JP2004147542A - 糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を用いた癌組織の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の新規な糖転移酵素は、1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素であって、ヒト由来の特定なアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つN−アセチル−D−グルコサミン受容体基質に、N−アセチル−D−グルコサミン供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド、を含むことを特徴とする。
【選択図】 なし
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な「糖転移酵素」及びそれをコードする「核酸」に関連し、また癌化した組織における前記核酸の発現量が増加することに基づく「組織の癌化検出方法」に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、生体内での糖鎖や複合糖質の働きが注目されている。例えば、血液型を決定する因子は糖タンパク質であり、また神経系の働きに関与しているのは糖脂質である。従って、糖鎖を合成する働きのある酵素は、様々な糖鎖がもたらす生理活性を解析する上で極めて重要な手がかりとなる。
【0003】
糖の中でN−アセチル−D−グルコサミン残基(GlcNAc)はグリコサミノグリカンの構成成分であると共に、スフィンゴ糖脂質、ムチン型糖鎖と様々な糖鎖構造に存在する糖残基である。従って、GlcNAcを転移する酵素は、生体内の様々な組織で働く糖鎖の働きを解析する上で極めて重要なツールとなる。
【0004】
これまで、GlcNAcを転移する活性を有するN−アセチルグルコサミン酵素は、少なくとも19種類知られており(表1)、各々、受容体基質特異性が異なる。
【0005】
【表1】
【0006】
【非特許文献1】J. Biol. Chem., 250(9): 3303−9 (1975)
【0007】
【非特許文献2】Can. J. Biochem. Cell Biol., 61(9): 1049−1066 (1983)
【0008】
【非特許文献3】J. Biol. Chem., 257(17): 10235−10242 (1982)
【0009】
【非特許文献4】J. Biol. Chem., 258(10): 6162−73 (1983)
【0010】
【非特許文献5】J. Biol. Chem., 257(22): 13421−7 (1982)
【0011】
【非特許文献6】J. Biol. Chem., 275(42): 32598−602 (2000)
【0012】
【非特許文献7】Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96(2): 406−11 (1999)
【0013】
【非特許文献8】Cell, 105(7): 957−69 (2001)
【0014】
【非特許文献9】J. Biol. Chem., 276(5): 3498−507 (2001)
【0015】
【非特許文献10】J. Biol. Chem., 276(25): 22032−40 (2001)
【0016】
【非特許文献11】J. Biol. Chem., 277(15): 12802−9 (2002)
【0017】
【非特許文献12】Biochem. Biophys. Res. Commun., 294(4): 843−8 (2002)
【0018】
【非特許文献13】Nature, 406(6794): 411−5 (2000)
【0019】
【非特許文献14】J. Biol. Chem., 259(21): 13385−90 (1984)
【0020】
【非特許文献15】J. Biol. Chem., 255(23): 11253−61 (1980)
【0021】
【非特許文献16】J. Biol. Chem., 274(5): 3215−21 (1999)
【0022】
【非特許文献17】J. Biol. Chem., 275(15): 11106−13 (2000)
【0023】
【非特許文献18】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(16): 8991−6 (1999)
【0024】
【非特許文献19】J. Biol. Chem.,265(5): 2563−2568 (1990)
【0025】
【発明が解決しようとする課題】
生体内での糖鎖の働きが注目されているが、生体内での糖鎖合成の解析は十分に進んでいるとは言えない。糖鎖合成のメカニズム、生体内での糖合成の局在が充分に解析されていないことも一因である。糖鎖合成のメカニズムを解析するに当たっては、糖鎖合成酵素、特に糖転移酵素を解析し、その酵素を使ってどの様な糖鎖が生成されるのかを分析する必要である。そのために新たな糖転移酵素を見つけだし、その機能を解析することに対する要請が高まっている。
【0026】
従って、本発明は、N−アセチル−D−グルコサミン受容体基質にN−アセチル−D−グルコサミン残基を転移する活性を有する新規なβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質、及びそれをコードする核酸を提供することを目的とする。また、本発明、該核酸を宿主細胞内で発現する形質転換体、さらに、当該形質転換体を生育させて、当該タンパク質を単離する方法を提供することを目的とする。さらにまた、本発明は、該核酸または該糖転移酵素タンパク質の発現を示標に、生物試料の癌化を検定する方法を提供する。
【0027】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、目的とする酵素と類似した作用を有する酵素遺伝子の塩基配列を基に、配列同一性が高いと思われる目的とする酵素を単離及び精製を試みた。具体的には、まず、公知の糖転移酵素であるβ3グルクロン酸転移酵素7(β3GnT7)の塩基配列をクエリーとしてBLAST検索を行い、その結果、相同性を有する配列としてEST配列(GenBank Accession No. BC004908)を見出した。さらに、PCRでタンパク質の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸を決定した。これにより、当該核酸がコードするタンパク質が新規な糖転移酵素であることを見い出した。また、更に癌化した組織において、前記核酸の発現量が健常組織における発現量よりも高まっていることを発見し、これを組織の癌化検出方法に応用することで本発明を完成した。
【0028】
本発明は、N−アセチルグルコサミンを転移する活性を有するタンパク質及びこれらをコードする核酸を提供することにより、当該技術分野におけるこれらの多様な必要性を満たすのに貢献する。
【0029】
すなわち本発明は以下の通りである。
(1) 下記の性質を有するβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質。
活性: N−アセチル−D−グルコサミン供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミン受容体基質にN−アセチル−D−グルコサミン残基を転移する。
基質特異性: (1) GalNAc、(2) GlcNAc、(3) Gal、(4) Xyl、(5) Fuc、(6) Man、(7) ManNAc、(8) Galβ1−4Glc、及び(9) Galβ1−4GlcNAcの何れかのN−アセチル−D−グルコサミン受容体基質に、N−アセチル−D−グルコサミン供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミン残基を転移する。
【0030】
ここで「GalNAc」とはN−アセチル−D−ガラクトサミン残基を示し、「GlcNAc」とはN−アセチル−D−グルコサミン残基を示し、「Gal」とはD−ガラクトース残基を示し、「Xyl」とはD−キシロース残基を示し、「Fuc」とはD−フコース残基を示し、「Man」とはD−マンノース残基を示し、「ManNAc」とはN−アセチル−D−マンノース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖の炭素番号を示す。「β」は糖環1位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、5位CH2OH又はCH3との位置関係がシスのものを「β」で示す。
【0031】
金属イオン要求性: 二価金属陽イオンを酵素反応に必要とする。
反応pH: 中性近辺である。
(2) 以下の(A)又は(B)のポリペプチドを含むβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質。
(A)配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(B)配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つN−アセチル−D−グルコサミン受容体基質に、N−アセチル−D−グルコサミン供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。
(3) (2)(A)のポリペプチドが、配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列からなる、(2)記載の糖転移酵素タンパク質。
(4) (2)(A)のポリペプチドが、配列番号2記載のアミノ酸番号1乃至402からなるアミノ酸配列からなる、(2)記載の糖転移酵素タンパク質。
(5) 糖転移酵素タンパク質が、配列番号2のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列と少なくとも50%同一のアミノ酸配列を有する、(2)ないし(4)のいずれか記載の糖転移酵素タンパク質。
(6) (2)乃至(5)何れか記載のタンパク質をコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
(7) 配列番号1記載の塩基番号166乃至1206からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、(6)に記載の核酸。
(8) 配列番号1記載の塩基番号1乃至1206からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、(6)に記載の核酸。
(9) DNAであることを特徴とする(6)乃至(8)何れか記載の核酸。
(10) (6)乃至(9)何れか記載の核酸、又は当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする測定用核酸。
(11) 配列番号1記載の塩基番号683乃至775からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む、(10)に記載の測定用核酸。
(12) 測定用核酸が、プローブ、プライマーとして使用される、(10)又は(11)記載の測定用核酸。
(13) 測定用核酸が、癌マーカーとして使用される、(10)乃至(12)何れか記載の測定用核酸。
(14) DNAであることを特徴とする(10)乃至(13)何れか記載の測定用核酸。
(15) (6)乃至(14)何れか記載の核酸を含むベクター。
(16) (15)記載のベクターを含む形質転換体。
