JPH09510861A - 新規な蛋白質チロシンホスファターゼに対するヌクレオチド配列の一次構造および機能性発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、２つの新規な蛋白質チロシンホスファターゼのクローニングに関する。これらのホスファターゼ（ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２）をコードする核酸配列ならびにアンチセンス配列も提供される。組換え的に製造されたＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２蛋白質、ならびにこれらの蛋白質に対する抗体もまた提供される。ホスファターゼを単離する方法、核酸配列を使用する方法およびホスファターゼを使用する方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な蛋白質チロシンホスファターゼに対するヌクレオチド配列の 一次構造および機能性発現発明の分野 本発明は、２種類の新規な蛋白質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）をコード する核酸の単離およびクローニングに関するものである。詳細には本発明は、ヒ ト神経膠芽腫ｃＤＮＡ由来のＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２と表示される２種類の ＰＴＰを単離およびクローニングすることに関するものである。本発明は、単離 されたＰＴＰ核酸配列；単離されたＰＴＰアンチセンス配列；それらの核酸配列 を含むベクター；ＰＴＰ発現の増大、低下、または異なる制御を示すように、組 換えベクターにより形質転換された細胞、細胞株および動物宿主；それらの配列 と実質的に類似または相同の配列を同定するための単離されたプローブ；実質的 に純粋なＰＴＰ蛋白質およびその変異体またはフラグメント；これらのＰＴＰお よびその変異体またはフラグメントに結合する抗体または他の物質；これらのＰ ＴＰの活性をアッセイする方法；ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２の制御を評価する 方法；ならびにこれらのＰＴＰの発現または活性に影響を及ぼす可能性のある薬 物を同定および／または試験する方法を提供する。背景技術の簡単な説明 蛋白質チロシンのリン酸化は細胞の成長、増殖および分化の制御において本質 的な役割を果たす（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５０：８２３− ８２９１）。この動的プロセスは蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）および蛋白 質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）の反対平衡活性により調節される。最近の 細胞内シグナリング経路の解明によって、ＰＴＫに関する重要な役割が明らかに なった。Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）（Ｓｕｈ，Ｐ．−Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（ １９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：５４１９ −５４２３）、およびＳｒｃホモロジー３（ＳＨ３）（Ｍａｙｅｒ，Ｂ．Ｊ．ｅ ｔ ａｌ ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：２７２−２７５）ドメインな どの保存ドメインが、活性化ＰＴＫとシグナル伝達分子との相互作用を決定す ることが見出された（Ｐａｗｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｓｃｈｉｅｓｓｉｎｇｅｒ ，Ｊ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．３：４３４−４４２；Ｋｏｃｈ ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：６６８−６ ７４に概説）。それらの蛋白質相互作用の全体的作用は、チロシン残基における 蛋白質のリン酸化および脱リン酸化が主要な事象であるシグナリングカスケード の形成である。それらのシグナリングカスケードにＰＴＰが関与していることが 、この広範な蛋白質ファミリーの代表的数種類の作用の制御およびメカニズムに 関する研究から明らかになり始めた。

ＰＴＫと同様にＰＴＰもそれらの二次構造に従って２つの広い群、すなわち細 胞質分子およびトランスメンブラン分子に分類することができる（Ｃｈａｒｂｏ ｎｎｅａｕ，Ｈ．，ａｎｄ Ｔｏｎｋｓ，Ｎ，Ｋ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅ ｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．８：４６３−４９３；Ｐｏｔ，Ｄ．Ａ．，ａｎｄ Ｄ ｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３６：３５−４３に概説）。トランスメンブランＰＴＰはレセプターの構造 オーガニゼーションをもち、従って外的刺激に応答して細胞性シグナリングを開 始する能力をもつ。これらの分子は１つのトランスメンブランセグメントおよび ２つの縦列ＰＴＰドメインの存在を特色とし；１つのＰＴＰドメインをもつトラ ンスメンブランＰＴＰはわずか２例、すなわちＨＰＴＰ−Ｐ（Ｋｒｕｅｇｅｒ， Ｎ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９：３２４１−３２５２ ）およびＤＰＴＰ１０Ｄ（Ｔｉａｎ，Ｓ．−Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｃｅｌｌ ６７：６７５−６８５）が知られているにすぎない。

非レセプターＰＴＰは１つの触媒ドメインを示し、さらに非触媒アミノ酸配列 を含み、これは分子の細胞内局在を制御すると思われ、基質特異性の決定に関与 する可能性があり（Ｍａｕｒｏ．Ｌ．Ｊ．，ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．（１ ９９４）ＴＩＢＳ １９：１５１−１５５）、またＰＴＰ活性の制御物質である ことも示唆されている（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｈ．，ａｎｄ Ｔｏｎｋｓ， Ｎ，Ｋ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：４６３−４ ９３）。ＰＴＰ１Ｂ（Ｔｏｎｋｓ，Ｎ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂ ｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．２６３：６７３１−６７３７）は、そのＣ−末端３５アミ ノ酸により小胞体のサイトゾル表面に局在する（Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，Ｊ．Ｖ． ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：５４５−５６０）。カルシウム 依存性の中性プロテアーゼ、カルパインによるＰＴＰ１Ｂの蛋白質分解性開裂が この標的配列から上流で起こり、小胞体からサイトゾルへのこの酵素の再局在が 起こる；このような再局在はＰＴＰ１Ｂ酵素活性の２倍刺激に付随する（Ｆｒａ ｎｇｉｏｎｉ，Ｊ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：４ ８４３−４８５６）。同様にＴ細胞ＰＴＰの１１ｋＤａ Ｃ−末端ドメイン（Ｃ ｏｏｌ，Ｄ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８６：５２５７−５２６１）も、酵素の局在および機能制御 に関与することが示された（Ｃｏｏｌ，Ｄ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８７：７２８０−７２８４； Ｃｏｏｌ，Ｄ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８９：５４２２−５４２６）。

ＳＨ２ドメインを含むＰＴＰが報告されており、これには下記のものが含まれ る：ＰＴＰ１Ｃ（Ｓｈｅｎ，Ｓ．−Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒ ｅ ３５２：７３６−７３９）、これはＨＣＰ（Ｙｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１ ９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：８３６−８４６）、ＳＨＰ（Ｍａ ｔｔｈｅｗｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ｌ ．１２：２３９６−２４０５）またはＳＨ−ＰＴＰ１（Ｐｌｕｔｚｋｙ，Ｊ． ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ Ａ） ８９：１１２３−１１２７）とも命名される；および関連のホスファターゼ ＰＴＰ２Ｃ（Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ９０：２１９７−２２０１）、これはＳＨ− ＰＴＰ２（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｊｒ．Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８９：１１２３９−１１２４３ ）、ＳＨ−ＰＴＰ３（Ａｄａｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＦＥＢ Ｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１４：３３５−３３９）、ＰＴＰ１Ｄ（Ｖｏｇｅｌ，Ｗ ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６１１−１６１４ ）、またはＳｙｐ（Ｆｅｎｇ，Ｇ．−Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉ ｅｎｃ ｅ ２５９：１６０７−１６１１）とも命名される。ショウジョウバエ属（Ｄｒ ｏｓｏｐｈｉｌａ）ｃｓｋ遺伝子産物（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ． ，（１９９２）Ｃｅｌｌ ７０：２２５−２３６）もこのサブファミリーに属す る。ＰＴＰ１Ｃは、そのＳＨ２ドメインによりリガンド活性化ｃ−Ｋｉｔおよび ＣＳＦ−１レセプターＰＴＫに結合することが示されている（Ｙｉ，Ｔ．，ａｎ ｄＩｈｌｅ，Ｊ．Ｎ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：３３５ ０−３３５８；Ｙｏｕｎｇ，Ｙ．−Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏ ｌ ．Ｃｈｅｍ．２６７：２３４４７−２３４５０）が、活性化ＣＳＦ−１レセプ ターとの結合の後にのみＰＴＰ１Ｃのチロシンリン酸化が起こる。Ｓｙｐは上皮 増殖因子および血小板由来増殖因子に対するリガンド活性化レセプターと相互作 用し、それによりリン酸化される（Ｆｅｎｇ，Ｇ．−Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１ ９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６０７−１６１１）。Ｓｙｐはチロシンリ ン酸化されたインスリンレセプター基質１と結合することも報告されている（Ｋ ｕｈｎｅ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６ ８：１１４７９−１１４８１）。

２種類のＰＴＰ、すなわちＰＴＰＨ１（Ｙａｎｇ，Ｑ．，ａｎｄ Ｔｏｎｋｓ ，Ｎ．Ｋ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８８：５９４９−５９５３）およびＰＴＰａｓｅ ＭＥＧ（Ｇｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８： ５８６７−５８７１）が同定された。これらはそれらの各Ｎ−末端セグメントに 、下記との類似性をもつ領域を含む：細胞骨格結合蛋白質バンド４．１（Ｃｏｎ ｂｏｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．（ＵＳＡ） ８３：９５１２−９５１６）、エズリン（Ｇｏｕｌｄ，Ｋ．Ｌ． ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：４１３３−４１４２）、タリ ン（Ｒｅｅｓ，Ｄ．Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４７ ：６８５−６８９）、およびラジキシン（Ｆｕｎａｙａｍａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ ．，（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１５：１０３９−１０４８）。バ ンド４．１ファミリーの蛋白質の機能は、細胞骨格蛋白質に対する原形質膜内表 におけるアンカーの提供であると思われる（Ｃｏｎｂｏｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ． （１ ９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：９５１２− ９５１６；Ｇｏｕｌｄ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ． ８：４１３３−４１４２）。ＰＴＰＨ１およびＰＴＰａｓｅ ＭＥＧもこのファ ミリーの員子と同様に原形質膜と細胞骨格の境界に局在し、これにより細胞骨格 機能の調節に関与すると仮定されている（Ｔｏｎｋｓ，Ｎ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ． （１９９１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬＶＩ：２６５−２７３）。

ＰＴＫおよびＰＴＰの研究に対する関心は癌研究において特に大きい。たとえ ば既知のオンコジンの約三分の一がＰＴＫを含む（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．（１９８ ９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ，Ｒ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ編，コールド・スプリング・ハーバー・ラ ボラトリー・プレス、ニューヨーク）。さらにチロシンリン酸化の程度は、ラウ ス肉腫ウイルスの温度感受性突然変異体に感染した細胞における形質転換表現型 の発現と密接に関連する（Ｓｅｆｔｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．， （１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：８０７−８１６）。同様にＢｒｏｗｎ−Ｓｈｉｒｎｅｒらは、 ３Ｔ３細胞におけるＰＴＰ１Ｂの過剰発現がフォーカス形成、アンカー非依存性 増殖および腫瘍化により測定した癌性新生物（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｎｅｕ）の 形質転換能力を抑制することを証明した（Ｂｒｏｗｎ−Ｓｈｉｒｎｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ ．，（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：４７８−４８２） 。それらはＰＴＫ活性の直接アンタゴニストであるので、ＰＴＰも過剰のＰＴＫ 活性により引き起こされる癌の治療の手段を提供する可能性がある。従って種々 のＰＴＰの単離、特性解明およびクローニングは、たとえばＰＴＫオンコジンの 癌を治療するための遺伝子療法を開発する際の重要な段階である。発明の概要 本発明は、２種類の新規なＰＴＰをコードする、これまでクローニングされて いない、かつこれまで報告されていない核酸の分子クローニングに基づくもので ある。開示する配列は、本発明者らがＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２と表示したＰ ＴＰをコードする。（ＰＴＰＬ１は米国特許出願第０８／１１５，５７３号明細 書、 １９９３年９月１日出願において先にＧＬＭ−１と表示された。）特に本発明は 、ヒト神経膠芽腫細胞由来のＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２のＰＴＰの配列の分子 クローニングに基づくものである。本発明は、ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２転写 体に対応し、これらの新規なＰＴＰをコードする、単離されたｃＤＮＡおよびＲ ＮＡ配列を提供する。さらに本発明は、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ｃＤＮＡ 配列を含むベクター、内因性または外因性プロモーターを含む、ＰＴＰＬ１また はＧＬＭ−２配列を発現しうるベクター、ならびに前記ベクターのうち１または ２以上で形質転換された宿主を提供する。本明細書に開示する配列をプローブま たはプライマーとし、ＰＣＲクローニング、標的遺伝子ウォーキング、およびゲ ノムまたはｃＤＮＡライブラリーとのコロニー／プラークハイブリダイゼーショ ンなどの技術と共に用いることにより、本発明はさらに、開示した配列の対立遺 伝子（ａｌｌｅｌｉｃ）変異体、内因性ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２調節配列、 ならびにマウス、ラット、ウサギおよび非ヒト霊長類を含めた他の種に由来する 実質的に類似または相同のＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＤＮＡおよびＲＮＡ配 列の単離法を提供する。

本発明は、単離したＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２配列のフラグメントおよび変 異体、単離したＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＲＮＡのフラグメントおよび変異 体、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２配列の変異体およびフラグメントを含むベクタ ー、内因性または外因性調節配列を含む、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２配列の変 異体またはフラグメントを発現しうるベクター、ならびに前記ベクターのうち１ または２以上で形質転換された宿主をも提供する。本発明はさらに、マウス、ラ ット、ウサギおよび非ヒト霊長類を含めた他の種に由来する実質的に類似または 相同のＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＤＮＡおよびＲＮＡ配列の変異体またはフ ラグメントを提供する。

本発明は、単離したＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセンスＤＮＡ、単離し たＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２ アンチセンスＲＮＡ、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ −２アンチセンスＤＮＡを含むベクター、内因性または外因性プロモーターを含 む、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２アンチセンスＤＮＡを発現しうるベクター、な らびに前記ベクターのうち１または２以上で形質転換された宿主を提供する。本 発明はさらに、マウス、ラット、ウサギおよび非ヒト霊長類を含めた他の種に由 来する関連のＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のアンチセンスＤＮＡおよびアンチセ ンスＲＮＡ配列を提供する。

本発明は、単離したＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセンスＤＮＡのフラグ メントおよび変異体、単離したＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセンスＲＮＡ のフラグメントおよび変異体、ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセンスＤＮＡ のフラグメントまたは変異体を含むベクター、内因性または外因性プロモーター を含む、ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセンスＤＮＡの変異体またはフラグ メントを発現しうるベクター、ならびに前記ベクターのうち１または２以上で形 質転換された宿主をも提供する。本発明はさらに、マウス、ラット、ウサギおよ び非ヒト霊長類を含めた他の種に由来する関連のＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２ア ンチセンスＤＮＡならびにＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセンスＲＮＡ配列 のフラグメントまたは変異体を提供する。

