JP4251402B2 - Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体 - Google Patents
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Description
本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の活性を増加または減少しているＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体、それをコードする核酸、およびこれらの利用に関する。
これまでに、コアタンパク質やペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性を有するヒトの酵素としては１８種類が知られている。本出願前に、本発明者らは、前記活性を有する酵素として、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０（Ｃｈｅｎｇら、２００２）、Ｔ１２（Ｇｕｏら、２００２）、Ｔ１３（Ｚｈａｎｇら、２００３）、Ｔ１４（Ｗａｎｇら、２００３）、Ｔ１５（Ｃｈｅｎｇら、２００４）、Ｔ１６、Ｔ１７、およびＴ１８（国際公開ＷＯ０３／０５７８８７）を同定し、さらにこれらの遺伝子構造についても明らかにしている。なお、上記ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１６、Ｔ１７、およびＴ１８は、各々、国際公開ＷＯ０３／０５７８８７におけるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１、Ｔ１６、およびＴ１５に対応する。表１にＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素とその基質特異性について記載した。
しかし、それぞれの遺伝子で発現組織や転移可能なアミノ酸配列や周囲のアミノ酸への糖修飾のパターンにより、機能する酵素は異なっている。即ち、全てのヒトのタンパク質にＮ−アセチルガラクトサミン修飾を施すには、あらゆる種類のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素）が必要になると考えられる。さらに、コアタンパク質やペプチド配列のセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性を有する酵素はＯ−結合型糖鎖の根元酵素である。一般に、この酵素の変化による細胞表面やタンパク質上の糖鎖密度の変化や糖鎖構造の欠如により、多数の疾患が引き起こされることが知られている。具体的な例としては、癌細胞の糖鎖修飾は正常細胞と比較して異なることが多い。最も特徴的な癌細胞の糖鎖変化は、ムチン型（Ｏ−結合型）糖鎖において起こり、これらの変化は癌細胞の浸潤や転移に関連し、癌細胞の脱分化や成長速度の上昇を反映する。そのＯ−結合型糖鎖の根元（還元末端）には、コアタンパク質やペプチド配列のセリン、スレオニン残基に直接結合するＧａｌＮＡｃが存在する。細胞表面のＧａｌＮＡｃの密度あるいは露出度の変化はＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ特異的なＣａ２＋依存性レクチンをもつマクロファージの癌細胞の認識や接着度合と関連している。さらに、合成したＴｎ抗原を持つ多抗原性のＯ−結合型糖ペプチドは、免疫感作療法に使用され、腫瘍耐性マウスの生存率が増加するという報告もなされている。このように、糖転移酵素の基質認識機構の解析、基質特異性の改良は、疾患の診断薬や治療薬の開発において重要であると考えられる。
さらに、本発明者らは、上記Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の各種類毎に、該酵素によるＮ−アセチルガラクトサミンを転移する酵素活性の大きさが異なることを発見した。即ち、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１７、およびＴ１８の転移酵素活性は、他の酵素よりもその活性が著しく低かった。特定の酵素による活性が低い原因は不明であるが、受容基質の認識が厳密であり、本来の基質以外に対してＧａｌＮＡｃを転移することができない、転移酵素としての活性以外の別の機能を有する、あるいは別の活性化因子（サブユニット）が欠如しているためなどの理由が考えられる。
これらの酵素活性が低いことから、生体でこれらの酵素が作り出す糖タンパク質は非常に希少である可能性があり、それらの糖タンパク質の機能を解析することは困難であることが予想される。酵素活性の高い改変型活性化酵素を開発できれば、生体では微量にしか存在しない糖鎖（糖タンパク質）を大量に合成できる可能性がある。
なお、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の各アミノ酸配列、塩基配列は、先行技術文献に開示されるが、本明細書においては、アミノ酸配列および塩基配列を、各々、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７では配列番号１と配列番号２、Ｔ９（Ｔｏｂａら、２０００）では配列番号３と配列番号４、Ｔ１８では配列番号５と配列番号６、Ｔ８（Ｗｈｉｔｅら、２０００）では配列番号７と配列番号８、Ｔ１（Ｗｈｉｔｅら、１９９５）では配列番号２３と配列番号２４、Ｔ１３では配列番号２５と配列番号２６、Ｔ３（Ｂｅｎｎｅｔら、１９９６）では配列番号２７と配列番号２８、Ｔ６（Ｂｅｎｎｅｔら、１９９９）では配列番号２９と配列番号３０、Ｔ１２では配列番号３１と配列番号３２、Ｔ４（Ｂｅｎｎｅｔら、１９９８）では配列番号３３と配列番号３４、Ｔ１５では配列番号３５と配列番号３６、Ｔ１０では配列番号３７と配列番号３８、Ｔ７（Ｂｅｎｎｅｔら、１９９９）では配列番号３９と配列番号４０、Ｔ５（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ２７７５９１）では配列番号４１と配列番号４２、Ｔ１１（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、２００２）では配列番号４３と配列番号４４、Ｔ１４では配列番号４５と配列番号４６、Ｔ１６では配列番号４７と配列番号４８、およびＴ２（Ｗｈｉｔｅら、１９９５）では配列番号４９と配列番号５０として開示した。
国際公開ＷＯ０３／０５７８８７
Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２４６，３４７−３５６（２０００）
Ｔｏｂａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４９３，２６４−２６８（２０００）
Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２４１５６−２４１６５（１９９５）
Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１７００６−１７０１２（１９９６）
Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３０４７２−３０４８１（１９９８）
Ｔｅｎ Ｈａｇｅｎ，Ｋ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，２７７４９−２７７５４（１９９８）
Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２５３６２−２５３７０（１９９９）
Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．，４６０，２２６−２３０（１９９９）
Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２４８，３４７−３５６（２０００）
Ｔｏｂａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４９３，２６４−２６８（２０００）
Ｔｅｎ Ｈａｇｅｎ，Ｋ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，１７３９５−１７４０４（２００１）
Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５３１，１１５−１２１（２００２）
Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２２６２３−２２６３８（２００２）
Ｇｕｏ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５２４，２１１−２１８（２００２）
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，５７３−５８４（２００３）
Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｈｙｓ．．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３００，７３８−７４４（２００３）
Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５６６，１７−２４（２００４）
さらに、本発明者らは、上記Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の各種類毎に、該酵素によるＮ−アセチルガラクトサミンを転移する酵素活性の大きさが異なることを発見した。即ち、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１７、およびＴ１８の転移酵素活性は、他の酵素よりもその活性が著しく低かった。特定の酵素による活性が低い原因は不明であるが、受容基質の認識が厳密であり、本来の基質以外に対してＧａｌＮＡｃを転移することができない、転移酵素としての活性以外の別の機能を有する、あるいは別の活性化因子（サブユニット）が欠如しているためなどの理由が考えられる。
これらの酵素活性が低いことから、生体でこれらの酵素が作り出す糖タンパク質は非常に希少である可能性があり、それらの糖タンパク質の機能を解析することは困難であることが予想される。酵素活性の高い改変型活性化酵素を開発できれば、生体では微量にしか存在しない糖鎖（糖タンパク質）を大量に合成できる可能性がある。
なお、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の各アミノ酸配列、塩基配列は、先行技術文献に開示されるが、本明細書においては、アミノ酸配列および塩基配列を、各々、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７では配列番号１と配列番号２、Ｔ９（Ｔｏｂａら、２０００）では配列番号３と配列番号４、Ｔ１８では配列番号５と配列番号６、Ｔ８（Ｗｈｉｔｅら、２０００）では配列番号７と配列番号８、Ｔ１（Ｗｈｉｔｅら、１９９５）では配列番号２３と配列番号２４、Ｔ１３では配列番号２５と配列番号２６、Ｔ３（Ｂｅｎｎｅｔら、１９９６）では配列番号２７と配列番号２８、Ｔ６（Ｂｅｎｎｅｔら、１９９９）では配列番号２９と配列番号３０、Ｔ１２では配列番号３１と配列番号３２、Ｔ４（Ｂｅｎｎｅｔら、１９９８）では配列番号３３と配列番号３４、Ｔ１５では配列番号３５と配列番号３６、Ｔ１０では配列番号３７と配列番号３８、Ｔ７（Ｂｅｎｎｅｔら、１９９９）では配列番号３９と配列番号４０、Ｔ５（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ２７７５９１）では配列番号４１と配列番号４２、Ｔ１１（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋら、２００２）では配列番号４３と配列番号４４、Ｔ１４では配列番号４５と配列番号４６、Ｔ１６では配列番号４７と配列番号４８、およびＴ２（Ｗｈｉｔｅら、１９９５）では配列番号４９と配列番号５０として開示した。
本発明の目的は、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体であって、以下の工程
１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；
２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして
３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換する
ことを含む方法によって製造され、並びに
タンパク質またはペプチドのセリンまたはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性が、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、増加または減少している、前記改変体を提供することである。
さらに、本発明の目的は、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、その活性が増加または減少しているＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体を製造する方法を提供する。
１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；
２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして
３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換する
ことを含む方法によって製造され、並びに
タンパク質またはペプチドのセリンまたはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性が、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、増加または減少している、前記改変体を提供することである。
さらに、本発明の目的は、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、その活性が増加または減少しているＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体を製造する方法を提供する。
前述したように、１８種類のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素のアミノ酸配列の一次構造を比較検討した結果、転移酵素の活性が著しく低いＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群では、アミノ酸配列中のいくつかの位置において、他のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素のアミノ酸配列と異なる、共通するアミノ酸配列を有することを見出した。ここで、本明細書においては、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の分類上、転移酵素の活性が低いＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群を「Ｙファミリー」、活性が高いＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群を「Ｗファミリー」とする。
本発明者らは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分が同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し、アミノ酸残基（α）をβに置換することによって、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の活性が改変前に比べて増加させることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして、３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換することを含む方法によって製造され、並びにタンパク質またはペプチドのセリンまたはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性が、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、増加または減少している、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体が提供される。
本発明の一態様において、本発明の改変体は、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体である。前記Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、好ましくは、改変前のアミノ酸配列が配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７であるアミノ酸配列を有していてもよい。ここで、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７は、各々、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７、Ｔ９、Ｔ１８、およびＴ８のアミノ酸配列に相当する。
本発明の一態様において、本発明の改変体は、配列番号１のアミノ酸残基２３４に相当するアミノ酸、アミノ酸残基２５６に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基３７７に相当するアミノ酸残基のうちの１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されていてもよい。好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２３４に相当するアミノ酸残基ＴｒｐのＡｌａへの改変、アミノ酸残基２５６に相当するアミノ酸残基ＡｌａのＬｅｕへの改変、アミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基ＬｅｕのＴｙｒへの改変、アミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基ＴｙｒのＴｒｐへの改変、およびアミノ酸残基３７７に相当するアミノ酸残基ＡｌａのＧｌｙへの改変のうちの１つまたは複数のアミノ酸が改変されていてもよい。
本発明の一態様において、改変体の酵素活性が、対応する改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して増加している改変体が提供される。改変体の活性は、改変前と比較して、好ましくは１００倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらにより好ましくは２５倍以上、最も好ましくは１０倍以上である。
本発明の一態様において、改変体の酵素活性が、対応する改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して減少している改変体が提供される。改変体の活性は、改変前と比較して、好ましくは、１／１００以下、より好ましくは１／５０以下、さらにより好ましくは１／２５以下、最も好ましくは、１／１０以下である。
本発明によれば、本発明のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体を製造する方法が提供される。本発明の製造方法は、好ましくは、１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして、３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換する工程を含む。
本発明によれば、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の活性を増加または減少させる方法が提供される。本発明の方法は、好ましくは、１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして、３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換する工程を含む。
本発明によれば、本発明の改変体をコードする核酸（以下、「本発明の核酸」という）が提供される。
本発明によれば、本発明の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」という）が提供される。本発明の組換えベクターは、好ましくは発現ベクターである。
本発明によれば、本発明の核酸が導入され、該核酸を発現する宿主細胞が提供される。
本発明によれば、本発明の改変体を含む医薬組成物が提供される。
本発明者らは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分が同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し、アミノ酸残基（α）をβに置換することによって、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の活性が改変前に比べて増加させることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして、３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換することを含む方法によって製造され、並びにタンパク質またはペプチドのセリンまたはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性が、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、増加または減少している、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体が提供される。
本発明の一態様において、本発明の改変体は、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体である。前記Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、好ましくは、改変前のアミノ酸配列が配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号７であるアミノ酸配列を有していてもよい。ここで、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７は、各々、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７、Ｔ９、Ｔ１８、およびＴ８のアミノ酸配列に相当する。
本発明の一態様において、本発明の改変体は、配列番号１のアミノ酸残基２３４に相当するアミノ酸、アミノ酸残基２５６に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基３７７に相当するアミノ酸残基のうちの１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されていてもよい。好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２３４に相当するアミノ酸残基ＴｒｐのＡｌａへの改変、アミノ酸残基２５６に相当するアミノ酸残基ＡｌａのＬｅｕへの改変、アミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基ＬｅｕのＴｙｒへの改変、アミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基ＴｙｒのＴｒｐへの改変、およびアミノ酸残基３７７に相当するアミノ酸残基ＡｌａのＧｌｙへの改変のうちの１つまたは複数のアミノ酸が改変されていてもよい。
本発明の一態様において、改変体の酵素活性が、対応する改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して増加している改変体が提供される。改変体の活性は、改変前と比較して、好ましくは１００倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらにより好ましくは２５倍以上、最も好ましくは１０倍以上である。
本発明の一態様において、改変体の酵素活性が、対応する改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して減少している改変体が提供される。改変体の活性は、改変前と比較して、好ましくは、１／１００以下、より好ましくは１／５０以下、さらにより好ましくは１／２５以下、最も好ましくは、１／１０以下である。
本発明によれば、本発明のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体を製造する方法が提供される。本発明の製造方法は、好ましくは、１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして、３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換する工程を含む。
本発明によれば、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の活性を増加または減少させる方法が提供される。本発明の方法は、好ましくは、１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして、３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換する工程を含む。
本発明によれば、本発明の改変体をコードする核酸（以下、「本発明の核酸」という）が提供される。
本発明によれば、本発明の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」という）が提供される。本発明の組換えベクターは、好ましくは発現ベクターである。
本発明によれば、本発明の核酸が導入され、該核酸を発現する宿主細胞が提供される。
本発明によれば、本発明の改変体を含む医薬組成物が提供される。
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
１．Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体の作製
（１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素
本発明者らのグループは、既に、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素としてｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０、Ｔ１２、Ｔ１４、Ｔ１５、Ｔ１６、Ｔ１７、およびＴ１８をコードする遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列および推定アミノ酸配列を決定している（国際公開ＷＯ０３／０５７８８７）。これらＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードする核酸の塩基配列、推定アミノ酸配列、基質特異性、および組織における発現分布に関しては、国際公開ＷＯ０３／０５７８８７に開示される。なお、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０は、国際公開ＷＯ０３／０５７８８７において開示するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に該当し、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１５はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１６はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１６に該当し、およびｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１８はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１５に該当する（表１参照）。その他全てのＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素については、表１に記載の先行技術文献に開示されている。
本明細書においては、本発明の理解のために、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素一般の性質について以下に簡単に説明する。なお、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の塩基配列および該核酸がコードする核酸配列の情報は、前述した表１の技術文献に記載されるとおりであるが、該酵素のうちｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７については、本明細書において、該酵素をコードしている核酸を配列番号２に記載し、該核酸がコードする推定アミノ酸配列を配列番号１に記載する。
Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素は次の性質を有する。
作用： コアタンパク質とポリペプチドのセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する。触媒する反応を反応式で記載すると、
ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン＋ペプチド（セリン／スレオニン）⇔ＵＤＰ＋Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミン−１−セリン／スレオニン−ペプチド）
基質特異性： コアタンパク質のポリペプチドのセリン、スレオニン残基の水酸基
本発明の改変体に使用されるＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は限定されない。即ち、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現されたタンパク質、または化学合成タンパク質の何れでもよい。
（２）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体
本発明のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体（以下、単に「本発明の改変体」という）は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の改変体は、遺伝子工学的手法によりＤＮＡから発現させた組換えタンパク質、または化学合成タンパク質の何れであってもよい。あるいは、本明細書に記載した特徴を有する限り、人為的に改変を施したものでなく天然に得られたタンパク質であってもよい。あるいは、タンパク質レベルで天然由来のタンパク質に改変を施したものでもよい。
本発明によれば、１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして、３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換することを含む方法によって製造され、並びにタンパク質またはペプチドのセリンまたはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性が、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、増加または減少している、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体が提供される。
ここで、本明細書において使用する用語「Ｙファミリー」とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のうち酵素活性が高い酵素群と低い酵素群とを大別した場合に、酵素活性が低い酵素群をいう。ここで、酵素活性が低い酵素群の活性は、高い酵素群と比較して、好ましくは１０倍以下、より好ましくは２５倍以下、さらにより好ましくは５０倍以下、最も好ましくは１００倍以下である。好ましくは、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７、Ｔ９、Ｔ１８、およびＴ８である。なお、本明細書において、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７、Ｔ９、Ｔ１８、およびＴ８のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７に記載される。
本明細書において使用する用語「Ｗファミリー」とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のうち酵素活性が高い酵素群をいう。好ましくは、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ１３、Ｔ１４、Ｔ１５、Ｔ１６である。なお、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ１３、Ｔ１４、Ｔ１５、およびＴ１６のアミノ酸配列は、表１に記載の各文献にアミノ酸配列および塩基配列は開示され、これら文献は全て本明細書において援用される。
本発明の改変体は、以下の工程によって作製することができる。即ち、１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして、３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換することを含む方法によって製造することができる。
本明細書において、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させる方法は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この配列比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較する方法によってなされる。当業者により使用される配列比較のプログラムでは、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＯ．，ＬＴＤ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ．（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０（１９９４））である。プログラムによる配列比較の各種条件（パラメーター）は、ソフトウェアに添付の仕様書、または専用サイトに詳説されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、ＧＥＮＥＴＹＸは、核酸解析、タンパク質解析用の遺伝情報処理ソフトウェアで、通常のホモロジー解析やマルチアラインメント解析の他、シグナルペプチド予測やプロモーター部位予測、二次構造予測が可能である。また、本明細書で用いたホモロジー解析プログラムは、高速・高感度な方法として多用されているＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法［Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．＆Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４３５−１４４１（１９８５）］を採用している。
本発明によれば、前述した配列比較によって、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し、その後、前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換することよって製造することができる。
例えば、図３において、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７のアミノ酸残基２３４番目の位置を基準にすると、ＹファミリーのＴ１７、Ｔ９、Ｔ１８、Ｔ８では全てＴｒｐ（α）として共通である。一方、このαに対応する位置において、ＷファミリーのＴ１、Ｔ１３、Ｔ３、Ｔ６、Ｔ１２、Ｔ４、Ｔ１５、Ｔ１０、Ｔ２０、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ１１、Ｔ１９、Ｔ１４、Ｔ１６、Ｔ２では全てＡｌａ（β）となっている。本発明は、例えばこの位置のα（Ｔｒｐ）をβ（Ａｌａ）にすることにより活性を変えるものである。
本発明の一態様としては、図３および図４に示すように、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が有する共通のアミノ酸残基（α）としては、限定されるわけではないが、アミノ酸残基Ｔｒｐ（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の２３４番目）、Ａｌａ（２５６番目）（以上、図３）、Ｌｅｕ（３４３番目）、Ｔｙｒ（３５０番目）、Ａｌａ（３７７番目）（以上、図４）が例示される。アミノ酸残基αに相当する位置にあり、αと異なる共通するＷファミリーのアミノ酸残基（β）としては、各々、Ａｌａ（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の１９７番目）、Ｌｅｕ（２１９番目）（以上、図３）、Ｔｙｒ（３０９番目）、Ｔｒｐ（３１６番目）、Ｇｌｙ（３４３番目）（以上、図４）が相当する。
Ｗファミリーにおいては、アミノ酸残基βが全てのＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素において共通している必要はなく、１つ程度異なっていてもよい。例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ７ではＴｙｒ（３１１番目）となっているが、これに相当する位置における他のＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素では全てＬｅｕ（例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の２１９番目）となっている。このような態様である改変体も本発明に含まれる。
本発明の改変体に使用されるＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードする核酸、および該核酸がコードする推定アミノ酸は、前述のようにすでに公知となっている。したがって、本発明の改変体の発現、単離及び精製は、任意公知の技術を用いて行うことができる。例えば、非限定的に以下の手法を適用することができる。
本発明の改変体は、簡単には、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするｃＤＮＡを鋳型として、標的とするアミノ酸残基（例えば、Ｙファミリーのアミノ酸残基α）をコードする３塩基（コドン）を他のアミノ酸残基（例えば、Ｗファミリーのアミノ酸残基β）のコドンに置換したＰＣＲ用のプライマーを用いて行うことができる。同一のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素に点突然変異を複数箇所導入するには、各種プライマーの組み合わせによって達成される。このような特定の１つまたは複数のアミノ酸残基を置換させる方法は、公知の点突然変異法（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｉｎ Ｌｅｓ Ｐｒｉｘ Ｎｏｂｅｌ（ｅｄ．Ｔ．Ｆｒａｎｇｓｍｙｒ），ｐ．１０７．Ａｌｍｑｖｉｓｔ ａｎｄ Ｗｉｌｓｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，１９９３； Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｉｎ Ｌｅｓ Ｐｒｉｘ Ｎｏｂｅｌ（ｅｄ．Ｔ．Ｆｒａｎｇｓｍｙｒ），ｐ．１２３．Ａｌｍｑｖｉｓｔ ａｎｄ Ｗｉｌｓｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，１９９３）を参照して行うことも可能である。具体的には、後述する実施例２に記載したように、点突然変異を有する改変体を構築することができる。なお、本発明の改変体は、例えば、後述の実施例３に従って、点突然変異を施した核酸（好ましくはＤＮＡ）を大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入および発現させることにより大量に得ることができる。
本発明の一態様において、本発明の改変体は、好ましくは配列番号１のアミノ酸残基２３４に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基２５６に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基、およびアミノ酸残基３７７に相当するアミノ酸残基のうちの１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されている改変体である。このうち、配列番号１のアミノ酸残基２３４、および２５６番目に相当するアミノ酸残基は、図３に示されるＧＴ１モチーフと呼ばれるドメインに属する（図３）。また、配列番号１のアミノ酸残基３４３、３５０、および３７７番目に相当するアミノ酸残基は、図４に示されるＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔモチーフと呼ばれるドメインに属する。したがって、本発明の改変体は、好ましくは、ＧＴ１モチーフ、および／またはＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔモチーフに属するアミノ酸残基の置換である。ここで、本明細書において、ＧＴ１モチーフとは、糖転移酵素（Ｇｌｙｃｏｓｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に一般的に保存されている、二価カチオンＭｎ＋と結合するＤＸＨ配列を含む保存性の高い領域をいい、Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔモチーフとは、ＧａｌＮＡｃ転移酵素−β１−４ガラクトース転移酵素間に強く保存されている領域をいう。本発明の改変体は、Ｙファミリーにおいて置換されているアミノ酸残基が、上記のドメインに限定されず、これら以外のドメインに属しているものであってよい。
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２３４に相当するアミノ酸残基ＴｒｐのＡｌａへの改変、アミノ酸残基２５６に相当するアミノ酸残基ＡｌａのＬｅｕへの改変、アミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基ＬｅｕのＴｙｒへの改変、アミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基ＴｙｒのＴｒｐへの改変、およびアミノ酸残基３７７に相当するアミノ酸残基ＡｌａのＧｌｙへの改変のうち１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されている改変体である。
さらにより好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基ＬｅｕのＴｙｒへの改変、アミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基ＴｙｒのＴｒｐへの改変、およびアミノ酸残基３７７に相当するアミノ酸残基ＡｌａのＧｌｙへの改変のうちの１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されている改変体である。改変箇所は、１つでもよく、複数でもよい。
最も好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基ＬｅｕがＴｙｒに改変され、およびアミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基ＴｙｒがＴｒｐに改変されている改変体である。
本発明によれば、本発明の改変体は、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、酵素活性が増加または減少している。
本発明の一態様では、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体は、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、酵素活性が増加することが好ましい。Ｙファミリーの酵素活性の増加は、好ましくは１００倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらにより好ましくは２０倍以上、最も好ましくは１０倍以上である。具体的には、後述する実施例６に記載したように、Ｙファミリーに属するｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７のアミノ酸配列に２箇所の点突然変異を施した場合、酵素活性が約１００倍増加している。
本発明の一態様では、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体は、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、酵素活性が減少することが好ましい。Ｗファミリーの酵素活性の減少は、好ましくは１／１００以下、より好ましくは１／５０以下、さらにより好ましくは１／２５以下、最も好ましくは１／１０以下である。
（３）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体をコードする核酸
本発明によれば、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体をコードする核酸（以下、「本発明の核酸」という）が提供される。上記核酸は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ、およびそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組合せが含まれる。使用する核酸としては、ＤＮＡが好ましい。本明細書において、ある特定の塩基配列について記載する場合、特に言及しない限り、その相補鎖も含む。
本明細書では、配列番号１および配列番号２において、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７のアミノ酸配列、およびそれをコードする塩基配列が開示されている。また、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７以外の酵素のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、ＷＯ０３／０５７８８７、あるいは本明細書に記載した先行技術文献に開示されている。当該配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応などの遺伝子工学的手法により、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子、及び当該遺伝子がコードするタンパク質またはポリペプチドも、本発明のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体を得るために利用可能である。
前述したＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体におけるアミノ酸残基αおよびβ以外のアミノ酸残基は、活性を変更しない限り、変更することが可能である。相同遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件下で行うことが好ましい。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも ７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ Ｄ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９）； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２２（１９９０）； Ｂａｒａｎｙ Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９３（１９９１））および転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））およびＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，ｐ．１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定されれ；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｂｉａｓｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
（３）組換えベクターと形質転換体
プラスミド等のベクターに本発明の改変体をコードする核酸のＤＮＡ断片を組込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、大腸菌ＤＨ５α、ＤＨ１０ＢＡＣ、ＴＢ１、ＬＥ３９２、ＸＬ−ＬＥ３９２、またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１６．１（２００１）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
ベクターは、簡単には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＴＡＰｌｕｓ、ｐＤｒｉｖｅ、ｐＥＴＢｌｕｅ−１等が例示されるが、これらに限定されない。
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、本発明の改変体を発現させたい宿主細胞に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように発現ベクターは、本発明の改変体が目的の宿主細胞中で発現し得るように遺伝子発現に関与する領域（プロモーター領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに本発明の改変体をコードする核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。また、発現ベクターの構築は、制限処理および連結作業を必要としない、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を用いても行うことができる。Ｇａｔｅｗａｙシステムとは、ＰＣＲ産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、ＤＮＡ断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、ＰＣＲ産物およびドナーベクターから部位特異的な組換え酵素であるＢＰクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるＬＢクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにＰＣＲ産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間のかかるサブクローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
発現ベクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０等が好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２、ｐＡＵＲ１２３（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡ０８１５（以上ピキア属）、昆虫細胞用発現ベクターとしてｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、哺乳類細胞用発現ベクターとしてｐＤＥＳＴ１２．２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３、ｐＤＯＮ−ＡＩなどが好ましい。
上記発現ベクターを宿主細胞に組み込み、形質転換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。該形質転換体を得るための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト（例えば、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０、２９３、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）等由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
ところで、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードする核酸は、哺乳類のゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、真核細胞を形質転換体の宿主細胞として用いることより天然物に近い性質を有したＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体が得られる（例えば、糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、宿主細胞としては真核細胞、特に哺乳類細胞を選択することが好ましい。哺乳類細胞としては、具体的には、ヒト由来、ラット由来、マウス由来、アフリカツメガエル由来、ハムスター由来、またはサル由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。また、宿主細胞としての大腸菌、酵母または昆虫細胞は、具体的には、大腸菌（ＤＨ５α、ＤＨ１０ＢＡＣ、Ｍ１５Ｍ、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（Ｓｆ２１、Ｓｆ９、ＢｍＮ４、カイコ幼虫等）などが例示される。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを含んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
発現べクタ−において、好ましい開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好ましいプラスミドとしては、大腸菌ではプラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２若しくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばジェネティシン（Ｇ−４１８）、テトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン若しくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション（連結）等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｒの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８））やリチウム法（Ｊ．Ｂ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５））、エレクトロポレ−ション法（Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６））によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３））、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３））によってそれぞれ形質転換することができる。なお、組換えベクターの構築およびそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が実施例４に詳述されている。
（４）タンパク質の単離・精製
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させて、その培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
本発明の改変体は、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源若しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源若しくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、本発明の改変体が大量に生産されるように適宜選択される。
本発明の改変体は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明の改変体が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば、濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液であり、ｐＨは用いる緩衝液によって異なるがｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明の改変体が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明の改変体の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明の改変体を生産した場合には、イオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
本発明の改変体はまた、精製および同定を容易にするために添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれるが、これらに限定さるものではない。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号９））であり、該ペプチドは非常に抗原性であり、そしてそれぞれに特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。また、４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
具体的には、本発明の改変体を発現する発現ベクターにＦＬＡＧタグのｃＤＮＡを挿入し、標識した改変体を発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて改変体の発現を確認することができる。
（５）医薬組成物
本発明において、本発明の改変体は、タンパク質またはペプチドのセリンまたはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性が、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して増加することが明らかとなった。したがって、本発明のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体を含む医薬組成物は、タンパク質のＯ−グリカンの修飾パターンを変えることができる。
本発明の医薬組成物は、薬学的に受容可能な担体との混合物中に、本発明の改変体を治療上有効な量を含む。本発明の医薬組成物は、全身的にまたは局所的に、好ましくは静脈内、皮下内、筋肉内に非経口的に投与し得る。非経口的に投与可能な改変体の溶液の調剤は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術範囲内において行い得る。
本発明の医薬組成物の用量用法は、薬剤の作用、例えば、患者の症状の性質および／若しくは重度、体重、性別、食餌、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定され得る。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の医薬組成物の用量を決定することができる。
あるいは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体をコードする核酸を組込んだ発現ベクターを作製し、生体内の標的部位で発現させるか、あるいは当該発現ベクターを組み込んだ細胞を標的部位に輸送させることにより、標的部位のタンパク質のＯ−グリカンの修飾パターンを改変し、さらには、その結果として糖タンパク質の高次構造を改変することも可能である。
本発明によれば、改変型Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素を導入することにより、Ｏ−グリカンの修飾パターンを変化させることができ、その結果としてＯ−グリカンの異常によって引き起こされる疾患を予防、または治療するための医薬組成物が提供される。Ｏ−グリカンの異常によって引き起こされる疾患とは、例えば、ＩｇＡ腎症、ＨＥＭＰＡＳ、Ｔｎポリアグルチネーション症候群、糖尿病および高血糖症に伴うコア２ＧｌｃＮＡｃ転移酵素誘導による心疾患である。
（６）本発明の改変体を認識する抗体
本発明により、本発明の改変体に免疫反応性である抗体が提供される。こうした抗体は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介して、該タンパク質に特異的に結合し得る。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその断片、変異体若しくは融合タンパク質などを、それぞれに免疫反応性である抗体を産生するための免疫原として使用することが可能である。
より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含むが、これら抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもよいし、より高次構造（断続的）でもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるあらゆる方法によって同定できる。したがって、本発明は、本発明の改変体の抗原性エピトープにも関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。
前記のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル抗体（若しくは抗血清）または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製するための研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、タンパク質の化学的または酵素的切断などの当該技術分野において公知の技術を用いて、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて産生することができる。
本発明の改変体によってあらゆる態様の抗体が誘導される。該タンパク質のポリペプチド全部若しくは一部またはエピトープが単離されていれば、慣用的技術を用いてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも調製可能である。例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０；Ｂｕｒｄｏｎら編「生化学実験法１０ モノクローナル抗体」東京化学同人、１９８９を参照されたい。
本発明によれば、本発明のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も提供される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明の酵素タンパク質で免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。こうしたモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化型抗体は、ヒトに投与されて免疫原性を減少させるという利点を有する。
また、本発明によれば、上記抗体の抗原結合断片も提供される。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片および誘導体もまた提供される。このような抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、本発明の改変体またはそのポリペプチド断片の存在を検出するためのアッセイに使用可能である。また本発明の抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって該タンパク質またはそのポリペプチド断片を精製することにも使用することができる。
１．Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体の作製
（１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素
本発明者らのグループは、既に、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素としてｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０、Ｔ１２、Ｔ１４、Ｔ１５、Ｔ１６、Ｔ１７、およびＴ１８をコードする遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列および推定アミノ酸配列を決定している（国際公開ＷＯ０３／０５７８８７）。これらＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードする核酸の塩基配列、推定アミノ酸配列、基質特異性、および組織における発現分布に関しては、国際公開ＷＯ０３／０５７８８７に開示される。なお、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０は、国際公開ＷＯ０３／０５７８８７において開示するＧａｌＮＡｃ−Ｔ１３に該当し、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１４はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１５はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１６はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１１、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１６に該当し、およびｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１８はＧａｌＮＡｃ−Ｔ１５に該当する（表１参照）。その他全てのＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素については、表１に記載の先行技術文献に開示されている。
本明細書においては、本発明の理解のために、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素一般の性質について以下に簡単に説明する。なお、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の塩基配列および該核酸がコードする核酸配列の情報は、前述した表１の技術文献に記載されるとおりであるが、該酵素のうちｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７については、本明細書において、該酵素をコードしている核酸を配列番号２に記載し、該核酸がコードする推定アミノ酸配列を配列番号１に記載する。
Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素は次の性質を有する。
作用： コアタンパク質とポリペプチドのセリン、スレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する。触媒する反応を反応式で記載すると、
ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン＋ペプチド（セリン／スレオニン）⇔ＵＤＰ＋Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミン−１−セリン／スレオニン−ペプチド）
基質特異性： コアタンパク質のポリペプチドのセリン、スレオニン残基の水酸基
本発明の改変体に使用されるＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は限定されない。即ち、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現されたタンパク質、または化学合成タンパク質の何れでもよい。
（２）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体
本発明のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体（以下、単に「本発明の改変体」という）は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。即ち、本発明の改変体は、遺伝子工学的手法によりＤＮＡから発現させた組換えタンパク質、または化学合成タンパク質の何れであってもよい。あるいは、本明細書に記載した特徴を有する限り、人為的に改変を施したものでなく天然に得られたタンパク質であってもよい。あるいは、タンパク質レベルで天然由来のタンパク質に改変を施したものでもよい。
本発明によれば、１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして、３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換することを含む方法によって製造され、並びにタンパク質またはペプチドのセリンまたはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性が、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、増加または減少している、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体が提供される。
ここで、本明細書において使用する用語「Ｙファミリー」とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のうち酵素活性が高い酵素群と低い酵素群とを大別した場合に、酵素活性が低い酵素群をいう。ここで、酵素活性が低い酵素群の活性は、高い酵素群と比較して、好ましくは１０倍以下、より好ましくは２５倍以下、さらにより好ましくは５０倍以下、最も好ましくは１００倍以下である。好ましくは、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７、Ｔ９、Ｔ１８、およびＴ８である。なお、本明細書において、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７、Ｔ９、Ｔ１８、およびＴ８のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７に記載される。
本明細書において使用する用語「Ｗファミリー」とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のうち酵素活性が高い酵素群をいう。好ましくは、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ１３、Ｔ１４、Ｔ１５、Ｔ１６である。なお、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ１３、Ｔ１４、Ｔ１５、およびＴ１６のアミノ酸配列は、表１に記載の各文献にアミノ酸配列および塩基配列は開示され、これら文献は全て本明細書において援用される。
本発明の改変体は、以下の工程によって作製することができる。即ち、１）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させ；２）Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し；そして、３）前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換することを含む方法によって製造することができる。
本明細書において、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群のアミノ酸配列を、重複する部分の同一性が最大化するようにし、そして配列ギャップが最小化するように並列させる方法は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この配列比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較する方法によってなされる。当業者により使用される配列比較のプログラムでは、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＯ．，ＬＴＤ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ．（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６７３−４６８０（１９９４））である。プログラムによる配列比較の各種条件（パラメーター）は、ソフトウェアに添付の仕様書、または専用サイトに詳説されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、ＧＥＮＥＴＹＸは、核酸解析、タンパク質解析用の遺伝情報処理ソフトウェアで、通常のホモロジー解析やマルチアラインメント解析の他、シグナルペプチド予測やプロモーター部位予測、二次構造予測が可能である。また、本明細書で用いたホモロジー解析プログラムは、高速・高感度な方法として多用されているＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法［Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．＆Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４３５−１４４１（１９８５）］を採用している。
本発明によれば、前述した配列比較によって、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が共通するアミノ酸残基（α）を有し、かつ、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群がαに相当する位置においてαと異なる共通するアミノ酸残基（β）を有するような、アミノ酸残基を見出し、その後、前記アミノ酸残基の位置において、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基αをβに置換する、あるいはＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群の改変体の場合は、アミノ酸残基βをαに置換することよって製造することができる。
例えば、図３において、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７のアミノ酸残基２３４番目の位置を基準にすると、ＹファミリーのＴ１７、Ｔ９、Ｔ１８、Ｔ８では全てＴｒｐ（α）として共通である。一方、このαに対応する位置において、ＷファミリーのＴ１、Ｔ１３、Ｔ３、Ｔ６、Ｔ１２、Ｔ４、Ｔ１５、Ｔ１０、Ｔ２０、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ１１、Ｔ１９、Ｔ１４、Ｔ１６、Ｔ２では全てＡｌａ（β）となっている。本発明は、例えばこの位置のα（Ｔｒｐ）をβ（Ａｌａ）にすることにより活性を変えるものである。
本発明の一態様としては、図３および図４に示すように、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素群が有する共通のアミノ酸残基（α）としては、限定されるわけではないが、アミノ酸残基Ｔｒｐ（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の２３４番目）、Ａｌａ（２５６番目）（以上、図３）、Ｌｅｕ（３４３番目）、Ｔｙｒ（３５０番目）、Ａｌａ（３７７番目）（以上、図４）が例示される。アミノ酸残基αに相当する位置にあり、αと異なる共通するＷファミリーのアミノ酸残基（β）としては、各々、Ａｌａ（ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の１９７番目）、Ｌｅｕ（２１９番目）（以上、図３）、Ｔｙｒ（３０９番目）、Ｔｒｐ（３１６番目）、Ｇｌｙ（３４３番目）（以上、図４）が相当する。
Ｗファミリーにおいては、アミノ酸残基βが全てのＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素において共通している必要はなく、１つ程度異なっていてもよい。例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ７ではＴｙｒ（３１１番目）となっているが、これに相当する位置における他のＷファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素では全てＬｅｕ（例えば、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の２１９番目）となっている。このような態様である改変体も本発明に含まれる。
本発明の改変体に使用されるＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードする核酸、および該核酸がコードする推定アミノ酸は、前述のようにすでに公知となっている。したがって、本発明の改変体の発現、単離及び精製は、任意公知の技術を用いて行うことができる。例えば、非限定的に以下の手法を適用することができる。
本発明の改変体は、簡単には、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードするｃＤＮＡを鋳型として、標的とするアミノ酸残基（例えば、Ｙファミリーのアミノ酸残基α）をコードする３塩基（コドン）を他のアミノ酸残基（例えば、Ｗファミリーのアミノ酸残基β）のコドンに置換したＰＣＲ用のプライマーを用いて行うことができる。同一のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素に点突然変異を複数箇所導入するには、各種プライマーの組み合わせによって達成される。このような特定の１つまたは複数のアミノ酸残基を置換させる方法は、公知の点突然変異法（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｉｎ Ｌｅｓ Ｐｒｉｘ Ｎｏｂｅｌ（ｅｄ．Ｔ．Ｆｒａｎｇｓｍｙｒ），ｐ．１０７．Ａｌｍｑｖｉｓｔ ａｎｄ Ｗｉｌｓｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，１９９３； Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｉｎ Ｌｅｓ Ｐｒｉｘ Ｎｏｂｅｌ（ｅｄ．Ｔ．Ｆｒａｎｇｓｍｙｒ），ｐ．１２３．Ａｌｍｑｖｉｓｔ ａｎｄ Ｗｉｌｓｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，１９９３）を参照して行うことも可能である。具体的には、後述する実施例２に記載したように、点突然変異を有する改変体を構築することができる。なお、本発明の改変体は、例えば、後述の実施例３に従って、点突然変異を施した核酸（好ましくはＤＮＡ）を大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入および発現させることにより大量に得ることができる。
本発明の一態様において、本発明の改変体は、好ましくは配列番号１のアミノ酸残基２３４に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基２５６に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基、アミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基、およびアミノ酸残基３７７に相当するアミノ酸残基のうちの１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されている改変体である。このうち、配列番号１のアミノ酸残基２３４、および２５６番目に相当するアミノ酸残基は、図３に示されるＧＴ１モチーフと呼ばれるドメインに属する（図３）。また、配列番号１のアミノ酸残基３４３、３５０、および３７７番目に相当するアミノ酸残基は、図４に示されるＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔモチーフと呼ばれるドメインに属する。したがって、本発明の改変体は、好ましくは、ＧＴ１モチーフ、および／またはＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔモチーフに属するアミノ酸残基の置換である。ここで、本明細書において、ＧＴ１モチーフとは、糖転移酵素（Ｇｌｙｃｏｓｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に一般的に保存されている、二価カチオンＭｎ＋と結合するＤＸＨ配列を含む保存性の高い領域をいい、Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔモチーフとは、ＧａｌＮＡｃ転移酵素−β１−４ガラクトース転移酵素間に強く保存されている領域をいう。本発明の改変体は、Ｙファミリーにおいて置換されているアミノ酸残基が、上記のドメインに限定されず、これら以外のドメインに属しているものであってよい。
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２３４に相当するアミノ酸残基ＴｒｐのＡｌａへの改変、アミノ酸残基２５６に相当するアミノ酸残基ＡｌａのＬｅｕへの改変、アミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基ＬｅｕのＴｙｒへの改変、アミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基ＴｙｒのＴｒｐへの改変、およびアミノ酸残基３７７に相当するアミノ酸残基ＡｌａのＧｌｙへの改変のうち１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されている改変体である。
さらにより好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基ＬｅｕのＴｙｒへの改変、アミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基ＴｙｒのＴｒｐへの改変、およびアミノ酸残基３７７に相当するアミノ酸残基ＡｌａのＧｌｙへの改変のうちの１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されている改変体である。改変箇所は、１つでもよく、複数でもよい。
最も好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基３４３に相当するアミノ酸残基ＬｅｕがＴｙｒに改変され、およびアミノ酸残基３５０に相当するアミノ酸残基ＴｙｒがＴｒｐに改変されている改変体である。
本発明によれば、本発明の改変体は、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、酵素活性が増加または減少している。
本発明の一態様では、Ｙファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体は、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、酵素活性が増加することが好ましい。Ｙファミリーの酵素活性の増加は、好ましくは１００倍以上、より好ましくは５０倍以上、さらにより好ましくは２０倍以上、最も好ましくは１０倍以上である。具体的には、後述する実施例６に記載したように、Ｙファミリーに属するｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７のアミノ酸配列に２箇所の点突然変異を施した場合、酵素活性が約１００倍増加している。
本発明の一態様では、Ｗファミリーに属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体は、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して、酵素活性が減少することが好ましい。Ｗファミリーの酵素活性の減少は、好ましくは１／１００以下、より好ましくは１／５０以下、さらにより好ましくは１／２５以下、最も好ましくは１／１０以下である。
（３）Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体をコードする核酸
本発明によれば、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体をコードする核酸（以下、「本発明の核酸」という）が提供される。上記核酸は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ、およびそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組合せが含まれる。使用する核酸としては、ＤＮＡが好ましい。本明細書において、ある特定の塩基配列について記載する場合、特に言及しない限り、その相補鎖も含む。
本明細書では、配列番号１および配列番号２において、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７のアミノ酸配列、およびそれをコードする塩基配列が開示されている。また、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７以外の酵素のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、ＷＯ０３／０５７８８７、あるいは本明細書に記載した先行技術文献に開示されている。当該配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応などの遺伝子工学的手法により、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子、及び当該遺伝子がコードするタンパク質またはポリペプチドも、本発明のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体を得るために利用可能である。
前述したＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体におけるアミノ酸残基αおよびβ以外のアミノ酸残基は、活性を変更しない限り、変更することが可能である。相同遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件下で行うことが好ましい。ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも ７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ Ｄ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９）； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ Ｋ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２２（１９９０）； Ｂａｒａｎｙ Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９３（１９９１））および転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））およびＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，ｐ．１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定されれ；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｂｉａｓｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
（３）組換えベクターと形質転換体
プラスミド等のベクターに本発明の改変体をコードする核酸のＤＮＡ断片を組込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、大腸菌ＤＨ５α、ＤＨ１０ＢＡＣ、ＴＢ１、ＬＥ３９２、ＸＬ−ＬＥ３９２、またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１６．１（２００１）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
ベクターは、簡単には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＴＡＰｌｕｓ、ｐＤｒｉｖｅ、ｐＥＴＢｌｕｅ−１等が例示されるが、これらに限定されない。
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、本発明の改変体を発現させたい宿主細胞に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように発現ベクターは、本発明の改変体が目的の宿主細胞中で発現し得るように遺伝子発現に関与する領域（プロモーター領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに本発明の改変体をコードする核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。また、発現ベクターの構築は、制限処理および連結作業を必要としない、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を用いても行うことができる。Ｇａｔｅｗａｙシステムとは、ＰＣＲ産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、ＤＮＡ断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、ＰＣＲ産物およびドナーベクターから部位特異的な組換え酵素であるＢＰクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるＬＢクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにＰＣＲ産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間のかかるサブクローニングステップが不要である点を特徴の一つとする。
発現ベクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０等が好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２、ｐＡＵＲ１２３（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡ０８１５（以上ピキア属）、昆虫細胞用発現ベクターとしてｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、哺乳類細胞用発現ベクターとしてｐＤＥＳＴ１２．２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３、ｐＤＯＮ−ＡＩなどが好ましい。
上記発現ベクターを宿主細胞に組み込み、形質転換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。該形質転換体を得るための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト（例えば、ＨＴ１０８０ ＦＰ−１０、２９３、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）等由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
ところで、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードする核酸は、哺乳類のゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、真核細胞を形質転換体の宿主細胞として用いることより天然物に近い性質を有したＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体が得られる（例えば、糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、宿主細胞としては真核細胞、特に哺乳類細胞を選択することが好ましい。哺乳類細胞としては、具体的には、ヒト由来、ラット由来、マウス由来、アフリカツメガエル由来、ハムスター由来、またはサル由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。また、宿主細胞としての大腸菌、酵母または昆虫細胞は、具体的には、大腸菌（ＤＨ５α、ＤＨ１０ＢＡＣ、Ｍ１５Ｍ、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（Ｓｆ２１、Ｓｆ９、ＢｍＮ４、カイコ幼虫等）などが例示される。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを含んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
発現べクタ−において、好ましい開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好ましいプラスミドとしては、大腸菌ではプラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２若しくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばジェネティシン（Ｇ−４１８）、テトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン若しくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション（連結）等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｒの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８））やリチウム法（Ｊ．Ｂ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５））、エレクトロポレ−ション法（Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６））によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３））、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３））によってそれぞれ形質転換することができる。なお、組換えベクターの構築およびそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が実施例４に詳述されている。
（４）タンパク質の単離・精製
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させて、その培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
本発明の改変体は、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源若しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源若しくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、本発明の改変体が大量に生産されるように適宜選択される。
本発明の改変体は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明の改変体が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば、濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液であり、ｐＨは用いる緩衝液によって異なるがｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明の改変体が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明の改変体の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明の改変体を生産した場合には、イオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
本発明の改変体はまた、精製および同定を容易にするために添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれるが、これらに限定さるものではない。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号９））であり、該ペプチドは非常に抗原性であり、そしてそれぞれに特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。また、４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
具体的には、本発明の改変体を発現する発現ベクターにＦＬＡＧタグのｃＤＮＡを挿入し、標識した改変体を発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて改変体の発現を確認することができる。
（５）医薬組成物
本発明において、本発明の改変体は、タンパク質またはペプチドのセリンまたはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性が、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して増加することが明らかとなった。したがって、本発明のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体を含む医薬組成物は、タンパク質のＯ−グリカンの修飾パターンを変えることができる。
本発明の医薬組成物は、薬学的に受容可能な担体との混合物中に、本発明の改変体を治療上有効な量を含む。本発明の医薬組成物は、全身的にまたは局所的に、好ましくは静脈内、皮下内、筋肉内に非経口的に投与し得る。非経口的に投与可能な改変体の溶液の調剤は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮し、当業者の技術範囲内において行い得る。
本発明の医薬組成物の用量用法は、薬剤の作用、例えば、患者の症状の性質および／若しくは重度、体重、性別、食餌、投与の時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮し、診察する医師により決定され得る。当業者は、これらの要素に基づき、本発明の医薬組成物の用量を決定することができる。
あるいは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体をコードする核酸を組込んだ発現ベクターを作製し、生体内の標的部位で発現させるか、あるいは当該発現ベクターを組み込んだ細胞を標的部位に輸送させることにより、標的部位のタンパク質のＯ−グリカンの修飾パターンを改変し、さらには、その結果として糖タンパク質の高次構造を改変することも可能である。
本発明によれば、改変型Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素を導入することにより、Ｏ−グリカンの修飾パターンを変化させることができ、その結果としてＯ−グリカンの異常によって引き起こされる疾患を予防、または治療するための医薬組成物が提供される。Ｏ−グリカンの異常によって引き起こされる疾患とは、例えば、ＩｇＡ腎症、ＨＥＭＰＡＳ、Ｔｎポリアグルチネーション症候群、糖尿病および高血糖症に伴うコア２ＧｌｃＮＡｃ転移酵素誘導による心疾患である。
（６）本発明の改変体を認識する抗体
本発明により、本発明の改変体に免疫反応性である抗体が提供される。こうした抗体は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介して、該タンパク質に特異的に結合し得る。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはその断片、変異体若しくは融合タンパク質などを、それぞれに免疫反応性である抗体を産生するための免疫原として使用することが可能である。
より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含むが、これら抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもよいし、より高次構造（断続的）でもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるあらゆる方法によって同定できる。したがって、本発明は、本発明の改変体の抗原性エピトープにも関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。
前記のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル抗体（若しくは抗血清）または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製するための研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、タンパク質の化学的または酵素的切断などの当該技術分野において公知の技術を用いて、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて産生することができる。
本発明の改変体によってあらゆる態様の抗体が誘導される。該タンパク質のポリペプチド全部若しくは一部またはエピトープが単離されていれば、慣用的技術を用いてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも調製可能である。例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０；Ｂｕｒｄｏｎら編「生化学実験法１０ モノクローナル抗体」東京化学同人、１９８９を参照されたい。
本発明によれば、本発明のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も提供される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明の酵素タンパク質で免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。こうしたモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化型抗体は、ヒトに投与されて免疫原性を減少させるという利点を有する。
また、本発明によれば、上記抗体の抗原結合断片も提供される。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片および誘導体もまた提供される。このような抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、本発明の改変体またはそのポリペプチド断片の存在を検出するためのアッセイに使用可能である。また本発明の抗体は、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって該タンパク質またはそのポリペプチド断片を精製することにも使用することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１ Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素のＹファミリーおよびＷファミリーの分類法
Ｈａｇｅｎらは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の分子構造から酵素活性領域にはＧＴ１モチーフとＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔモチーフが含まれ、触媒活性に関与していると推定している（Ｈａｇｅｎ，Ｆ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，６７９７−６８０３，１９９９）。我々は、１８種類のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素のアミノ酸配列をＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＯ．，ＬＴＤ）によりマルチアライメント分析を行い系統樹（図１）を得た。さらに、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素のアミノ酸配列のマルチアライメント分析（図２）から、少なくとも、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１７、およびＴ１８の４つの酵素は、他のｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔと比べて、ＧＴ１モチーフ領域において２ヶ所（図３）、Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔモチーフ領域において３ヶ所の共通なアミノ酸置換があることを見つけた（図４）。
ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７のアミノ酸配列（配列番号１）を参考にして、具体的なアミノ酸残基の置換について以下に説明する：
（１）２３４番目のトリプトファン（Ｗ）は、Ｗファミリーの相応する位置のアラニン（Ａ）に対応する。
（２）２５６番目のアラニン（Ａ）は、Ｗファミリーの相当する位置のロイシン（Ｌ）に対応する。
（３）３４３番目のロイシン（Ｌ）は、Ｗファミリーの相当する位置のチロシン（Ｔ）に対応する。
（４）３５０番目のチロシン（Ｙ）は、Ｗファミリーの相当する位置のトリプトファン（Ｗ）に対応する。
（５）３７７番目のアラニン（Ａ）は、Ｗファミリーの相当する位置のグリシン（Ｇ）に対応する。
ここで、上記（４）の３５０番目に相当するアミノ酸残基がチロシン（Ｙ）であるＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素をＹファミリーと命名し、それ以外のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素をＷファミリーと命名した。
実施例２ Ｙファミリーのｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７を用いた点突然変異体の構築
ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の点突然変異は、実施例１に示した５ヶ所のアミノ酸残基の全てか、またはそのうちのいくつかを相当する位置のＷファミリーのアミノ酸残基に置換するものである。このような点突然変異体の作製は、ＰＣＲ法を用いて行った（図５参照）。
簡単には、置換アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含むプライマーを設計し、２段階のＰＣＲによって目的の点突然変異体を作製する。第一のＰＣＲでは、プライマーＦ（5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTTCACTGAGAAGAGTCAAAG-3’（配列番号１０）：下線部は配列番号２のヌクレオチド１−２５に相当する）とプライマーＡ、およびプライマーＢとプライマーＲ（5’-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTACTTGATGGAGTTCTTAATGGTCCAC- 3’（配列番号１１）：下線部は配列番号２のヌクレオチド１７９７−１７７０に相当する）によってそれぞれ５’側の断片および３’側の断片を増幅する。プライマーＡとプライマーＢとは、下記に示すように、置換アミノ酸をコードするヌクレオチドを含むものであり、互いに１４−３０塩基の相補的な配列を有する。さらに、アニーリング、増幅を行った後、第二のＰＣＲを行う。この第二のＰＣＲでは、前記のプライマーＦとプライマーＲを用いて点突然変異体の全長を増幅する。
以下、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の各点突然変異体の作製に使用したプライマーＡとプライマーＢを示す。各プライマーの下線を施したヌクレオチドは変異箇所である。
（１）配列番号１のアミノ酸残基３４３と３５０の二置換体（以下、「Ｏ６ＤＭ」と称する）
１）プライマーＡ（Ｏ６ＤＭＲ１０５９）
5’-TTC TCC TCC CCA TAC ATC CAT GCC AGG ATC GTA AAG ACC AAT TTC- 3’（配列番号１２）
353-Glu Gly Gly Trp Val Asp Met Gly Pro Asp Tyr Leu Gly Ile Glu-339
（配列番号２のヌクレオチド１０１５−１０５９、アンチセンス）
２）プライマーＢ（Ｏ６ＤＭＦ１０１８）
5’-TT GGT CTT TAC GAT CCT GGC ATG GAT GTA TGG GGA GGA GAA AAT- 3’（配列番号１３）
341-Gly Leu Tyr Asp Pro Gly Met Asp Val Trp Gly Gly Glu Asn-354
（配列番号２のヌクレオチド１０１９−１０６２、センス）
（２）配列番号１のアミノ酸残基３４３の置換体（以下、「Ｏ６ＬＹ」と称する）
１）プライマーＡ（Ｏ６ＬＹ１０４６Ｒ）
5’-AC ATC CAT GCC AGG ATC GTA AAG ACC AAT TTC- 3’（配列番号１４）
348-Asp Met Gly Pro Asp Tyr Leu Gly Ile Glu-339
（配列番号２のヌクレオチド１０１５−１０４６、アンチセンス）
２）プライマーＢ（Ｏ６ＬＹ１００５Ｆ）
5’-G TTC TTC GGT GAA ATT GGT CTT TAC GAT CCT GG- 3’（配列番号１５）
336-Phe Phe Gly Glu Ile Gly Leu Tyr Asp Pro-345
（配列番号２のヌクレオチド１００５−１０３７、センス）
（３）配列番号１のアミノ酸残基３５０の置換体（以下、「Ｏ６ＹＷ」と称する）
１）プライマーＡ（Ｏ６ＹＷ１０６８Ｒ）
5’-TTC AAT ATT TTC TCC TCC CCA TAC ATC CAT GCC- 3’（配列番号１６）
356-Glu Ile Asn Glu Gly Gly Trp Val Asp Met Gly-346
（配列番号２のヌクレオチド１０３６−１０６８、アンチセンス）
２）プライマーＢ（Ｏ６ＹＷ１０２９Ｆ）
5’-GAT CCT GGC ATG GAT GTA TGG GGA GGA GAA AAT- 3’（配列番号１７）
344-Asp Pro Gly Met Asp Val Typ Gly Gly Glu Asp-354
（配列番号２のヌクレオチド１０３０−１０６８、センス）
（４）配列番号１のアミノ酸残基３７７の置換体（以下、「Ｏ６ＡＧ」と称する）
１）プライマーＡ（Ｏ６ＡＧ１１４９Ｒ）
5’-CTT CTT CCG CTC AAT GTG GCC CAC CCG T- 3’（配列番号１８）
383-Lys LysArg Glu Ile His Gly Val Arg-375
（配列番号２のヌクレオチド１１２２−１１４９、アンチセンス）
２）プライマーＢ（Ｏ６ＡＧ１１０８Ｆ）
5’-TC CTT CCT TGC TCA CGG GTG GGC CAC ATT GAG- 3’（配列番号１９）
371-Leu Pro Cys Ser Arg Val Gly His Ile Glu-380
（配列番号２のヌクレオチド１１０９−１１４０、センス）
（５）配列番号１のアミノ酸残基２３４と２５６の二置換体（以下、「Ｏ６−２Ｎ」と称する）
１）プライマーＡ（Ｏ６ＷＡ７４７Ｒ）
5’-CAC GTG GGC ATC AAA GAA GCC AGT GAC CTG CCC GGT AGC CAC CTT CGC GCC CTC AAT- 3’（配列番号２０）
249-Val His Ala Asp Phe Phe Gly Thr Val Gln Gly Thr Ala Val Lys Ala Gly Glu Ile-231
（配列番号２のヌクレオチド６９１−７４７、アンチセンス）
２）プライマーＢ（Ｏ６ＡＬ７２１Ｆ）
5’-GTC ACT GGC TTC TTT GAT GCC CAC GTG GAA TTC ACC GCT GGC TGG CTT GAG CCG GTT- 3’（配列番号２１）
241-Val Thr Gly Phe Phe Asp Ala His Val Glu Phe Thr Ala Gly Trp Leu Glu Pro Val-259
（配列番号２のヌクレオチド７２１−７７７、センス）
上記のようなプライマーの設計により各種点突然変異体を作製することができるが、Ｏ６ＤＭの改変体の作製を一例として説明する。
野生型ｐＤＯＮＲ２０１−ＲＯ６プラスミドを鋳型とし、第一のＰＣＲ−１ではプライマーＦとプライマーＯ６ＤＭＲ１０５９、第一のＰＣＲ−２ではプライマーＯ６ＤＭＦ１０１８とプライマーＲを用いて行った。増幅は２５μｌの反応系において、１ｎｇ／μｌの鋳型ＤＮＡ、１０μＭの各プライマー、５ Ｕｎｉｔｓ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４６ １７３）を用いて、９５℃３０秒、５８℃４５秒、７２℃１分を２０サイクル行う反応条件で増幅し、それぞれ９５７ｂｐと７８２ｂｐのＤＮＡ断片を得た。増幅されたＤＮＡ断片はＳＲ−４００ゲルろ過カラム（アマシャム社）を用いて精製した。第一のＰＣＲによって得られたＰＣＲ精製産物（各１μｌ）を鋳型ＤＮＡとし、第二のＰＣＲを行った。第２のＰＣＲでは、まず、１０μｌの反応系として、第一のＰＣＲによるＤＮＡ断片をアニーリング（９８℃、５分）し、鋳型ＤＮＡを伸長（７２℃、１０分、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４６ １７３））した。その後、前述のプライマーＦとプライマーＲをそれぞれの最終濃度が１０μＭとなるように添加し、最終反応系が２５μｌになるように調製し、９５℃３０秒、５８℃４５秒、７２℃２分を２０サイクル行った。得られたＤＮＡ断片を精製し、ＧＡＴＡＷＡＹ ＳＹＳＴＹＥＭ ｐＤＯＮＲ２０１のドナーベクター（インビトロジン社）にクローニングし、配列を確認した。
実施例３ 発現ベクターの構築
（１）ＧａｔｅｗａｙシステムによるｐＦａｓｔＢａｃへの組込み
（ｉ）エントリークローンの作製
上記の実施例２で得られた各種改変体のＤＮＡ断片を精製した後、ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ反応によってｐＤＯＮＲ２０１に組み込み、エントリークローンを作成した。目的のＤＮＡ断片５μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１ １μｌ（１５０ｎｇ）、反応緩衝液２μｌ、ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘ ２μｌを２５℃で１時間インキュベートして反応させた。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを１μｌ加えて３７℃で１０分間インキュベートした後、反応を停止した。その後、全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショックの後、カナマイシンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクターを抽出および精製した。変異遺伝子の塩基配列の全長を確認した。
（ｉｉ）発現クローンの作製
エントリークローンは、ＤＮＡ挿入部の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換え部位であるａｔｔＬを有するため、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（ラムダファージの組換え酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデスティネーションベクターと混合することにより、ＤＮＡ挿入部がデスティネーションベクターに移り、発現クローンが作製される。具体的な工程は以下のとおりである。
まず、エントリークローン１μｌ、ｐＦＢＩＦを０．５μｌ（７５ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ ４．５μｌ、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘ ２μｌを２５℃で１時間反応させた。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを１μｌ加えて３７℃で１０分間インキュベートさせ、反応を終了させた（この組換え反応でｐＦＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔが生成される）。
（２）Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄの作製
続いて、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社）を用いて上記ｐＦＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＴとｐＦａｓｔＢａｃとの間で組換えを起こさせ、昆虫細胞中で増殖可能なＢａｃｍｉｄにＧａｌＮＡｃ−Ｔその他の配列を挿入した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、Ｂａｃｍｉｄを含む大腸菌（ＤＨ１０ＢＡＣ）に目的遺伝子を挿入したｐＦａｓｔＢａｃを導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換えタンパク質によって目的の遺伝子がＢａｃｍｉｄへ取り込まれるというものである。またＢａｃｍｉｄにはｌａｃＺ遺伝子が組み込まれており、古典的な青（挿入なし）−白（挿入あり）コロニーによる選択が可能である。
上記の精製ベクター（ｐＦＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ）５０μｌと混合し、ヒートショック後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、及びＩＰＴＧを含むＬＢプレートにまいた。翌日、白い単独コロニーをさらに培養し、Ｂａｃｍｉｄを回収した。
実施例４ 昆虫細胞へのＢａｃｍｉｄの導入
白コロニーから得られたＢａｃｍｉｄに目的とする配列が挿入されていることを確認した後、Ｂａｃｍｉｄを昆虫細胞（Ｓｆ２１）に導入した。３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１細胞９×１０５ ｃｅｌｌ／２ｍｌ（抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩ）を加え、２７℃で１時間培養することによって細胞を接着させた。（１）溶液Ａ：精製したｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ ５μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ １００μｌを加えたものである。（２）溶液Ｂ：ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ Ｒｅａｇｅｎｔ ６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ １００μｌを加えたものである。その後、溶液Ａおよび溶液Ｂを丁寧に混合して１５〜４５分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引・除去し、抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ ２ｍｌを加えた。溶液Ａと溶液Ｂを混合して調製した溶液（ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に抗生物質を含まないＳｆ９００ＩＩ ８００μｌを加えて丁寧に混和した。培養液を吸引・除去し、細胞に希釈したｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液を添加し、２７℃で５時間インキュベートした。その後、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓを除き、抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩ培養液２ｍｌを加えて２７℃で７２時間インキュベーションした。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎから７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をチューブに保存した（上清を一次ウイルス液とした）。
Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７ ｃｅｌｌ／２０ｍｌ Ｓｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を加えて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したことを確認後、前記の一次ウイルスを８００μｌ添加して、２７℃で４８時間培養した。４８時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清をチューブに保存した（上清を二次ウイルス液とした）。
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７ ｃｅｌｌ／２０ｍｌ Ｓｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を加えて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したことを確認したのち、二次ウイルス液１０００μｌを添加して、２７℃で７２〜９６時間培養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清をチューブに保存した（上清を三次ウイルス液とした）。
さらに、１００ｍｌ用スピナーフラスコにＳｆ２１細胞を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度で１００ｍｌを加え、三次ウイルス液を１ｍｌ添加した。２７℃で約９６時間培養した後に、細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清をチューブに保存した（この上清を四次ウイルス液とした）。
一次ウイルス液から三次ウイルス液を調製するまでに得られるセルペレットをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）、細胞粗抽出液をＨ２Ｏで２０倍に希釈し、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行った。その後、ウエスタンブロッテイングを行い、それぞれ目的とする改変体の発現を確認した。ＦＬＡＧで標識された改変体（ＦＬＡＧ−改変体）に対する検出用抗体として、抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、ＳＩＧＭＡ社）を用いた。各改変体は、推定アミノ酸配列から計算した分子量とほぼ同じ位置にバンドとして検出された（データ示さず）。
実施例５ 各改変体のレジン精製
前記で調製した三次感染のボトルからさらに四次感染をさせ、両ボトルからペレットと上清を回収し、遠心分離後（５０００ｒｐｍ、１０分を２回）、ペレットをソニケーションした（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）、ペレット粗抽出液と上清についてタンパク質定量（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）した。タンパク量を調整した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッテイングで改変体の発現を確認した。この結果から精製には、もっとも相対的に発現量の多い、四次感染のＦＬＡＧ−改変体の上清を使用することとした。上清２０ｍｌにＮａＮ３（０．０５ ％）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、抗Ｍ１レジン（Ｓｉｇｍａ 社）（１００μｌ）を混合し、４℃で一夜攪拌した。翌日、遠心（３０００ｒｐｍ、５分、４℃）してペレットを回収し、ＴＢＳを９００μｌ加えて２回洗浄遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）した。ペレットを２００μｌの２−４ｍＭ ＥＤＴＡ・ＴＢＳに１２時間浮遊させ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の簡易フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を通して、この上清を活性測定用の酵素源とした。上記のように精製した改変体をウエスタンブロッテイングでタンパク質定量を行った。なお、０−４５０ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＰＡ（シグマ社）タンパク質を検量タンパク質とした。
実施例６ 各改変体の受容体基質へ活性測定
改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の活性と比較して、各改変体の活性変化を測定するために、Ｎ末端にＦＡＭで標識した合成ペプチドＭｕｃ１ａ（ＦＡＭ−ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲ（配列番号２２）（サワディー・テクノロジー社）を受容体基質として、供与体基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（シグマ社）を用いて酵素活性を測定した。
反応液は、受容体基質（５０μＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（２５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（１０ｍＭ）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（２５０ｎＭ）（カッコ内は最終濃度を示す）とした。この反応液にＧａｌＮＡｃ−Ｔ酵素液を１０μｌ加えて、さらにＨ２Ｏを加えて全量を２０μｌとした。
上記反応混合液を３７℃で６０分、１２０分、２１０分、３６０分反応させ、０．５Ｍ
ＥＤＴＡで反応を終了させた。反応終了後、Ｈ２Ｏを４０μｌ加え、軽く遠心後、上清を回収した。得られた上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の簡易フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を通して、２０μｌ−４０μｌをＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ用カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク社 Ｃｏｄｅ Ｎｏ．３７８−６６）を用いた。展開バッファーＡは、０．０５％ ＴＦＡを含むイオン交換水とし、展開バッファーＢは、受容体基質によって０．０５％ ＴＦＡのアセトニトリルを用いた。分離には展開バッファーＢの濃度勾配を用い、３０分で５０％まで上昇するようにした。検出条件は、励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍとした。
ＨＰＬＣ分析により、受容体基質Ｍｕｃ１ａのピーク（保持時間１９.６１６分）とは異なり、反応後には新たな反応産物由来のピーク（保持時間１８，９３０分）が検出された（データ示さず）。さらに反応産物の生産量を表すピーク面積の比（パーセンテージ）により各改変体の相対活性を算出した。各変異体の相対活性の結果は図６に示す。受容体基質ＭＵＣ１ａ’を用いた実験結果により、各変異体はＧａｌＮＡｃＴ活性を有することが明らかになった。また野生型Ｏ６（Ｏ６ＷＴ）に対し、点変異酵素はより強い相対活性があることが分かった。より具体的には、Ｏ６ＷＲの活性を１とした場合に、一置換体であるＯ６ＹＷでは活性が約２５倍まで増加した。また、一置換体であるＯ６ＬＹでは約９０倍まで増加した。さらに、これらのアミノ酸残基の置換体を有する二置換体のＯ６ＤＭでは、相乗効果として約１３８倍まで活性が増加した。また、改変体の活性は、Ｗファミリーに属する野生型Ｔ２やＴ１３（それぞれＴ２ＷＴ、Ｔ１３ＷＴ）と同程度まで回復した。
実施例１ Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素のＹファミリーおよびＷファミリーの分類法
Ｈａｇｅｎらは、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の分子構造から酵素活性領域にはＧＴ１モチーフとＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔモチーフが含まれ、触媒活性に関与していると推定している（Ｈａｇｅｎ，Ｆ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，６７９７−６８０３，１９９９）。我々は、１８種類のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素のアミノ酸配列をＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＯ．，ＬＴＤ）によりマルチアライメント分析を行い系統樹（図１）を得た。さらに、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素のアミノ酸配列のマルチアライメント分析（図２）から、少なくとも、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１７、およびＴ１８の４つの酵素は、他のｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔと比べて、ＧＴ１モチーフ領域において２ヶ所（図３）、Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔモチーフ領域において３ヶ所の共通なアミノ酸置換があることを見つけた（図４）。
ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７のアミノ酸配列（配列番号１）を参考にして、具体的なアミノ酸残基の置換について以下に説明する：
（１）２３４番目のトリプトファン（Ｗ）は、Ｗファミリーの相応する位置のアラニン（Ａ）に対応する。
（２）２５６番目のアラニン（Ａ）は、Ｗファミリーの相当する位置のロイシン（Ｌ）に対応する。
（３）３４３番目のロイシン（Ｌ）は、Ｗファミリーの相当する位置のチロシン（Ｔ）に対応する。
（４）３５０番目のチロシン（Ｙ）は、Ｗファミリーの相当する位置のトリプトファン（Ｗ）に対応する。
（５）３７７番目のアラニン（Ａ）は、Ｗファミリーの相当する位置のグリシン（Ｇ）に対応する。
ここで、上記（４）の３５０番目に相当するアミノ酸残基がチロシン（Ｙ）であるＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素をＹファミリーと命名し、それ以外のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素をＷファミリーと命名した。
実施例２ Ｙファミリーのｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７を用いた点突然変異体の構築
ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の点突然変異は、実施例１に示した５ヶ所のアミノ酸残基の全てか、またはそのうちのいくつかを相当する位置のＷファミリーのアミノ酸残基に置換するものである。このような点突然変異体の作製は、ＰＣＲ法を用いて行った（図５参照）。
簡単には、置換アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含むプライマーを設計し、２段階のＰＣＲによって目的の点突然変異体を作製する。第一のＰＣＲでは、プライマーＦ（5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTTCACTGAGAAGAGTCAAAG-3’（配列番号１０）：下線部は配列番号２のヌクレオチド１−２５に相当する）とプライマーＡ、およびプライマーＢとプライマーＲ（5’-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTACTTGATGGAGTTCTTAATGGTCCAC- 3’（配列番号１１）：下線部は配列番号２のヌクレオチド１７９７−１７７０に相当する）によってそれぞれ５’側の断片および３’側の断片を増幅する。プライマーＡとプライマーＢとは、下記に示すように、置換アミノ酸をコードするヌクレオチドを含むものであり、互いに１４−３０塩基の相補的な配列を有する。さらに、アニーリング、増幅を行った後、第二のＰＣＲを行う。この第二のＰＣＲでは、前記のプライマーＦとプライマーＲを用いて点突然変異体の全長を増幅する。
以下、ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１７の各点突然変異体の作製に使用したプライマーＡとプライマーＢを示す。各プライマーの下線を施したヌクレオチドは変異箇所である。
（１）配列番号１のアミノ酸残基３４３と３５０の二置換体（以下、「Ｏ６ＤＭ」と称する）
１）プライマーＡ（Ｏ６ＤＭＲ１０５９）
5’-TTC TCC TCC CCA TAC ATC CAT GCC AGG ATC GTA AAG ACC AAT TTC- 3’（配列番号１２）
353-Glu Gly Gly Trp Val Asp Met Gly Pro Asp Tyr Leu Gly Ile Glu-339
（配列番号２のヌクレオチド１０１５−１０５９、アンチセンス）
２）プライマーＢ（Ｏ６ＤＭＦ１０１８）
5’-TT GGT CTT TAC GAT CCT GGC ATG GAT GTA TGG GGA GGA GAA AAT- 3’（配列番号１３）
341-Gly Leu Tyr Asp Pro Gly Met Asp Val Trp Gly Gly Glu Asn-354
（配列番号２のヌクレオチド１０１９−１０６２、センス）
（２）配列番号１のアミノ酸残基３４３の置換体（以下、「Ｏ６ＬＹ」と称する）
１）プライマーＡ（Ｏ６ＬＹ１０４６Ｒ）
5’-AC ATC CAT GCC AGG ATC GTA AAG ACC AAT TTC- 3’（配列番号１４）
348-Asp Met Gly Pro Asp Tyr Leu Gly Ile Glu-339
（配列番号２のヌクレオチド１０１５−１０４６、アンチセンス）
２）プライマーＢ（Ｏ６ＬＹ１００５Ｆ）
5’-G TTC TTC GGT GAA ATT GGT CTT TAC GAT CCT GG- 3’（配列番号１５）
336-Phe Phe Gly Glu Ile Gly Leu Tyr Asp Pro-345
（配列番号２のヌクレオチド１００５−１０３７、センス）
（３）配列番号１のアミノ酸残基３５０の置換体（以下、「Ｏ６ＹＷ」と称する）
１）プライマーＡ（Ｏ６ＹＷ１０６８Ｒ）
5’-TTC AAT ATT TTC TCC TCC CCA TAC ATC CAT GCC- 3’（配列番号１６）
356-Glu Ile Asn Glu Gly Gly Trp Val Asp Met Gly-346
（配列番号２のヌクレオチド１０３６−１０６８、アンチセンス）
２）プライマーＢ（Ｏ６ＹＷ１０２９Ｆ）
5’-GAT CCT GGC ATG GAT GTA TGG GGA GGA GAA AAT- 3’（配列番号１７）
344-Asp Pro Gly Met Asp Val Typ Gly Gly Glu Asp-354
（配列番号２のヌクレオチド１０３０−１０６８、センス）
（４）配列番号１のアミノ酸残基３７７の置換体（以下、「Ｏ６ＡＧ」と称する）
１）プライマーＡ（Ｏ６ＡＧ１１４９Ｒ）
5’-CTT CTT CCG CTC AAT GTG GCC CAC CCG T- 3’（配列番号１８）
383-Lys LysArg Glu Ile His Gly Val Arg-375
（配列番号２のヌクレオチド１１２２−１１４９、アンチセンス）
２）プライマーＢ（Ｏ６ＡＧ１１０８Ｆ）
5’-TC CTT CCT TGC TCA CGG GTG GGC CAC ATT GAG- 3’（配列番号１９）
371-Leu Pro Cys Ser Arg Val Gly His Ile Glu-380
（配列番号２のヌクレオチド１１０９−１１４０、センス）
（５）配列番号１のアミノ酸残基２３４と２５６の二置換体（以下、「Ｏ６−２Ｎ」と称する）
１）プライマーＡ（Ｏ６ＷＡ７４７Ｒ）
5’-CAC GTG GGC ATC AAA GAA GCC AGT GAC CTG CCC GGT AGC CAC CTT CGC GCC CTC AAT- 3’（配列番号２０）
249-Val His Ala Asp Phe Phe Gly Thr Val Gln Gly Thr Ala Val Lys Ala Gly Glu Ile-231
（配列番号２のヌクレオチド６９１−７４７、アンチセンス）
２）プライマーＢ（Ｏ６ＡＬ７２１Ｆ）
5’-GTC ACT GGC TTC TTT GAT GCC CAC GTG GAA TTC ACC GCT GGC TGG CTT GAG CCG GTT- 3’（配列番号２１）
241-Val Thr Gly Phe Phe Asp Ala His Val Glu Phe Thr Ala Gly Trp Leu Glu Pro Val-259
（配列番号２のヌクレオチド７２１−７７７、センス）
上記のようなプライマーの設計により各種点突然変異体を作製することができるが、Ｏ６ＤＭの改変体の作製を一例として説明する。