(17) (15)記載の形質転換体を生育させ、β1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を発現させ、その生育物から前記糖転移酵素を回収する、ことを含む、前記糖転移酵素タンパク質の製造方法。
(18) (1)乃至(5)何れか記載のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を認識する抗体。
(19) 生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a)生物試料中の(1)ないし(5)の何れか記載のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量し;そして
(b)生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の1.5倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。
(20) (18)記載の抗体を用いてβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量する、(19)記載の検定方法。
(21) 生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a)生物試料中の(6)記載の核酸を定量し;そして
(b)生物試料中の(6)記載の核酸の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記核酸の定量値の1.5倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。
(22) (a−1)生物試料中の(6)記載の核酸に(10)記載の測定用核酸から選択される一対のプライマーをハイブリダイズさせ;
(a−2)(6)記載の核酸を増幅させ;
(a−3)前記増幅産物を定量し;そして
(b)前記定量値が、対照の正常な生物試料中の対応する定量値の1.5倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、(21)記載の方法。
(23) 配列番号1記載の塩基番号683−775からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸を定量する、(21)又は(22)に記載の方法。
(24) 前記生物試料が、大腸由来の試料である、(21)乃至(23)何れか記載の方法。
【0032】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
(1)本発明タンパク質
本発明タンパク質はGlcNAc受容体基質に、GlcNAc供与体基質からGlcNAc残基を転移する活性を有する糖転移酵素である。
【0033】
ここで「GlcNAc供与体基質」とは、GlcNAcを有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては、例えば、アデノシン二リン酸−N−アセチルグルコサミン(ADP−GlcNAc)、ウリジン二リン酸−N−アセチルグルコサミン(UDP−GlcNAc)、グアノシン二リン酸−N−アセチルグルコサミン(GDP−GlcNAc)、シチジン二リン酸−N−アセチルグルコサミン(CDP−GlcNAc)等が例示され、UDP−GlcNAcが最も好ましいが特に限定はされない。
【0034】
「GlcNAc受容体基質」は本発明タンパク質がGlcNAc供与体基質からGlcNAcを転移することができる化合物である限り特に限定はされないが、(1) GalNAc、(2) GlcNAc、(3) Gal、(4) Xyl、(5) Fuc、(6) Man、(7) ManNAc、(8) Galβ1−4Glc、及び(9) Galβ1−4GlcNAcの何れかであることが好ましい。さらに、上記糖残基の糖環1位にα又はβ結合で、これに限定されるわけではないが、Bz、pNp、oNpの何れかが結合していることがより好ましい。最も好ましいGlcNAc受容体基質は、GalNAcα1−Bz、GalNAcβ1−pNp、GlcNAcα1−Bz、GlcNAcβ1−Bz、Galα1−pNp、Galβ1−oNp、Xylβ1−pNp、Fucα1−pNp、Manα1−Bz、ManNAcα1−Bz、Galβ1−4Glcβ1−Bz、Galβ1−4GlcNAcα1−pNpの何れかである。ここで、「Bz」はベンジル基を示し、「pNp」はパラニトロフェニル基を示し、「oNp」はオルトニトロフェニル基を示す。また、「−」はグリコシド結合を示し、式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示す。「α」及び「β」は糖環1位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、5位CH2OH又はCH3との位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す。
【0035】
これらの「GlcNAc受容体基質」の何れかの化合物へ「GlcNAc残基」を転移する活性の確認は、例えば[14C]又は[3H]などの放射性同位元素でGlcNAc残基を放射能標識した「GlcNAc供与体基質」と、上記「GlcNAc受容体基質」で例示した各化合物とを混合し、そこに「本発明タンパク質」の存在下で酵素反応させ、「反応生成物」を「GlcNAc供与体基質」と分離して「反応生成物の放射能」を測定する方法で行うことができる。このような方法としては具体的には後述の実施例2記載の方法が例示される。
【0036】
「本発明タンパク質」は酵素反応に「二価金属陽イオン」を必要とする(この性質を「金属イオン要求性」とも記載する)。すなわち、「二価金属陽イオン」をキレート剤(例えばエチレンジアミン四酢酸(以下「EDTA」とも略記する)等)でキレートすると、活性を実質的に失う性質を有する。
【0037】
「二価金属陽イオン」としては、例えばカルシウムイオン(Ca2+)、コバルトイオン(Co2+)、マンガンイオン(Mn2+)、マグネシウムイオン(Mg2+)等が挙げられる。好ましくは、Mn2+、Mg2+が2.5mMから40mMの濃度で共存する条件下では酵素活性の増強が確認される。Mn2+、Mg2+が特に好ましい。
【0038】
「本発明タンパク質の反応pH」は中性近辺、好ましくは、pH6.0からpH8.0である。例えば、20mMのMn2+共存下で、pH7.4での酵素活性の方がpH6.6での酵素活性よりも強い(何れもカコジル酸ナトリウム緩衝液中)という特徴を有する。このような酵素活性の強さの比較は、例えば実施例2記載の方法により、放射能標識を用いて容易且つ正確に行うことができる。
【0039】
このような「本発明タンパク質」は、より具体的には、例えば、以下の(A)乃至(A’’)のポリペプチドを含む。
(A)配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド
(A’)配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(A’’)配列番号2記載のアミノ酸番号1乃至402からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド
また、それらに糖鎖が結合した糖ポリペプチドの形態の糖転移酵素も本発明タンパク質の一態様として挙げられる。
【0040】
なお、一般にアミノ酸配列に1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入等の変異が存在していても、酵素の活性が維持されることは当業者にとっては理解されうるところであり、上記配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号2記載のアミノ酸番号1乃至402からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドの当該アミノ酸配列に於いても1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入等の変異が存在していても「糖転移酵素活性」を有する限りにおいて上記「ポリペプチド」として使用することができる。
【0041】
すなわち、天然に存在するポリペプチドには、それをコードするDNAの多型や変異の他、生成後のポリペプチドの細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、又は挿入等の変異が起こりうるが、それにも拘わらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示す物があることが知られている。このように構造的に若干の相違があってもその機能については大きな違いが認められないものも、上記「ポリペプチド」に包含される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記の様な変異を導入した場合も同様であり、この場合には更に多種多様の「変異を有するポリペプチド」を作成することが可能である。なお、このような置換、欠失、又は挿入等の変異には、「転位」、核酸中の一部分の別位置への移動、例えば、染色体上の遺伝子移動も含む。
【0042】
例えば、ヒトインターロイキン2(IL−2)のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリン残基に置換したポリペプチドがIL−2の活性を保持することが知られている(Science, 224(1984), p.1431)。またある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれに当たり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このような活性に必須でないペプチド領域の配列を有するポリペプチドは、二次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドであり、「本発明タンパク質のポリペプチド」もそのような配列が連結していても良い。このような「変異を有するポリペプチド」は「部位特異的変異法」などの公知の方法により容易に作成することが可能である。
【0043】
なお、ここで「複数個」とは、GlcNAc供与体基質からGlcNAc受容体基質にGlcNAc残基を転移する糖転移活性を有する限りに於いて「複数個」とは特に限定はされないが、好ましくは全アミノ酸数の10%以下、より好ましくは5%以下程度のアミノ酸数を示す。例えば347個のアミノ酸からなるポリペプチド(例えば上述の(A’)記載のポリペプチド)に於いては35個以下、好ましくは17個以下を示し、また402個のアミノ酸からなるポリペプチド(例えば上述の(A’’)記載のポリペプチド)に於いては40個以下、好ましくは20個以下を示す。
【0044】
本発明の糖転移酵素タンパク質は、クローニングされた核酸の塩基配列からの推定に基づいて、配列番号2のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。
【0045】
本発明タンパク質について、BLASTによる同一性検索を行うと、最も似ているβ3GnT7とは46%の同一性である。従って、本発明タンパク質は新規な酵素であると考えられる。よって、同一性は、少なくとも50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらになお好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上である。
【0046】
本願明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Altschulら(Nuc. Acids Res., 25, p.3389−3402, 1997)に記載されているBLASTプログラム、あるいはPearsonら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, p.2444−2448, 1998)に記載されているFASTAを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information (NCBI)、あるいはDNA Data Bank of Japan (DDBJ)のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件(パラメーター)は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【0047】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換(例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換)を導入した場合、得られる変異タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作成する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【0048】
本発明のタンパク質は、例えば、後述する実施例1に従って、本発明の核酸による配列番号1に記載の核酸を適当な宿主細胞、例えば、大腸菌、酵母、昆虫、又は動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入し、発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
【0049】
本発明によって、このタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列が開示されれば、当該配列又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、PCR等の核酸増幅反応等の遺伝子工学的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子がコードする新規タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【0050】
なお、本発明タンパク質は、そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、前記酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。より具体的には、後述する実施例2に記載したように、本発明タンパク質における受容体基質の探索から、該タンパク質は、N−アセチル−D−グルコサミンにN−アセチル−D−グルコサミンを転移する活性を有するものである。特に、配列相同性より、β1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移活性を有すると考えられる。
【0051】
(2)本発明核酸
本発明はまた、本発明の新規糖転位酵素タンパク質の全長または断片をコードする核酸を提供する。
【0052】
「本発明核酸」としては、例えば配列番号1記載の塩基番号683乃至775からなる塩基配列からなる核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸(本発明核酸1)、配列番号1記載の塩基番号166乃至1206(配列番号2のアミノ酸残基56−402をコードする)からなる塩基配列からなる核酸(本発明核酸2)、配列番号1記載の塩基番号1乃至1206(配列番号2のアミノ酸残基1−402をコードする)からなる塩基配列からなる核酸(本発明核酸3)又はそれらに相補的な塩基配列からなる核酸が例示される。これらの核酸がコードするアミノ酸配列と縮重により同一のアミノ酸配列をコードする核酸も本発明に含まれる。
【0053】
上記「本発明核酸1」は、例えば後述の「本発明検出法」への利用に適した核酸である。
上記「本発明核酸2」は、「本発明タンパク質のポリペプチド」のうち、「膜貫通領域(疎水性アミノ酸が10乃至20個程度連続した領域)を欠失した態様のポリペプチド」をコードするので、当該核酸を発現させることによって生成されるポリペプチドを「可溶性ポリペプチド」とすることができる。また「本発明核酸3」は、「本発明タンパク質のポリペプチド」の全配列をコードする。特に「本発明核酸2」や「本発明核酸3」等は、タンパク質合成における終始コドンに相当する塩基配列を含むため、「配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」(上記(A’)記載のポリペプチド)や「アミノ酸番号1乃至402からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド」(上記(A’’)記載のポリペプチド)を遺伝子工学的に調製するためにも使用することができる。
【0054】
「本発明核酸」は、一本鎖及び二本鎖型両方のDNA、及びそのRNA相補体も含む。DNAには、例えば、天然由来のDNA、組換えDNA、化学結合したDNA、PCRによって増幅されたDNA、及びそれらの組み合わせが含まれる。後述の「癌化検出方法」にプローブ等として使用する場合や、ベクターや形質転換体の調製時に安定である点で優れるため、DNAであることが好ましい。
【0055】
特に配列番号1記載の塩基配列の全部又は一部を有する核酸は、例えば「本発明核酸」の生体内での発現状況などを検査するための、プライマー、プローブ等として使用することができ、医学研究用の試薬又は診断薬として極めて有用である。このようなプローブとしての核酸はあまりに分子量が大きいと取扱が困難となるため、40塩基乃至1209塩基が例示され、より好ましくは50塩基乃至500塩基、最も好ましくは60塩基乃至300塩基が例示される。合成オリゴヌクレオチドのプローブ又はプライマーとして利用する場合には、少なくとも10塩基以上、好ましくは、15塩基以上、より好ましくは20塩基以上である。好ましくは50塩基以下である。
【0056】
なお、ここで「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、DNAの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Vol.1、7.42−7.45 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、5×SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH8.0)の前洗浄溶液、約40−50℃での、約50%ホルムアミド、2×SSC−6×SSC(又は約42℃での約50%ホルムアミド中の、スターク溶液(Stark’s solution)などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液)のハイブリダイゼーション条件、および約60℃、0.5×SSC、0.1% SDSの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばDNAの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び/又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び/又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ68℃、0.2×SSC、0.1% SDSの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
【0057】
「本発明核酸」は例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知のβ3グルクロン酸転移酵素7(β3GnT7)の塩基配列(GenBank AccessionNo.AK000770)(配列番号10)をクエリーとして塩基配列の検索を行ない、EST(GenBank Accession No. BC004908)の相補配列を得ることができた。この相補配列又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いてcDNAライブラリーなどから本発明核酸(例えば本発明DNA)を調製することができる。上記相補配列がコードするアミノ酸配列(配列番号2)はN末端に膜貫通領域を有することが予測されるので、この膜貫通領域を有しないポリペプチドをコードする塩基配列の領域を調製すると、可溶化形態のポリペプチドをコードする「本発明核酸」が得られる。
【0058】
配列番号2のアミノ酸配列より、アミノ酸番号1乃至55が膜貫通領域である。よって、当該領域の全部又は一部を欠如したポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする核酸は、「可溶化形態のポリペプチドまたはその核酸」として本発明に含まれる。例えば「配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列」が挙げられ、このようなアミノ酸配列からなる可溶化形態のポリペプチドをコードする核酸としては、「配列番号1記載の塩基番号166乃至1209からなる塩基配列からなる核酸」が例示される。このような核酸の調製は、例えば配列番号3記載の配列を5’プライマー(配列番号3の塩基番号32−56は、配列番号1の塩基番号166−190に対応する)、配列番号4記載の配列を3’プライマー(配列番号4の塩基番号31−55は、配列番号1の塩基番号1209−1185に対応する)として使用し、例えばヒトゲノムcDNAライブラリーを鋳型として常法に従って核酸増幅反応を行うことで調製することができる。
【0059】
ここで、核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)[Saiki R.K., et al., Science, 230, 1350−1354 (1985)]、ライゲース連鎖反応(LCR)[Wu D. Y., et al., Genomics, 4, 560−569 (1989); Barringer K. J., et al., Gene, 89, 117−122 (1990); Barany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 189−193 (1991)]及び転写に基づく増幅[Kwoh D. Y., et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 86, 1173−1177 (1989)]等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応(SDA)[Walker G. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392−396 (1992); Walker G. T., et al., Nuc. Acids Res., 20, 1691−1696 (1992)]、自己保持配列複製(3SR)[Guatelli J. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1874−1878 (1990)]およびQβレプリカーゼシステム[リザイルディら、BioTechnology 6, p.1197−1202 (1988)]等の恒温反応を含む。また、欧州特許第0525882号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅(Nucleic Acid Sequence Based Amplification: NASABA)反応等も利用可能である。好ましくはPCR法である。