本明細書に開示する配列および当技術分野で周知の技術に基づいて、本発明は 開示したＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２配列と同一、実質的に類似または相同の配 列の発現の存在またはレベルを検出するのに有用な、単離されたプローブをも提 供する。プローブは本明細書に開示するＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２のＤＮＡ、 ＲＮＡまたはアンチセンス配列からなりうる。プローブをたとえば放射性同位体 で標識し；たとえばノーザンもしくはサザンブロット法に用いるフィルター上に 固定化し；または結合の検出を高め、もしくは容易にする任意の他の種類のマー カーを付与することができる。プローブはオリゴヌクレオチドまたは合成オリゴ ヌクレオチド類似体であってもよい。

本発明は実質的に純粋なＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２蛋白質をも提供する。こ れらの蛋白質は天然源から本明細書に開示する方法により得ることができ、また は特に本発明は本明細書に開示するいずれかのベクターで形質転換された宿主細 胞またはトランスジェニック動物により産生される実質的に純粋なＰＴＰＬ１お よびＧＬＭ−２蛋白質をも提供する。

本発明は実質的に純粋な、ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２蛋白質の変異体および フラグメントをも提供する。

本発明は、本明細書に開示する実質的に純粋なＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ 蛋白質、またはＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２蛋白質の変異体もしくはフラグメ ントを用いて、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２に結合しうる物質を得る方法および 同定する方法を提供する。具体的には、それらの物質には抗体、ペプチド、炭水 化物および薬剤が含まれる。それらの物質には天然のリガンド、コファクター、 補助蛋白質もしくは結合ペプチド、調節物質、制御物質または阻害物質も含まれ る。それらの物質を試験または開発するためにＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２蛋 白質全体を用いてもよく、またはそれらの変異体もしくはフラグメントを用いて もよい。特にＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２蛋白質の特定のドメインのみを用いて もよい。本発明はさらに、検出可能なように標識された、固定化された、および トキシンとコンジュゲートした形の、これらの物質を提供する。

本発明は、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰの活性をアッセイする方法を も提供する。たとえば本明細書に開示するＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセ ンスプローブを用いて、試験すべき細胞または組織からのｍＲＮＡ全体または特 定のものにプローブをハイブリダイズさせることにより、ＰＴＰＬ１またはＧＬ Ｍ−２発現の存在およびレベルを判定することができる。あるいは本明細書に開 示する抗体または他の結合性物質を用いて、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２蛋白質 の存在およびレベルを判定することができる。それらの方法はたとえばＰＴＰＬ １またはＧＬＭ−２発現の組織特異性を判定するために利用しうる。

本発明は、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２機能の制御を評価する方法をも提供す る。それらの方法には、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２核酸配列の調節領域をマー カー遺伝子座に融合させ、この融合生成物をベクターにより宿主細胞内へ導入し 、そしてマーカー遺伝子座の発現を測定することによりＰＴＰＬ１またはＧＬＭ −２の誘導物質または阻害物質を調べることが含まれる。さらに、標識されたＰ ＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセンス転写体を用いることにより、ＰＴＰＬ１ またはＧＬＭ−２ ｍＲＮＡの発現レベルを確認し、種々の内因性および外因性 化合物または処置がＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２の発現に及ぼす作用を判定する ことができる。また、種々の内因性および外因性化合物または処置がＰＴＰＬ１ またはＧＬＭ−２の発現に及ぼす作用は、本明細書に開示する標識抗体を用いて 、 ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２蛋白質のレベルを測定することによっても評価しう る。

本発明は、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２の発現または活性を増強または阻害す るための薬物の活性または力価を効果的に試験する方法を提供する。特に本明細 書に開示する核酸配列およびベクターは、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２発現の増 大、低下、または異なる制御を伴う細胞株およびトランスジェニック生物の開発 を可能にする。それらの細胞株および動物は薬剤組成物を試験するための有用な 被験体である。

本発明はさらに、細胞におけるＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２ ＰＴＰの活性を 調節する方法を提供する。詳細には、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰに結 合しうる物質、特に抗体を、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２を発現する細胞に供与 する。ＰＴＰへのそれらの物質の結合を利用して、この蛋白質の活性を活性化ま たは阻害することができる。さらにＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセンス転 写体を、それらが細胞に進入し、かつＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ｍＲＮＡ の転写および／またはＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２核酸配列の転写を阻害する ように投与することができる。あるいはＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＲＮＡを 、それが細胞に進入し、転写の鋳型として作用し、これによりＰＴＰＬ１または ＧＬＭ−２蛋白質の産生が増大するように投与することができる。他の態様にお いては、ＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ｍＲＮＡ転写体またはＰＴＰＬ１もし くはＧＬＭ−２アンチセンスＲＮＡ転写体を発現しうるベクターを、それが細胞 に進入し、転写体を発現するように投与する。図面の簡単な説明 図１。ＰＴＰＬ１とバンド４．１スーパーファミリーの蛋白質との比較。Ｃｌ ｕｓｔａｌ Ｖアラインメントプログラムを用いてアラインメントを行った（Ｆ ａｚｉｏｌｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１３ ３５−１３４５）。２以上の配列において保存される同一アミノ酸残基を四角で 囲んだ。エズリンにおいて上皮増殖因子レセプターによりリン酸化されることが 示された保存チロシン残基を星印で示す。

図２。ＧＬＧＦ反復配列のアミノ酸配列の比較。アラインメントは手動で行っ た。ＧＬＧＦ反復配列の番号は、蛋白質のＮ−末端から開始して示される。少な くとも８（４２％）の反復配列において保存された残基を肉太文字で示す。ＰＴ ＰＬ１中に５つの反復配列が見られ、３つはグアニレートキナーゼ、ｄｇｌ−Ａ 遺伝子産物、ＰＳＤ−９５および２２０−ｋＤａ蛋白質中に見られる。１つのＧ ＬＧＦ反復配列はグアニレートキナーゼｐ５５中、ＰＴＰ類であるＰＴＰＨ１お よびＰＴＰａｓｅ ＭＥＧ中、ならびに酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）中に見ら れる。１つの反復配列は神経膠腫細胞株Ｕ−１１８ＭＧからの変化したｒｏｓ１ 転写体中にも見られる。

図３。ＰＴＰＬ１および他のＧＬＧＦ反復配列を含む蛋白質のドメイン構造を 示す模式図。図に示したドメインおよびモチーフは下記のとおりである：Ｌ、ロ イシンジッパーモチーフ；バンド４.１、バンド４.１様ドメイン；Ｇ、ＧＬＧＦ 反復配列；ＰＴＰａｓｅ、触媒性ＰＴＰａｓｅドメイン；３、ＳＨ３ドメイン； ＧＫ、グアニレートキナーゼドメイン；Ｂｉｎｄ．Ｒｅｇ．、補酵素結合領域。

図４。ＰＴＰＬ１のＰＴＰ活性。ＰＴＰＬ１に対する抗血清（αＬ１Ｂ）を用 いたＣＯＳ−１細胞からの免疫沈殿−−ペプチドで遮断されていないもの（中空 円）またはペプチドで遮断されたもの（中空四角）−−を、チロシン残基におい て³²Ｐ−標識されたミエリン塩基性蛋白質と共に２、４、６または１２分間イン キュベートした。無機ホスフェートとして放出された放射能の量を放射能の全入 力に対する％として表す。発明の定義の詳細な説明 以下の記述において、生化学、分子生物学、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術お よび免疫学において用いられる多数の用語は広義で用いられる。さらに説明をよ り容易にするために、また本発明の対象をより明瞭かつ明確に指示するために、 ある種の新用語を導入する。明細書および請求の範囲ならびにそのような用語に より示される範囲を明瞭に、かつ矛盾なく理解するために、以下の定義を提示す る。

遺伝子。遺伝子は、それから核酸ポリメラーゼによりＲＮＡ分子が転写される 鋳型として作用しうるコーディング配列に作動可能なように連結したプロモータ ー領域を含む核酸配列である。遺伝子は、それにポリメラーゼが結合するプロモ ーター配列、転写が開始すべき地点のシグナルとなる開始配列、および転写が終 了すべき地点のシグナルとなる終止配列を含む。遺伝子は、ポリメラーゼを遮断 して転写を阻止するためのリプレッサーが結合しうるオペレーター部位を含むこ ともでき、かつ／またはリボソーム結合部位、キャッピングシグナル、転写エン ハンサーおよびポリアデニル化シグナルを含むことができる。プロモーター配列 、開始配列、終止配列、ならびに存在する場合にはオペレーター配列、リボソー ム結合部位、キャッピングシグナル、転写エンハンサーおよびポリアデニル化シ グナルは、まとめて調節配列と呼ばれる。転写開始コドンの５’側の調節配列は まとめてプロモーター領域と呼ばれる。ＲＮＡに転写される配列はコーディング 配列である。ＲＮＡは蛋白質をコードする場合、またはコードしない場合がある 。蛋白質をコードするＲＮＡはプロセシングされてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ ＮＡ）となる。他のＲＮＡ分子は、全く蛋白質に転写されずに機能または用途を 果たすであろう。これらにはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲ ＮＡ）、および本発明のアンチセンスＲＮＡが含まれる。真核生物においては、 転写開始コドン（ＡＴＧ）と転写終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧ）の 間のコーディング配列は２種類のもの、すなわちエキソンおよびイントロンであ ろう。エキソンはプロセシングされたｍＲＮＡ転写体中に含まれ、一般にペプチ ドまたは蛋白質に翻訳される。イントロンはＲＮＡがプロセシングされて成熟ｍ ＲＮＡになるのに伴ってＲＮＡから切除され、ペプチドまたは蛋白質に翻訳され ない。本明細書において用いる遺伝子という用語は、ゲノムＤＮＡから得られる ようにそれのイントロンを含む遺伝子、およびｃＤＮＡから得られるようにイン トロンがＤＮＡから切除された遺伝子の両方を包含する。

アンチセンスＤＮＡはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡであると定義さ れ、アンチセンスＲＮＡはある特定のＲＮＡ転写体に対して相補的な、またはそ れに選択的にハイブリダイズしうるＲＮＡである。従って特定の遺伝子に対する アンチセンスＲＮＡは、その遺伝子のＲＮＡ転写体と選択的にハイブリダイズし うるであろう。すなわちアンチセンス遺伝子は、アンチセンスＲＮＡをコードす る配列を発現しうるように調節配列に作動可能なように連結されたアンチセンス ＤＮＡのセグメントであると定義される。

ｃＤＮＡ。相補的ＤＮＡ、すなわちｃＤＮＡは、成熟ｍＲＮＡから逆転写によ り産生されたＤＮＡである。真核生物において、遺伝子中のイントロンに対応す るＲＮＡ中の配列はｍＲＮＡプロセシングに際して切除される。従ってｃＤＮＡ 配列は対応するゲノムＤＮＡ中に存在するイントロン配列を欠失している。さら にｃＤＮＡ配列はＲＮＡに転写されない調節配列を欠失しているであろう。従っ て機能性ｃＤＮＡ遺伝子を形成するためには、ｃＤＮＡ配列は転写が起こり得る ようにプロモーターに作動可能なように連結しなければならない。

作動可能なように連結した。コーディング配列とプロモーター領域は、それら がコーディング配列の発現または転写をプロモーター領域の影響または制御下に 置く様式で共有結合している場合に、作動可能なように連結していると言われる 。コーディング配列が機能性蛋白質に翻訳されることを望むとき、下記の場合に ２つのＤＮＡ配列は作動可能なように連結していると言われる：プロモーター機 能の誘導の結果コーディング配列が転写される場合、かつ２つのＤＮＡ配列間の 結合の性質は（１）フレームシフト変異を導入せず、（２）プロモーター領域が コーディング配列の転写を指令する能力を妨害せず、または（３）対応するＲＮ Ａ転写体が蛋白質に翻訳される可能性を妨害しないものである場合。たとえば得 られる転写体が目的の蛋白質またはポリペプチドに翻訳されるようにプロモータ ー領域がそのＤＮＡ配列の転写を行わせることができた場合、そのプロモーター 領域はコーディング配列に作動可能なように連結しているであろう。

アンチセンスＲＮＡ発現の場合のようにコーディング配列が最終的に蛋白質ま たはポリペプチドとして発現されることを望まないならば、コーディング配列と プロモーター領域がフレームシフトなしに結合することを保証する必要はない。

従って最終的に蛋白質またはポリペプチドとして発現される必要のないコーディ ング配列は、プロモーター機能の誘導の結果コーディング配列のＲＮＡ配列が転 写された場合には、プロモーター領域に作動可能なように連結していると言われ る。

遺伝子発現に必要な調節配列の厳密な性質は種間または細胞タイプ間で異なる 可能性はあるが、必要なものとして一般に、それぞれ転写および翻訳の開始に関 与する５’側非転写配列および５’側非翻訳配列、たとえばＴＡＴＡボックス、 キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含むべきである。特にこれらの５’側非 転写−調節配列には、作動可能なように連結した遺伝子の転写調節のためのプロ モーター配列を含むプロモーター領域が含まれるであろう。それらの転写調節配 列には、所望によりエンハンサー配列または上流アクチベーター配列が含まれて もよい。

