177 (1989)] 等の温度循環を必要とする反応、 並びに鎖置換 反応 (SDA) [Walker G. T.， et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89， 392-39
6 (1992)； Walker G. T.， et al., Nuc. Acids Res., 20, 1691-1696 (1992)]、 自己保持配列複製 (3SR) [Guatelli J. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,
1874-1878 (1990)] および Q ]3レプリカ一ゼシステム [リザイルディら、 BioTec hnology 6, p.1197-1202 (1988)] 等の恒温反応を含む また、 欧州特許第 05258 82号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増 幅 (Nucleic Acid Sequence Based Amplification: NASABA)反応等も利用可能で ある。 好ましくは PCR法である。
配列番号 3及び 4のプライマーを使用した場合、 PCR産物として約 1. lkbpの DNA 断片が得られるので、 これを例えばァガロースゲル電気泳動等の分子量により DN A断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って 単離して 「本発明核酸」 を得ることができる。
上記のようなハイプリダイゼーション、 核酸増幅反応等を使用してクロ一ニン グされる相同な核酸は、 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列に対して少なくと も 50%以上、 好ましくは 60%以上、 より好ましくは 70%以上、 さらに好ま しくは 80%以上、 さらになお好ましくは 90%以上、 最も好ましくは 95%以 上の同一性を有する。
同一性パーセントは、 視覚的検査および数学的計算によって決定することが可 能である。 あるいは、 2つの核酸配列の同一性パーセントは、 Devereuxら， Nucl . Acids Res. 12: 387, 1984に記載され、 そしてウィスコンシン大学遺伝学コン ピュー夕一グループ （UWGCG) より入手可能な GAPコンピュータ一プログ ラム、 バ一ジョン 6.0を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能であ る。 GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメ一夕一には: ( 1) ヌクレオチ ドに関する単一（unary)比較マトリックス （同一に対し 1および非同一に対し 0 の値を含む）、 並びに Schwartz及び Dayhoff監修， Atlas of Protein Sequence an d Structure, pp.353-358, National Biomedical Research Foundation, 1979に 記載されるような、 Gribskov及び Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986の 加重比較マトリックス；（2) 各ギャップに対する 3.0のペナルティおよび各ギヤ ップ中の各記号に対しさらに 0.10のペナルティ ；及び （3) 末端ギャップに対す るペナルティなし、 が含まれる。 当業者に用いられる、 配列比較の他のプロダラ ムもまた、 使用可能である。
(3) 本発明のベクタ一及び形質転換体
本発明によれば、 単離した 「本発明核酸」 を含む組換えベクターが提供される 。プラスミド等のベクターに本発明核酸の MA断片を組込む方法としては、例えば 、 Sambrook, J.ら， Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.1 (2001)に記載の方法などが挙げられる。簡 便には、 市販のライゲーシヨンキット （例えば、 宝酒造製等） を用いることもで きる。 このようにして得られる組換えベクター （例えば、 組換えプラスミド） は
、 宿主細胞 （例えば、 大腸菌 DH5 Q!、 TB1、 LE392、 又は XL-LE392又は XL- lBlue等） に導入される。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、 Sambrook, J.ら， Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laborator y, 16.1 (2001)に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム Z塩化ルビジゥ ム法、 エレクトロボレ一シヨン法、 エレクト口インジェクション法、 PEGなど の化学的な処理による方法、 遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
ベクタ一は、 簡単には当業界において入手可能な組換え用べクタ一 （例えば、 プラスミド DNA等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製するこ とができる。 用いられるベクターの具体例としては、 大腸菌由来のプラスミドと して、 例えば、 PDONR20K pBluescript, pUC18、 pUC19、 pBR322等が例示されるが 、 これらに限定されない。
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが 可能である。発現ベクターは、 「本発明タンパク質を発現させたい宿主細胞」に適 したものを当業者であれば適宜選択することができる。 このように本発明発現べ クタ一は上記の本発明核酸が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に 関与する領域 （プロモーター領域、 ェンハンサー領域、 オペレーター領域等） が 適切に配列されており、 さらに本発明核酸が適切に発現するように構築されてい ることが好ましい。 また、 発現べクタ一の構築は、 制限処理及び連結作業を必要 としない、 Gatewayシステム （インビトロジェン社） を用いることもできる。 Gat ewayシステムとは、 P C R産物の方向性を維持したままクローニングができ、 ま た、 DN A断片を適切に改変した発現べクタ一にサブクロ一ニングを可能にした 部位特異的な組換えを利用したシステムである。 具体的には、 P CR産物とドナ 一ベクターとから部位特異的な組換え酵素である B Pクロナーゼによってェント リークローンを作成し、 その後、 このクローンと別の組換え酵素である LBクロ ナーゼによつて組換え可能なデスティネーシヨンベクターに P C R産物を移入す ることにより、 発現系に対応した発現クローンを調製するものである。 最初にェ ントリ一クローンを作成すれば、 制限酵素ゃリガーゼで作業する手間の係るサブ クローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
発現ベクターの種類は、 原核細胞及び/又は真核細胞の各種の宿主細胞中で所 望の遺伝子を発現し、 所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特 に限定されないが、 例えば、 大腸菌用発現ベクターとして、 PQE- 30、 pQE_60、 pM AL-C2、 pMAL- p2、 pSE420などが好ましく、 酵母用発現ベクターとして pYES2 (サッ カロマイセス属）、 PIC3.5K, pPIC9K, pA0815 (以上ピキア属）、 昆虫用発現べク 夕一として pFastBac、 pBacPAK8/9、 pBK283, pVL1392、 pBlueBac4.5などが好まし い。
上記 「本発明発現ベクター」 を宿主細胞に組み込み、 形質転換体を得ることが できる。 上記 「宿主細胞」 として真核細胞 （ほ乳類細胞、 酵母、 昆虫細胞等） で あっても原核細胞 （大腸菌、 枯草菌等） であっても使用することができる。 本発 明の形質転換体をえるための宿主細胞は、 特に限定されず、 さらに、 または、 ヒ ト （例えば、 He L a、 293 T、 SH— SY5Y)、 マウス （例えば、 Ne u r o 2 a、 N I H3T3) 等由来の培養細胞でもよい。 これらはいずれも公知であ り、 市販されているか （例えば、 大日本製薬社)、 あるいは公共の研究機関 （例え ば、 理研セルバンク) より入手可能である。 あるいは、 胚、 器官、 組織若しくは 非ヒト個体も使用可能である。
