JP2000512147A

JP2000512147A - ＩＬ―１／ＴＮＦ―α活性化キナーゼ（ＩＴＡＫ）、並びに当該キナーゼを作成しそして使用する方法

Info

Publication number: JP2000512147A
Application number: JP10501605A
Authority: JP
Inventors: シムス，ジョン・イー; ヴィルカ，ジー・デューク; バード，ティモシー・エイ; アンダーソン，ダーク・エム
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 2000-09-19
Also published as: PT914451E; NZ333214A; AU718792B2; DK0914451T3; KR20000016286A; DE69736326D1; EP0914451A1; IL127363A0; NO985742L; NO985742D0; WO1997047750A1; CA2257373A1; IL127363A; AU3284297A; DE69736326T2; EP0914451B1; ATE332974T1; ES2270463T3

Abstract

(57)【要約】精製され単離されたIL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）、ITAKをコードする核酸、ITAKの組換え型を作成する過程、ITAKを含む薬剤組成物、および治療およびITAKのアンタゴニストおよびアゴニストを検出する検定を含むさまざまな検定へのITAKの利用が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 IL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）、並びに当該キナーゼを作成しそして使用する方法技術分野本発明は一般的に、炎症に関連する情報伝達経路、およびより詳細にはIL-1/T NF-α活性化キナーゼ（ITAK）に向けられる。発明の背景インターロイキン-1（IL-1）および腫瘍壊死因子-α（TNF-α）は感染、負傷または免疫的誘発に反応して、全身でおよび局所的に産生される２つのサイトカインである。一方（またはもう一方）のサイトカインの作用が特異的に遮断されている、あるいは精製サイトカインが投与されている研究に基づき、IL-1および TNF-αは多くの疾患過程に関連づけられている。例えば、IL-1は、慢性関節リウマチおよびその他の変性関節疾患、炎症性腸疾患、I型糖尿病、乾癬、アルツハイマー病、およびアレルギーを含む炎症性疾患に関連づけられている。 TNF-αの過剰産生は、同様に、再灌流損傷、慢性関節リウマチ、心臓血管疾患、 HIV感染およびHIV誘導神経障害などの感染性疾患、アレルギー性／アトピー性疾患、炎症性疾患／自己免疫、悪性疾患、器官移植拒絶または移植片対宿主疾患を含む移植困難、悪液質、および先天性、皮膚、神経、腎、毒性および代謝／特発性疾患などの疾患に関連づけられている。２つのサイトカインが共同で作用していると考えられる特定の特異な事例は、全身性炎症反応症候群の誘導におけるものである。 IL-1およびTNF-αが制御なしに産生された結果が重大なものとなる可能性があるため、当該サイトカインの１つ、または好ましくは両方の産生または活性を制限しうる療法に関し、かなりな努力が払われてきた。普及している療法は、循環するサイトカインに特異的に結合するタンパク質を投与し、その結果サイトカインが細胞受容体と相互作用するのを妨げるものである。こうしたタンパク質に基づいた治療薬は典型的には、抗体または「可溶性」受容体（すなわち、天然細胞受容体の組換え型で、膜貫通および情報伝達領域が欠失しているもの）である。さらに別の、タンパク質に基づく治療薬は、IL-1受容体アンタゴニストタンパク質（IL-1ra）であり、IL-1のアゴニスト型と同じ細胞受容体に結合において競合するが、細胞内情報を誘導しない。 IL-1またはTNF-αによりごく少数のIL-1またはTNF-α受容体が占有されただけで細胞反応（そしてしたがって上述の有害な影響）が生成されるため、タンパク質に基づく３種の治療の効果はいずれも、限定されている。したがって、複合体形成に有利な平衡に追いやるために（すなわち、IL-1またはTNF-αがそれぞれの受容体に結合するのを効果的に妨げるために）、抗サイトカイン抗体、可溶性受容体またはアンタゴニストタンパク質を比較的高いレベルに維持する必要がある。そのようなタンパク質に基づく治療薬の別の欠点は、各治療薬は２種のサイトカインのうち１種のみに選択的であるということである。したがって、IL-1 およびTNF-α産生を制御しようと試みるなら、多数の治療薬を大量に患者に投与しなければならない。 TNF-αおよびIL-1の生物学的効果は全く同様であるが、これらサイトカインの構造、およびこれらの受容体の構造は大変異なっている。IL-1およびTNF-αは、それぞれのサイトカインがその受容体に結合すると、同様の受容体後情報伝達経路に影響を及ぼすらしいため、これらは重複する生物学的活性を有しているようである。これらの経路の詳細の多くは明らかでない。例えば、どちらのサイトカインも転写因子NF-κBおよびAP-1を活性化し、広い範囲のさまざまな遺伝子の制御された転写を導くが、この過程を制御する受容体に近接した特異的なエフェクターは明らかでない。さらに、どちらのサイトカインも、それぞれセラミドおよびアラキドン酸を生成するスフィンゴミエリナーゼおよびホスホリパーゼの活性化を引き起こすことが報告されている。どちらのサイトカインもまた、ERK1、 ERK2、並びにストレス活性化キナーゼJNK-1およびp3 8を含むマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）ファミリーのメンバーを活性化する。このキナーゼファミリーは、さまざまな程度に、広範囲のホルモン、成長因子、重金属、タンパク質合成阻害因子および紫外線光によって活性化され、したがって、これらキナーゼの活性化はIL-1/TNF-α情報伝達経路に特有のものとは考えられない。 IL-1およびTNF-α双方に活性化されるものに加え、IL-1はIL-1受容体関連キナーゼ、IRAKを特異的に活性化することが報告されている（Cao，HenzelおよびGao ，Science 271:1128(1996)）。TNF受容体の細胞質領域もまた、TRAF1およびTRAF 2、FADD、MORTおよびTRADDなどのその他の情報伝達分子と相互作用することが報告されている。こうしたTNF-α受容体相互作用タンパク質もまた、T-およびB-細胞活性化物質CD40およびアポトーシス仲介物質fasなどの全く異なった細胞反応を仲介する受容体を含む広範な受容体ファミリーと相互作用することが可能なようである（TewariおよびDixit，Curr．Opin．Genet．Dev．6:39，1996;Leeら，J ．Exp．Med．183:669，1996）。 IL-1、TNF-α、またはその他の仲介物質により、ある種の細胞反応を誘導することが可能である一方、IL-1またはTNF-αに特有に誘導されるが、その他の限定された刺激剤によっては誘導されないと見られる唯一の既知の情報伝達は、in v itroでβ-カゼインリン酸化能として検出することができるタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ活性である（Guesdonら，J．Biol．Chem．268:4236(1993); Biochem．J．304:761 (1994)）。このβ-カゼインキナーゼ活性は、繊維芽細胞およびその他の結合組織由来細胞で、IL-1およびTNF-αによって誘導されるが、試験された他の21の剤では誘導されなかった。β-カゼインキナーゼの構造はこの報告では明らかにされなかった。しかし、IL-1およびTNF-α双方の細胞内効果の抑制または刺激を提供する基質およびまたは方法に対する要求は満たされていない。また、IL-1およびTNF-αの受容体後経路との相互作用を提供する基質および方法に対する要求も、IL-1およびTNF-α双方に対しアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する単一の化合物を含む、IL-1またはTNF-αに対するアゴニストおよび／またはアンタゴニストを検出する機会を提供する基質および方法に対する要求と同様、満たされていない。本発明はこれらおよびその他の関連する利点を提供する。発明の概要本発明は、IL-1およびTNF-α双方の受容体後細胞内経路の少なくとも１つと相互作用する、好ましくはヒトの、タンパク質キナーゼの核酸およびアミノ酸配列を提供する。こうしたキナーゼは本明細書中ではIL-1/TNF-α活性化キナーゼ（I TAK）と呼ぶ。こうしたキナーゼは、適切な細胞をIL-1またはTNF-αにより処置することで、特異的な基質タンパク質をリン酸化することができる、酵素活性のあるキナーゼとして誘導される。本発明はさらに、ITAKをコードする核酸分子の単離および精製のための組成物および方法も提供する。さらに本明細書中に開示されるのは、ITAKを発現しそして精製する方法、並びに、IL-1およびTNF-αのアンタゴニストまたはアゴニストとして有用であるかもしれないITAK活性の阻害因子または刺激剤を検出する特異的な検定である。これに加え、本発明はITAKをコードする単離核酸、および好ましくはITAKをコードするcDNA由来より、ITAKを発現できる発現ベクターを含むベクターに向けられる。本発明はこうした発現ベクターを含む宿主細胞、および、こうした宿主細胞を工業的な量を含めてITAKの発現および好ましくは精製を助ける条件下で、培養を行うことにより、ITAKを産生する過程を含む。ある程度はこうしたITAK精製のため、本発明はまた、ITAKに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体にも向けられる。本発明はまた、例えばIL-1またはTNF-αに反応して伝達された情報の遮断手段として、ITAK活性に対する潜在的な阻害因子または刺激剤をスクリーニングする ITAKを使用した検定にも向けられる。さらにITAKを使用してITAK活性の阻害因子を設計する方法もまた開示される。特に、1つの側面において、ヒトIL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）などのIT AKをコードする単離核酸分子、またはその変異体が提供される。1つの態様において、単離核酸分子は、ヌクレオチド番号1からヌクレオチド番号2940までの配列番号1のヌクレオチド配列を含む。この単離核酸分子は、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。関連する態様において、Lys81がAlaに置換されたITAK変異体を含むITAK変異体をコードする核酸分子が提供される。関連する側面の範囲内で、単離ITAKまたはその変異体が提供される。別の関連する側面の範囲内で、ITAKコード配列に機能可能であるように連結されたプロモーターを含む組換え発現ベクターを含む組換えベクターが提供される。本発明はさらに、こうした組換えベクターいずれかを含む宿主細胞を提供する。さらに別の側面において、本発明は、IL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）をコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズできる、少なくとも15ヌクレオチド長の核酸プローブを提供する。本発明のさらにまた別の側面の範囲内で、IL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK ）のキナーゼ活性を調節する剤をスクリーニングする方法であって：（a）候補剤と生物学的に活性をもつITAKを、候補剤にITAKのキナーゼ活性を調節させる条件下で、そして十分な時間をかけて接触させ；そして（b）候補剤がI TAKキナーゼ活性を調節する能力を測定する、ことを含む方法が提供される。1つの態様の範囲内では、この方法はさらに、当該候補剤を単離することも含む。本発明のさらに別の側面の範囲内で、選択された剤がIL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）アゴニストであるかどうか決定する方法であって：（a）選択された剤を未刺激のITAK反応経路に、経路を刺激させる条件下で、そして十分な時間をかけて曝露し；そして（b）反応経路の刺激を検出し、そしてそこからITAKアゴニストの存在を決定する、ことを含む方法が提供される。関連する側面の範囲内で、選択された剤がIL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）アゴニストであるか決定する方法であって：（a）ITAK反応経路のITAKキナーゼ活性を測定し；（b）選択された剤を測定されたITAK反応経路に曝露し；そして(c)当該反応経路において増加したITAKキナーゼ活性を検出する、ことを含む方法が提供される。本発明のさらにまた別の側面の範囲内で、選択された剤がIL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）アンタゴニストであるかどうか決定する方法であって：（a）選択された剤を、ITAKアゴニストの存在下で、経路の刺激を減少させる条件下で、そして十分な時間をかけてITAK反応経路に曝露し；そして（b）ITAKアゴニストのみの反応経路刺激と比較して反応経路の刺激の減少を検出し、そしてそこからITAKアンタゴニストの存在を決定することを含む方法が提供される。こうした方法を利用して、ITAKアゴニストおよびITAKアンタゴニストが提供される。さらに別の側面の範囲内で、ITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列（ITAK pho sphorylation substrate peptide acceptor sequence）であり、哺乳類β-カゼインでなく、そして単離ITAKにより少なくとも40nmol、好ましくは少なくとも80 nmol、さらに好ましくは少なくとも98nmolリン酸／mgタンパク質／分の速度でリン酸化されうる配列が提供される。本発明のさらにまた別の側面の範囲内では、IL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITA K）活性を検出する方法であって：（a）ITAKを哺乳類β-カゼインではないITAK リン酸化基質ペプチド受容体配列と、ATP存在下で、ATP供与体からITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列にγ-リン酸基を輸送させる条件下で、そして十分時間をかけて接触させ；そして（b）当該ITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列によるリン酸の取り込みを測定する、ことを含む方法が提供される。１つの態様の範囲内で、このATPはγ-（³²P）-ATPである。本発明の関連する態様において、ITA Kリン酸化基質ペプチド受容体配列は、アミノ酸配列：Arg-Arg-Arg-His-Leu-Pro -Pro-Leu-Leu-Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro-His-Gln（配列番号3）を有する。本発明の別の側面の範囲内で、ITAKアンタゴニストを治療上有効な量、患者に投与することを含む、IL-1またはTNF-αが仲介する炎症性障害を治療する方法が提供される。本発明はさらに、試料中のITAKを検出するキットであって：β-カゼインではなく、そして単離ITAKにより少なくとも40nmol、好ましくは少なくとも80nmol，さらに好ましくは少なくとも98nmolリン酸／mgタンパク質／分の速度でリン酸化されうるITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列；およびITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列により取り込まれたリン酸を測定する手段、を含むキットを提供する。本発明はさらに、ITAKと関与する遺伝子産物を同定する方法であって：（a）I TAKポリペプチド配列をコードする核酸配列を、宿主細胞の生存率に本質的であるタンパク質の機能的に不完全な第一の部分を含む融合タンパク質の一部として ITAK配列が発現するように第一の発現ベクターに導入し；（b）ITAKに関与する複数の候補遺伝子産物をコードする核酸配列を、候補遺伝子産物がいずれも、宿主細胞の生存率に本質的である当該タンパク質の機能的に不完全な第二の部分を含む融合タンパク質の一部として発現するように第二の発現ベクターに導入し；（c）第一および第二の発現ベクターを、宿主細胞の生存が、当該タンパク質の第一および第二の機能的に不完全な部分双方が再構成され機能的に完全なタンパク質になることに依存するような条件下で、そして十分な時間をかけて導入し；そして（d）生存宿主細胞を同定し、そしてそこから第二の発現ベクター中のI TAKと関与する候補遺伝子産物をコードする核酸配列を決定することを含む方法を提供する。本発明のこの側面の1つの態様において、宿主細胞は酵母宿主細胞である。本発明のこの側面の別の態様において、当該酵母は酵母株Y190である。関連する態様において、宿主細胞の生存率に本質的なタンパク質はモジュラー（modular）酵母転写因子GAL4である。関連する別の態様において、宿主細胞の生存率に本質的なタンパク質の機能的に不完全な第一の部分は、モジュラー酵母転写因子GAL4 のN末端の147アミノ酸を含み、一方他の態様において、機能的に不完全な第二の部分はモジュラー酵母転写因子GAL4のC末端の114アミノ酸を含む。