ベクター。ベクターはその中へ目的配列を制限消化およびリゲーションにより 挿入しうる多数の核酸配列のうち任意のものであってよい。ベクターは一般にＤ ＮＡからなるが、ＲＮＡベクターも利用しうる。ベクターにはプラスミド、ファ ージ、ファスミドおよびコスミドが含まれる。クローニングベクターは、宿主細 胞内で複製することができるものであって、さらに１または２以上のエンドヌク レアーゼ制限部位を含むことを特色とし、これらにおいてベクターを一定の様式 で切断し、新たな組換えベクターが宿主細胞内で複製する能力を保持するように 、ここへ目的ＤＮＡ配列をリゲーションすることができるものである。プラスミ ドの場合、目的配列の複製は宿主細菌内でプラスミドのコピー数が増加するのに 伴って多数回、または宿主が有糸分裂により繁殖する前に宿主当たり１回だけ起 こりうる。ファージの場合、複製は溶菌期には能動的に、または溶原期には受動 的に起こりうる。発現ベクターは、その中へ目的ＤＮＡ配列を、それがプロモー ター領域に作動可能なように連結し、かつＲＮＡ転写体として発現しうるように 、制限消化およびリゲーションにより挿入しうるものである。ベクターはさらに 、そのベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞またはされて いない細胞の同定に利用するのに適した、１または２以上のマーカー配列を含む ことかできる。マーカーには、たとえば抗生物質または他の化合物に対する抵抗 性または感受性を増大または低下させる蛋白質をコードする遺伝子、その活性を 当技術分野で知られている標準的アッセイ法（たとえばβ−ガラクトシダーゼま たはアルカリホスファターゼ）により検出ことかできる酵素をコードする遺伝子 、および形質転換またはトランスフェクションした細胞、宿主、コロニーまたは プラークの表現型に目視可能な影響を及ぼす遺伝子が含まれる。

フラグメント。本明細書において用いる“フラグメント”という用語は、ユニ ークフラグメントおよび実質的に特徴的なフラグメントの両方を意味する。本明 細書において用いる“フラグメント”という用語は、標準的な辞書の定義に従っ て解釈すべきでない。

実質的に特徴的なフラグメント。分子、たとえば蛋白質または核酸配列の“実 質的に特徴的なフラグメント”は、それがその分子に由来することを同定するの に、またはそれを一群の非関連分子から区別するのに十分なほど稀であるか、ま たはそれに十分なほどその分子に特徴的な、分子の任意の部分を表すものとする 。単一のアミノ酸もしくはヌクレオチド、またはわずか２もしくは３個の配列は 、実質的に特徴的なフラグメントにはなり得ない。そのように短い配列は自然に 頻繁に起こるからである。

核酸配列の実質的に特徴的なフラグメントは、ゲノムまたはｃＤＮＡ全体の試 料内において、それが由来した核酸配列全体を同定する際のプローブとして有用 なものである。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下では、実質的に 特徴的なフラグメントはそれが由来した配列にのみ、または実質的に類似する少 数の関連配列、たとえば対立遺伝子変異体、異種特異的相同遺伝子座、およびヌ クレオチドもしくはヌクレオチド類似体のわずかな挿入配列、欠失もしくは置換 を含む変異体にのみ、ハイブリダイズするであろう。実質的に特徴的なフラグメ ントは、ストリンジェンシーの比較的低いハイブリダイゼーション条件下では非 対立遺伝子および非相同遺伝子の遺伝子座とハイブリダイズすることができ、そ れらの遺伝子座を見出すためのプローブとして用いられるであろうが、比較的高 いストリンジェンシーにおいてはそうではないであろう。

蛋白質の実質的に特徴的なフラグメントは、多数の非関連蛋白質の混合物から それが由来する全蛋白質、または対立形質蛋白質もしくは異種特異的相同蛋白質 を識別する抗体を産生する際に有用である。

たとえばＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブまたは抗体 産生のためのエピトープとして、核酸配列および蛋白質の実質的に特徴的なフラ グメントを認識し、調製し、使用することは、当業者の知識および能力の範囲内 にある。

ユニークフラグメント。本明細書において用いる、蛋白質または核酸の“ユニ ークフラグメント”は、自然に他のいずれかで生じることが現在知られていない 実質的に特徴的なフラグメントである（対立または異種特異的相同変異体を除く 、すなわちそれはＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ＰＴＰ、またはＰＴＰＬ１も しくはＧＬＭ−２ ＰＴＰ“相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）”中にのみ存在する ）。ユニークフラグメントは一般に１５ヌクレオチドまたは５アミノ酸残基より 大きいであろう。当業者は、入手しうる核酸および蛋白質配列のコンピューター データベース、たとえばＧｅｎｂａｎｋ（米国ロス・アラモス・ナショナル・ラ ボラトリーズ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔまたはナショナル・バイオメディカル・リ サーチ・ファウンデーションなどのデータベースを検索することにより、ユニー クフラグメントを確認することができる。ユニークフラグメントは、たとえばモ ノクローナル抗体の生成またはＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーのスクリー ニングに際して特に有用である。

ストリンジェントハイブリダイゼーション条件。“ストリンジェントハイブリ ダイゼーション条件”は、当業者には理解されている技術用語である。任意の核 酸配列につき、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、核酸配列をそ の相補配列に対してハイブリダイズさせるが、実質的に異なる配列に対してはハ イブリダイズさせない温度および緩衝液条件である。“ストリンジェント”条件 を構成する厳密な条件は、核酸配列の長さおよびその配列のサブセットが他の不 一致配列内で出現する頻度に依存する。ハイブリダイゼーション条件をハイブリ ダイゼーションが起こらないストリンジェンシーレベルから、ハイブリダイゼー ションが最初に観察されたレベルにまで変化させることにより、当業者は過度の 実験を行うことなく、その配列が一致配列とのみハイブリダイズしうる条件を決 定することができる。そのようなストリンジェンシー条件の適切な範囲はＫｒａ ｕｓｅ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，２００：５４６−５５６（１９９１）に記載されてい る。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、配列の長さおよび共通 性に応じて、３０−６５℃および５×−０．１×ＳＳＰＣのハイブリダイゼーシ ョン条件が含まれる。ストリンジェントより低いハイブリダイゼーション条件は 、 特定の配列に対して実質的に類似、対立または相同である核酸配列を単離するた めに用いられる。

ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰをコードする核酸に由来するプライマー を用いる場合、高いストリンジェンシー条件（たとえば５０−６０℃におけるア ニーリング）を採用することによりプライマーに対して約７５％以上相同である 配列が増幅されることは、当業者には認識されているであろう。より低いストリ ンジェンシー条件（たとえば３５−３７℃におけるアニーリング）を採用するこ とによりプライマーに対して約４０−５０％以上相同である配列が増幅されるで あろう。

ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰに由来するＤＮＡプローブをコロニー／ プラークハイブリダイゼーションに用いる場合、高いストリンジェンシー条件（ たとえば５０−６５℃、５×ＳＳＰＣ、５０％ホルムアミドにおけるハイブリダ イゼーション、５０−６５℃、０．５×ＳＳＰＣにおける洗浄）を採用すること により、プローブに対して約９０％以上相同である領域を含む配列が得られ、よ り低いストリンジェンシー条件（たとえば３５−３７℃、５×ＳＳＰＣ、４０− ４５％ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーション、４２℃、ＳＳＰＣにおけ る洗浄）を採用することにより、プローブに対して約３５−４５％以上相同であ る領域を含む配列が得られるであろう。

実質的に類似。２つの核酸配列は、それらのうちの一方またはそのアンチセン ス相補体が厳しいハイブリダイゼーション条件下で他方に結合し、これによりそ の鎖をｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー中の他のすべて、または実質的にすべ ての配列から識別しうる場合、それらの核酸配列は実質的に類似する。あるいは 、ある配列またはそのアンチセンス相補体が厳しいハイブリダイゼーション条件 下で類似のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在をスクリーニングする際のプローブと して有用である場合、それは他のものに実質的に類似する。２つの蛋白質が実質 的に類似のＤＮＡまたはＲＮＡ配列によりコードされる場合、それらは実質的に 類似する。さらに、２つの蛋白質が実質的に類似の核酸によりコードされない場 合でも、それらが実質的に同じ効果または有用性をもつ同じ生物学的役割（構造 上または機能上）を果たすのに十分な一次、二次および三次構造を共有するなら ば、 それらは実質的に類似する。

変異体。蛋白質もしくは核酸またはそのフラグメントの“変異体”は、蛋白質 もしくは核酸またはそのフラグメントに構造が実質的に類似する分子を包含する ものである。核酸配列の変異体には、保存的ヌクレオチド置換、わずかな挿入も しくは欠失または付加を伴う配列が含まれる。蛋白質の変異体には、保存的アミ ノ酸置換、わずかな挿入もしくは欠失または付加を伴う蛋白質が含まれる。たと えば後続の翻訳生成物のアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換が特 に考慮される。同様に、蛋白質の機能上の有用性を破壊しない、蛋白質における 構造的に類似のアミノ酸の置換（たとえばイソロイシンに代わるロイシン）、挿 入、欠失および末端付加が考慮される。核酸配列の対立遺伝子変異体、および蛋 白質またはポリペプチド配列の対立形質変異体が特に考慮される。当技術分野で 周知のように、対立遺伝子変異体は単に多形遺伝子の自然の変異体であり、その 用語は本明細書においては集団遺伝学の分野で一般に用いられるものに従って用 いられる。それらの変異体の形成法は当技術分野で周知であり、従ってそれらの 変異体は請求の範囲の精神および範囲に包含されるものとする。

相同および相同体。本明細書において用いる“相同体”という用語はその概念 が示すように、相同核酸配列および相同蛋白質配列のいずれか、および／または 両方を包含するものとする。相同体は、それらが進化上共通の起源をもつこと、 ならびに構造および機能の類似性が進化保存の結果であることを当業者に示すの に十分な程度の構造および機能の類似性を共有する前記の変異体群である。ＰＴ ＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰの相同体であるとみなされるためには、核酸配 列およびそれらがコードする蛋白質は下記の２基準に適合しなければならない： （１）相同核酸によりコードされるポリペプチドは、少なくとも２０アミノ酸の 繋がりの少なくとも１つにつき少なくとも約５０−６０％、好ましくは少なくと も７０％が一致する。当技術分野で周知のように、全体的なアミノ酸組成のみで なく、アミノ酸残基相互の一致性およびおおまかな位置が共に保存されていなけ ればならない。従って相同体の保存領域を“整列”させて、５０−６０％の一致 性があると結論することができなければならない；（２）ポリペプチドは蛋白質 チロシンホスファターゼであるという点でＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰ に対する機能的類似性を保持していなければならない。

実質的に純粋。“実質的に純粋”という用語は、本発明の蛋白質、変異体また はそのフラグメントに用いた場合、蛋白質がそれらの意図する用途にとって実用 的かつ適切である程度に、他の物質を本質的に含まないことを意味する。特に蛋 白質は、たとえば蛋白質配列決定または薬剤調製物の製造に有用であるのに十分 なほど純粋であり、かつそれに十分なほどそれらの宿主の他の生物成分を含まな い。本発明の核酸からみて、当技術分野で周知の技術によって実質的に純粋な蛋 白質、変異体またはそのフラグメントを調製することができる。

単離された。単離されたとは、：（ｉ）インビトロで、たとえばポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された；（ｉｉ）クローニングにより組換え製造 された；（ｉｉｉ）開裂およびゲル分離により精製された；または（ｉｖ）たと えば化学合成により合成された、核酸配列を意味する。単離された核酸配列は、 当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって容易に操作しうるものである。従 って５’および３’制限部位が既知であるか、またはそれに対するポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーが示されているベクター中に含まれる核酸配列は 単離されているとみなされるが、その天然の状態でその天然宿主中にあるものは そうでない。単離された核酸は実質的に精製されたものであってもよいが、そう でなくてもよい。たとえばクローニングまたは発現ベクター中に単離された核酸 配列は、それが存在する細胞内の物質のわずかな割合を構成するにすぎないとい う点で、純粋ではない。しかしそのような核酸は当業者に知られている標準的技 術によって容易に操作しうるので、本明細書においてこの用語を用いるように、 この核酸は単離されている。

免疫原的に有効な量。“免疫原的に（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ） 有効な量”は、抗原のエピトープに結合する抗体の産生を誘導するのに必要な抗 原（たとえば蛋白質、その変異体およびフラグメント）の量である。“免疫原的 に有効な量”を構成する実際の量は、抗原の性質、免疫感作される生物、および 免疫感作の様式に応じて異なるであろう。その量の決定は過度の実験を行うこと なく当業者が容易になしうる範囲のものである。

抗原および抗体。本発明において用いる“抗原”という用語は、動物に導入さ れた場合に検出可能な免疫反応を誘導しうる物質を表すものである。それらの物 質には蛋白質およびそのフラグメントが含まれる。

“エピトープ”という用語は、抗体が認識し、かつ結合しうる抗原部分を表す ものである。抗原は１または２以上のエピトープを保有しうる。“抗原”はその 抗原のエピトープに結合しうる抗体を産生するように動物を誘導することができ る。“免疫原”は、特に抗原に対する免疫反応を生じる目的で動物に導入される 抗原である。抗体は、ある分子と特異的に反応し、これによりその分子を抗体に 結合させうる場合、その分子と“選択的に結合しうる”と言われる。抗原と抗体 の選択的結合は、その抗原が高度に特異的な様式でそれに対応する抗体と反応し 、他の抗原により誘導される可能性のある他の多数の抗体とは反応しないことを 示すものである。

本明細書において用いる“抗体”（Ａｂ）または“モノクローナル抗体”（Ｍ ａｂ）という用語は、抗原を結合しうる無傷の分子およびそのフラグメント（た とえばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂フラグメント）を含むものである。Ｆａｂお よびＦ（ａｂ’）₂フラグメントは無傷の抗体のＦｃフラグメントを欠如し、無 傷の抗体より速やかに循環系から消失し、より特異性の低い組織結合性をもつ。

一本鎖抗体、ヒト化抗体、およびそのフラグメントも含まれる。好ましい態様の説明 本発明は、ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２と表示される２種類の新規な蛋白質チ ロシンホスファターゼの同定、単離およびクローニングに関するものである。詳 細には、本発明はヒト神経膠芽腫および脳細胞ｃＤＮＡライブラリーからＰＴＰ Ｌ１およびＧＬＭ−２のｃＤＮＡの単離およびクローニングならびにアミノ酸配 列を開示する。まずこれらのホスファターゼにつき以下に別個に述べる。それら はそれらの触媒ドメインに関し、機能および有用性ならびに構造において関連す るので、それらを以下に交互に説明する。