ところで 「本発明核酸」 はヒトゲノムライブラリ一から発見された核酸である ため、 本発明においては真核細胞を本発明の形質転換体の宿主細胞として用いる とより天然物に近い性質を有した 「本発明タンパク質」 が得られる （例えば糖鎖 が付加された態様など） と考えられる。 従って、 「宿主細胞」 としては真核細胞、 特にほ乳類細胞を選択することが好ましい。 ほ乳類細胞としては、 具体的には、 マウス由来、 動物細胞としてはマウス由来、 アフリカッメガエル由来、 ラット由 来、 ハムスター由来、 サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から 樹立した培養細胞株などが例示される。 また、 宿主細胞としての大腸菌、 酵母又 は昆虫細胞は、 具体的には、 大腸菌 (腿 c M15、 JM109, BL21等）、 酵母 (INVSc 1 (サッカロマイセス属）、 GS115、 KM71 (以上ピキア属） など）、 昆虫細胞 （Sf21 、 BmN4、 カイコ幼虫等） などが例示される。 宿主細胞として細菌、 特に大腸菌を用いる場合、 一般に発現ベクターは少なく とも、 プロモーター オペレーター領域、 開始コドン、 所望のタンパク質をコー ドする遺伝子、 終止コドン、 ターミネ一夕一および複製可能単位から構成される 宿主細胞として酵母、 植物細胞、 動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、 一般に発現ベクターは少なくとも、 プロモーター、 関始コドン、 所望のタンパク 質をコードする遺伝子、 終止コドン、 ターミネータ一を合んでいることが好まし い。 またシグナルペプチドをコードする DNA、 ェンハンサー配列、 所望の遺伝子の 5 ' 側および 3 ' 側の非翻訳領域、 選択マーカー領域または複製可能単位などを 適宜含んでいてもよい。
本発明のベクターにおいて、 好適な開始コドンとしては、 メチォニンコドン （ AT G) が例示される。 また、 終止コドンとしては、 常用の終止コドン （例えば 、 T A G , T G A、 T A Aなど） が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全 DNA配列を複製することができる能力を もつ DMを意味し、 天然のプラスミド、 人工的に修飾されたプラスミド （天然のプ ラスミドから調製されたプラスミド） および合成プラスミド等が含まれる。 好適 なプラスミドとしては、 E. co l iではブラスミド pQE30、 pET又は pCAL若しくはそれ らの人工的修飾物 （pQE30、 pET又は pCALを適当な制限酵素で処理して得られる DN Aフラグメント） が、 酵母ではプラスミド PYES2若しくは pP IC9Kが、 また昆虫細胞 ではプラスミド pBacPAK8/9等があげられる。
ェンハンサー配列、 ターミネータ一配列については、 例えば、 それぞれ S V 4 0に由来するもの等、 当業者において通常使用されるものを用いることができる 選択マ—カーとしては、 通常使用されるものを常法により用いることができる 。 例えばテトラサイクリン、 アンピシリン、 またはカナマイシンもしくはネオマ イシン、 ハイグロマイシンまたはスぺクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子な どが例示される。
発現ベクターは、 少なくとも、 上述のプロモーター、 開始コドン、 所望のタン パク質をコードする遺伝子、 終止コドン、 およびターミネータ一領域を連続的か つ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。 ま たこの際、 所望により制限酵素での消化や T4 DNAリガーゼを用いるライゲーショ ン等の常法により適当な DNAフラグメント （例えば、 リンカ一、他の制限酵素部位 など） を用いることができる。
本発明の発現ベクターの宿主細胞への導入 [形質転換（形質移入)]は従来公知 の方法を用いて行うことができる。
例えば、 細菌 (E. coli, Bacillus subtilis等) の場合は、 例えば Cohenらの方 法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、 プロトプラスト法 [Mol. Gen. Genet., 168， 111 (1979)] やコンビテント法 [J. Mol. Biol., 56， 209 ( 1971)] によって、 Saccharomyces cerevisiaeの場合は、 例えば Hinnenらの方法 [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927 (1978)] やリチウム法 [J. B. Bacteri ol.， 153, 163 (1983)] によって、 植物細胞の場合は、 例えばリーフディスク法 [Science, 227, 129 (1985)]、 エレクト口ポレーシヨン法 [Nature, 319, 791 (1986)] によって、 動物細胞の場合は、 例えば Grahamの方法 [Virology, 52, 45 6 (1973)]、 昆虫細胞の場合は、 例えば Su誦 erらの方法 [Mol. Cell Biol., 3, 2 156-2165 (1983)] によってそれぞれ形質転換することができる。
(4) 本発明タンパク質の単離 ·精製
近年は遺伝子工学的手法として、 形質転換体を培養、 生育させてその培養物、 生育物から目的物質を単離 ·精製する手法が確立されている。
本発明タンパク質は、 例えば、 上記の如く調製された発現べクタ一を含む形質 転換体を栄養培地で培養することによって発現 （生産） することができる。 栄養 培地は、 宿主細胞 （形質転換体） の生育に必要な炭素源、 無機窒素源もしくは有 機窒素源を含んでいることが好ましい。 炭素源としては、 たとえばグルコース、 デキストラン、 可溶性デンプン、 ショ糖、 メタノールなどが、 例示される。 無機 窒素源もしくは有機窒素源としては、 例えばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 アミ ノ酸、 コ一ンスチープ' リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 パレ イショ抽出液などが例示される。 また、 所望により他の栄養素 （例えば無機塩 ( 例えば、 塩化ナトリウム、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥム）、 ビタミン類、 抗生物質 （例えばテトラサイクリン、 ネオマイシン、 ァ ンピシリン、 カナマイシン等） など） を含んでいてもよい。 培養は、 当業界にお いて知られている方法により行われる。 培養条件、 例えば温度、 培地の p H及び 培養時間は、 本発明のタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。 本発明のタンパク質は、 上記培養により得られる培養物より以下のようにして 取得することができる。 すなわち、 本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積する 場合には、 遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、 これを適当な緩衝 液 （例えば濃度が 1 0〜 1 0 0 mM程度のトリス緩衝液、 リン酸緩衝液、 H E P E S緩衝液、 M E S緩衝液などの緩衝液。 p Hは用いる緩衝液によって異なるが 、 p H 5 . 0〜9 . 0の範囲が望ましい） に懸濁した後、 用いる宿主細胞に適し た方法で細胞を破壊し、 遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。 一方、 本発明 のタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、 遠心分離やろ過などの操作に より宿主細胞と培地を分離し、 培養ろ液を得る。 宿主細胞破壊液、 あるいは培養 ろ液はそのまま、 または硫安沈殿と透析を行なった後に、 本発明のタンパク質の 単離，精製に供することができる。 単離 ·精製の方法としては、 以下の方法が挙 げることができる。 即ち、 当該タンパクに 6 Xヒスチジンや G S T、 マルト一ス 結合タンパクといったタグを付けている場合には、 一般に用いられるそれぞれの タグに適したァフィ二ティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができ る。 一方、 そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、 例えば後述する実施例に'詳しく述べられている方法、 即ちイオン交換クロマトグ ラフィ一による方法を挙げることができる。 また、 これに加えてゲルろ過や疎水 性クロマトグラフィー、 等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙 げることができる。
本発明タンパク質を、 糖タンパク質、 オリゴ糖または多糖等に作用させること により、 N—ァセチルダルコサミンが転移される。 従って、 本発明タンパク質は 、 糖タンパク質の糖鎖の修飾や、 糖類の合成に用いることができる。 さらに、 本 発明タンパク質を免疫原として動物に投与することにより、 該タンパク質に対す る抗体を作製することができ、 該抗体を用いて免疫測定法により該ダンパク質を 測定することが可能になる。 従って、 本発明タンパク質及びこれをコードする核 酸は、 このような免疫原の作製に有用である。 本発明発現ベクターはそのような本発明タンパク質の単離 ·精製が容易となる ように構築されていることが好ましい。 特に 「本発明タンパク質」 を 「酵素活性 を有するポリペプチド （例えば上述の （Α)、 (Α ' ) 又は （Α ' ' ) 記載のポリぺプ チド）」 と 「標識ペプチド」 との 「融合タンパク質」 の形態で発現するように構築 した 「本発明発現ベクター」 を用いて遺伝子工学的に 「本発明タンパク質」 を調 製すると単離 ·精製が容易となるため好ましい。
