PT914451E - Quinase activada por il-1/tnf-x (itak) e métodos para produzifr e utilizar a mesma - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Quinase activada por IL-l/TNF-α (ITAK) e métodos para produzir e utilizar a mesma "

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se em geral a vias de transdução de sinal associadas com inflamação e, mais em particular, a quinases activadas por IL-l/TNF-α (ITAK).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A interleucina-1 (11-1) e o factor-α de necrose tumoral (TNF-oí) são duas citóquinas produzidas sistémica e localmente em resposta a infecção, dano ou desafio imunológico. Com base em estudos em que a acção de uma (ou da outra) citóquina foi especificamente bloqueada, ou em que foram administradas citóquinas purificadas, a IL-1 e o TNF-oí foram implicados em vários processos de doença. Por exemplo, a IL-1 foi implicada em doenças inflamatórias, incluindo artrite reumatóide e outras doenças degenerativas das articulações, doença inflamatória do intestino, diabetes tipo I, psoriase, doença de Alzheimer e alergia. A sobre-produção de TNF-oí tem sido igualmente implicada em doenças como o dano de reperfusão, artrite reumatóide, doença cardiovascular, doença infecciosa, tal como infecção por VIH e neuropatia induzida por VIH, doenças alérgicas/atópicas, doença inflamatória/auto-imunidade, malignidade, dificuldades de transplante, incluindo rejeição de transplante de órgãos ou doença de enxerto-versus-hospedeiro, caquexia, e doenças congénitas, dermatológicas, neurológicas, renais, de toxicidade e metabólicas/idiopáticas. Um caso particular em que se pensa que as duas citóquinas actuam sinergicamente é na indução da sindrome de resposta inflamatória sistémica.

Uma vez que as consequências de produção descontrolada de IL-1 e TNF-oí podem ser graves, tem sido desenvolvido um esforço considerável em terapias que limitem a produção ou actividade de uma, ou preferencialmente de ambas as citóquinas. A terapia prevalecente tem sido administrar proteínas que se ligam especificamente às citóquinas circulantes, impedindo-as desse modo de interagir com os seus receptores celulares. Tipicamente, estes agentes terapêuticos 2 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ baseados em proteínas são anticorpos ou receptores "solúveis" (i.e. versões recombinantes dos receptores celulares naturais que não possuem domínios transmembranares e de sinalização). Outro agente terapêutico baseado em proteínas é a proteína antagonista do receptor de IL-1 (IL-lra) que compete para a ligação nos mesmos receptores celulares que as formas agonistas de IL-1, mas não desencadeia um sinal celular. A eficácia de todos os três tipos de terapia baseada em proteínas é limitada, pois a ocupação de mesmo um número muito pequeno de receptores de IL-1 ou TNF-α por IL-1 ou TNF-α gera uma resposta celular (e portanto os efeitos prejudiciais descritos acima). É, portanto, necessário, manter níveis relativamente elevados de anticorpo anti-citóquina, receptor solúvel ou proteína antagonista, de modo a desviar o equilíbrio a favor da formação de complexo (i.e., para impedir efectivamente a ligação de IL-1 ou TNF-α aos seus receptores respectivos). Outra desvantagem destes agentes terapêuticos baseados em proteínas é que cada agente terapêutico é selectivo para apenas uma das duas citóquinas. Assim, terão que ser administradas a um paciente doses elevadas de vários agentes terapêuticos, de modo a tentar controlar a produção de IL-1 e TNF-a.

Embora os efeitos biológicos de TNF-α e IL-1 sejam bastante semelhantes, as estruturas das citóquinas e a estrutura dos seus receptores são muito diferentes. A IL-1 e o TNF-α parecem ter actividades biológicas sobrepostas pois a ligação de cada citóquina ao seu receptor parece afectar vias de transdução de sinal pós-receptor, semelhantes. Muitos dos detalhes destas vias não são claros.

Por exemplo, embora ambas as citóquinas activem os factores de transcrição NF-KB e AP-1, o que leva à transcrição regulada de uma grande variedade de genes, as moléculas efectoras próximas do receptor particulares que regulam este processo não são claras. Adicionalmente, foi referido que ambas as citóquinas provocam a activação de esfingomielinases e fosfolipases que geram, respectivamente, ceramida e ácido araquidónico. Ambas as citóquinas também activam membros da família da proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK), incluindo ERKl, ERK2 e as quinases activadas por stress, JNK-1 3 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ e ρ38. Esta família de quinases é activada, em várias extensões, por uma vasta gama de hormonas, factores de crescimento, metais pesados, inibidores sintéticos de proteína e luz ultravioleta e, portanto, a activação destas quinases não pode ser considerada única para a via de transdução de sinal de IL-l/TNF-a.

Além dos itens activados por ambos, IL-1 e TNF-α, foi referido que a IL-1 activa especificamente a quinase associada ao receptor de IL-1, IRAK (Cao, Henzel e Gao, Science 271·. 1128 (1996)). Também foi referido que os domínios citoplasmáticos dos receptores de TNF interagem com outras moléculas de transdução de sinal, tais como TRAF1 e TRAF2, FADD, MORT e TRADD. Estas proteínas que interagem com o receptor de TNF-a também parecem ser capazes de interagir com uma família de receptores alargada, incluindo os que medeiam respostas celulares bastante distintas, tais como o activador de células T e B CD40 e um mediador de apoptose, fas. (Tewari and Dixit, Curr. Opin. Genet. Dev. 6:39, 1996; Lee et al., J. Exp. Me d 183:6 6 9, 1996) .

Apesar de algumas respostas celulares poderem ser desencadeadas por IL-1, TNF-α ou outros mediadores, o único fenómeno de sinalização conhecido que parece ser unicamente induzido por IL-1 ou TNF-α, mas por nenhum outro estímulo definido, é uma actividade de proteína-serina/treonina-quinase que foi possível detectar in vitro devido à sua capacidade de fosforilar a β-caseína. Guesdon et al., J. Biol. Chem. 268:4236 (1993); Biochem. J. 304:161 (1994). Esta actividade de β-caseína-quinase foi induzida em fibroblastos e outras células derivadas de tecido conjuntivo por IL-1 e TNF-α, mas não por 21 outros agentes testados. A estrutura da β-caseína-quinase não foi elucidada nesta descrição.

No entanto, continua por colmatar a necessidade de substâncias e/ou métodos que proporcionem, ou a repressão, ou a estimulação de efeitos intracelulares de ambos, IL-1 e TNF-α. Continua também por colmatar a necessidade de substâncias e métodos que proporcionem interacção(ões) com a(s) via pós-receptor de IL-1 e TNF-α, bem como de substâncias e métodos que proporcionem oportunidades para detectar agonistas e/ou antagonistas de IL-1 ou TNF-α, incluindo 4 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ compostos únicos que actuam como um agonista ou antagonista de ambos, IL-1 e TNF-α. A presente invenção proporciona estas e outras vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona sequências de ácido nucleico e aminoácidos de proteína-quinases, de preferência humanas, que interagem com pelo menos uma via intracelular pós-receptor de ambos, IL-1 e TNF-α. Estas quinases são aqui designadas por quinase activada por IL-l/TNF-α (ITAK). Estas quinases são induzidas como quinases enzimaticamente activas capazes de fosforilar proteínas substrato específicas, por tratamento de células adequadas com IL-1 ou TNF-α. A presente invenção proporciona também composições e métodos para o isolamento e purificação de moléculas de ácido nucleico que codificam para ITAK. Também se descrevem aqui métodos para expressar e purificar ITAK, bem como testes específicos para a detecção de inibidores ou estimuladores da actividade de ITAK que terão utilidade como antagonistas ou agonistas de IL-1 e TNF-a.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se a ácidos nucleicos isolados que codificam para ITAK e a vectores, incluindo vectores de expressão, capazes de expressar ITAK, de preferência a partir de um ADNc que codifica para ITAK. A presente invenção inclui células hospedeiras que contêm estes vectores de expressão e processos para produzir ITAK por cultura destas células hospedeiras sob condições que levam à expressão de ITAK e, de preferência, à purificação de ITAK, incluindo em quantidades industriais. Em parte devido a esta purificação de ITAK, a invenção também se refere a anticorpos, de preferência anticorpos monoclonais, específicos para ITAK. A presente invenção também se refere a testes que utilizam ITAK para pesquisar inibidores ou estimuladores potenciais da actividade de ITAK, por exemplo como um meio para bloquear um sinal transduzido em resposta a IL-1 ou TNF-α. Além disso, também se descrevem métodos para utilizar ITAK na concepção de inibidores da actividade de ITAK.

Em particular, num aspecto, proporciona-se uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica para uma quinase 5 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ activada por IL-l/TNF-α (ΙΤΑΚ), tal como uma ITAK humana, ou sua variante. Numa concretização, a molécula de ácido nucleico isolada compreende a sequência de nucleótidos em SEQ ID N0:1, desde o nucleótido número 1 ao nucleótido número 2940. Esta molécula de ácido nucleico isolada codifica para uma proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Numa concretização relacionada, proporcionam-se moléculas de ácido nucleico que codificam para variantes de ITAK, incluindo a variante ITAK substituída com Lys81—>Ala. Num aspecto relacionado, proporciona-se uma ITAK isolada, ou uma sua variante.

Noutros aspectos relacionados, proporcionam-se vectores recombinantes, incluindo vectores de expressão recombinantes compreendendo um promotor ligado operativamente a sequências que codificam para ITAK. A invenção proporciona também células hospedeiras que contêm qualquer destes vectores recombinantes.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona uma sonda de ácido nucleico com pelo menos 15 nucleótidos de comprimento que é capaz de hibridar especificamente com uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma quinase activada por IL-l/TNF-α (ITAK).

Ainda noutro aspecto da invenção, proporciona-se um método para pesquisar um agente que modula a actividade de quinase de uma quinase activada por IL-l/TNF-α (ITAK) compreendendo: (a) contactar um agente candidato com ITAK biologicamente activa sob condições e durante um tempo suficiente para permitir que o agente candidato module a actividade de quinase da ITAK; e (b) medir a capacidade do agente candidato modular a actividade de quinase da ITAK. Numa concretização, o método compreende também isolar o agente candidato.

Noutro aspecto da invenção, proporciona-se um método para determinar se um agente seleccionado é um agonista da quinase activada por IL-l/TNF-α (ITAK), compreendendo: (a) expor o agente seleccionado a uma via de resposta de ITAK não estimulada sob condições e durante um tempo suficiente para permitir a estimulação da via; e (b) detectar a estimulação da via de resposta e a partir daí determinar a presença de um 6 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ agonista de ΙΤΑΚ. Num aspecto relacionado, proporciona-se um método para determinar se um agente seleccionado é um agonista de quinase activada por IL-l/TNF-α (ITAK), compreendendo: (a) medir a actividade de quinase da ITAK de uma via de resposta de ITAK; (b) expor o agente seleccionado à via de resposta de ITAK medida; e (c) detectar uma actividade de quinase ITAK aumentada na via de resposta.

Ainda noutro aspecto da invenção, proporciona-se um método para determinar se um agente seleccionado é um antagonista da quinase activada por IL-l/TNF-α, compreendendo: (a) expor o agente seleccionado a uma via de resposta de ITAK na presença de um agonista de ITAK sob condições e durante um tempo suficiente para permitir uma diminuição na estimulação da via; e (b) detectar uma diminuição na estimulação da via de resposta em relação à estimulação da via de resposta pelo agonista de ITAK isolado e a partir dai determinar a presença de um antagonista de ITAK. Utilizando estes métodos, proporcionam-se agonistas de ITAK e antagonistas de ITAK.

Ainda noutros aspectos da invenção, proporciona-se um método para detectar actividade de quinase activada por IL-l/TNF-α (ITAK), compreendendo: (a) contactar ITAK com uma sequência aceitadora de péptido substrato de fosforilação por ITAK que não é β-caseína de mamífero, na presença de ATP, sob condições e durante um tempo suficiente para permitir a transferência de um grupo γ-fosfato de um dador de ATP para a sequência aceitadora de péptido de substrato de fosforilação por ITAK; e (b) medir a incorporação de fosfato pela sequência aceitadora de péptido de substrato de fosforilação por ITAK. Numa concretização, o ATP é γ-(32Ρ)-ΑΤΡ. Em concretizações da invenção relacionadas, a sequência aceitadora de péptido de substrato de fosforilação por ITAK tem a sequência de aminoácidos: Arg-Arg-Arg-His-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu,-Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln. (SEQ ID NO: 3).

Noutro aspecto da invenção, proporciona-se um método para tratar um distúrbio inflamatório mediado por IL-1 ou TNF-a, compreendendo administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de ITAK. Uma sequência aceitadora de péptido de substrato de fosforilação por ITAK que não é β-caseína humana, é um péptido que pode ser 7 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ fosforilado por ΙΤΑΚ isolada a uma taxa de pelo menos 40 nmol, de preferência pelo menos 80 nmol, ainda mais preferencialmente pelo menos 98 nmol de fosfato/mg proteina/minuto. A invenção proporciona ainda métodos para identificar produtos de genes que se associam com ITAK, compreendendo: (a) introduzir sequências de ácido nucleico que codificam para um polipéptido ITAK num primeiro vector de expressão, de modo que as sequências de ITAK são expressas como parte de uma proteina de fusão compreendendo uma primeira porção funcionalmente incompleta de uma proteina que é essencial para a viabilidade de uma célula hospedeira; (b) introduzir sequências de ácido nucleico que codificam para várias produtos de gene candidatos que se associam com ITAK num segundo vector de expressão, de modo que quaisquer produtos de gene candidatos são expressos como parte de uma proteina de fusão compreendendo uma segunda porção funcionalmente incompleta da proteina que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira; (c) introduzir o primeiro e segundo vectores de expressão numa célula hospedeira sob condições e durante um tempo suficiente para que a sobrevivência da célula hospedeira seja dependente da reconstituição de ambas, a primeira e segunda porções da proteina funcionalmente incompletas, numa proteína funcionalmente completa; e (d) identificar células hospedeiras sobreviventes e a partir daí determinar as sequências de ácido nucleico que codificam para produtos de gene candidatos que se associam com ITAK no segundo vector de expressão.

Numa concretização deste aspecto da invenção, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de levedura. Noutra concretização deste aspecto da invenção, a levedura é a estirpe de levedura Y190. Em concretizações relacionadas, a proteína que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira é o factor de transcrição de levedura modular, GAL4. Noutra concretização relacionada, a primeira porção funcionalmente incompleta de uma proteína que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira, compreende os 147 aminoácidos N-terminais do factor de transcrição de levedura modular GAL4, enquanto que noutra concretização, a segunda porção funcionalmente incompleta compreende os 114 aminoácidos C-terminais do factor de transcrição de 8 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ levedura modular GAL4. Ainda noutra concretização, a primeira porção funcionalmente incompleta de uma proteína que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira compreende o domínio de ligação a ADN de um factor de transcrição modular. Numa concretização relacionada, a segunda porção funcionalmente incompleta de uma proteína que é essencial para a viabilidade de um hospedeiro unicelular compreende um domínio de activação da transcrição de um factor de transcrição modular.

Estes e outros aspectos da presente invenção serão evidentes por referência à descrição detalhada que se segue e figuras anexas. São aqui apresentadas várias referências que descrevem determinados procedimentos ou composições (e.g. plasmídeos, etc.). Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas para referência na sua totalidade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1A-1F mostram uma sequência de nucleótidos de ITAK humana representativa e sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID N0:8).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como referido acima, a presente invenção proporciona composições e métodos para o isolamento e purificação de proteínas ITAK, as quais têm actividades de quinase que são especificamente induzidas por exposição de células adequadas a IL-1 ou TNF-α. Os inibidores da transdução de sinal de IL-1 têm utilidade clínica no tratamento de vários distúrbios inflamatórios e imunitários caracterizados pela sobre-produção ou produção desregulada de IL-1, tais como alergia, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, psoríase e doença de Alzheimer. A inibição da sinalização por TNF-a também tem utilidade clínica no tratamento de condições caracterizadas pela sobre-produção ou produção desregulada de TNF-α, tal como a síndrome da resposta inflamatória sistémica, dano de reperfusão, doença cardiovascular, doença infecciosa, tal como infecção por VIH e neuropatia por VIH, doença inflamatória/auto-imunidade, doenças alérgicas/atópicas, malignidade, transplantes incluindo rejeição de transplante de órgãos e doença de enxerto-versus-hospedeiro, caquexia, doenças congénitas, dermatológicas, neurológicas, renais, 9 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ toxicidade e metabólicas/idiopáticas. A descrição aqui efectuada de um ADNc que codifica para ITAK proporciona métodos e composições adequados para a inibição de IL-1 e/ou TNF-α, bem como uma variedade de outras vantagens. A constatação da ITAK feita pelos requerentes permite, entre outras coisas, a construção de vectores, incluindo vectores de expressão, compreendendo sequências de ácido nucleico que codificam para ITAK, células hospedeiras contendo estes vectores (por exemplo via transfecção ou transformação), a produção de ITAK, incluindo quantidades industriais de ITAK e anticorpos imunorreactivos com ITAK. Além disso, a compreensão do mecanismo pelo qual a ITAK funciona na sinalização por IL-1 e TNF-α permite conceber testes para detectar inibidores da actividade de IL-1 e/ou TNF-oí.

Tal como aqui utilizado, o termo "ITAK" refere-se a um género de polipéptidos com actividades de quinase que são especificamente induzidos por exposição das células fonte de ITAK a IL-1 ou TNF-α e que são capazes de fosforilar a β-caseína de bovino desfosforilada, ou de fosforilar outros substratos peptídicos ou polipeptidicos adequados, identificados pela sua homologia estrutural com locais aceitadores de fosforilação de β-caseína de bovino. Em geral, estas actividades não são induzidas por PMA, soro fetal de vitela a 10%, PDGF, bradiquinina, EGF, TGF-βΙ, bFGF, interferão-β, interferão-γ, histamina, prostaglandina E2, forscolina, A23187, choque térmico a 44°C ou arsenito de sódio (Guesdon et al., Biochem. J. 304:161 (1994)). Salvo referido em contrário, ITAK refere-se também às suas variantes e derivados. Numa concretização preferida, ITAK inclui proteínas com a sequência de aminoácidos 1-979 de SEQ ID NO:2, bem como proteínas com um grau elevado de homologia de sequência (tipicamente pelo menos 90% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 95% de identidade e mais preferencialmente pelo menos 98% de identidade) com estas sequências de aminoácidos. A ITAK também inclui os produtos de gene dos nucleótidos 1-2940 de SEQ ID NO:l e as sequências de aminoácidos codificadas por estes nucleótidos, bem como os produtos de gene de outras moléculas de ácido nucleico que codificam para ITAK. Estas proteínas e/ou produtos de genes são de preferência biologicamente activas. A ITAK de tamanho 10 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ total tem um peso molecular de aproximadamente 110-125 kD, tal como determinado por electroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE). A ITAK também inclui as moléculas de ácido nucleico que codificam para ITAK.

Uma "variante de ITAK", tal como aqui utilizado, refere-se a um polipéptido substancialmente homólogo à ITAK nativa, mas que tem uma sequência de aminoácidos diferente da de ITAK nativa (humana, de coelho, de murideo ou outra espécie de mamífero) devido a uma ou mais eliminações, inserções ou substituições que ocorrem naturalmente, ou não naturais. A sequência de aminoácidos variante é pelo menos cerca de 80% idêntica à sequência de aminoácidos de ITAK nativa, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% idêntica e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% idêntica. A percentagem de identidade pode ser determinada, por exemplo, comparando a informação de sequência utilizando o programa de computador GAP, versão 6.0 descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:381, 1984) e disponível do University of

Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). O programa GAP utiliza o método de alinhamento de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), tal como revisto por Smith e Waterman {Adv. Appl Math 2:482, 1981). Os parâmetros por defeito preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não-identidades) para nucleótidos e a matriz de comparação ponderada de Gribskov e Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) uma penalização de 3,0 para cada intervalo e uma penalização adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo; e (3) nenhuma penalização para intervalos finais.

Uma classe de variantes de ITAK baseia-se na tendência das proteína-quinases conterem um resíduo de lisina no subdomínio catalítico II que é vantajoso para uma actividade enzimática máxima. Em particular, a mutação deste resíduo de lisina (correspondente à posição 81 na ITAK descrita na SEQ ID NO: 2) leva à perda de função catalítica em proteína-quinases. Assim, uma quinase mutante deste tipo (de preferência recombinante) pode exercer um fenótipo "negativo dominante" 11 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ quando sobre-expresso em células, impedindo desse modo a sinalização através da via bioquímica em que a ITAK do tipo selvagem normalmente funciona. Esta variante, por exemplo ITAK A81 em que a alanina é substituída por lisina-81, pode ser particularmente vantajosa para utilizações terapêuticas na inibição da sinalização por IL-1 ou TNF-α, como discutido mais à frente. Outras variantes de ITAK que não possuem a actividade de proteína-quinase de ITAK, tais como variantes de ITAK com substituições de aminoácidos além da substituição Lys—>Ala de ITAK A81 e incluindo eliminações, inserções ou substituições de aminoácidos, estão incluídas nas variantes de ITAK da invenção.

As variantes de ITAK podem compreender sequências substituídas de forma conservativa, o que significa que um determinado resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo com características físico-químicas semelhantes. Exemplos de substituições conservativas incluem substituição de um resíduo alifático por outro, tal como Ile, Vai, Leu, ou Ala uns pelos outros, ou substituições de um resíduo polar por outro, tal como entre Lys e Arg, Glu e Asp, ou Gin e Asn. São bem conhecidas outras substituições conservativas deste tipo, por exemplo substituições de regiões inteiras com características de hidrofobicidade semelhantes. As variantes de ITAK que ocorrem naturalmente também são abrangidas pela invenção. Exemplos destas variantes são proteínas que têm substituições de aminoácidos, resultam de fenómenos de splicing alternativo de ARNm, ou resultam da clivagem proteolítica da proteína ITAK, em que os fragmentos proteolíticos retêm a actividade biológica de ITAK. AS variações que podem ser atribuídas a proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N ou C de ITAK que ocorre naturalmente, tal como isolada a partir de células ou tecidos, ou variações semelhantes detectáveis por expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais da proteína ITAK (geralmente de 1-5 aminoácidos terminais).