さらにまた別の態様の範囲内では、宿主細胞の生存率に本質的なタンパク質の機能的に不完全な第一の部分はモジュラー転写因子のDNA結合領域を含む。関連する態様において、単細胞宿主の生存率に本質的なタンパク質の機能的に不完全な第二の部分はモジュラー転写因子の転写活性化領域を含む。本発明のこれらおよび別の側面は、以下の詳細な記載および添付の図表に論及することで明確になるであろう。ある種の方法または組成物（プラスミドなど）を記載するさまざまな論及が本明細書中に述べられる。本明細書中に言及された論及は本明細書中に全体が援用される。図の簡単な説明図1A-1Fは代表的なヒトITAKヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列（配列番号8）を図示している。発明の詳細な説明上述のように、本発明は、適切な細胞をIL-1またはTNF-αに曝露することで特異的に誘導されるキナーゼ活性を有するITAKタンパク質の単離および精製のための組成物および方法を提供する。IL-1情報伝達阻害因子は、アレルギー、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、およびアルツハイマー病などの、IL-1過剰産生または未制御産生によって特徴づけられるさまざまな炎症および免疫障害の治療に臨床的な用途を有する。TNF-α情報伝達阻害もまた、全身性炎症反応症候群、再灌流損傷、心臓血管疾患、HIV感染およびHIV神経障害などの感染性疾患、炎症性疾患／自己免疫、アレルギー性／アトピー性疾患、悪性疾患、器官移植拒絶または移植片対宿主疾患を含む移植困難、悪液質、先天性、皮膚、神経、腎、毒性および代謝／特発性疾患などの、TNF-α過剰産生または未制御産生によって特徴づけられる疾患の治療に臨床的な用途を有する。ITAKをコードするcDNAを本明細書中に開示することにより、IL-1およびまたはTNF-αの阻害に適した方法および組成物が、さまざまなその他の利点と共に提供される。出願人がITAKを発見したことは、とりわけ、ITAKをコードする核酸配列を含む、発現ベクターを含むベクターの構築、こうしたベクターを含む宿主細胞（例えばトランスフエクションまたは形質転換によって）、工業量のITAKを含むITAKの産生、およびITAKに免疫的に反応する抗体を可能にする。さらに、ITAKがIL-1およびTNF-αの情報伝達において機能する機構を理解することで、IL-1および／またはTNF-α活性の阻害因子を検出する検定の設計が可能になる。本明細書中で用いられる際、「ITAK」という用語は、ITAK源細胞がIL-1または TNF-αに曝露されて特異的に誘導されたキナーゼ活性を有し、そして脱リン酸化されたウシβ-カゼインのリン酸化、またはウシβ-カゼインのリン酸化受容部位と構造的に相同であることで同定されるその他の適切なペプチドまたはポリペプチド基質のリン酸化が可能であるキナーゼ活性を有するポリペプチド種を指す。一般的に、こうした活性はPMA、10％ウシ胎児血清、PDGF、ブラディキニン、EGF 、TGF-βl、bFGF、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、ヒスタミン、プロスタグランジンE₂、フォルスコリン、A23187、44℃熱ショックまたは亜ヒ酸ナトリウムによっては誘導されない（Guesdonら，Biochem．J． 304:761(1994)）。異なる記述がされない限り、ITAKはまた、その変異体および誘導体も指す。好ましい態様において、ITAKは配列番号2の1-979アミノ酸配列を有するタンパク質を、こうしたアミノ酸配列と高い配列相同性（典型的には少なくとも90％の配列相同性、好ましくは少なくとも95％の相同性、より好ましくは少なくとも98％の相同性）を有するタンパク質と共に含む。ITAKはまた、配列番号1のヌクレオチド1-2940の遺伝子産物およびこれらのヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を、その他のITAKをコードする核酸分子の遺伝子産物と共に含む。こうしたタンパク質および／または遺伝子産物は、好ましくは生物学的に活性がある。完全長ITAKはSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で決定するとおよそ110-125kDの分子量を有する。ITAKはまた、ITAKをコードする核酸分子も含む。本明細書中で用いられる「ITAK変異体」は、天然ITAKに実質的に相同であるが、天然または非天然に起こった1つまたはそれ以上の欠失、挿入または置換によって天然ITAK（ヒト、ウサギ、ネズミまたはその他の哺乳動物種）と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。変異体アミノ酸配列は、天然アミノ酸配列に好ましくは少なくとも約80％相同、より好ましくは少なくとも約90％相同、そしてさらに好ましくは少なくとも約95％相同である。％相同性は例えば、Deve reuxら（Nucl．Acids Res．12:387，1984）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGCG）から入手可能なGAPコンピュータープログラム、バージョン6.0を用いて配列情報を比較することによって決定することが可能である。GAPプログラムはSmithおよびWaterman（Adv．Appl．Math 2: 482，1981）が改訂したNeedlemanおよびWunsch（J．Mol/Biol．48:443，1970）の並列法を利用している。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（1）ヌクレオチドに対する比較マトリックス（同一に対する1および非同一に対する0の値を含む）、およびSchwartzおよびDayhoff監修，Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，pp．35 3-358，1979に記載されるGribskovおよびBurgess，Nucl．Acids Res．14:6745， 1986の加重比較マトリックス；（2）それぞれのギャップに対する3.0のペナルティおよびギャップごとのそれぞれの記号に対しさらに0.10のペナルティ；および（3）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。 ITAK変異体の1つの種類は、タンパク質キナーゼが酵素活性を最大にするのに有利であるように、触媒サブドメインIIにリジン残基を含む傾向があることに基づいている。特に、このリジン残基（配列番号2に開示されたITAKの81位に対応する）に突然変異が起こると、タンパク質キナーゼの触媒機能の欠失につながる。したがって、こうした突然変異体（好ましくは組換え体）キナーゼは、細胞中で過剰発現すると「優性ネガティブ」表現型を表わし、それにより野生型ITAKが通常機能する生化学経路を通した情報伝達を妨げることが可能である。例えばリジン-81がアラニンに置換されたITAKA 81などのこうした変異体は、さらに後で論じられるように、IL-1またはTNF-α情報伝達の阻害を治療目的で使用する際、特に利点がある可能性がある。ITAKのタンパク質キナーゼ活性を失ったその他の ITAK変異体、例えばITAKA 81のリジンからアラニンへのアミノ酸置換以外の置換を有する、およびアミノ酸の欠失、挿入または置換を含むITAK変異体は、本発明のITAK変異体に含まれる。 ITAK変異体は、保存性置換配列、つまり、あるアミノ酸残基が同様の物理化学的特性を有する残基と置き換えられている配列を含んでもよい。保存性置換の例には、1つの脂肪族残基の別のものへの置換、例えばIle、Val、LeuまたはAlaなどの相互置換、または1つの極性残基の別のものへの置換、例えばLysおよびArg 、GluおよびAsp、またはGlnおよびAsn同士の置換を含む。その他のこうした保存性置換、例えば同様の疎水特性を有する領域全体の置換が周知である。天然に発生したITAK変異体もまた、本発明に含まれる。こうした変異体の例は、選択的mR NAスプライシングの結果、またはITAKタンパク質のタンパク質分解切断の結果、ここでタンパク質分解された断片はITAKの生物学的活性を保持している切断である、生じるアミノ酸置換を有するタンパク質である。例えば、細胞または組織から単離される天然発生ITAKのNまたはC末端の相違、または、ITAKタンパク質から 1つまたはそれ以上の末端アミノ酸（通常1-5末端アミノ酸）がタンパク質分解で除かれることによる、異なる種類の宿主細胞で発現され検出された同様の変異である。「ヌクレオチド配列」は、標準的な生化学的方法（Maniatisら，Molecular Cl oning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982，およびSa mbrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Sprond Harb or Laboratory,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989)に略述されたものなど）により、その構成要素であるヌクレオチド配列の同定、操作および回収が可能であるように、少なくとも1度は実質的に純粋な（すなわち外因性成分の混入がない）形および量または濃度で単離されたDNAまたはRNA由来である、分離された断片の形またはより大きな核酸構築物の構成要素としてのポリヌクレオチドを指す。こうした配列は好ましくは、真核生物遺伝子に典型的に存在する内部の翻訳されない配列、イントロンにより中断されていない読み枠の形で提供される。翻訳されないDNAの配列は、読み枠から5'または3'に存在してもよく、ここで同はコード領域の操作または発現に干渉しない。「単離された」という用語は本明細書中で使用される際、ITAKタンパク質がクーマシーブルー（Coomassie blue）染色を使用したドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）による組成物の染色パターンに基づき、組成物のタンパク質含有量の少なくとも約90％を含むように、ITAKタンパク質が組換えまたは非組換え体として、産生細胞から分離されたことを意味する。典型的には、精製タンパク質は少なくともタンパク質含有量の約92％を含み、好ましくは少なくともタンパク質含有量の約94％を含み、さらに好ましくは少なくともタンパク質含有量の約96％を含み、そしてさらにより好ましくは少なくともタンパク質含有量の約98％を含む。別の態様において、他のいかなる（望ましくない）タンパク質も、SDS-PAGE解析に続くクーマシーブルー染色に応じて検出されず、そして好ましくは他のいかなる（望ましくない）タンパク質もSDS-PAGE解析に続く銀染色に応じて検出されない。「単離（された）」核酸分子は、本明細書中にさらに論じられるようにITAKをコードし、そして産生細胞から単離された核酸分子を意味する。さらに、ITAK遺伝子（またはその断片、または変異体など、やはり本明細書中に論じられる）は、染色体など、生物学的産生細胞核酸分子から分離されていれば、単離されたとみなす。こうした単離遺伝子は組換え核酸分子内に含まれていてもよい。 ITAKに関し「生物学的に活性がある」という用語は、本明細書中で用いられる際、脱リン酸化されたウシβ-カゼインのリン酸化、または1つまたはそれ以上のウシβ-カゼインのリン酸化受容部位に実質的に相同性を有するリン酸化合成ペプチド基質（本発明により提供されるITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列など）のリン酸化ができるITAKを意味する。こうした基質の1つは、ポリペプチドRRR HLPPLLLQSWMHQPHQ（配列番号3）である。脱リン酸化されたウシβ-カゼインのリン酸化に好ましい条件は、Guesdonら，J．Biol．Chem．268:4236(1993); Guesdo nら，Biochem．J．304:761(1994)で見い出すことができ、一方、合成ポリペプチドRRRHLPPLLLQSWMHQPHQ（配列番号3）のリン酸化に好ましい条件は、実施例1に見い出すことができる。基質ペプチドのITAKによるin vitroリン酸化は、シンチレーション近接検定（scintillation proximity assay; SPA）などの高効率スクリーニングに適用してもよい。したがって、ITAKを通じてβ-カゼインまたはITA Kリン酸化基質ペプチド受容体配列に取り込まれたリン酸を測定する方法は、取り込まれた³²Pの検出；当業に知られるSPA検出法；蛍光定量、比色分析、または分光光度測定法；免疫化学検出、例えばリン酸化されたアミノ酸またはペプチドに特異的に反応する抗体を使用した検出；または当業者に知られる関連する検出法を含む。本発明にしたがって単離されたITAKは、後述される組換え発現系によって産生してもよく、また天然発生した細胞から産生してもよい。ITAKはまた、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で110kDから125kDの構成要素として移動し、そしてペプチド地図および部分的配列解析で示されるように同一のアミノ酸配列を有する一連のリンタンパク質により示されるように、実質的に精製することも可能である。ITAKを産生する1つの過程は、ITAKをコードするDNA配列を含む発現ベクターにより形質転換した宿主細胞を、ITAKの発現を促進するに足る条件下で培養することを含む。ITAKはその後、使用した発現系次第で、培地または細胞抽出物から回収される。当業者に知られるように、組換えタンパク質を精製する過程は、使用した宿主細胞の種類、および組換えタンパク質が培地に分泌されるかどうかといった要因により異なるであろう。例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系が使用された場合、培地はまず、例えばAmicon またはMillipore Pellicon限外ろ過装置などの、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮してもよい。濃縮段階後、濃縮物はゲルろ過基剤などの精製マトリックスに適用してもよい。または、例えばジエチルアミノエチル（DEAE）基側鎖を有するマトリックスまたは支持体といった陰イオン交換樹脂を使用してもよい。マトリックスにはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製によく用いられるその他の種類のものを使用してもよい。または、陽イオン交換段階を使用してもよい。適当な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含むさまざまな不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）基剤（例えば、遊離の（pendant）メチル基または他の脂肪属基側鎖を有するシリカゲル）を使用した1つまたはそれ以上のR P-HPLC段階を使用して、ITAKをさらに精製してもよい。さまざまに組み合わされた、前述の精製段階のいくつかまたは全ては、周知であり、そして単離および精製組換えタンパク質を提供するのに使用してもよい。組換えにより産生されたITAKに加え、ITAKは次の細胞株のいずれから単離および精製してもよい：C122（Simsら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 86:8946-8950， 1989）、HUT102（ATCC TIB162）、KB（ATCC CCL17）、Raji（ATCCCCL86）、SK-H ep-1（ATCC HTB52）、およびWI-26（ATCC CCL95.1）。ITAKのその他の産生源を用いてもよく、そしてITAKはまた、IL-1またはTNF-αを産生する、またはこれらに反応するその他の細胞種に見い出される。候補細胞によるITAK産生は、例えば ITAKの生物学的活性の決定に関連する上述の、および実施例1に記載される検定、および／または適切な核酸ハイブリダイゼーション検定による検定などの、本明細書中に論述される検定を使用して検出してもよい。 ITAK産生細胞または細胞株が一度同定されれば、ITAKは、所望によりまずIL-1またはTNF-αで産生細胞を刺激して単離および精製してもよい。望むならば、こうした刺激は当業に周知の技術を用いて行ってもよい。IL-1は好ましくは1-50ng/m lで使用し、そしてTNF-αは好ましくは20-200ng/mlで使用する（Guesdonら，199 3，1994）。細胞はその後回収し、洗浄し、そして細胞質タンパク質を慣用過程によって抽出する。部分的に精製されたITAKは、ITAK活性制御に重要な特異的に関連する種類を含む可能性がある350kDより大きい高分子量複合体として見い出される。ITAKはまた、グリコシル基、ポリエチレングリコール（PEG）基、脂質、リン酸、アセチル基および類似物などの、その他の化学物質部分と共有または凝集結合体を形成することによりITAK誘導体を作るよう修飾してもよい。ITAKの共有結合誘導体は、化学物質部分をITAKアミノ酸側鎖の官能基、またはITAKポリペプチドのN末端またはC末端に結合させることで調製してもよい。本発明の範囲内のITAKのその他の誘導体には、組換え培養においてN末端またはC末端融合体として合成されるものなどの、ITAKまたはその断片とその他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または凝集結合体を含む。