上記「識別ペプチド」 の例としては、 「本発明タンパク質」 を遺伝子組み換えに よって調製する際に、 該 「識別ペプチド」 と 「酵素活性を有するポリペプチド」 とが結合した 「融合タンパク質」 として発現させることにより、 形質転換体の生 育物から 「本発明タンパク質」 の分泌，分離 ·精製又は検出を容易にすることを 可能とする機能を有したペプチドである。 このような 「識別ペプチド」 としては 、 例えばシグナルペプチド (多くのタンパク質の Ν末端に存在し、 細胞内の膜透過 機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している 15〜30アミノ酸 残基からなるペプチド：例えば (kpA、 0即1\ Dsb等）、 プロテインキナ一 A、 プロ ティン A (黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約 42， 000のタンパク質）、 グ ル夕チオン S転移酵素、 Hi sタグ （ヒスチジン残基を 6乃至 10個並べて配した配列） 、 mycタグ（cMycタンパク質由来の 1 3アミノ酸配列）、 FLAGペプチド （8アミノ酸 残基からなる分析用マーカ一）、 T7タグ（genel Oタンパク質の最初の 1 1アミノ酸残 基からなる）、 Sタグ （滕臓 RNaseA由来の 15アミノ酸残基からなる）、 HSVタグ、 pe IB (大腸菌外膜タンパク質 pe lBの 22アミノ酸配列）、 HAタグ（へマグルチニン由来 の 10アミノ酸残基からなる）、 Trxタグ （チォレドキシン配列）、 CBPタグ （カルモ ジュリン結合ペプチド）、 CBDタグ （セルロース結合ドメイン）、 CBRタグ （コラー ゲン結合ドメイン）、 ]3 - l ac/b lu ( )3ラクタマーゼ）、 j3 -gal ( i3ガラクトシダー ゼ）、 luc 0レシフェラ一ゼ）、 HP-Th i o (Hi s- patchチォレドキシン）、 HSP (熱ショ ックペプチド）、 Ln r (ラミニンァペプチド）、 Fn (フイブロネクチン部分べプチ ド）、 GFP (緑色蛍光ペプチド）、 YFP (黄色蛍光ペプチド）、 CFP (シアン蛍光ぺプ チド）、 BFP (青色蛍光ペプチド）、 DsRed、 DsRed2 (赤色蛍光ペプチド）、 MBP (マ ル！ ^一ス結合ペプチド）、 LacZ (ラクト一スオペレーター）、 IgG (免疫グロブリン G)、 アビジン、 プロテイン G等のペプチドが挙げられ、 何れの識別ペプチドであつ ても使用することが可能である。 その中でも特にシグナルペプチド、 プロテイン キナーゼ 、 プロテインお ダル夕チオン s転移酵素、 Hisタグ、 mycタグ、 FLAGぺプ チド、 T7タグ、 Sタグ、 HSVタグ、 pelB又は HAタグが、 遺伝子工学的手法による本 発明タンパク質の発現、 精製がより容易となることから好ましく、 特に FLAGぺプ チド（Asp— Tyr— Lys— Asp— Asp— Asp— Asp— Lys) (配列番号 6 ) との融合タンパ ク質として 「本発明タンパク質」 を得るのが、 取扱面で極めて優れているため好 ましい。 上記 FLAGペプチドは非常に抗原性であり、 そして特異的なモノクローナ ル抗体が可逆的に結合するェピトープを提供し、 発現された組換えタンパク質の 迅速なアツセィおよび容易な精製を可能にする。 4E11と称されるネズミハイプリ ドーマは、本願明細書に援用される米国特許第 5，011, 912に記載されるように、特 定の二価金属陽イオンの存在下で、 FLAGペプチドに結合するモノクローナル抗体 を産生する。 4E11ハイプリドーマ細胞株は、 寄託番号 HB 9259下に、 アメリカン · タイプ'カルチヤ一 'コレクション （American Type Culture Collection) に寄 託されている。 FLAGペプチドに結合するモノクローナル抗体は、 Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, コネチカット州ニューヘブンより 入手可能である。
ほ乳類細胞で発現可能であって、 かつ上述の FLAGぺプチドとの融合タンパク質 として 「本発明タンパク質」 を得ることができる基本ベクターとしては例えば PF LAG-CMV-1 (シグマ社）、 FBIF (pFastBac (インビトロジェン社） に FLAGペプチド をコードする領域を組み込んだベクター：後述の実施例参照） 等が例示されるが 、 当業者であれば 「本発明タンパク質」 の発現に使用する宿主細胞、 制限酵素、 識別べプチドなどから判断して適当な基本べクタ一を選択することが可能である なお、 本発明によって 「本発明核酸の塩基配列」 が開示されたため、 当業者で あれば目的とする 「本発明核酸」 や調製したい 「本発明核酸の一部の領域」 の両 端の塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いて PCR法などによって目 的の領域を増幅して調製することが容易である。
(5) 本発明測定用核酸
本発明によれば、 本発明核酸とハイブリダィズする核酸 （以下、 「測定用核酸」 と称する） が提供される。 本発明測定用核酸は、 典型的には、 本発明タンパク質 をコードする核酸の天然由来の又は合成されたフラグメントであり、 プライマー 又はプローブを含むが、 これらに限定されるものではない。 なお、 本明細書にお いて使用される用語 「測定」 には、 検出、 増幅、 定量、 および半定量のいずれも が包含される。
( a ) プライマー
本発明測定用核酸を核酸増幅反応用のプライマーとして使用する場合、 本発明 測定用核酸は、 オリゴヌクレオチドであって、
配列番号 2に示すタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を 満たすように 2つの領域を選択し：
1 ) 各領域の長さが 1 5— 5 0塩基であること；
2 ) 各領域中の G + Cの割合が 4 0— 7 0 %であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖 DN Aを製造し、 または、 上記一本鎖 DNAによってコードされるアミノ酸残基を変化さ せないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖 DNAの混合物を製造し、さらに必 要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を 失わないように修飾した上記一本鎖 DNAを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
本発明のプライマーは、 本発明核酸の部分領域と相同的な配列を有することが 好ましいが、 1または 2塩基の不一致があっても差し支えない。
なお、 本発明のプライマーの塩基数は 1 5塩基以上、 好ましくは 1 8塩基以上 、 より好ましくは 2 1塩基以上であり、 5 0塩基以下である。
本発明のプライマ一は、 典型的には、 配列番号 7 (配列番号 1の塩基番号 6 8 3 - 7 0 1に対応する） 及び配列番号 8 (配列番号 1の塩基番号 7 7 5— 7 5 5 に対応する） の塩基配列を有し、 単独、 又はプライマ一対として用いることがで さる。
( b ) プローブ
本発明測定用核酸をプローブとして使用する場合、 本発明測定用核酸は、 配列 番号 1に記載の塩基配列の全体又は部分領域と相同的な配列を有することが好ま しい。 本発明の測定用核酸が、 c D NAプローブの場合、 塩基数は、 1 0塩基以 上、 好ましくは 1 5塩基以上で、 最長で、 コード領域の全長、 即ち、 1 2 0 9塩 基である。 配列番号 1に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と 5 0 %以 下、 好ましくは 2 0 %以下の不一致があっても、 プローブとしての機能を果たし 得る。 また、 本発明の測定用核酸が、 合成オリゴヌクレオチドの場合、 塩基数は 1 5塩基以上、 好ましくは 2 0塩基以上である。 合成オリゴヌクレオチドの場合 、 長さによるが、 配列番号 1に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と 1 または 2塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たしうる。
本発明のプローブは、 例えば、 配列番号 9に記載された塩基配列を有する。 こ れは、 配列番号 1の塩基番号 7 0 7— 7 2 4の相当し、 配列番号 7および 8をプ ライマ一として核酸増幅反応を行つた場合、 その増幅産物にハイプリダイズして 検出しうる。
本発明のプロ一ブには、 該プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを検 出または確認するために、 蛍光標識、 放射標識、 ビォチン標識等の標識を付した 標識プロ一ブが含まれる。 被検核酸またはその増幅物を固相化し、 標識プローブ とハイブリダィズさせ、 洗浄後、 固相に結合された標識を測定することにより、 検体中に被検核酸が存在するかを決定することができる。