新規なＰＴＰを同定するために、ＰＣＲに基づく方法を採用した。ＰＣＲは鋳 型としてヒト神経膠腫細胞株Ｕ−３４３ ＭＧａ ３１ＬからのｃＤＮＡを、お よびＰＴＰの保存領域に基づく縮重プライマーを用いて実施された。１つのプラ イマーはＰＴＰドメインの触媒部位（ＨＣＳＡＧ）に由来するものであり、２つ のプライマーはそのドメインのＮ−末端部分の保存領域に由来するものであった 。数種類のＰＣＲ生成物が得られ、これには下記の細胞質ＰＴＰに対応するもの ：ＰＴＰＨ１（Ｙａｎｇ，Ｑ．，ａｎｄ Ｔｏｎｋｓ，Ｎ．Ｋ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８８：５９４９−５９５３ ）、ＰＴＰａｓｅ ＭＥＧ（Ｇｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８８：５８６７−５８７１）、Ｐ１９ ＰＴＰ（ｄｅｎ Ｈｅｒｔｏｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉ ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １８４：１２４１−１２４９）、 およびＴＣ−ＰＴＰ（Ｃｏｏｌ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８６：５２５７−５２６１）、なら びにレセプター様ＰＴＰであるＨＰＴＰ−α、ＨＰＴＰ−γ、およびＨＰＴＰ− δに対応するもの（Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｎ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｅ ＭＢＯ Ｊ ．９：３２４１−３２５２）が含まれていた。これら既知の配列のほ か、新規なＰＴＰ様配列をコードする３種類のＰＣＲ生成物が見出された。

これらのＰＣＲ生成物のうち１種類は、ヒト白血病細胞株に由来するＰＣＲ生 成物（Ｈｏｎｄａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７： ７４２−７４６）とほぼ等しく、さらに特性解明するために選ばれ、オリゴ−（ ｄＴ）−プライミングＵ−３４３ ＭＧａ ３１Ｌ ｃＤＮＡライブラリーのス クリーニングに用いられ、その結果クローンλ６．１５が単離された。λ６．１ ５挿入配列をプローブとするヒト包皮繊維芽細胞ＡＧ１５１８からのｍＲＮＡの ノーザンブロット分析に際して、９．５ｋｂの転写体が見られた。従って全長ク ローンを得るためにＡＧ１５１８ ｃＤＮＡライブラリーを構築し、λ６．１５ を用いてスクリーニングした。λ６．１５を用い、次いで続いて単離されたクロ ーンを用いたこれらのライブラリーのスクリーニングにより、数種類のオーバー ラップクローンが得られ、これらは一緒になってＰＴＰＬ１と表示される新規ホ スファターゼの全コーディング配列を含む８０４０ｂｐをカバーしていた。オー プンリーディグフレームの全長は、予想分子量２７５ｋＤａの２４６６アミノ酸 をコードする７３９８ｂｐであった。ＰＴＰＬ１のヌクレオチド配列および推 定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１および配列番号：２として開示する。７ ８−８０位の推定開始コドンを囲む配列はＫｏｚａｋ共通配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：８１２５−８１４８）と 十分には一致しないが、プリンが−３位にあり、これは開始部位にとって重要な 要件である。７７ｂｐの５’側非翻訳領域はＧＣに富み、４５−４７位にインフ レーム終止コドンを含む。５６５ｂｐの３’側非翻訳領域は７４７６−７４７８ 位のＴＡＧ終止コドンの後から開始し、ポリＡテイルを含まない。

ＰＴＰＬ１の推定アミノ酸配列にはトランスメンブランドメインまたは分泌の ためのシグナル配列が見られず、これはＰＴＰＬ１が細胞質ＰＴＰであることを 示す。Ｎ−末端から開始して最初の４７０アミノ酸残基の配列は既知の蛋白質に 対する相同性を示さない。領域４７０−５０５はロイシンジッパーモチーフを含 み、通常は第４ロイシンが見られる位置にメチオニンを含む（ＬＸ₆ＬＸ₆ＬＸ₆ ＭＸ₆Ｌ）；メチオニン残基による同様なロイシン残基の置換が、転写因子ＣＹ Ｓ−３（Ｆｕ，Ｙ．−Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂ ｉｏｌ ．９：１１２０−１１２７）およびｄＦＲＡ（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｋ．Ｋ． ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：８２２−８３４）のロ イシンジッパー中にも見られる。さらにこれが機能性ロイシンジッパーであると いう見解と一致して、この領域にはヘリックス破壊性残基（グリシンおよびプロ リン）は存在しない。ロイシンジッパーモチーフに続いてバンド４．１スーパー ファミリーに相同の３００アミノ酸領域（５７０−８８５）がある（図１参照） 。このスーパーファミリーの員子は、Ｎ−末端に相同ドメインをもつ細胞骨格結 合蛋白質である（Ｔｓｕｋｉｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｕｒｒ ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．４：８３４−８３９）。興味深いことに、２ 種類の細胞質ＰＴＰであるＰＴＰＨ１およびＰＴＰａｓｅ ＭＥＧは４．１様ド メインを含む。ＰＴＰＬ１の４．１様ドメインは下記を含むこのスーパーファミ リーの大部分の既知の蛋白質に２０−２４％類似する：エズリン（Ｇｏｕｌｄ， Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：４１３３−４１４２ ）、モエジン（Ｌａｎｋｅｓ，Ｗ．Ｔ．，ａｎｄ Ｆｕｒｔｈｍａｙｒ，Ｈ．， （１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：８２９ ７− ８３０１）、ラジキシン（Ｆｕｎａｙａｍａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１ ）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１５：１０３９−１０４８）、メルリン（Ｔｒｏ ｆａｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：７９１ −８００）、バンド４．１蛋白質(Ｃｏｎｂｏｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９８ ６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：９５１２−９５ １６)、ＰＴＰＨ１（Ｙａｎｇ，Ｑ．，ａｎｄ Ｔｏｎｋｓ，Ｎ．Ｋ．，（１９ ９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：５９４９−５ ９５３）およびＰＴＰａｓｅ ＭＥＧ（Ｇｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８８：５８６７−５８７１ ）。

アミノ酸残基１０８０と１９４０との間にはＧＬＧＦ−反復配列と表示される ８０アミノ酸反復配列が５つある。この反復配列は最初にＰＳＤ−９５（Ｃｈｏ ，Ｋ．−Ｏ.,ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ ９：９２９−９４２） 中に見出され、これはＳＡＰ（Ｋｉｓｔｎｅｒ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９ ３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：４５８０−４５８３）とも呼ばれ、シナ プス後膜肥厚における蛋白質、すなわちシナプス接合部の亜膜性細胞骨格構造体 である。ラットＰＳＤ−９５は、中隔接合部（ｓｅｐｔａｔｅ ｊｕｎｃｔｉｏ ｎ）に位置する蛋白質をコードするショジョウバエ属のｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ 腫瘍サプレッサー遺伝子ｄｌｇ−Ａと相同である（Ｗｏｏｄｓ，Ｄ．Ｆ．，ａｎ ｄ Ｂｒｙａｎｔ，Ｐ．Ｊ．，（１９９１）Ｃｅｌｌ ６６：４５１−４６４） 。これら２蛋白質はそれぞれ３つのＧＬＧＦ−反復配列、１つのＳＨ−３ドメイ ンおよびグアニレートキナーゼドメインを含む。手動探索で補足した蛋白質デー タベースのコンピューター探索により、９種類の蛋白質（それらのすべてが酵素 ）中に１９のＧＬＧＦ−反復配列が見出された（図２および図３を参照されたい ）。ｄｌｇ−ＡおよびＰＳＤ−９５のほかに、グアニレートキナーゼファミリー の他の２員子がある；すなわち３つのＧＬＧＦ−反復配列を含む原形質膜アンダ ーコートの構成蛋白質である２２０−ｋＤａ蛋白質（Ｉｔｏｈ，Ｍ．，ｅｔ ａ ｌ ．，（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２１：４９１−５０２）、およ び１つのＧＬＧＦ−反復配列を含む赤血球膜由来のパルミトイル化蛋白質である ｐ５５（Ｒｕｆｆ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８８：６５９５−６５９９）がある。ＰＴＰＨ１およびＰＴ Ｐａｓｅ ＭＥＧの配列を詳細に調べると、それらはそれぞれバンド４．１相同 ドメインとＰＴＰドメインの間に１つのＧＬＧＦ−反復配列をもつことが明らか になった。ラット脳からの酸化窒素シンターゼ中にも１つのＧＬＧＦ−反復配列 が見出され（Ｂｒｅｄｔ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５１：７１４−７１８）、および神経膠腫細胞株Ｕ−１１８ＭＧは変化したｒｏｓ１ 転写体を発現し（Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｏ ｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ ．５：９１−１００）、これは恐らく遺伝子融合の結果 としてＧＬＧＦ−反復配列を含む。

ＰＴＰＬ１のＰＴＰドメインはＣ−末端に局在する（アミノ酸残基２１９５− ２４４９）。それはＰＴＰドメインの大部分の保存モチーフを含み、既知のＰＴ Ｐに対して約３０％の類似性を示す。

配列番号：１を含む９．５ｋｂのプローブを組織特異性発現に関するノーザン ブロット分析に用いて、ヒトの腎臓、胎盤、卵巣および精巣においてＰＴＰＬ１ の高い発現；ヒトの肺臓、膵臓、前立腺および脳において中程度の発現；ヒトの 心臓、骨格筋、脾臓、肝臓、小腸および結腸において低い発現を示し；そしてヒ ト白血球においては発現は実質的に検出不可能であった。さらにＰＴＰＬ１に対 するラットＰＣＲ生成物をプローブとして用いて、ＰＴＰＬ１はラット成体にお いては発現するが、ラット胚においては発現しないことが見出された。この後者 の所見は、ＰＴＰＬ１が多くのＰＴＰと同様に細胞の成長または分化を誘導する シグナル伝達プロセスにおいて役割をもつ可能性があることを示唆する。

ＰＴＰＬ１配列中のアミノ酸残基１８０２−１８２３に由来する合成ペプチド に対して形成されたウサギ抗血清αＬ１Ａ（実施例５参照）は、ＰＴＰＬ１ ｃ ＤＮＡでトランスフェクションした［³⁵Ｓ］メチオニンおよび［³⁵Ｓ］システイ ン標識ＣＯＳ−１細胞から２５０ｋＤａの成分を特異的に沈殿させた。この成分 はトランスフェクションしていない細胞、またはトランスフェクションした細胞 において予備免疫血清または免疫原ペプチドで予備遮断した抗血清を用いた場合 には検出できなかった。ＰＴＰＬ１の残基４５０−４７０に対して形成された抗 血清αＬ１Ｂ（実施例５参照）を用いた場合も同じ結果が得られた。約２５０ｋ Ｄａの成分はＡＧ１５１８細胞、ＰＣ−３細胞、ＣＣＬ−６４細胞、Ａ５４９細 胞およびＰＡＥ細胞を用いた沈殿中にも検出された。この成分は予備免疫血清を 用いて沈殿させた場合、またはペプチドで予備遮断したαＬ１Ａ抗血清を用いて 沈殿させた場合には見られなかった。異なる細胞間で見られたわずかなサイズ変 動は種差によるものであろう。αＬ１Ａ抗血清によってより小さな７８ｋＤａの 成分も特異的に沈殿した。この分子とＰＴＰＬ１の関係は、なお調べるべきもの である。

ＰＴＰＬ１がＰＴＰ活性をもつことを証明するために、ＰＴＰＬ１ ｃＤＮＡ でトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞からの免疫沈殿を、基質としてのチ ロシン残基上で³²Ｐ−標識されたミエリン塩基性蛋白質と共にインキュベートし た。無機ホスフェートとして放出された放射能の量を測定した。αＬ１Ｂ抗血清 による免疫沈殿（中空円）は脱リン酸化の経時的増大を生じ、抗血清をペプチド で予備遮断した場合の２％脱リン酸化（中空四角）と比較して１２分後に３０％ を越える脱リン酸化を伴った（図４参照）。

本発明は、ＧＬＭ−２と表示される新規ＰＴＰをコードする単離された核酸配 列、その変異体およびフラグメント、ならびにそれに関連する用途をも提供する 。ＧＬＭ−２ ＰＴＰをコードする１配列および周囲のヌクレオチドを配列番号 ：３として開示する。この配列には、ＧＬＭ−２ ＰＴＰのコーディング配列、 ならびに調節配列を含む５’側および３’側非翻訳領域が含まれる。開示した配 列番号：３と表示される全配列は長さ３０９０ｂｐである。

配列番号：３の核酸配列は、１３１０ｂｐの５’側非翻訳領域および６７３ｂ ｐの３’側非翻訳領域（ポリ−Ａ（ポリアデニル化）テイルの配列をコードしな いと思われる）を含む。配列番号：３の転写はほぼ１１４６位で開始する。翻訳 開始コドン（ＡＴＧ）は配列番号：３の１３１１−１３１３位に存在する。開始 コドンを囲むヌクレオチド（ＡＧＣＡＴＧＧ）はＫｏｚａｋ共通配列（ＲＣＣＡ ＴＧＧ）（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５ ：８１２５−８１４８）との実質的類似性を示す。翻訳終止コドン（ＴＧＡ）は 配列番号：３の２４１８−２４２０位に存在する。１１０７ｂｐのオープンリー ディグフレームは、予想分子量４１ｋＤをもつ３６９アミノ酸残基の蛋白質をコ ー ドする。この蛋白質の推定アミノ酸配列を配列番号：４に開示する。

配列番号：３に開示した配列は、ラットＰＴＰ ＳＴＥＰ（５３％の一致率； Ｌｅｍｂｒｏｓｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９１）およびヒトＰＴＰ ＬＣ−ＰＴＰ （５１％の一致率；Ａｄａｃｈｉ，Ｍ，，ｅｔ ａｌ.，（１９９１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１４：３３５−３３９）に類似の単一ドメインＰＴＰをコ ードする。配列決定された領域はいずれも、既知のシグナルドメインまたはトラ ンスメンブランドメインに実質的に類似するポリペプチド配列をコードしない。