例えば、結合体は、ITAKポリペプチドのN末端にリーダーポリペプチド配列（サッカロミセス（Saccharomyces）のα-因子リーダーなど）を含んでもよい。シグナルまたはリーダーペプチドは翻訳と同時に、または翻訳後に、結合体の合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側の部位への輸送を指示する。 ITAK結合抗体などのITAK結合タンパク質を含むアフィニティカラムを使用して、発現したITAKポリペプチドをアフィニティ精製することも可能である。ITAKポリペプチドは、慣用技術を用いてアフィニティカラムから除去することもできる。例えば、高塩溶出緩衝液に溶出し、その後、使用したアフィニティマトリックス次第で、より低塩の緩衝液中で透析し、またはpHまたはその他の構成要素を変えて、使用する。望ましい生物学的活性を保持する天然ITAKの変異体および誘導体は、天然ITAK ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異により得てもよい。天然アミノ酸配列の改変は、数多くの慣用法のいずれを用いて達成してもよい。突然変異は、天然配列の断片に連結することができるよう制限酵素を隣接した突然変異配列を含む合成オリゴヌクレオチドにより、特定の遺伝子座に導入することが可能である。連結後、その結果生じた再構築配列は、望ましいアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体（analog）をコードする。または、あらかじめ決められたコドンが置換、欠失または挿入によって改変されてもよい改変遺伝子を提供するため、オリゴヌクレオチドによる部位特異的突然変異誘発手法を用いもよい。上述の改変を作成する典型的な方法はWaldersら（Gene 42:133，1986）；Bauerら（Gene 37:73，1985）；Craik（BioTechniques ，January 1985，12-19）；Smithら（Genetic Engineering:Principles and Met hods，Plenum Press，1981）；Kunkel（Proc．Natl.Acad．Sci．USA 82:488，19 85）；Kunkelら（Methods in Enzymol．154:367，1987）および米国特許第4,518 ,584号および第4,737,462号に開示されている。アミノ酸残基または配列のさまざまな追加または置換、または生物学的活性に不要な末端または内部残基または配列の欠失をコードする均等のDNA構築物もまた、本発明に含まれる。例えば、生物学的活性に本質的でないCys残基をコードする配列は、Cys残基が欠失するか他のアミノ酸に置き換えられるように改変し、再生の際、誤った分子内ジスルフィド架橋が形成されるのを防いでもよい。その他の均等物は、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系で、発現を高めるため、隣接した2つの塩基性アミノ酸残基を修飾することで調製することも可能である。EP212,914号は、タンパク質中のKEX2プロテアーゼ作用部位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発法を開示している。KEX2プロテアーゼ作用部位では、残基を欠失、追加または置換することにより、Arg-Arg、Arg-LysおよびLys- Arg対を改変し、これら隣接する塩基性残基の出現を除く。Lys-Lys対はKEX2切断をかなり受けにくく、そしてArg-LysまたはLys-ArgのLys-Lysへの変換は、KEX2 部位を不活性化する保存的で好ましい方法を代表する。本発明の範囲内の核酸配列は、本明細書中に開示される天然ITAKヌクレオチド配列に、中程度または高度に厳密な（stringent）条件でハイブリダイズし、そして生物学的に活性のあるITAKをコードする、およびその相補配列である単離DN AおよびRNA配列を含む。本明細書中で用いられる際、中程度に厳密な条件は、当業者に知られるように、そしてSambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory M anual，第2版．Vol.1，pp．1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press ，(1989)に定義されるとおり、ニトロセルロースフィルターに対し前洗浄溶液として5X SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)を使用し、ハイブリダイゼーション条件は50%ホルムアミド、6X SSCで42℃（または同様のハイブリダイゼーション溶液またはスタークの溶液（Stark's solution）を用い50%ホルムアミド中で42℃）であり、そして洗浄条件は約60℃、0.5 X SSC、0. 1% SDSである。高度に厳密な条件は、ハイブリダイゼーション条件は上述のもので、そして洗浄を68℃、0.2X SSC、0.1% SDSで行うことで定義される。当業者はハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液の温度、塩濃度、およびカオトロープ（chaotrope）組成物は、プローブの長さおよびヌクレオチド塩基組成物などの要素により必要に応じて調節してもよいことを認識するであろう。既知の1つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードできるという遺伝暗号の縮重のため、DNA配列は、例えば図1に示されたものとは異なり、そしてなお配列番号 2のアミノ酸配列を有するもののように、ITAKタンパク質をコードする可能性がある。こうした変異体DNA配列はサイレント突然変異（例えばPCR増幅の際、発生するもの）の結果生じてもよいし、また天然配列に意図的に突然変異誘発した産物であってもよい。したがって本発明は、生物学的に活性のあるITAKをコードする同等の単離核酸配列を含み、核酸配列には：（a）天然哺乳動物ITAK遺伝子のコード領域由来の核酸分子；（b）ヌクレオチド配列、配列番号1および配列番号8からなる群から選択された核酸分子；（c）中程度に厳密な条件下で（a）（またはその相補鎖）の核酸分子とハイブリダイズでき、そしてITAKをコードする核酸分子；および（ d）遺伝暗号の結果、（a）、（b）または（c）に定義された核酸分子に関し、縮重しており、そしてITAKをコードする核酸分子から選択されたものを含む。好ましくは、核酸分子はDNAであり、そしてさらに好ましくはITAKは生物学的に活性がある。こうした均等な核酸配列にコードされるITAKタンパク質および遺伝子産物は本発明に含まれる。図1、配列番号1のDNA配列と均等な核酸分子は、中程度に厳密な条件下で配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする二本鎖天然DNA配列にハイブリダイズするであろう。こうしたDNAにコードされるITAKの例は、限定されるわけではないが、上述のものも含め、不活性化されたKEX2プロテアーゼ作用部位、または保存性アミノ酸置換を含むITAK断片およびITAKタンパク質である。その他の哺乳動物種由来のDNAにコードされるITAKタンパク質であって、当該DNAが図1または配列番号1または配列番号8のcDNAの相補鎖に特異的にハイブリダイズするようなタンパク質もまた含まれる。 ITAKポリペプチド結合体（conjugate）はITAKの精製および同定を容易にするためにITAKに加えられたペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、例えば、ポリHisまたは米国特許第5,011,912号およびHoppら，Bio/Technology6:1204 ，1988に記載された抗原同定ペプチドが含まれる。ITAK融合タンパク質はさらに、ITAKの精製、同定および局在化を容易にするためITAKに加えられた免疫グロブリン定常部ポリペプチドを含んでもよい。定常領域ポリペプチドは好ましくは、可溶性ITAKのC末端に融合される。抗体由来ポリペプチドのさまざまな部分に融合した異種性ポリペプチドを含む融合タンパク質の一般的な調製は、例えばAshk enaziら（PNAS USA 88:10535，1991）およびByrnら（Nature 344:677，1990）によって記載されている。ITAK:Fc融合タンパク質をコードする遺伝子融合体は、適切な発現ベクターに挿入される。ITAK:Fc融合タンパク質は、抗体分子とほぼ同様に組み合わされ、その結果、鎖間のジスルフィド結合がFcポリペプチド間に形成され、二価のITAKが得られる。 ITAKをコードする核酸配列を含む、発現ベクターを含む組換えベクターは、周知の方法を用いて調製することが可能である。発現ベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適切な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列に機能可能であるように連結したITAK DNA配列を含む。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、および転写および翻訳の開始および終止を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が機能的にITAK DNA配列に結び付けられた際、「機能可能であるように連結」している。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列がITAK DNA配列の転写を制御しているならば、ITAK DNA配列に機能可能であるように連結している。通常複製起点により与えられる、望ましい宿主細胞中で複製する能力および形質転換体を同定するための選択遺伝子を、さらに発現ベクターに組み込んでもよい。さらに、天然にはITAKと関与しない、適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに組み込んでもよい。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のDNA配列をITAK配列にインフレームに融合させ、ITAKが初めはシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにしてもよい。意図した宿主細胞で機能するシグナルペプチドは、ITAKポリペプチドの細胞外への分泌を高める。シグナルペプチドは細胞からITAKが分泌される際、ITAKポリペプチドから切断されてもよい。 ITAKポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞またはより高次の真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主への使用に適したクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwelsら，Cloning V ectors:A Laboratory Manual，ニューヨーク州エルセビア（1985）に記載されている。細胞不含翻訳系もまた、本明細書中に開示されたDNA構築物由来のRNAを用いて、ITAKポリペプチドを産生するのに使用してもよい。原核生物は、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌（E．coli）またはバチルス属（Bacilli）を含む。形質転換に適した原核宿主細胞は、例えば、大腸菌、枯草菌（Bacilus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimu rium）およびシュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトミセス属（Strepto myces）およびブドウ球菌（Staphylococcus）属のさまざまなその他の種を含む。大腸菌のような原核宿主細胞では、原核宿主細胞中の組換えポリペプチドの発現を容易にするため、ITAKポリペプチドはN末端メチオニン残基を含んでもよい。N末端Metは発現された組換えITAKポリペプチドから切断してもよい。原核宿主細胞で使用される発現ベクターは、一般的に1つまたはそれ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与える、または独立栄養必要条件を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に使用できる発現ベクターの例は、クローニングベクターpBR322(ATCC 37017)などの商業的に入手可能なプラスミド由来のものを含む。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、そしてしたがって、形質転換細胞を同定する単純な方法を提供する。pBR322を用いた発現ベクターを構築するために、適切なプロモーターおよびITAK DNA配列がpBR322ベクターに挿入される。その他の商業的に入手可能なベクターには、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals，ウプスラ、スウェーデン）および pGEM1（Promega Biotec，ウィスコンシン州マディソン、米国）が含まれる。組換え原核宿主細胞発現ベクターによく用いられるプロモーター配列には、β -ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Changら，Natu re 275:615，1978;およびGoeddelら，Nature 281:544，1979）、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら，Nucl．Acids Res．8:4057，1980;およびEP -A第36776号）およびtacプロモーター（Maniatis，Molecular Cloning:A Labora tory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，p.412，1982）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系には、λファージP_LプロモーターおよびcI857ts熱不安定性リプレッサー配列を使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から入手可能な、λP_Lプロモーター誘導体を組み込んだプラスミドベクターには、プラスミドpHUB2（大腸菌株J MB9（ATCC 37092）に内在）およびpPLc28（大腸菌RR1（ATCC 53082）に内在）が含まれる。 ITAKポリペプチドはまた、酵母宿主細胞、好ましくはサッカロミセス属（例えばS.セレビシエ（S．cerevisiae））で発現してもよい。ピキア属（Pichia）,K. ラクティス（K．lactis）またはクロイベロミセス属（Kluyveromyces）などこの他の属の酵母も使用してもよい。酵母ベクターはしばしば、2μ酵母プラスミド由来の複製起点、自律複製配列（ARS）、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終止配列、および選択マーカー遺伝子を含むであろう。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、他のものの中でも、メタロチオネイン、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzemanら，J．Biol．Chem．255:2073，1980）またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのその他の解糖酵素（Hessら，J．Adv．Enzyme Reg．7:149，1968;およびHollandら，Biochem．17:4900，1978）が含まれる。その他、酵母発現に使用するのに適したベクターおよびプロモーターはさらに、Hitzeman，EPA-73,657号またはFleerら，Gene 107:285-195(1991);およびvan den Bergら，Bio/Technology 8:135-139(1990)に記載されている。また別に、Russellら（J．Biol．Chem．258:2674，1982）およびBeierら（Nature 30 0:724，1982）に記載されるグルコース抑制性のADH2プロモーターがある。酵母および大腸菌双方で複製可能なシャトルベクターを、大腸菌での選択および複製のためのpBR322由来DNA配列（Amp^r遺伝子および複製起点）を上述の酵母ベクターに挿入することによって構築してもよい。酵母α-因子リーダー配列はITAKポリペプチドの分泌を支配するのに使用してもよい。α-因子リーダー配列はしばしば、プロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入する。例えば、Kurjanら，Cell 30:933，1982; Bltterら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81:5330，1984;米国特許第4,546,082号；およびEP324, 274号を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を容易にするのに適したその他のリーダー配列は、当業者に知られている。