一般的に、 PCRのような核酸増幅法自体は、 当該技術分野において周知であり、 そのための試薬キットおよび装置も市販されているので容易に行うことができる 。 上記した本発明のプライマー対を用い、 被検核酸を铸型として用いて核酸増幅 法を行うと、 被検核酸が増幅されるのに対し、 検体中に被検核酸が含まれない場 合には増幅が起きないので、 増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が 存在するか否かを知ることができる。 増幅産物の検出は、 増幅後の反応溶液を電 気泳動し、 バンドをェチジゥムプロミド等で染色する方法や、 電気泳動後の増幅 産物をナイロン膜等の固相に不動化し、 被検核酸と特異的に八イブリダィズする 標識プローブとハイブリダィズさせ、 洗浄後、 該標識を検出することにより行う ことができる。 また、 クェンチヤ一蛍光色素とレポ一夕一蛍光色素を用いた定量 的 RT- PCRを行うことにより、 検体中の被検核酸の量を定量することも可能である 。 なお、 定量的 RT-PCR用のキットも市販されているので、 容易に行うことができ る。 さらに、 電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能 である。 なお、 被検核酸は、 mRNAでも、 mRNAから逆転写した c DNAであってもよ い。被検核酸として mRNAを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いた N 3 8八法（3 3尺法、 TMA法）を採用することもできる。 NA S B A法自体は 周知であり、 そのためのキットも市販されているので、 上記一対のプライマーを 用いて容易に実施することができる。
( 6 ) 本発明検定方法
本発明者らは、 本発明の新規) 3 1 , 3— N—ァセチル—D—ダルコサミン糖転 移酵素タンパク質、 及び/又は核酸の発現量が、 癌組織において正常組織よりも 多いことを見出した。 よって、 本発明の生物試料中において本発明のタンパク質 または核酸を定量し、 対照の正常な生物試料中の相当する量と比較することによ り、 生物試料の癌化を検定することが可能である。
具体的には、 本発明は、 生物試料の癌化を検定する方法であって、
( a ) 生物試料中の本発明の /3 1 , 3— N—ァセチルー D—ダルコサミン糖転 移酵素タンパク質を定量し；そして
( b ) 生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、 対照の正常な生物 試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の 1 . 5倍以上である場合には癌化 していると判断する
工程を含む、 前記方法を提供する。
また、 本発明の検定方法は、
( a ) 生物試料中の本発明の /3 1， 3—N—ァセチルー D—ダルコサミン糖転 移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸を定量し；そして
( b ) 生物試料中の前記核酸の定量値が、 対照の正常な生物試料中の前記核酸 の定量値の 1 . 5倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、 ものであってもよい。
上記のように、 本発明の； 3 1 , 3—N—ァセチルー D—ダルコサミン糖転移酵 素タンパク質を癌マ一カーとして定量する場合には、 例えば、 該タンパク質を免 疫原として作成される抗体を用いることができる。 抗体を利用したタンパク質の 定量方法としては、 当該技術分野における周知な方法、 例えば、 ELISA法、 ウェス タンプロット法を使用することが可能である。 また、 本発明の糖転移酵素タンパ ク質の活性を利用することによって、 定量することもできる。 前記定量値の比は
、 1 . 5倍以上、 好ましくは 2倍以上、 より好ましくは 3倍以上、 さらに好まし くは 5倍以上、 さらにより好ましくは 1 0倍以上、 最も好ましくは 2 0倍以上で ある。
また、 本発明の 3 1， 3—N—ァセチルー D—ダルコサミン糖転移酵素タンパ ク質の全部又は一部をコードする核酸を癌マ一カーとして定量する場合には、 本 発明の検定方法は、
( a - 1 ) 生物試料中の /3 1， 3— N—ァセチルー D—ダルコサミン糖転移酵 素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸に本発明の測定用核酸から選択さ れる一対のプライマ一をハイブリダィズさせ；
( a - 2 ) β 1 , 3— Ν—ァセチルー D—ダルコサミン糖転移酵素タンパク質 の全部又は一部をコードする核酸を増幅させ；
( a— 3 ) 前記増幅産物を定量し；そして
( b ) 前記定量値が、 対照の正常な生物試料中の対応する定量値の 1 . 5倍以 上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、 ものであってもよい。
本発明検定方法への利用できる核酸は、 本発明測定用核酸として例示されるが 、 特に限定されず、 例えば、 配列番号 1記載の塩基番号 1乃至 1 2 0 6からなる 塩基配列又はそれに相補的な塩基配列から選択される、 任意の配列を利用可能で ある。 配列番号 1記載の塩基番号 6 8 3乃至 7 7 5からなる塩基配列からなる核 酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸 （本発明核酸 1 ) を使用することが 好ましい。 即ち、 本発明検定方法によって生物試料において検出される核酸 （特 に mR N A) は、 配列番号 1記載の塩基配列番号 6 8 3乃至 7 7 5からなる塩基 配列を含む核酸であることが好ましいが、 具体的には、 配列番号 1記載の塩基番 号 6 8 3乃至 7 7 5からなる塩基配列からなる核酸、 配列番号 1記載の塩基番号 1 6 6乃至 1 2 0 9からなる塩基配列からなる核酸、 及び配列番号 1記載の塩基 番号 1乃至 1 2 0 9からなる塩基配列からなる核酸が例示される。
これらの核酸の発現量は、 例えば、 本発明測定用核酸を使用した P C R法を用 いて定量することができる。 P C R法では、 定量的 P C R法の使用が好ましく、 キネティックス分析のための R T— P C R法、 定量的リアルタイム P C R法が例 示される。 本発明によれば、 核酸の定量には、 これらに限定されるものではなく 、 ノーゼンブロット、 ドットプロット、 D NAマイクロアレイを使用することも 可能である。 一方、 同一組織等に広く一般的に存在する遺伝子の核酸、 例えばグ リセルアルデヒド— 3リン酸一脱水素酵素 （GAPDH)、 0—ァクチンをコードする 核酸を対照として利用することができる。 癌化していると判断されるシグナルの 定量比は、 1 . 5以上であり、 好ましくは 2以上、 より好ましくは 3以上、 さら に好ましくは 5以上、 さらにより好ましくは 1 0以上、 最も好ましくは 2 0以上 である。
本明細書において、 「生物試料」 というときは、 器官、 組織及び細胞を示すが、 好ましくは組織であり、 具体的には、 食道、 胃、 塍臓、 肝臓、 腎臓、 十二指腸、 小腸、 大腸、 直腸、 結腸が例示される。 好ましくは大腸、 直腸、 及び結腸であり 、 より好ましくは大腸である。
本発明検定方法は、 上記の通り、 生物試料の癌化を検定するものであり、 医療 における癌の診断、 治療等に応用することができる。 本明細書において使用され る用語 「癌」 には、 典型的には、 悪性腫瘍全般をいい、 該悪性腫瘍による疾病状 態を含む。 本発明検定方法は、 限定されるわけではないが、 食道癌、 胃癌、 滕臓 癌、 肝臓癌、 腎臓癌、 十二指腸癌、 小腸癌、 大腸癌、 直腸癌、 及び結腸癌、 好ま しくは大腸癌、 直腸癌、 及び結腸癌であり、 より好ましくは大腸癌の検定に適し ている。
( 7 ) 本発明抗体
本発明の /3 1， 3— N—ァセチルー D—ダルコサミン糖転移酵素タンパク質に 免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こうした抗体は、 （非特異的結合 と対照的に） 抗体の抗原結合部位を介して、 該糖転移酵素タンパク質に特異的に 結合する。 したがって、 上述のような、 配列番号 2のタンパク質、 断片、 変異体 、 融合タンパク質などを、 それと免疫反応性である抗体を産生する際の 「免疫原 j として使用することが可能である。 より具体的には、 タンパク質、 断片、 変異 体、 融合タンパク質などは、 抗体形成を引き出す抗原決定基またはェピトープを 含む。 これらの抗原決定基またはェピトープは、 直鎖でも高次構造的 （conforma t i onal) (断続的）でもどちらでもよい。なお、 該抗原決定基またはェピトープは 、 当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定してもよい。
したがって、 本発明の 1つの側面は、 本発明の ;8 1， 3—N—ァセチルー D— ダルコサミン糖転移酵素タンパク質の抗原性ェピトープに関する。 こうしたェピ トープは、 以下により詳細に記載されるように、 抗体、 特にモノクローナル抗体 を作成するのに有用である。 さらに、 本発明の )3 1， 3 — N—ァセチルー D—グ ルコサミン糖転移酵素タンパク質のェピトープは、 アツセィにおいて、 そしてポ リク口ーナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に 結合する抗体を精製する研究試薬として使用可能である。 こうしたェピトープま たはその変異体は、 固相合成、 タンパク質の化学的または酵素的切断などの、 当 該技術分野に公知の技術を用いて、あるいは組換え DNA技術を用いて、産生するこ とが可能である。
前記糖転移酵素タンパク質によって誘導される可能性がある抗体に関しては、 該タンパク質の全部若しくは一部が単離されていても、 またはェピトープが単離 されていても、 ポリクロ一ナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらも、 慣用 的技術によって調製することが可能である。 例えば、 Kennetら （監修） ， Monocl onal Ant ibodies, Hybr idomas： A New Dimens ion in Biological Analyses, Pie num Press, New York, 1980を参照されたい。
