JP2004147542A - 糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を用いた癌組織の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】新規な糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに組織の癌化の新規な検定方法を提供する。
【解決手段】本発明の新規な糖転移酵素は、１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素であって、ヒト由来の特定なアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド、を含むことを特徴とする。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明の新規な糖転移酵素は、１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素であって、ヒト由来の特定なアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド、を含むことを特徴とする。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な「糖転移酵素」及びそれをコードする「核酸」に関連し、また癌化した組織における前記核酸の発現量が増加することに基づく「組織の癌化検出方法」に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体内での糖鎖や複合糖質の働きが注目されている。例えば、血液型を決定する因子は糖タンパク質であり、また神経系の働きに関与しているのは糖脂質である。従って、糖鎖を合成する働きのある酵素は、様々な糖鎖がもたらす生理活性を解析する上で極めて重要な手がかりとなる。
【０００３】
糖の中でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）はグリコサミノグリカンの構成成分であると共に、スフィンゴ糖脂質、ムチン型糖鎖と様々な糖鎖構造に存在する糖残基である。従って、ＧｌｃＮＡｃを転移する酵素は、生体内の様々な組織で働く糖鎖の働きを解析する上で極めて重要なツールとなる。
【０００４】
これまで、ＧｌｃＮＡｃを転移する活性を有するＮ−アセチルグルコサミン酵素は、少なくとも１９種類知られており（表１）、各々、受容体基質特異性が異なる。
【０００５】
【表１】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５０（９）： ３３０３−９ （１９７５）
【０００７】
【非特許文献２】Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ６１（９）： １０４９−１０６６ （１９８３）
【０００８】
【非特許文献３】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５７（１７）： １０２３５−１０２４２ （１９８２）
【０００９】
【非特許文献４】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５８（１０）： ６１６２−７３ （１９８３）
【００１０】
【非特許文献５】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５７（２２）： １３４２１−７ （１９８２）
【００１１】
【非特許文献６】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５（４２）： ３２５９８−６０２ （２０００）
【００１２】
【非特許文献７】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９６（２）： ４０６−１１ （１９９９）
【００１３】
【非特許文献８】Ｃｅｌｌ， １０５（７）： ９５７−６９ （２００１）
【００１４】
【非特許文献９】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６（５）： ３４９８−５０７ （２００１）
【００１５】
【非特許文献１０】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６（２５）： ２２０３２−４０ （２００１）
【００１６】
【非特許文献１１】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７（１５）： １２８０２−９ （２００２）
【００１７】
【非特許文献１２】Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２９４（４）： ８４３−８ （２００２）
【００１８】
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ， ４０６（６７９４）： ４１１−５ （２０００）
【００１９】
【非特許文献１４】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５９（２１）： １３３８５−９０ （１９８４）
【００２０】
【非特許文献１５】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５（２３）： １１２５３−６１ （１９８０）
【００２１】
【非特許文献１６】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４（５）： ３２１５−２１ （１９９９）
【００２２】
【非特許文献１７】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５（１５）： １１１０６−１３ （２０００）
【００２３】
【非特許文献１８】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６（１６）： ８９９１−６ （１９９９）
【００２４】
【非特許文献１９】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６５（５）： ２５６３−２５６８ （１９９０）
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
生体内での糖鎖の働きが注目されているが、生体内での糖鎖合成の解析は十分に進んでいるとは言えない。糖鎖合成のメカニズム、生体内での糖合成の局在が充分に解析されていないことも一因である。糖鎖合成のメカニズムを解析するに当たっては、糖鎖合成酵素、特に糖転移酵素を解析し、その酵素を使ってどの様な糖鎖が生成されるのかを分析する必要である。そのために新たな糖転移酵素を見つけだし、その機能を解析することに対する要請が高まっている。
【００２６】
従って、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する活性を有する新規なβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質、及びそれをコードする核酸を提供することを目的とする。また、本発明、該核酸を宿主細胞内で発現する形質転換体、さらに、当該形質転換体を生育させて、当該タンパク質を単離する方法を提供することを目的とする。さらにまた、本発明は、該核酸または該糖転移酵素タンパク質の発現を示標に、生物試料の癌化を検定する方法を提供する。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、目的とする酵素と類似した作用を有する酵素遺伝子の塩基配列を基に、配列同一性が高いと思われる目的とする酵素を単離及び精製を試みた。具体的には、まず、公知の糖転移酵素であるβ３グルクロン酸転移酵素７（β３ＧｎＴ７）の塩基配列をクエリーとしてＢＬＡＳＴ検索を行い、その結果、相同性を有する配列としてＥＳＴ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＢＣ００４９０８）を見出した。さらに、ＰＣＲでタンパク質の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸を決定した。これにより、当該核酸がコードするタンパク質が新規な糖転移酵素であることを見い出した。また、更に癌化した組織において、前記核酸の発現量が健常組織における発現量よりも高まっていることを発見し、これを組織の癌化検出方法に応用することで本発明を完成した。
【００２８】
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミンを転移する活性を有するタンパク質及びこれらをコードする核酸を提供することにより、当該技術分野におけるこれらの多様な必要性を満たすのに貢献する。
【００２９】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１） 下記の性質を有するβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質。
活性： Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する。
基質特異性： （１） ＧａｌＮＡｃ、（２） ＧｌｃＮＡｃ、（３） Ｇａｌ、（４） Ｘｙｌ、（５） Ｆｕｃ、（６） Ｍａｎ、（７） ＭａｎＮＡｃ、（８） Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、及び（９） Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの何れかのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する。
【００３０】
ここで「ＧａｌＮＡｃ」とはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＮＡｃ」とはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を示し、「Ｇａｌ」とはＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」とはＤ−キシロース残基を示し、「Ｆｕｃ」とはＤ−フコース残基を示し、「Ｍａｎ」とはＤ−マンノース残基を示し、「ＭａｎＮＡｃ」とはＮ−アセチル−Ｄ−マンノース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖の炭素番号を示す。「β」は糖環１位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、５位ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ３との位置関係がシスのものを「β」で示す。
【００３１】
金属イオン要求性： 二価金属陽イオンを酵素反応に必要とする。
反応ｐＨ： 中性近辺である。
（２） 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを含むβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。
（３） （２）（Ａ）のポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列からなる、（２）記載の糖転移酵素タンパク質。
（４） （２）（Ａ）のポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸番号１乃至４０２からなるアミノ酸配列からなる、（２）記載の糖転移酵素タンパク質。
（５） 糖転移酵素タンパク質が、配列番号２のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列と少なくとも５０％同一のアミノ酸配列を有する、（２）ないし（４）のいずれか記載の糖転移酵素タンパク質。
（６） （２）乃至（５）何れか記載のタンパク質をコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
（７） 配列番号１記載の塩基番号１６６乃至１２０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、（６）に記載の核酸。
（８） 配列番号１記載の塩基番号１乃至１２０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、（６）に記載の核酸。
（９） ＤＮＡであることを特徴とする（６）乃至（８）何れか記載の核酸。
（１０） （６）乃至（９）何れか記載の核酸、又は当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする測定用核酸。
（１１） 配列番号１記載の塩基番号６８３乃至７７５からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む、（１０）に記載の測定用核酸。
（１２） 測定用核酸が、プローブ、プライマーとして使用される、（１０）又は（１１）記載の測定用核酸。
（１３） 測定用核酸が、癌マーカーとして使用される、（１０）乃至（１２）何れか記載の測定用核酸。
（１４） ＤＮＡであることを特徴とする（１０）乃至（１３）何れか記載の測定用核酸。
（１５） （６）乃至（１４）何れか記載の核酸を含むベクター。
（１６） （１５）記載のベクターを含む形質転換体。
（１７） （１５）記載の形質転換体を生育させ、β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を発現させ、その生育物から前記糖転移酵素を回収する、ことを含む、前記糖転移酵素タンパク質の製造方法。
（１８） （１）乃至（５）何れか記載のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を認識する抗体。
（１９） 生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の（１）ないし（５）の何れか記載のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。
（２０） （１８）記載の抗体を用いてβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量する、（１９）記載の検定方法。
（２１） 生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の（６）記載の核酸を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の（６）記載の核酸の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記核酸の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。
（２２） （ａ−１）生物試料中の（６）記載の核酸に（１０）記載の測定用核酸から選択される一対のプライマーをハイブリダイズさせ；
（ａ−２）（６）記載の核酸を増幅させ；
（ａ−３）前記増幅産物を定量し；そして
（ｂ）前記定量値が、対照の正常な生物試料中の対応する定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、（２１）記載の方法。
（２３） 配列番号１記載の塩基番号６８３−７７５からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸を定量する、（２１）又は（２２）に記載の方法。
（２４） 前記生物試料が、大腸由来の試料である、（２１）乃至（２３）何れか記載の方法。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明タンパク質
本発明タンパク質はＧｌｃＮＡｃ受容体基質に、ＧｌｃＮＡｃ供与体基質からＧｌｃＮＡｃ残基を転移する活性を有する糖転移酵素である。
【００３３】
ここで「ＧｌｃＮＡｃ供与体基質」とは、ＧｌｃＮＡｃを有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては、例えば、アデノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、グアノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、シチジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＣＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）等が例示され、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが最も好ましいが特に限定はされない。
【００３４】
「ＧｌｃＮＡｃ受容体基質」は本発明タンパク質がＧｌｃＮＡｃ供与体基質からＧｌｃＮＡｃを転移することができる化合物である限り特に限定はされないが、（１） ＧａｌＮＡｃ、（２） ＧｌｃＮＡｃ、（３） Ｇａｌ、（４） Ｘｙｌ、（５） Ｆｕｃ、（６） Ｍａｎ、（７） ＭａｎＮＡｃ、（８） Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、及び（９） Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの何れかであることが好ましい。さらに、上記糖残基の糖環１位にα又はβ結合で、これに限定されるわけではないが、Ｂｚ、ｐＮｐ、ｏＮｐの何れかが結合していることがより好ましい。最も好ましいＧｌｃＮＡｃ受容体基質は、ＧａｌＮＡｃα１−Ｂｚ、ＧａｌＮＡｃβ１−ｐＮｐ、ＧｌｃＮＡｃα１−Ｂｚ、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｂｚ、Ｇａｌα１−ｐＮｐ、Ｇａｌβ１−ｏＮｐ、Ｘｙｌβ１−ｐＮｐ、Ｆｕｃα１−ｐＮｐ、Ｍａｎα１−Ｂｚ、ＭａｎＮＡｃα１−Ｂｚ、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｂｚ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１−ｐＮｐの何れかである。ここで、「Ｂｚ」はベンジル基を示し、「ｐＮｐ」はパラニトロフェニル基を示し、「ｏＮｐ」はオルトニトロフェニル基を示す。また、「−」はグリコシド結合を示し、式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示す。「α」及び「β」は糖環１位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、５位ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ３との位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す。
【００３５】
これらの「ＧｌｃＮＡｃ受容体基質」の何れかの化合物へ「ＧｌｃＮＡｃ残基」を転移する活性の確認は、例えば［１４Ｃ］又は［３Ｈ］などの放射性同位元素でＧｌｃＮＡｃ残基を放射能標識した「ＧｌｃＮＡｃ供与体基質」と、上記「ＧｌｃＮＡｃ受容体基質」で例示した各化合物とを混合し、そこに「本発明タンパク質」の存在下で酵素反応させ、「反応生成物」を「ＧｌｃＮＡｃ供与体基質」と分離して「反応生成物の放射能」を測定する方法で行うことができる。このような方法としては具体的には後述の実施例２記載の方法が例示される。
【００３６】
「本発明タンパク質」は酵素反応に「二価金属陽イオン」を必要とする（この性質を「金属イオン要求性」とも記載する）。すなわち、「二価金属陽イオン」をキレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」とも略記する）等）でキレートすると、活性を実質的に失う性質を有する。
【００３７】
「二価金属陽イオン」としては、例えばカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）等が挙げられる。好ましくは、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋が２．５ｍＭから４０ｍＭの濃度で共存する条件下では酵素活性の増強が確認される。Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋が特に好ましい。
【００３８】
「本発明タンパク質の反応ｐＨ」は中性近辺、好ましくは、ｐＨ６．０からｐＨ８．０である。例えば、２０ｍＭのＭｎ２＋共存下で、ｐＨ７．４での酵素活性の方がｐＨ６．６での酵素活性よりも強い（何れもカコジル酸ナトリウム緩衝液中）という特徴を有する。このような酵素活性の強さの比較は、例えば実施例２記載の方法により、放射能標識を用いて容易且つ正確に行うことができる。
【００３９】
このような「本発明タンパク質」は、より具体的には、例えば、以下の（Ａ）乃至（Ａ’’）のポリペプチドを含む。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（Ａ’）配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ａ’’）配列番号２記載のアミノ酸番号１乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド
また、それらに糖鎖が結合した糖ポリペプチドの形態の糖転移酵素も本発明タンパク質の一態様として挙げられる。
【００４０】
なお、一般にアミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入等の変異が存在していても、酵素の活性が維持されることは当業者にとっては理解されうるところであり、上記配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号２記載のアミノ酸番号１乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドの当該アミノ酸配列に於いても１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入等の変異が存在していても「糖転移酵素活性」を有する限りにおいて上記「ポリペプチド」として使用することができる。