リーダー配列はその3'端近くに1つまたはそれ以上の制限酵素部位を含むように修飾してもよい。これにより、リーダー配列と構造遺伝子の融合が容易になるであろう。酵母形質転換プロトコルは当業者に知られている。こうしたプロトコルの1つはHinnenら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:1929，1978に記載されている。Hi nnenらのプロトコルは、Trp⁺形質転換体を選択培地中で選択し、ここで当該選択培地は0.67％酵母窒素基剤、0.5％カザミノ酸、2％グルコース、10μｇ/mlアデニンおよび20μｇ/mlウラシルからなる。 ADH2プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、「リッチな」培地で、発現を誘発するように成長させてもよい。豊富な培地の例は、80μｇ/mlアデニンおよび80μｇ/mlウラシルを補った、1％酵母抽出物、2％ペプトン、および1％グルコースからなるものである。ADH2プロモーターの抑制は、グルコースが培地から枯渇した際に起こる。哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えITAKポリペプチドを発現するため使用してもよい。昆虫細胞内で、異種性タンパク質を産生するバキュロウイルス系は、LuckowおよびSummers，Bio/Technology 6:47(1988)により論評されている。哺乳動物由来の樹立細胞株も使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞株の例は、サル腎臓細胞のCOS-7株（ATCC CRL 1651）（Gluzmanら，Cell 23:175，1981）、L細胞、C127細胞、3T3細胞（ATCC CCL 163）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、およびBHK（ATCC CRL 10）細胞株、およびMcMahanら（EMBO J．10:2821，1991）に記載されたアフリカミドリザル腎臓細胞株CVI（ATCC CCL 70）由来のCV-1/EBNA-1細胞株である。哺乳動物宿主細胞発現ベクターの転写および翻訳調節配列はウイルスゲノムから切り出してきてもよい。よく用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列はポリオーマウイルス、アデノウイルス2、シミアンウイルス40（SV40）、およびヒトサイトメガロウイルス由来である。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えばSV40起点、初期および後期ブロモーター、エンハンサー、スプライシングおよびポリアデニル化部位は、哺乳動物宿主細胞中で、構造遺伝子の発現に他の遺伝的要素を提供するために使用してもよい。ウイルスの初期および後期プロモーターは、双方ともウイルスゲノムからウイルス複製起点も含んでもよい断片として容易に得ることができる（Fiersら，Nature 273:113，1978）ため、特に有用である。SV40ウイルス複製起点部位に位置するHind III部位からBgl I部位に渡るおよそ250bp配列が含まれているならば、より小さいまたはより大きいS V40断片もまた、使用してもよい。哺乳動物宿主細胞に使用する典型的な発現ベクターはOkayamaおよびBerg（Mol ．Cell．Biol．3:280，1983）に開示されたように構築してもよい。C127ネズミ乳腺上皮細胞で哺乳動物cDNAを安定して高レベルで発現する有用な系は、実質上 Cosmanら（Mol．Immunol．23:935，1986）に記載されたように構築してもよい。 Cosmanら，Nature 312:768，1984に記載された有用な高発現ベクター、PMLSV N1 /N4はATCC 39890として寄託されている。別の有用な哺乳動物発現ベクターはEP- A-0367566号および1991年5月16日に提出された米国特許出願第07/701,415号に記載されている。ベクターはレトロウイルス由来でもよい。天然シグナル配列の代わりに、異種性シグナル配列、米国特許第4,965,195号に記載されたIL-7シグナル配列；Cosmanら，Nature 312:768(1984)に記載されたIL-2受容体シグナル配列；EP367,566号に記載されたIL-4シグナルペプチド；米国特許第4,968,607号に記載されたI型IL-1受容体シグナルペプチド；および EP460,846号に記載されたII型IL-1受容体シグナルペプチドなどを付加してもよい。細菌培養中で産生される組換えタンパク質は、通常、まず宿主細胞の破壊、遠心、不溶性ポリペプチドであれば細胞沈殿物からの、または可溶性ポリペプチドであれば上清液からの抽出の後、1度またはそれ以上の遠心、塩析、イオン交換、アフィニティ精製またはサイズ排除クロマトグラフィー段階により単離される。最後にRP-HPLCを最終精製段階として使用してもよい。微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、都合のよい方法いずれで破壊してもよい。形質転換された酵母宿主細胞は好ましくは、精製を単純化するため、分泌ポリペプチドとしてITAKを発現するために使用される。酵母宿主細胞発酵から分泌された組換えポリペプチドは、Urdalら（J．Chromatog．296:171，1984）に開示されたものと類似の方法により精製してもよい。Urdalらは、分離用HPLCカラム上で組換えヒトIL-2を精製する、2つの連続した逆相HPLC段階を記載している。上述のように、本発明はITAK、IL-1および／またはTNF-αのアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法を提供する。本明細書中で用いる際、「ITAKアゴニスト」はIL-1またはTNF-αを含まない。こうした方法はIL-1およびTNF-αそれぞれの情報伝達経路要素の同定を可能にする。したがって、1つの態様において、本発明は一般的にITAKに関与する遺伝子産物を同定する方法であって：（a）ITAKポリペプチドをコードする核酸配列を、宿主細胞の生存率に本質的であるタンパク質の機能的に不完全な第一の部分を含む融合タンパク質の一部として、ITAK配列が発現されるように第一の発現ベクターに導入し；（b）ITAKと相互作用または関与する複数の候補遺伝子産物をコードする核酸配列を、候補遺伝子産物いずれも、宿主細胞の生存率に本質的であるような当該タンパク質の機能的に不完全な第二の部分を含む融合タンパク質の一部であるように発現されるように第二の発現ベクターに導入し；（c）第一および第二の発現ベクターを、宿主細胞の生存が（宿主細胞の生存率に本質的な）当該タンパク質の第一および第二の機能的に不完全な部分双方が再構成され機能的に完全なタンパク質になることに依存するような条件下で、そして十分な時間をかけて導入し；そして（d）第二の発現ベクター中のITAKと関与する候補遺伝子産物をコードする核酸配列を同定することを含む方法である。例えば、酵母ツーハイブリッド（two-hybrid）系（FieldsおよびSong，Nature 340:245(1989); Fieldsら、米国特許第5,283,173号）は、ITAKおよびその他のタンパク質間、またはITAKおよび選択された化合物間またはプールされた化合物間、ここで化合物はITAK、IL-1およびまたはTNF-αの活性を増加または減少する、またはそうでなければITAKを生物学的シグナルを伝達するため使用すると疑われるもの、の相互作用を検出するために用いてもよい。こうした相互作用は酵母転写因子の機能的な再構成をスクリーニングすることにより検出することもできる。簡潔には、酵母ツーハイブリッド系は2つのタンパク質が直接互いに関与または相互作用しているか調べる方法として開発され、そしてその後、関心事の既知タンパク質または「おとり」と相互作用する候補タンパク質を「捕える」方法として働くように修整された。おとりタンパク質は酵母転写因子GAL4のDNA結合領域との融合タンパク質として、GAL4に制御されるリポーター遺伝子を含む特に設計された酵母株（Y190）で発現される（Durfeeら，Genes & Devel．7:555，1993 ）。GAL4は、モジュラー酵母転写因子であり、DNA結合領域はN末端の147残基の範囲にあり、一方転写活性化機能残基は完全にC末端114残基の範囲にある。ツーハイブリッド系に使用されるライブラリーはGAL4活性化領域融合タンパク質を発現するクローンを有する。この方法は、2つの融合タンパク質が互いに関与するタンパク質をコードする際、GAL4機能を再構成し、DNA結合領域融合体が活性化領域融合体をGAL4プロモーターの位置に誘い、GAL4に調節されるリポーター遺伝子の転写活性化につながるのを検出する。本明細書中に開示されるITAK核酸配列は、当業に周知の方法を用いて、GAL4の DNA結合領域を持つ適切なベクターにクローニングし、そしてGAL4 DNA結合領域／ITAK領域融合タンパク質を発現する酵母細胞を産生するため適切な酵母株を形質転換してもよい。活性化領域cDNAライブラリーはその後、適切なベクター中でスクリーニングしてもよい。こうしたツーハイブリッド検定の陽性信号は ITAKの基質または活性化因子などのITAKと特異的に関与するタンパク質をコードするcDNAクローンに起因する可能性もある。ITAKと関与するタンパク質を知ることは、またIL-1およびまたはTNF-α情報伝達の阻害因子の検索を可能にする。 ITAKおよびその関連タンパク質の機能的相互作用はまた、ITAK/基質またはITA K/活性化因子の関与に干渉し、そしてそれによってIL-1またはTNF-α活性を阻害する小分子のスクリーニングも可能にする。例えば、酵母ツーハイブリッド系は次のように、IL-1およびまたはTNF-α阻害因子のスクリーニングに使用してもよい。ITAKおよび活性化因子／基質、または相互作用能を有するその一部は、それぞれGAL4 DNA結合領域およびGAL4転写活性化領域に融合し、そしてヒスチジンを欠損しているプレート上での培養をGAL4活性に依存する株に導入してもよい。IL -1およびまたはTNF-αの阻害因子を同定するために、成長を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。または、スクリーニングをITAK/活性化因子またはITAK／基質相互作用が成長を阻害するように修飾して、相互作用を阻害することによって成長が見られるようにしてもよい。または、in vitroで、IL-1およびまたはTNF-α阻害をスクリーニングする方法は、ITAKやその部分などの構成要素の1つを、ミクロタイタープレートのウェルに固定すること、またはその他の構成要素に容易に検出できる指示物質（indicator）と共役させることでもよい。相互作用の阻害因子は、ウェルから検出可能な指示物質が欠失していることで同定される。高効率スクリーニング検定もまた、ITAK活性を阻害する化合物を同定するのに使用できる。例えば、植物および海洋性源からの天然産物抽出物及び微生物発酵ブロスは、キナーゼ阻害因子の産生源である可能性があるし、そして潜在的ITAK アンタゴニストのスクリーニングを行うことができる。ITAKアンタゴニストのその他の産生源には、小有機分子のすでに存在するまたは新規に作成されたライブラリー、およびすでに存在するまたは新規に作成されたコンビナトリアルケミストリーライブラリーを含む。内因性のITAK基質の同定、および特異的認識モチーフを決定するためのリン酸化部位の地図作成は、ペプチド擬似阻害因子の開発を可能にする。さらに、ITAK活性のin vivo制御は内因性タンパク質阻害因子を含んでいるようであり、本明細書中に記載される検定を用いて同定することが可能である。こうした検定はまた、内因性基質、活性化因子および前述の天然タンパク質阻害因子のような、生理学的に同等の方法でITAKと相互作用するその他の分子の同定を容易にする。こうした分子は、限定されるわけではないが、受容体および受容体関連ポリペプチド、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Gタンパク質）、グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）、グアニンヌクレオチド活性化タンパク質（GAP）、転写活性化因子、およびリプレッサーを含む。さらにITAK検定を読み出し装置として、情報伝達カスケードに関わるその他の酵素、例えばその他のキナーゼ、ホスファターゼおよびホスホリパーゼの同定に利用してもおよい。したがって、本発明は、IL-1またはTNF-α情報伝達の下流反応経路作用を検定することによって、ITAK、IL-1および／またはTNF-αのアゴニストまたはアンタゴニストを検出する方法を提供する。本発明の１つの側面において、選択された剤がITAKアゴニストであるかどうかを決定する方法は（a）選択された剤を未刺激のITAK反応経路に、経路を刺激させる条件下で十分な時間曝露し；そして（b ）反応経路の刺激を検出し、そしてそこからITAKアゴニストの存在を決定することを含む。関連する側面において、選択された剤がITAKアゴニストかどうか決定する方法は、（a）ITAK反応経路のITAKキナーゼ活性を測定し；（b）選択された剤を測定したITAK反応経路に曝露し；そして（c）反応経路において増加したITA Kキナーゼ活性を検出することを含む。別の側面の範囲内で、本発明はまた、選択された剤がITAKアンタゴニストであるかどうか決定する方法であって：（a）選択された剤をITAKアゴニストの存在下で、経路の刺激を減少させる条件下で十分な時間、ITAK反応経路に曝露し；そして（b）反応経路の刺激の減少を、ITAK アゴニストのみによる反応経路の刺激に比較して検出し、そしてそこからITAKアンタゴニストの存在を決定することを含む方法も提供する。こうした方法は、細胞増殖（Rainesら，Science 243:393，1989）、プロスタグランジン産生（Curti sら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 86:3045，1989）、コロニー刺激因子産生（Cu rtisら，1989）、細胞表面免疫グロブリン上向き制御（up-regulation）（Giriら，J．Immunol．131:223，1984）、NF-κB 活性化（Shirakawaら，Mol．Cell．Biol．9:959，1989）検定または当業者に知られたその他の確立された生物学的情報伝達検定を含んでもよい。関連する側面において、本発明のいうところのITAKポリペプチドは、ITAK阻害因子の設計と共に、IL-1またはTNF-α下流作用の阻害因子の構造に基づく設計に使用してもよい。こうした構造に基づく設計はまた、「合理的薬剤設計」としても知られる。こうした設計には、こうしたITAKポリペプチドの三次元構造を決定し、（分子の静電電位、タンパク質のフォールディングなどについてのITAKの解析と共に、）基質が結合すると思われる部位の三次元構造を決定し、ここで部位は予測される反応部位である、1つ（またはそれ以上）の予測される反応部位を組み込んだ分子を合成し、そして分子がITAKを阻害する活性を決定する段階を含んでもよい（Sudarsanamら，J．Comput．Aided．Mol．Design 6:223，1992）。I TAKポリペプチドは例えば、X線結晶学、核磁気共鳴法または相同性模型制作などいずれも周知である方法いずれを用いて三次元的に解析してもよい。例えば、メタロプロテアーゼの種特異的阻害因子設計のほとんどは、触媒作用を持つ亜鉛原子をキレートまたは亜鉛原子に結合する試みに焦点を当てている。合成阻害因子は通常、特定のプロテアーゼの特異性ポケットに適合するように設計された一連の他の基を結合させた負電荷の部分を含むよう設計される。サイトカイン、IL-1およびTNF-αのみがITAK活性を誘発するらしいため、本発明はこれらサイトカインに対する機能的細胞反応を選択的に遮断する利点を提供する。したがってITAKは、ITAK阻害因子およびしたがってIL-1およびTNF-αの過剰放出作用に対する阻害因子の発見を容易にする。ITAKをその潜在的阻害因子のスクリーニングに使用する、この用法は重要で、そして反応を汚染物質により妨げる可能性を除去または減少させる可能性がある。本発明の別の側面に目を向けると、IL-1活性は、IL-1分子が膜結合型IL-1受容体に結合し、続いてIL-1受容体がIL-1受容体の細胞質領域と関与する細胞質タンパク質と相互作用するすることにより、開始される。例えば、I型IL-1受容体の細胞質領域は、本明細書中ではIIP1と呼び、そして”IL-1 Receptor Interactin g Protein”（U.S.S.N．08/584,831、1996年1月11日提出）と題された出願に大変詳しく記載されているGTP-ase活性化タンパク質（GAP）と関与する。IIP1のようなGAPタンパク質は、Gタンパク質と相互作用し、Gタンパク質は続いて初期情報伝達機能を実行する細胞質作用分子（例えばタンパク質キナーゼまたはイオンチャンネル）と相互作用する。Gタンパク質はグアニンヌクレオチド（GDPまたはGTP）と結合する。Gタンパク質はGTPと結合する際、作用分子と相互作用し、生物学的情報を発生させる（「オン」配置）。逆に、Gタンパク質がG DPと結合する際、相互作用は起こらず、そして生物学的情報は発生しない（「オフ」配置）。Gタンパク質はGTP結合およびGDP結合型間で安定した平衡状態にある。IL-1がIL-1受容体に結合していなければ、IIP1はGTPからGDPへの加水分解を触媒し、GTP結合およびGDP結合Gタンパク質間の平衡をGDP結合「オフ」型に押しやり、したがってIL-1情報を妨げる。