Uma "sequência de nucleótidos" refere-se a uma molécula de polinucleótido na forma de um fragmento separado, ou como um componente de uma construção de ácido nucleico maior que foi derivada de ADN ou ARN isolado pelo menos uma vez na forma 12 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ substancialmente pura (i.e. isento de materiais endógenos contaminantes) e numa quantidade ou concentração que permite a identificação, manipulação e recuperação das suas sequências de nucleótidos componentes, por métodos bioquímicos convencionais (tais como os descritos em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989)). Estas sequências são preferencialmente proporcionadas na forma de uma fase de leitura aberta, não interrompida por sequências não traduzidas internas, ou intrões, que estão tipicamente presentes em genes eucarióticos. Poderão estar presentes sequências de ADN não traduzidas, 5' ou 3' em relação a uma fase de leitura aberta, sendo que as mesmas não interferem com a manipulação ou expressão da região codificante. 0 termo "isolado", tal como aqui utilizado, significa uma proteína ITAK que foi separada de uma célula fonte, quer recombinante, quer não recombinante, de modo que a proteína ITAK compreende pelo menos cerca de 90% do teor de proteína da composição com base no padrão de coloração da composição por electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) utilizando coloração com azul de Coomassie. Tipicamente, a proteína purificada compreende pelo menos cerca de 92% do teor de proteína, de preferência pelo menos cerca de 94% do teor de proteína, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 96% do teor de proteína e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% do teor de proteína. Em concretizações alternativas, não se detecta nenhuma outra proteína (indesejada) conforme análise de SDS-PAGE seguida de coloração com azul de Coomassie e de preferência não se detecta nenhuma outra proteína (indesejada) conforme análise de SDS-PAGE seguida de coloração por prata. Uma molécula de ácido nucleico "isolada" significa uma molécula de ácido nucleico que codifica para ITAK, tal como aqui discutido mais à frente e que foi isolada a partir da sua célula fonte. Adicionalmente, um gene de ITAK (ou um seu fragmento, ou variante, etc., também como aqui discutido) é considerado isolado se foi separado da sua molécula de ácido nucleico da célula fonte biológica, tal como um cromossoma. Este gene 13 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ isolado pode estar contido numa molécula de ácido nucleico recombinante. O termo "biologicamente activo", tal como aqui utilizado em referência a ITAK, significa ITAK que é capaz de fosforilar uma β-caseína de bovino desfosforilada, ou de fosforilar substratos peptídicos sintéticos (tais como sequências aceitadoras de péptido substrato de fosforilação por ITAK) com semelhança substancial com um ou mais dos locais aceitadores de fosforilação da β-caseína de bovino. Um substrato deste tipo é o polipéptido RRRHLPPLLLQSWMHQPHQ (SEQ ID NO: 3) . Condições preferidas para fosforilar uma β-caseína de bovino desfosforilada podem ser encontradas em Guesdon et al., J. Biol. Chem. 268:4236 (1993); Guesdon et al., Biochem. J. 304:161 (1994), enquanto que condições preferidas para a fosforilação de um polipéptido sintético RRRHLPPLLLQSWMHQPHQ (SEQ ID NO: 3) podem ser encontradas no Exemplo 1. A fosforilação in vitro de péptidos substrato por ITAK pode ser adaptada para pesquisas com rendimento elevado, por exemplo, por testes de proximidade de cintilação (SPA). Assim, os meios para medir o fosfato incorporado, via ITAK, em β-caseína ou em sequências aceitadoras de péptido substrato de fosforilação por ITAK incluem detectar o 32P incorporado; métodos de detecção de SPA conhecidos na arte; medições fluorimétricas, colorimétricas, ou espectrofotométricas; detecção imunoquímica, por exemplo utilizando anticorpos especificamente reactivos com aminoácidos ou péptidos fosforilados; ou métodos de detecção relacionados conhecidos dos peritos na arte.

Uma ITAK isolada de acordo com a invenção pode ser produzida por sistemas de expressão recombinantes como descrito a seguir, ou pode ser produzida a partir de células que ocorrem naturalmente. A ITAK também pode ser substancialmente purificada, tal como indicado por uma série de fosfoproteínas que migram como componentes de 110 kD a 125 kD em electroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE) e que têm sequências de aminoácidos idênticas, tal como indicado por mapas de péptidos e análise de sequência parcial. Um processo para produzir ITAK compreende cultivar uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão compreendendo uma sequência de ADN que codifica para ITAK, sob 14 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ condições suficientes para promover a expressão de ITAK. A ITAK é então recuperada do meio de cultura ou extractos celulares, dependendo do sistema de expressão utilizado. Tal como é conhecido do perito na arte, os procedimentos para purificar uma proteína recombinante irão variar de acordo com factores como o tipo de células hospedeiras e o facto de a proteína recombinante ser ou não segregada no meio de cultura. Por exemplo, quando se utilizam sistemas de expressão que segregam a proteína recombinante, o meio de cultura pode ser primeiro concentrado utilizando um filtro de concentração de proteínas disponível no mercado, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após o passo de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação, tal como um meio de filtração em gel. Alternativamente, pode-se utilizar uma resina de troca aniónica, por exemplo, uma matriz ou substrato com grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos normalmente utilizados na purificação de proteínas. Alternativamente, pode-se utilizar um passo de troca catiónica. Os permutadores catiónicos adequados incluem várias matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropilo ou carboximetilo. Os grupos sulfopropilo são preferidos. Por fim, pode-se utilizar um ou mais passos de cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa (RP-HPLC) utilizando meios de RP-HPLC hidrófobos (e.g., sílica gel com grupos metilo ou outros grupos alifáticos pendentes) para purificar ainda mais a ITAK. Alguns, ou todos os passos de purificação anteriores, em várias combinações, são bem conhecidos e podem ser utilizados para se obter uma proteína recombinante isolada e purificada.

Além da ITAK ser produzida de forma recombinante, a ITAK pode ser isolada e purificada a partir de qualquer uma das seguintes linhas celulares: C122 (Sims et al., Proc. Nat. Acad Sei. USA 86:8946-8950, 1989), HUT102 (ATCC TIB162), KB (ATCC CCL17) . Raji (ATCC CCL86), SK-Hep-1 (ATCC HTB52 e WI-26 (ATCC CCL95.1). Podem-se utilizar outras fontes de ITAK e a ITAK também pode ser encontrada noutros tipos de células que produzem, ou respondem a IL-1 ou TNF-α. A produção de ITAK por uma célula candidata pode ser detectada, por exemplo, utilizando os testes aqui discutidos, tais como os testes 15 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ acima descritos em relação à determinação da actividade biológica de ITAK e no Exemplo 1, e/ou através de testes de hibridação de ácidos nucleicos, adequados. Uma vez identificada uma célula ou linha celular fonte para ITAK, a ITAK pode ser isolada e purificada, estimulando primeiro opcionalmente as células fonte com IL-1 ou TNF-α. Quando desejado, esta estimulação pode ser realizada utilizando técnicas que são bem conhecidas na arte. A IL-1 é utilizada de preferência a 1-50 ng/ml e o TNF-α é utilizado de preferência a 20-200 ng/ml. (Guesdon et al. 1993, 1994) . As células são então recolhidas, lavadas e as proteínas citoplasmáticas são extraídas de acordo com procedimentos convencionais. A ITAK parcialmente purificada ocorre como um complexo de peso molecular elevado de >350 kD que pode conter espécies associadas especificamente, importantes para a regulação da actividade de ITAK. A ITAK também pode ser modificada para criar derivados de ITAK formando conjugados covalentes ou de agregação com outras porções químicas, tais como grupos glicosilo, grupos polietilenoglicol (PEG), lípidos, fosfato, grupos acetilo e semelhantes. Os derivados covalentes de ITAK podem ser preparados ligando as porções químicas a grupos funcionais em cadeias laterais de aminoácido de ITAK, ou no terminal N ou terminal C de um polipéptido ITAK. Outros derivados de ITAK no âmbito da presente invenção, incluem conjugados covalentes ou de agregação de ITAK, ou seus fragmentos, com outras proteínas ou polipéptidos, tal como por síntese em cultura recombinante como fusões N-terminais ou C-terminais. Por exemplo, o conjugado pode compreender uma sequência de polipéptido de sinal ou comando (e.g. o comando de factor-α de Saccharomyces) no terminal N de um polipéptido ITAK. O péptido de sinal ou comando dirige em co-tradução ou pós-tradução a transferência do conjugado do seu local de síntese para um local dentro ou fora da membrana celular ou parede celular.

Pode-se utilizar uma coluna de afinidade compreendendo uma proteína de ligação a ITAK, por exemplo um anticorpo de ligação a ITAK, para purificar por afinidade os polipéptidos de ITAK expressos. Os polipéptidos de ITAK podem ser removidos de uma coluna de afinidade utilizando técnicas convencionais, e.g. num tampão de eluição com uma concentração elevada de sal 16 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ e em seguida dialisados num tampão de concentração de sal mais baixa, para utilização, ou para alteração do pH ou outros componentes, dependendo da matriz de afinidade utilizada.

As variantes e derivados de ITAK nativa que retêm a actividade biológica desejada podem ser obtidos por mutações de sequências de nucleótidos que codificam para polipéptidos ITAK nativos. As alterações da sequência de aminoácidos nativa podem ser conseguidas por qualquer um de vários métodos convencionais. Podem-se introduzir mutações em loci particulares, sintetizando oligonucleótidos contendo uma sequência mutante, flanqueada por locais de restrição que permitem a ligação a fragmentos da sequência nativa. Após ligação, a sequência reconstruída resultante codifica para um análogo que tem a inserção, substituição ou eliminação de aminoácido desejada.

Alternativamente, podem-se utilizar procedimentos de mutagénese específica para um local, dirigida por oligonucleótidos para se obter um gene alterado em que codões pré-determinados podem ser alterados por substituição, eliminação ou inserção. Exemplos de métodos para produzir as alterações referidas acima, são descritos por Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:13, 1985); Craik (BioTechniques, Janeiro 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic

Englneerlng: Principies and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad Sei. USA 52:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:361, 1987); e patentes U.S. Nos. 4518584 e 4737462.

Construções de ADN equivalentes que codificam para várias adições ou substituições de resíduos ou sequências de aminoácidos, ou eliminações de resíduos ou sequências terminais ou internos, não necessárias para a actividade biológica, também são abrangidos pela invenção. Por exemplo, as sequências que codificam para resíduos Cys que não são essenciais para actividade biológica podem ser alteradas para fazer com que os resíduos Cys sejam eliminados ou substituídos por outros aminoácidos, impedindo a formação de pontes dissulfureto intramoleculares incorrectas, aquando da renaturação. Podem-se preparar outros equivalentes por modificação de resíduos de aminoácido dibásicos, adjacentes, 17 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ para aumentar a expressão em sistemas de levedura em que a actividade de protease KEX2 está presente. O EP 212914 descreve a utilização de mutagénese específica do local para inactivar locais de processamento da protease KEX2 numa proteína. Os locais de processamento da protease KEX2 são inactivados eliminando, adicionando ou substituindo resíduos para alterar pares Arg-Arg, Arg-Lys, e Lys-Arg para eliminar a ocorrência destes resíduos básicos adjacentes. Os emparelhamentos Lys-Lys são consideravelmente menos susceptíveis a clivagem por KEX2 e a conversão de Arg-Lys ou Lys-Arg em Lys-Lys representa uma abordagem conservativa e preferida para inactivar locais de KEX2.

As sequências de ácido nucleico no âmbito da invenção incluem sequências de ADN e ARN isoladas que hibridam com as sequências de nucleótidos de ITAK nativa aqui descritas, sob condições de rigor moderado ou elevado e que codificam para ITAK biologicamente activa e seus complementos. Tal como aqui utilizadas, as condições de rigor moderado, tal como conhecidas de um perito na arte e como definido por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Vol. 1, pp. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), incluem a utilização de uma solução de pré-lavagem para os filtros de nitrocelulose de 5X SSC, SDS a 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8.0), condições de hibridação de formamida a 50%, 6X SSC a 42°C (ou outra solução de hibridação semelhante, ou solução de Stark, em formamida a 50% a 42°C) e condições de lavagem de cerca de 60°C, 0,5X SSC, SDS a 0,1 %. As condições de rigor elevado são definidas como as condições de hibridação acima e com lavagem a 68°C, 0,2X SSC, SDS a 0,1%. O perito na arte irá reconhecer que a temperatura, concentração de sal e composição caotrópica das soluções de hibridação e lavagem podem ser ajustadas como necessário, de acordo com factores tais como o tamanho e composição de bases de nucleótido da sonda.

Devido à degenerescência conhecida do código genético, em que mais do que um codão pode codificar para o mesmo aminoácido, uma sequência de ADN pode variar, por exemplo em relação à apresentada na Figura 1 e codificar ainda para uma proteína ITAK, tal como uma que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Estas sequências de ADN variantes podem resultar de mutações silenciosas (e.g., que ocorrem durante a 18 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ amplificação por PCR) ou podem ser o produto de mutagénese deliberada de uma sequência nativa. A invenção inclui assim sequências de ácido nucleico isoladas, equivalentes, que codificam para ITAK biologicamente activa, incluindo as seleccionadas de entre (a) moléculas de ácido nucleico derivadas da região codificante de um gene de ITAK de mamífero nativa; (b) moléculas de ácido nucleico seleccionadas de entre o grupo constituído pelas sequências de nucleótidos SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO: 8; (c) moléculas de ácido nucleico capazes de hibridar com uma molécula de ácido nucleico de (a) (ou as suas cadeias complementares) sob condições de rigor moderado e que codificam para ITAK; e (d) moléculas de ácido nucleico que são degeneradas, como resultado do código genético, em relação a uma molécula de ácido nucleico definida em (a) , (b) ou (c) e que codificam para ITAK. De preferência, a molécula de ácido nucleico é ADN e ainda mais preferencialmente, a ITAK é biologicamente activa. As proteínas ITAK e produtos de genes codificados por estas sequências de ácido nucleico equivalentes são abrangidas pela invenção.

As moléculas de ácido nucleico que são equivalentes à sequência de ADN da Figura 1, SEQ ID N0:1 irão hibridar sob condições moderadamente rigorosas com as sequências de ADN nativas de cadeia dupla que codificam para polipéptidos que compreendem sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Exemplos de ITAK que codificam para estes ADN incluem, mas não se limitam a, fragmentos de ITAK e proteínas ITAK compreendendo local (s) de processamento de protease KEX2 inactivada, ou substituição (ões) de aminoácidos conservativa, incluindo as descritas acima. As proteínas ITAK codificadas pelo ADN derivado de outras espécies de mamífero em que o ADN irá hibridar especificamente com o complemento do ADNc da Figura 1 ou SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:8 também são abrangidas.

Os conjugados de polipéptido ITAK podem compreender péptidos adicionados a ITAK, para facilitar a purificação e identificação de ITAK. Estes péptidos incluem, por exemplo, poli-His ou os péptidos de identificação antigénica descritos na patente U.S. N° 5011912 e em Hopp et al., Βίο/Technology 6:1204, 1988. As proteínas de fusão de ITAK podem também 19 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ compreender polipéptidos de região constante de imunoglobulina adicionados a ITAK, para facilitar a purificação, identificação e localização de ITAK. 0 polipéptido de região constante é de preferência fundido com o terminal C de uma ITAK solúvel. A preparação geral de proteínas de fusão compreendendo polipéptidos heterólogos fundidos com várias porções de polipéptidos derivados de anticorpo (incluindo o domínio Fc) foi descrita, e.g., por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991) e Bym et al. (Nature 344:611, 1990). Uma fusão de genes que codifica para a proteína de fusão ITAK:F c é inserida num vector de expressão adequado. As proteínas de fusão ITAK:Fc são deixadas organizar-se de modo semelhante às moléculas de anticorpo, ocorrendo a formação de ligações dissulfureto entre polipéptidos Fc, o que origina ITAK bivalente.

Podem-se preparar vectores recombinantes, incluindo vectores de expressão, contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para ITAK, utilizando métodos bem conhecidos. Os vectores de expressão incluem uma sequência de ADN de ITAK ligada operativamente a sequências de nucleótidos reguladoras da transcrição ou tradução, adequadas, tais como as derivadas de um gene de mamífero, micróbio, vírus ou insecto. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores, operadores ou potenciadores, um local de ligação ao ribossoma e sequências adequadas que controlam a iniciação e terminação da transcrição e tradução. As sequências de nucleótido estão "ligadas operativamente" quando a sequência reguladora se relaciona funcionalmente com a sequência de ADN de ITAK. Assim, uma sequência de nucleótidos promotora está ligada operativamente a uma sequência de ADN de ITAK se a sequência de nucleótidos promotora controla a transcrição da sequência de ADN de ITAK. A capacidade de se replicar nas células hospedeiras desejadas, normalmente conferida por uma origem de replicação, e um gene de selecção pelo qual os transformantes são identificados, podem ser adicionalmente incorporadas no vector de expressão.

Adicionalmente, as sequências que codificam para péptidos de sinal adequados que não estão naturalmente associados com ITAK podem ser incorporadas em vectores de expressão. Por exemplo, uma sequência de ADN para um péptido de sinal 20 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ (comando secretor) pode ser fundida em fase com a sequência de ITAK, de modo que a ITAK é inicialmente traduzida como uma proteína de fusão compreendendo o péptido de sinal. Um péptido de sinal que é funcional nas células hospedeiras pretendidas potência a secreção extracelular do polipéptido ITAK. O péptido de sinal pode ser clivado do polipéptido ITAK aquando da secreção de ITAK a partir da célula. Células hospedeiras adequadas para expressão de polipéptidos ITAK incluem células de procariotas, levedura ou eucariotas superiores. Os vectores de clonagem e expressão adequados para utilização com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e de mamífero estão descritos, por exemplo, em Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nova Iorque (1985). Os sistemas de tradução isentos de células também podem ser utilizados para produzir polipéptidos ITAK utilizando ARN derivados de construções de ADN aqui descritas.

Os procariotas incluem organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, E. coli ou Bacilli. Células hospedeiras procariotas adequadas para transformação incluem, por exemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, e várias outras espécies do géneros Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus. Numa célula hospedeira procariota, tal como E. coli, um polipéptido ITAK pode incluir um resíduo de metionina N-terminal para facilitar a expressão do polipéptido recombinante na célula hospedeira procariota. A Met N-terminal pode ser clivada do polipéptido ITAK recombinante expresso.

Os vectores de expressão para utilização em células hospedeiras procariotas compreendem geralmente um ou mais genes marcadores seleccionáveis, fenotípicos. Um gene marcador seleccionável fenotípico é, por exemplo, um gene que codifica para uma proteína que confere resistência a antibióticos, ou que fornece um requisito autotrófico. Exemplos de vectores de expressão úteis para células hospedeiras procariotas incluem os derivados de plasmídeos disponíveis no mercado, tais como o vector de clonagem pBR322 (ATCC 37017) . O pBR322 contém genes para resistência a ampicilina e tetraciclina e proporcionam assim meios simples para identificar células transformadas. 21 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ

Para construir um vector de expressão utilizando pBR322, insere-se um promotor adequado e uma sequência de ADN de ITAK no vector pBR322. Outros vectores disponíveis no mercado incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia) e pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, EUA) .

As sequências promotoras normalmente utilizadas para vectores de expressão de células hospedeiras procariotas recombinantes incluem β-lactamase (penicilinase), sistema promotor de lactose (Chang et al.r Nature 275:615, 1978; e

Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; e EP-A-36776) e promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Um sistema de expressão de células hospedeiras procariotas particularmente útil utiliza um promotor PL de fago λ e uma sequência repressora termolábil cl857ts. Os vectores plasmídicos disponíveis da American Type Culture Collection que incorporam derivados do promotor PL de λ incluem o plasmídeo pHUB2 (residente em E. coli estirpe JMB9 (ATCC 37092)) e pPLc28 (residente em E. coli RR1 (ATCC 53082)) .

Os polipéptidos ITAK podem ser expressos alternativamente em células hospedeiras de levedura, de preferência do género Saccharomyces (e.g., S. cerevisiae) . Também se podem utilizar outros géneros de levedura, tais como Pichia, K. lactis ou Kluyveromyces. Os vectores de levedura terão muitas vezes uma sequência de origem de replicação de um plasmídeo de levedura 2μ e uma sequência de replicação autónoma (ARS), uma região promotora, sequências para poliadenilação, sequências para terminação da transcrição e um gene marcador seleccionável. Sequências promotoras adequadas para vectores de levedura incluem, entre outras, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2013, 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; e Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato- desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase. Outros 22 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ vectores e promotores adequados para utilização em expressão em levedura são também descritos em Hitzeman, EPA-73657 ou em Fleer et al., Gene 107:285-195 (1991); e van den Berg et al., Bio/Technology 8:135-139 (1990). Outra alternativa é o promotor de ADH2 repressível por glucose, descrito por Russell et al. {J. Biol Chem. 258:2674, 1982) e Beier et al. (Nature 800:724, 1982). Podem-se construir vectores vaivém replicáveis quer em levedura, quer em E. coli inserindo sequências de ADN de pBR322 para selecção e replicação em E. coli (gene Ampr e origem de replicação) nos vectores de levedura acima descritos. A sequência comando do factor-α de levedura pode ser utilizada para dirigir a secreção de um polipéptido ITAK. A sequência comando de factor-α é muitas vezes inserida entre a sequência promotora e a sequência do gene estrutural. Veja-se, e.g. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 81:5330, 1984; patente U.S. 4546082; e EP 324274. São conhecidas dos peritos na arte outras sequências comando adequadas para facilitar a secreção de polipéptidos recombinantes a partir de hospedeiros de levedura. Uma sequência comando pode ser modificada próximo da sua extremidade 3' para conter um ou mais locais de restrição. Isto irá facilitar a fusão da sequência comando com o gene estrutural.

Os protocolos de transformação de levedura são conhecidos do perito na arte. Um destes protocolos está descrito em Hinnen et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 75:1929, 1978. O protocolo de Hinnen et al. selecciona transformantes Trp+ num meio selectivo, em que o meio selectivo consiste de base de azoto de levedura a 0,67%, casaminoácidos a 0,5%, glucose a 2%, adenina 10 pg/ml e uracilo 20 pg/ml.

As células hospedeiras de levedura transformadas por vectores contendo a sequência do promotor ADH2 podem ser crescidas para induzir a expressão num meio "rico". Um exemplo de um meio rico é um que consiste de extracto de levedura a 1%, peptona a 2% e glucose a 1% suplementado com adenina 80 pg/ml e uracilo 80 pg/ml. A desrepressão do promotor ADH2 ocorre quando a glucose do meio está esgotada. 23 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ

Os sistemas de cultura de células hospedeiras de mamífero ou insecto também podem ser utilizados para expressar polipéptidos ITAK. Os sistemas de baculovírus para a produção de proteínas heterólogas em células de insecto estão revistos em Luckow e Summers, Βίο/Technology 6:41 (1988). Também se podem utilizar linhas celulares originárias de mamíferos, estabelecidas. Exemplos de linhas celulares de hospedeiros mamíferos adequadas incluem a linha COS-7 de células de rim de macaco (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al. , Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, e linhas celulares de BHK (ATCC CRL 10) e a linha celular CV-l/EBNA-1 derivada da linha celular de rim de macaco verde africano CVI (ATCC CCL 70) como descrito por McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991).

As sequências de controlo da transcrição e da tradução para vectores de expressão de células hospedeiras de mamífero podem ser excisadas de genomas virais. As sequências promotoras e sequências potenciadoras normalmente utilizadas são derivadas do vírus Polioma, adenovírus 2, vírus de símio 40 (SV40) e citomegalovírus humano. As sequências de ADN derivadas do genoma virai de SV40, por exemplo, origem de SV40, promotor precoce e tardio, potenciador locais de splicing e poliadenilação podem ser utilizados para proporcionar outros elementos genéticos para expressão de uma sequência de gene estrutural numa célula hospedeira de mamífero. Os promotores precoce e tardio virais são particularmente úteis pois são ambos facilmente obtidos de um genoma virai como um fragmento que pode também conter uma origem de replicação virai (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Também se podem utilizar fragmentos de SV40 menores ou maiores, desde que esteja incluída a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende do local Hind III até ao local Bgl I localizada no local da origem de replicação virai de SV4 0.

Exemplos de vectores de expressão para utilização em células hospedeiras de mamífero podem ser construídos como descrito por Okayama e Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Um sistema útil para uma expressão de nível elevado, estável, de ADNc de mamífero em células epiteliais mamárias de murídeo, 24 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ C127, pode ser construído substancialmente como descrito por Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Um vector de expressão elevada útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312:168, 1984 foi depositado como ATCC 39890.

Outros vectores de expressão de mamífero úteis estão descritos em EP-A-0367566, e no pedido de patente U.S. com o N° de série 07/701415, apresentado em 16 de Maio de 1991. Os vectores podem ser derivados de retrovírus. Em vez da sequência de sinal nativa, pode-se adicionar uma sequência de sinal heteróloga, tal como a sequência de sinal para IL-7 descrita na patente U.S. 4965195; a sequência de sinal para o receptor de IL-2 descrita em Cosman et al., Nature 312:768 (1984); o péptido de sinal IL-4 descrito em EP 367566; o péptido de sinal receptor de IL-1 tipo I descrito na patente U.S. 4968607; e o péptido de sinal receptor de IL-1 do tipo II descrito em EP 460846. A proteína recombinante produzida em cultura bacteriana é normalmente isolada por rompimento inicial das células hospedeiras, centrifugação, extracção a partir dos sedimentos celulares no caso de um polipéptido insolúvel, ou a partir do fluido sobrenadante, no caso de um polipéptido solúvel, seguido de um ou mais passos de concentração, saltlng-out, troca iónica, purificação por afinidade ou cromatografia por exclusão de tamanhos. Por fim, pode-se utilizar RP-HPLC para passos de purificação finais. As células microbianas podem ser rompidas por qualquer método convencional, incluindo ciclos de congelação-descongelação, ultra-sons, rompimento mecânico ou utilização de agentes de lise de células.

As células hospedeiras de levedura transformadas são preferencialmente utilizadas para expressar ITAK como um polipéptido segregado, de modo a simplificar a purificação. O polipéptido recombinante segregado de uma fermentação de células hospedeiras de levedura pode ser purificado por métodos análogos aos descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal et al. descrevem dois passos de HPLC de fase reversa, sequenciais para purificação de IL-2 humana recombinante, numa coluna de HPLC preparativa.

Como referido acima, a presente invenção proporciona métodos para detectar agonistas ou antagonistas de ITAK, IL-1 25 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ e/ou TNF-α. Tal como aqui utilizado, "um agonista de ITAK" não inclui IL-1 ou TNF-α. Estes métodos permitem a identificação de elementos das vias de transdução de sinal de cada um de IL-1 e TNF-a.

Numa concretização, a invenção proporciona assim, em geral, um método para identificar produtos de genes que se associam com ITAK, compreendendo: (a) introduzir sequências de ácido nucleico que codificam para um polipéptido ITAK num primeiro vector de expressão, de modo que as sequências de ITAK são expressas como parte de uma proteína de fusão compreendendo uma primeira porção funcionalmente incompleta de uma proteína que é essencial para a viabilidade de uma célula hospedeira; (b) introduzir sequências de ácido nucleico que codificam para uma pluralidade de produtos de gene candidatos que interagem ou se associam com ITAK num segundo vector de expressão, de modo que quaisquer produtos de gene candidatos são expressos como parte de uma proteína de fusão compreendendo uma segunda porção funcionalmente incompleta da proteína que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira; (c) introduzir o primeiro e segundo vectores de expressão numa célula hospedeira sob condições e durante um tempo suficiente, de modo que a sobrevivência dessa célula hospedeira depende da reconstituição de ambas, a primeira e segunda porções funcionalmente incompletas da proteína (isso é essencial para a viabilidade da célula hospedeira) numa proteína funcionalmente completa: e (d) identificar as sequências de ácido nucleico que codificam para os produtos de gene candidatos que se associam com ITAK no segundo vector de expressão.

Por exemplo, o sistema de dois híbridos de levedura (Fields e Song, Nature 340:245 (1989); Patente U.S. N° 5283173 de Fields et al.) pode ser utilizado para detectar interacções entre ITAK e outras proteínas, ou entre ITAK e compostos seleccionados, ou conjuntos de compostos que se suspeita que aumentam ou diminuem a actividade de ITAK, IL-1 e/ou TNF-α, ou que utilizam de outro modo ITAK para transduzir um sinal biológico. Estas interacções podem ser detectadas pesquisando a reconstituição funcional de um factor de transcrição de levedura. 26 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ

Em resumo, ο sistema de dois híbridos de levedura foi desenvolvido como um modo para testar se duas proteínas se associam ou interagem directamente uma com a outra e foi então modificado para servir como um método para "capturar" proteínas candidatas que interagem com uma proteína de interesse ou "isco", conhecida. A proteína isco é expressa como uma proteína de fusão com o domínio de ligação ao ADN de GAL4, um factor de transcrição de levedura, numa estirpe de levedura especialmente concebida (Y190) contendo genes repórter sob o controlo de GAL4 (Durfee et al., Genes & Devei. 7:555, 1993.) . 0 GAL4 é um factor de transcrição de levedura modular com o domínio de ligação ao ADN confinado aos 147 resíduos N-terminais, enquanto que a função de activação transcricional reside totalmente nos 114 resíduos C-terminais. As bibliotecas utilizadas no sistema de dois híbridos têm clones que expressam proteínas de fusão do domínio de activação de GAL4. 0 método detecta a reconstituição da função de GAL4 quando as duas proteínas de fusão codificam para proteínas que se associam umas com as outras, de modo que a fusão do domínio de ligação ao ADN recruta a fusão do domínio de activação para a posição no promotor de GAL4, levando à activação transcricional dos genes repórter controlados por GAL4 .

As sequências de ácido nucleico de ITAK aqui descritas podem ser clonadas num vector adequado que transporta o domínio de ligação a ADN de GAL4 e transformadas numa estirpe de levedura adequada, para produzir células de levedura que expressam uma proteína de fusão domínio de ligação ao ADN de GAL4/região ITAK, utilizando métodos bem conhecidos na arte. As bibliotecas de ADNc do domínio de activação podem então ser pesquisadas em vectores adequados. Um sinal positivo neste teste de dois híbridos pode resultar de clones de ADNc que codificam para proteínas que se associam especificamente com ITAK, tais como substratos ou activadores de ITAK. 0 conhecimento de proteínas que se associam com ITAK pode também permitir a pesquisa de inibidores da sinalização por IL-1 e/ou TNF-oí. A interacção funcional entre ITAK e as suas proteínas associadas também permite pesquisar moléculas pequenas que interferem com a associação ITAK/substrato ou ITAK/activador e 27 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ inibem desse modo a actividade de IL-1 ou TNF-α. Por exemplo, o sistema de dois híbridos de levedura pode ser utilizado para pesquisar inibidores de IL-1 e/ou TNF-α, como se segue. A ITAK e activador/substrato, ou suas porções responsáveis pela sua interacção, podem ser fundidos com o domínio de ligação ao ADN de GAL4 e domínio de activação da transcrição de GAL4, respectivamente e introduzidos numa estirpe que depende da actividade de GAL4 para crescimento em placas que não possuem histidina. Os compostos que impedem o crescimento podem ser pesquisados de modo a identificar inibidores de IL-1 e/ou TNF-α. Alternativamente, a pesquisa pode ser modificada de modo a que a interacção ITAK/activador ou ITAK/substrato iniba o crescimento, de modo a que a inibição das interacções permita que o crescimento ocorra. Outra abordagem in vitro para pesquisar a inibição de IL-1 e/ou TNF-α seria imobilizar um dos componentes, tal como ITAK, ou suas porções, em poços de uma placa de microtítulo e acoplar um indicador facilmente detectável ao outro componente. Um inibidor da interacção é identificado pela ausência do indicador detectável no poço.

Também se pode utilizar um teste de pesquisa com elevado rendimento para identificar compostos que inibem a actividade de ITAK. Por exemplo, extractos de produtos naturais, de plantas e fontes marinhas, bem como caldos de fermentação microbianos, podem ser fontes de inibidores de quinase e podem ser pesquisados quanto a antagonistas de ITAK potenciais. Outras fontes de antagonistas de ITAK incluem bibliotecas preexistentes ou criadas de novo de moléculas orgânicas pequenas e bibliotecas químicas combinatórias, preexistentes ou criadas de novo. A identificação do substrato (s) de ITAK endógeno e o mapeamento do seu(s) local de fosforilação para determinar um motivo(s) de reconhecimento específico, pode permitir o desenvolvimento de inibidores miméticos peptídicos. Além disso, a regulação in vivo da actividade de ITAK envolve provavelmente um inibidor(es) de proteína endógeno que pode ser identificado utilizando o(s) teste aqui descrito.

Estes testes também facilitam a identificação de outras moléculas que interagem com ITAK de um modo fisiologicamente relevante, tais como substratos endógenos, activadores e os inibidores de proteína naturais acima referidos. Estas moléculas incluem, mas não se limitam a, receptores e 28 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ polipéptidos associados a receptores, proteínas de ligação a nucleótidos de guanina (proteínas G) , factores de troca de nucleótidos de guanina (GEF), proteínas activadoras de nucleótidos de guanina (GAP), activadores e repressores da transcrição. Adicionalmente, os testes de ITAK podem servir como leituras para identificar outras enzimas envolvidas numa cascata de sinalização, tais como outras quinases, fosfatases e fosfolipases.

Deste modo, a invenção proporciona métodos para detectar agonistas ou antagonistas de ITAK, IL-1 e/ou TNF-α, testando os efeitos da transdução de sinal de IL-1 ou TNF-α na via de resposta a jusante. Num aspecto da invenção, o método para determinar se um agente seleccionado é um agonista de ITAK compreende (a) expor o agente seleccionado a uma via de resposta de ITAK não estimulada, sob condições e durante um tempo suficiente para permitir uma estimulação da via; e (b) detectar a estimulação da via de resposta e a partir daí determinar a presença de um agonista de ITAK. Num aspecto relacionado, o método para determinar se um agente seleccionado é um agonista de ITAK compreende (a) medir a actividade de quinase de ITAK de uma via de resposta de ITAK; (b) expor o agente seleccionado à via de resposta de ITAK medida; e (c) detectar uma actividade de quinase de ITAK aumentada na via de resposta. Noutro aspecto, a invenção também proporciona um método para determinar se um agente seleccionado é um antagonista de ITAK, compreendendo: (a) expor o agente seleccionado a uma via de resposta de ITAK na presença de um agonista de ITAK, sob condições e durante um tempo suficiente para permitir uma diminuição na estimulação da via; e (b) detectar uma diminuição na estimulação da via de resposta em relação à estimulação da via de resposta pelo agonista de ITAK isolado e a partir daí determinar a presença de um antagonista de ITAK. Estes métodos podem incluir testes de proliferação celular (Raines et al., Science 243:393, 1989), produção de prostaglandina (Curtis et al.r Proc. Nat. Acad Sei. USA 86:3045, 1989), produção do factor de estimulação de colónias (Curtis et al., 1989), supra-regulação de imunoglobulinas de superfície celular (Giri et al., J. Immunol. 131:223, 1984), activação de NFK-B (Shirakawa et al., Mol Cell. Biol. 9:959, 1989), ou outros testes de transdução 29 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ de sinal biológico estabelecidos, conhecidos dos peritos na arte.

Num aspecto relacionado, os polipéptidos ITAK de acordo com a invenção podem ser utilizados para a concepção baseada na estrutura de um inibidor dos efeitos a jusante de IL-1 ou TNF-α, bem como para a concepção de inibidores de ITAK. Esta concepção baseada na estrutura também é conhecida como "concepção de drogas racional". Esta concepção pode incluir os passos de determinar a estrutura tridimensional de um polipéptido ITAK deste tipo, analisar a estrutura tridimensional para os locais de ligação prováveis dos substratos (bem como analisar a ITAK quanto ao potencial electrostático das moléculas, enrolamento da proteína, etc.) locais esses que representam locais reactivos previsíveis, sintetizar uma molécula que incorpora um (ou mais) locais reactivos preditivos e determinar a actividade inibidora de ITAK da molécula (Sudarsanam et al., J. Comput. Aided. Mol. Design 6:223, 1992). Os polipéptidos ITAK podem ser analisados tridimensionalmente, por exemplo por cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear ou modelação de homologia, sendo todos estes métodos bem conhecidos. Por exemplo, a maior parte da concepção de inibidores de metaloproteases específicos de classe tem-se focado em tentativas de quelar ou ligar o átomo de zinco catalítico. Os inibidores sintéticos são normalmente concebidos para conter uma porção carregada negativamente à qual se liga uma série de outros grupos concebidos para se ajustarem às bolsas de especificidade da protease particular.

Uma vez que apenas as citóquinas IL-1 e TNF-oí parecem induzir actividade de ITAK, a presente invenção oferece a vantagem de bloquear selectivamente respostas celulares funcionais a estas citóquinas. Assim, a ITAK facilita a identificação de inibidores de ITAK e, assim, de inibidores dos efeitos da libertação excessiva de IL-1 e TNF-α. Esta utilização de ITAK para a pesquisa dos seus inibidores potenciais é importante e pode eliminar ou reduzir a possibilidade de reacções com contaminantes, interferentes.

Referindo outro aspecto da invenção, a actividade de IL-1 é iniciada pela ligação da molécula IL-1 a um receptor de IL-1 30 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ ligado à membrana, ο qual por sua vez interage com proteínas citoplasmáticas associadas com a região citoplasmática do receptor de IL-1. Por exemplo, o domínio citoplasmático do receptor de IL-1 tipo I está associado com uma proteína activadora de GTP-ase (GAP) que é aqui designada por IIP1 e que está descrita em maior detalhe num pedido intitulado "Proteína de interacção com o receptor de IL-1" (U.S.S.N. 08/584831, apresentado em 11 de Janeiro de 1996). As proteínas GAP, tais como IIP1, interagem com proteínas G que por sua vez interagem com moléculas efectoras citoplasmáticas (e.g. proteína-quinases ou canais iónicos) que realizam funções de sinalização precoces. As proteínas-G ligam-se a nucleótidos de guanina (GDP ou GTP). Quando uma proteína G está ligada a GTP ela interage com moléculas efectoras para gerar um sinal biológico (a configuração "LIGADA"). Pelo contrário, quando uma proteína-G está ligada a GDP, ela não interage e não é capaz de gerar um sinal biológico (a configuração "DESLIGADA"). As proteínas-G estão num estado de equilíbrio constante entre as formas ligada a GTP e ligada a GDP. Quando a IL-1 não está ligada ao receptor de IL-1, a IIP1 catalisa a hidrólise de GTP em GDP, forçando o equilíbrio entre a proteína-G ligada a GTP e ligada a GDP na direcção da forma "desligada", ligada a GDP, impedindo desse modo um sinal de IL-1. Quando a IL-1 se liga ao receptor de IL-1, a interacção de I IP 1 com as formas ligadas a GTP e GDP da proteína-G é interrompida, desviando o equilíbrio na direcção da forma "ligada", ligada a GTP, transmitindo desse modo um sinal de IL-1. Deste modo, o efeito global de IIP1 é suprimir o sinal ligado a proteína-G.

Uma via de sinalização regulada por proteína-G semelhante pode controlar a indução da actividade de ITAK em resposta a IL-1 ou TNF-α. Pelo contrário, a indução da actividade de ITAK mediada por IL-1 ou TNF-oí pode controlar a função de uma ou mais proteínas-G. A descrição aqui efectuada de um domínio de polipéptido ITAK com homologia de sequência de aminoácidos pronunciada com factores de permuta de nucleótidos de guanina (tais como RCC1 (Bischoff e Ponstingl, Nature 354:80, 1991) é compatível com qualquer um destes esquemas, que não se excluem mutuamente. Assim, ao proporcionar aqui ITAK, proporcionam-se vias alternativas para a investigação, detecção e possível controlo de vias relacionadas com proteína-G. A ITAK pode ser 31 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ utilizada como um reagente para identificar (a) uma proteína-G que regula - ou é regulada por - ITAK e que está envolvida na sinalização por IL-1 ou TNF-α e (b) outras proteínas com as quais a ITAK interage que estariam envolvidas em vias de transdução de sinal de IL-1 ou TNF-α. Estas outras proteínas, incluindo a proteína-G, são assim ferramentas úteis para pesquisar outros inibidores da sinalização por IL-1 ou TNF-a. A ITAK também pode ser utilizada para acoplar a proteína ITAK recombinante a uma matriz de afinidade.

Noutro aspecto, a presente invenção também proporciona sondas de ácido nucleico baseadas numa molécula de ácido nucleico que codifica para ITAK. Estas sondas podem ser utilizadas de acordo com testes de hibridação e outros conhecidos na arte, por exemplo, para detectar genes de ITAK em amostras candidatas, tais como amostras derivadas de linhas celulares candidatas, ou estirpes ou espécies animais. Estas sondas hibridam especificamente, de preferência, com o gene de ITAK sob condições determinadas de forma adequada, que podem ser condições de rigor moderado ou elevado (veja-se, e.g. Sambrook et al., supra) e compreendem geralmente pelo menos cerca de 15 nucleótidos, tipicamente pelo menos cerca de 18 nucleótidos, ou pelo menos cerca de 20 nucleótidos e de preferência de cerca de 18 a cerca de 35 nucleótidos e ainda mais preferencialmente várias centenas de nucleótidos. No entanto, estas sondas podem compreender até um gene de ITAK total, se desejado. A presente invenção também proporciona nucleótidos de sentido inverso ou directo compreendendo uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples (quer ARN, quer ADN) capaz de se ligar a uma sequência de ARNm de ITAK alvo (formando uma dúplex) ou à sequência de ITAK na hélice de ADN de cadeia dupla (formando uma hélice tripla). Estes nucleótidos muitas vezes compreendem um fragmento da região codificante de ADNc de ITAK, mas também podem compreender um fragmento da região não codificante do ADNc de ITAK. Tipicamente, estes nucleótidos compreendem um fragmento específico de ITAK. Este fragmento compreende geralmente pelo menos cerca de 15 nucleótidos, tipicamente pelo menos cerca de 18 nucleótidos, ou pelo menos cerca de 20 nucleótidos e, de preferência, de cerca de 18 a cerca de 35 nucleótidos e ainda 32 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ mais preferencialmente várias centenas de nucleótidos. A capacidade de criar um nucleótido de sentido inverso ou directo com base numa sequência de ADNc para uma determinada proteína está descrita, por exemplo, em Stein e Cohen, Câncer Res. 48:2659, 1988 e van der Krol et al., BioTechniques 6:958, 1988 . A ligação de nucleótidos de sentido inverso ou directo a sequências de ácido nucleico alvo resulta na formação de complexos que bloqueiam a tradução (ARN) ou transcrição (ADN) por um de vários meios, incluindo degradação aumentada de dúplices, terminação prematura da transcrição ou tradução por qualquer outro meio. Os nucleótidos de sentido inverso podem assim ser utilizados para bloquear a expressão de proteínas ITAK. 0 bloqueio da expressão de ITAK deste modo pode ser útil terapeuticamente em situações de doença inflamatória. Os nucleótidos de sentido inverso ou directo compreendem ainda oligonucleótidos com esqueletos de glícido-fosfodiéster modificados (ou outras ligações glicídicas, tais como as descritas no WO91/06629) e em que as ligações glicídicas são resistentes a nucleases endógenas. Estes oligonucleótidos com ligações glicídicas resistentes são estáveis in vivo (i.e. capazes de resistir à degradação enzimática), mas retêm a especificidade de sequência para serem capazes de se ligar a sequências de nucleótidos alvo. Outros exemplos de nucleótidos de sentido directo ou inverso incluem os oligonucleótidos que estão ligados covalentemente a porções orgânicas, tais como os descritos no WO 90/10448 e outras porções que aumentam a afinidade do oligonucleótido para uma sequência de ácidos nucleicos alvo, tal como poli-(L-lisina). Adicionalmente, podem-se ligar agentes intercalares, tais como elipticina e agentes alquilantes ou complexos de metais, a nucleótidos de sentido directo ou inverso, para modificar especificidades de ligação do nucleótido de sentido inverso ou directo para a sequência de nucleótidos alvo.

Os nucleótidos de sentido inverso ou directo podem ser introduzidos numa célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo por qualquer método de transferência de genes, incluindo, por exemplo, transfecção de ADN mediada por CaP04-, electroporação, ou utilizando vectores de transferência de genes, tais como o vírus de Epstein-Barr. Os nucleótidos de 33 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ sentido directo ou inverso são preferencialmente introduzidos numa célula que contém a sequência de ácido nucleico alvo por inserção do nucleótido de sentido directo ou inverso num vector retroviral adequado, contactando em seguida a célula com o vector retroviral contendo a sequência inserida, quer in vivo, ou ex vivo. Os vectores retrovirais adequados incluem, mas não se limitam a, retrovirus de murideo M-MuLV, N2 (um retrovirus derivado de M-MuLV), ou os vectores de cópia dupla designados por DCT5A, DCT5B e DCT5C (veja-se pedido PCT US 90/02656) .