野生型ｐＤＯＮＲ２０１−ＲＯ６プラスミドを鋳型とし、第一のＰＣＲ−１ではプライマーＦとプライマーＯ６ＤＭＲ１０５９、第一のＰＣＲ−２ではプライマーＯ６ＤＭＦ１０１８とプライマーＲを用いて行った。増幅は２５μｌの反応系において、１ｎｇ／μｌの鋳型ＤＮＡ、１０μＭの各プライマー、５ Ｕｎｉｔｓ Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４６ １７３）を用いて、９５℃３０秒、５８℃４５秒、７２℃１分を２０サイクル行う反応条件で増幅し、それぞれ９５７ｂｐと７８２ｂｐのＤＮＡ断片を得た。増幅されたＤＮＡ断片はＳＲ−４００ゲルろ過カラム（アマシャム社）を用いて精製した。第一のＰＣＲによって得られたＰＣＲ精製産物（各１μｌ）を鋳型ＤＮＡとし、第二のＰＣＲを行った。第２のＰＣＲでは、まず、１０μｌの反応系として、第一のＰＣＲによるＤＮＡ断片をアニーリング（９８℃、５分）し、鋳型ＤＮＡを伸長（７２℃、１０分、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４６ １７３））した。その後、前述のプライマーＦとプライマーＲをそれぞれの最終濃度が１０μＭとなるように添加し、最終反応系が２５μｌになるように調製し、９５℃３０秒、５８℃４５秒、７２℃２分を２０サイクル行った。得られたＤＮＡ断片を精製し、ＧＡＴＡＷＡＹ ＳＹＳＴＹＥＭ ｐＤＯＮＲ２０１のドナーベクター（インビトロジン社）にクローニングし、配列を確認した。
実施例３ 発現ベクターの構築
（１）ＧａｔｅｗａｙシステムによるｐＦａｓｔＢａｃへの組込み
（ｉ）エントリークローンの作製
上記の実施例２で得られた各種改変体のＤＮＡ断片を精製した後、ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ反応によってｐＤＯＮＲ２０１に組み込み、エントリークローンを作成した。目的のＤＮＡ断片５μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１ １μｌ（１５０ｎｇ）、反応緩衝液２μｌ、ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘ ２μｌを２５℃で１時間インキュベートして反応させた。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを１μｌ加えて３７℃で１０分間インキュベートした後、反応を停止した。その後、全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショックの後、カナマイシンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクターを抽出および精製した。変異遺伝子の塩基配列の全長を確認した。
（ｉｉ）発現クローンの作製
エントリークローンは、ＤＮＡ挿入部の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換え部位であるａｔｔＬを有するため、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（ラムダファージの組換え酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデスティネーションベクターと混合することにより、ＤＮＡ挿入部がデスティネーションベクターに移り、発現クローンが作製される。具体的な工程は以下のとおりである。
まず、エントリークローン１μｌ、ｐＦＢＩＦを０．５μｌ（７５ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ ４．５μｌ、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘ ２μｌを２５℃で１時間反応させた。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを１μｌ加えて３７℃で１０分間インキュベートさせ、反応を終了させた（この組換え反応でｐＦＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔが生成される）。
（２）Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄの作製
続いて、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社）を用いて上記ｐＦＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＴとｐＦａｓｔＢａｃとの間で組換えを起こさせ、昆虫細胞中で増殖可能なＢａｃｍｉｄにＧａｌＮＡｃ−Ｔその他の配列を挿入した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、Ｂａｃｍｉｄを含む大腸菌（ＤＨ１０ＢＡＣ）に目的遺伝子を挿入したｐＦａｓｔＢａｃを導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換えタンパク質によって目的の遺伝子がＢａｃｍｉｄへ取り込まれるというものである。またＢａｃｍｉｄにはｌａｃＺ遺伝子が組み込まれており、古典的な青（挿入なし）−白（挿入あり）コロニーによる選択が可能である。
上記の精製ベクター（ｐＦＢＩＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ）５０μｌと混合し、ヒートショック後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、及びＩＰＴＧを含むＬＢプレートにまいた。翌日、白い単独コロニーをさらに培養し、Ｂａｃｍｉｄを回収した。
実施例４ 昆虫細胞へのＢａｃｍｉｄの導入
白コロニーから得られたＢａｃｍｉｄに目的とする配列が挿入されていることを確認した後、Ｂａｃｍｉｄを昆虫細胞（Ｓｆ２１）に導入した。３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１細胞９×１０５ ｃｅｌｌ／２ｍｌ（抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩ）を加え、２７℃で１時間培養することによって細胞を接着させた。（１）溶液Ａ：精製したｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ ５μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ １００μｌを加えたものである。（２）溶液Ｂ：ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ Ｒｅａｇｅｎｔ ６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ １００μｌを加えたものである。その後、溶液Ａおよび溶液Ｂを丁寧に混合して１５〜４５分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引・除去し、抗生物質を含まないＳｆ−９００ＩＩ ２ｍｌを加えた。溶液Ａと溶液Ｂを混合して調製した溶液（ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に抗生物質を含まないＳｆ９００ＩＩ ８００μｌを加えて丁寧に混和した。培養液を吸引・除去し、細胞に希釈したｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液を添加し、２７℃で５時間インキュベートした。その後、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓを除き、抗生物質を含むＳｆ−９００ＩＩ培養液２ｍｌを加えて２７℃で７２時間インキュベーションした。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎから７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をチューブに保存した（上清を一次ウイルス液とした）。
Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７ ｃｅｌｌ／２０ｍｌ Ｓｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を加えて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したことを確認後、前記の一次ウイルスを８００μｌ添加して、２７℃で４８時間培養した。４８時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清をチューブに保存した（上清を二次ウイルス液とした）。
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞１×１０７ ｃｅｌｌ／２０ｍｌ Ｓｆ−９００ＩＩ（抗生物質入り）を加えて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したことを確認したのち、二次ウイルス液１０００μｌを添加して、２７℃で７２〜９６時間培養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清をチューブに保存した（上清を三次ウイルス液とした）。
さらに、１００ｍｌ用スピナーフラスコにＳｆ２１細胞を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度で１００ｍｌを加え、三次ウイルス液を１ｍｌ添加した。２７℃で約９６時間培養した後に、細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清をチューブに保存した（この上清を四次ウイルス液とした）。
一次ウイルス液から三次ウイルス液を調製するまでに得られるセルペレットをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）、細胞粗抽出液をＨ２Ｏで２０倍に希釈し、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行った。その後、ウエスタンブロッテイングを行い、それぞれ目的とする改変体の発現を確認した。ＦＬＡＧで標識された改変体（ＦＬＡＧ−改変体）に対する検出用抗体として、抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、ＳＩＧＭＡ社）を用いた。各改変体は、推定アミノ酸配列から計算した分子量とほぼ同じ位置にバンドとして検出された（データ示さず）。
実施例５ 各改変体のレジン精製
前記で調製した三次感染のボトルからさらに四次感染をさせ、両ボトルからペレットと上清を回収し、遠心分離後（５０００ｒｐｍ、１０分を２回）、ペレットをソニケーションした（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）、ペレット粗抽出液と上清についてタンパク質定量（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）した。タンパク量を調整した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッテイングで改変体の発現を確認した。この結果から精製には、もっとも相対的に発現量の多い、四次感染のＦＬＡＧ−改変体の上清を使用することとした。上清２０ｍｌにＮａＮ３（０．０５ ％）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、抗Ｍ１レジン（Ｓｉｇｍａ 社）（１００μｌ）を混合し、４℃で一夜攪拌した。翌日、遠心（３０００ｒｐｍ、５分、４℃）してペレットを回収し、ＴＢＳを９００μｌ加えて２回洗浄遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）した。ペレットを２００μｌの２−４ｍＭ ＥＤＴＡ・ＴＢＳに１２時間浮遊させ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の簡易フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を通して、この上清を活性測定用の酵素源とした。上記のように精製した改変体をウエスタンブロッテイングでタンパク質定量を行った。なお、０−４５０ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＰＡ（シグマ社）タンパク質を検量タンパク質とした。
実施例６ 各改変体の受容体基質へ活性測定
改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の活性と比較して、各改変体の活性変化を測定するために、Ｎ末端にＦＡＭで標識した合成ペプチドＭｕｃ１ａ（ＦＡＭ−ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲ（配列番号２２）（サワディー・テクノロジー社）を受容体基質として、供与体基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（シグマ社）を用いて酵素活性を測定した。
反応液は、受容体基質（５０μＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）（２５ｍＭ）、ＭｎＣｌ２（１０ｍＭ）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（２５０ｎＭ）（カッコ内は最終濃度を示す）とした。この反応液にＧａｌＮＡｃ−Ｔ酵素液を１０μｌ加えて、さらにＨ２Ｏを加えて全量を２０μｌとした。
上記反応混合液を３７℃で６０分、１２０分、２１０分、３６０分反応させ、０．５Ｍ
ＥＤＴＡで反応を終了させた。反応終了後、Ｈ２Ｏを４０μｌ加え、軽く遠心後、上清を回収した。得られた上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の簡易フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を通して、２０μｌ−４０μｌをＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ用カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ（ナカライテスク社 Ｃｏｄｅ Ｎｏ．３７８−６６）を用いた。展開バッファーＡは、０．０５％ ＴＦＡを含むイオン交換水とし、展開バッファーＢは、受容体基質によって０．０５％ ＴＦＡのアセトニトリルを用いた。分離には展開バッファーＢの濃度勾配を用い、３０分で５０％まで上昇するようにした。検出条件は、励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍとした。
ＨＰＬＣ分析により、受容体基質Ｍｕｃ１ａのピーク（保持時間１９.６１６分）とは異なり、反応後には新たな反応産物由来のピーク（保持時間１８，９３０分）が検出された（データ示さず）。さらに反応産物の生産量を表すピーク面積の比（パーセンテージ）により各改変体の相対活性を算出した。各変異体の相対活性の結果は図６に示す。受容体基質ＭＵＣ１ａ’を用いた実験結果により、各変異体はＧａｌＮＡｃＴ活性を有することが明らかになった。また野生型Ｏ６（Ｏ６ＷＴ）に対し、点変異酵素はより強い相対活性があることが分かった。より具体的には、Ｏ６ＷＲの活性を１とした場合に、一置換体であるＯ６ＹＷでは活性が約２５倍まで増加した。また、一置換体であるＯ６ＬＹでは約９０倍まで増加した。さらに、これらのアミノ酸残基の置換体を有する二置換体のＯ６ＤＭでは、相乗効果として約１３８倍まで活性が増加した。また、改変体の活性は、Ｗファミリーに属する野生型Ｔ２やＴ１３（それぞれＴ２ＷＴ、Ｔ１３ＷＴ）と同程度まで回復した。
本発明により、高活性型のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体を作製することができた。したがって、活性の低いＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の発現に基づく疾患の診断や、該疾患の治療が可能となった。
Claims (8)
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列中の２３４位に相当するアミノ酸残基がＴｒｐであり、同２５６位に相当するアミノ酸残基がＬｅｕであり、同３４３位に相当するアミノ酸残基がＬｅｕであり、同３５０位に相当するアミノ酸残基がＴｙｒであり、同３７７位に相当するアミノ酸残基がＡｌａである、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群（Ｙファミリー）に属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素のアミノ酸配列において、少なくとも前記アミノ酸残基のＬｅｕ（３４３位）をＴｙｒに、Ｔｙｒ（３５０位）をＴｒｐに、又はＡｌａ（３７７位）をＧｌｙに変異させる、いずれかの置換がなされた改変体であって、タンパク質またはペプチドのセリンまたはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性が、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して増加している、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素改変体。
- 前記Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変前のアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の改変体。
- 請求項１又は２に記載のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体をコードする、核酸。
- 請求項３に記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター。
- 請求項３に記載の核酸が導入され、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素改変体を発現する形質転換体。
- 請求項１又は２に記載のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素の改変体を含む、医薬組成物。
- Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素をコードする遺伝子に基づく疾患を予防、診断、または治療するための、請求項６に記載の医薬組成物。
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列中の２３４位に相当するアミノ酸残基がＴｒｐであり、同２５６位に相当するアミノ酸残基がＬｅｕであり、同３４３位に相当するアミノ酸残基がＬｅｕであり、同３５０位に相当するアミノ酸残基がＴｙｒであり、同３７７位に相当するアミノ酸残基がＡｌａである、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素群（Ｙファミリー）に属するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素のアミノ酸配列において、少なくとも前記アミノ酸残基のＬｅｕ（３４３位）をＴｙｒに、Ｔｙｒ（３５０位）をＴｒｐに、又はＡｌａ（３７７位）をＧｌｙに変異させる、いずれかの置換を行う工程を含む改変体の製造方法であって、タンパク質またはペプチドのセリンまたはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミンをα１結合で転移する活性が、改変前のＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素と比較して増加している、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素改変体の製造方法。
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