IL-1がIL-1受容体に結合する際、IIP1のG タンパク質GTP結合およびGDP結合型との相互作用が遮断され、その結果平衡がGT P結合「オン」型へと移動し、そしてしたがってIL-1情報が伝達される。したがって、IIP1の最終効果はGタンパク質関連情報を抑制する。同様のGタンパク質制御情報伝達経路は、IL-1またはTNF-αに反応しITAK活性誘導を制御する可能性がある。逆に、IL-1またはTNF-αが仲介するITAK活性の誘導が、1つまたはそれ以上のGタンパク質の機能を調節する可能性もある。本明細書中に開示される、既知のグアニンヌクレオチド交換因子（RCC1など（Bischoff およびPonstingl，Nature 354:80，1991））と明白に相同なアミノ酸配列を有するITAKポリペプチド領域は、互いに排除しないこれらの計画どちらとも共存できる。したがって本明細書中で、ITAKの提供は、Gタンパク質関連経路の研究、検出および制御可能性への別の手段を提供する。ITAKは（a）ITAKを制御するまたはITAKに制御される、そしてIL-1またはTNF-α情報伝達に関与するGタンパク質、および（b）IL-1またはTNF-α情報伝達経路に関与しているかもしれない、ITA Kと相互作用するその他のタンパク質を同定するための試薬として使用してもよい。Gタンパク質を含むこれらその他のタンパク質は、さらにIL-1またはTNF-α 情報伝達のその他の阻害因子の検索に有用な道具となる。ITAKはまた、組換えIT AKタンパク質をアフィニティマトリックスに共役させるのに使用してもよい。別の側面において、本発明はまた、ITAKをコードする核酸分子に基づいた核酸プローブをも提供する。こうしたプローブはハイブリダイゼーションおよび当業に知られるその他の検定、例えば候補細胞株または動物系統または種由来の試料などの候補試料中のITAK遺伝子を検出する検定に用いてもよい。こうしたプローブは好ましくは、中程度または高度に厳密な条件（例えばSambrookら、前記を参照されたい）でもよい適切に決定された条件下で、ITAK遺伝子に特異的にハイブリダイズし、そして一般的に少なくとも約15ヌクレオチド、典型的には少なくとも約18ヌクレオチドまたは少なくとも約20ヌクレオチド、そして好ましくは約18 から約35ヌクレオチドそしてさらにより好ましくは数100ヌクレオチドを含む。しかしこうしたプローブは、望ましい場合、全ITAK遺伝子までを含んでもよい。本発明はまた、単鎖核酸配列（RNAまたはDNA）を含むアンチセンスまたはセンスヌクレオチドで、標的ITAK mRNA配列（二重構造を形成する）または二重鎖DNA らせん（三重らせんを形成する）に結合できるヌクレオチドも提供する。こうしたヌクレオチドはしばしば、ITAK cDNAのコード領域断片を含むが、ITAK cDNAの非コード領域断片も含んでもよい。典型的にはこうしたヌクレオチドはITAKに特異的な断片を含む。こうした断片は一般的に少なくとも約15ヌクレオチド、典型的には少なくとも約18ヌクレオチドまたは少なくとも約20ヌクレオチド、そして好ましくは約18から約35ヌクレオチドそしてさらにより好ましくは数100ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質のcDNA配列に基づいてアンチセンスまたはセンスヌクレオチドを生み出す手法は、例えばSteinおよびCohen，Cancer Res． 48:2659，1988およびvan der Krolら，BioTechniques 6:958，1988に記載されている。アンチセンスまたはセンスヌクレオチドを標的核酸配列に結合させることによって、複合体が形成され、二重構造の崩壊の増大、転写または翻訳の早期終止、または他の方法を含むいくつかの方法で、翻訳（RNA）または転写（DNA）が遮断される。したがってアンチセンスヌクレオチドはITAKタンパク質発現を遮断するために使用してもよい。この方法でのITAK発現の遮断は、炎症性疾患状態において治療法として有用である可能性がある。アンチセンスまたはセンスヌクレオチドはさらに、修飾された糖リン酸ジエステル主鎖（またはWO91/06629に記載されたようなその他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、そしてここでこうした糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性がある。耐性糖結合を有するこうしたオリゴヌクレオチドは、in vivoで安定（すなわち酵素による分解に耐性がある）であるが、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性を保持する。センスまたはアンチセンスヌクレオチドのその他の例には、WO90/10448に記載されたような有機部分、およびポリ（L-リジン）のような標的核酸配列ヘのオリゴヌクレオチドの親和性を高めるようなその他の部分に共有結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。さらにまた、エリプチシンなどの挿入剤、およびアルキル化剤または金属錯体をセンスまたはアンチセンスヌクレオチドに結合させ、アンチセンスまたはセンスヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列に対する結合特性を修飾してもよい。アンチセンスまたはセンスヌクレオチドは、標的核酸配列を含む細胞に、例えばCaPO₄が仲介するDNAトランスフェクション、エレクトロポレーション、またはエプスタイン・バーウイルスなどの遺伝子導入ベクターの使用を含む遺伝子導入法のいずれを用いて導入してもよい。アンチセンスまたはセンスヌクレオチドは好ましくは、適切なレトロウイルスベクターにアンチセンスまたはセンスヌクレオチドを挿入し、その後挿入配列を含むレトロウイルスベクターを細胞とin viv oまたはex vivoで接触させることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入する。適切なレトロウイルスベクターには、限定されるわけではないが、ネズミレトロウイルスM-MuLV、N2（M-MuLV由来のレトロウイルス）、またはDCT5A、DCT5BおよびDCT5Cと称す二重コピーベクター（PCT出願US90/02656を参照されたい）が含まれる。センスまたはアンチセンスヌクレオチドはまた、WO91/04753に記載されるように、リガンド結合分子と結合体を形成することにより、標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子には、限定されるわけではないが、細胞表面受容体、成長因子、その他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子の結合体は、実質的に、リガンド結合分子が対応する分子または受容体に結合する能力を妨げたり、あるいはセンスもしくはアンチセンスヌクレオチドまたはその結合体型が細胞に入るのを遮断しない。あるいは、センスもしくはアンチセンスヌクレオチドは、WO90/10448に記載されるように、ヌクレオチド−脂質複合体を形成することにより、標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センスまたはアンチセンスヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性のリパーゼにより細胞内で分離される。別の側面において、本発明はITAKと特異的に相互作用する結合相手を提供する。こうした結合相手は典型的には抗体で、in vivoでIL-1またはTNF-α活性を阻害し、そして試料中のITAKの存在を検出するのに有用である可能性がある。適切なITAK結合相手には、ITAKに免疫的に反応する抗体、および好ましくはITAKに対するモノクローナル抗体、およびITAKに高い親和性で結合できるその他のタンパク質が含まれる。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、F(ab')₂、およびFab断片のようなその断片が、組換えによって産生された結合相手同様含まれる。抗体は、ITAKに約10⁷M^-1より大きいか等しいKaで結合するとき、特異的に結合すると定義される。結合相手または抗体ヘの親和性は、例えばScatchardら，Ann．N.Y．Acad．Sci．51:660(1949)に記載されたもののような、慣用技術を用いて容易に決定できる。例えば本明細書中に記載された酵母ツーハイブリッドスクリーニング系を用いて、他のタンパク質をITAKの結合相手として決定することも可能である。本発明はまた、ITAKに特異的に結合する結合相手および抗体を調製するための、ITAK、およびITAKのアミノ酸配列に基づくペプチドの使用を含む。ポリクローナル抗体であるITAK結合相手は、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットなどのさまざまな産生源から、当業に周知の手法を用いて、容易に産生することが可能である。一般的に、精製ITAKあるいは適切に結合されたITAKのアミノ酸配列に基づくペプチドは、典型的には注射により宿主動物に投与される。ITAKの免疫原性は例えばフロイント完全または不完全アジュバントのようなアジュバントを使用することで高めてもよい。追加免疫後、少量の血清試料を収集しそしてITAKまたはITAKペプチドに対する反応性を試験する。こうした決定に有用なさまざまな検定の例には：逆電流免疫電気泳動（CIEP）、放射免疫検定、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ドットブロット検定およびサンドイッチ検定（米国特許第4,3 76,110号および第4,486,530号を参照されたい）のような手法と共に、Antibodie s:A Laboratory Manual，HarlowおよびLane（監修），ColdSpring Harbor Labor atory Press，1988に記載されるものを含む。ここに提供される単離ITAKによって、ITAKに特異的なモノクローナル抗体が周知の手法を用いて容易に調製される。手法の例としては、米国特許第RE32011号、第4,902,614号、第4,543,439号および第4,411,993号；Monoclonal Antibodies ，Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，Kenne tt，McKearnおよびBechtol（監修），1980; Harlow,前記を参照されたい。簡潔には、マウスなどの宿主動物は、少なくとも1度、そして好ましくは約3週間間隔でに少なくとも2度、単離されそして精製されたITAKまたは結合したITAKペプチドを、任意でアジュバントの存在下で、腹腔内に注射される。マウス血清はその後、慣用ドットブロット技術または抗体捕獲（ABC）により検定し、どの動物が融合に最適かを決定する。およそ2から3週間後、マウスはITAKまたは結合された ITAKポリペプチドで静脈内追加免疫される。マウスはその後、屠殺し、そして確立されたプロトコルにしたがって、脾臓細胞をAg8.653（ATCC）のような商業的に入手可能な骨髄腫細胞と融合させる。簡潔には、当該骨髄腫細胞を培地中で数回洗浄し、そして1つの骨髄腫細胞あたりおよそ3つの脾臓細胞という割合になるようにマウス脾臓細胞を融合させる。融合剤は当業に用いる、例えばポリエチレングリコール（PEG）などの適切な剤いずれを用いてもよい。融合物は、融合細胞を選択的に成長させるような培地を含むプレートにまく。当該融合細胞は、その後、およそ8日間成長させる。結果として生じたハイブリドーマからの上清を回収し、そしてヤギ抗マウスIgでまず覆われたプレートに添加する。洗浄後、¹² ⁵ I-ITAKのような標識をそれぞれのウェルに加え、その後培養する。陽性のウェルは、続いてオートラジオグラフィーによって検出することが可能である。陽性クローンは、全体培養で成長させ、そして引き続いて上清をプロテインAカラム（Pharmacia）上で精製する。本発明のモノクローナル抗体は、Alting-Meesら，”Monoclonal Antibody Exp ression Libraries:A Rapid Alternatibe to Hybridomas,”Strategies in Mole cular Biology 3:1-9(1990)に記載されたもののような、別法を用いて産生してもよい。同様に、結合相手は組換えDNA技術を用いて構築し、特異的に結合する抗体をコードする遺伝子のさまざまな領域を組み込んでもよい。こうした技術は Larrickら，Biotechnology 7:394(1989)に記載されている。「抗体」の他の種類は、本明細書中に提供された情報を当業の知識状熊と組み合わせたものを用いて産生してもよい。例えば、ITAKに特異的に結合できるヒト抗体の構成分子を含むように設計された抗体もまた、本発明に含まれる。一度単離され精製されたITAK結合相手は、確立された検定プロトコルを用いて、試料中のITAKの存在を検出するのに用いてもよい。さらに、本発明の結合相手、典型的には抗体は、in vivoでITAKに結合し、そしてその活性を阻害するため、治療に用いてもよい。こうしたITAK結合相手は、カラムクロマトグラフィーマトリックス、またはITAKを発現する細胞から得られた分子構成要素を同定、分離または精製するのに適当な同様の基質などの固相に結合させてもよい。固相接触表面へのITAKまたはITAK結合タンパク質の接着は、どのような方法で達成してもよく、例えばITAK結合タンパク質を磁気小球体で覆い、そして磁場中でインキュベーション容器に保持してもよい。細胞抽出物はそのすぐ後で、ITAKまたはITAK 結合タンパク質を有する固相に接触させる。ITAKまたはITAK関連種は固定された結合タンパク質に結合し、そして結合しない成分はその後洗い流される。このアフィニティ結合法は、こうしたITAK関連分子を溶液から精製、スクリーニングまたは分離するのに有用である。陽性に選択された構成要素を固相から放出する方法は当業に知られており、そして例えば、pH変化、塩濃度改変またはカオトロピック剤の利用を含む。 ITAKまたはその断片または変異体もまた、それ自体、IL-1および／またはTNF- α情報伝達阻害における治療剤として有用である可能性がある。本発明によって提供されるITAKアゴニストまたはITAKアンタゴニストもまた、単独でまたはITAK またはその断片またはその変異体と組み合わせて、 IL-1および／またはTNF-α 情報伝達阻害における治療剤として有用である可能性がある。ITAKまたはITAKアゴニストまたはITAKアンタゴニストは、リポソームへのITAK（またはそのアゴニストまたはアンタゴニスト）の内包、または特定の種類の細胞を標的としたモノクローナル抗体へのITAKの共役などの周知の方法によって、細胞内環境に導入される。治療剤として使用した際、ITAK、ITAKアゴニストまたはITAKアンタゴニストは、既知の方法により、薬剤組成物に処方することが可能である。好ましい態様において、ITAKは81位のリジン残基が別のアミノ酸に変わる突然変異を含む。例えば、リジンからアラニンへの突然変異を含むITAKA 81として知られるITAK変異体がある。ITAK、ITAKアゴニストまたはITAKアンタゴニストは分野に周知の方法、例えばリポソームへのITAKの内包、または特定の種類の細胞を標的としたモノクローナル抗体へのITAKの共役を用いて細胞内環境に導入してもよい。 ITAK、ITAKアゴニストまたはITAKアンタゴニストは、単独の活性成分としてまたはその他の既知の活性成分と共に、薬剤として適切な希釈剤（例えばＴｒｉｓ −ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、保存剤（例えばチメロサル、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと混合物として組み合わせてもよい。適切なキャリアーおよびその処方は、Remington' s Pharmaceutical Sciences，第16版．1980，Mack Publishing Co.に記載されている。さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（PEG）、金属イオンと複合体を作成した、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物に取り込まれた、またはリポソーム、微小乳剤、ミセル、単層または複層小胞、赤血球ゴーストまたは球状芽細胞に取り込まれた、ITAK、または ITAKアゴニストまたはITAKアンタゴニストを含んでもよい。こうした組成物はIT AKの物理的状態、可溶性、安定性、in vivo放出速度、およびin vivo排除速度に影響するであろう。 ITAKまたはその断片、ITAK変異体またはその断片、ITAKアゴニストまたはその断片、またはITAKアンタゴニストまたはその断片をコードするヌクレオチド配列である本発明の組成物は、遺伝子治療戦術にしたがって治療剤として使用される。一般的に、こうしたヌクレオチド配列は、ベクターに組み込まれ、望ましいヌクレオチド配列の発現につながる；こうしたベクターは当業者により容易に構築できる。さらにこうしたベクターのさまざまな投与法は、当業者に周知である。遺伝子治療のためのこうしたベクターは、レトロウイルスベクター構築物でもよく、または、例えばポリオウイルス（Evansら，Nature 339:385-388，1989;およびSabin，J．Biol．