これはさらに、ＧＬＭ−２が細胞質ＰＴＰであることを示す。

配列番号：３を含めた３．６ｋｂのプローブを組織特異性発現に関するノーザ ンブロット分析に用いた場合、ヒト脳組織との強い結合が示され、ヒトの心臓、 胎盤、肺臓、肝臓、骨格筋、腎臓または膵臓においてはほとんど、または全く発 現が示されなかった。これはＳＴＥＰが示した組織特異性発現のパターンに類似 する。ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２のクローニングおよび発現 本発明の１系列の形態においては、ＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ＰＴＰ、 またはその変異体もしくはフラグメントをコードする単離されたＤＮＡ、ｃＤＮ ＡまたはＲＮＡ配列が提供される。最初のＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２配列を単 離するために用いた前記の方法を用いる必要はもはや無い。むしろ本明細書に開 示した配列を用いて、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを容易にスクリ ーニングして、少なくともＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２配列のフラグメント、お よび所望により全配列を含むクローンを単離することができる。あるいは本明細 書に開示した配列を用いてＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２をコードする核酸を合成 することができる。

本発明はさらに、ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２をコードする核酸配列を含むベ クターを提供する。それらのベクターにはプラスミド、ファージ、プラスミドお よびコスミドベクターが含まれるが、これらに限定されない。本発明の開示を考 慮して、当業者はルーティン法により本発明の核酸配列を任意の多数の既知の適 切なベクター中へ容易に挿入することができる。

ＤＮＡライブラリーの核酸の源はゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれであっ てもよい。これらのうちいずれを用いるかは、クローニングしたい配列およびこ れらの配列の目的用途の性質に依存する。

ゲノムＤＮＡは当業者に周知の方法により得られる（たとえばＧｕｉｄｅ ｔ ｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ，Ｓ．Ｌ．Ｂ ｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．編，アカデミック・プレス（１９８７）を参照された い）。内因性調節配列を含めた全遺伝子をクローニングしたい場合はゲノムＤＮ Ａが好ましい。同様に関心のあるのが調節配列のみである場合にもゲノムＤＮＡ が用いられる。

相補的、すなわちｃＤＮＡは、当業者に周知の逆転写法により得られる（たと えばＧｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ ，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．編，アカデミック・プレス（１９ ８７）を参照されたい）。好ましくは、逆転写のためのｍＲＮＡ調製物は目的配 列のｍＲＮＡに富むものでなければならない。これはｍＲＮＡが高いレベルで産 生される細胞を選択することにより、または高レベルの産生を誘導することによ り達成しうる。あるいはインビトロ法、たとえばスクロース濃度勾配法を用いて 、特定のサイズのｍＲＮＡ転写体を単離することができる。遺伝子の調節配列が 必要でない場合、または発現された転写体と比較してゲノムが極めて大きい場合 、ｃＤＮＡが好ましい。特にイントロンを含む真核生物遺伝子を原核生物宿主内 で発現させる場合、ｃＤＮＡが好ましい。

ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを形成するためには、適切なＤＮＡまたは ｃＤＮＡ調製物をランダムに切断し、または制限エンドヌクレアーゼにより酵素 的に開裂させて、選ばれたライブラリーベクターに適したサイズのフラグメント を形成する。ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを常法によりベクターに挿入す ることができる。これにはリゲーションのための平滑末端法または付着末端法が 含まれる。一般にこれは適切な末端を得るための制限酵素消化、付着末端の適宜 なフィルイン、目的外の結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、およ び適切なリガーゼによるリゲーションにより達成される。このような操作技術は 当技術分野で周知であり、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第２ 版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，ニューヨーク州 プレインビュー（１９８９）に見られる。このライブラリーはそれぞれが全ＤＮ ＡまたはｃＤＮＡのフラグメントを含む著しく多数のクローンからなるであろう 。多様なクローニングベクター、制限エンドヌクレアーゼ、およびリガーゼが市 販されており、ＤＮＡライブラリーの形成におけるそれらの使用法は当業者に周 知である。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第２版，コールド・ スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，ニューヨーク州プレインビュー （１９８９）を参照されたい。

ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２核酸配列をコードする配列を含むＤＮＡまたはｃ ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２をコード する配列を、その配列を特異的に選択する任意の手段で同定することができる。

それらの手段には下記が含まれる：（ａ）目的とするＤＮＡまたはｃＤＮＡのユ ニークフラグメントまたは実質的に特徴的なフラグメントを含む適宜な核酸配列 （１または２以上）とハイブリダイズさせ、（ｂ）問題のクローンにハイブリダ イズする天然ｍＲＮＡをインビトロで翻訳するハイブリダイゼーション選択−翻 訳分析を行い、翻訳生成物をさらに解明する：（ｃ）クローニングされた遺伝子 配列自体がｍＲＮＡを発現しうる場合、そのクローンを含む宿主により産生され た翻訳ＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２組換え産物を免疫沈殿させ、または好まし くは（ｄ）目的配列のユニークフラグメントまたは実質的に特徴的なフラグメン トをＰＣＲプライマーとして用いて、それがハイブリダイズするクローンを増幅 させる。

好ましくはプローブまたはプライマーは、開示された配列のいずれかの実質的 に特徴的なフラグメントである。より好ましくはプローブは、開示された配列の いずれかのユニークフラグメントである。フラグメントを選ぶ際には、提示され たプローブを配列データベース中に見出される既知配列と比較することにより、 ユニークフラグメントおよび実質的に特徴的なフラグメントを同定することがで きる。あるいは全ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２配列をプローブとして用いてもよ い。好ましい態様においては、プローブは本明細書に開示するＰＴＰＬ１または ＧＬＭ−２核酸配列の³²Ｐランダム標識ユニークフラグメントである。極めて好 ましい態様においては、本明細書に開示するＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２配列の ユニークフラグメントまたは実質的に特徴的なフラグメントを含むプローブがＰ ＣＲプライマーとして用いられる。

スクリーニングされるライブラリーはＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれであって もよい。好ましくはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。好ましい態様 においては、Ｕ−３４３ ＭＧａ ３１Ｌヒト神経膠芽腫（Ｎｉｓｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ ．，（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：３９１０−３９１８ ）またはＡＧ１５１８ヒト繊維芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａ ｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄ ｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ニュージャージー州カムデン）ｃＤＮＡライブラ リーを、ＰＴＰＬ１配列のユニークフラグメントまたは実質的に特徴的なフラグ メントに対するプローブによりスクリーニングする。ＰＴＰＬ１は多様な組織に おいて発現するので、多数の組織からのｃＤＮＡライブラリーを用いることがで きる。他の好ましい態様においては、λｇｔ１０ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カリフォルニア州）を、ＧＬＭ−２配列のユニークフラグメ ントまたは実質的に特徴的なフラグメントに対するプローブによりスクリーニン グする。ＧＬＭ−２の発現は脳組織において高いが、試験した他の組織において は低いか、または発現しないと思われるので、ＧＬＭ−２のクローニングには脳 ｃＤＮＡライブラリーが推奨される。

選ばれたフラグメントを当業者に知られている多数のベクターのうちのいずれ かにクローニングすることができる。好ましい１態様においては、クローニング ベクターはプラスミド、たとえばｐＵＣ１８またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ）である。クローニングされた配列を調べて、それらが全ＰＴ ＰＬ１もしくはＧＬＭ−２配列またはその目的部分を含むか否かを判定すべきで ある。部分配列の一連のオーバーラップクローンを選択し、当技術分野で周知の 方法により組み合わせて完全配列を作成することができる。

ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ヌクレオチド配列をクローニングする他の態様に おいては、発現ベクターを用いてライブラリーを調製する。次いでこのライブラ リーを蛋白質に対する抗体で、もしくは目的ＲＮＡ配列に対する標識プローブで スクリーニングすることにより、またはリン酸化された基質、たとえばパラ−ニ トリルフェニルホスフェートに対するＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰ活性 につきアッセイすることにより、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２蛋白質を発現する クローンにつきライブラリーをスクリーニングする。従って前記の方法は、ＰＴ ＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ＰＴＰまたはその変異体もしくはフラグメントを発 現しうるクローニングされた遺伝子配列を同定することができる。

ＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ＰＴＰ、その変異体もしくはフラグメント、 またはＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２アンチセンスＲＮＡおよびその変異体もし くはフラグメントを発現させるためには、適宜な宿主が認識しうる転写および翻 訳シグナルを必要とする。これらの方法により得られるクローニングされたＰＴ ＰＬ１またはＧＬＭ−２をコードする配列を好ましくは二本鎖の形で、発現ベク ター中の調節配列に作動可能なように連結させ、宿主細胞（原核細胞または真核 細胞）に導入して、組換えＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ＰＴＰ、その変異体 もしくはフラグメント、ＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２アンチセンスＲＮＡまた はその変異体もしくはフラグメントを製造することができる。

発現を望む目的に応じて、宿主は真核生物または原核生物のいずれであっても よい。たとえば目的がその活性の誘導物質または阻害物質の探索におけるＰＴＰ Ｌ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰの調節を研究することである場合、宿主は好まし くは真核生物である。好ましい１態様においては、真核宿主細胞はサル腎臓由来 のＣＯＳ細胞である。特に好ましい態様においては、宿主細胞はヒト繊維芽細胞 である。当技術分野で周知のように、他の多数の真核宿主細胞を用いることがで きる。たとえばアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞が真核生物ｍＲ ＮＡまたはＤＮＡの機能性発現に有用な細胞系を構成することは当技術分野で知 られている。この系はたとえばウサギのナトリウム：グルコース共輸送体をクロ ーニングするために用いられている（Ｈｅｄｉｇｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ８４：２６３４−２６３７ （１９８７））。あるいは目的が大量のＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰを 製造することである場合、原核生物発現系が好ましい。適切な発現系の選択は当 業者が容易になしうる範囲のものである。

ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰをコードする配列のいずれの鎖が調節配 列に作動可能なように連結しているかに応じて、発現ベクターはＰＴＰＬ１もし くはＧＬＭ−２ ＰＴＰ、その変異体もしくはフラグメントを産生するか、また はＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセンスＲＮＡ、その変異体もしくはフラグ メントを発現するであろう。それらのＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２アンチセンス ＲＮＡを用いて、ＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ＰＴＰの発現および／または それらの配列の複製を阻害することができる。

異なる宿主における蛋白質の発現により、蛋白質の特性を変化させる可能性の ある異なる翻訳後修飾が生じる場合がある。これは真核生物遺伝子を原核生物宿 主において発現させた場合に、特にそうである。しかし本発明においては、ＰＴ ＰＬ１およびＧＬＭ−２が細胞質ＰＴＰであり、翻訳後にグリコシル化されにく いので、これはさほど問題ではない。

抑制または活性化が可能な転写開始調節配列を選択し、これにより作動可能な ように連結した配列の発現を調節することができる。それらの調節配列には、温 度感受性であり、従って温度を変化させることにより発現を抑制もしくは開始し うる調節配列、または阻害物質もしくは誘導物質による化学的制御を受ける調節 配列が含まれる。同様に重要なものは、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ｍＲＮＡ 、およびＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ アンチセンスＲＮＡの両方が転写可能な 形態で得られるが、ただし異なるプロモーターまたは他の転写調節要素を含み、 従ってＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ｍＲＮＡの発現の誘導に伴って対応する アンチセンスＲＮＡの発現が抑制されるか、またはＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ− ２ ｍＲＮＡの発現の抑制に伴って対応するアンチセンスＲＮＡの発現が誘導さ れる構造体である。ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２ アンチセンスＲＮＡ配列を発 現することが目的である場合、翻訳配列は不必要である。

ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰをコードする配列に対して５’側または ３’側にある非転写および／または非翻訳配列は、本明細書に開示するプローブ のいずれかを用いる前記クローニング法により、ゲノムＤＮＡライブラリーから クローンを選択することにより得られる。５’側領域は、ＰＴＰＬ１またはＧＬ Ｍ−２ ＰＴＰの内因性調節配列として使用しうる。３’側非転写領域は、転写 終止調節配列として、または翻訳終止調節配列として使用しうる。天然の調節配 列が宿主細胞において十分に機能しない場合、宿主細胞において機能する外因性 配列を使用しうる。

本発明のベクターはさらに、作動可能なように連結した他の調節要素、たとえ ば作動可能なように連結したコーディング配列の組織特異性または細胞タイプ特 異性発現をもたらすＤＮＡ要素を含む。

ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチ ドプローブを用いて、関連核酸配列、たとえば対立遺伝子変異体または相同配列 を保有するゲノムまたはｃＤＮＡライブラリークローンを同定することができる 。ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２をコードする配列のフラグメントをコードしうる 適切なオリゴヌクレオチドもしくは一組のオリゴヌクレオチド、またはそれらの オリゴヌクレオチドもしくは一組のオリゴヌクレオチドのＰＴＰＬ１もしくはＧ ＬＭ−２アンチセンス相補体を、当技術分野において周知の手段で合成し（たと えばＳｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａ ｎｄ ＲＮＡ ，Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ編，１９８７，アカデミック・プレス、カ リフォルニア州サンディエゴ）、クローニングされたＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ −２配列、その変異体またはフラグメントを当技術分野において周知の手段で同 定および単離するために用いることができる。前記のように本明細書に開示する ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２配列のユニークフラグメントまたは実質的に特徴的 なフラグメントが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションおよびクローン同定の 技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第２版，コールド・スプリング ・ハーバー・ラボラトリー・プレス，ニューヨーク州プレインビュー（１９８９ ）、およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ，Ｉ ＲＬプレス，ワシントンＤＣ（１９８５）に示されている。クローニングの目的 のため、または単にＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２配列の存在を検出するための いず れであっても、目的とするＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２核酸配列の検出を容易に するために、前記プローブを検出可能な基で標識することができる。このような 検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を備えた任意の物質であっ てよい。それらの物質は核酸ハイブリダイゼーションの分野で十分に開発されて おり、一般にそれらの方法に有用な大部分の任意の標識を本発明に利用しうる。

特に有用なものは、放射性標識である。適切なシグナルを提供し、かつ十分な半 減期をもつ、任意の放射性標識を使用しうる。一本鎖である場合、オリゴヌクレ オチドをキナーゼ反応により放射性標識することができる。あるいはオリゴヌク レオチドを非放射性マーカー、たとえばビオチン、酵素または蛍光性基で標識し た場合、それらも核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。たと えばＬｅａｒｙ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．（ＵＳＡ） ８０：４０４５（１９８３）；Ｒｅｎｚ，Ｍ.，ｅｔ ａｌ.，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．１２：３４３５（１９８４）；およびＲｅｎｚ ，Ｍ.,ＥＭＢＯ Ｊ．６：８１７（１９８３）を参照されたい。