Os nucleótidos de sentido directo e inverso também podem ser introduzidos numa célula contendo a sequência de nucleótidos alvo, por formação de um conjugado com a molécula de ligação ao ligando, como descrito no WO91/04753. As moléculas de ligação ao ligando adequadas incluem, mas não se limitam a, receptores de superfície celular, factores de crescimento, outras citóquinas, ou outros ligandos que se ligam a receptores de superfície celular. De preferência, a conjugação da molécula de ligação ao ligando não interfere substancialmente com a capacidade da molécula de ligação ao ligando se ligar à sua molécula ou receptor correspondente, ou bloquear a entrada do nucleótido de sentido directo ou inverso, ou da sua versão conjugada na célula.

Alternativamente, pode-se introduzir um nucleótido de sentido directo ou inverso numa célula que contém a sequência de ácido nucleico alvo por formação de um complexo nucleótido-lípido, como descrito no WO 90/10448. O complexo nucleótido de sentido directo ou inverso-lípido é de preferência dissociado dentro da célula por uma lipase endógena.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona parceiros de ligação que interagem especificamente com ITAK. Estes parceiros de ligação, tipicamente anticorpos, podem ser úteis para inibir a actividade de IL-1 ou TNF-α in vivo e para detectar a presença de ITAK numa amostra. Os parceiros de ligação de ITAK adequados incluem anticorpos que são imunorreactivos com ITAK e de preferência anticorpos monoclonais contra ITAK e outras proteínas que são capazes de uma ligação a ITAK com afinidade elevada. O termo "anticorpos" inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, seus 34 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ fragmentos, tais como fragmentos F(ab')2 e Fab, bem como quaisquer parceiros de ligação produzidos de forma recombinante. Define-se que os anticorpos têm ligação especifica quando se ligam a ITAK com uma Ka superior a, ou igual a cerca de 107 M_1. As afinidades dos parceiros de

ligação ou anticorpos podem ser facilmente determinadas utilizando técnicas convencionais, por exemplo, as descritas por Scatchard et al.f Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660 (1949). A determinação de outras proteínas como parceiros de ligação de ITAK pode ser realizada utilizando, por exemplo, o sistema de pesquisa de dois-híbridos de levedura aqui descrito. A presente invenção também inclui a utilização de ITAK e péptidos baseados na sequência de aminoácidos de ITAK, para preparar parceiros de ligação e anticorpos que se ligam especificamente a ITAK.

Os parceiros de ligação de ITAK que são anticorpos policlonais podem ser facilmente produzidos a partir de uma variedade de fontes, por exemplo cavalos, vacas, cabras, ovelhas, cães, galinhas, coelhos, ratinhos ou ratos, utilizando procedimentos que são bem conhecidos na arte. Em geral, a ITAK purificada, ou um péptido baseado na sequência de aminoácidos de ITAK que é conjugado de forma adequada, é administrada ao animal hospedeiro, tipicamente por injecção parentérica. A imunogenicidade de ITAK pode ser aumentada utilizando um adjuvante, por exemplo, adjuvante de Freund completo ou incompleto. Após imunizações de reforço recolhem-se amostras pequenas de soro e testam-se quanto à reactividade para ITAK ou péptidos ITAK. Exemplos de vários testes úteis para esta determinação incluem os descritos em Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, bem como procedimentos, tais como imunoelectroforese em contra-corrente (CIEP), radioimunoensaio, radioimunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), ensaios dot blot, e ensaios sanduíche, veja-se as patentes U.S. Nos 4376110 e 4486530.

Em virtude da ITAK isolada aqui proporcionada, preparam-se facilmente anticorpos monoclonais específicos para ITAK, utilizando procedimentos bem conhecidos, veja-se, por exemplo, os procedimentos descritos nas patentes U.S. Nos RE 32011, 35 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 4902614, 4543439 e 4411993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, e Bechtol (eds.), 1980; Harlow, supra. Em resumo, os animais hospedeiros, tais como ratinhos, são injectados intraperitonealmente pelo menos uma vez e, de preferência, pelo menos duas vezes, a intervalos de cerca de 3 semanas, com ITAK isolada e purificada ou péptido ITAK conjugado, opcionalmente na presença de adjuvante. Os soros de ratinho são então testados pela técnica dot blot convencional ou captura de anticorpo (ABC), para determinar qual o animal que é melhor para fundir. Aproximadamente duas a três semanas mais tarde, os ratinhos recebem um reforço intravenoso de ITAK ou péptido ITAK conjugado. Os ratinhos são mais tarde sacrificados e as células do baço fundidas com células de mieloma disponíveis no mercado, tais como Ag8.653 (ATCC), de acordo com protocolos estabelecidos. Em resumo, as células de mieloma são lavadas várias vezes em meio e fundidas com células de baço de ratinho, a uma razão de cerca de três células de baço para uma célula de mieloma. O agente de fusão pode ser qualquer agente adequado utilizado na arte, por exemplo, polietilenoglicol (PEG). A fusão é plaqueada em placas contendo meio que permite o crescimento selectivo das células fundidas. As células fundidas podem então ser deixadas crescer durante aproximadamente oito dias. Os sobrenadantes dos hibridomas resultantes são recolhidos e adicionados a uma placa que é primeiro revestida com Ig de cabra anti-ratinho. A seguir às lavagens, adiciona-se um marcador, tal como 125I-ITAK a cada poço, seguido de incubação. Os poços positivos podem ser subsequentemente detectados por autorradiografia. Os clones positivos podem ser crescidos em cultura total e os sobrenadantes são subsequentemente purificados numa coluna de proteína A (Pharmacia).

Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser produzidos utilizando técnicas alternativas, tais como as descritas por Alting-Mees et ai., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas," Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990). De igual modo, podem-se construir parceiros de ligação utilizando técnicas de ADN para incorporar as regiões variáveis de um gene que codifica para um anticorpo de ligação específica. Esta técnica está descrita em Larrick et al., Biotechnology 7:394 (1989). 36 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ

Podem-se produzir outros tipos de "anticorpos" utilizando a informação aqui proporcionada em conjunção com os conhecimentos na arte. Por exemplo, os anticorpos que foram manipulados para conter elementos de anticorpos humanos que são capazes de se ligar especificamente a ITAK também são abrangidos pela invenção.

Uma vez isolados e purificados, os parceiros de ligação de ITAK podem ser utilizados para detectar a presença de ITAK numa amostra, utilizando protocolos de teste estabelecidos. Além disso, os parceiros de ligação, tipicamente os anticorpos da invenção podem ser utilizados terapeuticamente para se ligar a ITAK e inibir a sua actividade in vivo. Estes parceiros de ligação de ITAK podem ser ligados a uma fase sólida, tal como uma matriz de cromatografia em coluna ou um substrato semelhante, adequado para identificar, separar ou purificar componentes moleculares obtidos de células que expressam ITAK. A aderência de ITAK ou proteínas de ligação a ITAK a uma superfície que contacta uma fase sólida pode ser realizada por qualquer meio, por exemplo, microesferas magnéticas podem ser revestidas com proteínas de ligação a ITAK e mantidas no vaso de incubação através de um campo magnético. Os extractos celulares são contactados com a fase sólida que tem a ITAK ou proteínas de ligação a ITAK. A ITAK, ou espécies associadas a ITAK liga-se à proteína de ligação fixa e o material não ligado é então removido por lavagem. Este método de ligação por afinidade é útil para purificar, pesquisar ou separar estas moléculas associadas a ITAK da solução. Os métodos para libertar componentes seleccionados positivamente da fase sólida são conhecidos na arte e incluem, por exemplo, a utilização de alterações de pH, concentração de sal alterada ou agentes caotrópicos. A ITAK ou um seu fragmento ou variante, também pode ser útil ela própria como um agente terapêutico na inibição da sinalização por IL-1 e/ou TNF-α. Os agonistas de ITAK ou antagonistas de ITAK proporcionados pela invenção também são úteis como agentes terapêuticos na inibição da sinalização por IL-1 e/ou TNF-a, isolados ou em combinação com ITAK ou um seu fragmento ou variante. A ITAK, ou um agonista de ITAK ou um antagonista de ITAK, é introduzida no meio intracelular por 37 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ meios bem conhecidos, tais como inserindo ITAK (ou o seu agonista ou antagonista) em lipossomas ou acoplando-a com um anticorpo monoclonal direccionado para um tipo de célula especifico.

Quando utilizada como agente terapêutico, a ITAK, um agonista de ITAK ou um antagonista de ITAK, pode ser formulada em composições farmacêuticas de acordo com métodos conhecidos. Numa concretização preferida, a ITAK contém uma mutação do resíduo de lisina na posição 81 noutro aminoácido, por exemplo, a variante de ITAK conhecida como ITAK A81, que contém uma mutação de lisina para alanina. A ITAK, um agonista de ITAK ou um antagonista de ITAK pode ser introduzida no meio intracelular utilizando métodos bem conhecidos no campo, tais como inclusão de ITAK em lipossomas ou acoplamento de ITAK a uma anticorpo monoclonal direccionado para um tipo de célula específico. A ITAK, um agonista de ITAK ou um antagonista de ITAK pode ser combinada em mistura, quer como o único material activo, quer com outros materiais activos conhecidos, com diluentes farmaceuticamente adequados (e.g., Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (e.g., Timerosal, álcool benzílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adjuvantes e/ou transportadores. Transportadores adequados e suas formulações estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed. 1980, Mack Publishing Co. Além disso, estas composições podem conter ITAK, ou um agonista de ITAK, ou um antagonista de ITAK, complexado com polietilenoglicol (PEG), iões metálicos, ou incorporada em compostos poliméricos, tais como poli(ácido acético), ácido poliglicólico, hidrogéis, etc., ou incorporada em lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, membranas de eritrócitos (ghosts) ou esferoblastos de eritrócitos. Estas composições irão influenciar o estado físico, solubilidade, estabilidade, velocidade de libertação in vivo e velocidade de eliminação in vivo de ITAK.

As composições da invenção que são sequências de nucleótidos que codificam para ITAK ou um seu fragmento, uma variante de ITAK ou um seu fragmento, um agonista de ITAK ou um seu fragmento, ou um antagonista de ITAK ou um seu 38 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ fragmento, são utilizadas como agentes terapêuticos de acordo com estratégias de terapia génica. Em geral, estas sequências de nucleótidos são incorporadas em vectores, levando à expressão das sequências de nucleótidos desejadas; estes vectores são facilmente construídos pelos peritos na arte. Adicionalmente, a administração destes vectores por vários meios é bem conhecida dos peritos na arte.

Estes vectores para terapia génica podem ser construções de vectores retrovirais ou podem ser desenvolvidos e utilizados com outros transportadores virais, incluindo, por exemplo, poliovírus (Evans et al., Nature 339:385-388, 1989; e Sabin, J. Biol. Standardization 1:115-118, 1973); rinovírus; poxvírus, tal como poxvírus de canário ou vírus vacínia (Fisher-Hoch et al.r PNAS 86:311-321, 1989; Flexner et al.,

Ann. N.Y. Acad Sei. 559:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:11-21, 1990; patentes U.S. Nos 4603112 e 4769330; WO 89/01973); SV40 (Mulligan et al., Nature 277:108-114, 1979); vírus de influenza (Luytjes et al., Cell 59:1107-1113, 1989; McMichael et al., N. Eng. J. Med. 309:13-11, 1983; e Yap et al., Nature 273:238-239, 1978); adenovírus (Berkner,

Biotechniques 5:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991); parvovírus tais como vírus adeno- associados (Samulski et al., J. Vir. 63:3822-3828, 1989;

Mendelson et al., Virol. 166:154-165, 1988); e herpes (Kit,

Adv. Exp. Med. Biol. 215:219-236, 1989).

Uma vez preparado um vector, ele pode ser administrado terapeuticamente a um animal de sangue quente. Como referido acima, os métodos para administrar um vector são bem conhecidos dos peritos na arte e incluem, por exemplo, administração directa ou via transfecção, utilizando vários métodos físicos, tais como lipofecção (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7417, 1989), injecção de ADN directa (Acsadi et al., Nature 352:815-818, 1991); bombardeamento de microprojécteis (Williams et al., PNAS 88:2726-2730, 1991); lipossomas (Wang et al., PNAS 84:7851- 7855, 1987); CaPCg (Dubensky et al., PNAS 81:7529-7533, 1984); ou ligando de ADN (Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989). 39 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ

Proporcionam-se composições farmacêuticas para terapia génica compreendendo um dos vírus recombinantes acima descritos contendo sequências de nucleótidos que codificam para ITAK, ou um seu fragmento, uma variante de ITAK ou um seu fragmento, um agonista de ITAK ou um seu fragmento ou um antagonista de ITAK ou um seu fragmento. A composição pode ser preparada quer como uma solução líquida, quer numa forma sólida (e.g. liofilizada) que é suspensa numa solução antes de administração. Adicionalmente, a composição pode ser preparada com transportadores ou diluentes adequados quer para injecção, administração oral ou rectal. Em geral, o vírus recombinante é utilizado a uma concentração na gama de 0,25% a 25% e de preferência de cerca de 5% a 20% antes da formulação. Subsequentemente, após preparação da composição, o vírus recombinante irá constituir cerca de 1 pg de material por dose, com cerca de 10 vezes esta quantidade de material (10 pg) como contaminantes co-purifiçados. De preferência, a composição é preparada em 0,1-1,0 ml de solução aquosa formulada como descrito a seguir.

Os transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas. Exemplos representativos de transportadores ou diluentes para soluções injectáveis incluem água, soluções salinas isotónicas que são de preferência tamponadas a um pH fisiológico (tal como solução salina tamponada com fosfato ou solução salina tamponada com Tris), manitol, dextrose, glicerol e etanol, bem como polipéptidos ou proteínas, tais como albumina de soro humano. Uma composição particularmente preferida compreende um vector ou vírus recombinante em manitol 10 mg/ml, HSA 1 mg/ml, Tris 20 mM, pH 7,2 e NaCl 150 mM. Neste caso, uma vez que o vector recombinante representa aproximadamente 1 pg de material, ele pode ser menos de 1% do material de peso molecular elevado e menos de 1/100.000 do material total (incluindo água). Esta composição é estável a -70°C durante pelo menos seis meses. A composição pode ser injectada intravenosamente (i.v.), subcutaneamente (s.c.) ou intramuscularmente (i.m.). As formulações orais podem também ser utilizadas com transportadores ou diluentes, tais como celulose, lactose, manitol, esferas de poli(DL-lactido-co-glicolido) e/ou hidratos de carbono, tais como amido. A composição pode ter a 40 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ forma de, por exemplo, um comprimido, cápsula de gel, pílula, solução ou suspensão e adicionalmente pode ser formulada para libertação controlada. Para administração rectal, a preparação de um supositório pode ser realizada com transportadores tradicionais, tais como polialquilenoglucose, ou um triglicérido.

Os Exemplos seguintes proporcionam uma ilustração de concretizações da invenção e não deverão ser entendidos como limitantes do âmbito da invenção que é apresentada nas reivindicações anexas. Nos Exemplos seguintes, todos os métodos descritos são convencionais, salvo indicação em contrário. EXEMPLOS EXEMPLO 1

DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DE ITAK

As sequências de gene de ITAK clonado foram inicialmente detectadas por análise comparativa da sequência de aminoácidos parcial de um polipéptido de β-caseína-quinase induzida por IL-1 de coelho, isolada e purificada, quinase activada por IL-l/TNF-a (ITAK). Identificaram-se sequências de nucleótidos humanas clonadas que codificavam para regiões de polipéptidos características de proteína-quinases e que apresentavam homologia de sequência de aminoácidos com péptidos derivados de ITAK. A actividade de ITAK foi originalmente detectada pela sua capacidade de fosforilar β-caseína intacta (Guesdon et al., J. Biol Chem. 268:4236 (1993); Guesdon et al., Biochem. J. 304:161 (1994)). No entanto, o teste utilizado ao longo desta purificação é um teste baseado em péptidos de segunda geração. Identificaram-se três locais (Ser 57, Ser 124 e Ser 142) de fosforilação de β-caseína mediada por ITAK, utilizando métodos conhecidos na arte. A β-caseína de bovino desfosforilada foi então marcada com P com ITAK, sob condições anteriormente descritas (Guesdon et al., 1993; Guesdon et al., 1994; supra). A β-caseína marcada radioactivamente foi digerida com proteinase e os péptidos resultantes foram separados por cromatografia em camada fina bidimensional e/ou cromatografia 41 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ líquida de alta eficiência de fase inversa (RP-HPLC) . Os péptidos radioactivos, isolados foram então sequenciados para determinar as sequências de aminoácido de locais aceitadores de fosforilação. Identificaram-se deste modo três péptidos contendo fosfosserina. Sintetizaram-se vários substratos peptídicos compostos por sequências em torno e incluindo estes três resíduos de serina num sintetizador de péptidos ABI Modelo 430. Todos os substratos peptídicos foram sintetizados com múltiplos resíduos básicos no terminal N ou terminal C para mediar a ligação do péptido a filtros de fosfocelulose; esta é uma abordagem normalmente utilizada em testes de quinase baseados em péptidos (Glass et al., Anal. Biochem. 87:566,1978; Casnellie et al.r Proc. Nat. Acad. Sei. USA 79:282, 1982). A análise cinética dos vários substratos peptídicos potenciais resultou na selecção do seguinte péptido para o teste de ITAK convencional:

Arg-Arg-Arg-His-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln (código de letra única: RRRHLPPLLLQSWMHQPHQ) (SEQ ID:NO 3)

No teste de ITAK convencional, adicionam-se 10 μΐ de amostra contendo ITAK a 10 μΐ de 2x tampão de teste (Hepes 40 mM, pH 7,4/MnCl2 20 mM/ATP 20 μΜ/γ-(32P)-ATP 1 pCi) contendo 2 mM de substrato peptídico, a reacção prossegue durante 20 minutos a 30°C, em seguida é parada adicionando 10 μΐ de ácido fórmico. Os controlos de branco consistem de testes realizados na ausência de substrato peptídico. Após as reacções terem parado, colocam-se gotas das misturas de teste em filtros de fosfocelulose circulares de 2,5 cm (P81, Whatman, Fairfield, NJ), lavam-se duas vezes com H3PO4 75 mM, e colocam-se em frascos de cintilação de borossilicato de 20 ml para contagem Cerenkov num contador-β. As contagens globais por minuto, cpm, (cpm da amostra menos cpm do branco) são utilizadas para calcular as picomoles de fosfato incorporado no substrato peptídico. Uma unidade de actividade de ITAK é definida como a quantidade de ITAK necessária para incorporar 1 picomole de fosfato no substrato peptídico, RRRHLPPLLLQSWMHQPHQ (SEQ ID:NO 3), em um minuto, sob condições de teste convencionais. A actividade específica é definida como unidades de actividade de ITAK por miligrama de proteína. As adaptações deste teste para uma pesquisa em grande escala podem incluir a utilização de péptido substrato de ITAK 42 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ biotilinado, num teste de proximidade de cintilação (SPA) com esferas de SPA revestidas com estreptavidina, ou modificação covalente do péptido substrato de ITAK com marcadores fluorescentes, por técnicas conhecidas na arte. EXEMPLO 2

PURIFICAÇÃO DE ITAK

Este exemplo descreve a purificação de ITAK de pulmão de coelho induzida por IL-1 em quantidades suficientes para permitir a sequenciação de aminoácidos parcial da proteína ITAK (veja-se Tabela 1). Os pulmões de coelho foram escolhidos pois apresentam o maior aumento na actividade de ITAK em resposta a IL-Ια, quando comparados com tecidos de animais controlo, não tratados. Este exemplo pormenoriza a purificação de ITAK a partir de 70 pares de pulmões recolhidos de coelhos tratados com IL-la.

Em resumo, injectaram-se na orelha, intravenosamente, coelhos brancos da Nova Zelândia (2,0-2,5 kg) com 100 pg de IL-Ια recombinante humana/kg de peso corporal, num volume total de 0,5 ml em PBS (solução salina tamponada com fosfato). Quinze minutos após a injecção, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e os pulmões foram rapidamente excisados (no espaço de 2-3 minutos) . Uma vez removidos, os pulmões foram rapidamente congelados em gelo seco e em seguida armazenados a -80°C.

Os pulmões foram cortados em pedaços pequenos (—0,5 cm3), enquanto o tecido estava ainda parcialmente congelado, em tampão de lavagem arrefecido em gelo (PBS contendo inibidores de proteinase, leupeptina 0,1 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1,0 mM) em gelo. Os pulmões cortados em pedaços pequenos foram lavados pelo menos duas vezes, para remover proteínas do sangue contaminantes, com 100 ml de tampão de lavagem arrefecido em gelo/par de pulmões. Em geral, processaram-se cinco pares de pulmões de cada vez; assim, cada lavagem foi realizada em 500 ml de tampão de lavagem, durante dez minutos com agitação constante, após o que se removeu o tampão por decantação e aspiração. 43 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ

Após a segunda lavagem, o tecido de pulmão cortado em pedaços pequenos foi imediatamente colocado em tampão de homogeneização arrefecido em gelo (HB: Tris-HCl 25 mM, pH 7,5/p-glicerofosfato 100 mM/para-nitrofenilfosfato 25 mM/ortovanadato de sódio 10 mM/DTT (ditiotreitol) 2 mM/MgCl2 11 mM/EDTA (ácido etilenodiaminatetracético) 5 mM/ EGTA (ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetiléter)N,N,N',N'-tetracético) 5 mM/benzamidina 5 mM/E-64 (trans-epoxi-succinil-L-leucilamido-(4-guanidino)butano) 1 μΜ/ PMSF 1 mM/leupeptina 0,1 mM) , e cortado novamente. Os pulmões cortados em pedaços pequenos foram homogeneizados a uma razão final de 10:1 (vol. HB (ml) : massa de tecido (gm) ) . Inicialmente, os pulmões cortados em pedaços pequenos foram homogeneizados em 75% do volume total de HB, o material sólido foi sedimentado por centrifugação a 12.000 rpm durante 30 min a 4°C e os sedimentos foram novamente homogeneizados nos restantes 25% do tampão. A homogeneização (do tecido cortado em pedaços pequenos em 75% do tampão) foi realizada utilizando um homogeneizador Brinkman ajustado para #8 durante 2 pulsos de 20 segundos. O material sólido foi removido por centrifugação a 12 000 rpm durante 30 minutos a 4°C. O sobrenadante foi removido, os sedimentos foram ressuspensos nos restantes 25% do HB e re-homogeneizados na regulação #8 durante 30 segundos. Utilizou-se outra centrifugação a 12.000 rpm durante 30 minutos a 4°C para remover o material insolúvel. Ambos os sobrenadantes foram combinados e posteriormente clarificados por filtração por gravidade, através de lã de vidro.

Esta preparação, que utilizou 70 pares de pulmões (peso húmido de 560 gramas) isolados de coelhos tratados com rHuIL-la, originou 5,7 litros de homogenato de pulmão. O homogenato de pulmão foi ajustado para 25% em relação ao sulfato de amónio, por adição gradual de 764 gm de sulfato de amónio sólido com agitação lenta, constante, a 4°C. Quando todo o sulfato de amónio estava em solução, a agitação foi parada e o homogenato incubado a 4°C durante a noite. O precipitado de sulfato de amónio a 0-25% foi recolhido por centrifugação a 12.000 rpm durante 30 min a 4°C. Os precipitados sedimentados foram novamente solubilizados em quatro lotes iguais, em 500 ml cada de tampão A (Tris 20 mM, 44 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ ρΗ 8,5^-glicerofosfato 50 mM/DTT 2 mM/EDTA 1 mM/EGTA 1 mM/PMSF lmM/leupeptina 0,1 mM) . O precipitado solubilizado de novo a 0-25% foi dialisado mais uma vez contra duas mudas (10 litros cada) de tampão A, a 4°C, durante a noite. Após diálise, o material insolúvel residual foi removido por centrifugação a 20 000 rpm durante 30 min a 4°C. O sobrenadante resultante foi sequencialmente filtrado através de um pré-filtro de fibra de vidro, um filtro de 0,8 ym e por fim um filtro de 0,45 ym (Corning, Corning, Nova Iorque).

Os tampões utilizados para todas as cromatografias foram filtrados através de filtros de 0,45 ym (Corning), antes de utilização. Cada um dos quatro lotes filtrados (contendo 550-600 ml) foi aplicado individualmente a uma coluna de 25 ml (10,5 x 1,6 cm) da Source 15Q (Pharmacia, Piscataway, NJ) previamente equilibrada com tampão A, a um fluxo de 6,0 ml/min. A coluna foi então lavada com dez volumes de leito (250 ml) de tampão A, a 6,0 ml/min. A proteina ligada foi eluida com um gradiente linear crescente de NaCl (0-0,5 M) em tampão A, a 6,0 ml/min durante um período de 56,6 minutos. Recolheram-se fracções de 4,5 ml e testaram-se 10 yl de cada fracção quanto a actividade de ITAK. Todos os passos cromatográficos foram realizados a 4°C, salvo indicação em contrário. A actividade de ITAK eluiu da Source 15Q a uma concentração de NaCl de 200-300 mM (Tabela 1) . As fracções contendo actividade de ITAK eluida das quatro corridas separadas de Source 15Q foram reunidas, diluídas 1:2 com tampão B (tampão A contendo glicerol a 10%) e aplicadas a uma coluna de 50 ml (9,5 x 2,6 cm) de Green 19 reactivo (Sigma, St. Louis, MO), previamente equilibrada com tampão B, a um fluxo de 2,5 ml/min. Após carga, a coluna foi lavada com quatro volumes de leito (200 ml) de tampão B a 2,5 ml/ min. A proteína foi eluida da coluna Green 19 com um gradiente linear crescente de NaCl (0-2,0 M) em tampão B a 2,5 ml/min durante 80 min. Recolheram-se fracções de 4 ml e testaram-se alíquotas de 5 yl de cada fracção quanto a actividade de ITAK. A actividade de ITAK eluiu num pico largo com uma concentração de NaCl de 1,0-1,5 M. As fracções activas foram reunidas e concentradas num concentrador Centriprep 30 (Amicon, Beverly, MA) para um volume final de 5,0 ml. 45 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ Ο concentrado de ΙΤΑΚ foi carregado numa coluna de cromatografia por exclusão de tamanhos HiLoad 26/60 Superdex 200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) previamente equilibrada com tampão B. A proteína foi eluída com tampão B a 2,5 ml/min. Recolheram-se fracções de 4,0 ml e testaram-se alíquotas de 5 μΐ quanto a actividade de ITAK. Utilizaram-se padrões de calibração de filtração em gel (BioRad, Hercules, CA) cromatografados sob condições idênticas para estimar o peso molecular aparente de ITAK; a sua eluição era consistente com um Mr -350 kD.

As fracções de pico de actividade de ITAK reunidas eluídas de Superdex 200 foram ajustadas para 0,1 % em NP-40 por adição da quantidade adequada de uma solução de NP-40 a 10% (Pierce, Rockford, IL) , incubadas a 37°C durante 5 minutos, em seguida imediatamente aplicadas numa coluna de 25 ml (12,5 x 1,6 cm) de Heparina-Sepharose (Pharmacia) previamente equilibrada com tampão C (tampão B contendo NP-40 a 0,1 %) , a um fluxo de 2,0 ml/min. Este passo e todos os passos cromatográficos subsequentes foram realizados à temperatura ambiente (20°C). Após carga, a coluna foi lavada com quatro volumes de coluna (100 ml) de tampão C, com o mesmo fluxo. A coluna foi desenvolvida com um gradiente linear crescente de NaCl (0-1,0 M) em tampão C a 2,0 ml/min durante 50 min. Recolheram-se fracções de 1 ml ao longo do gradiente de sal e testaram-se 2 μΐ de cada fracção quanto a actividade de ITAK. A ITAK eluiu na região de NaCl 175-250 mM do gradiente.

As fracções activas foram combinadas e diluídas 1:5 com tampão C, o pH foi ajustado para 8,0, incubou-se a 37°C durante 5 minutos, em seguida aplicou-se imediatamente a uma coluna HR5/5 MonoQ de 1,0 ml (Pharmacia), previamente equilibrada com tampão C pH 8,0, a 1,0 ml/min. A coluna foi lavada a 1,0 ml/min com 10 volumes de coluna (10 ml) de tampão C pH 8,0, antes de ser desenvolvido com um gradiente linear crescente de NaCl (0-0,5 M) em tampão C pH 8,0, também a 1,0 ml/min durante 20 minutos. Recolheram-se fracções de 0,5 ml ao longo do gradiente de sal e testou-se 1 μΐ de cada

quanto a actividade de ITAK (Tabela 1) . A actividade de ITAK eluiu como um único pico bem resolvido na porção de NaCl 200- 46 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 250 mM do gradiente. Removeu-se mais 1 μΐ de cada fracção para análise por electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), utilizando geles de gradiente 8-16% Novex pré-moldados (San Diego, CA).

Antes da SDS-PAGE as fracções de 1 μΐ contendo ITAK da coluna MonoQ foram incubadas sob condições de teste de quinase modificado (Hepes 20 mM -pH 7,4/ MnCl2 10 mM/ATP 10 μΜ/γ-(32Ρ)-ATP 0,5 pCi, durante 45 min a 30°C) na ausência de substrato adicionado exogenamente. Este procedimento tinha anteriormente resultado na marcação com 32P de porções endógenas que se estimou terem -110-125 kD. Após electroforese, o gel foi corado com prata e a banda(s) marcada radioactivamente foi identificada utilizando um Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) . Verificou-se que as bandas coradas com prata evidentes que se estimou serem de 90, 100 e 110 kD correspondem a actividade de ITAK. A banda de 110 kD e duas bandas coradas fracamente a 120 e 125 kD migraram para posições no gel que coincidem com as porções marcadas com 32P. Todas as estimativas de peso molecular basearam-se na comparação directa com padrões de proteína de gama alargada da Novex analisados por electroforese no mesmo gel.

As fracções da coluna MonoQ com actividade de ITAK foram combinadas, o pH foi ajustado para 7,0 com Tris-HCl 2,0 M, pH 7,0, em seguida foram aplicadas em quatro lotes separados (300-400 μΐ cada) a uma coluna de filtração em gel de HPLC Bio-Sil SEC-400 de 60 x 0,75 cm (BioRad, Hercules, CA) previamente equilibrada com tampão D (Tris-HCl 20 mM, pH 7,0/ β-glicerofosfato 10 mM/DTT 1 mM/EDTA 1 mM/EGTA lmM/PMSF 1 mM/leupeptina 0,1 mM/glicerol a 10 %/NP-40 a 0,1%). As proteínas foram eluídas da coluna a um fluxo de 0,5 ml/min, recolheram-se fracções de 0,5 ml e testaram-se 0,5 μΐ de cada fracção quanto a actividade de ITAK. Utilizaram-se 0,5 μΐ adicionais para marcação radioactiva com 32P com γ-(32Ρ)-ΑΤΡ, sob condições de teste de quinase modificado, sem substrato exógeno, SDS-PAGE e coloração com prata, como descrito acima. Mais uma vez, as bandas de 90 e 100 kD co-eluíram com actividade de ITAK, tal como as bandas de 110, 120 and 125 kD marcadas endogenamente com 32P. Os padrões de calibração de filtração em gel (BioRad) foram cromatografados sob condições idênticas, imediatamente após a corrida de ITAK final. A ITAK 47 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ (Tabela 1) eluiu da coluna Bio-Sil SEC-400 (todas as quatro corridas) a um volume de eluição consistente com um Mr = 350 kD.

As fracções contendo ITAK da coluna de filtração em gel de HPLC foram combinadas e aplicadas a uma coluna microbore MonoQ (Pharmacia) de 35 μΐ (5 x 0,1 cm) previamente equilibrada com tampão E (Tris-HCl 20 mM, pH 8,5/ β-glicerofosfato 10 mM/DTT 1 mM/EDTA lmM/EGTA lmM/PMSF 1 mM/leupeptina 0,1 mM/glicerol a 10 %/NP-40 a 0,1 %) . A ITAK foi aplicada à coluna a 50 μΐ/min; foram necessárias múltiplas cargas e em cada caso a coluna foi lavada com tampão E até a absorvância a 280 nm voltar para a linha de base. Após a carga final, a coluna foi lavada com mais 30 volumes de coluna de tampão E. Todas as cargas e lavagens foram realizadas a um fluxo de 50 μΐ/min. A proteína foi eluída da coluna com um gradiente linear crescente gradual de NaCl (0-0,5 M) em tampão E, a um fluxo de 50 pm/min durante um período de 10 min. Recolheram-se fracções de 50 μΐ e removeram-se 0,25 μΐ de cada fracção para testar quanto a actividade de ITAK. Removeram-se mais 0,25 μΐ para marcação radioactiva com 32P com γ-(32Ρ)-ΑΤΡ sob condições de teste de quinase modificado, sem substrato exógeno, SDS-PAGE e coloração com prata, como descrito em detalhe acima.

Praticamente toda a actividade de ITAK (>95%) eluiu numa única fracção (Fracção #12, Tabela 1) que continha as bandas de 90 e 100 kD não marcadas previamente observadas, bem como as bandas de 110, 120 e 125 kD marcadas com (32P). Utilizou-se aproximadamente um terço da fracção contendo ITAK para a electroforese em gel preparativa. A amostra foi primeiro marcada endogenamente com 32P como descrito acima, após o que foi reduzida (com DTT em excesso a 100°C durante 30 min) e em seguida alquilada com um excesso de iodoacetamida durante 15 minutos no escuro. A electroforese foi realizada utilizando geles de gradiente 8-16% Novex pré-moldados e corrida a 100 V (voltagem constante) durante 30 min, em seguida a 150 V (voltagem constante) por mais 90 min. Após electroforese, o gel foi corado com Coomassie Brilliant Blue G-250, descorado, envolvido em película plástica e exposto a ecrã de fósforo de armazenamento para identificação por Phosphorlmager da(s) banda marcada radioactivamente. As bandas co-purifiçadas com 48 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ actividade de ΙΤΑΚ, incluindo as bandas marcadas radioactivamente, foram excisadas do gel para digestão com tripsina in-gel, utilizando uma modificação de técnicas conhecidas na arte (Henzel et al., in Methods: A Companion to Methods in Enzymology 6, pp. 239-247, 1994.)

Foi estimado para três fatias excisadas de regiões radioactivas do gel que continham proteínas com massas moleculares de 110, 120 e 125 kD, com base na comparação com padrões de proteína de gama alargada (Novex, San Diego, CA) co-analisados por electroforese. Fez-se a contagem de Cerenkov destas fatias de gel e continham 3, 0 x 105, 6, 9 x 105 e 8,3 x 105 cpm, respectivamente. A digestão com tripsina in-gel foi realizada nestas fatias de gel utilizando tripsina de grau de sequenciação (Promega, Madison, WI) a uma razão de 1:10 (p/p). A digestão foi realizada em NH4HCO3 20 mM, pH 8,0 a 37°C durante 16 horas. Os péptidos resultantes foram isolados dos pedaços de gel por extracção com acetonitrilo a 60%/ácido fórmico a 5%, utilizando quer incubação a 37°C, quer ultra-sons para facilitar a recuperação dos péptidos.

Os péptidos recuperados foram brevemente concentrados sob vácuo (Speed-Vac SC 100, Savant, Farmingdale, NY) para remover a maioria do acetonitrilo, em seguida foram separados aplicando o material a uma coluna capilar Ci8 (Vydac, Hesperia, CA) previamente equilibrada com ácido trif luoroacético a 0,1% (TFA) a um fluxo de 15yl/min. Após carga, a coluna capilar foi exaustivamente lavada com TFA a 0,1% a 15 μΐ/min. Os péptidos foram eluídos com um gradiente crescente de acetonitrilo (0-90%, 1,0% por minuto) durante 90 min. Os péptidos eluídos foram monitorizados espectrofotometricamente a 214 nm e as fracções recolhidas à mão. Os mapas de péptidos trípticos das bandas de 110 e 120 kD eram praticamente idênticos e o mapa da banda de 125 kD era semelhante, embora menos bem definido, sugerindo que estas três bandas eram provavelmente formas modificadas da mesma proteína. Analisou-se uma pequena porção (3-5%) de cada fracção por MALDI (espectrometria de massa de desadsorção com laser assistida por matriz) utilizando um analisador de massa Lasermat (Finnigan MAT) e/ou por espectroscopia de massa triplo quadrupolo (Finnigan MAT TSQ 700 com ionização por electropulverização), e o restante foi sequenciado por 49 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ degradação de Edman, utilizando ou um sequenciador de proteínas automatizado ABI 476A ou ABI 494. Estas posteriores análises dos péptidos derivados das três bandas marcadas radioactivamente corroboravam a hipótese de que as bandas de 110, 120 e 125 kD estão relacionadas.

Verificou-se que a ITAK contém as seguintes sequências: Gly-Ala-Phe-Gly-Glu-Ala-Thr-Leu-Tyr-Arg (SEQ ID:NO 4)

Val-Thr-Leu-Leu-Asn-Ala-Pro-Thr-Lys (SEQ ID:NO 5)

Com base na homologia com outras quinases, a sequência apresentada como SEQ ID:NO 4 assemelha-se a uma versão truncada de um motivo de assinatura de quinase (Hanks et ai., Science 241:42, 1988). A presença deste fragmento de sequência de ITAK de coelho, que identificou esta molécula como uma quinase, permitiu a comparação com as sequências de clones de ADNc, derivadas de materiais fonte biológicos independentes, que também continham motivos de quinase (vejam-se os Exemplos 3, 4) . A tradução de um destes clones parciais produzido a partir de uma biblioteca de ADNc de células dendríticas humanas subtraída e designada por HH0381, revelou que este clone de ADNc continha sequências idênticas à SEQ ID:NO 4. Verificou-se que uma versão alargada do ADNc de HH0381 designado por clone 7 continha sequências de nucleótidos derivadas de ADNc humano que foram traduzidas em ambas as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOS: 4 e 5, que foram identificadas em péptidos ITAK de coelho purificados. Além disso, também se verificou que outras sequências de aminoácidos presentes entre os péptidos trípticos produzidos a partir de ITAK de 110, 120 e 125 kD de pulmão de coelho purificadas eram codificadas pelo clone 7. Estas sequências partilhadas são aqui apresentadas como SEQ ID:NO 6 e SEQ ID:NO 7.

Ser-Ser-Thr-Val-Thr-Glu-Ala-Pro-Ile-Ala-Val-Val-Thr-Ser-Arg (SEQ ID:NO 6)

Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Glu-Glu-Asp-Tyr-Tyr-Thr-Pro-Gln-Lys-Val-Asp-Val-Pro-Lys (SEQ ID:N0 7) 50 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ

Tabela 1

Isolamento e purificação de ITAK a partir de pulmão de coelho induzido por IL-Ia

Preparação Proteína total (mg) volume (ml) conc. de proteína (mg/ml) actividade (Unidades) Act. espec. (Unidades/ mg) Magnitude da purif. Homogenato de pulmão total 57300 5700 10.05 [0] 0,43 1 Carga de S15Q (sedimento ammS04 0-25%) 1510 2040 0,74 [0] 16, 5 38 Carga de Green 19 333 241 1,38 19039 57, 1 133 Carga de Superdex 200 112 52 2,15 {5474} 222,1 517 Carga de Heparina Sepharose 9,4 20 0,47 24851 2646 6153 Carga de Mono Q, pH 8,0 *1 70 0,014 5345 5345 12430 Carga de SEC-400 0,225 1,35 0,167 4105 18244 42428 Carga de microMono Q 0,14 10,6 0,013 6477 46254 107591 Fracção #12 de microMono Q $0,1 0,062 1,61 9844 98640 229395 * estimado, demasiado diluído para se obter uma medida precisa $ estimado com base em A a 280nm e coloração com prata

[ ] impossibilitado de testar devido a ruído de fundo elevado e inibição { } aberrantemente baixo. SA baseado na carga de HS EXEMPLO 3

IDENTIFICAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE GENES DE QUINASE HUMANA NUMA BIBLIOTECA DE ADNc DE CÉLULAS DENDRÍTICAS

As células dendriticas humanas (DC) foram purificadas a partir de medula óssea humana recolhida de fresco, como se segue.

As células de medula óssea foram fraccionadas num gradiente de densidade de Ficoll e as células de medula óssea CD34+ foram isoladas da fracção de densidade elevada (película amarela - buffy coat) utilizando um kit de biotina Ceprate LC CD34 (CellPro, Bothell, WA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células da película amarela foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-CD34 51 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ biotinilado, lavadas em tampão contendo solução salina normal e a suspensão de células foi aplicada a uma coluna de estreptavidina imobilizada em fase sólida. As células CD34+ foram absorvidas na coluna por ligação de afinidade de estreptavidina-biotina, enquanto que as células CD34- foram removidas por lavagem no efluente da coluna. As células CD34+ seleccionadas positivamente foram então desadsorvidas mecanicamente da coluna flexível espremendo-a, pois a interacção estreptavidina-biotina é de maior afinidade do que entre o anticorpo e o seu ligando cognato, CD34.

As células CD34+ foram cultivadas a 37°C num incubador humidificado (CO2 a 10%) durante duas semanas, em meio de Super McCoy suplementado com soro fetal de vitela a 10%, factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos 20 ng/ml, IL-4 20 ng/ml, TNF-a 20 ng/ml, e ligando FLT3 100 ng/ml. As células viáveis recuperadas das culturas foram ainda seleccionadas quanto a expressão dos marcadores de superfície celular DC conhecidos CDla e HLA-DR por separação de células activada por fluorescência (FACS) utilizando anticorpos específicos para estes marcadores.

Isolou-se ARN total de CDla+/HLA-DR+ DC por centrifugação em gradiente de cloreto de tiocianato de guanidínio (protocolo convencional, veja-se Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). O ARN poliadenilado foi purificado em esferas de látex acopladas a oligo dT (Qiagen, Chatsworth, CA), de acordo com as instruções do fabricante. Preparou-se uma biblioteca de ADNc DC no plasmídeo pBluescriptSK(-) (Stratagene, La Jolla, CA) essencialmente como descrito em Larsen et al., J. Exp. Med 172:159 (1990). Resumidamente, converteu-se aproximadamente 1 yg de ARN de DC poliA+ em ADNc de cadeia dupla utilizando iniciadores de hexâmeros ao acaso e transcriptase inversa, utilizando um kit de ADNc Timesaver (Pharmacia, Piscataway, NJ) . As reacções de ADNc foram optimizadas para originar um tamanho médio de ADNc de cerca de 400 pb. O ADNc de cadeia dupla foi modificado com adaptadores BglII (descrito em Larsen et al.f supra) e ligado a pBluescriptSK(-) que tinha sido linearizado com BamHI e modificado de modo semelhante com adaptadores BglII. As construções recombinantes foram transformadas em E. coli. 52 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ A hibridação subtractiva da biblioteca de ADNc de DC humana foi realizada utilizando uma biblioteca de ADNc de fibroblastos humanos para enriquecer nos ADNc contidos preferencialmente na biblioteca de DC. Resumidamente, a biblioteca de ADNc de DC em pBluescript foi convertida em fagemideo de cadeia simples e o fagemideo de cadeia simples foi subtraído com ARN biotinilado transcrito de inserções de uma biblioteca de ADNc referência, preparada a partir de fibroblastos de prepúcio humano num vector XgtlO modificado contendo um promotor de polimerase de ARN de SP6. Para uma descrição geral dos métodos envolvidos, veja-se Klar et ai. (Cell 69:95 (1992)) e Owens et al. (Mol. Cell. Biol. 11:4177 (1991)). Os fagemídeos de cadeia simples recuperados da subtracção foram novamente transformados em E. coli. Isolaram-se colónias individuais e preparou-se ADN plasmídico e sequenciou-se utilizando metodologia de terminador corante (ABI Prism DyeDeoxy Kit, Perkin-Elmer, Foster City, CA).

Cada plasmídeo foi sequenciado numa direcção utilizando um iniciador específico do vector adjacente ao local de clonagem de BamRl. As sequências foram comparadas com sequências de bases de dados de proteínas e nucleótidos não redundantes (National Ctr. for Biotechnol. Information (NCBI), Bethesda, MD) utilizando o algoritmo BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990). A tradução da inserção de ADNc de ITAK do clone HH0381 (542 nt) revelou que este codificava para a sequência de aminoácidos GAFGEATLYR (SEQ ID:NO 4) previamente detectada num péptido tríptico de ITAK de pulmão de coelho (veja-se Exemplo 2) . A sequência HH0381 traduzida também apresentava homologia com domínios catalíticos de várias proteína-quinases, na base de dados NCBI. A sequência de aminoácidos de ITAK parcial codificada por HH0381 apresentava a homologia de sequência mais forte (superior a 30% de identidade) com a região correspondente da proteína nekl de murídeo (Letwin et al., EMBO J. 11:354, 1992), de entre as sequências de proteína-quinase na base de dados. 53 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ EXEMPLO 4

CLONAGEM DO GENE DE TAMANHO TOTAL QUE CODIFICA PARA ITAK

Para identificar o gene humano de tamanho total que codifica para ITAK, a inserção clonada de ADNc humano de HH0381 foi marcada com 32P por iniciação ao acaso, de acordo com protocolos convencionais (Sambrook et al., supra) para utilização como uma sonda, para pesquisar uma biblioteca de ADNc de células dendriticas humanas preparada utilizando o vector λΖΑΡΙΙ vector (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente, a inserção de ADNc do clone HH0381 (542 pb) foi excisada do plasmideo, purificada em gel, marcada radioactivamente com 32P utilizando um kit Prime-It II (Stratagene, La Jolla, CA) , e utilizada como sonda para analisar outra biblioteca de ADNc de DC preparada no vector de bacteriófago lambda λΖΑΡΙΙ (Stratagene). Esta segunda biblioteca de ADNc de DC foi preparada a partir do mesmo ARNm de DC que a biblioteca de DC descrita acima, excepto que se utilizou uma fracção de ADNc com um tamanho médio maior (cerca de 1000 pb, em vez de 400 pb). As extremidades do ADNc foram modificadas com adaptadores FcoRI incluídos no kit de síntese de ADNc Timesaver (Pharmacia) e em seguida ligadas a λΖΑΡΙΙ digerido com EcoRI. Seleccionou-se um clone positivo com base na hibridação com a sonda derivada de HH0381 e isolou-se por ciclos sucessivos de purificação e re-hibridação. A inserção deste clone, designado por clone 7, foi sequenciada utilizando metodologia de terminador corado. A Figura 1 (SEQ ID:NO 8) mostra uma sequência de nucleótidos compósita de cadeias que codificam para ITAK da inserção de ADNc do clone 7 (nucleótidos 1-2040) e clone 16-1 (nucleótidos 2041-3264). A sequência de aminoácidos traduzida (640 aminoácidos) da fase de leitura aberta é apresentada a

por baixo da sequência de nucleótidos correspondente. A análise da sequência codificante de ADN da inserção do clone 7 mostrou que por tradução numa sequência de aminoácidos, ela codificava para a sequência peptídica assinatura da quinase GRGAFGEATLYR (Hanks et al., Science 241:42, 1988), uma porção da qual, GAFGEATLYR, foi identificada num péptido tríptico de ITAK de coelho como SEQ ID:NO 4 (veja-se Exemplo 2). Também se 54 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ verificou que as sequências de aminoácidos de outros péptidos tripticos ITAK de coelho eram codificadas por porções da sequência de ADN do clone 7 humano, incluindo os péptidos ITAK de SEQ ID NOS: 4-7. Apesar do clone 7 incluir sequências que codificam para um resíduo de metionina iniciador, o clone 7 não parecia conter sequências de ADN que codificam para a fase de leitura aberta (ORF) completa de ITAK.

De modo a identificar as sequências que codificam para o restante da ORF de ITAK, concebeu-se uma nova sonda de ADN a partir dos dados de sequência do clone 7, para utilização na hibridação com bibliotecas de ADNc humano adicionais. Preparou-se uma sonda de ADN de 918 pb a partir da sequência de inserção do clone 7, como se segue: primeiro, o fragmento foi amplificado por reacção em cadeia com polimerase (PCR) utilizando os iniciadores indicados: a) iniciador 5': CCATGGCTGAGACGCTTG (SEQ ID:NO 9) b) iniciador 3': GTCGTCCATATTCGCCACAG (SEQ ID:NO 10) 0 ADN modelo (~2xl06 fagos) consistia de uma biblioteca de ADNc humano construída em λgtl0 da linha celular de carcinoma epidérmico humano KB (ATCC CCL17). Uma reacção de amplificação de 50 μΐ continha modelo (~ 2 x 106 fagos) mais 25 pmol de cada iniciador, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl2 1.5 mM, KC1 50 mM, 200 μΜ cada de dATP, dGTP, dCTP, dTTP e 2.5 unidades de polimerase Taq (Boehringer Mannheim,

Indianapolis, IN) . As condições reaccionais eram: 1 ciclo de (5 min, 94°C; 1 min, 64°C; 2 min, 72°C); 29 ciclos de (1 min, 94°C; 1 min, 64°C; 2 min, 72°C); seguido de 5 min, a 72°C.

Segundo, construiu-se uma sonda a partir deste fragmento derivado do clone 7 amplificado, utilizando 7,5 ng do fragmento como modelo em 100 μΐ de reacção de amplificação contendo 50 pmol do iniciador 3' (GTCGTCCATATTCGCCACAG) (iniciador (b) acima; (SEQ ID:NO 10)), Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, 20 μΜ cada de dATP, dGTP, dTTP, 1 μΜ de dCTP, [a-32P]dCTP 100 pCi e 5 unidades de polimerase Taq (Boehringer Mannheim). As condições reaccionais eram: 5 min, 94°C; seguido de 29 ciclos de (1 min, 94°C; 1 min, 55°C; 1 min, 72°C); seguido de 5 minutos a 72°C. A radioactividade 55 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ não incorporada foi removida passando a sonda sobre Sephadex G-50 (Pharmacia). A sonda de 918 pb marcada radioactivamente foi então utilizada para pesquisar 500.000 placas de uma biblioteca de fibroblastos dérmicos humanos construída em XgtlO (Sims et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86:8946, 1989). Identificaram- se múltiplas placas positivas (>60). Aproximadamente 20 das placas primárias positivas foram seleccionadas e analisadas por amplificação com uma combinação de iniciadores derivados da sequência do clone 7 e iniciadores do vector λρίΙΟ.

Utilizaram-se os iniciadores: c) CAACCAGTGAGTCATCCTC (dirigido para a extremidade 5' do ARNm) (SEQ ID:NO 11) d) CAACCATGAAGCATACCATG (dirigido para a extremidade 3' do ARNm) (SEQ ID:NO 12) e) CGAGCTGCTCTATAGACTGCTGGGTAGTCC (iniciador do vector, ramo esquerdo) (SEQ ID:NO 13) f) TAACAGAGGTGGCTTATGAGTATTTCTTCC (iniciador do vector, ramo direito) (SEQ ID:NO 14) A análise dos tamanhos dos produtos de amplificação produzidos utilizando os iniciadores (d) , (e) e (f) revelou que se podia esperar que os clones designados por 11-1 e 16-1 contivessem o remanescente da região codificante de ITAK (no lado C-terminal), que não estava presente no clone 7. Esta conclusão foi verificada por sequenciação de ADN directa dos produtos de PCR destes dois clones. A análise de sequência de ADN de clones de células de fibroblastos e de células dendríticas revelou várias sequências variantes. Por exemplo o nucleótido 419 na Figura IA (SEQ ID NO: 8) é um "A" nos clones derivados de células dendríticas (clones 7 e 2) e um "T" nos clones derivados de células de fibroblastos. Esta alteração de nucleótidos é silenciosa, no entanto, o codão resulta numa Ile em ambos os casos. Adicionalmente, para o nucleótido 443, encontra-se um "C" nos clones de células dendríticas 7 e 2; encontra-se um "T" nos clones de fibroblastos 3 e 16. Esta 56 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ variante também é silenciosa. Uma variante não silenciosa é encontrada no nucleótido 1405; os clones de células de fibrolastos 3, 11 e 16 têm um "A" (codão His), enquanto que os clones de células dendriticas 2 e 7 têm um "G" (codão Arg) . Além disso, o clone 16 tem uma inserção de 36 bases no nucleótido 1649. Esta inserção pequena parece ser um intrão que é normalmente removido por splicing do ARNm maduro. A fonte das outras posições variantes descritas será provavelmente os polimorfismos naturais. É pouco provável que estas alterações tenham sido introduzidas durante a clonagem, dado que cada variante foi encontrada em pelo menos dois clones derivados de forma independente.

Assim, um compósito dos clones 7 e 11-1 codifica para uma fase de leitura aberta completa de ITAK. Figura 1. A fase de leitura aberta tem 979 aminoácidos de comprimento. O domínio de ITAK com homologia com proteína serina/treonina-quinases situa-se nos »300 aminoácidos N-terminais (aminoácidos »50-300). O parente mais próximo é uma quinase designada por nekl (número de acesso da GenBank S25284) . O domínio de ITAK correspondente aos »300-750 aminoácidos tem homologia com uma família de factores de permuta de nucleótidos de guanina para as proteínas G de baixo peso molecular ran e TC4. O parente mais próximo é designado por RCC1 (número de acesso da GenBank A26691, Bischoff e Ponstingl, Nature 354:80, 1991). A sequenciação de ADN foi realizada utilizando química de terminador corado e iniciadores usuais em sequenciadores de ADN automático ABI/Perkin Elmer 373 e 377. EXEMPLO 5 CLONAGEM POR REACÇÃO EM CADEIA COM POLIMERASE DIRECTA DE ITAK A PARTIR DE BIBLIOTECAS DE ADNc

Um ADNc contendo toda a região codificante para o polipéptido ITAK é amplificado a partir de ARN celular numa forma adequada para subclonagem num vector adequado. O ARN de uma fonte celular adequada que se sabe que expressa ITAK, por exemplo células dendriticas humanas, fibroblastos dérmicos humanos ou células KB (veja-se Exemplos 3 e 4) , é utilizado como modelo para a síntese da primeira cadeia de ADNc. 57 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ

Resumidamente, misturam-se 1-5 pg de ARN total com 0,5 pg do iniciador oligodTi2-i8 num volume final de 12 pl e aquece-se a 70°C durante 1 min, em seguida arrefece-se em gelo. À mistura acima adicionam-se 2 pl de 10X tampão de PCR (Tris-HCl 200 mM pH 8,4, KC1 500 mM) , 2 pl de MgCl2 25 mM, 2 pl de dNTP mistos 10 mM (10 mM cada de dATP, dGTP, dCTP e dTTP) e 2 pl de ditiotreitol 0,1 M e a reacção é deixada prosseguir durante 5 min a 42°C. Adiciona-se à reacção transcriptase inversa Superscript RTII (200 unidades) (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) que prossegue durante 50 min a 42°C e é parada por incubação a 70°C durante 15 min, após o que a mistura é mantida em gelo. Adiciona-se ARNase H (4 unidades)(GibcoBRL) à reacção e incuba-se durante 20 min a 37°C.

Para produzir ADNc que codifica para ITAK utilizam-se 2 pl da primeira cadeia de ADNc como um modelo, em 50 pl de reacção em cadeia com polimerase (PCR) contendo 25 pmol de cada iniciador, Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KC1 5 0 mM, 200 pM cada de dATP, dGTP, dCTP e dTTP e 2,5 unidades de polimerase Taq (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). As condições reaccionais são: 1 ciclo de (5 min 94°C; 1 min 64°C; 2 min 72°C); 29 ciclos de (1 min 94°C; 1 min 64°C; 2 min 72°C); seguido de 5 min a 72°C. Os iniciadores adequados irão conter as seguintes sequências: a) iniciador 5': ATGTCGGTGCTGGGCGAG (SEQ ID:NO 15) b) iniciador 3': CTAGAGGCTGGGTCTACAG (SEQ ID:NO 16)

De modo a clonar o segmento codificante de ITAK num vector adequado para expressão em mamifero, por exemplo o plasmideo de expressão pDC304 (sfNCAV, Immunex, Seattle, WA) ou outros plasmideos de expressão bem conhecidos na arte, o fragmento do produto de PCR isolado é ligado num vector que foi cortado com uma enzima de restrição adequada, por exemplo Not 1 no caso de pDC304 e em que as extremidades do local de restrição foram subsequentemente tornadas rombas preenchendo com polimerase de ADN de T4 e dNTP (Sambrook et al., supra) . Alternativamente, os iniciadores podem ser sintetizados com, por exemplo, locais de restrição Not 1 nas suas extremidades 5': 58 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ a) iniciador 5' alt. ATATGCGGCCGCATGTCGGTGCTGGGCGAG (SEQ ID:NO 17) b) iniciador 3' alt.: ATATGCGGCCGCCTAGAGGCTGGGTCTACAG (SEQ ID:NO 18)

Neste caso, o produto de PCR isolado é digerido com NotI e ligado no vector cortado com NotI, sem o passo intermédio de preenchimento de extremidades.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Immunex Corporation (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: QUINASE ACTIVADA POR IL-l/TNF-a

(ITAK) E MÉTODOS PARA PRODUZIR E UTILIZAR A MESMA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 18

(iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÁRIO: Christopher L. Wight, Immunex Corporation (B) RUA: 51 University Street (C) CIDADE: Seattle (D) ESTADO: Washington

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 98101 (v) FORMA DE LEITURA DO COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disguete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão # 1.30 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09 JUN 1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO PARA MANDATÁRIO/AGENTE: (A) NOME: Christopher L. Wight (B) NÚMERO DE REGISTO: 31.680

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 2005-WO

(ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES (A) TELEFONE (206) 587-0430 (B) TELEFAX: (206) 233-0644 59 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 2940 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..2937 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: ATG TCG GTG CTC GGC GAG TAC GAG CGA CAC TGC GAT TCC ATC AAC TCG 48 Het 1 Ser Vai Leu Gly S Glu Tyr Glu Arg His 10 Cys Asp IH Ile Asn 15 Ser GAC TTT GGG AGC GAG TCC GGG GGT TCC GGG GAC TCG AGT CCG GGG CCT 96 ASp Phe Gly Ser 20 Glu Ser Gly Gly Cys 25 Gly Asp Ser Ser Pro 30 Gly Pro AGC GCC AGT CAG GGG CCG CGA GCC GGC GGC GGC GCG GCG GAG CAG GAG 144 Ser Ala Ser 35 Gin Gly Pro Arg Ala 40 Gly Gly Gly Ala Ala 45 Glu Gin GlU GAA CFG CAC TAC ATC CCC ATC CGC GTC CTG GGC CGC GGC GCC TTC GGG 192 Glu Leu 50 His Tyr Ile Pro Ile 55 Arg Vai Leu Gly Arg 60 Gly Ala Phe Gly GAA GCC ACG CTG TAC CGC CGC ACC GAG GAT GAC TCA CTG GTT GTG TGG 240 Glu 65 Ala Thr Leu Tyr Arg 70 Arg Thr Glu Asp Asp 75 Ser Leu Vai Vai Trp 80 AAG GAA GTC GAT TTG ACC CGG CTG TCT GAG AAG GAA CGT CGT GAT GCC 288 Lys Glu Vai Asp Leu 85 Thr Arg Leu Ser Glu 90 Lys Glu Arg Arg Asp 95 Ala -"TC AAT GAG ATA GTT ATT CTG GCA CTG CTG CAG CAC GAC AAC ATT ATT 336 Leu Α3Π Glu Ile 100 vai Ile Leu Ala Leu 105 Leu Gin His Asp Asn 110 Ile Ile GCC TAC TAC AAT GAC TTC ATG GAC AAT ACC ACG CTG CTG ATT GAG CTG 384 Ala Tyr Tyr 115 Aon Hia Phe Met Asp 120 Asn Thr Thr Leu Leu 125 Xle Glu Leu GAA TAT TtíT AAT GGA GGG AAC CTG TAT GAC AAA ATC CTT CGT CAG AAG 432 Glu Tyr 130 Cys Asn Gly Gly Asn 135 Leu Tyr Asp Lys Ile 140 Leu Arg Gin Lys GAC AAG TTG TTT GAG GAA GAG ATG GTG GTG tgg TAC CTA TTT CAG ATT 480 Asp 145 Lys Leu Phe Glu Glu 150 Glu Met Vai Vai Trp 155 Tyr Leu Phe Gin Ile 160 GTT TCA GCA GTG AGC TGC ATC CAT AAA GCT GGA ATC CTT CAT AGA GAT 528 Vai Ser Ala Vai Ser 165 Cys Ile His Lys Ala 170 Gly Ile Leu His Arg 175 Asp ATA AAG ACA TTA AAT ATT TTT CTG ACC AAG GCA AAC CTG ATA AAA CTT 576 11« Lys Thr Leu ISO Asn Ile Phe Leu Thr 185 Lys Ala Asn Leu Ile 190 Lys Leu 60 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ GGA GAT TAT GGC CTA GCA AAG AAA CTT AAT TCT GAG TAT TCC ATG GCT 624 Gly Asp Tyr Gly Leu Ala Lys Lys Leu Asn Ser Glu Tyr Ser Met Ala 195 200 205 GAG ACG CTT GTG GGA ACC CCA TAT TAC ATG TCT CCA GAG CTC TGT CAA 672 Glu Thr Leu Vai Gly Thr Pro Tyr Tyr Met Ser Pro Glu Leu Cys Gin 210 215 220 GGA GTA AAG TAC AAT TTC AAG TCT GAT ATC TGG GCA GTT GGC TGC GTC 720 Gly Vai Lys Tyr Asn Phe Lys Ser Asp Ile Trp Ala Val Gly Cys Val 225 230 235 240 ATT TTT GAA CTG CTT ACC TTA AAG AGG ACG TTT GAT GCT ACA AAC CCA 768 lie Phe Glu Leu Leu Thr Leu Lys Arg Thr Phe ASp Ala Thr Asn Pro 245 250 255 CTT AAC CTG TGT GTG AAG ATC GTG CAA GGA ATT CGG GCC ATG GAA GTT S16 LeU Asm Leu Cys vai Lys Xle val Gin Gly He Arg Ala Met Glu Val 260 265 270 GAC TCT AGC CAG TAC TCT TTG GAA TTG ATC CAA ATG GTT CAT TCG TGC 864 ASp Ser Ser Gin Tyr Ser Leu Glu Leu Ile Gin Met val His Ser Cys 275 280 285 CTT GAC CAG GAT CCT GAG CAG AGA CCT ACT GCA GAT GAA CTT CTA GAT 912 Leu Asp Gin Asp Pro Glu Gin Arg Pro Thr Ala Asp GXu Leu Leu Asp 290 295 300 CGC CCT CTT CTC A< ái AAA CGC AGG AGA GAG ATG GAG GAA AAA GTC ACT 960 Arg Pro Leu Leu Arg Lys Arg Arg Arg Glu Met Glu Glu Lys val Thr T05 310 315 320 CTG CTT AAT GCA α CT ACA AAG AGA CCA AGG TCA AGC ACT GTG ACT GAA 1008 Leu Leu Asn Ala pro Thr Lys Arg Pro Arg Ser Ser Thr Val Thr Glu 325 330 335 GCA ccc ATT GCT GTA GTA ACA TCA CGA ACC AGT GAA GTC TAT GTT TGG 1056 Ala Pro Xle Ala Vai val Thr Ser Arg Thr Ser Glu Val Tyr Val Trp 340 345 350 GGT GGT GGA AAA TCC ACC CCC CAG AAA CTG GAT GTT ATC AAG AGT GGC 1104 Gly Gly Gly Lysi Ser Thr Pro Gin Lys Leu Asp Val Xle Lys Ser Gly 355 360 365 TGT AGT GCC CGG CAG CTC TGT GCA GGG AAT ACC CAC TTT GCT GTG GTC 1152 Cys Ser Ala Arg cln val Cys Ala Gly Asn Thr His Phe Ala Val val 370 375 360 ACA GTG GAG AAG GAA CTG TAC ACT TGG GTG AAC ATG CAA GGA GGC ACT 1200 Thr Vai Glu Lys Glu Leu Tyr Thr Trp Val Asn Met Gin Gly Gly Thr 385 390 395 400 AAA CTC CAT GGT CAG CTG GGC CAT GGA GAC AAA GCC TCC TAT CGA CAG 1248 Lys Leu His Gly Gin Leu Gly His Gly Asp Lys Ala Ser Tyr Arg Gin 405 410 415 CCA AAG CAT GTG GAA AAG TTG CAA GGC AAA GCT ATC CAT CAG GTG TCA 1296 Pro Lys HiS vai Glu Lys Leu Gin Gly Lys Ala Xle His Gin Val Ser 420 425 430 61 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ TGT GGT GAT GAT TTC ACT GTC TGT GTG ACT GAT GAG GGT CAG CTC TAT 1344 Cys Gly Asp ASP Phe Thr vai Cys vai Thr Asp Glu Gly Gin Leu Tyr 435 440 445 GCC TTC GGA TCA GAT TAT TAT GGC TGC ATG GGG GTG GAC AAA GTT GCT 1392 Ala Phe Gly Ser Asp Tyr Tyr Gly Cys Met Gly vai Asp Lys Vai Ale «50 455 460 GGC CCT GAA GTG CTA GAA CCC ATC CAG CTG AAC TTC TTC CTC AGC AAT 1440 Gly Pro Glu Vai Leu Glu Pro Met. Gin Leu Asn Phe Phe Leu Ser Asn 455 470 475 480 CCA GTG GAG CAG GTC TCC TGT GGA GAT AAT CAT GTG GTG GTT CTG ACA 1488 Pro Vai Glu Gin vai Ser Cys Gly Asp Asn His Vai Vai Vai Leu Thr 485 490 495 CGA AAC AAG GAA GTC TAT TCT TGG GGC TGT GGC GAA TAT GGA CGA CTG 1536 Arg Asn Lys Glu Vai Tyr Ser Trp Gly Cys Gly Glu Tyr Gly Arg Leu 500 505 510 GGT TTG GAT TCA GAA GAG GAT TAT TAT ACA CCA CAA AAG GTG GAT GTT 1584 Gly Leu Asp Sor Glu Glu Asp Tyr Tyr Thr Pro Gin Lys Vai Asp Vai SIS 520 52S CCC AAG GCC TTG ATT ATT GTT GCA GTT CAA TGT GGC TGT GAT GGG ACA 1632 Pr o Lys Ala Leu lie He Vai Ala Vai Gin Cys Gly cys ASP Gly Thr 530 535 540 ΤΓΤ CTG TTG ACC CAC TCA GGC AAA GTG CT" GCC TGT GCA CTC AAT GAA 1680 Phe Leu Leu Thr Gin Ser Gly Lys Vai Leu Ala cys Gly Leu Asn Glu 545 550 555 560 TTC AAT AAG CTG GGT CTG AAT CAG TGC ATG TCG GGA ATT ATC AAC CAT 1728 Phe Asn Lys Leu Gly Leu Asn Gin cys Met Ser Gly Ile Ue Asn His 565 570 575 GAA GCA TAC CAT GAA GTT CCC TAC ACA ACG TCC TTT ACC TTG GCC AAA 1776 Glu Ala Tyr His Glu Vai Pro Tyr Thr Thr Ser Phe Thr Leu Ala Lys 580 585 590 CAG TTG TCC TTT TAT AAG ATC CGT ACC ATT lÉiil CCA GGC AAG ACT !§||! 1824 Gin Leu Ser Phe Tyr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Pro Gly Lys Thr His 595 600 605 ACA GCT GCT ATT GAT GAG CGA GGC CGG CTG CTG ACC TTT GGC TGC AAC 1872 Thr Ala Ala Ile Asp Glu Arg Gly Arg Léu Leu Thr Phe Gly Cys Asn 610 615 620 AAG TGT GGG CAG CTG GGC GTT GGG AAC TAC AAG AAG CGT CTG GGA ATC 1920 Ly3 Cys Gly Gin Leu Gly Vai Gly Asn Tyr Lys Lys Arg Leu Gly Ile 625 630 635 640 AAC CTG TTG GGG GGA CCC CTT GGT GGG AAG CAA GTG ATC AGG GTC TCC 1968 Asn Leu Leu Gly Gly Pro Leu Gly Gly Lys Gin Vai Ile Arg Vai Ser 645 650 655 TGC GGT GAT GAG TTT ACC ATT GCT GCC ACT GAT GAT AAT CAC ATT TTT 2016 Cys Gly Asp Glu Phe Thr Ile Ala Ala Thr Asp Asp Asn His Ile Phe 660 665 670 62 ΕΡ 0 914 451 /PT GCC TGG GGC AAT GGT GGT AAT GGC CGC Ala Trp Gly €75 Asn Gly Gly Asn Gly 680 Arg AGA CCA CAT GGC TCT GAT ATC TGT ACC Arg Pro 690 Hle Gly Ser Asp Ile 695 Cys Thr GGA TCT CTG CAT CAT GTC CCG GAC CTG Gly 705 Ser Leu* His Hl3 Vai 710 Pro Asp Leu ATT CTC ATC GTT GAG AAA GTA TTG AAT Ile Leu Ile Vai GlU 725 Lys vai Leu Asn AGC AGT GGC TTA TCC ATT GGA ACT GTG Ser ser Gly Leu 740 Ser Ile Gly Thr Vai 745 GGA GGC GGC GGG GGC GGC GGT GGT GAA Gly Gly Gly 755 Gly Gly Gly Gly Gly 760 Glu TCT GAA ACT CCT GAC CCA AGT GGA GGC Ser Glu 770 Thr Pro Asp Pro Ser 775 Gly Gly GAC CGA GGA ATS GAA GGT TTA ATC AGT Asp 785 Arg Gly Met Glu Gly 790 Leu ile Ser AGT AAT GGG GCC AGC AGC TCC TGT CCT Ser Asn Gly Ala Ser 805 Ser Ser Cys Pro GAA AAT GCA GAA TTT ATC ccc ATG CCT Glu Asn Ala GlU 820 Phe lie Pro Met Pro 825 GCA GCG TTT TCA GAA TCT GAG AAA GAT Ala Ala Phe 835 Ser GlU Ser Glu Lys 840 Asp CAA GCA CTC AAA GTG GCC TCT GAA GCT Gin Gly 850 Leu Lys Vai Ala Ser 855 Glu Ala GTA GAA GCC TCG TCA CCT CGG CTG AAT Vai 865 Glu Ala Ser Ser Pro 870 Arg Leu Asn AAG GGA ACA CCA CTG ACT CCT CCT GCG Lys Gly Thr Pro Leu 885 Thr Pro Pro Ala GTG GAG GTT GAG AGA TTG CAG GGT CTG Vai Glu Vai Glu 300 Arg Leu Gin Gly Leu 305 CTG GCA ATG ACC CCC ACA GAG 2064 Leu Ala Met Thr 685 Pro Thr Glu TCA TGG CCT CGG CCT ATT :f§y 2112 Ser Trp Pro 700 Arg Pro Ile Phe TCT TGC CGT GGA TGG CAT ACC 2160 Ser Cys Arg 715 Gly Trp Hl5 Thr 720 TCT AAG ACC ATC CGT TCC AAT 2208 Ser 730 Lys Thr Xlé Arg ser 735 Asn TTT CAG AGC TCT AGC CCG GGA 2256 Phe Gin Ser Ser Ser 750 Pro Gly GAA GAG GAC AGT CAG CAG GAA 2304 Glu Glu Asp Ser 765 Gin Gin Glu TTC CGA GGA ACA ATG GAA GCA 2352 Phe Arg Gly 780 Thr Met Glu Ala CCC ACA GAG GCC ATG GGG AAC 2400 Pro Thr Glu 795 Ala Met Gly Asn 800 GGC TGG CTT CGA AAG GAG CTG 2448 Gly 810 Trp Leu Arg Lys Glu 835 Leu GAC AGC CCA TCT CCT CTC AGT 2496 Aep Ser Pro Ser pro 830 Leu Ser ACC CTG CCC TAT GAA CAG CTG 2544 Tlir Leu Pro Tyr 845 GlU Glu Leu CCT TTG GAA CAC AAA CCC CAA 2592 Pro Leu Glu 860 Kis Lys Pro Gin CCT GCA GTA ACC TGT GCT GGG 2640 Pro Ala vai 875 Thr Cys Ala Gly 880 TGT GCG TGC AGC TCT CTG CAG 2688 Cys 890 Ala Cys Ser Ser Leu 8S5 Gin GTG TTA AAG TGT CTG GCT GAA 2736 Vai s a ............. Cys Leu 910 Ala Glu 63 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ CAA CAG AAG CTA CAG CAA GAA AAC CTC CAG ATT TTT ACC CAA CTG CAG 2784 Gin Gin Lys 915 Leu Gin Gin Glu Asn 920 Leu Gin Ile Phe Thr Gin 925 Leu Gin AAG TTG AAC AAG AAA: TTA GAA GGA GGG CAG CAG CTG GGG ATG CAT TCC 2832 Lys Leu 930 Asn Lys Lys Leu Glu 935 Gly Gly Gin Gin Vai Gly Het 940 Hls Ser AAA GGA ACT CAG ACA GCA AAG GAA GAG ATG GAA ATG GAT CCA AAG CCT 2860 Lys 945 Gly Thr Gin Thr Ala 950 Lys Glu Glu het Glu 955 Met Asp Pro Pro 960 GAC TTA GAT TCA GAT TCC TGG TGC CTC CFG GGA ACA GAC TCC TGT AGA 2928 Asp Leu Asp Ser Asp 965 Ser Trp Cys Leu Leu 970 Gly Thr Asp Ser Cys 975 Arg CCC AGC CTC TAG 2940

Pro Ser Leu (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 979 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met Ser vai Leu Cly Glu Tyr Glu Arg His Cys Asp Ser Xle Asn Ser 15 10 15

Asp Phe Gly Ser Glu Ser Gly Gly Cys Gly Asp Ser Ser Pro Gly Pro 20 25 30

Ser Ala Ser Gin Gly Pro Arg Ala Gly Gly Gly Ala Ala Glu Gin Glu 35 40 45

Glu Leu Hís Tyr xie Pro Xle Arg Vai Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly 50 55 60

Glu Ala Thr Leu Tyr Arg Arg Thr Glu Asp Asp Ser Leu Vai Vai Trp .......65...!!!!!!......................... .......70l|............. .........^111! .........so

Lys Glu Vai Asp Leu Thr Arg Leu Ser Glu Lys Glu Arg Arg Asp Ala 85 90 95

Leu Asn Glu Xle vai Ile Leu Ala Leu Leu Gin His Asp Asn Xle Ile llllill! i!P:: i^!!!!!!ç::;!!!P : ;i i|!!!i

Ala Tyr Tyr Asn Hls Phe Met Asp Asn Thr Thr Leu Leu He Glu Leu 115 120 125

Glu Tyr Cys Asn Gly Gly Asn Leu Tyr Asp Lys Ile Leu Arg Gin Lys 130 135 140

Asp Lys Leu Phe Glu Glu Glu Met vai Vai Trp Tyr Leu Phe Gin Ile 145 150 155 160 LP 0 914 451 /PT 64 Vai Ser Ala Vai Ser 165 Cys Ile His Lys Ala Gly Ile Leu 170 His Arg Asp 175 Ile Lys Thr Leu 180 Asn lie Phe Leu Thr 185 Lys Ala Asn Leu Ile Lys Leu 190 Gly Asp Tyr 195 Gly Leu Ala Lys Lys 200 Leu Asn Ser Glu Tyr 205 Ser Met Ala Glu Thr 210 Leu Vai Gly Thr Pro 215 Tyr Tyr Met Ser pro Glu 220 Leu Cys Gin Gly 225 Vai Lys Tyr Asn Phe 230 Lys Ser Asp Ile Trp Ala Val 235 Gly Cys Val 240 Ile Phe Glu Leu Leu 245 Thr Leu Lys Arg Thr Phe Asp Ala 250 Thr Asn Pro 255 Leu Asn Leu Cys 260 Vai Lys Ile Vai Gin 265 Gly Ile Arg Ala Met Glu Val 270 Asp Ser Ser 275 Gin Tyr Ser Leu Glu 280 Leu Ile Gin Met Val .285 His Ser Cys Leu Asp 230 Gin Asp Pro Glu Gin 295 Arg Pro Thr Ala Asp Glu Leu Leu Asp Arg 305 Pro Leu Leu Arg Lys 310 Arg Arg Arg Glu Met Glu Glu 315 Lys Val Thr 320 Leu Leu Asn Ala Pro 325 Thr Lys Arg Pro Arg Ser Ser Thr 330 Val Thr Glu 335 Ala Pro ile Ala 340 Vai Vai Thr Ser Arg 345 Thr Ser Glu Val Tyr Val Trp 350 Gly Gly Gly 355 Lys Ser Thr Pro Gin 360 Lys Leu Asp Val lie Lys Ser Gly 365 Cys Ser 370 Ala Arg Gin Vai Cys 375 Ala Gly Asn Thr His Phe 380 Ala val val Thr 385 Vai Glu Lys Glu Leu 390 Tyr Thr Trp Val Asn Met Gin Gly Gly Thr 395 400 Lys Leu HlS Gly Gin 405 Leu Gly His Gly Asp Lys Alâ Ser 410 Tyr Arg Gin 415 Pro Lys His Vai 420 Glu Lys Leu Gin Gly 425 Lys Ala Ile His Gin val Ser 430 ,,,, Cys Gly Asp 435 Asp Phe Thr Vai Cys 440 val Thr Asp Glu Gly Gin Leu Tyr 445 Ala Phe 450 Gly Ser Asp Tyr Tyr 455 Gly Cys Met Gly Val Asp 460 Lys Val Ala Gly 465 Pro Glu Vai Leu Glu 47!) Pro Met Gin Leu Asn Phe Phe 475 Leu Ser Asn 480 65 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ

Pro Val Glu Gin Vai 485 Ser cys Gly Asp Asn 490 His Val Val Val Leu 495 Thr Arg Asn Lys Glu 500 val Tyr Ser Trp Gly 505 Cys Gly Glu Tyr Gly 510 Arg Leu Gly Leu Asp 515 Ser Glu Glu Asp Tyr 520 Tyr Thr Pro Gin Lys 525 Val Asp val Pro Lys 530 Ala Leu He Ile Val 535 Ala val Gin cys Gly 540 Cys Asp Gly Thr Phe 545 Leu Leu Thr Gin ser Gly 550 Lys val Leu Ala 555 Cys Gly Leu Asn Glu 560 Phe Asn Lys Leu Gly 565 Leu Asn Gin Cys het 570 Ser Gly Ile Ile Asn 575 Bis Glu Ala Tyr ::ii§ 680 GlU Val Pro Tyr Thr 585 Thr Ser Phe Thr Leu 590 Ala Lys Gin Leu Ser 595 Phe Tyr Lys Ile ΙϊϊίΡ 600 Thr Ile Ala Pro Gly 605 Lys Thr Kis Thr Ala 610 Ala Ile ASP Glu Arg 615 Gly Arg Leu Leu Thr 620 Phe Gly cys Asn Lys 635 Cys Gly Gin Leu Gly Val 630 Gly Asn Tyr Lys 635 Lys Arg Leu Gly Ile 640 Asn Leu Leu Gly Gly 645 Pro Leu Gly Gly Lys Gin 650 Val He Arg Val 655 Ser Cys Gly Asp Glu 660 Phe Thr Ile Ala Ala 665 Thr Asp Asp Asn His 670 Ile Phe Ale Trp Gly Asn 675 Gly Gly Asn Gly 680 Arg Leu Ala Met Thr 685 Pro Thr Glu Arg Pro 690 His Gly Ser Asp He 695 Cys Thr ser Trp Pro 700 Arg Pro Zle Phe Gly 705 Ser Leu His His Val Pro 710 Asp Leu Ser Cys 715 Arg Gly Trp His Thr 720 Ile Leu Ile Vai Glu 725 Lys Val Leu Asn Ser 730 Lys Thr Hii%. Arg Ser 735 Asn Ser Ser Gly Leu 740 Ser He Gly Thr Val 745 Phe Gin Ser Ser Ser 750 Pro Gly Gly Gly Gly Gly 755 Gly Gly Gly Gly Glu 760 Glu Glu Asp Ser 765 Gin Gin Glu Ser Glu 770 Thr Pro Asp Pro Ser 775 Gly Gly Phe Arg Gly 780 Thr Met Glu Ala Asp Arg 785 Gly Het Glu Gly Leu 790 Ile Ser Pro Thr 795 Glu Ala Met Gly Asn 800 Ser Asn Gly Ala Ser Ser Ser Cys Pro Gly Trp Leu Arg Lys Glu Leu 805 810 815 EP 0 914 451 /PT 66 Glu Asn Ala Glu Phe Xle Pro Met Pro Asp ser Pro Ser Pro Leu Ser 820 825 830 Ala Ala Phe Ser Glu Ser Glu Lys Asp Thr Leu Pro xyx GlU Glu Leu 835 840 845 Gin Gly Leu Lys vai Alâ Ser Glu Ala Pro Leu Glu HiS Lys Pro Gin 850 855 860 Vai Glu Ala Ser Ser Pro Arg Leu Asn Pro Ala Vai Thr Cys Ala Gly 865 870 875 880 Lys Gly Thr Pro Leu Thr Pro Pro Ala Cys Ala Cys Ser Ser Leu 01 n 885 890 895 Vai Glu Vai Glu Arg Leu Gin Gly Leu Vai Leu Lys Cys Leu Ala Glu 900 905 910 Gin Gin Lys Leu Gin Gin Glu Asn Leu Gin Xle Phe Thr Gin Leu Gin 915 920 925 Lys Leu Asn Lys Lys Leu Glu Gly Gly Gin Gin Vai Gly Met His Ser 930 935 940 Lys Gly Thr Gin Thr Ala Lys Glu Glu Met Glu Met Asp Pro Lys Pro 945 950 955 960 Asp Leu Asp Ser Asp Ser Trp cys Leu Leu Gly Thr Asp Ser cys Arg 965 970 975

Pro Ser Leu (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO 3:

Arg Arg Arg His Leu Pro Pro Leu leu Leu Gin Ser Trp Met Bis Gin 15 10 15

Pro His Gin (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 67 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Gly Ala Phe Gly Glu Ala Thr Leu Tyr Arg 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Vai Thr Leu Leu Asn Ala Fro Thr Lys 1 S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Ser Ser Thr Vai Thr Glu Ala Fro Xle Ala Vai Vai Thr Ser Arg 1 5 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

Leu Gly Leu Asp Ser Glu Glu Asp Tyr Tyr Thr Pro Gin Lys Vai Asp 15 10 15

Vai Fro Lys 68 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 3264 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: TCTTCGCGGG GTTGCTGGGC TGACCCATCC GOGGGCCCGC ATCTGAAGCG AGCGGGACGC 60 AGCGCGGCCA GGGCCTCCGG GCATACGCAG GCTGGTCCCC AAGGCCCGCG GCCGCCGCCA 120 TGTCGGTGCT GGGCGAGTAC GAGCGACACT GCGATTCCAT CAACTCGGAC TTTGGGAGCG 180 AGTCCGGGGG TTGCGGGGAC TCGAGTCCGG GGCCTAGCGC CAGTCAGGGG CCGCCAGOCG 240 OCGGCGGCGC GGCGGAGCAG GAGGAACTGC ACTACATCCC CATCCGCGTC CHSÍSGCCGCGi 300 GCGCCTTCGG GGAAGCCACC CTGTACC3CC GCACCGAGGA TGACTCACTG CTTGTGTOSA 360 AGGAAGTCGA TTTGACCCGG CTGTCTGAGA AGGAACGTOG TGAfGCCTTG AATGAGATAG 420 TTATTCTGôC ACTGCTGCAG CACGACAACA TTATTGCCTA CTACAATCAC rrCATGGACA 480 ATACCACGCT GCTGATTGAG CTGGAATATT GTAATGGAGG GAACCTGTAT GACAAAATCC mMmm TTCGTCAGAA GGACAAGTTC TTTGAGGAAG AGATGGTGGT ÔTGGTACCT& 2TTCACATTG 600 TTTCAOCAGT GAGCTGCATC CATAAAGCTG GAATCCTTCA TAGAGATATA AAGACATTAA 660 ATATTTTTCT GACCAAGGCA AACCTGATAA AACTTGGAGA TTPATGGCCTA GCAAAGAAAC 720 TTAATTCTGA GTATTCCATC GCTGAGACGC TTGTGGGAAC CCCATATTAC ATCJTCTCCAG 780 AGCTCTG7CA AGGAGTAAAG TACAATTTCA AGTCTGATAT CTGGGCAGTY GGCTGCGTCA 040 ΊΤΤΤΓΟΑΑΟΤ GcrTACcrrA AAGAGGACGT TTGATGCTAC AAACCCACTT AACCTGTGTG 900 TGAAGATCGT GCAAGGAATT CGGGCCATX3G AAGTTGACTC TAGCCAGTAC TCTTrOGAAT 960 TGATCCAAAT GGTTCATTCG TGCCTTGACC AGOATCCTGA GCAGAGACCT ACTGCAGATG 1020 AACTTCTAGA TCGCCCTCTT CTCAGGAAAC GCAGGAGAGA GATGGAGGAA AAAGXCACTC 1080 TGCTTAATGC ACCTACAAAG AGACCAAGGT CAAGCACTGT GACK3AAGCA CCCATTGCTG 1140 TAGTAACATC ACGAACCAGT GAAGTCTATG TTTGGGGIGG TGGAAAATCC ACCCCCCAGA 1200 AACTGGATGT TATCAAGAGT GGCTtSTAGTG CCCGGCAGGT CTGK5CA£3GG AATACOCACT 1260 TTGCTGTGGT CACAGTGGAG AAGGAACTGT ACACTTOGGT GAACATGCAA GGAGGCACTA 1320 AACTCCATGG TCAGOTGGGC CATGGAGACA AAGCeTCCTA TCGACAGCCA AAGCATGTGG 1380 AAAAGTTGCA AGGCAAAGCT ATCCATCAGG TGTCATGTGG TGATGATTTC ACTGTCTGTG 1440 TGACTGATGA GGGTCAGCTC TATGCCTTCO GATCAGATTA TTATGGCTGC hTGGGGGTOG 1500 ACAAAGTTGC TGGCCCTGAA OFGCTASAAC CCATGCAGCT GAACTTCTTC CTCAGCAATC 1560 CAGTGGAGCA GGTCTCCTGT GGAGATAATC ATGTGGTGGT TCTGACACGA AACAACGAAG 1620 TCTATTCTTG GGGCrCTGGC GAATATGGAC GACTGGGm* GGATTCAGAA GAGGATTATT 1680 69 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ ATACACCACA AAAGGTGGAT GTTCCCAAGG 0 1 > g > >4 TGTTGCAGTT CAATGTGGCT 1740 GTOATGGGAC ATrrcTGTTG ACCCAGTCAG GCAAAGTGCT GGCCTGTGGA CTCAATGAAT 1800 TCAATAAGOT GGGTCTGAAT CAGKSCATGT CGGGAATTAT CAACCATGAA GCATACCATG 1860 AAGTTCCCTA CACAACGTCC TTTACCTTGG CCAAACAGTT GTCCTTTTAT AAGATCCGTA 1920 CCATTGCCCC AGGCAAGACT CACACAGCTG CTATTGATGA GCGAGGCCGG CTGCTGACCT 1980 TOGGCTGCAA CAAGTGTGGG CAGCTGGGCG TTGGGAACTA CAAGAAGCGT CTGGGAATCA 2040 ACCTGTTGGG GGGACCCCTT GGTGGGAAGC AAGTGATCAG GGTCTCCTGC GGTGATGAGT 2100 1 1 TGCCACTGAT GATAATCACA TTTTTGCCTG GGGCAATGGT GGTAATGGCC 2160 GCCTGGCAAT GACCCCCACA GAGAGACCAC ATGGCTCTGA TATCTGTACC TCATN3GCCTC 2220 GGCCTATTTT TGGATCTCTG CATCATGTCC CGGACCTGTC TTGCCGTGGA TGGCATACCA 2280 TTCTCATCGT TGAGAAAGTA TTGAATTCTA AGACCATCCG TTCCAATAGC AGTGGCTTAT 2340 CCATTGGAAC TGTGTTTCA6 AGCTCTAGCC CGGGAGGAGG CGGCGGGGGC GGCGGTGGTG 2400 aagaagagga CAGTCAÇJCAG GAATCTÇAAA CTCCTGACCC AAGTGGAGGC TTCCGAGGAA 2460 CAATGGAAGC AGACCGAGGA ATGGAAGGTT TAATCAGTCC CACAGAGGCC ATGGGGAACA 2520 GTAATGGGGC CAGCAGCTCC TGTCCTGGCT GGCTTCGAAA GGAGCTGGAA AATGCAGAAT 2580 rTATCCCCAT GCCTGACAGC CCATCTCCTC TCAGTGCAGC GTTTTCAGAA TCTGAGAAAG 2640 ATACCCTGCC CTATGAAGAG CTGCAAGGAC TCAAAGTGGC CTCTGAAGCT CCTTTCGAAC 2700 ACAAACCCCA AGTAGAAGCC TCGTCACCTC GGCTGAATCC TGCAGTAACC TGTGCTGGGA 2760 AGGGAACACC ACTGACTCCT CCTGCGTGTG CGTGCAGCTC TCTGCAGGTG GAGGTTGAGA 2820 GATTGCAGGG TCTGGTGTTA AAGTGTCTGG CTGAACAACA GAAGCTACAG CAAGAAAACC 2880 TCCAGATTTT TACCCAACTG CAGAAGTTGA ACAAGAAATT AGAAGGAGGG CAGCAGGTGG 2940 GGATGCATTC CAAAGGAACT CAGACAGCAA AGGAAGAGAT GGAAATGGAT CCAAAGCCTG 3000 ACTCAGATTC AGATTCCTGG TGCCTCCTGG GAACAGACTC CTGTAGACCC AGCCTCTAGT 3060 CTCCTGAGCC TATAGAGCCC CCAGGAGACT GGGACCCAAA GAACTTCACA GCACACTTAC 3120 CGAATGCAGA OAGCAGCTTT CCTGGCTTTG TTCACTTGCA GAAAAGGAGC GCAAGGCAGA 3180 GGCTCTGAAG CACTTTCCTT GTACATTTGG AGAGTGGCAT -TGCCTTTTAG ATAGGATTAG 3240 GCCGGATATT TTGCTTTTTA CCCT 3264 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 70 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: CCATGGCTGA GACGCTTG 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10 GTCGTCCATA TTCGCCACAG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11 CAACCAGTGA GTCATCCTC 19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12 CAACCATGAA GCATACCATG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13 30

CGAGCTGCTC TATAGACTGC TGGGTAGTCC 71 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14 TAACAGAGGT GGCTTATGAG TATTTCTTCC 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15 ATGTCGGTGC TGGGCGAG 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16 CTAGAGGCTG GGTCTACAG 19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17 30

ATATGCGGCC GCATGTCGGT GCTGGGCGAG 72 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18 ATATGCGGCC GCCTAGAGGC TGGGTCTACA G 31

Lisboa

Claims (24)

1. ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência seleccionada do grupo constituído por (a) a sequência de nucleótidos em SEQ ID NO: 1, desde o nucleótido número 1 ao nucleótido número 2940, ou uma sequência complementar a esta; (b) moléculas de ácido nucleico capazes de hibridar com uma molécula de ácido nucleico de (a) sob condições de rigor moderado e que codificam para um polipéptido que é capaz de fosforilar um substrato de β-caseína; e (c) moléculas de ácido nucleico que são degeneradas, como resultado do código genético, em relação às moléculas de ácido nucleico de (a) ou (b) .
2. 2. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica para um polipéptido, em que o referido polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 2 e em que o referido polipéptido é capaz de fosforilar um substrato de β-caseína.
3. 3. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 2, em que a referida molécula codifica para um polipéptido com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, desde o aminoácido número 1 ao aminoácido número 979.
4. 4. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a referida molécula codifica para um polipéptido humano que ocorre naturalmente.
5. 5. Vector recombinante, compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4.
6. 6. Vector de expressão recombinante, compreendendo um promotor ligado operativamente a uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4.
7. 7. Célula hospedeira contendo um vector de acordo com a reivindicação 5 ou 6. ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 2/4
8. 8. Polipéptido isolado codificado por uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4.
9. 9. Polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 8 compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO:2, em que o referido polipéptido é capaz de fosforilar um substrato de β-caseina.
10. 10. Polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 8 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido número 1 ao aminoácido número 979.
11. 11. Método de pesquisa de um agente que modula a actividade de quinase de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, compreendendo: a) contactar um agente candidato com um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 sob condições e durante um tempo suficientes para permitir que o agente candidato module a actividade de quinase do polipéptido; e b) medir a capacidade do agente candidato modular a actividade de quinase do polipéptido.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11 compreendendo ainda isolar o agente candidato.
13. 13. Método para detectar a actividade de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 compreendendo: a) contactar um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 com uma sequência aceitadora de péptido substrato de fosforilação que não é β-caseina de mamífero, na presença de ATP sob condições e durante um tempo suficientes para permitir a transferência de um grupo γ-fosfato de um dador de ATP para a sequência aceitadora de péptido substrato de fosforilação; e b) medir a incorporação de fosfato pela sequência aceitadora de péptido substrato de fosforilação. ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 3/4
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a sequência aceitadora de péptido substrato de fosforilação compreende a sequência de aminoácidos: Arg-Arg-Arg-His-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln (SEQ ID:NO 3).
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que o ATP é γ- (32P) -ATP .
16. 16. Sequência aceitadora de péptido substrato de fosforilação que não é β-caseína de mamífero, compreendendo a sequência de aminoácidos: Arg-Arg-Arg-His-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln (SEQ ID NO: 3).
17. 17. Método para identificar produtos de genes que se associam com um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, compreendendo: a) introduzir sequências de ácido nucleico que codificam para um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 num primeiro vector de expressão, de modo que o polipéptido é expresso como parte de uma proteína de fusão compreendendo uma primeira porção funcionalmente incompleta de uma proteína que é essencial para a viabilidade de uma célula hospedeira; b) introduzir sequências de ácido nucleico que codificam para uma pluralidade de produtos de genes candidatos num segundo vector de expressão de modo que quaisquer produtos de genes candidatos são expressos como parte de uma proteína de fusão compreendendo uma segunda porção funcionalmente incompleta da proteína que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira; c) introduzir o primeiro e segundo vectores de expressão numa célula hospedeira sob condições e durante um tempo suficiente de modo que a sobrevivência da célula hospedeira é dependente de reconstituição de ambas a primeira e a segunda porções funcionalmente incompletas numa proteína funcionalmente completa; e d) identificar células hospedeiras sobreviventes e, a partir daí, determinar as sequências de ácido nucleico que codificam para produtos de genes candidatos que se associam com o ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 4/4 polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 .
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira de levedura.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a levedura é a estirpe de levedura Y190.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que a proteína que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira é o factor de transcrição de levedura modular GAL4.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que a primeira porção funcionalmente incompleta de uma proteína que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira compreende os 147 aminoácidos de N-terminais do factor de transcrição de levedura modular GAL4.
22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, em que a segunda porção funcionalmente incompleta de uma proteína que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira compreende os 114 aminoácidos C-terminais do factor de transcrição de levedura modular GAL4.
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20 em que a primeira porção funcionalmente incompleta de uma proteína que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira compreende o domínio de ligação ao ADN de um factor de transcrição modular.
24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23 em que a segunda porção funcionalmente incompleta de uma proteína que é essencial para a viabilidade da célula hospedeira compreende um domínio de activação da transcrição de um factor de transcrição modular. Lisboa, ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 1/6 FIGURA 1Α TCTTCGCGGG 6TTGCTGGGC TGACGGATCC GCGGGCCGGC ATCTGAAGCG AGCGGGACGC 60 AGCGCGGCCA GGGCCTCCGG GCAXACGCAG GCTGGTCCCC AAGGCCGGCG GCCGCCGCC 119 ATG TCG GTG CTG GGC GAG TAC GAG CGA CAC TGC GAT TCC ATC AAC TCG 167 Met Ser Vai Leu Gly Glu Tyr Glu Arg His Cys Asp Ser Ile Asn Ser 1 5 10 15 GAC TTT GGG AGC GAG TCC GGG GGT TGC GGG GAC TCG AGT CCG GGG CCT 215 Asp Phe Gly Ser Glu Ser Gly Gly Cys Gly Asp Ser Ser Pro Gly Pro 20 25 30 AGC GCC AGT CAG GGG CCG CGA GCC GGC GGC GGC GCG GCG GAG CAG GAG 263 Ser Ala Ser Gin Gly Pro Arg Ala Gly Gly Gly Ala Ala Glu Gin Glu 35 40 45 GAA CTG CAC TAC ATC CCC ATC CGC GTC CTG GGC CGC GGC GCC TTC GGG 311 GlU Leu His Tyr Ile Pro Ile Arg Vai Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly 50 55 50 GAA GCC ACG CTG TAC CGC CGC ACC GAG GAT GAC TCA CTG GTT GTG TGG 3S9 Glu Ala Thr Leu Tyr Arg Arg Thr Glu Asp Asp Ser Leu Vai Vai Trp €5 70 75 80 AAG GAA GTC GAT TTG ACC CCG CTG TCT GAG AAG GAA CGT CGT GAT GCC 407 Lys Glu Vai Asp Leu Thr Arg Leu Ser Glu Lys Glu Arg Arg Asp Ala 85 90 95 TTG AAT GAG ATA GTT ATT CTG GCA CTG CTG CAG CAC GAC AAC ATT ATT 455 Leu Asn Glu Ile Vai Ile Leu Ala Leu Leu Gin His Asp Asn Ile Ile 100 105 110 GCC TAC TAC AAT CAC TTC ATG GAC AAT ACC ACG CTG CTG ATT GAG CTG 503 Ala Tyr Tyx Asn His Phe Met Asp Asn Thr Thr Leu Leu Ile Glu Leu 115 120 125 GAA TAT TGT AAT GGA GGG AAC CTG TAT GAC AAA ATC CTT CGT CAG AAG 551 Glu Tyr Cys Asn Gly Gly Asn Leu Tyr Asp Lys Ile Leu Arg Gin Lys 130 135 140 GAC AAG TTG TTT GAG GAA GAG ATG GTG GTG TGG TAC CTA TTT CAG ATT 599 Asp Lys Leu Phe Glu Glu Glu Met Vai Vai Trp Tyr Leu Phe Gin Ile 145 150 155 160 GTT TCA GCA GTG AGC TGC ATC CAT AAA GCT GGA ATC CTT CAT' AGA GAT 647 Vai Ser Ala Vai Ser Cys Ile His Lys Ala Gly Ile Leu His Arg Asp 155 170 175 695 695 EP 0 914 451 /PT ATA AAG ACA TTA AAT ATT TTT CTG 11 e Lys Thr Leu Asn Ile Phe Leu 180 GGA GAT TAT GGC CTA GCA AAG AAA Gly Asp Tyr Gly Leu Ala Lys Lys 195 200 GAG ACG CTT GTG GGA ACC CCA TAT Glu Thr Leu Vai Gly Thr Pro Tyr 210 215 GGA GTA AAG TAC AAT TTC AAG TCT Gly Vai Lys Tyr Asn Phe Lys Ser 225 230 ATT TTT GAA CTG CTT ACC TTA AAG Xle Phe Glu Leu Leu Thr Leu Lys 245 CTT AAC CTG TGT GTG AAG ATC GTG Leu Asn Leu Cys Vai Lys Xle Vai 260 GAC TCT AGC CAG TAC TCT TTG GAA Asp Ser Ser Gin Tyr Ser Leu Glu 275 280 CTT GAC CAG GAT CCT GAG CAG AGA Leu Asp Gin Asp Pro Glu Gin Arg 290 295 CGC CCT CTT CTC AGG AAA CGC AGG Arg Pro Leu Leu Arg Lys Arg Axg 305 310 CTG CTT AAT GCA CCT ACA AAG AGA Leu Leu Asn Ala Pro Thr Lys Arg 325 GCA CCC ATT GCT GTA GTA ACA TCA Ala Pro Ile Ala Vai Vai Thr Ser 340 GGT GGT GGA AAA TCC ACC CCC CAG Gly Gly Gly Lys Ser AtiA pro 355 360 2/6 FIGURA 1B ACC AAG GCA AAC CTG ATA AAA CTT Thr Lys Ala Asn Leu Ile Lys Leu 185 190 CTT AAT TCT GAG TAT TCC ATG GCT Leu Asn Ser Glu Tyr Ser Met Ala 205 TAC ATG TCT CCA GAG CTC TGT CAA Tyr Met Ser Pro Glu Leu cys Gin 220 GAT ATC TGG GCA GTT GGC TGC GTC Asp Xle Trp Ala Val Gly Cys Val 23S 240 AGG ACG TTT GAT GCT ACA AAC CCA Arg Thr Phe Asp Ala Thr Asn Pro 250 255 CAA GGA ATT CGG GCC ATG GAA GTT Gin Gly Xle Arg Ala Met Glu Val 265 270 TTG ATC CAA ATG GTT CAT TCG TGC Leu Ile Gin Mec Val His Ser Cys 285 CCT ACT GCA GAT GAA CTT CTA GAT Pro Thr Ala Asp Glu Leu Leu Asp 300 AGA GAG ATG GAG GAA AAA GTC ACT Arg Glu Met Glu Glu Lys Val Thr 315 320 CCA AGG TCA AGC ACT GTG ACT GAA Pro Arg Ser Ser Thr Val Thr Glu 330 335 CGA ACC AGT GAA GTC TAT GTT TGG Arg Thr Ser Glu Val Tyr Val Trp 345 350 AAA CTG GAT GTT ATC AAG AGT GGC Lys Leu Asp val Ile T.ve — Ser Gly 365 743 791 839 887 935 983 1031 1079 1127 1175 1223 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 3/6 FIGURA 1C TGT AGT GCC CGG CAG GTC TGT GCA GGG AAT ACC CAC TTT GCT GTG GTC 1271 Cys Ser Ala Arg Gin Val cys Ala Gly Asn Thr His Phe Ala Val val 370 375 380 ACA GTG GAG AAG GAA CTG TAC ACT TGG GTG AAC ATG CAA GGA GGC ACT 1319 Thr Vai Glu Lys Glu Leu Tyr Thr Trp Val Asn MeC Gin Gly Gly Thr 385 390 395 400 AAA CTC CAT GGT CAG CTG GGC CAT GGA GAC AAA GCC TCC TAT CGA CAG 1367 Lys Leu Bis Gly Gin Leu Gly Bis Gly Asp Lys Ala Ser Tyr Arg Gin 405 410 415 CCA AAG CAT GTG GAA AAG TTG CAA GGC AAA GCT ATC CAT CAG GTG TCA 1415 Pro Lys His Vai Glu Lys Leu Gin Gly Lys Ala Ile Bis Gin Val Ser 420 425 430 TGT GGT GAT GAT TTC ACT GTC TGT GTG ACT GAT GAG GGT CAG CTC TAT 1463 Cys Gly Asp Asp Phe Thr Val Cys Val Thr Asp Glu Gly Gin Leu Tyr 435 440 445 GCC TTC GGA TCA GAT TAT TAT GGC TGC ATG GGG GTG GAC AAA GTT GCT 1511 Ala Phe Gly Ser Asp Tyr Tyr Gly Cys Mec Gly Val Asp Lys Val Ala 450 455 460 GGC CCT GAA GTG CTA GAA CCC ATG CAG CTG AAC TTC TTC CTC ASC AAT 1559 Gly Pro Glu vai Leu Glu Pro Met Gin Leu Asn Phe Phe Leu Ser Asn 465 470 475 480 CCA GTG GAG CAG GTC TCC TGT GGA GAT AAT CAT GTG GTG GTT CTG ACA 1607 Pro Vai Glu Gin val Ser Cys Gly ASp Asn His Val Val Val Leu Thr 485 490 495 CGA AAC AAG GAA GTC TAT TCT TGG GGC TGT GGC GAA TAT GGA CGA CTG 1655 Arg Asa Lys Glu val Tyr Ser Trp Gly Cys Gly Glu Tyr Gly Arg Leu 500 505 510 GGT TTG GAT TCA GAA GAG GAT TAT TAT ACA CCA CAA AAG GTG GAT GTT 1703 Gly Leu Asp Ser Glu GlU Asp Tyr Tyr Thr Pro Gin Lys Val Asp Val 515 520 52S CCC AAG GCC TTG ATT ATT GTT GCA GTT CAA TGT GGC TGT GAT GGG ACA 1751 Pro Lys Ala Leu Ile lie Val Ala Val Gin Cys Gly Cys Asp Gly Thr 530 535 540 TTT CTG TTG ACC CAG TCA GGC AAA GTG CTG GCC TGT GGA CTC AAT GAA 1799 Phe Leu Leu Thr Gin Ser Gly Lys Val Leu Ala Cys Gly Leu Asn ι*·1 .. V2AU 545 550 555 560 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 4/6 FIGURA 1D TTC AAT AAG CTG GGT CTG AAT CAG TGC ATG TCG GGA ATT ATC AAC CAT 1847 Phe Asn Lys Leu Gly Leu Asn Gin Cys Met Ser Gly Ile Ile Asn His 565 570 575 GAA GCA TAC CAT GAA GTT CCC TAC ACA ACG TCC TTT ACC TTG GCC AAA 1895 Glu Ala Tyr Bis Glu Vai Pro Tyr Thr Thr Ser Phe Thr Leu Ala Lys 580 58S 590 CAG TTG TCC TTT TAT AAG ATC CGT ACC ATT GCC CCA GGC AAG ACT CAC 1943 Gin Leu Ser Phe Tyr Lys Ile Arg Thr Ile Ala Pro Gly Lys Thr His 595 600 605 ACA GCT GCT ATT GAT GAG CGA GGC GGG CTG CTG ACC TTT GGC TGC AAC 1991 Thr Ala Ala Ile Asp Glu Arg Gly Arg Leu Leu Thr Phe Gly Cys Asn 610 615 620 AAG TGT SGG CAG CTG GGC GTT GGG AAC TAC AAG AAG CGT CTG GGA ATC 2039 Lys Cys Gly Gin Leu Gly Vai Gly Asn Tyr Lys Lys Arg Leu Gly ile 625 630 635 640 AAC CTG TTG GGG GGA CCC CTT GGT GGG AAG CAA GTG ATC AGG GTC TCC 2087 Asn Leu Leu Gly Gly Pro Leu Gly Gly Lys Gin Vai Ile Arg Vai Ser 645 650 655 TGC GGT GAT GAG TTT ACC ATT GCT GCC ACT GAT GAT AAT CAC ATT TTT 2135 Cys Gly Asp Glu Phe Thr Ile Ala Ala Thr Asp Asp Asn His Ile Phe 660 665 670 GCC TGG GGC AAT GGT GGT AAT GGC CGC CTG GCA ATG ACC CCC ACA GAG 2183 Ala Trp Gly Asn Gly Gly Asn Gly Arg Leu Ala Met Thr Pro Thr Glu 675 680 685 AGA CCA CAT GGC TCT GAT ATC TGT ACC TCA TGG CCT CGG CCT ATT TTT 2231 Arg Pro His Gly Ser Asp Ile Cys Tbr Ser Trp Pro Arg Pro Ile Phe 690 695 700 GGA TCT CTG CAT CAT GTC CCG GAC CTG TCT TGC CGT GGA TGG CAT ACC .2279 Gly Ser Leu HiS HiS Vai Pro Asp Leu Ser Cys Arg Gly Trp Bis Thr 705 710 715 720 ATT CTC ATC GTT GAG AAA GTA TTG AAT TCT AAG ACC ATC CGT TCC AAT 2327 Ile Leu Ile Vai Glu Lys Vai Leu Asn Ser Lys Thr Ile Arg Ser Asn 725 730 735 AGC AGT GGC TTA TCC ATT GGA ACT GTG TTT CAG AGC TCT AGC CCG GGA 2375 Ser Ser Gly Leu Ser Ile Gly Thr Vai Phe Gin Ser Ser Ser Pro Gly 740 745 7S0 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 5/6 FIGURA 1Ε GGA GGC GGC GGG GGC GGC GGT GGT GAA GAA GAG GAC AGT CAG CAG GAA Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu GlU Glu Asp Ser Gin Gin Glu 755 760 765 TCT GAA ACT CCT GAC CCA AGT GGA GGC TTC CGA GGA ACA ATG GAA GCA Ser Glu Thr Pro Asp Pro Ser Gly Gly Phe Arg Gly Thr Met Glu Ala 770 775 780 GAC CGA GGA ATG GAA GGT TTA ATC AGT CCC ACA GAG GCC ATG GGG AAC ASp Arg Gly Met Glu Gly Leu Ile Ser Pro Thr Glu Ala Met Gly Asn 785 790 795 800 AGT AAT GGG GCC AGC AGC TCC TGT CCT GGC TGG crr CGA AAG GAG CTG Ser Asn Gly Ala Ser Ser Ser Cys Pro Gly Trp Leu Arg Lys Glu Leu 805 810 815 GAA AAT GCA GAA TTT ATC CCC ATG CCT GAC AGC CCA TCT CCT CTC AGT Glu Asn Ala Glu Phe Ile Pro Met Pro Asp Ser Pro Ser Pro Leu Ser B20 825 830 GCA GCG TTT TCA GAA TCT GAG AAA GAT ACC CTG CCC TAT GAA GAG CTG Ala Ala Phe Ser Glu Ser Glu Lys Asp Thr Leu Pro Tyr Glu Glu Leu 835 840 845 CAA GGA CTC AAA GTG GCC TCT GAA GCT CCT TTG GAA CAC AAA CCC CAA Gin Gly Leu Lys Vai Ala Ser Glu Ala Pro Leu Glu His Lys Pro Gin 850 855 860 GTA GAA GCC TCG TCA CCT CGG CTG AAT CCT GCA GTA ACC TGT GCT GGG Vai Glu Ala Ser Ser Pro Arg Leu Asn Pro Ala Vai Thr Cys Ala Gly 865 870 875 880 AAG GGA ACA CCA CTG ACT CCT CCT GCG TGT GCG TGC AGC TCT CTG CAG Lys Gly Thr Pro Leu Thr Pro Pro Ala Cys Ala Cys Ser Ser Leu Gin 885 890 855 GTG GAG GTT GAG AGA TTG CAG GGT CTG GTG TTA AAG TGT CTG GCT GAA Vai Glu Vai Glu Arg Leu Gin Gly Leu Vai Leu Lys Cys Leu Ala Glu 900 905 910 CAA CAG AAG CTA CAG CAA GAA AAC CTC CAG ATT TTT ACC CAA CTG CAG Gin Gin Lys Leu Gin Gin Glu Asn Leu Gin Ile Phe Thr Gin Leu Gin 915 520 925 AAG TTG AAC AAG AAA TTA GAA GGA GGG CAG CAG GTG GGG ATG CAT TCC Lys Leu Asn Lys Lvs Leu Glu Gly Gly Gin Gin Vai Rlv ”· J Met His Ser 930 935 940 2423 2471 2519 2567 2615 2663 2711 2759 2807 2855 2903 2951 ΕΡ Ο 914 451 /ΡΤ 6/6 FIGURA 1F ΑΑΑ GGA ACT CAG ACA GCA AAG GAA GAG AXG GAA ATG GAT CCA AAG CCT 2999 Lys Gly Thr Gin Thr Ala Lys Glu Glu Met Glu Met Asp Pro Lys Pro 945 950 955 960 GAC TTA GAT TCA GAT TCC TGG TGC CTC CTG GGA ACA GAC TCC TGT AGA 3047 Asp Leu Asp Ser Asp Ser Trp Cys Leu Leu Gly Thr Asp Ser Cys Arg 965 970 975 CCC AGC CTC TAGTCTCCTG AGCCTATAGA GCCCCCAGGA GACTGGGACC 3096 Pro Ser Leu CAAAGAACTT CACAGCACAC TTACCGAATG CAGAGAGCAG CTTTCCTGGC TTTGTTCACT 3156 TGCAGAAAAG GAGCGCAAGG CAGAGGCTCT GAAGCACTTT CCTTGTACAT TTGGAGAGTG 3216 GCATTGCCTT TTAGATAGGA TTAGGCCGGA TATTTTGCTT TTTACCCT 3264