Standardization 1:115-118，1973）；ライノウイルス；カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスのようなポックスウイルス（Fisher-Hochら，PNAS 86:317-321，1989; Flexnerら，Ann．N.Y．Acad．Sci． 569:86-103，1989; Flexnerら，Vaccine 8:17-21，1990;米国特許第4603112号および第4769330号; WO 89/01973）；SV40（Mulliganら，Nature 277:108-114，19 79）；インフルエンザウイルス（Luytjesら，Cell 59:1107-1113，1989; McMich aelら，N．Eng．J．Med．309:13-17，1983;およびYapら，Nature 273:238-239， 1978）；アデノウイルス（Berkner，Biotechniques 6:616-627，1988;Rosenfeld ら，Science 252:431-434，1991）；アデノ関連ウイルスのようなパルボウイルス（Samulskiら，J．Vir．63:3822-3828，1989; Mendelsonら，Virol．166:154- 165，1988）；およびヘルペス（Kit，Adv．Exp．Med．Biol．215:219-236，1989 ）を含むその他のウイルスキャリアーを発展させそして利用してもよい。一度ベクターが調製されれば、ベクターは温血動物に治療目的に投与してよい。上述のように、ベクターの投与法は当業者に周知であり、そして例えば、直接投与、またはリポフェクション（Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7 413-7417，1989）、直接DNA注入（Acsadiら，Nature 352:815-818，1991）；微小発射物衝撃（Williamsら，PNAS 88:2726-2730，1991）；リポソーム（Wangら，PNAS 84:7851-7855，1987）;CaPO₄（Dubenskyら，PNAS81:7529-7533，1984）またはDNAリガンド（Wuら，J．Biol．Chem．264:16985-16987，1989）などのさまざまな物理的方法を用いたトランスフェクションを通じた方法を含む。 ITAKまたはその断片、ITAK変異体またはその断片、ITAKアゴニストまたはその断片、またはITAKアンタゴニストまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む上述の組換えウイルスの1つを含む遺伝子療法のための薬剤組成物が提供される。組成物は溶液として調製してもよいし、固体の形（凍結乾燥など）で調製して投与前に溶液に懸濁してもよい。さらに、組成物は、注射、経口または直腸投与のいずれに対しても適切なキャリアーまたは希釈剤と調製してもよい。一般的に、組換えウイルスは処方前に0.25％から25％の範囲、そして好ましくは約5％から20％の濃度で使用する。続いて、組成物の調製後、組換えウイルスは投与ごとに成分約1μｇを、共に精製された約10倍量（10μｇ）の混入物質と共に組成するであろう。好ましくは組成物は後述のように処方された0.1-1.0ml の水を含む溶液中に調製される。薬剤に認められるキャリアーまたは希釈剤は、使用される投薬および濃度で被投与者に毒性がない。注射可能な溶液のキャリアーまたは希釈剤として代表的な例には、ヒト血清アルブミンなどのポリペプチドやタンパク質と共に、水、好ましくは生理学的pHで緩衝されている（リン酸緩衝生理食塩水またはトリス緩衝生理食塩水）等張塩溶液、マンニトール、デキストロース、グリセロール、およびエタノールがある。特に好ましい組成物は、ベクターまたは組換えウイルスを10 mg/mlマンニトール、1mg/ml HSA、20mMトリス、pH7.2および150mM NaClに含む。この場合、組換えベクターは約成分1μｇに相当するので、高分子量成分の1％より少ないかもしれないし、そして全成分（水を含む）の1/100,000より少ないかもしれない。この組成物は、少なくとも6か月間、-70℃で安定である。組成物は静脈内（i.v．）、皮下（s.c.）、または筋肉内（i.m.）注射してもよい。経口処方もまた、キャリアーまたは希釈剤として、例えば、セルロース、ラクトース、マンニトール、ポリ（DL−ラクチド−コーグリコール酸）球体、および／またはスターチのような炭水化物を使用してもよい。組成物は例えば、錠剤、ゲルカプセル、丸薬、溶液または懸濁液のいずれの形で服用してもよく、そしてさらに、持続放出のために処方してもよい。直腸投与のため、ポリアルカリグルコース、またはトリグリセリドなどの伝統的なキャリアーにより、座薬の調製を行ってもよい。次の実施例は、本発明の態様の例証を提供し、そして添付の請求の範囲で述べられる本発明の範囲を制限すると解釈すべきではない。次の実施例において、記載される全ての方法は異なって特定されない限り、慣用法である。実施例実施例1 ITAK活性の測定クローン化されたITAK遺伝子配列は、まず、単離されそして精製されたウサギ IL-1誘導β-カゼインキナーゼポリペプチド、IL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK ）の部分的アミノ酸配列の比較解析により検出された。クローン化されたヒトヌクレオチド配列はタンパク質キナーゼに特徴的なポリペプチド領域をコードし、そしてITAK由来ペプチドと相同なアミノ酸を示すことが同定された。 ITAK活性は元来、損なわれていない（intact）β-カゼインをリン酸化する能力により検出された（Guesdonら，J．Biol．Chem．268:4236(1993);Guesdonら， Biochem．J．304:761(1994)）。しかし、この精製を通じて使用される検定は第二代ペプチドに基づいた検定である。ITAKが介するβ-カゼインのリン酸化の3つの部位（Ser 57、Ser124およびSer142）は当業に知られる方法により同定された。脱リン酸化されたウシβ-カゼインはその後、以前記載された条件下（Guesdon ら，1993; Guesdonら，1994;前記）でITAKにより³²Pで標識された。放射標識されたβ-カゼインはプロテイナーゼで消化され、そしてその結果生じたペプチドは二次元薄層クロマトグラフィーおよび／または逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）により分離された。単離された放射活性を持つペプチドを、その後、配列分析し、リン酸化受容部位のアミノ酸配列を決定した。ホスホセリンをを含む3つのペプチドがこの方法により同定された。これら3つのセリン残基の周囲の、およびこれらを含む配列を含むさまざまなペプチド基質が、ABI Model 43 0 Peptide Synthesizerにより合成された。すべてのペプチド基質は、ホスホセルロースフィルターへのペプチドの結合を介するように、複数のN末端またはC末端塩基性残基を有するように合成された；これはペプチドに基づくキナーゼ検定の方法としてよく用いられるものである（Glassら，A nal．Biochem．87:566，1978;Casnellieら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 79:282 ，1982）。さまざまな潜在的ペプチド基質の動力学的解析の結果、次のペプチドが標準的ITAK検定のために選択された：標準的なITAK検定において、ITAKを含む10μｌの試料を、2mMのペプチド基質を含む10μｌの2x検定緩衝液（40mMヘペス、pH7.4/20mM MnCl₂／20μＭATP/1μC iγ-(³²P)-ATP）に加え、反応を30℃、20分で進め、その後10μｌのギ酸を加えて停止する。ブランク対照は、ペプチド基質がない状態で行われる検定からなる。反応が停止された後、検定混合物は丸い2.5cmのホスホセルロースフィルター（P81，Whatman、ニュージャージー州フェアフィールド）上に染み込ませ、75mM H₃PO₄で2度洗浄し、そして20mlのホウケイ酸シンチレーションバイアル内に入れ、β−カウンター中でチェレンコフカウントを行う。1分当たりの総カウント、cpm（試料cpmからブランクcpmを除いたもの）を、ペプチド基質に取り込まれたリン酸のピコモルを計算するのに用いる。ITAK活性の1ユニットは、標準検定条件下で1分間に、１ピコモルのリン酸をペプチド基質、RRRHLPPLLLQSWMHQPHQ（配列番号3）に取り込むのに必要なITAK量として定義される。比活性はタンパク質ミリグラムあたりのITAK活性ユニットとして定義される。この検定の大規模なスクリーニングへの適用は、シンチレーション近接検定（SPA）にストレプトアビジンで覆われたSPAビーズと共にビオチン化ITAK基質ペプチドを使用すること、または当業に知られる技術により、ITAK基質ペプチドを蛍光標識で共有的に修飾することを含んでもよい。実施例2 ITAK の精製本実施例は、ITAKタンパク質の部分的アミノ酸配列分析に十分な量の、IL-1により誘導されたウサギ肺ITAKの精製を記載する（表1を参照されたい）。ウサギ肺は、未処置の対照動物組織と比較した際、IL-1αに反応してITAK活性が最も高い増加を示したため選択された。本実施例はIL-1α処置ウサギから取られた70対の肺からのITAK精製を詳細に述べる。簡潔には、ニュージーランドシロウサギ（2.0-2.5kg）の耳に、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で全体積0.5mlとした100μｇ／kg体重のヒト組換えIL-1αを静脈注射した。注射後15分で動物を頚椎脱臼により屠殺し、そして肺を速やかに切除した（2-3分以内）。除去された後、肺はドライアイス上で急速に凍結し、-80℃ で保存した。肺は組織がまだ一部凍っている状態で、水冷した洗浄緩衝液（プロテイナーゼ阻害因子、0.1mMロイペプチンおよび1.0mMフェニルメチルスルホニルフロリド（ PMSF）を含むPBS）中で、氷上で小片に切りわけられた（〜0.5cm³）。細かく刻んだ肺は少なくとも2回、混入した血液タンパク質を除去するために、肺1対当たり100mlの氷冷洗浄緩衝液で洗浄した。一般的に、1度に5対の肺を処理し；したがってそれぞれの洗浄は500mlの洗浄緩衝液で、常に撹拌しながら１０分間行われ、その後緩衝液はデカントおよび吸引により除かれた。 2度目の洗浄後、細かく刻んだ肺組織は、すぐに氷冷したホモジェナイゼーション緩衝液（HB: 25mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH7.5／100mM β−グリセロリン酸／ 25mMパラ−ニトロフェニルリン酸／10mMオルトバナジン酸ナトリウム／2mM DTT （ジチオスレイトール）／1mM MgCl₂／5mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）／5 mM EGTA（エチレングリコールビス（β-アミノメチル）エーテル）N,N,N',N'-四酢酸）／5mMベンズアミジン／1μＭ E-64（トランス−エポキシスクシニル−L −ロイシルアミド−（4−グアニジノ）ブタン）／1mM PMSF／0.1mMロイペプチン）中に置き、そしてさらに細かく刻んだ。細かく刻んだ肺は、最終的に10:1（HB 容積（ml）：組織重量（gm））の比率でホモジェナイズした。初めに、細かく刻んだ肺は、総容積の75％のHB中でホモジェナイズし、 4℃で12,000rpm、30分遠心分離して固体成分を沈殿させ、そして沈殿は残った25 ％の緩衝液で再ホモジェナイズした。ホモジェナイゼーション（75％の緩衝液中での細かく刻んだ組織の）はBrinkm an Homogenizerを#8の設定で20秒間2回用いて行った。固体成分は4℃で12,000rp m、30分遠心分離して除いた。上清は除去し、沈殿物は残った25％のHBに再び懸濁し、そして設定＃8で30秒間再ホモジェナイズした。もう1度4℃で12,000rpm、 30分遠心分離して、不溶性成分を除いた。上清双方は混合し、グラスウールを通して引力ろ過し、さらに浄化した。この調製は、rHuIL-1αで処置されたウサギから単離した70対の肺（湿重量560 グラム）を使用し、5.7リットルの肺ホモジェネートを生じた。肺ホモジェネートは硫酸アンモニウムに対し、25％になるように、4℃で常にゆっくり撹拌しながら、固体の硫酸アンモニウム764グラムを徐々に加えた。全ての硫酸アンモニウムを溶液内に加えた後、撹拌をやめ、そしてホモジェネートは4℃で1晩インキュベートした。0-25％硫酸アンモニウム沈殿は、4℃で12,000rpm、30分遠心分離して回収した。沈殿した沈殿物は4つの等しい群に分け、それぞれ500mlの緩衝液 A（20mMトリス、pH8.5／50mMβ−グリセロリン酸／2mM DTT／1mM EDTA／1mM EGT A/1mM PMSF／0.1mMロイペプチン）に再度溶解した。再溶解した0-25％沈殿物は、緩衝液A（10リットルずつ）を2度交換し、4℃で1晩透析した。透析後、残った不溶性成分は4℃で20,000rpm、30分遠心分離して除去した。その結果生じた上清は、続けてグラスファイバープレフィルター、0.8μｍフィルターおよび最後に0 .45μｍフィルター（Corning、ニューヨーク州コーニング）でろ過した。全てのクロマトグラフィーに使用した緩衝液は、使用前に0.45μｍフィルター（Corning）でろ過した。4つのろ過した群（550-600mlを含む）のそれぞれは、個々にあらかじめ緩衝液Aで平衡化したSource 15Q（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）の25ml（10.5x 1.6cm）カラムに6.0ml/分の流速度で適用した。カラムはその後10総容積（250ml）の緩衝液Aで6.0ml/分の流速度で洗浄した。結合したタンパク質は、56.6分をかけ、6.0ml/分の流速度で緩衝液A中のNaC lを一次勾配で増加（0-0.5M）させて溶出した。4.5mlの分画を回収し、そしてそれぞれの分画から10μｌを用いITAK活性を検定した。クロマトグラフィー段階は、異なる記述がされない限り全て4℃で行った。 ITAK活性は、Source 15QからNaCl濃度が200-300mMの時、溶出された（表1）。 4つの別々のSource 15Q流出から得られた、溶出されたITAK活性を含む分画はまとめ、緩衝液B（10%グリセロールを含む緩衝液A）で1:2に希釈し、そしてあらかじめ緩衝液Bで平衡化したReactive Green 19（Sigma、ミズーリ州セントルイス）の50ml（9.5x 2.6cm）カラムに2.5ml/分の流速度で適用した。添加後、カラムは4総容積（200ml）の緩衝液Bで2.5ml/分の流速度で洗浄した。タンパク質は、Green 19カラムから、80分をかけ、2.5ml/分の流速度で緩衝液A 中のNaClを一次勾配で増加（0-2.0M）させて溶出した。4mlの分画を回収し、そしてそれぞれの分画から5μｌのアリコットを用いてITAK活性を検定した。ITAK 活性はNaCl濃度が1.0-1.5Mの時、溶出された。活性のある分画はまとめ、そして Centriprep 30濃縮装置（Amicon，マサチューセッツ州ビバリー）で最終容積が5 .0mlになるように濃縮した。 ITAK濃縮物はあらかじめ緩衝液Bで平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200サイズ排除クロマトグラフィーカラム（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウエイ）に装填した。タンパク質は2.5ml/分の流速度で緩衝液Bで溶出した。4mlの分画を回収し、そして5μｌのアリコットのITAK活性を検定した。同一の条件下でクロマトグラフィーにかけられたゲルろ過目盛標準（Biorad、カリフォルニア州ハーキュルス）は、ITAKの見かけの分子量を評価するのに用いられ；その溶出は常に分子量〜350kDの位置と一致した。 Superdex 200から溶出されたITAK活性のピーク分画はまとめて、10％NP-40溶液（Pierce、イリノイ州ロックフォード）を適当量加えてNP-40が0.1％になるようにし、37℃で5分間インキュベートし、その後すぐにあらかじめ緩衝液C（0.１ % NP-40を含む緩衝液B）で平衡化したHeparin-Sepharose（Pharmacia）の25ml（ 12.5x1.6cm）カラムに流速度2.0ml/分で適用した。この段階および続く全てのクロマトグラフィー段階は、室温（20℃）で行われた。添加後、カラムは同じ流速度で4カラム容積（100ml）の緩衝液Cで洗浄した。カラムは50分をかけ、2.0ml/ 分の流速度で緩衝液C中のNaClを一次勾配で増加（0- 1.0M）させ展開した。全ての塩勾配で1mlの分画を回収し、そしてそれぞれの分画から2μｌを用いてITAK活性を検定した。ITAKはNaCl勾配領域が175-250mMで溶出された。活性のある分画はまとめ、そしてpHを8.0に合わせた緩衝液Cで1:5に希釈し、3 7℃で5分間インキュベートし、その後すぐにあらかじめpH8.0の緩衝液Cで平衡化した1.0ml HR5/5 MonoQカラム（Pharmacia）に流速度1.0ml/分で適用した。カラムは流速度1.0ml/分で10カラム容積（10ml）の緩衝液C pH8.0で洗浄した後、20 分をかけ、やはり1.0ml/分の流速度で緩衝液C pH8.0中のNaClを一次勾配で増加（0-0.5M）させ展開した。全ての塩勾配で0.5mlの分画を回収し、そしてそれぞれの分画から1μｌを用いてITAK活性を検定した（表1）。