【００４１】
すなわち、天然に存在するポリペプチドには、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のポリペプチドの細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、又は挿入等の変異が起こりうるが、それにも拘わらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示す物があることが知られている。このように構造的に若干の相違があってもその機能については大きな違いが認められないものも、上記「ポリペプチド」に包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記の様な変異を導入した場合も同様であり、この場合には更に多種多様の「変異を有するポリペプチド」を作成することが可能である。なお、このような置換、欠失、又は挿入等の変異には、「転位」、核酸中の一部分の別位置への移動、例えば、染色体上の遺伝子移動も含む。
【００４２】
例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリン残基に置換したポリペプチドがＩＬ−２の活性を保持することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４（１９８４）， ｐ．１４３１）。またある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれに当たり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このような活性に必須でないペプチド領域の配列を有するポリペプチドは、二次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドであり、「本発明タンパク質のポリペプチド」もそのような配列が連結していても良い。このような「変異を有するポリペプチド」は「部位特異的変異法」などの公知の方法により容易に作成することが可能である。
【００４３】
なお、ここで「複数個」とは、ＧｌｃＮＡｃ供与体基質からＧｌｃＮＡｃ受容体基質にＧｌｃＮＡｃ残基を転移する糖転移活性を有する限りに於いて「複数個」とは特に限定はされないが、好ましくは全アミノ酸数の１０％以下、より好ましくは５％以下程度のアミノ酸数を示す。例えば３４７個のアミノ酸からなるポリペプチド（例えば上述の（Ａ’）記載のポリペプチド）に於いては３５個以下、好ましくは１７個以下を示し、また４０２個のアミノ酸からなるポリペプチド（例えば上述の（Ａ’’）記載のポリペプチド）に於いては４０個以下、好ましくは２０個以下を示す。
【００４４】
本発明の糖転移酵素タンパク質は、クローニングされた核酸の塩基配列からの推定に基づいて、配列番号２のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。
【００４５】
本発明タンパク質について、ＢＬＡＳＴによる同一性検索を行うと、最も似ているβ３ＧｎＴ７とは４６％の同一性である。従って、本発明タンパク質は新規な酵素であると考えられる。よって、同一性は、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらになお好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００４６】
本願明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５， ｐ．３３８９−３４０２， １９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、あるいはＰｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｐ．２４４４−２４４８， １９９８）に記載されているＦＡＳＴＡを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ （ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【００４７】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作成する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
本発明のタンパク質は、例えば、後述する実施例１に従って、本発明の核酸による配列番号１に記載の核酸を適当な宿主細胞、例えば、大腸菌、酵母、昆虫、又は動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入し、発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
【００４９】
本発明によって、このタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、当該配列又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応等の遺伝子工学的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子がコードする新規タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００５０】
なお、本発明タンパク質は、そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、前記酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。より具体的には、後述する実施例２に記載したように、本発明タンパク質における受容体基質の探索から、該タンパク質は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを転移する活性を有するものである。特に、配列相同性より、β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移活性を有すると考えられる。
【００５１】
（２）本発明核酸
本発明はまた、本発明の新規糖転位酵素タンパク質の全長または断片をコードする核酸を提供する。
【００５２】
「本発明核酸」としては、例えば配列番号１記載の塩基番号６８３乃至７７５からなる塩基配列からなる核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸（本発明核酸１）、配列番号１記載の塩基番号１６６乃至１２０６（配列番号２のアミノ酸残基５６−４０２をコードする）からなる塩基配列からなる核酸（本発明核酸２）、配列番号１記載の塩基番号１乃至１２０６（配列番号２のアミノ酸残基１−４０２をコードする）からなる塩基配列からなる核酸（本発明核酸３）又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸が例示される。これらの核酸がコードするアミノ酸配列と縮重により同一のアミノ酸配列をコードする核酸も本発明に含まれる。
【００５３】
上記「本発明核酸１」は、例えば後述の「本発明検出法」への利用に適した核酸である。
上記「本発明核酸２」は、「本発明タンパク質のポリペプチド」のうち、「膜貫通領域（疎水性アミノ酸が１０乃至２０個程度連続した領域）を欠失した態様のポリペプチド」をコードするので、当該核酸を発現させることによって生成されるポリペプチドを「可溶性ポリペプチド」とすることができる。また「本発明核酸３」は、「本発明タンパク質のポリペプチド」の全配列をコードする。特に「本発明核酸２」や「本発明核酸３」等は、タンパク質合成における終始コドンに相当する塩基配列を含むため、「配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」（上記（Ａ’）記載のポリペプチド）や「アミノ酸番号１乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」（上記（Ａ’’）記載のポリペプチド）を遺伝子工学的に調製するためにも使用することができる。
【００５４】
「本発明核酸」は、一本鎖及び二本鎖型両方のＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学結合したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。後述の「癌化検出方法」にプローブ等として使用する場合や、ベクターや形質転換体の調製時に安定である点で優れるため、ＤＮＡであることが好ましい。
【００５５】
特に配列番号１記載の塩基配列の全部又は一部を有する核酸は、例えば「本発明核酸」の生体内での発現状況などを検査するための、プライマー、プローブ等として使用することができ、医学研究用の試薬又は診断薬として極めて有用である。このようなプローブとしての核酸はあまりに分子量が大きいと取扱が困難となるため、４０塩基乃至１２０９塩基が例示され、より好ましくは５０塩基乃至５００塩基、最も好ましくは６０塩基乃至３００塩基が例示される。合成オリゴヌクレオチドのプローブ又はプライマーとして利用する場合には、少なくとも１０塩基以上、好ましくは、１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上である。好ましくは５０塩基以下である。
【００５６】
なお、ここで「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｖｏｌ．１、７．４２−７．４５ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
【００５７】
「本発明核酸」は例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知のβ３グルクロン酸転移酵素７（β３ＧｎＴ７）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＫ０００７７０）（配列番号１０）をクエリーとして塩基配列の検索を行ない、ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＢＣ００４９０８）の相補配列を得ることができた。この相補配列又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いてｃＤＮＡライブラリーなどから本発明核酸（例えば本発明ＤＮＡ）を調製することができる。上記相補配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）はＮ末端に膜貫通領域を有することが予測されるので、この膜貫通領域を有しないポリペプチドをコードする塩基配列の領域を調製すると、可溶化形態のポリペプチドをコードする「本発明核酸」が得られる。
【００５８】
配列番号２のアミノ酸配列より、アミノ酸番号１乃至５５が膜貫通領域である。よって、当該領域の全部又は一部を欠如したポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする核酸は、「可溶化形態のポリペプチドまたはその核酸」として本発明に含まれる。例えば「配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列」が挙げられ、このようなアミノ酸配列からなる可溶化形態のポリペプチドをコードする核酸としては、「配列番号１記載の塩基番号１６６乃至１２０９からなる塩基配列からなる核酸」が例示される。このような核酸の調製は、例えば配列番号３記載の配列を５’プライマー（配列番号３の塩基番号３２−５６は、配列番号１の塩基番号１６６−１９０に対応する）、配列番号４記載の配列を３’プライマー（配列番号４の塩基番号３１−５５は、配列番号１の塩基番号１２０９−１１８５に対応する）として使用し、例えばヒトゲノムｃＤＮＡライブラリーを鋳型として常法に従って核酸増幅反応を行うことで調製することができる。
【００５９】
ここで、核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０， １３５０−１３５４ （１９８５）］、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）［Ｗｕ Ｄ． Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ４， ５６０−５６９ （１９８９）； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ Ｋ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ８９， １１７−１２２ （１９９０）； Ｂａｒａｎｙ Ｆ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８， １８９−１９３ （１９９１）］及び転写に基づく増幅［Ｋｗｏｈ Ｄ． Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６， １１７３−１１７７ （１９８９）］等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）［Ｗａｌｋｅｒ Ｇ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ３９２−３９６ （１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０， １６９１−１６９６ （１９９２）］、自己保持配列複製（３ＳＲ）［Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ． Ｃ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７， １８７４−１８７８ （１９９０）］およびＱβレプリカーゼシステム［リザイルディら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， ｐ．１１９７−１２０２ （１９８８）］等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ： ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００６０】
配列番号３及び４のプライマーを使用した場合、ＰＣＲ産物として約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して「本発明核酸」を得ることができる。
【００６１】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらになお好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する。
【００６２】
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ３８７， １９８４に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、並びにＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｐｐ．３５３−３５８， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，１９７９に記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；及び（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【００６３】
（３）本発明のベクター及び形質転換体
本発明によれば、単離した「本発明核酸」を含む組換えベクターが提供される。プラスミド等のベクターに本発明核酸のＤＮＡ断片を組込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １．１ （２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、大腸菌ＤＨ５α、ＴＢ１、ＬＥ３９２、又はＸＬ−ＬＥ３９２又はＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
【００６４】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １６．１ （２００１）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００６５】
ベクターは、簡単には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＤＯＮＲ２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が例示されるが、これらに限定されない。
【００６６】
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明タンパク質を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように本発明発現ベクターは上記の本発明核酸が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモーター領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに本発明核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。また、発現ベクターの構築は、制限処理及び連結作業を必要としない、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を用いることもできる。Ｇａｔｅｗａｙシステムとは、ＰＣＲ産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、ＤＮＡ断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、ＰＣＲ産物とドナーベクターとから部位特異的な組換え酵素であるＢＰクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるＬＢクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにＰＣＲ産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間の係るサブクローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
【００６７】
発現ベクターの種類は、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
【００６８】
上記「本発明発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、形質転換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。本発明の形質転換体をえるための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）等由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬社）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
【００６９】
ところで「本発明核酸」はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、本発明においては真核細胞を本発明の形質転換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した「本発明タンパク質」が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、特にほ乳類細胞を選択することが好ましい。ほ乳類細胞としては、具体的には、マウス由来、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。また、宿主細胞としての大腸菌、酵母又は昆虫細胞は、具体的には、大腸菌（ＤＨ５α、Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（Ｓｆ２１、ＢｍＮ４、カイコ幼虫等）などが例示される。
【００７０】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００７１】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００７２】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
【００７３】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ． ｃｏｌｉではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２若しくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
【００７４】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００７５】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００７６】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００７７】