本明細書に開示する配列をプローブまたはプライマーとして使用し、かつＰＣ Ｒクローニングおよびコロニー／プラークハイブリダイゼーションなどの方法を 用いることにより、ヒト対立遺伝子変異体、ならびにマウス、ラット、ウサギお よび非ヒト霊長類を含めた種からのＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２核酸配列に実質 的に類似または相同の配列を得ることは、当業者が容易になしうる範囲のもので ある。従って本発明はさらに、マウス、ラット、ウサギおよび霊長類のＰＴＰＬ １およびＧＬＭ−２を目的とする。

特に、ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２に関して本明細書に開示する蛋白質配列を 用いて、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰに関連する蛋白質をコードする類 似の配列および潜在的に進化上類似する配列を単離する際に有用な一組の縮重（ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プローブまたはＰＣＲプライマーを形成することができ る。それらの縮重プローブはＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２核酸配列のいずれのフ ラグメントにも実質的に類似しない場合があるが、本明細書に開示する蛋白質配 列に由来するので、請求の範囲の精神および範囲に包含されるものとする。ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２に対する抗体 以下の記載においては、免疫学の技術分野の当業者に周知の種々の方法につい て述べる。免疫学の一般的原理について述べた標準的な参考文献には下記のもの が含まれる：Ｃａｔｔｙ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ，Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ，ＩＲＬプレス，ワシントンＤＣ （１９８８）；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｎｏｎｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ，ジョ ン・ワイリー・アンド・サンズ，ニューヨーク（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ， Ｒ.，ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉ ｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａ ｎａｌｙｓｅｓ ，プレナム・プレス，ニューヨークワ（１９８０）；Ｃａｍｂｅ ｌｌ，Ａ．，“モノクローナル抗体技術”，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｖｏｌ．１３（Ｂｕｒｄｏｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．編），エル ゼビル，アムステルダム（１９８４）；およびＥｉｓｅｎ，Ｈ．Ｎ．，Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌｏｇｙ ，第３版（Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．編）ハーパー ・アンド・ロー、フィラデルフィア（１９８０）。

本発明の抗体は多様な方法のいずれかにより調製される。１態様においては、 ＰＴＰ、その変異体またはフラグメントに結合しうるポリクローナル抗体を含有 する血清の生成を誘導するために、精製されたＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２、そ の変異体またはフラグメントを動物に投与する。

動物における抗血清の調製法は周知の技術である（たとえばＣｈａｒｄ，Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，“ラジオイ ムノアッセイおよび関連技術への入門”，ノース・ホランド・パブリシング・カ ンパニー（１９７８），ｐｐ．３８５−３９６；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ，Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ，Ｄ．Ｃａ ｔｔｙ編，ＩＲＬプレス，ワシントンＤＣ（１９８８））。動物の選択は通常は 、利用しうる手段と得られる抗血清の量に関して考えられる要件とのバランスに より決定される。大量の血清を容易に得ることができるので、大型の種、たとえ ば ヤギ、ロバおよびウマが好ましい。しかしより小型の種、たとえばしばしばより 高い力価の抗血清を与えるウサギまたはモルモットも使用しうる。通常は抗原性 物質（蛋白質もしくはそのフラグメント、またはハプテン−キャリヤー蛋白質結 合体）の皮下注射を採用する。適切な抗体の検出は、抗血清を適宜標識されたト レーサー含有分子で試験することにより実施しうる。次いでトレーサー含有分子 に結合する画分を単離し、必要な場合にはさらに精製する。

ＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ＰＴＰ、その変異体もしくはフラグメント、 またはそれらの蛋白質の混合物、その変異体もしくはフラグメントを発現する細 胞を、ポリクローナル抗体（それらのうち幾つかはＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ ＰＴＰを結合しうるであろう）を含有する血清の産生を誘導するために、動物 に投与することができる。所望によりそれらのＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２抗体 を、標準的な蛋白質精製技術により、特に精製されたＰＴＰＬ１もしくはＧＬＭ −２蛋白質またはその変異体もしくはフラグメントを用いるアフィニティークロ マトグラフィーにより、他のポリクローナル抗体から精製することができる。

ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２蛋白質フラグメントを化学的に合成し、それをＨ ＰＬＣにより精製して、実質的に純粋にすることもできる。次いでそれらの調製 物を、高い比活性のポリクローナル抗血清の調製のために動物に導入する。好ま しい態様においては、蛋白質をキャリヤー蛋白質、たとえばウシ血清アルブミン またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させ、そしてこれを 用いて当技術分野で周知の慣用される技術によって免疫感作することができる。

さらにＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２蛋白質を免疫学的に不活性または活性なキャ リヤーと混合することができる。免疫応答を促進または誘導するキャリヤー、た とえばフロイントの完全アジュバントを使用しうる。

モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術により調製しうる（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ ａｌ ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒ，ｅ ｔ ａｌ ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌ ｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ，エルゼビル，ニューヨ ーク，ｐｐ．５６３−６８１（１９８１））。一般にそれらの方法は動物をＰＴ ＰＬ１もしくはＧＬＭ−２ ＰＴＰ、またはその変異体もしくはフラグメントで 免疫感作することを伴う。それらの動物の脾細胞を摘出し、適切な骨髄腫細胞株 と融合させる。融合後に、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地上で選択的 に維持し、次いでＷａｎｄｓ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏ−ｅｎｔ ｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１）の記載に従った限界希釈法 によりクローニングする。この参考文献は本明細書に参考として含まれるものと する。次いでこのような選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして 、ＰＴＰおよび／またはＰＴＰ抗原を結合しうる抗体を分泌するクローンを同定 する。当技術分野で用いられる方法を採用すると、形質転換細胞株の増殖は恐ら く古典的な骨髄腫法より有望である。

上記方法を利用することにより、ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２ ＰＴＰのエピ トープを認識する抗体を産生しうる他の細胞株を得ることができる。

これらの抗体を、脳、芽腫または他の組織中におけるＰＴＰＬ１およびＧＬＭ −２ ＰＴＰのマーカー（定量的および定性的の両方）として臨床的に利用しう る。さらにこれらの抗体は、癌患者または他の患者においてＰＴＰ機能を評価す る方法に有用である。

ＰＴＰＬ１に対する２抗体を産生する方法を実施例５に概説する。実質的に純粋なＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２蛋白質 当該技術分野において知られている種々の方法論を用いて、精製したＰＴＰＬ １またはＧＬＭ−２のＰＴＰを得ることができる。１つの方法においては、天然 に蛋白質を産生する組織または細胞から蛋白質を精製する。あるいは、発現ベク ターを細胞内に導入して蛋白質を産生させることができる。たとえば、ヒト繊維 芽細胞またはサル腎臓ＣＯＳ細胞を用いることができる。他の態様においては、 ｍＲＮＡ転写体を、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞またはウサギ網状赤血球等の細胞の 中にマイクロインジェクションすることができる。他の態様においては、ｍＲＮ Ａをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系とともに用いる。好ましい態様においては、細菌細 胞を用いて大量の蛋白質を生成する。特に好ましい態様においては、細菌ＧＳＴ フュージョン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の融合蛋白質を用い、融合生成物をアフ ィニティークロマトグラフィーにより精製し、ハイブリッドを連結しているアミ ノ酸配列を切断することによりＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２蛋白質をハイブリッ ドから切り離すことができる。

当業者は、本発明の開示に照らして、天然の混入物を含まない実質的に純粋な ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰを得るために、既知の方法にしたがって容 易に蛋白質を単離することができる。これらには、免疫クロマトグラフィー、Ｈ ＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およ び免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれるが、これらに制限されるも のではない。

純度の判定は、物理的性状決定（サイズ分画における分子量等）、免疫学的技 術または酵素的アッセイにより実施することができる。

上述の方法にしたがって、または上述の一連の工程の均等物を用いる方法によ り精製したＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰ、これらの変異体もしくはフラ グメントは、ＰＴＰ活性を阻害もしくは増強するための医薬組成物のための、お よびｉｎ ｖｉｔｒｏ脱リン酸のためのポリクローナルおよびモノクローナル抗 体の調製において有用である。ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２の核酸および蛋白質の変異体 変更された核酸配列を有するＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２の変異体は、ＤＮＡ の突然変異誘発により製造することができる。これは、当該技術分野において知 られている突然変異誘発方法の１つを用いて実施することができる。

ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２の変異体の製造は、好ましくは部位特異的突然変 異誘発により行う。部位特異的突然変異誘発により、所望の突然変異ＤＮＡ配列 を含む特定のオリゴヌクレオチドを用いてこれらのＰＴＰの変異体を製造するこ とが可能となる。

部位特異的突然変異誘発は、典型的には一本鎖および二本鎖の両方の形で存在 するファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘発に有用な典型的なベク ターには、Ｍｅｓｓｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｉｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ および Ｒｅｃｏ ｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ，Ａ．Ｗａｌｔｏｎ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍ ｓｔｅｒｄａｍ（１９８１）に記載されるようなＭ１３ファージが含まれる（こ れらの開示を本明細書の一部としてここに引用する）。これらのファージは商業 的に入手可能であり、これらの使用は一般に当業者によく知られている。あるい は、一本鎖ファージ複製起点を含むプラスミドベクター（Ｖｅｉｒａ，ｅｔ ａ ｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３（１９８７）を用いて一本鎖ＤＮ Ａを得ることができる。

一般に、本発明にしたがう部位特異的突然変異誘発は、まずその配列中に変更 すべきＤＮＡ配列を含む一本鎖ベクターを得ることにより行う。所望の突然変異 配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般には合成により、たとえば Ｃｒｅａ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ７５：５７６５（１９７８）の方法により製造する。次にプライマーを変更すべ き配列を含む一本鎖ベクターとアニーリングさせ、作成されたベクターをＥ．ｃ ｏｌｉポリメラーゼＩクレノーフラグメント等のＤＮＡ重合酵素とともに適当な 反応緩衝液中でインキュベートする。ポリメラーゼは、突然変異含有鎖の合成を 完成させるであろう。したがって、第２鎖は所望の突然変異を含むであろう。次 にこのヘテロデュープレックスベクターを用いて適当な細胞を形質転換し、突然 変異配列を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。

配列変異を導入するための部位はあらかじめ決定するが、突然変異それ自体は あらかじめ決定する必要はない。たとえば、ある部位における突然変異の成果を 最適化するために、標的領域においてランダム突然変異誘発を実施し、新たに発 生した配列を所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングすることが できる。当業者は、日常的なスクリーニングアッセイにより変異体の機能性を評 価することができる。

本発明はさらに、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰの融合生成物を含む。

広く知られているように、真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをコー ドするコドンにおいて開始する。真核生物プロモーターとＰＴＰＬ１またはＧＬ Ｍ−２配列との間にこのようなコドンが存在すると、融合蛋白質が形成されるか （ＡＴＧコドンがＰＴＰをコードするＤＮＡ配列と同一のリーディングフレーム にある場合）またはフレームシフト突然変異が生ずる（ＡＴＧコドンがＰＴＰを コードするＤＮＡ配列と同一のリーディングフレームにない場合）。融合蛋白質 は、これらのＰＴＰの検出のための増強された免疫特異性を有するように構築し てもよい。ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰをコードする配列を、特定の宿 主からの蛋白質の分泌またはその宿主内での蛋白質の区画化を可能とするシグナ ル配列に連結することもできる。このようなシグナル配列は、続いてシグナルペ プチド配列を除去しうるように特定のプロテアーゼ部位を含むかまたは含まない ように設計することができる。

本発明はさらに、検出可能なように標識した、固定化した、およびトキシンと コンジュゲートした形のＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２のＰＴＰ、ならびにこれら の変異体またはフラグメントを提供する。このような標識した、固定化した、ま たはトキシンとコンジュゲートした形の蛋白質の製造は、当業者にはよく知られ ている。放射性標識が代表的な具体例であるが、ＰＴＰまたはその変異体もしく はフラグメントはまた、当該技術分野において知られる技術を用いて蛍光標識、 酵素標識、フリーラジカル標識、アビジン−ビオチン標識、またはバクテリオフ ァージ標識を用いて標識することもできる（Ｃｈａｒｄ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ”Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉ ｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔ ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９７８））。

典型的な蛍光標識としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン 、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンおよびフルオレスア ミンが挙げられる。

典型的な化学発光化合物としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アク リジンエステル、イミダゾール、およびシュウ酸エステルが挙げられる。

典型的な生物発光化合物としては、ルシフェリンおよびルシフェラーゼが挙げ られる。典型的な酵素としては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダー ゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、マレエートデヒドロゲナ ーゼ、グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。形質転換した細胞、細胞株および宿主 哺乳動物細胞を本発明の核酸配列で形質転換するためには、組換えＤＮＡ構築 物を宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に挿入することが望まれるか、またはそれらを染 色体外型で存在させることが望まれるかに依存して、多くのベクター系が利用可 能である。ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰのコーディング配列を、動作可 能なように連結された制御配列とともに、非複製ＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子と して受容体真核生物細胞中に導入する場合、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴ Ｐの発現は、導入された配列の過渡的発現を通して起こる。そのような非複製Ｄ ＮＡ（またはＲＮＡ）分子は、線状分子であってもよく、より好ましくは自動的 に複製することができない閉環共有（ｃｌｏｓｅｄ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｉｒ ｃｕｌａｒ）分子でありうる。

好ましい態様においては、遺伝的に安定な形質転換体はベクター系または形質 転換系を用いて構築することができ、このことにより組換えＰＴＰＬ１またはＧ ＬＭ−２のＰＴＰのＤＮＡは宿主染色体中にインテグレーションされる。そのよ うなインテグレーションは、細胞内において新規に生じ、または最も好ましい態 様においては、機能的にそれ自身を宿主染色体に挿入するベクター、たとえばレ トロベクター、トランスポゾンまたはＤＮＡ配列の染色体へのインテグレーショ ンを促進する他のＤＮＡ要素を用いる形質転換により助けられる。所望の配列を 哺乳動物宿主細胞の染色体中にインテグレートすることができるベクターを用い る。好ましい態様においては、形質転換した細胞はヒト繊維芽細胞である。他の 好ましい態様においては、形質転換した細胞はサル腎臓ＣＯＳ細胞である。

それらの染色体中に安定にインテグレートした導入されたＤＮＡを有する細胞 は、染色体中に発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１またはそれ以 上のマーカー、たとえば抗生物質もしくは重金属（銅など）耐性等の生物毒耐性 を与えるマーカーをも導入することにより選択することができる。選択可能マー カーは、発現すべきＤＮＡ配列に直接連結するか、またはコトランスフェクショ ンにより同一の細胞に導入することができる。