本発明の /3 1， 3 — N—ァセチルー D—ダルコサミン糖転移酵素タンパク質に 特異的なモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞株もまた、 本明細書 に意図される。 こうしたハイプリドーマは、 慣用的技術によって産生しそして同 定することが可能である。 こうしたハイプリドーマ細胞株を産生するための 1つ の方法は、 動物を該糖転移酵素タンパク質で免疫し；免疫された動物から脾臓細 胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、 それにより八イブリドー マ細胞を生成し；そして該タンパク質に結合するモノクローナル抗体を産生する ハイブリド一マ細胞株を同定することを含む。 モノクローナル抗体は、 慣用的技 術によって回収可能である。
本発明のモノクローナル抗体には、 キメラ抗体、 例えば、 ネズミモノクローナ ル抗体のヒト化型が含まれる。 こうしたヒト化抗体を既知の技術によって調製し 、 そして抗体がヒトに投与されるとき、 免疫原性の減少という利点を提供しても よい。
慣用的技術によって産生可能な、 抗体の抗原結合断片もまた、 本発明に含まれ る。 こうした断片の例には、 限定されるわけではないが、 & ぉょぴ ( a b ') 2断片が含まれる。 遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘導体 もまた提供される。
本発明の抗体は、 in vi tro又は in vivoいずれかで、前記糖転移酵素タンパク質 または断片の存在を検出するアツセィで用いることが可能である。 抗体はまた、 免疫ァフィ二ティ一クロマトグラフィーによって、 本発明のポリペプチドまたは 断片を精製する際にも使用可能である。
さらに、 結合パートナー、 例えば受容体基質への本発明のタンパク質の結合を 遮断することが可能な抗体を用いて、 こうした結合から生じる生物学的活性を阻 害することが可能である。 こうした遮断抗体は、 受容体基質を発現している特定 の細胞への該タンパク質の結合を阻害する能力に関して、 抗体を試験することに よるなど、 いかなる適切なアツセィ法を用いて、 同定してもよい。 あるいは、 遮 断抗体は、 標的細胞の結合パートナーに結合している本発明タンパク質から生じ る生物学的影響を阻害する能力に関するアツセィにおいて、 同定することが可能 である。
こうした抗体を、 in vi t ro法で使用するか、 又は in vivoで投与して、抗体を生 成した実体によって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。 した がって、 本発明の/ 3 1， 3— N—ァセチルー D—ダルコサミン糖転移酵素タンパ ク質と結合パートナーとの相互作用によって、 （直接または間接的に）引き起こさ れるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。 療法は、 結合パート ナ一仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、 ほ乳動物に in viv o投与することを伴う。一般的に、 こうした療法の使用には、 モノクローナル抗体 が好ましい。 1つの態様において、 抗原結合抗体断片が使用される。 2003/013957 実施例
以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも、 本発明は下 記実施例に限定されるものではない。
実施例 1 本発明 MA及び本発明タンパク質の調製方法
)3 3グルクロン酸転移酵素 7 ( i3 3GnT7) の塩基配列 （GenBank Access i on No. AK 000770) (配列番号 1 0 ) をクエリーとして、 BLAST検索を行った。 その結果、 ES T (GenBank Access ion No. BC004908)の相補配列が i3 3GnT7とホモロジ一を有する ことが判明した。 相補配列は配列番号 1の通りであった。 この塩基配列がコード するアミノ酸配列 （配列番号 2 ) は N末端に膜貫通領域を有することが予測され、 この膜貫通領域を有しないタンパク質をコードする塩基配列の領域を調製するこ ととした。 調製は、 Gat ewayシステム （インビトロジェン社） を利用して、 pFas t Bac (インビトロジェン社） の誘導体である pFBIFに遺伝子を組み込み、 Bac- t o - B acシステム （インピトロジェン社） によるパクミドを作成して行った。
(1) エントリ一クローンの調製
ヒトゲノム cDNA (クロンテック社製） を铸型とし、 5 ' プライマーとして配列 番号 3記載の塩基配列からなる DNA (配列番号 3の塩基番号 3 2— 5 6は、配列番 号 1の塩基番号 1 6 6— 1 9 0に対応する）、 3 'プライマーとして配列番号 4記 載の塩基配列からなる DNA (配列番号 4の塩基番号 3 1— 5 5は、配列番号 1の塩 基番号 1 2 0 9— 1 1 8 5に対応する）を使用して PCR法を行った。 PCR法は 96°C 1分、 55°C 1分、 72°C 1分を 30サイクル繰り返す条件で行った。 そして PCR産物を ァガロースゲル電気泳動を行い、 ゲル切り出し法でゲルを切り出して常法により 単離した。 このようにして単離した PCR産物を BPクロナーゼ反応によって PD0NR20 1 (商標） （インピトジェン社製） へ組み込んで 「エントリークローン」 を作成し た。 反応は上記 PCR産物 2 1、 PDONR201 1 1 (150ng)、 BP反応緩衝液 2 し トリ ス—EDTA緩衝液 （PH8. 0 :以下 「TE」 とも略記する） 3 z l、 BPクロナーゼ mix Ί を 25°Cで 1時間インキュベーションして行った。 その後、 プロティナーゼ K (科研 製薬株式会社製） を 1 ^ 1加えて 37°C、 10分間インキュベートして反応を終了させ た。 その反応混合液 11 lをコンビテントセル （大腸菌 DH5 Q! ) I OO Iと混合し、 ヒートショック法による形質転換の後、 カナマイシンを含む LBプレートに播いた 。 翌日コロニーを回収し、 PCR法で目的 DNAが導入されていること及びその塩基配 列を確認し、 揷入されたべクタ一 （pDONR- G26A) を常法に従って抽出、 精製した 。 このベクターに揷入された DNAの塩基配列は、配列番号 1記載の塩基配列のうち 、 塩基番号 166乃至 1209からなる塩基配列を含むことが確認された。
(2) 発現クローンの調製
上記ェントリークローンは、 揷入部位の両端に λファージが大腸菌から切り出 される際の組換部位である at tLを持つもので、 LRクロナ一ゼ （λファージの組換 酵素 Int、 IHF、 Xi sを混合したもの） とデスティネーションベクター （at tRを有す る） とを混合することで、 揷入部位がデスティネーションベクターに移り、 発現 クロ一ンが作成される。
l 1のエントリークローン（pDONR- G26A)、 0. 5 1のデスティネーションベクタ ― (pFBIF (75ng) )、 LR反応緩衝液 2 1、 TE4. 5 1、 LRクロナーゼミックス （λフ ァージの組換え酵素 Int、 IHF、 及び Xi sを混合した溶液） 2 1を 25°Cで 1時間イン キュペートし、 プロティナーゼ K (科研製薬株式会社製） を 1 1加えて 37 で 10 分間インキュベートして反応を停止させた （この組換反応で pFBIF- G26Aが生成さ れた）。 pFBIFは pFas tBac l (インビトロジェン社製) に Ig cシグナル配列 （配列番 号 5 ) と精製用の FLAGペプチド （配列番号 6 ) とを常法に従って揷入したもので ある。 さらに、 pFBIFに Gateway配列 （at tR) を揷入するため、 Gateway Vec tor C onvers i on Sys tem (インビトロジェン社） を用いて変換カセットを揷入した。 こ の変換カセットは、 発現べクタ一をデスティネーションベクターに改変するため のカセットであり、 at tR組換え部位、 クロラムフエ二コール耐性遺伝子、 及び大 腸菌 DNA gyraseを阻害するタンパク質をコードする ccdB遺伝子を有する。また、 I g / シグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、 FLAGタグは精製を容易と するために挿入した。
pFBIF- G26Aが含まれる反応混液 （11 1) とコンビテントセルである大腸菌 DH5 100 1とを混合し、 ヒートショック法による形質転換の後、 アンピシリンをで 含む LB培地に組換 DH5 Q!を蒔いて培養した。 24時間培養後、 コロニーを回収し、 Q IAprep Spin Miniprep Ki t (キアゲン社製） によりプラスミド （pFBIF- G26A) を 抽出精製した。 PCR法で目的 DNAが揷入されていることを確認した。 (3) Bac-to_Bacシステム （インビトロジェン社製） によるパクミドの調製 続いて Bac- to- Bacシステム （インビトロジェン社製） を用いて上記 pFBIF- G26A とパクミドとの間で組換を行い、 昆虫細胞中で増殖可能なバクミドに G26Aの配列 を揷入した。 このシステムは Tn7の組換部位を利用して、 バクミドを含む大腸菌（ 大腸菌 DHl OBac (商標）) に目的遺伝子を揷入させた pFas tBac (即ち、 pFBIF - G26A ) を導入するだけで、 ヘルパープラスミドから産生させる組換えタンパク質によ つて目的とする遺伝子 （G26A) がバクミドに取り込まれるシステムである。 また バクミドには LacZ遺伝子が含まれており、 古典的なコロニーの色 （青 （挿入なし ) 一白 （挿入あり）） による選択が可能である。