本発明の発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（Ｅ． ｃｏｌｉ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ６９， ２１１０ （１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １６８， １１１ （１９７９）］やコンピテント法［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５６， ２０９ （１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７５， １９２７ （１９７８）］やリチウム法［Ｊ． Ｂ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５３， １６３ （１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２７， １２９ （１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ， ３１９， ７９１ （１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２， ４５６ （１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒらの方法［Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ３， ２１５６−２１６５ （１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
【００７８】
（４）本発明タンパク質の単離・精製
近年は遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
【００７９】
本発明タンパク質は、例えば、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
【００８０】
本発明のタンパク質は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
【００８１】
本発明タンパク質を、糖タンパク質、オリゴ糖または多糖等に作用させることにより、Ｎ−アセチルグルコサミンが転移される。従って、本発明タンパク質は、糖タンパク質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、本発明タンパク質を免疫原として動物に投与することにより、該タンパク質に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該タンパク質を測定することが可能になる。従って、本発明タンパク質及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。
【００８２】
本発明発現ベクターはそのような本発明タンパク質の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に「本発明タンパク質」を「酵素活性を有するポリペプチド（例えば上述の（Ａ）、（Ａ’）又は（Ａ’’）記載のポリペプチド）」と「標識ペプチド」との「融合タンパク質」の形態で発現するように構築した「本発明発現ベクター」を用いて遺伝子工学的に「本発明タンパク質」を調製すると単離・精製が容易となるため好ましい。
【００８３】
上記「識別ペプチド」の例としては、「本発明タンパク質」を遺伝子組み換えによって調製する際に、該「識別ペプチド」と「酵素活性を有するポリペプチド」とが結合した「融合タンパク質」として発現させることにより、形質転換体の生育物から「本発明タンパク質」の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドである。このような「識別ペプチド」としては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のＮ末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、Ｄｓｂ等）、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約４２，０００のタンパク質）、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ（ヒスチジン残基を６乃至１０個並べて配した配列）、ｍｙｃタグ（ｃＭｙｃタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、ＦＬＡＧペプチド（８アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、Ｔ７タグ（ｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１アミノ酸残基からなる）、Ｓタグ（膵臓ＲＮａｓｅＡ由来の１５アミノ酸残基からなる）、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ（大腸菌外膜タンパク質ｐｅｌＢの２２アミノ酸配列）、ＨＡタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸残基からなる）、Ｔｒｘタグ（チオレドキシン配列）、ＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＢＤタグ（セルロース結合ドメイン）、ＣＢＲタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β−ｌａｃ／ｂｌｕ（βラクタマーゼ）、β−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、ＨＰ−Ｔｈｉｏ（Ｈｉｓ−ｐａｔｃｈチオレドキシン）、ＨＳＰ（熱ショックペプチド）、Ｌｎγ（ラミニンγペプチド）、Ｆｎ（フィブロネクチン部分ペプチド）、ＧＦＰ（緑色蛍光ペプチド）、ＹＦＰ（黄色蛍光ペプチド）、ＣＦＰ（シアン蛍光ペプチド）、ＢＦＰ（青色蛍光ペプチド）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光ペプチド）、ＭＢＰ（マルトース結合ペプチド）、ＬａｃＺ（ラクトースオペレーター）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、アビジン、プロテインＧ等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧペプチド、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ又はＨＡタグが、遺伝子工学的手法による本発明タンパク質の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にＦＬＡＧペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号６）との融合タンパク質として「本発明タンパク質」を得るのが、取扱面で極めて優れているため好ましい。上記ＦＬＡＧペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本願明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００８４】
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として「本発明タンパク質」を得ることができる基本ベクターとしては例えばｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（シグマ社）、ｐＦＢＩＦ（ｐＦａｓｔＢａｃ（インビトロジェン社）にＦＬＡＧペプチドをコードする領域を組み込んだベクター：後述の実施例参照）等が例示されるが、当業者であれば「本発明タンパク質」の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
【００８５】
なお、本発明によって「本発明核酸の塩基配列」が開示されたため、当業者であれば目的とする「本発明核酸」や調製したい「本発明核酸の一部の領域」の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いてＰＣＲ法などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
【００８６】
（５）本発明測定用核酸
本発明によれば、本発明核酸とハイブリダイズする核酸（以下、「測定用核酸」と称する）が提供される。本発明測定用核酸は、典型的には、本発明タンパク質をコードする核酸の天然由来の又は合成されたフラグメントであり、プライマー又はプローブを含むが、これらに限定されるものではない。なお、本明細書において使用される用語「測定」には、検出、増幅、定量、および半定量のいずれもが包含される。
【００８７】
（ａ）プライマー
本発明測定用核酸を核酸増幅反応用のプライマーとして使用する場合、本発明測定用核酸は、オリゴヌクレオチドであって、
配列番号２に示すタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−５０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−７０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
【００８８】
本発明のプライマーは、本発明核酸の部分領域と相同的な配列を有することが好ましいが、１または２塩基の不一致があっても差し支えない。
なお、本発明のプライマーの塩基数は１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは２１塩基以上であり、５０塩基以下である。
【００８９】
本発明のプライマーは、典型的には、配列番号７（配列番号１の塩基番号６８３−７０１に対応する）及び配列番号８（配列番号１の塩基番号７７５−７５５に対応する）の塩基配列を有し、単独、又はプライマー対として用いることができる。
【００９０】
（ｂ）プローブ
本発明測定用核酸をプローブとして使用する場合、本発明測定用核酸は、配列番号１に記載の塩基配列の全体又は部分領域と相同的な配列を有することが好ましい。本発明の測定用核酸が、ｃＤＮＡプローブの場合、塩基数は、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、最長で、コード領域の全長、即ち、１２０９塩基である。配列番号１に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と５０％以下、好ましくは２０％以下の不一致があっても、プローブとしての機能を果たし得る。また、本発明の測定用核酸が、合成オリゴヌクレオチドの場合、塩基数は１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上である。合成オリゴヌクレオチドの場合、長さによるが、配列番号１に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と１または２塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たしうる。
【００９１】
本発明のプローブは、例えば、配列番号９に記載された塩基配列を有する。これは、配列番号１の塩基番号７０７−７２４の相当し、配列番号７および８をプライマーとして核酸増幅反応を行った場合、その増幅産物にハイブリダイズして検出しうる。
【００９２】
本発明のプローブには、該プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを検出または確認するために、蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブが含まれる。被検核酸またはその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するかを決定することができる。
【００９３】
一般的に、ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、当該技術分野において周知であり、そのための試薬キットおよび装置も市販されているので容易に行うことができる。上記した本発明のプライマー対を用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、定量的ＲＴ−ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
【００９４】
（６）本発明検定方法
本発明者らは、本発明の新規β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質、及び／又は核酸の発現量が、癌組織において正常組織よりも多いことを見出した。よって、本発明の生物試料中において本発明のタンパク質または核酸を定量し、対照の正常な生物試料中の相当する量と比較することにより、生物試料の癌化を検定することが可能である。
【００９５】
具体的には、本発明は、生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００９６】
また、本発明の検定方法は、
（ａ）生物試料中の本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の前記核酸の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記核酸の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、ものであってもよい。
【００９７】
上記のように、本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を癌マーカーとして定量する場合には、例えば、該タンパク質を免疫原として作成される抗体を用いることができる。抗体を利用したタンパク質の定量方法としては、当該技術分野における周知な方法、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法を使用することが可能である。また、本発明の糖転移酵素タンパク質の活性を利用することによって、定量することもできる。前記定量値の比は、１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上、さらにより好ましくは１０倍以上、最も好ましくは２０倍以上である。
【００９８】
また、本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸を癌マーカーとして定量する場合には、本発明の検定方法は、
（ａ−１）生物試料中のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸に本発明の測定用核酸から選択される一対のプライマーをハイブリダイズさせ；
（ａ−２）β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸を増幅させ；
（ａ−３）前記増幅産物を定量し；そして
（ｂ）前記定量値が、対照の正常な生物試料中の対応する定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、ものであってもよい。
【００９９】
本発明検定方法への利用できる核酸は、本発明測定用核酸として例示されるが、特に限定されず、例えば、配列番号１記載の塩基番号１乃至１２０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列から選択される、任意の配列を利用可能である。配列番号１記載の塩基番号６８３乃至７７５からなる塩基配列からなる核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸（本発明核酸１）を使用することが好ましい。即ち、本発明検定方法によって生物試料において検出される核酸（特にｍＲＮＡ）は、配列番号１記載の塩基配列番号６８３乃至７７５からなる塩基配列を含む核酸であることが好ましいが、具体的には、配列番号１記載の塩基番号６８３乃至７７５からなる塩基配列からなる核酸、配列番号１記載の塩基番号１６６乃至１２０９からなる塩基配列からなる核酸、及び配列番号１記載の塩基番号１乃至１２０９からなる塩基配列からなる核酸が例示される。
【０１００】
これらの核酸の発現量は、例えば、本発明測定用核酸を使用したＰＣＲ法を用いて定量することができる。ＰＣＲ法では、定量的ＰＣＲ法の使用が好ましく、キネティックス分析のためのＲＴ−ＰＣＲ法、定量的リアルタイムＰＣＲ法が例示される。本発明によれば、核酸の定量には、これらに限定されるものではなく、ノーゼンブロット、ドットブロット、ＤＮＡマイクロアレイを使用することも可能である。一方、同一組織等に広く一般的に存在する遺伝子の核酸、例えばグリセルアルデヒド−３リン酸−脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、β−アクチンをコードする核酸を対照として利用することができる。癌化していると判断されるシグナルの定量比は、１．５以上であり、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは５以上、さらにより好ましくは１０以上、最も好ましくは２０以上である。
【０１０１】
本明細書において、「生物試料」というときは、器官、組織及び細胞を示すが、好ましくは組織であり、具体的には、食道、胃、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、小腸、大腸、直腸、結腸が例示される。好ましくは大腸、直腸、及び結腸であり、より好ましくは大腸である。
【０１０２】
本発明検定方法は、上記の通り、生物試料の癌化を検定するものであり、医療における癌の診断、治療等に応用することができる。本明細書において使用される用語「癌」には、典型的には、悪性腫瘍全般をいい、該悪性腫瘍による疾病状態を含む。本発明検定方法は、限定されるわけではないが、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、及び結腸癌、好ましくは大腸癌、直腸癌、及び結腸癌であり、より好ましくは大腸癌の検定に適している。
【０１０３】
（７）本発明抗体
本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質に免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こうした抗体は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介して、該糖転移酵素タンパク質に特異的に結合する。したがって、上述のような、配列番号２のタンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でも高次構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定してもよい。
【０１０４】
したがって、本発明の１つの側面は、本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、タンパク質の化学的または酵素的切断などの、当該技術分野に公知の技術を用いて、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて、産生することが可能である。
【０１０５】
前記糖転移酵素タンパク質によって誘導される可能性がある抗体に関しては、該タンパク質の全部若しくは一部が単離されていても、またはエピトープが単離されていても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術によって調製することが可能である。例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修）， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８０を参照されたい。
【０１０６】
本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を該糖転移酵素タンパク質で免疫し；免疫された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そして該タンパク質に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。
【０１０７】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術によって調製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供してもよい。
【０１０８】
慣用的技術によって産生可能な、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
【０１０９】
本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏいずれかで、前記糖転移酵素タンパク質または断片の存在を検出するアッセイで用いることが可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
【０１１０】
さらに、結合パートナー、例えば受容体基質への本発明のタンパク質の結合を遮断することが可能な抗体を用いて、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害することが可能である。こうした遮断抗体は、受容体基質を発現している特定の細胞への該タンパク質の結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて、同定してもよい。あるいは、遮断抗体は、標的細胞の結合パートナーに結合している本発明タンパク質から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定することが可能である。
【０１１１】
こうした抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用するか、又はｉｎ ｖｉｖｏで投与して、抗体を生成した実体によって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。したがって、本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質と結合パートナーとの相互作用によって、（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、結合パートナー仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、ほ乳動物にｉｎｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。
【０１１２】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【０１１３】
【実施例】
実施例１ 本発明ＤＮＡ及び本発明タンパク質の調製方法
β３グルクロン酸転移酵素７（β３ＧｎＴ７）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＫ０００７７０）（配列番号１０）をクエリーとして、ＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果、ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＢＣ００４９０８）の相補配列がβ３ＧｎＴ７とホモロジーを有することが判明した。相補配列は配列番号１の通りであった。この塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）はＮ末端に膜貫通領域を有することが予測され、この膜貫通領域を有しないタンパク質をコードする塩基配列の領域を調製することとした。調製は、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を利用して、ｐＦａｓｔＢａｃ（インビトロジェン社）の誘導体であるｐＦＢＩＦに遺伝子を組み込み、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社）によるバクミドを作成して行った。
【０１１４】
（１） エントリークローンの調製
ヒトゲノムｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、５’プライマーとして配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号３の塩基番号３２−５６は、配列番号１の塩基番号１６６−１９０に対応する）、３’プライマーとして配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号４の塩基番号３１−５５は、配列番号１の塩基番号１２０９−１１８５に対応する）を使用してＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法は９６℃ １分、５５℃ １分、７２℃ １分を３０サイクル繰り返す条件で行った。そしてＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動を行い、ゲル切り出し法でゲルを切り出して常法により単離した。このようにして単離したＰＣＲ産物をＢＰクロナーゼ反応によってｐＤＯＮＲ２０１（商標）（インビトジェン社製）へ組み込んで「エントリークローン」を作成した。反応は上記ＰＣＲ産物２μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１ １μｌ（１５０ｎｇ）、ＢＰ反応緩衝液２μｌ、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０：以下「ＴＥ」とも略記する）３μｌ、ＢＰクロナーゼｍｉｘ ２μｌを２５℃で１時間インキュベーションして行った。その後、プロテイナーゼＫ（科研製薬株式会社製）を１μｌ加えて３７℃、１０分間インキュベートして反応を終了させた。その反応混合液１１μｌをコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシンを含むＬＢプレートに播いた。翌日コロニーを回収し、ＰＣＲ法で目的ＤＮＡが導入されていること及びその塩基配列を確認し、挿入されたベクター（ｐＤＯＮＲ−Ｇ２６Ａ）を常法に従って抽出、精製した。このベクターに挿入されたＤＮＡの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号１６６乃至１２０９からなる塩基配列を含むことが確認された。
【０１１５】
（２） 発現クローンの調製
上記エントリークローンは、挿入部位の両端にλファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔｔＬを持つもので、ＬＲクロナーゼ（λファージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデスティネーションベクター（ａｔｔＲを有する）とを混合することで、挿入部位がデスティネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。
【０１１６】
１μｌのエントリークローン（ｐＤＯＮＲ−Ｇ２６Ａ）、０．５μｌのデスティネーションベクター（ｐＦＢＩＦ（７５ｎｇ））、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ４．５μｌ、ＬＲクロナーゼミックス（λファージの組換え酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、及びＸｉｓを混合した溶液）２μｌを２５℃で１時間インキュベートし、プロテイナーゼＫ（科研製薬株式会社製）を１μｌ加えて３７℃で１０分間インキュベートして反応を停止させた（この組換反応でｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａが生成された）。ｐＦＢＩＦはｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロジェン社製）にＩｇκシグナル配列（配列番号５）と精製用のＦＬＡＧペプチド（配列番号６）とを常法に従って挿入したものである。さらに、ｐＦＢＩＦにＧａｔｅｗａｙ配列（ａｔｔＲ）を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて変換カセットを挿入した。この変換カセットは、発現ベクターをデスティネーションベクターに改変するためのカセットであり、ａｔｔＲ組換え部位、クロラムフェニコール耐性遺伝子、及び大腸菌ＤＮＡ ｇｙｒａｓｅを阻害するタンパク質をコードするｃｃｄＢ遺伝子を有する。また、Ｉｇκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、ＦＬＡＧタグは精製を容易とするために挿入した。
【０１１７】
ｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａが含まれる反応混液（１１μｌ）とコンピテントセルである大腸菌ＤＨ５α １００μｌとを混合し、ヒートショック法による形質転換の後、アンピシリンをで含むＬＢ培地に組換ＤＨ５αを蒔いて培養した。２４時間培養後、コロニーを回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）によりプラスミド（ｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａ）を抽出精製した。ＰＣＲ法で目的ＤＮＡが挿入されていることを確認した。
【０１１８】
（３） Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社製）によるバクミドの調製
続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社製）を用いて上記ｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａとバクミドとの間で組換を行い、昆虫細胞中で増殖可能なバクミドにＧ２６Ａの配列を挿入した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、バクミドを含む大腸菌（大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ（商標））に目的遺伝子を挿入させたｐＦａｓｔＢａｃ（即ち、ｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａ）を導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生させる組換えタンパク質によって目的とする遺伝子（Ｇ２６Ａ）がバクミドに取り込まれるシステムである。またバクミドにはＬａｃＺ遺伝子が含まれており、古典的なコロニーの色（青（挿入なし）−白（挿入あり））による選択が可能である。
【０１１９】
すなわち、上記精製ベクター（ｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａ）５０μｌとコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ）５０μｌとを混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、５−ブロモインドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ）、及びイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地に蒔き、２４時間後にバクミドに目的ＤＮＡが挿入された白い独立したコロニーを回収し、更に培養を行った後、常法に従ってバクミドを回収した。
【０１２０】
（４） バクミドの昆虫細胞への導入
回収したバクミドに目的ＤＮＡが挿入されていることを常法に従って確認し、バクミドを昆虫細胞（Ｓｆ２１：インビトロジェン社製）に導入した。すなわち３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１細胞９×１０５個／２ｍｌに抗生物質を含むＳｆ９００ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）を添加し、２７℃で１時間細胞を接着させた。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して、ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液（Ａ溶液（１００μｌのＳｆ−９００ＳＦＭに上記バクミド５μｌを添加した混合物）とＢ溶液（１００μｌのＳｆ−９００ＳＦＭに６μｌのＣｅｌｌ ＦＥＣＴＩＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を添加した混合物）とを丁寧に混合して３０分間程度室温でインキュベートして得た溶液）にＳｆ９００ＩＩ（インビトロジェン社製）８００μｌを添加した培養液を添加して２７℃で５時間インキュベーションした。その後、培地を除去し、抗生物質を含むＳｆ９００ＳＦＭ培地２ｍｌを添加し、２７℃で７２時間インキュベートした。培養後ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収して１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「一次ウイルス液」とした）。
【０１２１】
更にＴ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７個／２０ｍｌＳｆ−９００ＳＦＭ（抗生物質を含む）を添加し、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着した後、一次ウイルス液８００μｌを添加し、２７℃で４８時間培養した。培養後、ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収した。これを１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「二次ウイルス液」とした）。
【０１２２】
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７個／２０ｍｌＳｆ−９００ＳＦＭ（抗生物質を含む）を添加し、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着した後、二次ウイルス液１０００μｌを添加し、２７℃で８４時間培養した。培養後、ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収した。これを１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「三次ウイルス液」とした）。
【０１２３】
さらに、Ｓｆ２１細胞を６×１０５個／ｍｌの濃度で含むＳｆ−９００ＳＦＭ（抗生物質を含む）を１００ｍｌ用スピナーフラスコに１００μｌ添加し、三次ウイルス液１ｍｌを添加し、２７℃で９６時間培養した。培養後、細胞と培養液を回収した。これを１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「四次ウイルス液」とした）。
【０１２４】
四次ウイルス液１０ｍｌに対し、アジ化ナトリウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムを加えた。終濃度はアジ化ナトリウムを０．０５％、塩化ナトリウムを１５０ｍＭ、塩化カルシウムを２ｍＭとした。抗ＦＬＡＧ抗体ゲル（Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ、シグマ社製）を５０μｌ添加し、４℃で１６時間緩やかに転倒混和した。遠心分離（１，０００×ｇ、３分、４℃）して上清を除去した後、１ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液：ｐＨ７．４）で２回洗浄した。そして洗浄後のアフィニティーゲルを１ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳ（ｐＨ７．４）２００μｌに懸濁して、この懸濁液を活性測定用のＧ２６酵素液とした。
【０１２５】
実施例２ 本発明タンパク質の酵素活性
配列番号２記載のアミノ酸配列を基に、他の公知の糖転移酵素と対比した結果、活性部位と考えられるＣ−末端領域の配列の保存性などから、Ｇ２６はβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素類に分類されることが示唆された。そこでＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＧｌｃＮＡｃ供与体基質として用いてＧ２６酵素液の酵素活性の確認を行った。
【０１２６】
ＧｌｃＮＡｃ受容体基質としては、ＧａｌＮＡｃα１−Ｂｚ、ＧａｌＮＡｃβ１−ｐＮｐ、ＧｌｃＮＡｃα１−Ｂｚ、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｂｚ、Ｇａｌα１−ｐＮｐ、Ｇａｌβ１−ｏＮｐ、Ｘｙｌβ１−ｐＮｐ、Ｆｕｃα１−ｐＮｐ、Ｍａｎα１−Ｂｚ、ＭａｎＮＡｃα１−Ｂｚ、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｂｚ（以上全てシグマ社製）、及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１−ｐＮｐ（トロントリサーチケミカル社製）の全てを同時に用い、各々最終濃度で１０ｎｍｏｌずつ含むように反応液を調製して活性を確認した。
【０１２７】
反応液は最終濃度５０ｍＭのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨを６．６、７．０、及び７．４の各実験系を調製した）、最終濃度０．４％のＴｒｉｔｏｎ（商標） ＣＦ−５４（シグマ社製）、最終濃度４８０μＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、１７５ｎＣｉのＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＮＡｃ、最終濃度２０ｍＭのＭｇＣｌ２、ＣｏＣｌ２又はＣｕＣｌ２、１０．１μｌのＧ２６酵素液、及び蒸留水を含む全量２０μｌとした。
【０１２８】
反応液を３７℃で１６時間インキュベートし、その後蒸留水２００μｌを添加し、不溶性画分を遠心分離（１００×ｇ、１０分）により除去して上清画分を回収した。Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｇｅ（ウォーターズ社製：予め１ｍｌのメタノールで１回、次いで１ｍｌの蒸留水で２回洗浄して平衡化したもの）に通筒し、上清に含まれるＧｌｃＮＡｃ受容体基質及び反応生成物を吸着させた。１ｍｌの蒸留水でカラムを２回洗浄し、カラムに吸着したＧｌｃＮＡｃ受容体基質と反応生成物を１ｍｌのメタノールで溶出した。溶出液を５ｍｌの液体シンチレーター（アマシャム バイオサイエンス株式会社製）と混和し、シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定した（図１）。
【０１２９】
その結果、Ｇ２６は２０ｍＭのＭｎＣｌ２又はＭｇＣｌ２存在下では何れのｐＨに於いても活性は確認されたが、ｐＨ６．６よりもｐＨ７．４の方が強い活性が観察された。ＥＤＴＡにより二価金属陽イオンをキレートした条件下では酵素活性は観察されなかったことから、Ｇ２６は二価金属陽イオンを酵素反応に必要とすることが明らかとなった。
【０１３０】
実施例３ 大腸癌組織における本発明ＤＮＡ発現量の変化
定量的リアルタイムＰＣＲ法を用いてヒト大腸癌組織と同一患者の健常大腸組織での本発明核酸（ｍＲＮＡ）の発現量を比較した。ヒト大腸癌組織及び健常大腸組織のＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）で抽出し、Ｓｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロゲン社製）を用いたｏｌｉｇｏ（ｄＴ）法によりｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡとした。このＤＮＡを鋳型として用いてプライマー（５’プライマー：配列番号７（配列番号１の塩基番号６８３−７０１に対応する）、３’プライマー：配列番号８（配列番号１の塩基番号７７５−７５５に対応する））及びＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ（配列番号９）（配列番号１の塩基番号７０７−７２４に対応する）を用いてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（アプライドバイオシステムス社製）により定量的リアルタイムＰＣＲ法を行なった。ＰＣＲ反応の条件は、５０℃で２分、９５℃で１０分で反応させた後、９５℃で１５秒、６０℃１分を５０回繰り返して行った（表２）。
【０１３１】
【表２】
【０１３２】
その結果、癌化した組織における本発明ＤＮＡの発現量は、健常組織と比較して平均して７倍以上に増加していることが明らかとなった。また、試料番号１−１０のうちの８つ、即ち、被験者の８０％以上が、２倍以上の発現量を示した。
【０１３３】
【配列表】
【０１３４】
【発明の効果】
本発明により新規な糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに組織の癌化の新規な検定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明タンパク質の活性への反応ｐＨ、各種二価金属イオン、及びＥＤＴＡの影響を示す図である。黒塗りの三角はマンガンイオン、黒塗りの丸はコバルトイオン、黒塗りの正方形はマグネシウムイオンを各々示し、白抜きの三角はＥＤＴＡ、白抜きの丸と菱形は陰性対照を各々示す。縦軸は放射能の量（ｄｐｍ）を示し、横軸は反応ｐＨを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な「糖転移酵素」及びそれをコードする「核酸」に関連し、また癌化した組織における前記核酸の発現量が増加することに基づく「組織の癌化検出方法」に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体内での糖鎖や複合糖質の働きが注目されている。例えば、血液型を決定する因子は糖タンパク質であり、また神経系の働きに関与しているのは糖脂質である。従って、糖鎖を合成する働きのある酵素は、様々な糖鎖がもたらす生理活性を解析する上で極めて重要な手がかりとなる。
【０００３】
糖の中でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）はグリコサミノグリカンの構成成分であると共に、スフィンゴ糖脂質、ムチン型糖鎖と様々な糖鎖構造に存在する糖残基である。従って、ＧｌｃＮＡｃを転移する酵素は、生体内の様々な組織で働く糖鎖の働きを解析する上で極めて重要なツールとなる。
【０００４】
これまで、ＧｌｃＮＡｃを転移する活性を有するＮ−アセチルグルコサミン酵素は、少なくとも１９種類知られており（表１）、各々、受容体基質特異性が異なる。
【０００５】
【表１】
【非特許文献１】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５０（９）： ３３０３−９ （１９７５）
【０００７】
【非特許文献２】Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ６１（９）： １０４９−１０６６ （１９８３）
【０００８】
【非特許文献３】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５７（１７）： １０２３５−１０２４２ （１９８２）
【０００９】
【非特許文献４】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５８（１０）： ６１６２−７３ （１９８３）
【００１０】
【非特許文献５】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５７（２２）： １３４２１−７ （１９８２）
【００１１】
【非特許文献６】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５（４２）： ３２５９８−６０２ （２０００）
【００１２】
【非特許文献７】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９６（２）： ４０６−１１ （１９９９）
【００１３】
【非特許文献８】Ｃｅｌｌ， １０５（７）： ９５７−６９ （２００１）
【００１４】
【非特許文献９】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６（５）： ３４９８−５０７ （２００１）
【００１５】
【非特許文献１０】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６（２５）： ２２０３２−４０ （２００１）
【００１６】
【非特許文献１１】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７（１５）： １２８０２−９ （２００２）
【００１７】
【非特許文献１２】Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２９４（４）： ８４３−８ （２００２）
【００１８】
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ， ４０６（６７９４）： ４１１−５ （２０００）
【００１９】
【非特許文献１４】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５９（２１）： １３３８５−９０ （１９８４）
【００２０】
【非特許文献１５】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５（２３）： １１２５３−６１ （１９８０）
【００２１】
【非特許文献１６】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４（５）： ３２１５−２１ （１９９９）
【００２２】
【非特許文献１７】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７５（１５）： １１１０６−１３ （２０００）
【００２３】
【非特許文献１８】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６（１６）： ８９９１−６ （１９９９）
【００２４】
【非特許文献１９】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６５（５）： ２５６３−２５６８ （１９９０）
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
生体内での糖鎖の働きが注目されているが、生体内での糖鎖合成の解析は十分に進んでいるとは言えない。糖鎖合成のメカニズム、生体内での糖合成の局在が充分に解析されていないことも一因である。糖鎖合成のメカニズムを解析するに当たっては、糖鎖合成酵素、特に糖転移酵素を解析し、その酵素を使ってどの様な糖鎖が生成されるのかを分析する必要である。そのために新たな糖転移酵素を見つけだし、その機能を解析することに対する要請が高まっている。
【００２６】
従って、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する活性を有する新規なβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質、及びそれをコードする核酸を提供することを目的とする。また、本発明、該核酸を宿主細胞内で発現する形質転換体、さらに、当該形質転換体を生育させて、当該タンパク質を単離する方法を提供することを目的とする。さらにまた、本発明は、該核酸または該糖転移酵素タンパク質の発現を示標に、生物試料の癌化を検定する方法を提供する。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、目的とする酵素と類似した作用を有する酵素遺伝子の塩基配列を基に、配列同一性が高いと思われる目的とする酵素を単離及び精製を試みた。具体的には、まず、公知の糖転移酵素であるβ３グルクロン酸転移酵素７（β３ＧｎＴ７）の塩基配列をクエリーとしてＢＬＡＳＴ検索を行い、その結果、相同性を有する配列としてＥＳＴ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＢＣ００４９０８）を見出した。さらに、ＰＣＲでタンパク質の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸を決定した。これにより、当該核酸がコードするタンパク質が新規な糖転移酵素であることを見い出した。また、更に癌化した組織において、前記核酸の発現量が健常組織における発現量よりも高まっていることを発見し、これを組織の癌化検出方法に応用することで本発明を完成した。
【００２８】
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミンを転移する活性を有するタンパク質及びこれらをコードする核酸を提供することにより、当該技術分野におけるこれらの多様な必要性を満たすのに貢献する。
【００２９】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１） 下記の性質を有するβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質。
活性： Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する。
基質特異性： （１） ＧａｌＮＡｃ、（２） ＧｌｃＮＡｃ、（３） Ｇａｌ、（４） Ｘｙｌ、（５） Ｆｕｃ、（６） Ｍａｎ、（７） ＭａｎＮＡｃ、（８） Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、及び（９） Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの何れかのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する。
【００３０】
ここで「ＧａｌＮＡｃ」とはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＮＡｃ」とはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を示し、「Ｇａｌ」とはＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」とはＤ−キシロース残基を示し、「Ｆｕｃ」とはＤ−フコース残基を示し、「Ｍａｎ」とはＤ−マンノース残基を示し、「ＭａｎＮＡｃ」とはＮ−アセチル−Ｄ−マンノース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖の炭素番号を示す。「β」は糖環１位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、５位ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ３との位置関係がシスのものを「β」で示す。
【００３１】
金属イオン要求性： 二価金属陽イオンを酵素反応に必要とする。
反応ｐＨ： 中性近辺である。
（２） 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを含むβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。
（３） （２）（Ａ）のポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列からなる、（２）記載の糖転移酵素タンパク質。
（４） （２）（Ａ）のポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸番号１乃至４０２からなるアミノ酸配列からなる、（２）記載の糖転移酵素タンパク質。
（５） 糖転移酵素タンパク質が、配列番号２のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列と少なくとも５０％同一のアミノ酸配列を有する、（２）ないし（４）のいずれか記載の糖転移酵素タンパク質。
（６） （２）乃至（５）何れか記載のタンパク質をコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
（７） 配列番号１記載の塩基番号１６６乃至１２０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、（６）に記載の核酸。
（８） 配列番号１記載の塩基番号１乃至１２０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、（６）に記載の核酸。
（９） ＤＮＡであることを特徴とする（６）乃至（８）何れか記載の核酸。
（１０） （６）乃至（９）何れか記載の核酸、又は当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする測定用核酸。
（１１） 配列番号１記載の塩基番号６８３乃至７７５からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む、（１０）に記載の測定用核酸。
（１２） 測定用核酸が、プローブ、プライマーとして使用される、（１０）又は（１１）記載の測定用核酸。
（１３） 測定用核酸が、癌マーカーとして使用される、（１０）乃至（１２）何れか記載の測定用核酸。
（１４） ＤＮＡであることを特徴とする（１０）乃至（１３）何れか記載の測定用核酸。
（１５） （６）乃至（１４）何れか記載の核酸を含むベクター。
（１６） （１５）記載のベクターを含む形質転換体。
（１７） （１５）記載の形質転換体を生育させ、β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を発現させ、その生育物から前記糖転移酵素を回収する、ことを含む、前記糖転移酵素タンパク質の製造方法。
（１８） （１）乃至（５）何れか記載のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を認識する抗体。
（１９） 生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の（１）ないし（５）の何れか記載のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。
（２０） （１８）記載の抗体を用いてβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量する、（１９）記載の検定方法。
（２１） 生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の（６）記載の核酸を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の（６）記載の核酸の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記核酸の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。
（２２） （ａ−１）生物試料中の（６）記載の核酸に（１０）記載の測定用核酸から選択される一対のプライマーをハイブリダイズさせ；
（ａ−２）（６）記載の核酸を増幅させ；
（ａ−３）前記増幅産物を定量し；そして
（ｂ）前記定量値が、対照の正常な生物試料中の対応する定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、（２１）記載の方法。
（２３） 配列番号１記載の塩基番号６８３−７７５からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸を定量する、（２１）又は（２２）に記載の方法。
（２４） 前記生物試料が、大腸由来の試料である、（２１）乃至（２３）何れか記載の方法。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
（１）本発明タンパク質
本発明タンパク質はＧｌｃＮＡｃ受容体基質に、ＧｌｃＮＡｃ供与体基質からＧｌｃＮＡｃ残基を転移する活性を有する糖転移酵素である。
【００３３】
ここで「ＧｌｃＮＡｃ供与体基質」とは、ＧｌｃＮＡｃを有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては、例えば、アデノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、グアノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、シチジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＣＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）等が例示され、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが最も好ましいが特に限定はされない。
【００３４】
「ＧｌｃＮＡｃ受容体基質」は本発明タンパク質がＧｌｃＮＡｃ供与体基質からＧｌｃＮＡｃを転移することができる化合物である限り特に限定はされないが、（１） ＧａｌＮＡｃ、（２） ＧｌｃＮＡｃ、（３） Ｇａｌ、（４） Ｘｙｌ、（５） Ｆｕｃ、（６） Ｍａｎ、（７） ＭａｎＮＡｃ、（８） Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、及び（９） Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの何れかであることが好ましい。さらに、上記糖残基の糖環１位にα又はβ結合で、これに限定されるわけではないが、Ｂｚ、ｐＮｐ、ｏＮｐの何れかが結合していることがより好ましい。最も好ましいＧｌｃＮＡｃ受容体基質は、ＧａｌＮＡｃα１−Ｂｚ、ＧａｌＮＡｃβ１−ｐＮｐ、ＧｌｃＮＡｃα１−Ｂｚ、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｂｚ、Ｇａｌα１−ｐＮｐ、Ｇａｌβ１−ｏＮｐ、Ｘｙｌβ１−ｐＮｐ、Ｆｕｃα１−ｐＮｐ、Ｍａｎα１−Ｂｚ、ＭａｎＮＡｃα１−Ｂｚ、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｂｚ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１−ｐＮｐの何れかである。ここで、「Ｂｚ」はベンジル基を示し、「ｐＮｐ」はパラニトロフェニル基を示し、「ｏＮｐ」はオルトニトロフェニル基を示す。また、「−」はグリコシド結合を示し、式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示す。「α」及び「β」は糖環１位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、５位ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ３との位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す。
【００３５】
これらの「ＧｌｃＮＡｃ受容体基質」の何れかの化合物へ「ＧｌｃＮＡｃ残基」を転移する活性の確認は、例えば［１４Ｃ］又は［３Ｈ］などの放射性同位元素でＧｌｃＮＡｃ残基を放射能標識した「ＧｌｃＮＡｃ供与体基質」と、上記「ＧｌｃＮＡｃ受容体基質」で例示した各化合物とを混合し、そこに「本発明タンパク質」の存在下で酵素反応させ、「反応生成物」を「ＧｌｃＮＡｃ供与体基質」と分離して「反応生成物の放射能」を測定する方法で行うことができる。このような方法としては具体的には後述の実施例２記載の方法が例示される。
【００３６】
「本発明タンパク質」は酵素反応に「二価金属陽イオン」を必要とする（この性質を「金属イオン要求性」とも記載する）。すなわち、「二価金属陽イオン」をキレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」とも略記する）等）でキレートすると、活性を実質的に失う性質を有する。
【００３７】
「二価金属陽イオン」としては、例えばカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）等が挙げられる。好ましくは、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋が２．５ｍＭから４０ｍＭの濃度で共存する条件下では酵素活性の増強が確認される。Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋が特に好ましい。
【００３８】
「本発明タンパク質の反応ｐＨ」は中性近辺、好ましくは、ｐＨ６．０からｐＨ８．０である。例えば、２０ｍＭのＭｎ２＋共存下で、ｐＨ７．４での酵素活性の方がｐＨ６．６での酵素活性よりも強い（何れもカコジル酸ナトリウム緩衝液中）という特徴を有する。このような酵素活性の強さの比較は、例えば実施例２記載の方法により、放射能標識を用いて容易且つ正確に行うことができる。
【００３９】
このような「本発明タンパク質」は、より具体的には、例えば、以下の（Ａ）乃至（Ａ’’）のポリペプチドを含む。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（Ａ’）配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ａ’’）配列番号２記載のアミノ酸番号１乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド
また、それらに糖鎖が結合した糖ポリペプチドの形態の糖転移酵素も本発明タンパク質の一態様として挙げられる。
【００４０】
なお、一般にアミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入等の変異が存在していても、酵素の活性が維持されることは当業者にとっては理解されうるところであり、上記配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号２記載のアミノ酸番号１乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドの当該アミノ酸配列に於いても１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入等の変異が存在していても「糖転移酵素活性」を有する限りにおいて上記「ポリペプチド」として使用することができる。
【００４１】
すなわち、天然に存在するポリペプチドには、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のポリペプチドの細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、又は挿入等の変異が起こりうるが、それにも拘わらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示す物があることが知られている。このように構造的に若干の相違があってもその機能については大きな違いが認められないものも、上記「ポリペプチド」に包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記の様な変異を導入した場合も同様であり、この場合には更に多種多様の「変異を有するポリペプチド」を作成することが可能である。なお、このような置換、欠失、又は挿入等の変異には、「転位」、核酸中の一部分の別位置への移動、例えば、染色体上の遺伝子移動も含む。
【００４２】
例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリン残基に置換したポリペプチドがＩＬ−２の活性を保持することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２４（１９８４）， ｐ．１４３１）。またある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれに当たり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このような活性に必須でないペプチド領域の配列を有するポリペプチドは、二次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドであり、「本発明タンパク質のポリペプチド」もそのような配列が連結していても良い。このような「変異を有するポリペプチド」は「部位特異的変異法」などの公知の方法により容易に作成することが可能である。
【００４３】
なお、ここで「複数個」とは、ＧｌｃＮＡｃ供与体基質からＧｌｃＮＡｃ受容体基質にＧｌｃＮＡｃ残基を転移する糖転移活性を有する限りに於いて「複数個」とは特に限定はされないが、好ましくは全アミノ酸数の１０％以下、より好ましくは５％以下程度のアミノ酸数を示す。例えば３４７個のアミノ酸からなるポリペプチド（例えば上述の（Ａ’）記載のポリペプチド）に於いては３５個以下、好ましくは１７個以下を示し、また４０２個のアミノ酸からなるポリペプチド（例えば上述の（Ａ’’）記載のポリペプチド）に於いては４０個以下、好ましくは２０個以下を示す。
【００４４】
本発明の糖転移酵素タンパク質は、クローニングされた核酸の塩基配列からの推定に基づいて、配列番号２のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。
【００４５】
本発明タンパク質について、ＢＬＡＳＴによる同一性検索を行うと、最も似ているβ３ＧｎＴ７とは４６％の同一性である。従って、本発明タンパク質は新規な酵素であると考えられる。よって、同一性は、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらになお好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００４６】
本願明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５， ｐ．３３８９−３４０２， １９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、あるいはＰｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ｐ．２４４４−２４４８， １９９８）に記載されているＦＡＳＴＡを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ （ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【００４７】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作成する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
本発明のタンパク質は、例えば、後述する実施例１に従って、本発明の核酸による配列番号１に記載の核酸を適当な宿主細胞、例えば、大腸菌、酵母、昆虫、又は動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入し、発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
【００４９】
本発明によって、このタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、当該配列又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応等の遺伝子工学的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子がコードする新規タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００５０】
なお、本発明タンパク質は、そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、前記酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。より具体的には、後述する実施例２に記載したように、本発明タンパク質における受容体基質の探索から、該タンパク質は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを転移する活性を有するものである。特に、配列相同性より、β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移活性を有すると考えられる。
【００５１】
（２）本発明核酸
本発明はまた、本発明の新規糖転位酵素タンパク質の全長または断片をコードする核酸を提供する。
【００５２】
「本発明核酸」としては、例えば配列番号１記載の塩基番号６８３乃至７７５からなる塩基配列からなる核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸（本発明核酸１）、配列番号１記載の塩基番号１６６乃至１２０６（配列番号２のアミノ酸残基５６−４０２をコードする）からなる塩基配列からなる核酸（本発明核酸２）、配列番号１記載の塩基番号１乃至１２０６（配列番号２のアミノ酸残基１−４０２をコードする）からなる塩基配列からなる核酸（本発明核酸３）又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸が例示される。これらの核酸がコードするアミノ酸配列と縮重により同一のアミノ酸配列をコードする核酸も本発明に含まれる。
【００５３】
上記「本発明核酸１」は、例えば後述の「本発明検出法」への利用に適した核酸である。
上記「本発明核酸２」は、「本発明タンパク質のポリペプチド」のうち、「膜貫通領域（疎水性アミノ酸が１０乃至２０個程度連続した領域）を欠失した態様のポリペプチド」をコードするので、当該核酸を発現させることによって生成されるポリペプチドを「可溶性ポリペプチド」とすることができる。また「本発明核酸３」は、「本発明タンパク質のポリペプチド」の全配列をコードする。特に「本発明核酸２」や「本発明核酸３」等は、タンパク質合成における終始コドンに相当する塩基配列を含むため、「配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」（上記（Ａ’）記載のポリペプチド）や「アミノ酸番号１乃至４０２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」（上記（Ａ’’）記載のポリペプチド）を遺伝子工学的に調製するためにも使用することができる。
【００５４】
「本発明核酸」は、一本鎖及び二本鎖型両方のＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学結合したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。後述の「癌化検出方法」にプローブ等として使用する場合や、ベクターや形質転換体の調製時に安定である点で優れるため、ＤＮＡであることが好ましい。
【００５５】
特に配列番号１記載の塩基配列の全部又は一部を有する核酸は、例えば「本発明核酸」の生体内での発現状況などを検査するための、プライマー、プローブ等として使用することができ、医学研究用の試薬又は診断薬として極めて有用である。このようなプローブとしての核酸はあまりに分子量が大きいと取扱が困難となるため、４０塩基乃至１２０９塩基が例示され、より好ましくは５０塩基乃至５００塩基、最も好ましくは６０塩基乃至３００塩基が例示される。合成オリゴヌクレオチドのプローブ又はプライマーとして利用する場合には、少なくとも１０塩基以上、好ましくは、１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上である。好ましくは５０塩基以下である。
【００５６】
なお、ここで「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｖｏｌ．１、７．４２−７．４５ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
【００５７】
「本発明核酸」は例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知のβ３グルクロン酸転移酵素７（β３ＧｎＴ７）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＡＫ０００７７０）（配列番号１０）をクエリーとして塩基配列の検索を行ない、ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＢＣ００４９０８）の相補配列を得ることができた。この相補配列又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いてｃＤＮＡライブラリーなどから本発明核酸（例えば本発明ＤＮＡ）を調製することができる。上記相補配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）はＮ末端に膜貫通領域を有することが予測されるので、この膜貫通領域を有しないポリペプチドをコードする塩基配列の領域を調製すると、可溶化形態のポリペプチドをコードする「本発明核酸」が得られる。
【００５８】
配列番号２のアミノ酸配列より、アミノ酸番号１乃至５５が膜貫通領域である。よって、当該領域の全部又は一部を欠如したポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする核酸は、「可溶化形態のポリペプチドまたはその核酸」として本発明に含まれる。例えば「配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列」が挙げられ、このようなアミノ酸配列からなる可溶化形態のポリペプチドをコードする核酸としては、「配列番号１記載の塩基番号１６６乃至１２０９からなる塩基配列からなる核酸」が例示される。このような核酸の調製は、例えば配列番号３記載の配列を５’プライマー（配列番号３の塩基番号３２−５６は、配列番号１の塩基番号１６６−１９０に対応する）、配列番号４記載の配列を３’プライマー（配列番号４の塩基番号３１−５５は、配列番号１の塩基番号１２０９−１１８５に対応する）として使用し、例えばヒトゲノムｃＤＮＡライブラリーを鋳型として常法に従って核酸増幅反応を行うことで調製することができる。
【００５９】
ここで、核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０， １３５０−１３５４ （１９８５）］、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）［Ｗｕ Ｄ． Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ４， ５６０−５６９ （１９８９）； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ Ｋ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ８９， １１７−１２２ （１９９０）； Ｂａｒａｎｙ Ｆ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８， １８９−１９３ （１９９１）］及び転写に基づく増幅［Ｋｗｏｈ Ｄ． Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６， １１７３−１１７７ （１９８９）］等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）［Ｗａｌｋｅｒ Ｇ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ３９２−３９６ （１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０， １６９１−１６９６ （１９９２）］、自己保持配列複製（３ＳＲ）［Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ． Ｃ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７， １８７４−１８７８ （１９９０）］およびＱβレプリカーゼシステム［リザイルディら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６， ｐ．１１９７−１２０２ （１９８８）］等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ： ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００６０】
配列番号３及び４のプライマーを使用した場合、ＰＣＲ産物として約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して「本発明核酸」を得ることができる。
【００６１】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらになお好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する。
【００６２】
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ３８７， １９８４に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、並びにＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｐｐ．３５３−３５８， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，１９７９に記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；及び（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【００６３】
（３）本発明のベクター及び形質転換体
本発明によれば、単離した「本発明核酸」を含む組換えベクターが提供される。プラスミド等のベクターに本発明核酸のＤＮＡ断片を組込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １．１ （２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、大腸菌ＤＨ５α、ＴＢ１、ＬＥ３９２、又はＸＬ−ＬＥ３９２又はＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
【００６４】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １６．１ （２００１）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００６５】
ベクターは、簡単には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＤＯＮＲ２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が例示されるが、これらに限定されない。
【００６６】
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明タンパク質を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように本発明発現ベクターは上記の本発明核酸が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモーター領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに本発明核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。また、発現ベクターの構築は、制限処理及び連結作業を必要としない、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を用いることもできる。Ｇａｔｅｗａｙシステムとは、ＰＣＲ産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、ＤＮＡ断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、ＰＣＲ産物とドナーベクターとから部位特異的な組換え酵素であるＢＰクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるＬＢクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにＰＣＲ産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間の係るサブクローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
【００６７】
発現ベクターの種類は、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
【００６８】
上記「本発明発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、形質転換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。本発明の形質転換体をえるための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）等由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬社）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
【００６９】
ところで「本発明核酸」はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、本発明においては真核細胞を本発明の形質転換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した「本発明タンパク質」が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、特にほ乳類細胞を選択することが好ましい。ほ乳類細胞としては、具体的には、マウス由来、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。また、宿主細胞としての大腸菌、酵母又は昆虫細胞は、具体的には、大腸菌（ＤＨ５α、Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（Ｓｆ２１、ＢｍＮ４、カイコ幼虫等）などが例示される。
【００７０】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００７１】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００７２】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
【００７３】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ． ｃｏｌｉではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２若しくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
【００７４】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００７５】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００７６】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００７７】
本発明の発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（Ｅ． ｃｏｌｉ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ６９， ２１１０ （１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １６８， １１１ （１９７９）］やコンピテント法［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５６， ２０９ （１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７５， １９２７ （１９７８）］やリチウム法［Ｊ． Ｂ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １５３， １６３ （１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２７， １２９ （１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ， ３１９， ７９１ （１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２， ４５６ （１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒらの方法［Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ３， ２１５６−２１６５ （１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
【００７８】
（４）本発明タンパク質の単離・精製
近年は遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
【００７９】
本発明タンパク質は、例えば、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
【００８０】
本発明のタンパク質は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
【００８１】
本発明タンパク質を、糖タンパク質、オリゴ糖または多糖等に作用させることにより、Ｎ−アセチルグルコサミンが転移される。従って、本発明タンパク質は、糖タンパク質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、本発明タンパク質を免疫原として動物に投与することにより、該タンパク質に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該タンパク質を測定することが可能になる。従って、本発明タンパク質及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。
【００８２】
本発明発現ベクターはそのような本発明タンパク質の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に「本発明タンパク質」を「酵素活性を有するポリペプチド（例えば上述の（Ａ）、（Ａ’）又は（Ａ’’）記載のポリペプチド）」と「標識ペプチド」との「融合タンパク質」の形態で発現するように構築した「本発明発現ベクター」を用いて遺伝子工学的に「本発明タンパク質」を調製すると単離・精製が容易となるため好ましい。
【００８３】
上記「識別ペプチド」の例としては、「本発明タンパク質」を遺伝子組み換えによって調製する際に、該「識別ペプチド」と「酵素活性を有するポリペプチド」とが結合した「融合タンパク質」として発現させることにより、形質転換体の生育物から「本発明タンパク質」の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドである。このような「識別ペプチド」としては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のＮ末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、Ｄｓｂ等）、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約４２，０００のタンパク質）、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ（ヒスチジン残基を６乃至１０個並べて配した配列）、ｍｙｃタグ（ｃＭｙｃタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、ＦＬＡＧペプチド（８アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、Ｔ７タグ（ｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１アミノ酸残基からなる）、Ｓタグ（膵臓ＲＮａｓｅＡ由来の１５アミノ酸残基からなる）、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ（大腸菌外膜タンパク質ｐｅｌＢの２２アミノ酸配列）、ＨＡタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸残基からなる）、Ｔｒｘタグ（チオレドキシン配列）、ＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＢＤタグ（セルロース結合ドメイン）、ＣＢＲタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β−ｌａｃ／ｂｌｕ（βラクタマーゼ）、β−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、ＨＰ−Ｔｈｉｏ（Ｈｉｓ−ｐａｔｃｈチオレドキシン）、ＨＳＰ（熱ショックペプチド）、Ｌｎγ（ラミニンγペプチド）、Ｆｎ（フィブロネクチン部分ペプチド）、ＧＦＰ（緑色蛍光ペプチド）、ＹＦＰ（黄色蛍光ペプチド）、ＣＦＰ（シアン蛍光ペプチド）、ＢＦＰ（青色蛍光ペプチド）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光ペプチド）、ＭＢＰ（マルトース結合ペプチド）、ＬａｃＺ（ラクトースオペレーター）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、アビジン、プロテインＧ等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧペプチド、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ又はＨＡタグが、遺伝子工学的手法による本発明タンパク質の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にＦＬＡＧペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号６）との融合タンパク質として「本発明タンパク質」を得るのが、取扱面で極めて優れているため好ましい。上記ＦＬＡＧペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本願明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００８４】
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として「本発明タンパク質」を得ることができる基本ベクターとしては例えばｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（シグマ社）、ｐＦＢＩＦ（ｐＦａｓｔＢａｃ（インビトロジェン社）にＦＬＡＧペプチドをコードする領域を組み込んだベクター：後述の実施例参照）等が例示されるが、当業者であれば「本発明タンパク質」の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
【００８５】
なお、本発明によって「本発明核酸の塩基配列」が開示されたため、当業者であれば目的とする「本発明核酸」や調製したい「本発明核酸の一部の領域」の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いてＰＣＲ法などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
【００８６】
（５）本発明測定用核酸
本発明によれば、本発明核酸とハイブリダイズする核酸（以下、「測定用核酸」と称する）が提供される。本発明測定用核酸は、典型的には、本発明タンパク質をコードする核酸の天然由来の又は合成されたフラグメントであり、プライマー又はプローブを含むが、これらに限定されるものではない。なお、本明細書において使用される用語「測定」には、検出、増幅、定量、および半定量のいずれもが包含される。
【００８７】
（ａ）プライマー
本発明測定用核酸を核酸増幅反応用のプライマーとして使用する場合、本発明測定用核酸は、オリゴヌクレオチドであって、
配列番号２に示すタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−５０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−７０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
【００８８】
本発明のプライマーは、本発明核酸の部分領域と相同的な配列を有することが好ましいが、１または２塩基の不一致があっても差し支えない。
なお、本発明のプライマーの塩基数は１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは２１塩基以上であり、５０塩基以下である。
【００８９】
本発明のプライマーは、典型的には、配列番号７（配列番号１の塩基番号６８３−７０１に対応する）及び配列番号８（配列番号１の塩基番号７７５−７５５に対応する）の塩基配列を有し、単独、又はプライマー対として用いることができる。
【００９０】
（ｂ）プローブ
本発明測定用核酸をプローブとして使用する場合、本発明測定用核酸は、配列番号１に記載の塩基配列の全体又は部分領域と相同的な配列を有することが好ましい。本発明の測定用核酸が、ｃＤＮＡプローブの場合、塩基数は、１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上で、最長で、コード領域の全長、即ち、１２０９塩基である。配列番号１に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と５０％以下、好ましくは２０％以下の不一致があっても、プローブとしての機能を果たし得る。また、本発明の測定用核酸が、合成オリゴヌクレオチドの場合、塩基数は１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上である。合成オリゴヌクレオチドの場合、長さによるが、配列番号１に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と１または２塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たしうる。
【００９１】
本発明のプローブは、例えば、配列番号９に記載された塩基配列を有する。これは、配列番号１の塩基番号７０７−７２４の相当し、配列番号７および８をプライマーとして核酸増幅反応を行った場合、その増幅産物にハイブリダイズして検出しうる。
【００９２】
本発明のプローブには、該プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを検出または確認するために、蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブが含まれる。被検核酸またはその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するかを決定することができる。
【００９３】
一般的に、ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、当該技術分野において周知であり、そのための試薬キットおよび装置も市販されているので容易に行うことができる。上記した本発明のプライマー対を用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、定量的ＲＴ−ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
【００９４】
（６）本発明検定方法
本発明者らは、本発明の新規β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質、及び／又は核酸の発現量が、癌組織において正常組織よりも多いことを見出した。よって、本発明の生物試料中において本発明のタンパク質または核酸を定量し、対照の正常な生物試料中の相当する量と比較することにより、生物試料の癌化を検定することが可能である。
【００９５】
具体的には、本発明は、生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法を提供する。
【００９６】
また、本発明の検定方法は、
（ａ）生物試料中の本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の前記核酸の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記核酸の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、ものであってもよい。
【００９７】
上記のように、本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を癌マーカーとして定量する場合には、例えば、該タンパク質を免疫原として作成される抗体を用いることができる。抗体を利用したタンパク質の定量方法としては、当該技術分野における周知な方法、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法を使用することが可能である。また、本発明の糖転移酵素タンパク質の活性を利用することによって、定量することもできる。前記定量値の比は、１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上、さらにより好ましくは１０倍以上、最も好ましくは２０倍以上である。
【００９８】
また、本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸を癌マーカーとして定量する場合には、本発明の検定方法は、
（ａ−１）生物試料中のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸に本発明の測定用核酸から選択される一対のプライマーをハイブリダイズさせ；
（ａ−２）β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸を増幅させ；
（ａ−３）前記増幅産物を定量し；そして
（ｂ）前記定量値が、対照の正常な生物試料中の対応する定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、ものであってもよい。
【００９９】
本発明検定方法への利用できる核酸は、本発明測定用核酸として例示されるが、特に限定されず、例えば、配列番号１記載の塩基番号１乃至１２０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列から選択される、任意の配列を利用可能である。配列番号１記載の塩基番号６８３乃至７７５からなる塩基配列からなる核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸（本発明核酸１）を使用することが好ましい。即ち、本発明検定方法によって生物試料において検出される核酸（特にｍＲＮＡ）は、配列番号１記載の塩基配列番号６８３乃至７７５からなる塩基配列を含む核酸であることが好ましいが、具体的には、配列番号１記載の塩基番号６８３乃至７７５からなる塩基配列からなる核酸、配列番号１記載の塩基番号１６６乃至１２０９からなる塩基配列からなる核酸、及び配列番号１記載の塩基番号１乃至１２０９からなる塩基配列からなる核酸が例示される。
【０１００】
これらの核酸の発現量は、例えば、本発明測定用核酸を使用したＰＣＲ法を用いて定量することができる。ＰＣＲ法では、定量的ＰＣＲ法の使用が好ましく、キネティックス分析のためのＲＴ−ＰＣＲ法、定量的リアルタイムＰＣＲ法が例示される。本発明によれば、核酸の定量には、これらに限定されるものではなく、ノーゼンブロット、ドットブロット、ＤＮＡマイクロアレイを使用することも可能である。一方、同一組織等に広く一般的に存在する遺伝子の核酸、例えばグリセルアルデヒド−３リン酸−脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、β−アクチンをコードする核酸を対照として利用することができる。癌化していると判断されるシグナルの定量比は、１．５以上であり、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは５以上、さらにより好ましくは１０以上、最も好ましくは２０以上である。
【０１０１】
本明細書において、「生物試料」というときは、器官、組織及び細胞を示すが、好ましくは組織であり、具体的には、食道、胃、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、小腸、大腸、直腸、結腸が例示される。好ましくは大腸、直腸、及び結腸であり、より好ましくは大腸である。
【０１０２】
本発明検定方法は、上記の通り、生物試料の癌化を検定するものであり、医療における癌の診断、治療等に応用することができる。本明細書において使用される用語「癌」には、典型的には、悪性腫瘍全般をいい、該悪性腫瘍による疾病状態を含む。本発明検定方法は、限定されるわけではないが、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、及び結腸癌、好ましくは大腸癌、直腸癌、及び結腸癌であり、より好ましくは大腸癌の検定に適している。
【０１０３】
（７）本発明抗体
本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質に免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こうした抗体は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介して、該糖転移酵素タンパク質に特異的に結合する。したがって、上述のような、配列番号２のタンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でも高次構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定してもよい。
【０１０４】
したがって、本発明の１つの側面は、本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、タンパク質の化学的または酵素的切断などの、当該技術分野に公知の技術を用いて、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて、産生することが可能である。
【０１０５】
前記糖転移酵素タンパク質によって誘導される可能性がある抗体に関しては、該タンパク質の全部若しくは一部が単離されていても、またはエピトープが単離されていても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術によって調製することが可能である。例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修）， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８０を参照されたい。
【０１０６】
本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を該糖転移酵素タンパク質で免疫し；免疫された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そして該タンパク質に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。
【０１０７】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術によって調製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供してもよい。
【０１０８】
慣用的技術によって産生可能な、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
【０１０９】
本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏいずれかで、前記糖転移酵素タンパク質または断片の存在を検出するアッセイで用いることが可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
【０１１０】
さらに、結合パートナー、例えば受容体基質への本発明のタンパク質の結合を遮断することが可能な抗体を用いて、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害することが可能である。こうした遮断抗体は、受容体基質を発現している特定の細胞への該タンパク質の結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて、同定してもよい。あるいは、遮断抗体は、標的細胞の結合パートナーに結合している本発明タンパク質から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定することが可能である。
【０１１１】
こうした抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用するか、又はｉｎ ｖｉｖｏで投与して、抗体を生成した実体によって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。したがって、本発明のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質と結合パートナーとの相互作用によって、（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、結合パートナー仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、ほ乳動物にｉｎｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。
【０１１２】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【０１１３】
【実施例】
実施例１ 本発明ＤＮＡ及び本発明タンパク質の調製方法
β３グルクロン酸転移酵素７（β３ＧｎＴ７）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＫ０００７７０）（配列番号１０）をクエリーとして、ＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果、ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＢＣ００４９０８）の相補配列がβ３ＧｎＴ７とホモロジーを有することが判明した。相補配列は配列番号１の通りであった。この塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号２）はＮ末端に膜貫通領域を有することが予測され、この膜貫通領域を有しないタンパク質をコードする塩基配列の領域を調製することとした。調製は、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を利用して、ｐＦａｓｔＢａｃ（インビトロジェン社）の誘導体であるｐＦＢＩＦに遺伝子を組み込み、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社）によるバクミドを作成して行った。
【０１１４】
（１） エントリークローンの調製
ヒトゲノムｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、５’プライマーとして配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号３の塩基番号３２−５６は、配列番号１の塩基番号１６６−１９０に対応する）、３’プライマーとして配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号４の塩基番号３１−５５は、配列番号１の塩基番号１２０９−１１８５に対応する）を使用してＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法は９６℃ １分、５５℃ １分、７２℃ １分を３０サイクル繰り返す条件で行った。そしてＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動を行い、ゲル切り出し法でゲルを切り出して常法により単離した。このようにして単離したＰＣＲ産物をＢＰクロナーゼ反応によってｐＤＯＮＲ２０１（商標）（インビトジェン社製）へ組み込んで「エントリークローン」を作成した。反応は上記ＰＣＲ産物２μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１ １μｌ（１５０ｎｇ）、ＢＰ反応緩衝液２μｌ、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０：以下「ＴＥ」とも略記する）３μｌ、ＢＰクロナーゼｍｉｘ ２μｌを２５℃で１時間インキュベーションして行った。その後、プロテイナーゼＫ（科研製薬株式会社製）を１μｌ加えて３７℃、１０分間インキュベートして反応を終了させた。その反応混合液１１μｌをコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシンを含むＬＢプレートに播いた。翌日コロニーを回収し、ＰＣＲ法で目的ＤＮＡが導入されていること及びその塩基配列を確認し、挿入されたベクター（ｐＤＯＮＲ−Ｇ２６Ａ）を常法に従って抽出、精製した。このベクターに挿入されたＤＮＡの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号１６６乃至１２０９からなる塩基配列を含むことが確認された。
【０１１５】
（２） 発現クローンの調製
上記エントリークローンは、挿入部位の両端にλファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔｔＬを持つもので、ＬＲクロナーゼ（λファージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデスティネーションベクター（ａｔｔＲを有する）とを混合することで、挿入部位がデスティネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。
【０１１６】
１μｌのエントリークローン（ｐＤＯＮＲ−Ｇ２６Ａ）、０．５μｌのデスティネーションベクター（ｐＦＢＩＦ（７５ｎｇ））、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ４．５μｌ、ＬＲクロナーゼミックス（λファージの組換え酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、及びＸｉｓを混合した溶液）２μｌを２５℃で１時間インキュベートし、プロテイナーゼＫ（科研製薬株式会社製）を１μｌ加えて３７℃で１０分間インキュベートして反応を停止させた（この組換反応でｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａが生成された）。ｐＦＢＩＦはｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロジェン社製）にＩｇκシグナル配列（配列番号５）と精製用のＦＬＡＧペプチド（配列番号６）とを常法に従って挿入したものである。さらに、ｐＦＢＩＦにＧａｔｅｗａｙ配列（ａｔｔＲ）を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて変換カセットを挿入した。この変換カセットは、発現ベクターをデスティネーションベクターに改変するためのカセットであり、ａｔｔＲ組換え部位、クロラムフェニコール耐性遺伝子、及び大腸菌ＤＮＡ ｇｙｒａｓｅを阻害するタンパク質をコードするｃｃｄＢ遺伝子を有する。また、Ｉｇκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、ＦＬＡＧタグは精製を容易とするために挿入した。
【０１１７】
ｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａが含まれる反応混液（１１μｌ）とコンピテントセルである大腸菌ＤＨ５α １００μｌとを混合し、ヒートショック法による形質転換の後、アンピシリンをで含むＬＢ培地に組換ＤＨ５αを蒔いて培養した。２４時間培養後、コロニーを回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）によりプラスミド（ｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａ）を抽出精製した。ＰＣＲ法で目的ＤＮＡが挿入されていることを確認した。
【０１１８】
（３） Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社製）によるバクミドの調製
続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社製）を用いて上記ｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａとバクミドとの間で組換を行い、昆虫細胞中で増殖可能なバクミドにＧ２６Ａの配列を挿入した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、バクミドを含む大腸菌（大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ（商標））に目的遺伝子を挿入させたｐＦａｓｔＢａｃ（即ち、ｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａ）を導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生させる組換えタンパク質によって目的とする遺伝子（Ｇ２６Ａ）がバクミドに取り込まれるシステムである。またバクミドにはＬａｃＺ遺伝子が含まれており、古典的なコロニーの色（青（挿入なし）−白（挿入あり））による選択が可能である。
【０１１９】
すなわち、上記精製ベクター（ｐＦＢＩＦ−Ｇ２６Ａ）５０μｌとコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ）５０μｌとを混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、５−ブロモインドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ）、及びイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地に蒔き、２４時間後にバクミドに目的ＤＮＡが挿入された白い独立したコロニーを回収し、更に培養を行った後、常法に従ってバクミドを回収した。
【０１２０】
（４） バクミドの昆虫細胞への導入
回収したバクミドに目的ＤＮＡが挿入されていることを常法に従って確認し、バクミドを昆虫細胞（Ｓｆ２１：インビトロジェン社製）に導入した。すなわち３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１細胞９×１０５個／２ｍｌに抗生物質を含むＳｆ９００ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）を添加し、２７℃で１時間細胞を接着させた。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して、ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液（Ａ溶液（１００μｌのＳｆ−９００ＳＦＭに上記バクミド５μｌを添加した混合物）とＢ溶液（１００μｌのＳｆ−９００ＳＦＭに６μｌのＣｅｌｌ ＦＥＣＴＩＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を添加した混合物）とを丁寧に混合して３０分間程度室温でインキュベートして得た溶液）にＳｆ９００ＩＩ（インビトロジェン社製）８００μｌを添加した培養液を添加して２７℃で５時間インキュベーションした。その後、培地を除去し、抗生物質を含むＳｆ９００ＳＦＭ培地２ｍｌを添加し、２７℃で７２時間インキュベートした。培養後ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収して１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「一次ウイルス液」とした）。
【０１２１】
更にＴ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７個／２０ｍｌＳｆ−９００ＳＦＭ（抗生物質を含む）を添加し、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着した後、一次ウイルス液８００μｌを添加し、２７℃で４８時間培養した。培養後、ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収した。これを１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「二次ウイルス液」とした）。
【０１２２】
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７個／２０ｍｌＳｆ−９００ＳＦＭ（抗生物質を含む）を添加し、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着した後、二次ウイルス液１０００μｌを添加し、２７℃で８４時間培養した。培養後、ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収した。これを１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「三次ウイルス液」とした）。
【０１２３】
さらに、Ｓｆ２１細胞を６×１０５個／ｍｌの濃度で含むＳｆ−９００ＳＦＭ（抗生物質を含む）を１００ｍｌ用スピナーフラスコに１００μｌ添加し、三次ウイルス液１ｍｌを添加し、２７℃で９６時間培養した。培養後、細胞と培養液を回収した。これを１０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、上清を回収した（この上清を「四次ウイルス液」とした）。
【０１２４】
四次ウイルス液１０ｍｌに対し、アジ化ナトリウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムを加えた。終濃度はアジ化ナトリウムを０．０５％、塩化ナトリウムを１５０ｍＭ、塩化カルシウムを２ｍＭとした。抗ＦＬＡＧ抗体ゲル（Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ、シグマ社製）を５０μｌ添加し、４℃で１６時間緩やかに転倒混和した。遠心分離（１，０００×ｇ、３分、４℃）して上清を除去した後、１ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液：ｐＨ７．４）で２回洗浄した。そして洗浄後のアフィニティーゲルを１ｍＭの塩化カルシウムを含むＴＢＳ（ｐＨ７．４）２００μｌに懸濁して、この懸濁液を活性測定用のＧ２６酵素液とした。
【０１２５】
実施例２ 本発明タンパク質の酵素活性
配列番号２記載のアミノ酸配列を基に、他の公知の糖転移酵素と対比した結果、活性部位と考えられるＣ−末端領域の配列の保存性などから、Ｇ２６はβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素類に分類されることが示唆された。そこでＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＧｌｃＮＡｃ供与体基質として用いてＧ２６酵素液の酵素活性の確認を行った。
【０１２６】
ＧｌｃＮＡｃ受容体基質としては、ＧａｌＮＡｃα１−Ｂｚ、ＧａｌＮＡｃβ１−ｐＮｐ、ＧｌｃＮＡｃα１−Ｂｚ、ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｂｚ、Ｇａｌα１−ｐＮｐ、Ｇａｌβ１−ｏＮｐ、Ｘｙｌβ１−ｐＮｐ、Ｆｕｃα１−ｐＮｐ、Ｍａｎα１−Ｂｚ、ＭａｎＮＡｃα１−Ｂｚ、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｂｚ（以上全てシグマ社製）、及びＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃα１−ｐＮｐ（トロントリサーチケミカル社製）の全てを同時に用い、各々最終濃度で１０ｎｍｏｌずつ含むように反応液を調製して活性を確認した。
【０１２７】
反応液は最終濃度５０ｍＭのカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨを６．６、７．０、及び７．４の各実験系を調製した）、最終濃度０．４％のＴｒｉｔｏｎ（商標） ＣＦ−５４（シグマ社製）、最終濃度４８０μＭのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、１７５ｎＣｉのＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＮＡｃ、最終濃度２０ｍＭのＭｇＣｌ２、ＣｏＣｌ２又はＣｕＣｌ２、１０．１μｌのＧ２６酵素液、及び蒸留水を含む全量２０μｌとした。
【０１２８】
反応液を３７℃で１６時間インキュベートし、その後蒸留水２００μｌを添加し、不溶性画分を遠心分離（１００×ｇ、１０分）により除去して上清画分を回収した。Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｇｅ（ウォーターズ社製：予め１ｍｌのメタノールで１回、次いで１ｍｌの蒸留水で２回洗浄して平衡化したもの）に通筒し、上清に含まれるＧｌｃＮＡｃ受容体基質及び反応生成物を吸着させた。１ｍｌの蒸留水でカラムを２回洗浄し、カラムに吸着したＧｌｃＮＡｃ受容体基質と反応生成物を１ｍｌのメタノールで溶出した。溶出液を５ｍｌの液体シンチレーター（アマシャム バイオサイエンス株式会社製）と混和し、シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定した（図１）。
【０１２９】
その結果、Ｇ２６は２０ｍＭのＭｎＣｌ２又はＭｇＣｌ２存在下では何れのｐＨに於いても活性は確認されたが、ｐＨ６．６よりもｐＨ７．４の方が強い活性が観察された。ＥＤＴＡにより二価金属陽イオンをキレートした条件下では酵素活性は観察されなかったことから、Ｇ２６は二価金属陽イオンを酵素反応に必要とすることが明らかとなった。
【０１３０】
実施例３ 大腸癌組織における本発明ＤＮＡ発現量の変化
定量的リアルタイムＰＣＲ法を用いてヒト大腸癌組織と同一患者の健常大腸組織での本発明核酸（ｍＲＮＡ）の発現量を比較した。ヒト大腸癌組織及び健常大腸組織のＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）で抽出し、Ｓｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロゲン社製）を用いたｏｌｉｇｏ（ｄＴ）法によりｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡとした。このＤＮＡを鋳型として用いてプライマー（５’プライマー：配列番号７（配列番号１の塩基番号６８３−７０１に対応する）、３’プライマー：配列番号８（配列番号１の塩基番号７７５−７５５に対応する））及びＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ（配列番号９）（配列番号１の塩基番号７０７−７２４に対応する）を用いてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（アプライドバイオシステムス社製）により定量的リアルタイムＰＣＲ法を行なった。ＰＣＲ反応の条件は、５０℃で２分、９５℃で１０分で反応させた後、９５℃で１５秒、６０℃１分を５０回繰り返して行った（表２）。
【０１３１】
【表２】
その結果、癌化した組織における本発明ＤＮＡの発現量は、健常組織と比較して平均して７倍以上に増加していることが明らかとなった。また、試料番号１−１０のうちの８つ、即ち、被験者の８０％以上が、２倍以上の発現量を示した。
【０１３３】
【配列表】
【発明の効果】
本発明により新規な糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに組織の癌化の新規な検定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明タンパク質の活性への反応ｐＨ、各種二価金属イオン、及びＥＤＴＡの影響を示す図である。黒塗りの三角はマンガンイオン、黒塗りの丸はコバルトイオン、黒塗りの正方形はマグネシウムイオンを各々示し、白抜きの三角はＥＤＴＡ、白抜きの丸と菱形は陰性対照を各々示す。縦軸は放射能の量（ｄｐｍ）を示し、横軸は反応ｐＨを示す。
Claims (24)
- 下記の性質を有するβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質。
活性： Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する。
基質特異性： （１） ＧａｌＮＡｃ、（２） ＧｌｃＮＡｃ、（３） Ｇａｌ、（４） Ｘｙｌ、（５） Ｆｕｃ、（６） Ｍａｎ、（７） ＭａｎＮＡｃ、（８） Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、及び（９） Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの何れかのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する。
ここで「ＧａｌＮＡｃ」とはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＮＡｃ」とはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を示し、「Ｇａｌ」とはＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｘｙｌ」とはＤ−キシロース残基を示し、「Ｆｕｃ」とはＤ−フコース残基を示し、「Ｍａｎ」とはＤ−マンノース残基を示し、「ＭａｎＮＡｃ」とはＮ−アセチル−Ｄ−マンノース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示す。「β」は糖環１位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、５位ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ３との位置関係がシスのものを「β」で示す。
金属イオン要求性： 二価金属陽イオンを酵素反応に必要とする。
反応ｐＨ： 中性近辺である。 - 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを含むβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン受容体基質に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン供与体基質からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。 - 前記（Ａ）のポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列からなる、請求項２記載の糖転移酵素タンパク質。
- 前記（Ａ）のポリペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸番号１乃至４０２からなるアミノ酸配列からなる、請求項２記載の糖転移酵素タンパク質。
- 前記糖転移酵素タンパク質が、配列番号２のアミノ酸番号５６乃至４０２からなるアミノ酸配列と少なくとも５０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２ないし４のいずれか一項記載の糖転移酵素タンパク質。
- 請求項２乃至５何れか一項記載のタンパク質をコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
- 配列番号１記載の塩基番号１６６乃至１２０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、請求項６に記載の核酸。
- 配列番号１記載の塩基番号１乃至１２０６からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、請求項６に記載の核酸。
- ＤＮＡであることを特徴とする請求項６乃至８何れか一項記載の核酸。
- 請求項６乃至９何れか一項記載の核酸、又は当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする測定用核酸。
- 配列番号１記載の塩基番号６８３乃至７７５からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む、請求項１０に記載の測定用核酸。
- 前記測定用核酸が、プローブ、プライマーとして使用される、請求項１０又は１１記載の測定用核酸。
- 前記測定用核酸が、癌マーカーとして使用される、請求項１０乃至１２何れか一項記載の測定用核酸。
- ＤＮＡであることを特徴とする請求項１０乃至１３何れか一項記載の測定用核酸。
- 請求項６乃至１４何れか一項記載の核酸を含むベクター。
- 請求項１５記載のベクターを含む形質転換体。
- 請求項１５記載の形質転換体を生育させ、β１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を発現させ、その生育物から前記糖転移酵素を回収する、ことを含む、前記糖転移酵素タンパク質の製造方法。
- 請求項１乃至５何れか一項記載のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を認識する抗体。
- 生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の請求項１ないし５の何れか一項記載のβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。 - 請求項１８記載の抗体を用いてβ１，３−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量する、請求項１９記載の検定方法。
- 生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の請求項６記載の核酸を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の請求項６記載の核酸の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記核酸の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。 - （ａ−１）生物試料中の請求項６記載の核酸に請求項１０記載の測定用核酸から選択される一対のプライマーをハイブリダイズさせ；
（ａ−２）請求項６記載の核酸を増幅させ；
（ａ−３）前記増幅産物を定量し；そして
（ｂ）前記定量値が、対照の正常な生物試料中の対応する定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、請求項２１記載の方法。 - 配列番号１記載の塩基番号６８３−７７５からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸を定量する、請求項２１又は２２に記載の方法。
- 前記生物試料が、大腸由来の試料である、請求項２１乃至２３何れか１項記載の方法。
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