【0060】
配列番号3及び4のプライマーを使用した場合、PCR産物として約1.1kbpのDNA断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりDNA断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して「本発明核酸」を得ることができる。
【0061】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号1に記載の塩基配列に対して少なくとも50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらになお好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の同一性を有する。
【0062】
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、2つの核酸配列の同一性パーセントは、Devereuxら,Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ(UWGCG)より入手可能なGAPコンピュータープログラム、バージョン6.0を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには:(1)ヌクレオチドに関する単一(unary)比較マトリックス(同一に対し1および非同一に対し0の値を含む)、並びにSchwartz及びDayhoff監修,Atlas of Protein Sequence and Structure, pp.353−358, National Biomedical Research Foundation,1979に記載されるような、Gribskov及びBurgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745,1986の加重比較マトリックス;(2)各ギャップに対する3.0のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに0.10のペナルティ;及び(3)末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【0063】
(3)本発明のベクター及び形質転換体
本発明によれば、単離した「本発明核酸」を含む組換えベクターが提供される。プラスミド等のベクターに本発明核酸のDNA断片を組込む方法としては、例えば、Sambrook, J.ら,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.1 (2001)に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット(例えば、宝酒造製等)を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター(例えば、組換えプラスミド)は、宿主細胞(例えば、大腸菌DH5α、TB1、LE392、又はXL−LE392又はXL−1Blue等)に導入される。
【0064】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Sambrook, J.ら,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 16.1 (2001)に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【0065】
ベクターは、簡単には当業界において入手可能な組換え用ベクター(例えば、プラスミドDNA等)に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、pDONR201、pBluescript、pUC18、pUC19、pBR322等が例示されるが、これらに限定されない。
【0066】
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明タンパク質を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように本発明発現ベクターは上記の本発明核酸が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域(プロモーター領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等)が適切に配列されており、さらに本発明核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。また、発現ベクターの構築は、制限処理及び連結作業を必要としない、Gatewayシステム(インビトロジェン社)を用いることもできる。Gatewayシステムとは、PCR産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、DNA断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、PCR産物とドナーベクターとから部位特異的な組換え酵素であるBPクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるLBクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにPCR産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間の係るサブクローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
【0067】
発現ベクターの種類は、原核細胞及び/又は真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、pQE−30、pQE−60、pMAL−C2、pMAL−p2、pSE420などが好ましく、酵母用発現べクターとしてpYES2(サッカロマイセス属)、pPIC3.5K、pPIC9K、pAO815(以上ピキア属)、昆虫用発現ベクターとしてpFastBac、pBacPAK8/9、pBK283、pVL1392、pBlueBac4.5などが好ましい。
【0068】
上記「本発明発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、形質転換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞(ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等)であっても原核細胞(大腸菌、枯草菌等)であっても使用することができる。本発明の形質転換体をえるための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト(例えば、HeLa、293T、SH−SY5Y)、マウス(例えば、Neuro2a、NIH3T3)等由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか(例えば、大日本製薬社)、あるいは公共の研究機関(例えば、理研セルバンク)より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
【0069】
ところで「本発明核酸」はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、本発明においては真核細胞を本発明の形質転換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した「本発明タンパク質」が得られる(例えば糖鎖が付加された態様など)と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、特にほ乳類細胞を選択することが好ましい。ほ乳類細胞としては、具体的には、マウス由来、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。また、宿主細胞としての大腸菌、酵母又は昆虫細胞は、具体的には、大腸菌(DH5α、M15、JM109、BL21等)、酵母(INVSc1(サッカロマイセス属)、GS115、KM71(以上ピキア属)など)、昆虫細胞(Sf21、BmN4、カイコ幼虫等)などが例示される。
【0070】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター/オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【0071】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするDNA、エンハンサー配列、所望の遺伝子の5’側および3’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【0072】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン(ATG)が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン(例えば、TAG、TGA、TAAなど)が例示される。
【0073】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全DNA配列を複製することができる能力をもつDNAを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド(天然のプラスミドから調製されたプラスミド)および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E. coliではブラスミドpQE30、pET又はpCAL若しくはそれらの人工的修飾物(pQE30、pET又はpCALを適当な制限酵素で処理して得られるDNAフラグメント)が、酵母ではプラスミドpYES2若しくはpPIC9Kが、また昆虫細胞ではプラスミドpBacPAK8/9等があげられる。
【0074】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれSV40に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【0075】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【0076】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4 DNAリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なDNAフラグメント(例えば、リンカー、他の制限酵素部位など)を用いることができる。
【0077】
本発明の発現べクターの宿主細胞への導入[形質転換(形質移入)]は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌(E. coli, Bacillus subtilis等)の場合は、例えばCohenらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法[Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)]やコンピテント法[J. Mol. Biol., 56, 209 (1971)]によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1927 (1978)]やリチウム法[J. B. Bacteriol., 153, 163 (1983)]によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法[Science, 227, 129 (1985)]、エレクトロポレ−ション法[Nature, 319, 791 (1986)]によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法[Virology,52, 456 (1973)]、昆虫細胞の場合は、例えばSummerらの方法[Mol. Cell Biol., 3, 2156−2165 (1983)]によってそれぞれ形質転換することができる。