すなわち、 上記精製べクタ一 （PFBIF-G26A) 50 1とコンビテントセル （大腸菌 DHl OBac) とを混合し、 ヒートショック法による形質転換の後、 カナマイシ ン、 ゲンタマイシン、 テトラサイクリン、 5-ブロモインドリル J3 -D-ガラクトピラ ノシド （Bluo_gal)、 及びイソプロピル 3 -D-チォガラクトピラノシド （IPTG) を 含む LB培地に蒔き、 24時間後にバクミドに目的 DNAが揷入された白い独立したコロ ニーを回収し、 更に培養を行った後、 常法に従ってバクミドを回収した。
(4) バクミドの昆虫細胞への導入
回収したバクミドに目的 DMが揷入されていることを常法に従って確認し、バク ミドを昆虫細胞 （Sf 21：インビトロジェン社製） に導入した。 すなわち 35腿のシ ャーレに Sf 21細胞 9 X 105個 /2mlに抗生物質を含む Sf 900SFM培地 （インビトロジェ ン社製） を添加し、 27 で 1時間細胞を接着させた。細胞が接着したことを確認し て、 培養液を吸引して、 l ipi d-DNA comp l exes溶液 （A溶液 （100 ^ 1の S f- 900SFM に上記パクミド 5 ^ 1を添加した混合物） と B溶液 （I OO Iの S f- 900SFMに 6 1の C e l l FECTI0N Reagent (インビトロジェン社製） を添加した混合物） とを丁寧に混 合して 30分間程度室温でインキュベートして得た溶液）に Sf 900 I I (インビトロジ ェン社製） 800 β 1を添加した培養液を添加して 27°Cで 5時間ィンキュベーシヨンし た。 その後、 培地を除去し、 抗生物質を含む Sf 900SFM培地 2mlを添加し、 27°Cで 7 2時間インキュベートした。培養後ピベッティングにより細胞を遊離させ、細胞と 培養液を回収して l OOO X gで 10分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を 「一次ウィルス液」 とした）。 更に T75培養フラスコに Sf21細胞 1X107個 /20mlSf- 900SFM (抗生物質を含む) を 添加し、 27°Cで 1時間インキュベートした。 細胞が接着した後、 一次ウィルス液 8 OO Iを添加し、 27°Cで 48時間培養した。培養後、 ピペッティングにより細胞を遊 離させ、 細胞と培養液を回収した。 これを lOOOXgで 10分間遠心処理を行い、 上清 を回収した （この上清を 「二次ウィルス液」 とした）。
さらに、 T75培養フラスコに Sf21細胞 1X107個/ 20mlSf- 900SFM (抗生物質を含む ) を添加し、 27°Cで 1時間インキュベートした。 細胞が接着した後、 二次ウィルス 液 1000 1を添加し、 27°Cで 84時間培養した。培養後、 ピペッティングにより細胞 を遊離させ、 細胞と培養液を回収した。 これを lOOOXgで 10分間遠心処理を行い、 上清を回収した （この上清を 「三次ウィルス液」 とした）。
さらに、 Sf21細胞を 6X105個/ mlの濃度で含む Sf_900SFM (抗生物質を含む） を 1 00ml用スピナ一フラスコに 100 1添加し、 三次ウィルス液 lmlを添加し、 27°Cで 9 6時間培養した。 培養後、 細胞と培養液を回収した。 これを lOOOXgで 10分間遠心 処理を行い、 上清を回収した （この上清を 「四次ウィルス液」 とした）。
四次ウィルス液 10mlに対し、 アジ化ナトリウム、 塩化ナトリウム及び塩化カル シゥムを加えた。 終濃度はアジ化ナトリウムを 0.05%、 塩化ナトリウムを 150mM、 塩化カルシウムを 2mMとした。 抗 FLAG抗体ゲル （Anti- Flag Ml monoclonal antib ody Agarose Affinity GeK シグマ社製） を 50 1添加し、 4Tで 16時間緩やかに 転倒混和した。 遠心分離 （l,000Xg、 3分、 4°C) して上清を除去した後、 ImMの塩 化カルシウムを含む TBS (Tris- NaCl緩衝液： pH7.4) で 2回洗浄した。 そして洗浄 後のァフィ二ティーゲルを ImMの塩化カルシウムを含む TBS (pH7.4) 200 1に懸濁 して、 この懸濁液を活性測定用の G26酵素液とした。 実施例 2 本発明タンパク質の酵素活性
配列番号 2記載のアミノ酸配列を基に、 他の公知の糖転移酵素と対比した結果 、 活性部位と考えられる C-末端領域の配列の保存性などから、 G26は /31, 3-N 一ァセチルー D_ダルコサミン転移酵素類に分類されることが示唆された。 そこ で UDP_GlcNAcを GlcNAc供与体基質として用いて G26酵素液の酵素活性の確認を行 つた。 GlcNAc受容体基質としては、 GalNAcal— Bz、 GalNAc /31 -pNp, GlcNAcal-Bz 、 GlcNAc )31-Bz, Gal al-pNp, Gal |S 1-oNp, Xyl j31-pNp, Fuco;liNp、 Man al— Bz、 ManNAcal— Bz、 Gal j81 -4Glc S 1 -Bz (以上全てシグマ社製）、 及び Ga lj31-4GlcNAcoil-pNp (トロントリサーチケミカル社製） の全てを同時に用い、 各々最終濃度で lOnmolずつ含むように反応液を調製して活性を確認した。
反応液は最終濃度 50mMの力コジル酸ナトリウム緩衝液 11を6.6、 7.0、 及び 7. 4の各実験系を調製した）、 最終濃度 0.4%の Triton (商標） CF- 54 (シグマ社製） 、 最終濃度 480^Μの UDP- GlcNAc、 175nCiの UDP- [14C]GlcNAc、 最終濃度 20mMの MgCl 2、 CoCl2又は CuCl2、 10.1 1の026酵素液、 及び蒸留水を含む全量 20 1とした。 反応液を 37°Cで 16時間インキュベートし、 その後蒸留水 200^1を添加し、 不溶 性画分を遠心分離 （100Xg、 10分） により除去して上清画分を回収した。 Sep - Pa k plus C18 Cartrige (ウォーターズ社製：予め lmlのメタノールで 1回、 次いで 1 mlの蒸留水で 2回洗浄して平衡化したもの）に通筒し、上清に含まれる GlcNAc受容 体基質及び反応生成物を吸着させた。 lmlの蒸留水でカラムを 2回洗浄し、 カラム に吸着した GlcNAc受容体基質と反応生成物を lmlのメタノールで溶出した。溶出液 を 5mlの液体シンチレ一ター （アマシャム バイオサイエンス株式会社製） と混和 し、 シンチレ一シヨンカウンターを用いて放射能を測定した （図 1)。
その結果、 G26は 20mMの MnCl2又は MgCl2存在下では何れの pHに於いても活性は確 認されたが、 pH6.6よりも pH7.4の方が強い活性が観察された。 EDTAにより二価金 属陽イオンをキレートした条件下では酵素活性は観察されなかったことから、 G2 6は二価金属陽イオンを酵素反応に必要とすることが明らかとなった。 実施例 3 大腸癌組織における本発明 DNA発現量の変化
定量的リアルタイム PCR法を用いてヒト大腸癌組織と同一患者の健常大腸組織 での本発明核酸 （mRNA) の発現量を比較した。 ヒト大腸癌組織及び健常大腸組織 の RNAを、 RNeasy Mini Kit (キアゲン社製） で抽出し、 Super- Script First- Str and Synthesis System (インピトロゲン社製） を用いた oligo(dT)法により singl e strand DNAとした。 この DNAを铸型として用いてプライマ一 （5 ' プライマー： 配列番号 7 (配列番号 1の塩基番号 683 - 701に対応する）、 3 ' プライマ一 ：配列番号 8 (配列番号 1の塩基番号 7 7 5— 7 5 5に対応する）） 及び TaqMan MGBプローブ （配列番号 9) (配列番号 1の塩基番号 707— 724に対応する） を用いて ABI PRISM 7700 (アプライドパイオシステムス社製） により定量的リア ルタイム PCR法を行なった。 PCR反応の条件は、 50°Cで 2分、 95°Cで 10分で反応させ た後、 95°Cで 15秒、 6(TC1分を 50回繰り返して行った （表 2)。 表 2
Figure imgf000037_0001
その結果、癌化した組織における本発明 DNAの発現量は、健常組織と比較して平 均して 7倍以上に増加していることが明らかとなった。 また、 試料番号 1一 1 0 のうちの 8つ、 即ち、 被験者の 80 %以上が、 2倍以上の発現量を示した。 参考文献
1. J. Biol. Chem. , 250 (9)： 3303-9 (1975)
2. Can. J. Biochem. Cell Biol., 61(9)： 1049-1066 (1983)
3. J. Biol. Chem., 257 (17)： 10235-10242 (1982)
4. J. Biol. Chem., 258 (10)： 6162-73 (1983)