ITAK活性はNaCl勾配の 200-250mM部分で、単一のはっきりしたピークとして溶出された。さらにそれぞれの分画から1μｌを除き、プレキャスト8-16% Novex（カリフォルニア州サンディエゴ）勾配ゲルを用いたドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS- PAGE）により解析した。 SDS-PAGEの前に、ITAKを含むMonoQカラムの分画1μｌを、外因性に添加された基質の非存在下で修飾キナーゼ検定条件下（20mMヘペス、pH7.4／10mM MnCl₂／1 0μＭ ATP／0.5μCi γ-(³²P)-ATP、30℃で45分間）でインキュベートした。この過程により以前、〜110-125kDと概算される内因性部分が³²P標識される結果が得られていた。電気泳動後、ゲルを銀染色し、そして放射標識されたバンドはPh osphoImager（Molecular Dynamics、カリフォルニア州サニーベール）を用いて同定した。90、100および110kDと概算される目だって銀染色されたバンドが、IT AK活性に対応して観察された。110kDのバンドおよび2つの弱く染色された120および125kDのバンドは、ゲル上で³²P標識部分と一致する位置に移動した。全ての分子量概算は、同じゲル上で電気泳動されたNovex Wide Range Protein Standa rdsとの直接比較に基づいた。 ITAK活性を有する、溶出されたMonoQカラム分画はまとめ、2.0MＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH7.0でpHを7.0に合わせ、その後4つの別々の群（それぞれ300-400μｌ）にして、あらかじめ緩衝液D（20mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH7.0／10mMβ−グリセロリン酸／1mM DTT／1mM EDTA／2mM EGTA／1mM PMSF／0.１mMロイペプチン／10%グリセロール／0.1%NP-40）で平衡化された60 x 0.75cm Bio-Sil SEC-400 HPLCゲルろ過カラム（BioRad、カリフォルニア州ハーキュルス）に適用した。タンパク質は流速度0.5ml／分でカラムから溶出し、0.5mlの分画を回収し、そしてそれぞれの分画の0.5μｌを用いてITAK活性を検定した。さらに0.5μｌを、上述のように、外因性に添加された基質の非存在下、修飾キナーゼ検定条件下でγ-(³²P)-ATPを用いた³²P放射標識、SDS-PAGEおよび銀染色に用いた。再び9 0および100kDバンドが、ITAK活性と共に溶出し、³²P放射標識された内因性の110 、120および125kDバンドも溶出された。ゲルろ過目盛標準（BioRad）は同一の条件下で、最後のITAK流出直後にクロマトグラフィーにかけられた。ITAK（表1）は、Bio-Sil SEC-400カラム（4流出全て）から常に分子量350kDの溶出容積で溶出された。 HPLCゲルろ過カラムからのITAKを含む分画はまとめ、そしてあらかじめ緩衝液 E（20mMトリス塩酸、pH8.5／1 mMβ−グリセロリン酸／1mM DTT／1mM EDTA／1mM EGTA／1mM PMSF／0.1mMロイペプチン／10%グリセロール／0.1%NP-40）で平衡化された35μｌ（5 x 0.1cm）の小孔MonoQ（Pharmacia）カラムに適用した。ITAK はカラムに50μｌ／分で適用し；複数の適用が必要であり、そしていずれの場合もカラムは280nmの吸光度がベースラインに戻るまで緩衝液Eで洗浄した。最後の添加後、カラムはさらに30カラム容積の緩衝液Eで洗浄した。全ての適用および洗浄は全て流速度50μｌ／分で行った。タンパク質は10分をかけ、50μｌ/分の流速度で緩衝液E中のNaClを一次勾配で急激に増加（0-0.5M）させ溶出した。50 μｌの分画を回収し、そしてそれぞれの分画から0.25μｌを除いてITAK活性を検定した。さらに0.25μｌを除き、上述のように、外因性に添加された基質の非存在下、修飾キナーゼ検定条件下でγ-(³²P)-ATPを用いた³²P放射標識、SDS-PAGE および銀染色に用いた。事実上全ての(>95%)ITAK活性が、（³²P）標識された110、120および125kDのバンド同様、以前観察された標識されていない90および100kDバンドを含む単一の分画（分画#12、表1）に溶出された。ITAKを含む分画のおよそ1/3を用い、分離ゲル電気泳動を行った。試料はまず、上述のように内因性に³²Pで標識し、その後還元し（100℃で30分間、過剰のDTTを用いる）そしてその後、暗所で過剰のヨード酢酸によりアルキル化した。電気泳動は8-16％プレキャストNove x勾配ゲルを用いて行い、そして100V（定常電圧）で30分、その後150V（定常電圧）でさらに90分泳動した。電気泳動後、ゲルはクーマシーブリリアントブルー G-250で染色し、脱染色し、サランラップを巻いてPhosphorImagaerにより放射標識されたバンドを同定するためにStorage Phosphor Screenに曝露した。放射標識されたバンドを含む、ITAK活性と共に精製されたバンドは、ゲルから切り出され、当該分野に知られる修飾技術を用いてゲル内トリプシン消化した（Henzelら，Methods:A Companion to Methods in Enzymology 6，pp．239-247，1994）。ゲルの放射活性を持つ領域から切り出した3つの薄片は、同時に電気泳動されたWide Range Protein Standards（Novex、カリフォルニア州サンディエゴ）との比較に基づき、110、120および125kDの分子量を有するタンパク質を含むと概算された。これらのゲル薄片は、チェレンコフカウントされ、そしてそれぞれ3. 0 x10⁵、6.9 x10⁵および8.3 x10⁵cpmを含んでいた。ゲル内トリプシン消化はこれらのゲル薄片上で、配列解析できる等級のトリプシン（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を1:10（w/w）の比率で用いて行った。消化は20mM NH₄HCO₃ 、pH8.0中で、37℃、16時間行った。その結果生じたペプチドは、60％アセトニトリル／5％ギ酸中で、ペプチドの回収を容易にするために、37℃でのインキュベーションおよび超音波処理両方を行って、ゲル小片から抽出することにより単離した。回収されたペプチドは、簡単に真空濃縮し（Speed-Vac SC 100，Savant、ニューヨーク州ファーミングデール）、アセトニトリルの大半を除去し、その後、あらかじめ0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）で平衡化したキャピラリーC₁₈（Vydac、カリフォルニア州ヘスペリア）カラムに、成分を流速度15μｌ／分で適用することにより分離した。装填後、キャピラリーカラムは0.1％TFAを用い15μｌ／分で徹底して洗浄した。ペプチドはアセトニトリルの上昇勾配（0-90％、1.0％／分）により90分かけて溶出した。溶出したペプチドは分光光度計により214nmでモニターし、そして分画は手で回収された。110および120kDバンドのトリプシンペプチド地図は、実質的に同一であり、そして125kDバンドの地図はこれほど明らかではないが同様であり、このことによりこれら3つのバンドが同一のタンパク質の修飾された型であるらしいことが示唆された。それぞれの分画の小量（3-5％）は、Lasermat Mass Analyzer（Finnigan MAT）およびまたは三重四極質量分析（エレクトロスプレーイオン化と併用したFinnigan MAT TSQ 700）を用いたMALDI（マトリックス補助レーザー放出質量分析）により解析し、そして残った部分で、ABI 476AまたはABI 494自動タンパク質配列解析機のいずれかを用いて、エドマン分解による配列解析を行った。これら3つの放射標識されたバンド由来のペプチドのさらなる解析は、110、120および125kDバンドが関連しているという仮説を裏付けた。 ITAKは次の配列を有することが見い出されている：他のキナーゼとの相同性を基にすると、配列番号4として示された配列は、キナーゼサインモチーフの切断型に類似している（Hanksら，Sciecne 241:42，198 8）。この分子がキナーゼであると同定する、このウサギITAK配列断片の存在により、やはりキナーゼモチーフを含む別個の生物学的産生源成分由来のcDNAクローン（実施例3、4を参照されたい）の配列比較が可能になった。こうした部分的クローン1つの翻訳物は、ヒト樹状細胞cDNAサブトラクトライブラリーから生成されそしてHH0381と呼ばれているが、このcDNAクローンは配列番号4と同一の配列を含むことがわかった。HH0381 cDNAの伸長型はクローン7と呼ばれているが、精製されたウサギITAKペプチドに同定された配列番号4および5に示されたアミノ酸配列双方に翻訳される、ヒトcDNA由来のヌクレオチド配列を含むことがわかった。さらに精製ウサギ肺110、120および125kD ITAKから生成されたトリプシンペプチド中に存在するその他のアミノ酸配列もまた、クローン7にコードされることがわかった。これらの共通の配列はここに配列番号6および配列番号7として示される。表1 IL-1α誘導ウサギ肺からのITAKの単離および精製＊概算、正確な測定を行うには薄すぎた＄ 280nmでの吸光度および銀染色に基づいた概算 [] 高バックグラウンドおよび阻害のため検定不能 {} 異常に低い、比活性はHS添加に基づく実施例3 ヒト樹状細胞cDNAライブラリーのヒトキナーゼ遺伝子配列の同定ヒト樹状細胞（DC）は新たに集められたヒト骨髄から次のように精製された。骨髄細胞は、Ficoll密度勾配により分画化し、そしてCD34+骨髄細胞を、製造者の指示に従い、Ceprate LC CD34ビオチンキット（CellPro、ワシントン州ボセル）を用いて、高密度（軟層（buffy coat））分画から単離した。簡潔には、軟層細胞はビオチン化したモノクローナル抗CD34抗体とインキュベートし、通常の生理食塩水を含む緩衝液で洗浄し、そして細胞懸濁を固相固定したストレプトアビジンのカラムに装填した。CD34+細胞は、ストレプトアビジン−ビオチン親和性結合によりカラムに吸着し、一方、CD34-細胞はカラム流出物と共に洗い流された。陽性に選択されたCD34+細胞はその後、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用が抗体およびその同種のリガンド、CD34との相互作用より高い親和性を有するため、しなやかなカラムを機械的に絞ることにより、放出された。 CD34+細胞は37℃で、湿度を与えたインキュベーター（10% CO₂）内で、2週間、10%ウシ胎児血清、20ng/ml顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、20ng/ml IL-4、20ng/ml TNF-α、および100ng/ml FLT3リガンドを補ったスーパーマッコイの培地（Super McCoy's medium）中で、培養した。培養物から回収した生存細胞は、既知のDC細胞表面マーカーCD1aおよびHLA-DRの発現を、これらのマーカーに特異的な抗体を用いて、蛍光標示式細胞分取器（FACS）により、さらに選択した。 CD1a+/HLA-DR+総DC RNAは、グアニジニウムチオシアネート塩化セシウム勾配遠心（標準プロトコールは、Sambrookら，Molecular Cloning:A Laboratory Man ual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）を参照されたい）により単離された。ポリアデニル化されたRNAは、製造者の指示にしたがって、オリゴdT共役ラテックスビーズ（Quiagen、カリフォルニア州チャツワース）上で精製した。プラスミドpBluescristSK(-)（Stratagene、カリフォルニア州ラホラ）中のDC cDNAライブラリーは、本質的にLarsenら，J． Exp．Med．172:159(1990)に記載されたとおりに調製した。簡潔にはおよそ1μｇのポリA+DC RNAを、Timesaver cDNAキット（Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用い、ランダム６量体プライマーおよび逆転写酵素を用いて、二重鎖cDNAに変換した。cDNA反応は平均して約400bpのcDNAサイズを生成するように最適化した。二重鎖cDNAはBglIIアダプター（Larsenら、前記に記載）により修飾し、そして、BamHIで直線化しそして同様にBglIIアダプターにより修飾したpBluescristSK(-)に連結した。組換え構築物は大腸菌中に形質転換した。ヒトDC cDNAライブラリーのサブトラクトハイブリダイゼーションは、ヒト繊維芽細胞cDNAライブラリーを用いて行い、DCライブラリーに好んで含まれるcDNA を濃縮した。簡潔には、pBluescrist中のDC cDNAライブラリーは、単鎖のファージミド（phagemid）に変換し、そして当該単鎖ファージミドはヒト包皮繊維芽細胞から調製されたSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを含む修飾λgt10ベクター中の、ドライバーcDNAライブラリーの挿入物から転写されたビオチン化されたRN Aと共にサブトラクションした。関与する方法の一般的な記載には、Klarら（Cel l 69:95(1992)）およびOwenら（Mol．Cell．Biol．11:4177(1991)）を参照されたい。サブトラクションから回収された単鎖ファージミドは、大腸菌に再度形質転換した。個々のコロニーを単離し、そしてプラスミドDNAを調製し、そしてダイターミネーター（dye terminator）法（ABI Prism DyeDeoxy Kit，Perkin-Elm er、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて配列解析した。それぞれのプラスミドは、ベクターに特異的な、BamHIクローニング部位に隣接したプライマーを用いて一方向に配列解析した。配列は、BLASTアルゴリズム（Altschulら，J．Mol．Biol．215:403，1990）を用い、重複を含まないタンパク質およびヌクレオチドデータベース配列（米国バイオテクノロジー情報センター（National Ctr．for Biotechnol．Infomation（NCBI））、メリーランド州ベセスダ）と比較した。クローンHH0381（542nt）のITAK cDNA挿入物の翻訳により、以前ウサギ肺ITAKトリプシンペプチドで検出された（実施例2を参照されたい）GAFGEATLYRアミノ酸配列（配列番号4）をコードすることがわかった。翻訳されたHH0381配列はまた、NCBIデータベース中のいくつかのタンパク質キナーゼの触媒領域とも相同性を示した。HH0381がコードする部分的ITAKアミノ酸配列は、データベース中のタンパク質キナーゼ配列の中でも、ネズミneklタンパク質（Letwinら，EMBO J．11:354，1992）の対応する部分と最も強い配列相同性（ 30％より高い同一性）を示した。実施例4 ITAKをコードする全長遺伝子のクローニング ITAKをコードする全長ヒト遺伝子を同定するため、HH0381ヒトcDNAクローン挿入物を、標準的な方法にしたがったランダムプライマー法（Sambrookら、前記）により³²P標識し、製造者の推奨にしたがって、λZAPIIベクター（Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ）を用いて調製したヒト樹状細胞cDNAライブラリーをスクリーニングするプローブとして用いた。簡潔には、クローンHH0381（542bp）のcDNA挿入物はプラスミドから切り出し、ゲル精製し、Prime-It IIキット（Str atagene、カリフォルニア州ラホヤ）により³²P放射標識し、そしてバクテリオファージλベクターであるλZAPIIベクター（Stratagene）中に調製した別のDC cD NAライブラリーのプローブとして用いた。この二番目のDC cDNAライブラリーは、より大きな平均サイズ（400bpではなく約1000bp）のcDNA分画が用いられた以外は、上述のDCライブラリーと同じDC mRNAから調製された。cDNA末端は、Times aver cDNA合成キット（Pharmacia）に含まれるEcoRIアダプターで修飾し、そしてEcoRI消化したλZAPIIに連結した。陽性クローン1つを、HH0381由来のプローブとのハイブリダイゼーションに基づいて選択し、そして精製および再ハイブリダイゼーションの周期を続けることにより単離した。クローン7と称すこのクローンの挿入物はダイターミネーター法により配列解析した。図１（配列番号8）は、クローン7（ヌクレオチド1-2040）およびクローン16-1 （ヌクレオチド2041-3264）のITAKをコードするｃＤＮＡ挿入物の合成ヌクレオチド配列を示す。読み枠の翻訳されたアミノ酸配列（640アミノ酸）は対応するヌクレオチド配列の下に示されている。クローン7挿入DNAコード配列を検討すると、翻訳によりアミノ酸配列中にキナーゼサインペプチド配列GRGAFGEATLYR（ Hanksら，Science 241:42，1988）をコードすることが示された。当該配列の一部、GAFGEATLYRは、配列番号4としてウサギITAKトリプシンペプチドに同定されている（実施例2を参照されたい）。配列番号4-7のITAKペプチドを含む、別のウサギITAKトリプシンペプチドのアミノ酸配列もまた、ヒトクローン7DNA配列の一部にコードされることが見い出された。