別の態様においては、導入された配列を、受容体宿主中において自動複製しう るベクター中に取り込ませる。この目的のためには、以下に概要を記載するよう に、広範なベクターのいずれを用いることもできる。

特定のプラスミドまたはベクターの選択における重要な因子としては、ベクタ ーを含む受容体細胞が、ベクターを含まない受容体細胞から容易に認識され選択 されること；特定の宿主において望ましいベクターのコピー数；およびベクター を異なる種の宿主細胞の間で”シャトル”させうることが望ましいか否か、が挙 げられる。

好ましい真核生物プラスミドとしては、ウシパピローマウイルス、ＳＶ４０に 由来するプラスミド、および酵母においては２μｍ環を含むプラスミド等、およ びそれらの誘導体が挙げられれる。このようなプラスミドは当該技術分野におい てよく知られており（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉａｍｉ Ｗ ｎｔｒ．Ｓｙｍｐ ．１９：２６５−２７４（１９８２）；Ｂｒｏａｃｈ， Ｊ． Ｒ．，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓ ｔ Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ： Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒ ｉｔａｎｃｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０（１９８ １）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４（１９８２） ；Ｂｏｌｉｏｎ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏ ｎｃｏｌ ．１０：３９−４８（１９８０）；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏ ｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ Ｙ，ｐｐ．５６３−６０８（１９８０））、市販されている。たとえば、ＭＳＶ −ＬＴＲプロモーターを用いてクローニングされた遺伝子の発現を推進し、ヘル パーウイルスとともにコトランスフェクションしてプラスミドのコピー数を増幅 し、プラスミドを宿主細胞の染色体にインテグレートさせるする哺乳動物発現ベ クター系が記載されている（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．３：１１２３（１９８３）；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。

発現のためにベクターまたはＤＮＡ配列が用意できれば、これをトランスフェ クション等の種々の適当な方法のいずれかにより適当な宿主細胞中に導入する。

ベクターを導入した後、受容体細胞を選択培地中で増殖させ、ベクター含有細胞 の増殖を選択する。クローニングされた核酸配列の発現により、ＰＴＰＬ１また はＧＬＭ−２のＰＴＰが生成し、またはＰＴＰの変異体またはフラグメントが生 成し、またはＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のアンチセンスＲＮＡまたはその変異 体もしくはフラグメントが発現する。この発現は、過渡的様式で、連続的様式で 、またはたとえば形質転換した細胞の分化誘導（たとえばブロモデオキシウラシ ルを神経芽細胞腫細胞等に投与することによる）に続く発現等の制御された様式 で起こりうる。

本発明の他の態様においては、宿主はヒト宿主である。したがって、ＰＴＰＬ １またはＧＬＭ−２のＰＴＰ活性を欠損したヒトに、患者の内因性産生を補充し うる作動可能なＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２配列を導入するベクターを用いるこ とができる。他の態様においては、患者は、蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ） であるオンコジンにより引き起こされる癌に罹患している。ＰＴＰＬ１またはＧ ＬＭ−２蛋白質を発現しうるベクターを患者に導入してＰＴＫ活性を妨げる。

上述の方法にしたがって得られた組換えＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰ のｃＤＮＡコーディング配列を用いて、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のアンチセ ンスＲＮＡ配列を得ることができる。ＤＮＡ配列がＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２ アンチセンスＲＮＡ配列を発現するように制御配列に作動可能なように連結され たＤＮＡ配列を含む発現ベクターを構築する。このベクターにより形質転換を行 うと、形質転換した細胞においてＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２アンチセンスＲＮ Ａを発現しうる宿主細胞が得られる。好ましくは、このような発現は、所望のよ うに誘導および／または抑制されるような制御された様式で起こる。最も好まし くは、アンチセンスＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＲＮＡは、発現したときに、 内因性ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＤＮＡまたはＲＮＡと、ＰＴＰＬ１または ＧＬＭ−２のＰＴＰのＤＮＡ配列および／またはｍＲＮＡ転写体の転写および／ または翻訳を高度に特異的に阻害もしくは抑制するような様式で相互作用する。

アンチセンスＲＮＡプローブを用いて遺伝子発現を遮断することは、Ｌｉｃｈｔ ｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３３：８０１−８０２（１９８８）に 議論されている。アゴニストおよびアンタゴニストのアッセイ ＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２のクローニングにより、今や薬剤を単独でもしく は組み合わせて用いる治療戦略のためのＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰの 新規なアゴニスト（誘導剤／増強剤）およびアンタゴニスト（抑制剤／阻害剤） の同定および評価のためのスループットの高いアッセイの製造と使用が可能とな った。アッセイは、たとえば、トランスフェクトした細胞（たとえば繊維芽細胞 ）におけるＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰ活性を試験して、これらのＰＴ Ｐの発現または制御を妨害、増強または変更する薬剤を同定することができる。

さらに、開示されるＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２の核酸配列または蛋白質につい て開発されたプローブ（たとえばＤＮＡもしくはＲＮＡプローブまたはプライマ ーまたは蛋白質に対する抗体）を、細胞溶解物、全細胞または全組織においてＰ ＴＰの定性的および／または定量的指標として用いることができる。

好ましい態様においては、ヒト繊維芽細胞を、本明細書に開示されるＰＴＰＬ １またはＧＬＭ−２のＰＴＰの配列およびベクターで形質転換する。次に細胞を 種々の化合物で処理して、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２の転写、翻訳またはＰＴ Ｐ活性を増強もしくは阻害するものを同定する。さらに、ＰＤＧＦ（血小板由来 増殖因子）のシグナリング、細胞増殖、化学走性およびアクチン再構成について のアッセイは、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰの転写、翻訳または活性に 及ぼす化合物の影響を評価するために好ましい。

他の態様においては、化合物がＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰ活性を増 強または阻害する能力をｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイする。本明細書に開示され る実質的に純粋なＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰ、および検出可能なリン 酸化された基質を用いて、種々の化合物がＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のホスフ ァターゼ活性を増強または阻害する能力をアッセイすることができる。特に好ま しい態様においては、リン酸化された基質はパラニトリルフェニルホスフェート （脱リン酸により黄色に変化する）である。

他の態様においては、化合物がＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２の転写を増強また は阻害する能力をアッセイする。当業者は、本明細書に開示されるＰＴＰＬ１ま たはＧＬＭ−２のｃＤＮＡ配列を用いて、ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２遺伝子の ５’制御配列をクローニングすることができる。次に、これらの制御配列をマー カーをコードする配列に作動可能なように連結する。マーカーは容易にアッセイ しうる活性を有する酵素、または宿主細胞の表現型もしくはある分子に対する感 受性もしくは耐性の変化を引き起こすものでありうる。当業者には広範なマーカ ーが知られており、用いる宿主により適当なマーカーを選択することができる。

ＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２のＰＴＰの転写を変更する化合物は、マーカーに作 動可能なように連結したＰＴＰＬ１またはＧＬＭ−２制御配列で形質転換した細 胞に暴露し、マーカーの発現の増加または減少をアッセイすることにより試験す ることができる。

以下の実施例は、本発明のいくつかの態様を開発し実施するために用いられる 特定の材料および方法をさらに記載する。これらの実施例は今日までに用いられ た技術を例示するものにすぎず、いかなる意味においても本発明の範囲を限定す ることを意図するものではない。実施例１ ＰＴＰＬ１の最初のクローニング すべての細胞は、特に記載のない限り、１０％子牛胎児血清（ＦＣＳ，Ｆｌｏ ｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１００単位のペニシリン、５０μｇ／ｍｌの ストレプトマイシンおよびグルタミンを補充したダッベッコ改良イーグル培地（ ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。用いたヒト神経膠腫細胞株は、Ｕ−３４ ３ ＭＧａ ３１Ｌ（Ｎｉｓｔｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃａｎ ｃｅｒ Ｒｅｓ ．４８：３９１０−３９１８）であった。ＡＧ１５１８ヒト包皮 繊維芽細胞は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ｏｓｉｔｏｒｙ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪから入手した。

ＲＮＡは、Ｕ−３４３ ＭＧａ ３１Ｌ細胞またはＡＧ１５１８ヒト繊維芽細 胞から、グアニジンチオシアネート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）抽出（ Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９）により調製した。簡単には、細胞 を回収し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２５ｍＭクエン酸ナトリウム （ｐＨ７．０）および０．１Ｍ ２−メルカプトエタノールを含む４Ｍグアニジ ンチオシアネート中で溶解させた。ＲＮＡは５．７Ｍ塩化セシウムを通して沈殿 させ、次にＲＮＡペレットを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ緩衝液）に溶解し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エ タノールで沈殿させた。最終的なペレットは、−７０℃において保存するかまた はＴＥ緩衝液に再懸濁して次の操作を行った。ポリアデニル化［ポリ（Ａ）＋］ ＲＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２に記載されるように、オ リゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーにより調製した。

Ｕ−３４３ ＭＧａ ３１Ｌ細胞からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（５μｇ）を用い 、Ａｍｅｒｓｈａｍ λｇｔ１０ ｃＤＮＡクローニングシステムを用いてオリ ゴ（ｄＴ）−プライミングｃＤＮＡ合成によりｃＤＮＡライブラリを作成した。

同様に、５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ、ＲｉｂｏＣｌｏｎｅ ｃＤＮＡ合成シス テム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．，Ｕ ＳＡ）、ラムダＺＡＰＩＩ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＧｉｇａ ｐａｃｋ Ｇｏｌｄ ＩＩパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用 いて、ＡＧ１５１８繊維芽細胞からランダムおよびオリゴ（ｄＴ）プライミング ｃＤＮＡライブラリを調製した。既知のＰＴＰ配列の保存的アミノ酸領域に基づ いて縮重プライマーを設計し、Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌｕｓ（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）を用いて合成した。センスオリゴヌクレオチドは、配 列ＦＷＲＭ Ｉ／Ｖ ＷＥＱ（５’−ＴＴＣＴＧＧ Ａ／Ｃ ＧＮＡＴＧＡＴＮ ＴＧＧＧＡＡＣＡ−３’，２３ｍｅｒ，３２倍縮重）およびＫＣ Ａ／Ｄ Ｑ／ Ｅ ＹＷＰ（５’−ＡＡ Ａ／Ｇ ＴＧ Ｃ／Ｔ ＧＡＮＣＡＧＴＡ Ｃ／Ｔ ＴＧＧＣＣ−３’，２０ｍｅｒ，３２倍縮重）に対応し、アンチセンスオリゴヌ クレオチドは、配列ＨＣＳＡＧ Ｖ／Ｉ Ｇ（５’−ＣＣＮＡＣＮＣＣ Ａ／Ｃ ＧＣ Ａ／Ｇ ＣＴＧＣＡＧＴＧ−３’，２０ｍｅｒ，６４倍縮重）に基づいた 。Ｕ−３４３ ＭＧａ ３１Ｌライブラリ（１００ｎｇ）からのパッケージされ て いない鋳型ｃＤＮＡを、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５に記載されるよう に、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）、および１ ００ｎｇのアンチセンスプライマーと組み合わせた１００ｎｇのいずれかのセン スプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲは、９４℃、３０秒間の変性、４０℃、 ２分間、続いて５５℃、１分間のアニーリングおよび７２℃、２分間の伸長から なるサイクルを２５サイクル実施した。ＰＣＲ産物を２．０％低ゲル化温度アガ ロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＵＳＡ）で 分離し、約３６８塩基対（ＦＷＲＭセンスプライマーの場合）および約３００ｂ ｐ（ＫＣ Ａ／Ｄ Ｑセンスプライマーの場合）のＤＮＡフラグメントを切り出 し、ゲルから溶出し、Ｔ−テイルベクター（ＴＡクローニングキット，Ｉｎｖｉ ｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ） 中にサブクローニングし、配列決定した。

分析したＰＣＲ ｃＤＮＡクローンのいくつかからのヌクレオチド配列は、細 胞質およびレセプタータイプのＰＴＰの代表的なものであった。１３個のクロー ンは、ＭＥＧ（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１；８クローン）、ＰＴＰＨ１（Ｙ ａｎｇ ａｎｄ Ｔｏｎｋｓ，１９９１；２クローン）、Ｐ１９ＰＴＰ（ｄｅｎ Ｈｅｒｔｏｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）およびＴＣ−ＰＴＰ（Ｃｏｏｌ ｅ ｔ ａｌ．，１９８９，１クローン）を含む細胞質酵素をコードしており、１１ 個のクローンは、ＨＰＴＰ−α（Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，７ク ローン）、ＨＰＴＰ−γ（Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，３クローン ）およびＨＰＴＰ−δ（Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，１クローン） 等のレセプタータイプの酵素をコードしており、３個のクローンは新規なＰＴＰ 配列を規定していた。これらのうちの２つをＰＴＰＬ１およびＧＬＭ−２と名付 けた。

Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６ に記載のように、³²Ｐ−ランダムプラ イム標識（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）した、ＰＴＰＬ１ に対応する約３６８ｂｐの挿入物を用いて、Ｕ−３４３ ＭＧａ ３１Ｌ ｃＤ ＮＡライブラリをスクリーニングした。クローンλ６．１５を単離し、精製した ファージＤＮＡからＥｃｏＲＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）消化により切り出し、配列決 定のためにｐＵＣ１８中にサブクローニングした。他のｃＤＮＡクローンはすべ て、ＡＧ１５１８ヒト繊維芽細胞ｃＤＮＡライブラリから、³²Ｐ−標識λ６．１ ５挿入物で、次に単離された部分ｃＤＮＡクローンでスクリーニングして単離し た。