5. J. Biol. Chem. , 257 (22)： 13421-7 (1982)
6. J. Biol. Chem. , 275 (42)： 32598-602 (2000) 3957
7. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96(2)： 406- 11 (1999)
8. Cell, 105(7)： 957-69 (2001)
9. J. Biol. Chem. , 276 (5)： 3498-507 (2001)
1 0. J. Biol. Chem. , 276(25)： 22032-40 (2001)
1 1. J. Biol. Chei. , 277 (15)： 12802-9 (2002)
1 2. Biochem. Biophys. Res. Commun. , 294(4)： 843 -8 (2002)
1 3. Nature, 406 (6794)： 411-5 (2000)
14. J. Biol. Chei. , 259 (21)： 13385-90 (1984)
1 5. J. Biol. Chei. , 255 (23)： 11253-61 (1980)
1 6. J. Biol. Chei. , 274(5)： 3215-21 (1999)
1 7. J. Biol. Chei. , 275 (15)： 11106-13 (2000)
1 8. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(16)： 8991 -6 (1999)
1 9. J. Biol. Chem. , 265 (5)： 2563-2568 (1990) 産業上の利用の可能性
本発明により新規な糖転移酵素及びそれをコードする核酸、 並びに組織の癌化 の新規な検定方法が提供される。

Claims

請求の範囲
1 . 下記の性質を有する] 3 1， 3— N—ァセチルー D—ダルコサミン糖転移 酵素タンパク質。
活性： N—ァセチルー D—ダルコサミン供与体基質から N—ァセチルー D—グ ルコサミン受容体基質に N—ァセチルー D—ダルコサミン残基を転移する。
基質特異性： (1) GalNAc, (2) GlcNAc, (3) Gal、 (4) Xyl、 (5) Fuc、 (6) Man 、 (7) ManNAc, (8) Gal j3 1— 4Glc、 及び（9) Gal )3 1— 4GlcNAcの何れかの N—ァセ チルー D—ダルコサミン受容体基質に、 N—ァセチル _ D―ダルコサミン供与体 基質から N—ァセチル _ D—ダルコサミン残基を転移する。
ここで 「GalNAc」 とは N—ァセチルー D—ガラクトサミン残基を示し、 「GlcNA c」 とは N—ァセチルー D—ダルコサミン残基を示し、 「Gal」 とは D—ガラクトー ス残基を示し、 「Xyl」 とは D—キシロース残基を示し、 「Fuc」 とは D—フコース残 基を示し、 「Man」 とは D—マンノース残基を示し、 「ManNAc」 とは N—ァセチルー D—マンノース残基を示し、 「一」はグリコシド結合を示す。式中の数字は前記グ リコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示す。 「 」は糖環 1位の前記ダリコシ ド結合のァノマーを示し、 5位 CH20H又は C¾との位置関係がシスのものを 「|8」 で示す。
金属イオン要求性： 二価金属陽イオンを酵素反応に必要とする。
反応 p H : 中性近辺である。
2 . 以下の （A) 又は （B ) のポリペプチドを含む/ 3 1， 3— N—ァセチル —D—ダルコサミン糖転移酵素タンパク質。
(A) 配列番号 2記載のアミノ酸番号 5 6乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列を有 するポリペプチド；
( B ) 配列番号 2記載のアミノ酸番号 5 6乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列にお いて、 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、 欠失、 又は挿入したアミノ酸配列を 有し、 且つ N—ァセチルー D—ダルコサミン受容体基質に、 N—ァセチルー D— ダルコサミン供与体基質から N—ァセチルー D—ダルコサミン残基を転移する活 性を有するポリペプチド。
3 . 前記 （A) のポリペプチドが、 配列番号 2記載のアミノ酸番号 5 6乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列からなる、 請求項 2記載の糖転移酵素タンパク質。
4 . 前記 （A) のポリペプチドが、 配列番号 2記載のアミノ酸番号 1乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列からなる、 請求項 2記載の糖転移酵素タンパク質。
5 . 前記糖転移酵素タンパク質が、 配列番号 2のアミノ酸番号 5 6乃至 4 0 2からなるアミノ酸配列と少なくとも 5 0 %同一のアミノ酸配列を有する、 請求 項 2ないし 4のいずれか一項記載の糖転移酵素夕ンパク質。
6 . 請求項 2乃至 5何れか一項記載のタンパク質をコ一ドする塩基配列又は それに相補的な塩基配列からなる核酸。
7 . 配列番号 1記載の塩基番号 1 6 6乃至 1 2 0 6からなる塩基配列又はそ れに相補的な塩基配列からなる、 請求項 6に記載の核酸。
8 . 配列番号 1記載の塩基番号 1乃至 1 2 0 6からなる塩基配列又はそれに 相補的な塩基配列からなる、 請求項 6に記載の核酸。
9 . DNAであることを特徴とする請求項 6乃至 8何れか一項記載の核酸。
1 0 . 請求項 6乃至 9何れか一項記載の核酸、 又は当該核酸の塩基配列と相 補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする ことを特徴とする測定用核酸。
1 1 . 配列番号 1記載の塩基番号 6 8 3乃至 7 7 5からなる塩基配列又はそ れに相補的な塩基配列を含む、 請求項 1 0に記載の測定用核酸。
1 2 . 前記測定用核酸が、 プローブ、 プライマ一として使用される、 請求項 1 0又は 1 1記載の測定用核酸。
1 3 . 前記測定用核酸が、 癌マーカ一として使用される、 請求項 1 0乃至 1 2何れか一項記載の測定用核酸。
1 4 . MAであることを特徴とする請求項 1 0乃至 1 3何れか一項記載の測定 用核酸。
1 5 . 請求項 6乃至 1 4何れか一項記載の核酸を含むベクタ一。
1 6 . 請求項 1 5記載のベクターを含む形質転換体。
1 7 . 請求項 1 5記載の形質転換体を生育させ、 1， 3— N—ァセチル— D—ダルコサミン糖転移酵素夕ンパク質を発現させ、 その生育物から前記糖転移 酵素を回収する、 ことを含む、 前記糖転移酵素タンパク質の製造方法。
18. 請求項 1乃至 5何れか一項記載の J31， 3— N—ァセチルー D—ダル コサミン糖転移酵素タンパク質を認識する抗体。
19. 生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a) 生物試料中の請求項 1ないし 5の何れか一項記載の 01, 3—N—ァセ チルー D—ダルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量し；そして
(b) 生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、 対照の正常な生物 試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の 1. 5倍以上である場合には癌化 していると判断する
工程を含む、 前記方法。
20. 請求項 18記載の抗体を用いて) 31， 3— N—ァセチルー D—ダルコ サミン糖転移酵素タンパク質を定量する、 請求項 19記載の検定方法。
21. 生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a) 生物試料中の請求項 6記載の核酸を定量し；そして
(b) 生物試料中の請求項 6記載の核酸の定量値が、 対照の正常な生物試料中 の前記核酸の定量値の 1. 5倍以上である場合には癌化していると判断する 工程を含む、 前記方法。
22. (a- 1) 生物試料中の請求項 6記載の核酸に請求項 10記載の測定 用核酸から選択される一対のプライマーをハイブリダィズさせ；
(a— 2) 請求項 6記載の核酸を増幅させ；
(a— 3) 前記増幅産物を定量し；そして
(b) 前記定量値が、 対照の正常な生物試料中の対応する定量値の 1. 5倍以 上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、 請求項 21記載の方法。
23. 配列番号 1記載の塩基番号 683— 775からなる塩基配列又はそれ に相補的な塩基配列を含む核酸を定量する、 請求項 21又は 22に記載の方法。
24. 前記生物試料が、 大腸由来の試料である、 請求項 21乃至 23何れか 1項記載の方法。
PCT/JP2003/013957 2002-10-30 2003-10-30 糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を用いた癌組織の検出方法 WO2004039976A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003280655A AU2003280655A1 (en) 2002-10-30 2003-10-30 Novel glycosyltransferase, nucleic acid encoding the same and method of detecting cancer tissue using the nculeic acid