クローン7は開始メチオニン残基をコードする配列を含むが、クローン7が全長ITAK読み枠（ORF）をコードするDNA配列を含んでいるようではなかった。残りのITAK ORFをコードする配列を同定するため、クローン7配列データから、別のヒトcDNAライブラリーでのハイブリダイゼーションに使用するための新たなDNAプローブを設計した。918bpのDNAプローブを、次のようにクローン7挿入配列から調製した：まず断片をここに示すプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅した：鋳型DNA（〜2 x10⁶ファージ）はヒト上皮ガン細胞株KB（ATCC CCL17）からλg t10中に作成したヒトcDNAライブラリーからなった。50μｌの増幅反応は、鋳型（〜2 x10⁶ファージ）に加え、25pmolのそれぞれのプライマー、10mMＴｒｉｓ− ＨＣｌ、pH8.3、1.5mM MgCl₂、50mM KCl、それぞれ200μＭのdATP、dGTP、dCTP 、dTTP、および2.5ユニットのTaqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim、インディアナ州インディアナポリス）を含んだ。反応条件は：1周期の（5分、94℃；1 分、64℃；2分、72℃）；29周期の（1分、94℃；1分、64℃；2分、72℃）に続き；5分、72℃であった。次に、この増幅された、クローン7由来の断片から、50pmolの3'プライマー（G TCGTCCATATTCGCCACAG）（プライマー（b）上記；（配列番号10））、10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH8.3、1.5mM MgCl₂、50mM KCl、それぞれ20μＭのdATP、dGTP、dTTP、1μＭ dCTP、100μCi[α-³²P]dCTP、および5ユニットのTaqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を含む100μｌの増幅反応中に、鋳型として7.5ngの断片を用いてプローブを作成した。反応条件は：5分、94℃に続き；29周期の（1分、94℃；1分、5 5℃；2分、72℃）に続き；5分、72℃であった。取り込まれなかった放射活性は、プローブをSephadex G-50（Pharmacia）に通過させて除去した。放射標識された918bpのプローブはその後、λgt10中に作成されたヒト皮膚繊維芽細胞ライブラリー（Simsら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 86:8946，1989）の500,000個のプラークをスクリーニングするのに用いられた。複数（60以上）の陽性プラークが同定された。およそ20の陽性一次プラークを選択し、そしてクローン7配列由来のプライマーおよびλgt10ベクター由来のプライマーを組み合わせて増幅することにより解析した。使用したプライマーは：プライマー（d）、（e）および（f）を用いて生成された増幅産物サイズの解析により、11-1および16-1と称すクローンは、クローン7に存在していなかった、ITAKコード領域の残り（C末端側）を含むと期待されうることがわかった。この結論は、これら2つのクローンからのPCR産物を直接DNA配列決定することにより立証された。繊維芽細胞および樹状細胞由来のクローンのDNA配列解析により、いくつかの変異配列が示された。例えば、図１Ａ（配列番号8）のヌクレオチド419は樹状細胞由来のクローン（クローン7および2）では「A」であり、そして繊維芽細胞由来のクローンでは「T」である。しかし、このヌクレオチド変異はサイレントであり、どちらの場合もコドンはIleとなる。さらにヌクレオチド443は樹状細胞クローン7および2では「C」が見い出され、繊維芽細胞クローン3および16では「 T」が見い出される。この変異もサイレントである。サイレントでない変異はヌクレオチド1405に見られ；繊維芽細胞クローン3、11および16は「A」（Hisコドン）を有する一方、樹状細胞クローン2および7は「G」（Argコドン）を有する。さらにクローン16はヌクレオチド1649に、36塩基挿入を有する。この小さい挿入は通常、成熟mRNAではスプライシングされるイントロンであるようである。その他記載された変異部位の原因は天然ポリモルフィズムであるようである。それぞれの変異体は少なくとも2つの別個に由来したクローンで見い出されるため、これらの改変がクローニングの間に導入されたとは考えにくい。したがって、クローン7および11-1の合成物は、ITAKの完全な読み枠をコードする（図1）。読み枠は長さ979アミノ酸である。タンパク質セリン／スレオニンキナーゼに相同性を持つITAK領域は、N末端の〜300アミノ酸（アミノ酸〜50-300 ）にある。最も近縁なのはneklと呼ばれるキナーゼ（GenBank寄託番号S25284）である。アミノ酸〜300-750に対応するITAK領域は、低分予量Gタンパク質ranおよびTC4に対するグアニンヌクレオチド交換因子ファミリーに相同性を有する。最も近縁なものはRCCl（GenBank寄託番号A26691、BischoffおよびPonstingl，Na ture 354:80，1991）と呼ばれている。 DNA配列決定はダイターミネーター法およびカスタムプライマーを用いてABI/P erkin Elmer 373および377自動DNA配列解析機により行った。実施例5 cDNAライブラリーからのITAKの直接ポリメラーゼ連鎖反応クローニング ITAKポリペプチドの全コード領域を含むcDNAは細胞RNAから、適切なベクターにサブクローニングするのに適した形で増幅される。ITAKを発現することが知られる適切な細胞産生源、例えばヒト樹状細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞またはKB細胞（実施例3および4を参照されたい）のRNAは第一鎖cDNA合成の鋳型として使用される。簡潔には、1-5μｇの全RNAを12μｌ最終容積中で0.5μｇのオリゴdT₁ _2-18 プライマーと混合し、そして70℃で1分間熱し、その後氷上で冷やす。上記の混合物に2μｌの10 x PCR緩衝液（200mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH8.4、500mM KC l）、2μｌの25mM MgCl₂、2μｌの10mM混合dNTP（それぞれ10mMのdATP、dGTP、d CTPおよびdTTP）および2μｌの0.1Mジチオスレイトールを加え、そして反応を42 ℃で5分進ませる。Superscript RTII逆転写酵素（200ユニット）（GibcoBRL、メリーランド州ゲイザーズバーグ）を反応に加え、42℃で50分間反応を進め、そして70℃で15分間インキュベーションして停止し、その後混合物は氷上に置く。RN ase H（4ユニット）（GibcoBRL）を反応に加えそして37℃で20分間インキュベートする。 ITAKをコードするcDNAを生成するため、それぞれのプライマー25pmol、10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH8.3、1.5mM MgCl₂、50mM KCl、それぞれ200μＭのdATP、d GTP、dCTPおよびdTTP、および2.5ユニットのTaqポリメラーゼ（Boehringer Mann heim、インディアナ州インディアナポリス）を含む50μｌポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において、第一鎖をcDNA2μｌ鋳型として用いる。反応条件は：1周期の（5分、94℃；1分、64℃；2分、72℃）；29周期の（1分、94℃；1分、64℃；2分、72℃）に続いて；5分、72℃である。適切なプライマーには次の配列が含まれるはずである： ITAKコード部分を咄乳動物発現に適したベクター、例えば発現プラスミドpDC3 04（sfNACV，Immunex、ワシントン州シアトル）または当業に周知のその他の発現ベクターにクローンするために、単離されたPCR産物断片を適切な制限酵素、例えばpDC304の場合NotIにより切断し、そして次に制限酵素部位をT4 DNAポリメラーゼおよびdNTPで埋め込むことにより平滑末端化したベクター中に連結する（Sambrookら、前記）。また別に、プライマーは例えばその5'端のNotI制限酵素部位を合成してもよい：この例では、単離されたPCR産物はNotIで消化され、そして中間の末端埋め込み段階なしにNotI切断ベクターに連結される。本発明の特定の態様が、例証の目的でここに記載されたが、前記より、本発明の思想および範囲から逸脱せずに、さまざまな修飾がなされてもよいとみなされるであろう。したがって、本発明は添付した請求の範囲によるもの以外に、制限されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者バード，ティモシー・エイアメリカ合衆国ワシントン州98110，ベインブリッジ・アイランド，オラリー・ドライブ・ノース・イースト 10804 (72)発明者アンダーソン，ダーク・エムアメリカ合衆国ワシントン州98107，シアトル，ノースウエスト 3616 シックスティフォース・ストリート

Claims

【特許請求の範囲】 1. IL-1/TNF-α活性化キナーゼまたはその変異体をコードする単離核酸分子。 2. (a) ヌクレオチド番号1からヌクレオチド番号2940までの配列番号1のヌクレオチド配列；（b）中程度に厳密な条件下で（a）の核酸分子にハイブリダイズでき、そしてITAKをコードする核酸分子；および（c）（a）または（b）の核酸分子に関して、遺伝暗号の結果、縮重しており、そしてITAKをコードする核酸分子、からなる群から選択された配列を含む、請求項1に記載の単離核酸分子。 3. 前記分子がアミノ酸番号1からアミノ酸番号979までの配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項1に記載の単離核酸分子。 4. 前記分子がヒトIL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）をコードする、請求項1に記載の単離核酸分子。 5. 請求項1-4のいずれかに記載の核酸分子を含む組換えベクター。 6. 請求項1-4のいずれかに記載の核酸分子に、機能可能であるように連結したプロモーターを含む組換え発現ベクター。 7. 請求項5または6に記載のベクターを含む宿主細胞。 8. 単離IL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）、またはその変異体。 9. アミノ酸番号1からアミノ酸番号979までの配列番号2のアミノ酸配列を有する、請求項8に記載の単離IL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）。 10. IL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）をコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズできる少なくとも15ヌクレオチド長の核酸プローブ。 11. IL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）のキナーゼ活性を調節する剤をスクリーニングする方法であって：（a）候補剤を生物学的に活性があるITAKと、候補剤が前記ITAKのキナーゼ活性を調節する条件下で十分な時間接触させ；そして（b）ITAKキナーゼ活性を調節する候補剤の能力を測定することを含む前記方法。 12. さらに当該候補剤を単離することを含む、請求項11に記載の方法。 13. 選択された剤がIL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）アゴニストであるかどうか決定する方法であって：（a）選択された剤を未刺激のITAK反応経路に、経路を刺激する条件下で十分な時間曝露し；そして（b）反応経路の刺激を検出し、そしてそこからITAKアゴニストの存在を決定することを含む前記方法。 14. 選択された剤がIL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）アゴニストであるかどうか決定する方法であって：（a）ITAK反応経路のITAKキナーゼ活性を測定し；（b）選択された剤を測定されたITAK反応経路に曝露し；そして（c）反応経路中の、増加したITAKキナーゼ活性を検出することを含む前記方法。 15. 選択された剤がIL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）アンタゴニストであるかどうか決定する方法であって：（a）選択された剤をITAKアゴニストの存在下で、ITAK反応経路に、経路の刺激を減少させる条件下で十分な時間曝露し；そして（b）ITAKアゴニストのみによる反応経路の刺激と比較して反応経路の刺激の減少を検出し、そしてそこからITAKアンタゴニストの存在を決定することを含む前記方法。 16. ITAKアゴニスト。 17. ITAKアンタゴニスト。 18. 哺乳動物β-カゼインでなく、そして少なくとも40nmolリン酸／mgタンパク質／分の速度で単離ITAKによりリン酸化されうる、ITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列。 19. IL-1/TNF-α活性化キナーゼ（ITAK）活性を検出する方法であって：（a）ITAKを哺乳動物β-カゼインでないITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列に、ATPの存在下で、ATP供与体からITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列にγ -リン酸基が輸送される条件下で十分な時間接触させ；そして（b）ITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列により取り込まれたリン酸を測定することを含む前記方法。 20. 当該ITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列がアミノ酸配列： Arg-Arg-Arg-His-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro- His-Gln（配列番号3）を有する、請求項19に記載の方法。 21. ATPがγ-（³²P）-ATPである請求項19に記載の方法。 22. アミノ酸配列： Arg-Arg- Arg-His-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Leu-Gln-Ser-Trp-Met-His-Gln-Pro -His-Gln（配列番号3）を含むITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列。 23. 治療に有効な量のITAKアンタゴニストを患者に投与することを含む、 IL-1またはTNF-αが介する炎症性障害を治療する方法。 24. 試料中のITAKを検定するキットであって：哺乳動物β-カゼインでなく、そして少なくとも40 nmolリン酸／mgタンパク質／分の速度で単離ITAKによりリン酸化されうる、ITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列；および ITAKリン酸化基質ペプチド受容体配列に取り込まれたリン酸を測定する手段を含む前記キット。 25. ITAKと関与する遺伝子産物を同定する方法であって；（a）ITAKポリペプチドをコードする核酸配列を、ITAK配列が、宿主細胞の生存率に本質的なタンパク質の機能的に不完全な第一の部分を含む融合タンパク質の一部として発現されるように、第一の発現ベクターに導入し；（b）ITAKと関与する複数の候補遺伝子産物をコードする核酸配列を、候補遺伝子産物がいずれも、宿主細胞の生存率に本質的な当該タンパク質の機能的に不完全な第二の部分を含む融合タンパク質の一部として発現されるように、第二の発現ベクターに導入し；（c）第一および第二の発現ベクターを、宿主細胞の生存が、第一および第二の機能的に不完全な部分双方が再構成され、機能的に完全なタンパク質になることに依存するような条件下で、そして十分な時間をかけて導入し；そして（d）生存宿主細胞を同定し、そしてそこから第二の発現ベクター中のITAK と関与する候補遺伝子産物をコードする核酸配列を決定することを含む方法。 26. 宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項25に記載の方法。 27. 酵母が酵母株Y190であるような請求項26に記載の方法。 28. 宿主細胞の生存率に本質的なタンパク質がモジュラー酵母転写因子GAL4 である、請求項26に記載の方法。 29. 宿主細胞の生存率に本質的なタンパク質の機能的に不完全な第一の部分が、モジュラー酵母転写因子GAL4のN末端147アミノ酸を含む、請求項26に記載の方法。 30. 宿主細胞の生存率に本質的なタンパク質の機能的に不完全な第二の部分が、モジュラー酵母転写因子GAL4のC末端114アミノ酸を含む、請求項26に記載の方法。 31. 宿主細胞の生存率に本質的なタンパク質の機能的に不完全な第一の部分が、モジュラー酵母転写因子のDNA結合領域を含む、請求項25に記載の方法。 32. 宿主細胞の生存率に本質的なタンパク質の機能的に不完全な第二の部分が、モジュラー酵母転写因子の転写活性化領域を含む、請求項25に記載の方法。