【0078】
(4)本発明タンパク質の単離・精製
近年は遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
【0079】
本発明タンパク質は、例えば、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することによって発現(生産)することができる。栄養培地は、宿主細胞(形質転換体)の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素(例えば無機塩(例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム)、ビタミン類、抗生物質(例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等)など)を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のpH及び培養時間は、本発明のタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
【0080】
本発明のタンパク質は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液(例えば濃度が10〜100mM程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液、MES緩衝液などの緩衝液。pHは用いる緩衝液によって異なるが、pH5.0〜9.0の範囲が望ましい)に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに6×ヒスチジンやGST、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
【0081】
本発明タンパク質を、糖タンパク質、オリゴ糖または多糖等に作用させることにより、N−アセチルグルコサミンが転移される。従って、本発明タンパク質は、糖タンパク質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、本発明タンパク質を免疫原として動物に投与することにより、該タンパク質に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該タンパク質を測定することが可能になる。従って、本発明タンパク質及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。
【0082】
本発明発現ベクターはそのような本発明タンパク質の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に「本発明タンパク質」を「酵素活性を有するポリペプチド(例えば上述の(A)、(A’)又は(A’’)記載のポリペプチド)」と「標識ペプチド」との「融合タンパク質」の形態で発現するように構築した「本発明発現ベクター」を用いて遺伝子工学的に「本発明タンパク質」を調製すると単離・精製が容易となるため好ましい。
【0083】
上記「識別ペプチド」の例としては、「本発明タンパク質」を遺伝子組み換えによって調製する際に、該「識別ペプチド」と「酵素活性を有するポリペプチド」とが結合した「融合タンパク質」として発現させることにより、形質転換体の生育物から「本発明タンパク質」の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドである。このような「識別ペプチド」としては、例えばシグナルペプチド(多くのタンパク質のN末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している15〜30アミノ酸残基からなるペプチド:例えばOmpA、OmpT、Dsb等)、プロテインキナーゼA、プロテインA(黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタンパク質)、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ(ヒスチジン残基を6乃至10個並べて配した配列)、mycタグ(cMycタンパク質由来の13アミノ酸配列)、FLAGペプチド(8アミノ酸残基からなる分析用マーカー)、T7タグ(gene10タンパク質の最初の11アミノ酸残基からなる)、Sタグ(膵臓RNaseA由来の15アミノ酸残基からなる)、HSVタグ、pelB(大腸菌外膜タンパク質pelBの22アミノ酸配列)、HAタグ(ヘマグルチニン由来の10アミノ酸残基からなる)、Trxタグ(チオレドキシン配列)、CBPタグ(カルモジュリン結合ペプチド)、CBDタグ(セルロース結合ドメイン)、CBRタグ(コラーゲン結合ドメイン)、β−lac/blu(βラクタマーゼ)、β−gal(βガラクトシダーゼ)、luc(ルシフェラーゼ)、HP−Thio(His−patchチオレドキシン)、HSP(熱ショックペプチド)、Lnγ(ラミニンγペプチド)、Fn(フィブロネクチン部分ペプチド)、GFP(緑色蛍光ペプチド)、YFP(黄色蛍光ペプチド)、CFP(シアン蛍光ペプチド)、BFP(青色蛍光ペプチド)、DsRed、DsRed2(赤色蛍光ペプチド)、MBP(マルトース結合ペプチド)、LacZ(ラクトースオペレーター)、IgG(免疫グロブリンG)、アビジン、プロテインG等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ、mycタグ、FLAGペプチド、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、pelB又はHAタグが、遺伝子工学的手法による本発明タンパク質の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にFLAGペプチド(Asp−Tyr−Lys−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys)(配列番号6)との融合タンパク質として「本発明タンパク質」を得るのが、取扱面で極めて優れているため好ましい。上記FLAGペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。4E11と称されるネズミハイブリドーマは、本願明細書に援用される米国特許第5,011,912に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、FLAGペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。4E11ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号HB 9259下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)に寄託されている。FLAGペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
【0084】
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のFLAGペプチドとの融合タンパク質として「本発明タンパク質」を得ることができる基本ベクターとしては例えばpFLAG−CMV−1(シグマ社)、pFBIF(pFastBac(インビトロジェン社)にFLAGペプチドをコードする領域を組み込んだベクター:後述の実施例参照)等が例示されるが、当業者であれば「本発明タンパク質」の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
【0085】
なお、本発明によって「本発明核酸の塩基配列」が開示されたため、当業者であれば目的とする「本発明核酸」や調製したい「本発明核酸の一部の領域」の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いてPCR法などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
【0086】
(5)本発明測定用核酸
本発明によれば、本発明核酸とハイブリダイズする核酸(以下、「測定用核酸」と称する)が提供される。本発明測定用核酸は、典型的には、本発明タンパク質をコードする核酸の天然由来の又は合成されたフラグメントであり、プライマー又はプローブを含むが、これらに限定されるものではない。なお、本明細書において使用される用語「測定」には、検出、増幅、定量、および半定量のいずれもが包含される。
【0087】
(a)プライマー
本発明測定用核酸を核酸増幅反応用のプライマーとして使用する場合、本発明測定用核酸は、オリゴヌクレオチドであって、
配列番号2に示すタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように2つの領域を選択し:
1)各領域の長さが15−50塩基であること;
2)各領域中のG+Cの割合が40−70%であること;
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖DNAを製造し、または、上記一本鎖DNAによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖DNAの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖DNAを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
【0088】
本発明のプライマーは、本発明核酸の部分領域と相同的な配列を有することが好ましいが、1または2塩基の不一致があっても差し支えない。
なお、本発明のプライマーの塩基数は15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは21塩基以上であり、50塩基以下である。
【0089】
本発明のプライマーは、典型的には、配列番号7(配列番号1の塩基番号683−701に対応する)及び配列番号8(配列番号1の塩基番号775−755に対応する)の塩基配列を有し、単独、又はプライマー対として用いることができる。
【0090】
(b)プローブ
本発明測定用核酸をプローブとして使用する場合、本発明測定用核酸は、配列番号1に記載の塩基配列の全体又は部分領域と相同的な配列を有することが好ましい。本発明の測定用核酸が、cDNAプローブの場合、塩基数は、10塩基以上、好ましくは15塩基以上で、最長で、コード領域の全長、即ち、1209塩基である。配列番号1に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と50%以下、好ましくは20%以下の不一致があっても、プローブとしての機能を果たし得る。また、本発明の測定用核酸が、合成オリゴヌクレオチドの場合、塩基数は15塩基以上、好ましくは20塩基以上である。合成オリゴヌクレオチドの場合、長さによるが、配列番号1に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と1または2塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たしうる。
【0091】
本発明のプローブは、例えば、配列番号9に記載された塩基配列を有する。これは、配列番号1の塩基番号707−724の相当し、配列番号7および8をプライマーとして核酸増幅反応を行った場合、その増幅産物にハイブリダイズして検出しうる。
【0092】
本発明のプローブには、該プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを検出または確認するために、蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブが含まれる。被検核酸またはその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するかを決定することができる。
【0093】
一般的に、PCRのような核酸増幅法自体は、当該技術分野において周知であり、そのための試薬キットおよび装置も市販されているので容易に行うことができる。上記した本発明のプライマー対を用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いた定量的RT−PCRを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、定量的RT−PCR用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、mRNAでも、mRNAから逆転写したcDNAであってもよい。被検核酸としてmRNAを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたNASBA法(3SR法、TMA法)を採用することもできる。NASBA法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
【0094】
(6)本発明検定方法
本発明者らは、本発明の新規β1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質、及び/又は核酸の発現量が、癌組織において正常組織よりも多いことを見出した。よって、本発明の生物試料中において本発明のタンパク質または核酸を定量し、対照の正常な生物試料中の相当する量と比較することにより、生物試料の癌化を検定することが可能である。
【0095】
具体的には、本発明は、生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a)生物試料中の本発明のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量し;そして
(b)生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の1.5倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法を提供する。
【0096】
また、本発明の検定方法は、
(a)生物試料中の本発明のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸を定量し;そして
(b)生物試料中の前記核酸の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記核酸の定量値の1.5倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、ものであってもよい。
【0097】
上記のように、本発明のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を癌マーカーとして定量する場合には、例えば、該タンパク質を免疫原として作成される抗体を用いることができる。抗体を利用したタンパク質の定量方法としては、当該技術分野における周知な方法、例えば、ELISA法、ウエスタンブロット法を使用することが可能である。また、本発明の糖転移酵素タンパク質の活性を利用することによって、定量することもできる。前記定量値の比は、1.5倍以上、好ましくは2倍以上、より好ましくは3倍以上、さらに好ましくは5倍以上、さらにより好ましくは10倍以上、最も好ましくは20倍以上である。
【0098】
また、本発明のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸を癌マーカーとして定量する場合には、本発明の検定方法は、
(a−1)生物試料中のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸に本発明の測定用核酸から選択される一対のプライマーをハイブリダイズさせ;
(a−2)β1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の全部又は一部をコードする核酸を増幅させ;
(a−3)前記増幅産物を定量し;そして
(b)前記定量値が、対照の正常な生物試料中の対応する定量値の1.5倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、ものであってもよい。
【0099】
本発明検定方法への利用できる核酸は、本発明測定用核酸として例示されるが、特に限定されず、例えば、配列番号1記載の塩基番号1乃至1206からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列から選択される、任意の配列を利用可能である。配列番号1記載の塩基番号683乃至775からなる塩基配列からなる核酸又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸(本発明核酸1)を使用することが好ましい。即ち、本発明検定方法によって生物試料において検出される核酸(特にmRNA)は、配列番号1記載の塩基配列番号683乃至775からなる塩基配列を含む核酸であることが好ましいが、具体的には、配列番号1記載の塩基番号683乃至775からなる塩基配列からなる核酸、配列番号1記載の塩基番号166乃至1209からなる塩基配列からなる核酸、及び配列番号1記載の塩基番号1乃至1209からなる塩基配列からなる核酸が例示される。
【0100】
これらの核酸の発現量は、例えば、本発明測定用核酸を使用したPCR法を用いて定量することができる。PCR法では、定量的PCR法の使用が好ましく、キネティックス分析のためのRT−PCR法、定量的リアルタイムPCR法が例示される。本発明によれば、核酸の定量には、これらに限定されるものではなく、ノーゼンブロット、ドットブロット、DNAマイクロアレイを使用することも可能である。一方、同一組織等に広く一般的に存在する遺伝子の核酸、例えばグリセルアルデヒド−3リン酸−脱水素酵素(GAPDH)、β−アクチンをコードする核酸を対照として利用することができる。癌化していると判断されるシグナルの定量比は、1.5以上であり、好ましくは2以上、より好ましくは3以上、さらに好ましくは5以上、さらにより好ましくは10以上、最も好ましくは20以上である。
【0101】
本明細書において、「生物試料」というときは、器官、組織及び細胞を示すが、好ましくは組織であり、具体的には、食道、胃、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、小腸、大腸、直腸、結腸が例示される。好ましくは大腸、直腸、及び結腸であり、より好ましくは大腸である。
【0102】
本発明検定方法は、上記の通り、生物試料の癌化を検定するものであり、医療における癌の診断、治療等に応用することができる。本明細書において使用される用語「癌」には、典型的には、悪性腫瘍全般をいい、該悪性腫瘍による疾病状態を含む。本発明検定方法は、限定されるわけではないが、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、及び結腸癌、好ましくは大腸癌、直腸癌、及び結腸癌であり、より好ましくは大腸癌の検定に適している。
【0103】
(7)本発明抗体
本発明のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質に免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こうした抗体は、(非特異的結合と対照的に)抗体の抗原結合部位を介して、該糖転移酵素タンパク質に特異的に結合する。したがって、上述のような、配列番号2のタンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でも高次構造的(conformational)(断続的)でもどちらでもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定してもよい。
【0104】
したがって、本発明の1つの側面は、本発明のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質の抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、タンパク質の化学的または酵素的切断などの、当該技術分野に公知の技術を用いて、あるいは組換えDNA技術を用いて、産生することが可能である。
【0105】
前記糖転移酵素タンパク質によって誘導される可能性がある抗体に関しては、該タンパク質の全部若しくは一部が単離されていても、またはエピトープが単離されていても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術によって調製することが可能である。例えば、Kennetら(監修), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, 1980を参照されたい。
【0106】
本発明のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための1つの方法は、動物を該糖転移酵素タンパク質で免疫し;免疫された動物から脾臓細胞を採取し;前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し;そして該タンパク質に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。
【0107】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術によって調製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供してもよい。
【0108】
慣用的技術によって産生可能な、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、FabおよびF(ab’)2断片が含まれる。遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
【0109】
本発明の抗体は、in vitro又はin vivoいずれかで、前記糖転移酵素タンパク質または断片の存在を検出するアッセイで用いることが可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
【0110】
さらに、結合パートナー、例えば受容体基質への本発明のタンパク質の結合を遮断することが可能な抗体を用いて、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害することが可能である。こうした遮断抗体は、受容体基質を発現している特定の細胞への該タンパク質の結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて、同定してもよい。あるいは、遮断抗体は、標的細胞の結合パートナーに結合している本発明タンパク質から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定することが可能である。
【0111】
こうした抗体を、in vitro法で使用するか、又はin vivoで投与して、抗体を生成した実体によって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。したがって、本発明のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質と結合パートナーとの相互作用によって、(直接または間接的に)引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、結合パートナー仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、ほ乳動物にinvivo投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。1つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。
【0112】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0113】
【実施例】
実施例1 本発明DNA及び本発明タンパク質の調製方法
β3グルクロン酸転移酵素7(β3GnT7)の塩基配列(GenBank Accession No.AK000770)(配列番号10)をクエリーとして、BLAST検索を行った。その結果、EST(GenBank Accession No. BC004908)の相補配列がβ3GnT7とホモロジーを有することが判明した。相補配列は配列番号1の通りであった。この塩基配列がコードするアミノ酸配列(配列番号2)はN末端に膜貫通領域を有することが予測され、この膜貫通領域を有しないタンパク質をコードする塩基配列の領域を調製することとした。調製は、Gatewayシステム(インビトロジェン社)を利用して、pFastBac(インビトロジェン社)の誘導体であるpFBIFに遺伝子を組み込み、Bac−to−Bacシステム(インビトロジェン社)によるバクミドを作成して行った。
【0114】
(1) エントリークローンの調製
ヒトゲノムcDNA(クロンテック社製)を鋳型とし、5’プライマーとして配列番号3記載の塩基配列からなるDNA(配列番号3の塩基番号32−56は、配列番号1の塩基番号166−190に対応する)、3’プライマーとして配列番号4記載の塩基配列からなるDNA(配列番号4の塩基番号31−55は、配列番号1の塩基番号1209−1185に対応する)を使用してPCR法を行った。PCR法は96℃ 1分、55℃ 1分、72℃ 1分を30サイクル繰り返す条件で行った。そしてPCR産物をアガロースゲル電気泳動を行い、ゲル切り出し法でゲルを切り出して常法により単離した。このようにして単離したPCR産物をBPクロナーゼ反応によってpDONR201(商標)(インビトジェン社製)へ組み込んで「エントリークローン」を作成した。反応は上記PCR産物2μl、pDONR201 1μl(150ng)、BP反応緩衝液2μl、トリス−EDTA緩衝液(pH8.0:以下「TE」とも略記する)3μl、BPクロナーゼmix 2μlを25℃で1時間インキュベーションして行った。その後、プロテイナーゼK(科研製薬株式会社製)を1μl加えて37℃、10分間インキュベートして反応を終了させた。その反応混合液11μlをコンピテントセル(大腸菌DH5α)100μlと混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシンを含むLBプレートに播いた。翌日コロニーを回収し、PCR法で目的DNAが導入されていること及びその塩基配列を確認し、挿入されたベクター(pDONR−G26A)を常法に従って抽出、精製した。このベクターに挿入されたDNAの塩基配列は、配列番号1記載の塩基配列のうち、塩基番号166乃至1209からなる塩基配列を含むことが確認された。
【0115】
(2) 発現クローンの調製
上記エントリークローンは、挿入部位の両端にλファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるattLを持つもので、LRクロナーゼ(λファージの組換酵素Int、IHF、Xisを混合したもの)とデスティネーションベクター(attRを有する)とを混合することで、挿入部位がデスティネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。
【0116】
1μlのエントリークローン(pDONR−G26A)、0.5μlのデスティネーションベクター(pFBIF(75ng))、LR反応緩衝液2μl、TE4.5μl、LRクロナーゼミックス(λファージの組換え酵素Int、IHF、及びXisを混合した溶液)2μlを25℃で1時間インキュベートし、プロテイナーゼK(科研製薬株式会社製)を1μl加えて37℃で10分間インキュベートして反応を停止させた(この組換反応でpFBIF−G26Aが生成された)。pFBIFはpFastBac1(インビトロジェン社製)にIgκシグナル配列(配列番号5)と精製用のFLAGペプチド(配列番号6)とを常法に従って挿入したものである。さらに、pFBIFにGateway配列(attR)を挿入するため、Gateway Vector Conversion System(インビトロジェン社)を用いて変換カセットを挿入した。この変換カセットは、発現ベクターをデスティネーションベクターに改変するためのカセットであり、attR組換え部位、クロラムフェニコール耐性遺伝子、及び大腸菌DNA gyraseを阻害するタンパク質をコードするccdB遺伝子を有する。また、Igκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、FLAGタグは精製を容易とするために挿入した。
【0117】
pFBIF−G26Aが含まれる反応混液(11μl)とコンピテントセルである大腸菌DH5α 100μlとを混合し、ヒートショック法による形質転換の後、アンピシリンをで含むLB培地に組換DH5αを蒔いて培養した。24時間培養後、コロニーを回収し、QIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社製)によりプラスミド(pFBIF−G26A)を抽出精製した。PCR法で目的DNAが挿入されていることを確認した。
【0118】
(3) Bac−to−Bacシステム(インビトロジェン社製)によるバクミドの調製
続いてBac−to−Bacシステム(インビトロジェン社製)を用いて上記pFBIF−G26Aとバクミドとの間で組換を行い、昆虫細胞中で増殖可能なバクミドにG26Aの配列を挿入した。このシステムはTn7の組換部位を利用して、バクミドを含む大腸菌(大腸菌DH10Bac(商標))に目的遺伝子を挿入させたpFastBac(即ち、pFBIF−G26A)を導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生させる組換えタンパク質によって目的とする遺伝子(G26A)がバクミドに取り込まれるシステムである。またバクミドにはLacZ遺伝子が含まれており、古典的なコロニーの色(青(挿入なし)−白(挿入あり))による選択が可能である。
【0119】
すなわち、上記精製ベクター(pFBIF−G26A)50μlとコンピテントセル(大腸菌DH10Bac)50μlとを混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、5−ブロモインドリルβ−D−ガラクトピラノシド(Bluo−gal)、及びイソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を含むLB培地に蒔き、24時間後にバクミドに目的DNAが挿入された白い独立したコロニーを回収し、更に培養を行った後、常法に従ってバクミドを回収した。
【0120】
(4) バクミドの昆虫細胞への導入
回収したバクミドに目的DNAが挿入されていることを常法に従って確認し、バクミドを昆虫細胞(Sf21:インビトロジェン社製)に導入した。すなわち35mmのシャーレにSf21細胞9×105個/2mlに抗生物質を含むSf900SFM培地(インビトロジェン社製)を添加し、27℃で1時間細胞を接着させた。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して、lipid−DNA complexes溶液(A溶液(100μlのSf−900SFMに上記バクミド5μlを添加した混合物)とB溶液(100μlのSf−900SFMに6μlのCell FECTION Reagent(インビトロジェン社製)を添加した混合物)とを丁寧に混合して30分間程度室温でインキュベートして得た溶液)にSf900II(インビトロジェン社製)800μlを添加した培養液を添加して27℃で5時間インキュベーションした。その後、培地を除去し、抗生物質を含むSf900SFM培地2mlを添加し、27℃で72時間インキュベートした。培養後ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収して1000×gで10分間遠心処理を行い、上清を回収した(この上清を「一次ウイルス液」とした)。
【0121】
更にT75培養フラスコにSf21細胞1×107個/20mlSf−900SFM(抗生物質を含む)を添加し、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接着した後、一次ウイルス液800μlを添加し、27℃で48時間培養した。培養後、ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収した。これを1000×gで10分間遠心処理を行い、上清を回収した(この上清を「二次ウイルス液」とした)。
【0122】
さらに、T75培養フラスコにSf21細胞1×107個/20mlSf−900SFM(抗生物質を含む)を添加し、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接着した後、二次ウイルス液1000μlを添加し、27℃で84時間培養した。培養後、ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収した。これを1000×gで10分間遠心処理を行い、上清を回収した(この上清を「三次ウイルス液」とした)。
【0123】
さらに、Sf21細胞を6×105個/mlの濃度で含むSf−900SFM(抗生物質を含む)を100ml用スピナーフラスコに100μl添加し、三次ウイルス液1mlを添加し、27℃で96時間培養した。培養後、細胞と培養液を回収した。これを1000×gで10分間遠心処理を行い、上清を回収した(この上清を「四次ウイルス液」とした)。
【0124】
四次ウイルス液10mlに対し、アジ化ナトリウム、塩化ナトリウム及び塩化カルシウムを加えた。終濃度はアジ化ナトリウムを0.05%、塩化ナトリウムを150mM、塩化カルシウムを2mMとした。抗FLAG抗体ゲル(Anti−Flag M1 monoclonal antibody Agarose Affinity Gel、シグマ社製)を50μl添加し、4℃で16時間緩やかに転倒混和した。遠心分離(1,000×g、3分、4℃)して上清を除去した後、1mMの塩化カルシウムを含むTBS(Tris−NaCl緩衝液:pH7.4)で2回洗浄した。そして洗浄後のアフィニティーゲルを1mMの塩化カルシウムを含むTBS(pH7.4)200μlに懸濁して、この懸濁液を活性測定用のG26酵素液とした。
【0125】
実施例2 本発明タンパク質の酵素活性
配列番号2記載のアミノ酸配列を基に、他の公知の糖転移酵素と対比した結果、活性部位と考えられるC−末端領域の配列の保存性などから、G26はβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン転移酵素類に分類されることが示唆された。そこでUDP−GlcNAcをGlcNAc供与体基質として用いてG26酵素液の酵素活性の確認を行った。
【0126】
GlcNAc受容体基質としては、GalNAcα1−Bz、GalNAcβ1−pNp、GlcNAcα1−Bz、GlcNAcβ1−Bz、Galα1−pNp、Galβ1−oNp、Xylβ1−pNp、Fucα1−pNp、Manα1−Bz、ManNAcα1−Bz、Galβ1−4Glcβ1−Bz(以上全てシグマ社製)、及びGalβ1−4GlcNAcα1−pNp(トロントリサーチケミカル社製)の全てを同時に用い、各々最終濃度で10nmolずつ含むように反応液を調製して活性を確認した。
【0127】
反応液は最終濃度50mMのカコジル酸ナトリウム緩衝液(pHを6.6、7.0、及び7.4の各実験系を調製した)、最終濃度0.4%のTriton(商標) CF−54(シグマ社製)、最終濃度480μMのUDP−GlcNAc、175nCiのUDP−[14C]GlcNAc、最終濃度20mMのMgCl2、CoCl2又はCuCl2、10.1μlのG26酵素液、及び蒸留水を含む全量20μlとした。
【0128】
反応液を37℃で16時間インキュベートし、その後蒸留水200μlを添加し、不溶性画分を遠心分離(100×g、10分)により除去して上清画分を回収した。Sep−Pak plus C18 Cartrige(ウォーターズ社製:予め1mlのメタノールで1回、次いで1mlの蒸留水で2回洗浄して平衡化したもの)に通筒し、上清に含まれるGlcNAc受容体基質及び反応生成物を吸着させた。1mlの蒸留水でカラムを2回洗浄し、カラムに吸着したGlcNAc受容体基質と反応生成物を1mlのメタノールで溶出した。溶出液を5mlの液体シンチレーター(アマシャム バイオサイエンス株式会社製)と混和し、シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定した(図1)。
【0129】
その結果、G26は20mMのMnCl2又はMgCl2存在下では何れのpHに於いても活性は確認されたが、pH6.6よりもpH7.4の方が強い活性が観察された。EDTAにより二価金属陽イオンをキレートした条件下では酵素活性は観察されなかったことから、G26は二価金属陽イオンを酵素反応に必要とすることが明らかとなった。
【0130】
実施例3 大腸癌組織における本発明DNA発現量の変化
定量的リアルタイムPCR法を用いてヒト大腸癌組織と同一患者の健常大腸組織での本発明核酸(mRNA)の発現量を比較した。ヒト大腸癌組織及び健常大腸組織のRNAを、RNeasy Mini Kit(キアゲン社製)で抽出し、Super−Script First−Strand Synthesis System(インビトロゲン社製)を用いたoligo(dT)法によりsingle strand DNAとした。このDNAを鋳型として用いてプライマー(5’プライマー:配列番号7(配列番号1の塩基番号683−701に対応する)、3’プライマー:配列番号8(配列番号1の塩基番号775−755に対応する))及びTaqMan MGBプローブ(配列番号9)(配列番号1の塩基番号707−724に対応する)を用いてABI PRISM 7700(アプライドバイオシステムス社製)により定量的リアルタイムPCR法を行なった。PCR反応の条件は、50℃で2分、95℃で10分で反応させた後、95℃で15秒、60℃1分を50回繰り返して行った(表2)。
【0131】
【表2】
【0132】
その結果、癌化した組織における本発明DNAの発現量は、健常組織と比較して平均して7倍以上に増加していることが明らかとなった。また、試料番号1−10のうちの8つ、即ち、被験者の80%以上が、2倍以上の発現量を示した。
【0133】
【配列表】
【0134】
【発明の効果】
本発明により新規な糖転移酵素及びそれをコードする核酸、並びに組織の癌化の新規な検定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明タンパク質の活性への反応pH、各種二価金属イオン、及びEDTAの影響を示す図である。黒塗りの三角はマンガンイオン、黒塗りの丸はコバルトイオン、黒塗りの正方形はマグネシウムイオンを各々示し、白抜きの三角はEDTA、白抜きの丸と菱形は陰性対照を各々示す。縦軸は放射能の量(dpm)を示し、横軸は反応pHを示す。
Claims (24)
- 下記の性質を有するβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質。
活性: N−アセチル−D−グルコサミン供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミン受容体基質にN−アセチル−D−グルコサミン残基を転移する。
基質特異性: (1) GalNAc、(2) GlcNAc、(3) Gal、(4) Xyl、(5) Fuc、(6) Man、(7) ManNAc、(8) Galβ1−4Glc、及び(9) Galβ1−4GlcNAcの何れかのN−アセチル−D−グルコサミン受容体基質に、N−アセチル−D−グルコサミン供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミン残基を転移する。
ここで「GalNAc」とはN−アセチル−D−ガラクトサミン残基を示し、「GlcNAc」とはN−アセチル−D−グルコサミン残基を示し、「Gal」とはD−ガラクトース残基を示し、「Xyl」とはD−キシロース残基を示し、「Fuc」とはD−フコース残基を示し、「Man」とはD−マンノース残基を示し、「ManNAc」とはN−アセチル−D−マンノース残基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示す。「β」は糖環1位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、5位CH2OH又はCH3との位置関係がシスのものを「β」で示す。
金属イオン要求性: 二価金属陽イオンを酵素反応に必要とする。
反応pH: 中性近辺である。 - 以下の(A)又は(B)のポリペプチドを含むβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質。
(A)配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(B)配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列を有し、且つN−アセチル−D−グルコサミン受容体基質に、N−アセチル−D−グルコサミン供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミン残基を転移する活性を有するポリペプチド。 - 前記(A)のポリペプチドが、配列番号2記載のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列からなる、請求項2記載の糖転移酵素タンパク質。
- 前記(A)のポリペプチドが、配列番号2記載のアミノ酸番号1乃至402からなるアミノ酸配列からなる、請求項2記載の糖転移酵素タンパク質。
- 前記糖転移酵素タンパク質が、配列番号2のアミノ酸番号56乃至402からなるアミノ酸配列と少なくとも50%同一のアミノ酸配列を有する、請求項2ないし4のいずれか一項記載の糖転移酵素タンパク質。
- 請求項2乃至5何れか一項記載のタンパク質をコードする塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸。
- 配列番号1記載の塩基番号166乃至1206からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、請求項6に記載の核酸。
- 配列番号1記載の塩基番号1乃至1206からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる、請求項6に記載の核酸。
- DNAであることを特徴とする請求項6乃至8何れか一項記載の核酸。
- 請求項6乃至9何れか一項記載の核酸、又は当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする測定用核酸。
- 配列番号1記載の塩基番号683乃至775からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む、請求項10に記載の測定用核酸。
- 前記測定用核酸が、プローブ、プライマーとして使用される、請求項10又は11記載の測定用核酸。
- 前記測定用核酸が、癌マーカーとして使用される、請求項10乃至12何れか一項記載の測定用核酸。
- DNAであることを特徴とする請求項10乃至13何れか一項記載の測定用核酸。
- 請求項6乃至14何れか一項記載の核酸を含むベクター。
- 請求項15記載のベクターを含む形質転換体。
- 請求項15記載の形質転換体を生育させ、β1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を発現させ、その生育物から前記糖転移酵素を回収する、ことを含む、前記糖転移酵素タンパク質の製造方法。
- 請求項1乃至5何れか一項記載のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を認識する抗体。
- 生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a)生物試料中の請求項1ないし5の何れか一項記載のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量し;そして
(b)生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値の1.5倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。 - 請求項18記載の抗体を用いてβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン糖転移酵素タンパク質を定量する、請求項19記載の検定方法。
- 生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a)生物試料中の請求項6記載の核酸を定量し;そして
(b)生物試料中の請求項6記載の核酸の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記核酸の定量値の1.5倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。 - (a−1)生物試料中の請求項6記載の核酸に請求項10記載の測定用核酸から選択される一対のプライマーをハイブリダイズさせ;
(a−2)請求項6記載の核酸を増幅させ;
(a−3)前記増幅産物を定量し;そして
(b)前記定量値が、対照の正常な生物試料中の対応する定量値の1.5倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、請求項21記載の方法。 - 配列番号1記載の塩基番号683−775からなる塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含む核酸を定量する、請求項21又は22に記載の方法。
- 前記生物試料が、大腸由来の試料である、請求項21乃至23何れか1項記載の方法。
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