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002315451A JP2004147542A (ja) 2002-10-30 2002-10-30 糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を用いた癌組織の検出方法
JP2002-315451 2002-10-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004039976A1 true WO2004039976A1 (ja) 2004-05-13

Family

ID=32211652

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/013957 WO2004039976A1 (ja) 2002-10-30 2003-10-30 糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を用いた癌組織の検出方法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP2004147542A (ja)
AU (1) AU2003280655A1 (ja)
WO (1) WO2004039976A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1491630A1 (en) * 2002-03-14 2004-12-29 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Novel n-acetylglucosamine transferase, nucleic acid encoding the same and use thereof in diagnosing cancer and/or tumor

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000053750A1 (en) * 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumors

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000053750A1 (en) * 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumors

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIRA TOGAYASHI ET AL.: "Molecular cloning and characterization of UDP-GlcNAc: lactosylceramide beta 1,3-N-acetylglucosaminyltransferase (beta 3Gn-T5), an essential enzyme for the expression of HNK-1 and Lewis X epitopes on glycolipids.", THE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 276, no. 25, 2001, pages 22032 - 22040 *
KEN KATAOKA ET AL.: "A novel betal, 3-N-acetylglucosaminyltransferase involved in invasion of cancer, cells as assayed in vitro", BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN, vol. 294, 2002, pages 843 - 848, XP002975891 *
NORIHIKO SHIRAISHI ET AL.: "Identification and characterization of three novel beta 1, 3-N-acetylglucosaminyltranferases family", THE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 276, no. 5, 2001, pages 3498 - 3507, XP002961826, DOI: doi:10.1074/jbc.M004800200 *
TOSHIE IWAI ET AL.: "Molecular cloning and characterization of a novel UDP-GlcNAc: GalNAc-peptide beta 1, 3-N-acytylglucosaminyltransferase (beta 3Gn-T6), an enzyme synthesizong the core 3 structure of O-glycans.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 15, 2002, pages 12802 - 12809 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1491630A1 (en) * 2002-03-14 2004-12-29 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Novel n-acetylglucosamine transferase, nucleic acid encoding the same and use thereof in diagnosing cancer and/or tumor
EP1491630A4 (en) * 2002-03-14 2006-02-22 Nat Inst Of Advanced Ind Scien N-ACETYLGLUCOSAMINE TRANSFERASE, NUCLEIC ACID ENCODING THE ENZYME, AND USE IN THE DIAGNOSIS OF CANCER AND / OR TUMOR
US7223580B2 (en) 2002-03-14 2007-05-29 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology N-acetylglucosamine transferase, nucleic acid encoding the same and use thereof in diagnosing cancer and/or tumor

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003280655A1 (en) 2004-05-25
AU2003280655A8 (en) 2004-05-25
JP2004147542A (ja) 2004-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8278037B2 (en) N-acetylgalactosamine transferases and nucleic acids encoding the same
US8431365B2 (en) β1,3-N-acetyl-D-galactosamine transferase protein, nucleic acid encoding the same and method of examining canceration using the same
JP4608694B2 (ja) 糖転移酵素、該糖転移酵素をコードする核酸及び該核酸を用いた癌化検定方法
WO2004039976A1 (ja) 糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を用いた癌組織の検出方法
JP5105261B2 (ja) β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン転移酵素タンパク質及びそれをコードする核酸、並びにそれを用いた癌化検定方法
JP2004267015A (ja) 核酸及び該核酸を用いた癌化検定方法
JP4251402B2 (ja) Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体
JP2004215619A (ja) 新規ガラクトース転移酵素及びそれをコードする核酸
AU2003220920A1 (en) Novel N-Acetylglucosamine transferase, nucleic acid encoding the same and use thereof in diagnosing cancer and / or tumor
JPWO2003057887A1 (ja) 新規ｕｄｐ−ｎ−アセチル−ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びこれをコードする核酸
WO2003064645A1 (fr) Nouvelle n-acetylgalactosamine transferase et acide nucleique codant celle-ci

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase