JP4608694B2 - 糖転移酵素、該糖転移酵素をコードする核酸及び該核酸を用いた癌化検定方法 - Google Patents
糖転移酵素、該糖転移酵素をコードする核酸及び該核酸を用いた癌化検定方法 Download PDFInfo
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Description
糖の中でN−アセチル−D−グルコサミン残基(GlcNAc)やD−ガラクトース残基(Gal)等はグリコサミノグリカンの構成成分であると共に、スフィンゴ糖脂質、ムチン型糖鎖、アスパラギン結合型糖鎖(N結合型糖鎖)など様々な糖鎖構造に存在する糖残基である。従って、GlcNAc又はGalを転移する酵素は、生体内の様々な組織で働く糖鎖の働きを解析する上で極めて重要なツールとなる。
例えば、GlcNAcを転移する活性を有するN−アセチルグルコサミン酵素は、表1に示す通り、少なくとも20種類知られており、各々、受容体基質特異性が異なる(文献1〜18)。
他方、糖鎖合成は癌化において非常に良く変化することが知られており、癌の転移や悪性度と相関することが知られている(文献30〜32)。また、各種組織における発現プロファイル等の解析など、今日盛んなそれらの網羅的研究は、癌化メカニズムの解明にも向けられており、癌化のメカニズムが特定遺伝子の発現量と関与し得ることはたびたび議論されてきた。癌診断検査法として、血中癌マーカー等の検査、その他の癌化に関与する遺伝子産物等の同定などが既に行われていることは周知のとおりである。癌マーカーの中には、糖鎖に対する抗体も多く含まれる。とりわけ、癌遺伝子産物に対する免疫学的検定は、感度が高いという利点からたびたび採用されてきた。
文献
文献30:Kobata A.,Eur.J.Biochem.15,209(2),483−501,1992
文献31:Santer U.V.et al.,Cancer Res.,Sep,44(9),3730−5,1984
文献32:Taniguchi N.,Biochim.Biophys.Acta.,1455(2−3),287−300,1999
上述のように癌化に何らかの関与を持つ遺伝子産物の同定により、癌診断上有用な癌マーカーが提供されると期待されている。なかでも、癌化検定に際して転写産物中に見出される核酸を指標とすることができれば、その最終産物、例えばタンパク質の機能解明を待つまでもなく、特定遺伝子の転写産物の同定のみで十分に癌化検定に有用な指標を提供できる。特に核酸の同定は、DNAマイクロアレイ上で行うこともできるし、微量でもそれをPCRで増幅して定量することも可能であるから、免疫学的検定法にはない利点も有する。
他方、生体内での糖鎖の働きが注目されているが、生体内での糖鎖合成の解析は十分に進んでいるとは言えない。糖鎖合成のメカニズム、生体内での糖合成の局在が充分に解析されていないことも一因である。糖鎖合成のメカニズムを解析するに当たっては、糖鎖合成酵素、特に糖転移酵素を解析し、その酵素を使ってどの様な糖鎖が生成されるのかを分析する必要がある。そのために新たな糖転移酵素を見つけだし、その機能を解析することについての要請も高まっている。
本発明の別の目的は、上記癌化の指標として注目される特定遺伝子の解析に伴い、ヒトの新規な糖転移酵素タンパク質をコードする核酸、及び該新規な糖転移酵素タンパク質を提供することにある。本発明の糖転移酵素タンパク質は、特に、N−アセチル−D−グルコサミンを受容体基質へβ1,3結合で転移する活性を有するβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン転移酵素タンパク質である。
本発明のまた別の目的は、該核酸を宿主細胞内で発現する形質転換体、さらに、当該形質転換体を生育させて、当該タンパク質を単離する方法を提供することにもある。
図2は、G9ポリペプチドの活性について反応液の緩衝剤とpH依存性及び金属イオン依存性を示す。図2AにおいてpHの活性への効果がカコジル酸塩(黒角)及びHEPES(N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジシ−N’−[2−エタンスルホン酸])緩衝剤(黒円)でアッセイされた。図2Bにおいて2価陽イオンの効果が様々な濃度のMnCl2(黒円)、CaCl2(黒角)、MgCl2(黒三角)、ZnCl2(白円)、NiSO4(白角)、及びCdSO4(白三角)でアッセイされた。
図3は、2−アミノピリジン化オリゴ糖(N−グリカン)を受容体基質として用いた場合の活性測定の結果を示す。NDは非検出を示す。
図4は、α1−酸性糖タンパク質(オロソムコイド)、オボアルブミン、及びオボムコイドを受容体基質として用いた場合の活性測定を示す電気泳動写真である。酵素と基質の反応混合物は、グリコペプチダーゼFで処置しないか(−)又は処置し(+)、次いで、SDS−PAGEにより分離させた。ゲルはCBB(クマシ−ブリリアントブルー)で染色するか(上の写真)又はオートラジオグラフィーにかけた(下の写真)。
発明の詳細な説明
本発明者等は、目的とする酵素と類似した作用を有する酵素遺伝子の塩基配列を基に、配列相同性が高いと思われる目的とする核酸の単離と精製を試みた。具体的には、まず、公知の糖転移酵素であるβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素の配列をクエリーとしてBLAST検索を行い、その結果、相同性を有する配列としてゲノム配列(GenBank No.AC011462)を見出した。
さらに、PCRでタンパク質をコードする遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列(配列番号1)及び推測アミノ酸配列(配列番号2)を決定した。配列番号1の塩基配列を有する遺伝子をG9遺伝子、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質をG9タンパク質と命名した。これにより、当該核酸がコードするタンパク質が新規な糖転移酵素であることを発見し、さらに、癌化した組織において、前記核酸の発現の有無又はその発現量が健常組織と異なることを見出し、本発明を完成した。本発明者らは、さらに、本発明で得られた核酸を遺伝子工学的に発現し、組換えタンパク質を産生させた。本願発明のタンパク質の活性を確認したところ、供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミンを受容体基質へβ1,3結合で転移する活性を有するβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン転移酵素タンパク質であることが明らかになった。
本発明は、配列番号1に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に関する。
本発明の核酸は、好ましくは、配列番号1に記載の塩基配列中の少なくとも15個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる。
本発明の核酸は、典型的にはプローブまたはプライマーである。また本発明の核酸は、癌マーカでもあり得る。
本発明はまた、生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a)前記何れかに記載の核酸を使用して、生物試料中の該核酸の転写レベルを測定し;そして
(b)該生物試料中の該核酸の転写レベルが、対照の健常生物試料のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること
を含む方法に関する。
本発明による検定方法の好ましい態様によれば、その生物試料の癌化を検定する方法は、
(a)前記何れかに記載の核酸を標識されたプローブとして使用し、これを生物試料にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ここでハイブリダイズした核酸の標識からのシグナルに基づき該生物試料中の該核酸の転写レベルを測定し;そして
(b)該生物試料中の核酸の転写レベルが、対照の健常生物試料中のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること
を含む。
本発明による検定方法の好ましい他の態様によれば、その生物試料の癌化を検定する方法は、
(a)標識された前記プライマーを使用して、生物試料について核酸増幅を行い、且つ該核酸増幅産物の量を測定し;そして
(b)の該核酸増幅産物の量が、対照の健常生物試料中のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること
を含む。
さらに、本発明による検定方法の別の態様によれば、本発明の核酸を使用して、癌治療に関する処置の効果を検査することもできる。
本発明により癌治療に関する処置の有効性を検査する方法は、癌治療に関する処置の有効性を検査する方法であって、癌治療のための処置がなされた生物試料中の前記核酸の転写レベルを、本発明によるいずれかの核酸を使用して測定し、該測定値を、該処置前又は未処置のそれと比較することにより、該生物試料への該処置が有効であるか否かを判断することを含む方法である。
本発明による上記処置の有効性を検査する方法の好ましい態様には、既に癌化している前記生物試料を使用し、癌治療のための処置がなされた該生物試料中の前記核酸の転写レベルが、該処置前又は未処置のそれを有意に下回る場合に、該生物試料への該処置が有効であると判断することを含む方法が含まれる。
なお、上記処置の有効性を検査する方法を適用し得る生物試料には、非ヒトモデル動物のin vivo生物試料のほか、組織、細胞等(ヒトを含む)由来のin vitro生物試料が含まれる。また、本発明による上記各方法を適用し得る生物試料は、典型的には大腸又は末梢血由来の試料である。
本発明の他の側面において、配列番号1の塩基配列は、既知の遺伝子であるヒトのβ1,3GlcNAc転移酵素2及びβ1,3Gal転移酵素6と31%の相同性があり、保存されているモチーフはβ1,3Gal転移酵素に近い。また、マウスのβ1,3GlcNAc転移酵素1とは60%の相同性がある。さらに、配列番号2の推測アミノ酸配列は、そのN末端に糖転移酵素の特徴である疎水膜貫通領域を有する。
上記の観点から、配列番号1の核酸配列は、N−アセチル−D−グルコサミン残基を転移させて、β1,3結合で糖鎖を合成するヒトの新規な糖転移酵素をコードしていると推測され、そして、実際に生物活性を有する酵素タンパク質が単離・精製され、特定の活性が確認された(実施例4及び5)。
また配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質は、新規な糖転移酵素の活性を有するので、この新規なタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする核酸を提供することは、当該技術分野におけるこれらの多様な必要性を満たすのに貢献するであろう。
すなわち、本発明は、糖供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミン残基を糖受容体基質にβ1,3結合で転移する糖転移酵素タンパク質及びそれをコードする核酸にも関する。典型的な糖供与体基質は、UDP−GlcNAcであり、少なくともGalβ1,4GlcNAc糖鎖残基を受容体基質とする。
したがって本発明は、供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミンを受容体基質へβ1,3結合で転移する活性を有するβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン転移酵素タンパク質にも関する(「β」は糖環1位のグリコシド結合のアノマーのうち、シスのものを示す)。
また本発明の糖転移酵素タンパク質には、下記の性質(a)−(c):
(a)受容体基質の特異性
少なくともBz−β−ラクトシド及び/又はGalβ1,4GlcNAc基に対し、有意な転移活性を有する
(「Bz」はベンジル基を示し、「Gal」はガラクトース残基を示し、「GlcNAc」はN−アセチル−D−グルコサミン残基を示し、「β」は糖環1位のグリコシド結合のアノマーのうち、シスのものを示す);
(b)反応pH
中性又はその付近での活性が高い;又は、
(c)二価イオンの要求性
前記活性は、少なくともMn2+又はCo2+の存在下で増強される;
の少なくとも一つを有するものが含まれる。
特に、本発明の糖転移酵素タンパク質には、4つのGalβ1,4GlcNAc基を有するN結合型糖鎖を持つ受容体基質に有意な活性を有するものが含まれる。
また、本発明の糖転移酵素タンパク質の態様には、下記(A)〜(C)の何れか1つの配列を有するものが含まれる:
(A)配列番号2、配列番号16又は配列番号17の何れか1つのアミノ酸配列;
(B)配列番号2、配列番号16又は配列番号17の何れか1つのアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、又は挿入したアミノ酸配列;又は
(C)配列番号2、配列番号16又は配列番号17の何れか1つのアミノ酸配列と少なくとも40%同一であるアミノ酸配列。
さらに他の側面において本発明は、上記いずれかの態様のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン転移酵素タンパク質をコードする核酸にも関する。
本発明の糖転移酵素タンパク質をコードする核酸の態様には、配列番号1に記載の塩基配列全長、その中の塩基番号76〜1194の塩基配列、その中の塩基番号97〜1194の塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を含むものが含まれる。そのような核酸はDNAであり得る。
更なる他の側面において本発明は、上記のように糖転移酵素タンパク質をコードする核酸を含むベクター、及び該ベクターを含む形質転換体にも関する。さらに本発明は、β1,3−N−アセチル−D−グルコサミン転移酵素タンパク質の製造方法であって、前記形質転換体を生育させ、前記糖転移酵素タンパク質を発現させ、該形質転換体から該糖転移酵素タンパク質を回収することを含む製造方法にも関する。
更なる他の側面において本発明は、上記いずれかの態様のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン転移酵素タンパク質を認識する抗体を提供することもできる。
また、本発明の核酸が新規糖転移酵素タンパク質をコードするとの知見は、癌組織における該糖転移酵素タンパク質の発現量が健常組織よりを上回っていることを示唆する。よって、生物試料中に発現している本発明のタンパク質を検出又は定量し、対照の健常生物試料中のそれと比較することにより、該生物試料の癌化を検定することも可能であろう。
したがって本発明は、生物試料の癌化を検定する方法であって、
(a)生物試料中の本発明の新規糖転移酵素タンパク質を検出又は定量し;そして
(b)生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質の定量値が、対照の正常な生物試料中の前記糖転移酵素タンパク質のそれを有意に上回る場合には癌化していると判断する工程を含む方法にも関する。
ここで新規糖転移酵素タンパク質を検出するためには、糖転移酵素タンパク質を特異的に認識する抗体を使用することが例示される。
発明を実施するための好ましい形態
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
(1)癌化に関与する本発明の核酸
本発明者らは、配列番号1に記載の塩基配列を有する核酸が発現していない健常組織、例えばヒト大腸組織では、その癌化により該核酸の発現が確認されること、及び、配列番号1に記載の塩基配列を有する核酸が一般に発現している健常組織、例えば大腸癌患者の末梢血では該核酸の発現量が健常人と比較して有意に増大することを発見した。
したがって、配列番号1の塩基配列又はその相補的配列からなる核酸は、生物試料中の転写産物に対する検査において有用な癌マーカーとして着目される。本発明によれば、この癌マーカー核酸にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし得る核酸が提供される。
本発明によるプライマー又はプローブは、典型的には、配列番号1の塩基配列を有する核酸に由来する天然のDNAフラグメント、配列番号1の塩基配列を有するように合成されたDNAフラグメント、又はそれらの相補鎖である。
特に該癌マーカー核酸は、BLAST検索を介して突き止めたもので、それは構造遺伝子をコードするmRNAとして転写されている。通常、そのORF全長またはその部分が試料中に存在し得る。この見地から、該核酸を標的とするプライマー又はプローブとして、配列番号1の塩基配列のORF全域から、所望の標的配列を選択することができる。本発明のプライマー又はプローブは、配列番号1の塩基配列中の部分配列であることもできる。
上記のようなプライマー又はプローブを用いて、後述のように生物試料中の該標的核酸を検出し及び/又は定量することができる。また、ゲノム配列等も標的となりうるので、本発明の核酸を、医学研究用又は遺伝子治療用のアンチセンスプライマーとして提供されることもできる。
本発明のプローブ
本発明の核酸をプローブとして使用する場合、その核酸は、配列番号1の塩基配列から選ばれる15塩基以上、好ましくは20塩基以上のオリゴヌクレオチド若しくはその相補鎖であるか、或いは、最長でそのORF領域(塩基番号1−1191)の全長、即ち、1191塩基のcDNA若しくはその相補鎖である。
特に本発明のプローブは医学研究用の試薬又は診断薬として広く有用である。一般に核酸はあまり分子量が大きいと取り扱いが困難となり、この見地からは、プローブの好ましい塩基長として、50〜500塩基、より好ましくは60〜300塩基も例示される。
なお、採用される塩基長及びハイブリダイズ条件等に依存するが、比較的短鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号1の塩基配列又はその相補的な塩基配列と1又は数個の塩基、特に1又は2塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たし得る。また、比較的長鎖のcDNAプローブは、配列番号1の塩基配列又はその相補的な塩基配列と50%以下、好ましくは20%以下の不一致があっても、プローブとしての機能を果たし得る。
また、本発明の核酸が合成オリゴヌクレオチドである場合、その塩基数は15塩基以上、好ましくは20塩基以上である。合成オリゴヌクレオチドの場合、その塩基長及び採用されるハイブリダイズ条件に依存するが、配列番号1に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と1又は数個の塩基、特に1又は2塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たし得る。
本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、15塩基長もあれば、ストリンジェントな条件下で該標的核酸に対して特異的にハイブリダイズし得ることを理解されるべきである。当業者は、オリゴヌクレオチドプローブ設計に関する公知の各種ストラテジーに従い、配列番号1の塩基配列から適切な少なくとも15塩基の部分配列を選択することができる。また、配列番号2のアミノ酸配列情報は、プローブとして適切と思われるユニークな配列を選定するのに役立つであろう。
ここでストリンジェントな条件下とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、DNAの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第3版、Vol.1、7.42−7.45 Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の前洗浄溶液、約40−50℃での、約50%ホルムアミド、2×SSC−6×SSC(又は約42℃での約50%ホルムアミド中の、スターク溶液(Stark’s solution)などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液)のハイブリダイゼーション条件、および約60℃、0.5×SSC、0.1% SDSの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばDNAの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び/又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び/又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ68℃、0.2×SSC、0.1% SDSの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
上記のように、当業者であれば、当該技術分野において公知の各種プローブ設計法及びハイブリダイゼーション条件に関する技術常識、並びに通常用いられる実験手段を通じて得られるであろう経験則を基に、選択されたプローブに適切な中程度又は高程度にストリンジェントな条件を容易に見つけ出し、実施することができる。
また、本発明のプローブには、標的配列とハイブリダイズした該プローブを検出または確認するために、蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブが含まれる。本発明による標識プローブの一例は、配列番号6の塩基配列(配列番号1中の塩基番号485−502の相補鎖に相当する)からなるオリゴヌクレオチドである。この標識プローブは、標的核酸のPCR産物を確認又は定量するために使用し得る。また、本発明の標識プローブは、診断用DNAプローブキット等に組み込まれてもよいし、DNAマイクロアレイ等のチップ上に固定されてもよい。
本発明のプライマー
本発明の核酸をプライマーとして使用する場合、その核酸は、オリゴヌクレオチドである。具体的には、配列番号1の塩基配列のORF領域から以下の条件を満たすように2つの領域を選択し:
1)各領域の長さが15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは21塩基以上であり、50塩基以下であること;
2)各領域中のG+Cの割合が40−70%であること;
選択された2つの領域と同じ塩基配列若しくはそれら領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖DNAを製造してもよいし、その塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖DNAを製造してもよい。本発明のプライマーは、配列番号1のORF領域中の部分配列と完全に相補的な配列を有することが好ましいが、1または2塩基の不一致があっても差し支えない。
本発明による一対のプライマーの例は、配列番号4に記載の塩基配列(配列番号1中の塩基番号450−469の相補鎖に相当する)からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号5に記載の塩基配列(配列番号1中の塩基番号531−549の相補鎖に相当する)からなるオリゴヌクレオチドである。
PCRにより増幅させた標的核酸を定量するには、使用された一対のプライマーの間に位置する塩基配列から選択されるプローブを使用できる。PCR産物を検出するための標識プローブの例は、配列番号6に記載の塩基配列(配列番号1中の塩基番号485−502の相補鎖に相当する)からなるオリゴヌクレオチドである。
(2)本発明による癌化の検査方法
本発明の癌化検査方法により、生物試料の転写産物中の標的核酸の転写レベルを測定することができる。その測定の結果は、対照の健常生物試料についての結果と比較される。それら結果の間に有意な差違がある場合に、該生物試料は癌化した組織であると判断することができる。
また、この検定法において、対照とされる健常組織についての検出結果は、健常生物試料に関する既知データを基に予め一般化された閾値を、対照の検出結果として利用しても差し支えない。例えば、末梢血の検査のように同一患者から健常組織を得られない場合は、健常者から測定された平均値との比較が行われる。
ここで癌化していると判断されるべき有意な差違とは、例えばヒト大腸癌患者からの末梢血におけるように健常組織で該標的核酸が発現しているなら、被検組織中の該標的核酸の実質的な存在(即ち、有意な濃度)が確認されること、或いは、例えば大腸癌組織におけるように健常組織で一般に発現しているなら、被検組織中の該核酸濃度が健常組織のそれを有意に上回っていること、好ましくは被検組織の健常組織に対するその濃度比で1.5倍以上、より好ましくは2倍以上であることをいう。
本発明による癌化検査方法には、典型的にはハイブリダイゼーション検定法及びPCR法が含まれる。
ハイブリダイゼーション検定法
本発明で使用し得るハイブリダイゼーション検定法には、例えば、生物試料から抽出された転写産物に対するサザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット、又はコロニーハイブリダイゼーション法等のような当業者に周知である各種ハイブリダイゼーション検定法が含まれる。
また、標的核酸の転写量や健常組織との差違に依存するが、当該標的核酸の定量又は検出レベルの増幅が必要とされる場合、ドットブロット若しくはコロニーハイブリダイゼーション等の定量的ハイブリダイゼーション検定法、或いはそれに免疫学的検定法を組み合わせた公知の検査法を使用してもよい。
典型的なハイブリダイゼーション検定法によれば、生物試料から抽出された検核酸またはその増幅物が固相化され、標識プローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識が測定される。
生物試料からの転写産物の抽出及び精製には、当業者に知られているあらゆる方法を適用し得る。生物試料から精製されてハイブリダイゼーション検定法に供されるものは、典型的には、生物試料の転写産物総体からのcDNAである。但し、当該標的核酸の実質的な検出のみをもって癌化とみなせる場合、すなわち健常組織では標的核酸が発現していないと見られる場合の被検組織については、in situハイブリダイゼーションのような、転写産物の精製等が不要な検査法を使用することが臨床検査上は実用的であろう。
核酸増幅による検査法
本発明によって「本発明核酸の塩基配列」が開示されたため、当業者であれば目的とする本発明の核酸又は調製すべきその一部領域の、両端に位置する塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いて核酸増幅反応(PCR)などによって目的の領域を増幅して調製することが容易である。
ここで、核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)[Saiki R.K.,et al.,Science,230,1350−1354(1985)]、ライゲース連鎖反応(LCR)[Wu D.Y.,et al.,Genomics,4,560−569(1989);Barringer K.J.,et al.,Gene,89,117−122(1990);Barany F.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,189−193(1991)]及び転写に基づく増幅[Kwoh D.Y.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,1173−1177(1989)]等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応(SDA)[Walker G.T.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392−396(1992);Walker G.T.,et al.,Nuc.Acids Res.,20,1691−1696(1992)]、自己保持配列複製(3SR)[Guatelli J.C.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,1874−1878(1990)]およびQβレプリカーゼシステム[リザイルディら、BioTechnology 6,p.1197−1202(1988)]等の恒温反応を含む。また、欧州特許第0525882号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅(Nucleic Acid Sequence Based Amplification:NASABA)反応等も利用可能である。好ましくはPCR法である。
転写産物中の標的核酸は、例えば、本発明の標的核酸から選ばれる一対のプライマーを使用したPCR法を用いて検出することができる。一般に、PCRのような核酸増幅法自体は、当該技術分野において周知であり、そのための試薬キットおよび装置も市販されているので容易に行うことができる。
本発明のプライマー対を用い、そして上記被検核酸を鋳型として用い、PCRによる核酸増幅法を行うと、存在する被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物の存在を確認するとにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができるし、増幅産物を定量することにより被検核酸の転写レベル、すなわち濃度を知ることもできる。PCRの所定サイクル数の繰り返しにより被検核酸は所望の濃度まで増幅されるであろう。また、健常組織中の該核酸も同様にして測定される得る。また、同一組織等に広く一般的に存在する遺伝子の核酸、例えばグリセルアルデヒド−3リン酸−脱水素酵素(GAPDH)、β−アクチンをコードする核酸を対照として利用するとよい。
被検核酸は、被検組織又は細胞などの生物試料から抽出された転写産物としてのmRNA総体でも、mRNAから逆転写したcDNA総体でもよい。被検核酸であるmRNAを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたNASBA法(3SR法、TMA法)を採用してもよい。NASBA法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
PCR法で得られた増幅産物の検出又は定量は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブ、例えば、配列番号6に記載の標識プローブをハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。
また、被検組織と健常組織との間でそれら標的核酸の「濃度」を比較する場合、定量的PCR法を使用することが好ましく、それにはキネティックス分析のためのRT−PCR法、定量的リアルタイムPCR法が含まれる。先だって精製される標的核酸はmRNAであるから、定量的リアルタイムRT−PCR法は特に好適である。但し、本検定法における核酸の定量は、定量的PCR法に限定されるものではなく、PCR産物に対して、上述のプローブを用いたノーザンブロット、ドットブロット、DNAマイクロアレイのような公知の他のDNA定量法を適用し得る。
また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いた定量的RT−PCRを行うことにより、検体中の標的核酸の量を定量することも可能である。特に定量的RT−PCR用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて標的核酸を半定量することも可能である。
癌治療効果に関する検定方法
上記本発明による癌化検定法は、癌治療効果を検査する方法として使用することもできる。検査対象は、その癌治癒効果を検査すべき処置の効果であり、癌化した細胞や組織又は発癌実験モデル動物から得られる腫瘍組織等への処置の効果である。そのような処置には、抗癌剤の投与のほか、放射線治療等のあらゆる処方が含まれる。癌化した生物試料へ又は実験モデル動物の病巣へ処置が行われる。
本発明による癌治療効果の検定法によれば、目的の処置がなされた生物試料中の前記標的核酸の転写レベルが、処置前又は未処置の場合と比較される。また、処置後に転写レベルを追跡してもよい。当該処置に起因して、転写レベルが有意に下がるか、又は仕込まれた上昇が有意に抑制されるなら、該処置はその癌の治療に有効であると評価できる。
この種の検査には、癌化した組織に抗癌剤の候補物質を与えてそれが効くか否か、特に実験モデル動物中の病変組織等にそれが効くか否か、癌患者にとって新たな候補抗癌剤が有効であるか否か等の判断が含まれる。また逆に、発癌するように仕組まれた実験モデル動物において発癌が抑制されるか否か、つまり転写レベルの予期される上昇が有意に抑制されたか否かも評価の対象となる。
本明細書において、核酸の「転写レベル」又は「転写量」というときは、一定量の生物試料中の転写産物に由来する当該核酸の存在量を示す。また、核酸は定量のために増幅され又は標識のシグナルレベルを増幅され得るのであるから、測定された核酸の量は、増幅された量又は増幅されたシグナルレベルとしても記述され得る。
本明細書において、「被検核酸」又は「標的核酸」というときは、in vivo又はin vitroのいずれかを問わず、mRNAやsiRNAはもちろんのこと、mRNAを鋳型にして得られるあらゆるタイプの核酸が含まれる。
本明細書において、「生物試料」というときは、器官、組織及び細胞、並びに実験動物由来の器官、組織及び細胞等を示すが、好ましくは組織であり、具体的には、食道、胃、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、小腸、大腸、直腸、結腸、末梢血が例示される。好ましくは大腸、直腸、結腸及び末梢血であり、より好ましくは大腸及び末梢血である。また、本明細書において使用される用語「測定」には、検出、増幅、定量、および半定量のいずれもが包含される。また、本発明の核酸の用途には遺伝子治療も含まれる。
本発明の検定方法は、上記の通り、生物試料の癌化を検定するものであり、ここで「癌化の検定」という用語には、生物試料が発癌しているか否かについての検定のほか、悪性度が高いか否かについての検定も含まれ、医療における癌の診断、治療等に応用することができる。本明細書において使用される用語「癌」には、典型的には、悪性腫瘍全般をいい、該悪性腫瘍による疾病状態を含む。本発明検定方法は、限定されるわけではないが、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、及び結腸癌、末梢血、好ましくは大腸癌、直腸癌、及び結腸癌であり、より好ましくは大腸癌の検定に適している。
(2)新規糖転移酵素をコードする本発明の核酸
本発明はまた、上述の核酸の発見に基づき、新規糖転移酵素タンパク質の全長または断片をコードする核酸を提供する。
本発明の新規糖転移酵素をコードする核酸は、配列番号1に記載の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸、好ましくは配列番号1中の塩基番号76〜1194の塩基配列からなる核酸である。配列番号1の核酸には、配列番号2のアミノ酸配列をコードするものが含まれ、また配列番号1中の塩基番号76〜1194の核酸には、配列番号16及び17のアミノ酸配列をコードする核酸が含まれる。また、コドンの縮重によりそれらと同一のアミノ酸配列をコードする核酸も本発明に含まれる。これら核酸は、例えば癌化検定法への利用に適した核酸であることは既に述べた通りである。
本発明の新規糖転移酵素をコードする核酸は、一本鎖及び二本鎖型両方のDNA、及びそのRNA相補体も含む。DNAには、例えば、天然由来のDNA、組換えDNA、化学結合したDNA、PCRによって増幅されたDNA、及びそれらの組み合わせが含まれる。但し、ベクターや形質転換体の調製時に安定であるとの観点から、DNAであることが好ましい。
本発明の核酸は、例えば以下の方法により調製することが可能である。
先ず公知の糖転移酵素であるβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素のホモログタンパク質をコードする可能性のある候補遺伝子を検索し、そのアミノ酸(ポリペプチド)配列を決定する。すなわち、遺伝子データベースからBLAST等のプログラムを利用してβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子と相同性のある遺伝子を検索すれば、そのホモログタンパク質をコードするものと考えられるヒトゲノムDNA配列(AC011462:Homo sapiens chromosome 19 clone CTC−435M10)およびEST(expressed sequence tag,AW444713)配列などが見出される。
上記のようにして見出された核酸の相補配列又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いてcDNAライブラリーなどから常法に従って核酸増幅反応を行うことで、本発明の核酸を調製することができる。例えば、PCR産物として約1.2kbpのDNA断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりDNA断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離することができる。
また、推定アミノ酸配列(配列番号2)によれば、N末端に膜貫通領域を有することが予測されるので、この膜貫通領域を有しないポリペプチドをコードする塩基配列の領域を調製するとにより、可溶化形態のポリペプチドをコードする本発明の核酸も得ることができる。実際に発明者の実験により、そのアミノ酸配列のN末側から26ないし33番目までを除去して、目的の酵素活性を有するポリペプチドを作製できたことから、配列番号1中の塩基番号76〜1194又は塩基番号97〜1194の塩基配列からなる核酸は、酵素タンパク質の活性ドメイン領域をコードする領域を含むと考えられる。
また、上記ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列番号1に記載の塩基配列に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%以上、さらに好ましくは少なくとも80%、さらになお好ましくは少なくとも%以上、最も好ましくは少なくとも95%の同一性を有する。本発明の核酸は、β1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素タンパク質をコードする核酸であり、配列番号1に記載の塩基配列だけでなく、同様の活性、機能、特性等を有するタンパク質(又はその部分)をコードする核酸であれば、本発明の範囲に含まれる。本発明のタンパク質の活性、特性等については、後述の「(5)本発明のG9酵素タンパク質」に詳述してある。本発明の核酸は、公知のβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素タンパク質をコードする核酸、β1,3GlcNAc転移酵素2遺伝子と最も高い同一性を有し、両者の同一性は全長で31%、活性ドメイン(本発明の配列番号17に相当)で51%である。よって、好ましくは、配列番号1に記載の塩基配列に対して少なくとも55%同一であり、同様の性質を有するβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素タンパク質をコードする核酸は本発明の範囲に含まれる。
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、2つの核酸配列の同一性パーセントは、Devereuxら,Nucl.Acids Res.12:387,1984に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ(UWGCG)より入手可能なGAPコンピュータープログラム、バージョン6.0を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには:(1)ヌクレオチドに関する単一(unary)比較マトリックス(同一に対し1および非同一に対し0の値を含む)、並びにSchwartz及びDayhoff監修,Atlas of Protein Sequence and Structure,pp.353−358,National Biomedical Research Foundation,1979に記載されるような、Gribskov及びBurgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986の加重比較マトリックス;(2)各ギャップに対する3.0のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに0.10のペナルティ;及び(3)末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
(3)本発明のベクター及び形質転換体
本発明によれば、単離した上記核酸を含む組換えベクターが提供される。プラスミド等のベクターに該核酸のDNA断片を組込む方法としては、例えば、Sambrook,J.ら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,1.1(2001)に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット(例えば、宝酒造製等)を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター(例えば、組換えプラスミド)は、宿主細胞(例えば、大腸菌DH5α、TB1、LE392、又はXL−LE392又はXL−1Blue等)に導入される。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Sambrook,J.ら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,16.1(2001)に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
ベクターは、簡単には当業界において入手可能な組換え用ベクター(例えば、プラスミドDNA等)に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、pDONR201、pBluescript、pUC18、pUC19、pBR322等が例示されるが、これらに限定されない。
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、本発明の酵素を発現させたい宿主細胞に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように本発明による発現ベクターは、上記核酸が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域(プロモータ領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等)が適切に配列されており、さらに該核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。また、発現ベクターの構築は、制限処理及び連結作業を必要としない、Gatewayシステム(インビトロジェン社)を用いることもできる。Gatewayシステムとは、PCR産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、DNA断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、PCR産物とドナーベクターとから部位特異的な組換え酵素であるBPクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるLRクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにPCR産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間の係るサブクローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
発現ベクターの種類は、原核細胞及び/又は真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、pQE−30、pQE−60、pMAL−C2、pMAL−p2、pSE420などが好ましく、酵母用発現ベクターとしてpYES2(サッカロマイセス属)、pPIC3.5K、pPIC9K、pAO815(以上ピキア属)、昆虫用発現ベクターとしてpFastBac、pBacPAK8/9、pBK283、pVL1392、pBlueBac4.5などが好ましい。
本発明の上記発現ベクターを宿主細胞に組み込めば、形質転換体を得ることができる。上記宿主細胞は、真核細胞(ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等)であっても原核細胞(大腸菌、枯草菌等)であってもよい。本発明の形質転換体を得るための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト(例えば、HeLa、293T、SH−SY5Y)、マウス(例えば、Neuro2a、NIH3T3)等由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか(例えば、大日本製薬社)、あるいは公共の研究機関(例えば、理研セルバンク)より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
ところで、本発明の核酸はヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、本発明においては真核細胞を本発明の形質転換体の宿主細胞として用いることより天然物に近い性質を有した「本発明酵素」が得られる(例えば糖鎖が付加された態様など)と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、特にほ乳類細胞を選択することが好ましい。ほ乳類細胞としては、具体的には、マウス由来、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスター由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。また、宿主細胞としての大腸菌、酵母又は昆虫細胞は、具体的には、大腸菌(DH5α、M15、JM109、BL21等)、酵母(INVSc1(サッカロマイセス属)、GS115、KM71(以上ピキア属)など)、昆虫細胞(Sf21、BmN4、カイコ幼虫等)などが例示される。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター/オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現ベクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするDNA、エンハンサー配列、所望の遺伝子の5’側および3’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
本発明のベクターにおいて、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン(ATG)が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン(例えば、TAG、TGA、TAAなど)が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全DNA配列を複製することができる能力をもつDNAを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド(天然のプラスミドから調製されたプラスミド)および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E.coliではブラスミドpQE30、pET又はpCAL若しくはそれらの人工的修飾物(pQE30、pET又はpCALを適当な制限酵素で処理して得られるDNAフラグメント)が、酵母ではプラスミドpYES2若しくはpPIC9Kが、また昆虫細胞ではプラスミドpBacPAK8/9等があげられる。
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれSV40に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4 DNAリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なDNAフラグメント(例えば、リンカー、他の制限酵素部位など)を用いることができる。
本発明の発現ベクターの宿主細胞への導入[形質転換(形質移入)]は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌(E.coli,Bacillus subtilis等)の場合は、例えばCohenらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、プロトプラスト法[Mol.Gen.Genet.,168,111(1979)]やコンピテント法[J.Mol.Biol.,56,209(1971)]によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1927(1978)]やリチウム法[J.B.Bacteriol.,153,163(1983)]によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法[Science,227,129(1985)]、エレクトロポレーション法[Nature,319,791(1986)]によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法[Virology,52,456(1973)]、昆虫細胞の場合は、例えばSummerらの方法[Mol.Cell Biol.,3,2156−2165(1983)]によってそれぞれ形質転換することができる。
(4)本発明による酵素タンパク質の単離・精製
近年は遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
本発明に係る酵素タンパク質は、例えば、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養することによって発現(生産)することができる。栄養培地は、宿主細胞(形質転換体)の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素(例えば無機塩(例えば、NaCl、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム)、ビタミン類、抗生物質(例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等)など)を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のpH及び培養時間は、本発明に係るタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
本発明に係るタンパク質は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明に係るタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液(例えば濃度が10〜100mM程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液、MES緩衝液などの緩衝液。pHは用いる緩衝液によって異なるが、pH5.0〜9.0の範囲が望ましい)に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明によるタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、そのタンパク質の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに6×ヒスチジンやGST、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明に係るタンパク質を生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
本発明に係る酵素タンパク質を、糖タンパク質、オリゴ糖または多糖等に作用させることにより、所定の糖残基が転移される。従って、本発明に係る酵素は、糖タンパク質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、この酵素を免疫原として動物に投与することにより、該酵素に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該酵素を測定することが可能になる。従って、本発明による酵素及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。またこの酵素が合成する糖鎖構造は癌細胞で増加していると考えられ、この糖鎖に対する抗体は癌マーカーとして使用可能であると考えられる。糖鎖に対する抗体ではCA19−9などが癌マーカーとして有用であることが周知である。同様に腫瘍抗原となりうる糖鎖構造をG9を使用して合成することができる。
本発明の発現ベクターは、上記のような酵素の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に、酵素活性を有するポリペプチドと標識ペプチドとの融合タンパク質の形態で発現するように構築した本発明による発現ベクターを用いて遺伝子工学的に当該酵素を調製すれば、単離・精製は容易であろう。
上記識別ペプチドの例としては、本発明に係る酵素を遺伝子組み換えによって調製する際に、該識別ペプチドと酵素活性を有するポリペプチドとが結合した融合タンパク質として発現させることにより、形質転換体の生育物から本発明に係る酵素の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とする機能を有したペプチドである。このような識別ペプチドとしては、例えばシグナルペプチド(多くのタンパク質のN末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している15〜30アミノ酸残基からなるペプチド:例えばOmpA、OmpT、Dsb等)、プロテインキナーゼA、プロテインA(黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約42,000のタンパク質)、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ(ヒスチジン残基を6乃至10個並べて配した配列)、mycタグ(cMycタンパク質由来の13アミノ酸配列)、FLAGペプチド(8アミノ酸残基からなる分析用マーカー)、T7タグ(gene10タンパク質の最初の11アミノ酸残基からなる)、Sタグ(膵臓RNaseA由来の15アミノ酸残基からなる)、HSVタグ、pelB(大腸菌外膜タンパク質pelBの22アミノ酸配列)、HAタグ(ヘマグルチニン由来の10アミノ酸残基からなる)、Trxタグ(チオレドキシン配列)、CBPタグ(カルモジュリン結合ペプチド)、CBDタグ(セルロース結合ドメイン)、CBRタグ(コラーゲン結合ドメイン)、β−lac/blu(βラクタマーゼ)、β−gal(βガラクトシダーゼ)、luc(ルシフェラーゼ)、HP−Thio(His−patchチオレドキシン)、HSP(熱ショックペプチド)、Lnγ(ラミニンγペプチド)、Fn(フィブロネクチン部分ペプチド)、GFP(緑色蛍光ペプチド)、YFP(黄色蛍光ペプチド)、CFP(シアン蛍光ペプチド)、BFP(青色蛍光ペプチド)、DsRed、DsRed2(赤色蛍光ペプチド)、MBP(マルトース結合ペプチド)、LacZ(ラクトースオペレーター)、IgG(免疫グロブリンG)、アビジン、プロテインG等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼA、プロテインA、グルタチオンS転移酵素、Hisタグ、mycタグ、FLAGペプチド、T7タグ、Sタグ、HSVタグ、pelB又はHAタグが、遺伝子工学的手法による本発明に係る酵素の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にFLAGペプチド(Asp−Tyr−Lys−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys)(配列番号6)との融合タンパク質として本発明に係る酵素を得るのが、取扱面で極めて優れているため好ましい。上記FLAGペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。4E11と称されるネズミハイブリドーマは、米国特許第5,011,912(これを参照することにより本願明細書の開示に組み込む)に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、FLAGペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。4E11エハイブリドーマ細胞株は、寄託番号HB 9259下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)に寄託されている。FLAGペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Eastman Kodak Co.,Scientific Imaging Systems Division、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のFLAGペプチドとの融合タンパク質として本発明に係る酵素を得ることができる基本ベクターとしては例えばpFLAG−CMV−1(シグマ社製)ある。また、昆虫細胞で発現可能なベクターとしては、pFBIF(pFastBac(インビトロジェン社)にFLAGペプチドをコードする領域を組み込んだベクター:後述の実施例参照)等が例示されるが、当業者であれば、当該酵素の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
(5)本発明のG9酵素タンパク質
上述のように遺伝子工学的手法に基づき、本発明の配列番号1のG9核酸を用いて持定の酵素活性を有するポリペプチドを単離及び精製することができる。
第1に、上記の観点から、本発明のタンパク質の典型的な態様は、配列番号1の核酸配列から推定される配列番号2のアミノ酸配列を有するG9酵素タンパク質である。この酵素タンパク質は、具体的には下記の活性を有する。
触媒反応
その供与体基質からN−アセチル−D−グルコサミン(GlcNAc)をその受容体基質へβ1,3グリコシド結合で転移させ、糖鎖を合成することができる。
供与体基質特異性:
前記N−アセチル−D−グルコサミン供与体基質には、この糖残基を有する糖ヌクレオチド、例えば、ウリジン二リン酸−N−アセチルグルコサミン(UDP−GlcNAc)アデノシン二リン酸−N−グルコサミン(ADP−GlcNAc)、グアノシン二リン酸−N−アセチルグルコサミン(GDP−GlcNAc)、及びシチジン二リン酸−N−アセチルグルコサミン(CDP−GlcNAc)等が含まれる。典型的な供与体基質は、UDP−GlcNAcである。
受容体基質特異性(表5参照):
典型的な受容体基質としては、pNp−α−Glc、pNp−β−Glc、pNp−α−GlcNAc、pNp−β−GlcNAc、pNp−α−Gal、oNp−β−Gal、pNp−α−GalNAc、pNp−α−Xyl、oNp−β−Xyl、pNp−α−Fuc、Bz−α−Man、Bz−α−ManNAc、Bz−β−ラクトシド、GlcNAcβ1−4GlcNAcβ−BZ、Galβ1−4GlcNAcα−pNpのうち、Bz−β−ラクトシド及びGalβ1−4GlcNAcα−pNpに対して有意な活性を示し、特にGalβ1−4GlcNAcα−pNpに対して強い活性を示す。
なお本明細書において、「GlcNAc」はN−アセチル−D−グルコサミン残基を示し、「GalNAc」はN−アセチル−D−ガラクトサミン残基を示し、「ManNac」はN−アセチル−D−マンノサミン残基を示し、「Glc」はグルコサミン残基、「Man」はマンノース残基、「Gal」はガラクトース残基、「Bz」はベンジル基を示し、「pNp」はパラニトロフェニル基を示し、「oNp」はオルトニトロフェニル基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式中の数字は前記グリコシド結合が存在する糖環の炭素番号を示す。また「α」及び「β」は糖環1位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、5位CH2OH又はCH3との位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す)。
したがって、本発明のG9酵素タンパク質は、例えば次式の反応を触媒する。
UDP−GlcNAc+Galβ1−4GlcNAcα−R →
UDP+GlcNAcβ1−3Galβ1−4GlcNAcα−R
(Rは、当該GlcNAc残基を有する糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖、又は多糖等である)
また本発明のG9酵素タンパク質は、オリゴ糖(例えば2アミノピリジン化オリゴ糖)或いはオリゴ糖残基を有する糖タンパク質に対し、前記転移活性を示す。特にN結合型糖鎖の非還元末端に前記オリゴ糖鎖残基を4本鎖で有する基質に対し有意に強い活性或いは選択的に有意な活性を示す(図3及び図4参照)。
至適緩衝液及び至適pH(図2A参照):
カコジル酸ナトリウム緩衝液とHEPES緩衝液のいずれにおいても上記触媒作用を有する。概して中性又はその付近での活性が高い。各緩衝液での活性のpH依存性については、カコジル酸ナトリウム緩衝液ではpH6.4〜7.2の中性域でpHが大きくなるに伴って活性が上昇し、HEPES緩衝液ではpH7.0付近で最大の活性を示す。
二価イオンの要求性(図2B参照):
ヒトG9タンパク質の活性は、二価の金属イオンのうち、少なくともMnイオン又はCoイオンの存在下で有意に増強され、特にMnイオンでは顕著に増強される。これらの増強活性は、イオンの低濃度域で急速に上昇し、それ以降は漸次低下する。また、CdイオンやNiイオンでは低濃度域で僅かな増強効果があるが、MgイオンやZnイオンでは増強効果が実質的に見られない。また通常、糖転移酵素のうち二価イオンを要求するものの多くは、Mnイオンの存在下で反応が増強される。
上述のように本発明のG9酵素タンパク質は、上記所定の酵素反応条件下でGlcNAc残基を特定の糖鎖にβ1,3グリコシド結合で転移させることができるので、糖タンパク質などの糖鎖合成ないし修飾反応に有用である。
第2に、本明細書において、上記酵素タンパク質の1次構造を代表する配列番号2に記載のアミノ酸配列が開示されたことで、これらアミノ酸配列に基づき当該技術分野の周知の遺伝子工学的手法により産生され得るあらゆるタンパク質(以下、「変異タンパク質」ないし「修飾タンパク質」とも記述する)が提供される。すなわち、本発明の酵素タンパク質は、当該技術分野の技術常識によれば、配列番号2の推定アミノ酸配列からなるタンパク質のみに限定されず、下記で説示されるように、例えば、アミノ酸配列N末端側等が部分的に欠失した不完全長のポリペプチドからなるタンパク質、或いはそれらアミノ酸配列に相同なタンパク質であって、当該タンパク質の生来的な特性を有するタンパク質をも含まれると意図される。
先ず、本発明のヒトG9酵素タンパク質は、後述の実施例で得られたように、好ましくは、配列番号16に記載のアミノ酸配列(配列番号2中のアミノ酸番号26からC末端までのアミノ酸配列)、より好ましくは、配列番号17に記載のアミノ酸配列(配列番号2中のアミノ酸番号33からC末端までのアミノ酸配列)であり得る。
また、一般に酵素のような生理活性を有するタンパク質においては、上記アミノ酸配列のうち、1若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に1若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持され得ることは周知である。また、天然産のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型(ecotype)の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、1個〜複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することも知られている。この観点から、本発明のタンパク質には、配列番号2、16又17に示される各アミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に1若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、上記所定の酵素反応条件下でGlcNAc残基をGal残基にβ1,3グリコシド結合で転移する活性を有する変異タンパク質も含まれる。さらに、前記修飾タンパク質としては、配列番号2に示される各アミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に1若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。
上記において「複数個」とは、好ましくは1〜200個、より好ましくは1〜100個、さらにより好ましくは1〜50個、最も好ましくは1〜20個である。一般的には、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性は保持される程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、好ましくは1〜10個である。
また、本発明の修飾タンパク質には、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換で得られる修飾タンパク質が含まれる。すなわち、一般に同様の性質を有するアミノ酸同士の置換(例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換)を導入して所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、そのようにして得られた修飾タンパク質は元来のタンパク質と同様の性質を有することが多い。この観点から、そのようにアミノ酸置換された修飾タンパク質も本発明に含まれる。
また、本発明の修飾タンパク質は、上述した通りのアミノ酸配列を有し且つ目的酵素に生来的な酵素活性を有するものであれば、当該ポリペプチドに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。
また、本発明の相同タンパク質の範囲を特定するに当たり、本発明のアミノ酸配列についてGENETYX(ゼネティックス社)による同一性検索を行うと、そのアミノ酸配列は、公知のβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素2タンパク質と最も高い同一性を有し、両者の同一性は全長で37%、活性ドメイン(配列番号17に相当)で39%であることが分かる。この観点から、本発明の相同タンパク質として好適なアミノ酸配列は、概して、配列番号2、16又は17に示されるアミノ酸配列と少なくとも40%の同一性、より好ましくは少なくとも50%の同一性、特に好ましくは少なくとも60%の同一性を有するとよい。これら同様の性質を有するβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素タンパク質は本発明の範囲に含まれる。
なお、前記GENETYXは、核酸解析、タンパク質解析用の遺伝情報処理ソフトウェアであって、通常のホモロジー解析やマルチアラインメント解析の他、シグナルペプチド予測やプロモーター部位予測、二次構造予測が可能である。また、本明細書で用いたホモロジー解析プログラムは、高速・高感度な方法として多用されているLipman−Pearson法(Lipman,D.J.& Pearson,W.R.,Science,277,1435−1441(1985))を採用している。
本願明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Altschulら(Nucl.Acids.Res.,25.3389−3402(1997))に記載されているBLASTプログラム、あるいはPearsonら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2444−2448(1988))に記載されているFASTAを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information(NCBI)、あるいはDNA Data Bank of Japan(DDBJ)のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件(パラメーター)は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた使用可能である。
第3に、本発明の単離されたタンパク質は、後述のように、これを免疫原として動物に投与することによって該タンパク質に対する抗体を作製することができる。そのような抗体を用いて免疫測定法により当該酵素を測定、定量することができる。従って、本発明は、そのような免疫原の作製にも有用である。この観点からは、本発明のタンパク質には、抗体形成を引き出すための抗原決定基又はエピトープを含む、該タンパク質のポリペプチド断片、変異体、融合タンパク質なども含まれる。
(6)本発明に係るタンパク質を認識する抗体
本明細書において、本発明の核酸によりコードされる糖転移酵素タンパク質に免疫反応性である抗体が提供される。こうした抗体は、(非特異的結合と対照的に)抗体の抗原結合部位を介して、該糖転移酵素タンパク質に特異的に結合する。したがって、上述のような、配列番号2、16又は17のタンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でも高次構造的(conformational)(断続的)でもどちらでもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定してもよい。
したがって、本発明の1つの側面は、本発明の核酸によりコードされる糖転移酵素タンパク質の抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明に係る糖転移酵素タンパク質のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、タンパク質の化学的または酵素的切断などの、当該技術分野に公知の技術を用いて、あるいは組換えDNA技術を用いて、産生することが可能である。
前記糖転移酵素タンパク質によって誘導される可能性がある抗体に関しては、該タンパク質の全部若しくは一部が単離されていても、またはエピトープが単離されていても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術によって調製することが可能である。例えば、Kennetら(監修),Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Press,New York,1980を参照されたい。
本発明の糖転移酵素タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための1つの方法は、動物を該糖転移酵素タンパク質で免疫し;免疫された動物から脾臓細胞を採取し;前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し;そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。
本発明に係るモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術によって調製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供してもよい。
慣用的技術によって産生可能な、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、FabおよびF(ab’)2断片が含まれる。遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
本発明に係る抗体は、in vitro又はin vivoいずれかで、前記糖転移酵素タンパク質または断片の存在を検出するアッセイで用いることが可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
さらに、結合パートナー、例えば受容体基質への前記糖転移酵素タンパク質の結合を遮断することが可能な抗体を用いて、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害することが可能である。こうした遮断抗体は、受容体基質を発現している特定の細胞への該タンパク質の結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて、同定してもよい。あるいは、遮断抗体は、標的細胞の結合パートナーに結合している本発明に係る酵素から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定することが可能である。
こうした抗体を、in vitro法で使用するか、又はin vivoで投与して、抗体を生成した実体によって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。したがって、本発明の糖転移酵素タンパク質と結合パートナーとの相互作用によって、(直接または間接的に)引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、結合パートナー仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、ほ乳動物にin vivo投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。1つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。
(7)マウスG9の発見、及び遺伝子操作動物の作製
上記ヒトG9の発見に伴い、本発明者は、遺伝子データベースからBLAST検索等を用いて検索した結果、ヒトG9のマウスオーソログの存在を突き止めた(配列番号18〜20)。
マウスG9核酸は、全長で1845塩基長の配列(配列番号18)中に1170塩基長のORF(配列番号19)として見出された。このORFには389個のアミノ酸残基からなるマウスのβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン転移酵素タンパク質のアミノ酸配列(配列番号20)がコードされていると推定される。本願明細書においてヒトG9に関してなされたあらゆる検討及び考察は、マウスG9についても同様に適用され得る。
本発明は、上記マウスG9の発見に基づき、受精卵やES細胞を用いた各種遺伝子変換技術に基づく動物個体レベルでのG9の発現・機能解析の手段、典型的にはG9遺伝子を導入したトランスジェニック動物、及びマウスG9を欠損させたノックアウトマウスをも提供する。
例えば、ノックアウトマウスの作製は、当該技術分野における常法に従って行うことができる(ジーンターゲティングの最新技術 八木健編集 羊土社:ジーンターゲティング 野田哲生監訳 メディカル・サイエンス・インターナショナル社等を参照すればよい)。すなわち、当業者であれば、本願において開示されたマウスG9核酸配列情報を利用し、公知のジーンターゲティング法に従ってmG9の相同組換えES細胞を取得することができ、これを用いてG9ノックアウトマウスを作製することができる(実施例6参照)。
また、最近ではsmall interfering RNA法により遺伝子発現を抑制する方法が開発されており(T.R.Brummelkamp et al.,Science,296,550−553(2002))、このような公知の方法に従いG9ノックアウトマウスを作製することもできる。
G9ノックアウトマウスを提供することは、特定の生命現象へのG9遺伝子の関与、すなわち、当該遺伝子の重複性に関する情報のほか、当該遺伝子欠損と個体レベルでの表現型(運動、知能、感覚機能に関するあらゆるタイプの異常が含まれる)との関係、さらには発生、成長、老化といった個体のライフサイクルにおける当該遺伝子の機能の解明に役立つであろう。より詳細には、上記の方法により得られるノックアウトマウスを用いてG9およびmG9が合成する糖鎖のキャリアの検出および生理的機能、疾患との関連等について検討することができる。例えば、ノックアウトマウスより摘出した各組織より糖蛋白質および糖脂質を抽出し、プロテオミックス等の技法(例えば二次元電気泳動、二次元薄層クロマトグラフィ、質量分析等)により野生型マウスと比較することで、合成された糖鎖のキャリアを同定できる。また、ノックアウトマウスと野生型マウスの表現系(例えば、胎児形成、発育過程、自発行動等)を比較することにより生理的機能や疾患との関連を推定することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
遺伝子データベースから、Blast〔Altschul et al.,J.Mol.Biol.215,403−410(1990)〕、FASTA法、PSI−BLAST法、FrameSearch法〔Compugen社製〕等のプログラムを利用して、β1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子と相同性のある遺伝子または本酵素とアミノ酸レベルで相同性を有するタンパク質をコードする可能性のある遺伝子を検索した結果、ヒトゲノムDNA配列(AC011462:Homo sapiens chromosome 19 clone CTC−435M10)およびEST(AW444713)配列などを見出した。この配列がコードするポリペプチドは、β1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素のホモログタンパク質と考えられ、これをG9と命名した。
以下では、特に断らない限り、遺伝子操作的手法としてモレキュラー・クローニング第2版に記載されている公知の方法を用いた。
大腸癌細胞株colo205よりRNAをRNeasy Mini Kit(キアゲン社製)で抽出し、Super−Script First−Strand Synthesis System(インビトロジェン社製)を用いたoligo(dT)法によりsingle strand DNAとした。このDNAを鋳型とし、5’プライマー(配列番号3)および3’プライマー(配列番号4)を用いてPCRを行った。PCRの条件は94℃ 30秒、65℃ 1分、72℃ 1分を25サイクルとした。PCRにより得られたDNA断片は制限酵素サイトとしてORFの開始コドンの5’側にHindIIIをストップコドンの3’側にEcoRIを有する。
このDNA断片とpBluescriptRSKII(−)(TOYOBO社製)を各々制限酵素であるHindIII及びEcoRIにより処理した後、反応液を混合しライゲーション反応を行うことでpBluescriptRSKII(−)にG9のそのORFを導入した。反応液をエタノール沈殿法により精製した後、コンピテントセル(大腸菌DH5α)と混合し、ヒートショック法(42℃、30秒)を行い、IPTGおよびX−galを含むLB寒天培地に播いた。翌日白い単独コロニーを更に培養し、プラスミドDNAを回収した。
回収されたプラスミドDNAに目的の核酸配列が含まれていることを確認し、塩基配列を決定した(配列番号1)。その塩基配列中の予測されるオープンリーディングフレーム(ORF)は1194bpであり、また予測アミノ酸配列にして397アミノ酸(配列番号2)からなる。そのN末端に糖転移酵素の特徴である疎水アミノ酸領域を有する。該核酸配列および該アミノ酸配列からなるものをG9と命名した。
G9が組み込まれる上記pBluescriptRII SK(−)は、クローニング操作やシーケンシング操作をより簡便に行うために開発された多機能ベクターであり、従来のpUCやM13ベクターの機能以外に、様々な改良がなされている。pUCベクターと同様に、LacZ遺伝子中にマルチクローニングサイトがあるため、インサートが入ったプラスミドを、XL1−Blue MRF’やJM109などのlacZΔM15の遺伝子型を持つ大腸菌を形質転換すれば、IPTG/X−gal添加プレートで白色コロニーを形成し、インサートの有無を簡単に判定できる。また、マルチクローニングサイトは、21個の制限酵素サイトからなるポリリンカーを有するため、Exo/Mung Systemによりデリーション変異体を作製する場合、使用する制限酵素の選択の幅が広くなっている。組み込まれたG9遺伝子は、LacZオペレーター/プロモーターによって、lacIq変異を持つ大腸菌内で発現を調節でき、IPTGを培地に添加することによって、目的タンパク質を大腸菌に産生させることができる。さらに、そのマルチクローニングサイトの両側には、T3およびT7のプロモーターがあるので、これらのプロモーターによるRNAプローブの作製も可能である。それら両プロモーター配列の両端にはBssHIIサイトがあり、これを利用して挿入DNAをプロモーター配列ごと切り出すことができる。両プロモーターのプローブを利用してジーンマッピングを行うことも可能である。このようなベクターには、f1ファージの複製開始領域が含まれており、VCSM13やR408ヘルパーファージの感染により、一本鎖DNAを産生させ、シーケンスやSite Specific Mutagenesisに使用できる。ヘルパーファージの感染によりアンチセンス側の鎖がレスキューされる。
実施例2 ヒト大腸癌組織における本発明DNAの発現量
定量的リアルタイムPCR法を用いて同一患者の正常及び大腸癌組織でG9遺伝子の発現量を比較した。
定量的リアルタイムPCR法とはPCRにおいてセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーに加え、蛍光標識されたプローブを組合わせる方法である。PCRにより増幅する際、プローブの蛍光標識が外れて蛍光を示す。蛍光強度が遺伝子の増幅に相関して増幅するためこれを指標として定量を行う。
ヒト大腸癌組織と同一患者の正常及び大腸癌組織のRNAをRNeasy Mini Kit(キアゲン社製)で抽出し、Super−Script First−Strand Synthesis System(インビトロジェン社製)を用いた。oligo(dT)法によりsingle strand DNAとした。このDNAを鋳型として用いて5’プライマー(配列番号5)、3’プライマー(配列番号6)及びTaqManプローブ(配列番号7)を用いて、ABI PRISM 7700(アプライドバイオシステムズジャパン社製)により定量的リアルタイムPCRを行った。PCRの条件は、50℃ 2分、95℃ 10分で反応させた後、95℃ 15秒、60℃ 1分を50回繰り返した。得られた測定値は、個体間のばらつきを補正するため内標準遺伝子としてアプライドバイオシステムズジャパン社製のキットを用いて定量したβ−actinにより除し、ヒト大腸癌組織の測定値と、同一患者の正常及び大腸癌組織の測定値との間で比較を行った。
その結果、癌化していない組織において本発明DNAの転写産物は存在しないか測定限界以下であり、癌化した組織においては本発明DNAの転写産物が有意に存在していることが明らかとなった(表3参照)。
ヒト末梢血における本発明DNAの発現量
定量的リアルタイムPCR法を用いて、健常者と大腸癌患者とで末梢血におけるG9遺伝子の発現量を比較した。
健康なボランティアおよび大腸癌患者よりPAXgene blood RNA tube(PreAnalytix社製)に採血した。tube内の試薬と転倒混和し、24時間室温において反応させた後、RNAをPAXgene blood RNA kit(PreAnalytix社製)で抽出した。Super−Script First−Strand Synthesis System(インビトロジェン社製)を用い、添付のrandom primersにてcDNAを合成した。このDNAを鋳型として用いて、5’プライマー(配列番号4)、3’プライマー(配列番号5)及びTaqManプローブ(配列番号6)を用いて、ABI PRISM 7700(アプライドバイオシステムズジャパン社製)により定量的リアルタイムPCRを行った。PCRの条件は、50℃ 2分、95℃ 10分で反応させた後、95℃ 15秒、60℃ 1分を50回繰り返した。得られた測定は、個体間のばらつきを補正するため内標準遺伝子としてアプライドバイオシステムズジャパン社製のキットを用いて定量したβ−actinにより除し、健常者と大腸癌患者との間で比較を行った。
その結果、健常者に比較して大腸癌患者の末梢血における本発明DNAの転写レベルは有意に上回っていることが明らかとなった。大腸癌患者のうち、健常者の平均測定値+(標準偏差×2)を超えるものを陽性と判断する場合、大腸癌患者の陽性率は67%であった(表4参照)。
各種のヒト正常組織における本発明DNAの発現量
上記と同様にして、定量的リアルタイムPCR法を用いてヒト正常組織由来の本発明DNAの発現量(cDNA)を比較した。これらの組織のRNAはクロンテック社などにより市販されている。cDNA合成はSuper−Script First−Strand Synthesis System(インビトロジェン社製)を使用した。ただし、内部標準の検量線の作成においてはGAPDH(グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ)遺伝子を含むpCR2.1(Invitrogen)DNAを用いた。G9の検量線の作成においてはクローニングしたG9核酸のORFを含むpBluescript RSKII(−)ベクターDNAを使用した。
その結果、ほとんどのヒト正常組織において本発明DNAの発現が認められる。なかでも骨髄、脾臓、小腸で比較的発現が高いが、大腸や前立腺で発現が非常に弱いか或いは実質的に発現していないことが明らかとなった(図1参照)。
実施例3 単離されたG9全長の発現
pBluescript RSKll(−)にG9を組込んだプラスミドDNAおよびpcDNA3.1(インビトロジェン社製)を各々制限酵素であるHindIIIおよびEcoRIにより処理した後、反応液を混合しライゲーション反応を行うことでpcDNA3.1(+)にG9のORFを導入した。反応液をエタノール沈澱法により精製した後、配列を確認しpcDNA3.1(+)にG9が導入されたことを確認し、これをpcDNA3.1(+)−G9とした。pcDNA3.1(+)−G9をコンピテントセル(大腸菌DH5α)と混合し、ヒートショック法(42℃、45秒)を行い、アンピシリンを含むLB寒天培地に播いた。翌日単独コロニーを更に培養し、プラスミドDNAを回収した。回収したプラスミドDNAに目的の核酸配列が含まれていることを確認し、塩基配列を決定した。
pcDNA3.1(+/−)は、広範囲な哺乳類細胞の発現用ベクターである。forward転写用ベクターであり、発現レベルを上げるため従来のpcDNA3.1を改良してマルチクローニングサイト(MCS)配列からRNAの二次構造を形成する可能性のある配列を除去している。CMVのエンハンサー/プロモーターがあり高いレベルでの発現が可能である。ポリアデニル化シグナルと転写終結配列によりRNAが安定化される。SV40オリジンがあるため、SV40 Large T抗原を発現している細胞で複製が可能である。大腸菌での選択用にアンピシリン抵抗性遺伝子が導入されている。また、哺乳類細胞において安定株を作製するための選択用としてネオマイシン抵抗性遺伝子が導入されている。
ヒト大腸癌由来細胞株であるHCT15細胞を用いてG9発現安定株を作製するため、以下の操作を行った。HCT15細胞2×106個を抗生物質を含まない10%ウシ胎児血清入りRPMI−1640培地10mlにて懸濁し、10cmディッシュに播き、16時間37℃にてCO2インキュベーターで培養した。pcDNA3.1(+)−G9のプラスミドDNA20ng及びLipofectamin2000(インビトロジェン社製)30μlをOPTI−MEM(インビトロジェン社製)1.5mlと各々混和し、室温にて5分間インキュベーションした。更に2つの液を綬やかに混和し、室温にて20分間インキュベーションした。この混合液をディッシュに滴下し、48時間37℃にてCO2インキュベータにて培養した。定法により細胞を継代した。このとき培地はRPMI−1640(インビトロジェン社製)を用い、ウシ胎児血清および抗生物質としてペニシリン(インビトロジェン社製)、ストレプトマイシン(インビトロジェン社製)およびジェネチシン(ネオマイシン、インビトロジェン社製)を添加した。ジェネチシンを添加することによりpcDNA3.1(+)−G9が導入されていない細胞は死滅していくので、培養を続けることでpcDNA3.1(+)−G9が導入された細胞のみが生存することになる。これをG9発現安定株とした。
哺乳類細胞株におけるG9組換えタンパク質の発現
G9の組換えタンパク質を得るためにヒト腎臓由来細胞株293Tで発現させた。機能を確認するには、少なくともβ1,3GlcNAc転移酵素およびβ1,3Gal転移酵素と比較的相同性が保たれている配列番号2中の105番アミノ酸からC末端までの活性領域を発現させれば十分であると考えられるが、ここではG9の24番アミノ酸及び33番アミノ酸からC末端までの2種類の予測活性領域を発現させることとした。
pBluescriptR SKll(−)にG9を組込んだプラスミドDNAを鋳型とし、5’プライマー(配列番号8及び配列番号9)と3’プライマー(配列番号10)を用いてPCR反応を行い目的のDNA断片を得た。PCR法は94℃ 30秒、65℃ 1分、72℃ 1分を25サイクルとした。そして、PCR産物をアガロースゲル電気泳動し、ゲル切り出し法でゲルを切り出して定法により単離した。このPCR産物は制限酵素サイトとして5’側にHindIII、3’側にEcoRIを有していた。このDNA断片とpFLAG−CMV3を各々制限酵素であるHindIII及びEcoRIにて処理した後、反応液を混合し、ライゲーション反応を行うことでpFLAG−CMV3に導入した。反応液をエタノール沈殿法により精製した後、コンピテントセル(大腸菌DH5α)と混合し、ヒートショック法(42℃、45秒)を行い、アンピシリンを含むLB寒天培地に播いた。
翌日得られたコロニーを、直接PCRで目的DNAを確認した。さらに確実を期すためシーケンシングによりDNA配列の確認をした後、ベクター(pFLAG−CMV3)を抽出・精製した。
ヒト腎臓細胞由来細胞株293T細胞2×106個を抗生物質を含まない10%ウシ胎児血清入りのDMEM培地10mlにて懸濁し、10cmディッシュに播き、16時間37℃にてCO2インキュベーターにて培養した。pFLAG−CMV3−G9の20ng及びLipofectamin2000(インビトロジェン社製)30μlを。OPTI−MEM(インビトロジェン社製)1.5mlと各々混和し、室温にて5分間インキュベーションした。更に2つの液を緩やかに混和し、室温にて20分間インキュベーションした。この混合液をディッシュに滴下し、48時間37℃にてCO2インキュベータにて培養した。
培養上清10mlにNaN3(0.05%)、NaCl(150ml)、CaCl2(2ml)、抗FLAG M1アフィニティーゲル(シグマ社製)(100μl)を混合し、4℃で一夜撹拌した。翌日遠心して(3000rpm 5分、4℃)ペレットを回収し、2mlのCaCl2・TBSを900μl加えて再度遠心分離(2000rpm5分、4℃)し、ペレットを200μlの1mlCaCl2・TBSに浮遊させ活性測定のサンプル(G9酵素液)とした。この一部をSDS−PAGEによる電気泳動について抗FLAG M2−ペルオキシダーゼ(シグマ社製)を用いてウェスタンブロッティングを行い、目的とするG9タンパク質の発現を確認した。その結果、約45kDaの位置にバンドが検出、発現が確認された。
昆虫細胞株におけるG9組換えタンパク質の発現
G9の組換えタンパク質を得るためにG9を昆虫細胞内で発現させた。機能を確認するには、少なくともβ1,3GlcNAc転移酵素およびβ1,3Gal転移酵素と比較的相同性が保たれている配列番号2中の105番アミノ酸からC末端までの活性領域を発現させれば十分であると考えられるが、ここではG9の36番アミノ酸からC末端までの予測活性領域を発現させることとした。
pBluescriptR SKll(−)にG9を組込んだプラスミドDNAを鋳型とし、5’プライマー(配列番号11)と3’プライマー(配列番号12)を用いてPCR反応を行い目的のDNA断片を得た。PCR法は94℃ 30秒、65℃ 1分、72℃ 1分を25サイクルとした。そして、PCR産物をアガロースゲル電気泳動し、ゲル切り出し法でゲルを切り出して定法により単離した。このようにして単離したPCR産物をBPクロナーゼ反応によってpDONR201(商標)(インビトジェン社製)へ組み込んで「エントリークローン」を作成した。
反応は上記PCR産物2μl、pDONR201 1μl(150ng)、BP反応緩衝液2μl、トリス−EDTA緩衝液(pH8.0:以下「TE」とも略記する)3μl、BPクロナーゼmix2μlを25℃で1時間インキュベーションして行った。その後、プロテイナーゼK(科研製薬株式会社製)を1μl加えて37℃、10分間インキュベートして反応を終了させた。その反応混合液11μlをコンピテントセル(大腸菌DH5α)100μlと混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシンを含むLBプレートに播いた。翌日コロニーを回収し、PCR法で目的DNAが導入されていること及びその塩基配列を確認し、挿入されたベクター(pDONR−G9)を常法に従って抽出、精製した。このベクターに挿入されたDNAの塩基配列は、配列番号1記載の塩基配列を含むことが確認された。
発現クローンの調製
上記エントリークローンは、挿入部位の両端にλファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるattLを持つもので、LRクロナーゼ(λファージの組換酵素Int、IHF、Xisを混合したもの)とデスティネーションベクター(attRを有する)とを混合することで、挿入部位がデスティネーションベクターに移り、発現クローンが作成された。
1μlのエントリークローン(pDONR−G9)、0.5μlのデスティネーションベクター(pFBIF(75ng))、LR反応緩衝液2μl、TE4.5μl、LRクロナーゼミックス(λファージの組換え酵素Int、IHF、及びXisを混合した溶液)2μlを25℃で1時間インキュベートし、プロテイナーゼK(科研製薬株式会社製)を1μl加えて37℃で10分間インキュベートして反応を停止させた(この組換反応でpFBIF−G9が生成される)。pFBIFはpFastBac1(インビトロジェン社製)にIgκシグナル配列と精製用のFLAGペプチドとを常法に従って挿入した。さらに、pFBIFにGateway配列(attR)を挿入するため、Gateway Vector Conversion System(インビトロジェン社)を用いて変換カセットを挿入した。この変換カセットは、発現ベクターをデスティネーションベクターに改変するためのカセットであり、attR組換え部位、クロラムフェニコール耐性遺伝子、及び大腸菌DNA gyraseを阻害するタンパク質をコードするccdB遺伝子を有する。また、Igκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、FLAGタグは精製を容易とするために挿入された。
pFBIF−G9が含まれる反応混液(11μl)とコンピテントセルである大腸菌DH5α 100μlとを混合し、ヒートショック法による形質転換の後、アンピシリンをで含むLB培地に組換DH5αを蒔いて培養した。24時間培養後、コロニーを回収し、QIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社製)によりプラスミド(pFBIF−G9)を抽出精製した。PCR法で目的DNAが挿入されていることを確認した。
Bac−to−Bacシステム(インビトロジェン社製)によるバクミドの調製
続いてBac−to−Bacシステム(インビトロジェン社製)を用いて上記pFBIF−G9とバクミドとの間で組換を行い、昆虫細胞中で増殖可能なバクミドにG9の配列を挿入した。このシステムは、Tn7の組換部位を利用し、バクミドを含む大腸菌(大腸菌DH10Bac(商標))に目的遺伝子を挿入させたpFastBac(即ち、pFBIF−G9)を導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生させる組換えタンパク質によって目的とする遺伝子(G9)がバクミドに取り込まれるシステムである。またバクミドにはLacZ遺伝子が含まれており、古典的なコロニーの色(青(挿入なし)−白(挿入あり))による選択が可能である。
すなわち、上記精製ベクター(pFBIF−G9)50μlとコンピテントセル(大腸菌DH10Bac)50μlとを混合し、ヒートショック法による形質転換の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、5−ブロモインドリルβ−D−ガラクトピラノシド(Bluo−gal)、及びイソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を含むLB培地に蒔き、24時間後にバクミドに目的DNAが挿入された白い独立したコロニーを回収し、更に培養を行った後、常法に従ってバクミドを回収した。
バクミドの昆虫細胞への導入
回収したバクミドに目的DNAが挿入されていることを常法に従って確認し、バクミドを昆虫細胞(Sf21:インビトロジェン社製)に導入した。すなわち35mmのシャーレにSf21細胞9×105個/2mlに抗生物質を含むSf900SFM培地(インビトロジェン社製)を添加し、27℃で1時間細胞を接着させた。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して、lipid−DNA complexes溶液(A溶液(100μlのSf−900SFMに上記バクミド5μlを添加した混合物)とB溶液(100μlのSf−900SFMに6μlのCellfectin Reagent(インビトロジェン社製)を添加した混合物)とを丁寧に混合して30分間程度室温でインキュベートして得た溶液)にSf900II(インビトロジェン社製)800μlを添加した培養液を添加して27℃で5時間インキュベーションした。その後、培地を除去し、抗生物質を含むSf900SFM培地2mlを添加し、27℃で72時間インキュベートした。培養後ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収して1000×gで10分間遠心処理を行い、上清を回収した(この上清を「一次ウイルス液」とする)。
更にT75培養フラスコにSf21細胞1×107個/20mlSf−900SFM(抗生物質を含む)を添加し、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接着した後、一次ウイルス液800μlを添加し、27℃で48時間培養する。培養後、ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収した。これを1000×gで10分間遠心処理を行い、上清を回収した(この上清を「二次ウイルス液」とする)。
さらに、T75培養フラスコにSf21細胞1×107個/20mlSf−900SFM(抗生物質を含む)を添加し、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接着した後、二次ウイルス液1000μlを添加し、27℃で84時間培養した。培養後、ピペッティングにより細胞を遊離させ、細胞と培養液を回収した。これを1000×gで10分間遠心処理を行い、上清を回収した(この上清を「三次ウイルス液」とする)。
さらに、Sf21細胞を6×105個/mlの濃度で含むSf−900SFM(抗生物質を含む)を100ml用スピナーフラスコに100μl添加し、三次ウイルス液1mlを添加し、27℃で96時間培養した。培養後、細胞と培養液を回収した。これを1000×gで10分間遠心処理を行い、上清を回収した(この上清を「四次ウイルス液」とする)。
四次ウイルス液10mlに対し、NaN3、NaCl及びCaCl2を加えた。終濃度はNaN3を0.05%、NaClを150mM、CaCl2を2mMとする。抗FLAG M1抗体アフィニティーゲル(シグマ社製)を50μl添加し、4℃で16時間緩やかに転倒混和した。遠心分離(1,000×g、3分、4℃)して上清を除去した後、1mMのCaCl2を含むTBS(トリス−塩酸緩衝液:pH7.4)で2回洗浄した。そして洗浄後のアフィニティーゲルを1mMのCaCl2を含むTBS(pH7.4)200μlに懸濁して、この懸濁液を活性測定用のG9酵素液とした。
実施例4 哺乳動物細胞発現系によるG9酵素タンパク質の作製
(1)分泌型G9ポリペプチド組換え体の作製
上記の実施例で示したように、ポリペプチドのN末側を欠損させて構築されたG9ポリペプチドは、昆虫細胞等内でタンパク質として発現可能であることが確認された。同様にしてN末側を欠損させ、FLAGペプチド融合型G9ポリペプチドとして構築されたタンパク質は、哺乳類細胞発現系により活性を有する酵素タンパクとして単離、精製することもできる。
G9核酸のORFのうち、酵素タンパク質の触媒領域と考えられる部分は、pBluescriptR SKII(−)にG9を組込んだプラスミドDNAを鋳型とし、配列番号13又は14のいずれかの核酸配列を有する5’プライマーと、配列番号15の核酸配列を有する3’プライマーを用いてPCR反応により得ることができた。PCR法はPfx Taq DNAポリメラーゼ(インビトロジェン社製)を用いて計50μl反応液中、鋳型5ngの存在下で、94℃15秒、60℃30秒、68℃1分を25サイクルとした。そしてPCR産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、ゲル切り出し法でゲルを切り出して定法により単離した。
配列番号13の5’プライマーと配列番号15の3’プライマーを用いたPCR反応により、配列番号1の塩基番号76〜1194の核酸配列を有する組換えDNA断片が得られた。これは、配列番号2中のアミノ酸番号26〜397をコードするもの、すなわち配列番号16のアミノ酸配列をコードするものに相当する。
また、配列番号14の5’プライマーと配列番号15の3’プライマーを用いたPCR反応により、前記のDNA断片よりも少し短い配列の組換えDNA断片が得られた。これは、配列番号1の塩基番号97〜1194であり、配列番号2中のアミノ酸番号33〜397、すなわち配列番号17のアミノ酸配列をコードするものに相当する。これら組換えDNA断片から発現したポリペプチドは、いずれも酵素活性を有していることを確認したが、以下の実験では、配列番号13と配列番号15のプライマーを組み合わせて得られる長い方のDNA断片を使用した。
上記のようなG9ポリペプチドの開始メチオニンが除去された領域にプレプロトリプシンのシグナル配列及びFLAGペプチド(Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys)を付加することによりFLAGペプチド融合型G9ポリペプチドの分泌発現を試みることができる。すなわち、上記プライマーにて増幅したDNA断片を制限酵素Hind IIIとEcoR Iにて消化した後にDNA精製、pFLAG−CMV3(Invitrogen,Carlsbad,CA)ベクターのクローニング部位のHind III−EcoR I間に挿入しライゲーション反応を行うことで、pFLAG−CMV3−G9を造成した。反応液をエタノール沈殿法により精製した後、コンピテントセル(大腸菌DH5α)と混合し、ヒートショック法(42℃、45秒)を行い、アンピシリンを含むLB寒天培地に播いた。翌日得られたコロニーは直接PCRにより目的DNAが含まれていることが確認された。さらに確実を期すためシーケンシングによりプラスミドDNAの配列の確認をした後、ベクター(pFLAG−CMV3−G9)を抽出・精製した。得られた組換えDNAは、後述のように酵素タンパク質として発現させて精製することができ、その活性を確認できる。ここでコンピューター予測や、予備実験等により、おそらく触媒領域は膜貫通型でも分泌型でも同じエクソン(配列)であることが分かっており、またN末側は、膜貫通領域などで、とりあえずの活性の確認には必要ない領域であるため、上記のような配列部分を使用した。
前述のように作製したpFLAG−CMV3−G9プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクトして培養上清中にFLAGペプチド融合型G9ポリペプチドを発現・分泌させた。トランスフェクトの方法はLipofectamine2000(インビトロジェン社製)を用いて付属説明書に則って行った。具体的にはヒト腎臓細胞由来細胞株293T細胞2×106個を抗生物質を含まない10%ウシ胎児血清入りのDMEM培地10mlにて懸濁し、10cmディッシュに播き、16時間37℃にてCO2インキュベータにて培養した。pFLAG−CMV3−G9の20ng及びLipofectamin2000(インビトロジェン社製)30μlをOPTI−MEM(インビトロジェン社製)1.5mlと各々混和し、室温にて5分間インキュベーションした。更に二つの液を緩やかに混和し、室温にて20分間インキュベーションした。この混合液をディッシュに滴下し、48時間37℃にてCO2インキュベータにて培養した。
なお、配列番号16に記載の372個のアミノ酸残基は、上記のようにして得られたG9ポリペプチド部分のアミノ酸配列のうち、FLAG等含まない部分である。他方、同様にして得られるが少し短い配列番号17のポリペプチド部分は、配列番号16の配列に含まれるもので、公知のβ1,3−N−アセチル−D−グルコサミン転移酵素タンパク質との相同性などから見ても活性ドメインと考えられる領域を含む282個のアミノ酸残基からなる領域であり、少なくともこの領域を含むものは目的の酵素活性を示すと考えられる
(2)培養液中に分泌されたG9ポリペプチドの精製
上記のG9ポリペプチド組換え体は、FLAGペプチドとの融合タンパク質として分泌発現されることになるため、抗FLAG M1抗体アフィニティーゲル(シグマ社製)を用いて、容易に精製が可能である。精製された酵素タンパク質は、抗FLAG M1アフィニティーゲルから遊離させてもよいが、ゲルに吸着したままの酵素を使用してもよい。本実施例では、ゲルに吸着したままの酵素を用いて実験した。
上記で取得した培養上清15mlにNaN3、NaCl及びCaCl2を、それぞれ最終濃度0.1%、150mmol/lおよび2mmol/lになるように添加した後、抗FLAG M1アフィニティーゲル(Anti−FLAG M1 Affinity Gel;コスモ・バイオ社製)を100μl添加し、4℃で一晩ゆっくり攪拌した。
翌日遠心して(3000rpm5分、4℃)ペレットを回収し、2mMのCaCl2・TBSを900μl加えて再度遠心分離(2000rpm 5分、4℃)し、ペレットを200μlの1mM CaCl2・TBSに浮遊させ活性測定のサンプル(G9酵素液)とした。この一部をSDS−PAGEによる電気泳動について抗FLAG M2−ペルオキシダーゼ(シグマ社製)を用いてウエスタンブロッテイングを行い、目的とするG9タンパク質の発現を確認した。その結果約45kDaの位置にバンドが検出、発現が確認された。
洗浄後、該ゲルに50mmol/l トリス−塩酸(pH7.4)、150mmol/l NaCl、2mmol/l EDTAを含む緩衝液30μlを添加し、4℃で30分間処理することにより、ゲルに吸着したタンパク質を溶出した。その後、160×gで10分間遠心分離することにより上清を取得した。ゲルに再度50mmol/l トリス−塩酸(pH7.4)、150mmol/l NaCl、2mmol/l EDTAを含む緩衝液30μlを添加し、4℃で10分間処理した後、160×gで10分間遠心分離することにより上清を取得した。その後、上記の操作を再度行い、合計3回溶出操作を行い、得られた溶出液には、最終濃度が4mmol/lになるように1mol/lCaCl2を添加した。この溶出液を酵素源として使用した。
実施例5 G9酵素タンパク質の酵素活性の解析(糖脂質や合成単糖類などを基 質として用いた活性測定)
配列番号2記載のアミノ酸配列を基に、他の公知の糖転移酵素と対比した結果、活性部位と考えられるC−末端領域の配列の保存性などから、G9は転移酵素類に分類されることが示唆された。そこで、例えば、UDP−GlcNAcをGlcNAc供与体基質として用いて、上記実施例4で得られたG9ポリペプチドを含む酵素液の酵素活性を確認することができる。
本実施例では、下記の参考文献[1]−[3]に記載の方法とほぼ同様の方法に従ってG9酵素の活性の測定した。
[1]Shiraishi N,Natsume A,Togayachi A,Endo T,Akashima T,Yamada Y,Imai N,Nakagawa S,Koizumi S,Sekine S,Narimatsu H,Sasaki K.Identification and characterization of three novel beta 1,3−N−acetylglucosaminyltransferases structurally related to the beta 1,3−galactosyltransferase family.J Biol Chem.2001 Feb 2;276(5):3498−507.:
[2]Togayachi A,Akashima T,Ookubo R,Kudo T,Nishihara S,Iwasaki H,Natsume A,Mio H,Inokuchi J,Irimura T,Sasaki K,Narimatsu H.Molecular cloning and characterization of UDP−GlcNAc:lactosylceramide beta 1,3−N−acetylglucosaminyltransferase(beta 3Gn−T5),an essential enzyme for the expression of HNK−1 and Lewis X epitopes on glycolipids.J Biol Chem.2001 Jun 22;276(25):22032−40.:
[3]Iwai T,Inaba N,Naundorf A,Zhang Y,Gotoh M,Iwasaki H,Kudo T,Togayachi A,Ishizuka Y,Nakanishi H,Narimatsu H.Molecular cloning and characterization of a novel UDP−GlcNAc:GalNAc−peptide β 1,3−Nacetylglucosaminyltransferase(β 3Gn−T6),an enzyme synthesizing the core 3 structure of O−glycans.J Biol Chem.2001 Jun 22;276(25):22032−40。
(1)基質特異性の検討
上記実施例で得られたFLAGペプチド融合型G9ポリペプチドのβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素活性を、単糖・オリゴ糖・糖脂質・糖タンパク質を基質として既知の方法(前述の参考文献、及びFEBS,462,289(1999)、J.Biol.Chem.269,14730−14737(1994)、及びJ.Biol.Chem.,267,23507(1992)、J.Biol Chem.,267,2994(1992)など)に従って測定した。
受容体基質として、pNp−α−Glc、pNp−β−Glc、pNp−α−GlcNAc、pNp−β−GlcNAc、pNp−α−Gal、oNp−β−Gal、pNp−α−GalNAc、pNp−α−Xyl、oNp−β−Xyl、pNp−α−Fuc、Bz−α−Man、Bz−α−ManNAc、core1−α−pNp、core3−α−pNp、Bz−β−ラクトシド、GlcNAcβ1−4GlcNAcβ−Bz、Galβ1−4GlcNAcα−pNpを使用した(表5参照)。これら基質はシグマ社あるいはトロントリサーチケミカルズ(Toronto Research Chemieals)社などより購入することができる。
(表5においてNDは検出なし。受容体基質のaはカルバイオケム(Calbiochem)社、bはシグマ社、cはトロントリサーチケミカルズ社から購入した)
供与体基質に放射能ラベルされた基質を用いる場合の基本的な反応液は、14mM HEPES緩衝液pH7.4,10mM MnCl2,0.15% Triton CF−54,0.75mM ATP、50μM UDP−GlcNAc(シグマ社製),4.5μM(50nCi)[14C]UDP−GlcNAc(アマシャムバイオサイエンス社製)、10μM基質(上記の受容体基質)、及び適量(5〜10μl)の精製酵素タンパク質(実施例4で得られた酵素源)で計20μlである。酵素反応は37℃で数時間から16時間まで行った(通常16時間)。
反応終了後、0.1M KClを200μl加え、軽く遠心後上清を取得した。10mlのメタノールで1回洗浄後、10mlの0.1M KClで2回洗浄して平衡化したSep−Pak C18 Cartridge(Waters)に該上清を通し、上清中の基質および生成物をカートリッジに吸着させた。1mlのHPLC用純水にて2回カートリッジを洗浄後、1mlのメタノールで吸着した基質および生成物を溶出した。液体シンチレーター(ACSII、アマシャムバイオサイエンス社製)に混和した後、シンチレーションカウンターにて生成物の放射線の量を測定した。
その結果、G9ポリペプチドは、テストされた上記受容体基質のうちGalβ1−4GlcNAcα−pNpに最も転移活性を示し、Bz−β−ラクトシドに対しても多少転移する活性を示した(表5参照)。
(2)酵素反応条件の検討
反応液及び反応時間は上記と同様としたが、14mM HEPES緩衝液pH7.4の代わりにHEPES(pH6.75〜7.4)及びカコジル酸ナトリウム(pH6.4〜7.2)のバッファー条件を検討した(図2A)。
図2Aに示される通り、G9ポリペプチドは、カコジル酸ナトリウムとHEPESのいずれを使用しても活性を示した。概して中性又はその付近での活性が高く、カコジル酸ナトリウムではpH6.4〜7.2の中性域でpHが大きくなるに伴って活性が上昇し、HEPESではpH7.0付近で最大の活性を示した。
また、糖転移酵素は金属イオンを要求するものがあるので、G9酵素の金属イオン要求性について検討を行った。反応液及び反応時間は上記と同様とし、10mM MnCl2の代わりにMnCl2、CoCl2、MgCl2、ZnCl2、NiCl2、CdCl2を使用した。各金属イオンの濃度は2.5、10、40mMとしそれぞれの酵素反応を行った(図2B)。
図2Bに示される通り、G9ポリペプチドの活性は、二価の金属イオンのうち、少なくともMnイオン又はCoイオンの存在下で有意に増強され、特にMnイオンでは顕著に増強される。これらの増強活性は、イオンの低濃度域で急速に上昇し、それ以降は漸次低下する。また、CdイオンやNiイオンでは低濃度域で僅かな増強効果があるが、MgイオンやZnイオンでは増強効果が実質的に見られなかった。
また上記の結果から、上記(1)で用いた基本的な反応条件で最も活性が強く出ることが確認された。以下の実験でも同条件を用いて反応を行った。
(3)2−アミノピリジン化オリゴ糖(N−グリカン)を受容体基質として用いた場合の活性測定
基質としては、市販のPA化オリゴ糖を使用した。オリゴ糖の2−ピリジルアミノ化は、常法(Hase,S.Ibuki,T.and Ikenaka,T.,J.Biochem.95,197−203(1984))に従って行うことができ、PA化オリゴ糖は宝酒造、あるいは生化学工業株式会社から購入した。具体的な試験方法は下記の通りである。
14mM HEPES緩衝液、pH7.4,50mM UDP−GlcNAc,10mM MnCl2,0.15% Triton CF−54、40pmol受容体基質(PA化オリゴ糖)、及び適量(200ng)の精製酵素タンパク質を含む計20μlの反応液中で37℃、16時間反応後、生産物を高速液体クロマトグラフィー(HPLC;詳細は後述する)により検出した。前記精製酵素タンパク質としては、実施例4において抗FLAG M1抗体アフィニティーゲルで精製された酵素を使用した。
反応が終了したアッセイ溶液を100℃で5分間処理後、HPLC用純水80μlを加え、10,000×gで5分間遠心して上清を取得した。次いで、該上清をUltrafree−MCカラム(Millipore社製)に通した後、その一部(40μl)をHPLCに供する。Ultrafree−MCカラムの使用法は付属の説明書に従って行った。
HPLCは、カラムとしてPALPAK Type Rカラム(タカラ社製)、溶出液として溶出液A:100mM 酢酸/トリエチルアミン(pH4.0)、溶出液B:100mM 酢酸/トリエチルアミン(pH4.0)/0.5% 1−ブタノールを用いて5〜55%溶出液Bグラジェント(0〜60分)、カラム温度40℃、流速1ml/分の条件で行った。生成物の検出は、蛍光スペクトルフォトメーターRF−10AXL(島津製作所社製)を用いて行った(励起波長320nm、放射波長400nm)。
この結果、G9ポリペプチドは、4本鎖のN−グリカン(PA−004、PA−011:TAKARAのPA化基質番号)に有意な活性を示した(図3参照)。これに対し、公知のβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素2(β3GnT2)は糖鎖の本数に関係なくPA−001〜0011のタイプのN−グリカンに活性を示す。このことから、本実施例のG9ポリペプチドは、4本鎖のN−グリカンに有意な活性を示すが、1〜3本鎖のN−グリカンには有意な活性を示さないという選択的活性を有することも示唆される。なお、図3の結果においてG9ポリペプチドの活性をβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素2のそれと比較すると比較的弱く見えるが、これはβ1,3−N−アセチルグルコサミン転移酵素2が非常に酵素活性の強いホモログ酵素であるからである。
(4)糖タンパク質を受容体基質として用いた場合の活性測定
糖タンパク質を基質にした酵素反応を行った。反応液は、14mM HEPES緩衝液pH7.4,10mM MnCl2,0.15% Triton CF−54,0.75mM ATP、50μM UDP−GlcNAc(シグマ社製)、4.5μM(50nCi)[14C]UDP−GlcNAc(アマシャムバイオサイエンス社製)、40μg受容体基質、及び適量(5〜10μl)の精製酵素タンパク質で計20μlとした。前記受容体基質としてはα1−酸性糖タンパク質(オロソムコイド;シグマ社製)、オボアルブミン(シグマ社製)、又はオボムコイド(シグマ社製)などを用いた。前記精製酵素タンパク質としては、実施例4において抗FLAG M1抗体アフィニティーゲルで精製された酵素を使用した。
反応は37℃で数時間から16時間行った。反応物の一部をグリコペプチダーゼF(GPF、タラカ社製)による酵素消化を説明書に従って行い、酵素消化前のサンプルと酵素消化後のサンプルをともに10% SDS−PAGEにて解析した(図4)。
その結果、G9ポリペプチドは、いずれの糖タンパク質(オボアルブミンは比較的弱い)に対してもGlcNAc転移活性を示し、またGPF消化によってバンドが消失することから、これらの転移反応が各糖タンパク質のN−グリカン糖鎖に行われていることが確認された。
実施例6 G9ノックアウトマウスの作製
mG9遺伝子は少なくともORFはシングルエクソンであると考えられる。ノックアウトしたいmG9の活性化ドメインと思われる領域、例えば、配列番号1の塩基番号97〜1194の塩基配列を含む約10kb断片を中心とした染色体断片(約10kb)をpBluescript II SK(−)(TOYOBO製)に挿入したターゲティングベクター(pBSK−mG9−KOneo)を作製する。pBSK−mG9−KOneoには薬物耐性遺伝子としてneo(ネオマイシン耐性遺伝子)をmG9の予測されるGlcNAc転移活性領域が欠失し、この部分がneoで置換される。こうして得られたpBSK−mG9−KOneoを制限酵素であるNotIにて直鎖状とした後、80μgをES細胞(E14/129Svマウス由来)にトランスフェクション(エレクトロポレーション等)し、G418耐性のコロニーを選択する。G418耐性コロニーを24ウェルプレートに移し、培養を行う。細胞の一部を凍結保存した後、残りのES細胞からDNAを抽出し、PCRにより組み換えが起こっているクローンを120コロニー程度選択する。さらに、PCRとサザンブロッティング等により組み換えが予定通り起こっているかの確認を行い、最終的に組み換え体を10クローン程度選択する。選択したうちの2クローンのES細胞をC57BL/6マウスの胚盤胞内に注入する。ES細胞を注入したマウス胚を仮親マウスの子宮内へ移植してキメラマウスを誕生させる。その後、ジャームトランスミッションによりヘテロノックアウトマウスを得ることができる。
Claims (9)
- 生物試料の大腸癌の癌化を検定する方法であって、
(a)以下の:
(i)配列番号1に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる核酸;
(ii)配列番号1に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、供与体基質からN-アセチル-D-グルコサミンをその受容体基質へβ-1,3-グリコシド結合で転移させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸
;又は
(iii)配列番号1に記載の配列又はその相補的な塩基配列に特異的に結合する少なくとも15個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、核酸;
の少なくとも1に記載の核酸を使用して、生物試料中の該核酸の転写レベルを測定し;そして
(b)該生物試料中の該核酸の転写レベルが、対照の健常生物試料のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること;
を含む方法。 - 生物試料の大腸癌の癌化を検定する請求項1記載の方法であって、
(a)以下の:
(i)配列番号1に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる核酸;
(ii)配列番号1に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、供与体基質からN-アセチル-D-グルコサミンをその受容体基質へβ-1,3-グリコシド結合で転移させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸;又は
(iii)配列番号1に記載の配列又はその相補的な塩基配列に特異的に結合する少なくとも15個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、核酸;
の少なくとも1に記載の核酸を標識してプローブとして使用し、これを生物試料にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ここでハイブリダイズした核酸の標識からのシグナルに基づき該生物試料中の該核酸の転写レベルを測定し;そして
(b)該生物試料中の核酸の転写レベルが、対照の健常生物試料中のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること;
を含む方法。 - 生物試料の大腸癌の癌化を検定する請求項1記載の方法であって、
(a)配列番号1に記載の配列又はその相補的な塩基配列に特異的に結合する少なくとも15個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる核酸を標識してプライマーとして使用して、生物試料について核酸増幅を行い、且つ該核酸増幅産物の量を測定し;そして
(b)の該核酸増幅産物の量が、対照の健常生物試料中のそれを有意に上回る場合に、該生物試料が癌化していると判断すること;
を含む方法。 - 大腸癌の癌治療に関する処置の有効性を、以下の:
(i)配列番号1に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる核酸;
(ii)配列番号1に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、供与体基質からN-アセチル-D-グルコサミンをその受容体基質へβ-1,3-グリコシド結合で転移させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸;又は
(iii)配列番号1に記載の配列又はその相補的な塩基配列に特異的に結合する少なくとも15個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、核酸;
の少なくとも1に記載の核酸を使用して検査する方法であって、癌治療のための処置がなされた生物試料中の前記核酸の転写レベルを、上記核酸を使用して測定し、該測定値を、該処置前又は未処置のそれと比較することにより、該生物試料への該処置が有効であるか否かを判断することを含む方法。 - 既に癌化している生物試料を使用し、癌治療のための処置がなされた該生物試料中の前記核酸の転写レベルが、該処置前又は未処置のそれを有意に下回る場合に、該生物試料への該処置が有効であると判断することを含む、請求項4記載の方法。
- 生物試料が、非ヒトモデル動物のin vivo生物試料である、請求項4又は5記載の方法。
- 生物試料が大腸又は末梢血由来の試料である、請求項1〜6の何れか1項記載の方法。
- 請求項1〜3記載の大腸癌の癌化検定の方法で用いる、以下の:
(i)配列番号1に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる核酸;
(ii)配列番号1に記載の塩基配列又はその相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、供与体基質からN-アセチル-D-グルコサミンをその受容体基質へβ-1,3-グリコシド結合で転移させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸;
(iii)配列番号1に記載の配列又はその相補的な塩基配列に特異的に結合する少なくとも15個の連続する塩基配列又はその相補的な塩基配列からなる、核酸;
の少なくとも1を含む、組成物。 - 請求項8記載の組成物を含む、大腸癌のための癌マーカー。
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