二本鎖プラスミドＤＮＡは、単一チューブミニ調製法（Ｄｅｌ Ｓａｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８）またはＭａｇｉｃ ｍｉｎｉまたはｍａｘｉｐｒｅｐキッ ト（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造元の仕様書にしたがって調製した。二本鎖Ｄ ＮＡは変性させて、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ） 、およびＭ１３−ユニバーサルプライマーおよび逆プライマーまたは配列決定し つつあるｃＤＮＡに由来する合成オリゴヌクレオチドを用いるジデオキシヌクレ オチド鎖停止法による配列決定のための鋳型として用いた。合計８０４０ｂｐの ６個の重複するｃＤＮＡクローンからＰＴＰＬ１の完全な７３９５ｂｐのオープ ンリーディングフレームが得られ、約２７５ｋＤａの分子量を有する２４６５ア ミノ酸の蛋白質が予測される。８０４０ｂｐの配列は配列番号１に開示される。実施例２ ＧＬＭ−２の最初のクローニング ヒト神経膠腫細胞株Ｕ−３４３ ＭＧａ ３１Ｌ（Ｎｉｓｔｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：３９１０−３９１８）を 、１０％子牛胎児血清（ＦＣＳ，Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１０ ０単位のペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグル タミンを補充したダッベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）中で培 養した。

総ＲＮＡは、Ｕ−３４３ ＭＧａ ３１Ｌ細胞から、グアニジンチオシアネー ト（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）抽出（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ． ，１９７９）により調製した。簡単には、細胞を回収し、リン酸緩衝食塩水（Ｐ ＢＳ）で洗浄し、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および０．１Ｍ ２−メルカプトエタノールを含む４Ｍグアニジンチオシアネート中で溶解させた 。ＲＮＡは５．７Ｍ塩化セシウムを通して沈殿させ、次にＲＮＡペレットを１０ ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＥ緩衝液）に溶解し、 フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。最終的なペ レットは、−７０℃において保存するかまたはＴＥ緩衝液に再懸濁して次の操作 を行った。ポリアデニル化［ポリ（Ａ）＋］ＲＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２に記載されるように、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマト グラフィーにより調製した。

Ｕ−３４３ ＭＧａ ３１Ｌ細胞から単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（５μｇ ）を用い、Ａｍｅｒｓｈａｍ λｇｔ１０ ｃＤＮＡクローニングシステムを用 いてオリゴ（ｄＴ）−プライミングｃＤＮＡ合成によりｃＤＮＡライブラリを作 成した。既知のＰＴＰ配列の保存的アミノ酸領域に基づいて縮重プライマーを設 計し、Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌｕｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ ）を用いて合成した。センスオリゴヌクレオチドは、配列ＦＷＲＭ Ｉ／Ｖ Ｗ ＥＱ（５’−ＴＴＣＴＧＧ Ａ／Ｃ ＧＮＡＴＧＡＴＮＴＧＧＧＡＡＣＡ−３’ ，２３ｍｅｒ，３２倍縮重，プライマーＰ１）およびＫＣ Ａ／Ｄ Ｑ／Ｅ Ｙ ＷＰ（５’−ＡＡ Ａ／Ｇ ＴＧ Ｃ／Ｔ ＧＡＮＣＡＧＴＡ Ｃ／Ｔ ＴＧＧ ＣＣ−３’，２０ｍｅｒ，３２倍縮重，プライマーＰ２）に対応し、アンチセン スオリゴヌクレオチドは、配列ＨＣＳＡＧ Ｖ／Ｉ Ｇ（５’−ＣＣＮＡＣＮＣ Ｃ Ａ／Ｃ ＧＣ Ａ／Ｇ ＣＴＧＣＡＧＴＧ−３’，２０ｍｅｒ，６４倍縮重 ，プライマーＰ３）に基づいた。Ｕ−３４３ ＭＧａ ３１Ｌライブラリ（１０ ０ｎｇ）からのパッケージされていない鋳型ｃＤＮＡを、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａ ｌ．，１９８５に記載されるように、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ ｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）、および１００ｎｇのアンチセンスプライマーと組み合わ せた１００ｎｇのいずれかのセンスプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲは、９ ４℃、３０秒間の変性、４０℃、２分間、続いて５５℃、１分間のアニーリング および７２℃、２分間の伸長からなるサイクルを２５サイクル実施した。ＰＣＲ 産物を２．０％低ゲル化温度アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＵＳＡ）で分離し、約３６８塩基対（ＦＷＲＭセンスプラ イマーの場合）および約３００ｂｐ（ＫＣ Ａ／Ｄ Ｑセンスプライマーの場合 ）のＤＮＡフラグメントを切り出し、ゲルから溶出し、Ｔ−テイルベクター（Ｔ Ａクロ ーニングキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄ ｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）中にサブクローニングし、配列決定した。二本鎖プラ スミドＤＮＡは、単一チューブミニ調製法（Ｄｅｌ Ｓａｌ ｅｔ ａｌ．，１ ９８８）またはＭａｇｉｃ ｍｉｎｉまたはｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍ ｅｇａ）を用いて製造元の仕様書にしたがって調製した。二本鎖ＤＮＡは変性さ せて、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）、およびＭ１ ３−ユニバーサルプライマーおよび逆プライマー、または脳ｃＤＮＡライブラリ から単離されたｃＤＮＡクローンの場合には配列決定しつつあるｃＤＮＡに由来 する合成オリゴヌクレオチドをも用いるジデオキシヌクレオチド鎖停止法による 配列決定のための鋳型として用いた。

λｇｔ１０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｌｉｆ．）中に構築したヒト脳ｃＤＮＡ ライブラリを、Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６ に記載のように、³²Ｐ− ランダムプライム標識（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）した 、ＧＬＭ−２に対応する約３６０ｂｐの挿入物を用いてスクリーニングした。ク ローンＨＢＭ１を単離し、精製したファージＤＮＡからＥｃｏＲＩ（Ｂｉｏｌａ ｂｓ）消化により切り出し、配列決定のためにプラスミドベクターｐＵＣ１８ま たはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローニングした 。得られた配列は配列番号３として記載されている。実施例３ ＰＴＰＬ１の組織特異的発現 ホルムアルデヒドおよびホルムアミド中で変性させた総ＲＮＡ（２０μｇ）ま たはポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（２μｇ）を、ホルムアルデヒド／１％アガロースゲル 上の電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移した。フィルターは、５×標 準食塩水クエン酸塩（ＳＳＣ；１×ＳＳＣは、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐ Ｈ７．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、５０％ホルムアミド、０．１％ドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１ｍｇ／ｍ ｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、³²Ｐ−標識プローブを用いて４２℃で１６時 間ハイブリダイズさせた。すべてのプローブは、ランダムプライミング（Ｆｅｉ ｎｇｅｒｇ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，１９８３）により標識し、取り込 まれなかった³²ＰはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ ）クロマトグラフィーにより除去した。製造元の仕様書にしたがって、ヒト組織 ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｌｉｆ）をＰＴＰＬ１特異的プローブとハイ ブリダイズさせた。フィルターは、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６０℃にお いて３０分間（２回）、および０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６０℃にお いて３０分間（１回）洗浄し、増感スクリーン（Ｃｒｏｎｅｘ Ｌｉｇｈｔｉｎ ｇ Ｐｌｕｓ，Ｄｕｐｏｎｔ）を用いて−７０℃においてＸ線フィルム（Ｆｕｊ ｉ，ＸＲ）を感光させた。

種々のヒト組織からのＲＮＡのノーザンブロット分析は、９．５ｋｂのＰＴＰ Ｌ１転写体が異なるレベルで発現していることを示した。腎臓、胎盤、卵巣およ び精巣では高い発現を示し、これに対して、肺、膵臓、前立腺および脳組織では 中程度に、心臓、骨格筋、脾臓、肝、小腸、および結腸では低く、そしてリンパ 球では検出しうる発現はほとんどなかった。実施例４ ＧＬＭ−２の組織特異的発現 ヒト組織におけるＧＬＭ−２ ｍＲＮＡの発現を調べるために、ヒト心臓、脳 、胎盤、肺、肝、骨格筋、腎臓および膵臓組織からのｍＲＮＡを含む市販のフィ ルター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてノーザンブロット 分析を実施した。製造元の仕様書にしたがって、³²Ｐ−標識ＧＬＭ−２ ＰＣＴ 産物をプローブとして用いてフィルターをハイブリダイズさせ、０．１％ドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２×標準食塩水クエン酸塩（ＳＳＣ；１×Ｓ ＳＣは、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム ）中で６０℃において３０分間（２回）、および０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤ Ｓ中で６０℃において３０分間（１回）洗浄し、増感スクリーン（Ｃｒｏｎｅｘ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｐｌｕｓ，Ｄｕｐｏｎｔ）を用いて−７０℃においてＸ線 フィルム（Ｆｕｊｉ，ＲＸ）を感光させた。実施例５ ＰＴＰＬ１特異的抗血清の製造 ＰＴＰＬ１のアミノ酸残基１８０２から１８２３（ＰＡＫＳＤＧＲＬＫＰＧＤ ＲＬＩＫＶＮＤＴＤＶ）および４５０から４７０（ＤＥＴＬＳＱＧＱＳＱＲＰＳ ＲＱＹＥＴＰＦＥ）に対応するペプチドに対する、それぞれαＬ１ＡおよびαＬ １Ｂと名付けられるウサギ抗血清を製造した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成機でｔ−ブトキシカルボニル化学を用いてペプチ ドを合成し、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。記載されるよう に（Ｇｕｌｌｉｃｋ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４ ：２８６９−２８７７）、グルタルアルデヒドを用いてペプチドをキーホールリ ンペットヘモシアニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）にカップリン グさせ、次にフロイントアジュバントと混合してウサギの免疫感作に用いた。プ ロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）を用いるア フィニティークロマトグラフィーにより、製造元により記載されるように、αＬ １Ａ抗血清を精製した。実施例６ ＰＴＰＬ１ ｃＤＮＡのＣＯＳ−１細胞へのトランスフェクション 重複するクローンを用いて完全長ＰＴＰＬ１ ｃＤＮＡを構築し、ＳＶ４０系 発現ベクターｐＳＶ７ｄ（Ｔｒｕｅｔｔ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８５ ）ＤＮＡ ４：３３３−３４９）中にクローニングし、リン酸カルシウム沈殿法 （Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｃｅｌｌ １６：７７７− ７８５）によりＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。簡単には、細胞を６ウ エル細胞培養プレートに５×１０⁵細胞／ウエルの密度で播種し、翌日１０μｇ のプラスミドでトランスフェトした。一夜インキュベートした後、２５ｍＭ Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂および０．６ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄を含 む緩衝液で細胞を３回洗浄し、次に１０％子牛胎児血清および抗生物質を含むダ ルベッコ改良イーグル培地でインキュベートした。トランスフェクションの２日 後、細胞を用いて代謝標識し、免疫沈殿およびＳＤＳゲル電気泳動、または免疫 沈殿後に脱リン酸実験を行った。実施例７ ＰＴＰＬ１の代謝標識、免疫沈殿および電気泳動 ＣＯＳ−１細胞、ＡＧ１５１８細胞、ＰＣ−３細胞、ＣＣＬ−６４細胞、Ａ５ ４９細胞およびＰＡＥ細胞の代謝標識は、メチオニンフリー、システインフリー ＭＣＤＢ１０４培地（Ｇｉｂｃｏ）中で１５０μＣｉ／ｍｌの［³⁵Ｓ］メチオニ ンおよび［³⁵Ｓ］システイン（ｉｎ ｖｉｖｏラベリングミックス；Ａｍｅｒｓ ｈａｍ）を用いて４時間実施した。標識後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％デオキシコレート、０．５％Ｔｒａｓｙｌｏｌ （Ｂａｙ ｅｒ）および１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ；Ｓｉｇｍａ） を含む緩衝液中で細胞を可溶化した。氷上に１５分間置いた後、遠心分離により 細胞破片を除去した。次に、試料（１ｍｌ）を、αＬ１Ａ抗体または１０μｇの ペプチドであらかじめブロッキングしたαＬ１Ａ抗体とともに、４℃で１．５時 間インキュベートした。次に、免疫複合体を５０μｌのプロテインＡ−セファロ ース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）スラリー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の ５０％充填ビーズ）と混合し、４℃において４５分間インキュベートした。ビー ズをペレット化し、洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、５ ００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％デオキシコレート および０．２％ＳＤＳ）で４回洗浄し、次に蒸留水で１回洗浄した。ＳＤＳ−試 料緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８、０．０１％ブロモフェ ノールブルー、３６％グリセロール、４％ＳＤＳ）中で、１０ｍＭジチオスレイ トール（ＤＴＴ）の存在下で５分間沸騰させることにより免疫複合体を溶出し、 ４−７％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ゲル電気泳動で分析した（Ｂ ｌｏｂｅｌ，Ｇ．，ａｎｄ Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９７５）Ｊ．Ｃ ｅｌｌ Ｂｉｏｌ ．６７：８３５−８５１）。ゲルを固定し、Ａｍｐｌｉｆｙ（ Ａ ｍｅｒｓｈａｍ）とともに２０分間インキュベートし、乾燥し、フルオログラフ ィーに供した。実施例８ ＰＴＰＬ１についての脱リン酸アッセイ ＣＯＳ−１細胞を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％ デオキシコレート、１．５％Ｔｒａｓｙｌｏｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１ｍＭ ＤＴＴ中で１５分間溶解させた。遠心分離により溶解物を透明にし、３μｌの 抗血清αＬ１Ｂ（１０μｇのペプチドであらかじめブロッキングしたまたはして いない）を加え、試料を４℃において２時間インキュベートした。次に、プロテ インＡ−セファローススラリー（２５μｌ）を加え、４℃においてさらに３０分 間インキュベートを続けた。ビーズをペレット化し、溶解緩衝液で４回および脱 リン酸アッセイ緩衝液（２５ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１ｍｇ／ ｍｌウシ血清アルブミンおよび１ｍＭ ＤＴＴ）で１回洗浄し、最後に、チロシ ン残基で³²Ｐ−標識した、バキュロウイルス発現したインスリンレセプターの細 胞内部分である２μＭのミエリン塩基性蛋白質（Ａ．Ｊ．Ｆｌｉｎｔ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）およびＭ．Ｍ．Ｃｏｂ ｂ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ）より提供された）を含む脱リン 酸アッセイ緩衝液に再懸濁した。３０℃において指示された時間インキュベート した後、木炭混合物（Ｓｔｒｅｕｌｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１５２３−１５３０）で反応を停止させ、上清の放射 活性をチェレンコフ計数により決定した。それぞれの試料について、５ｃｍ²の コンフルエント細胞に対応する溶解物を用いた。

上述は単にある好ましい態様および特定の実験の態様の例の詳細な記載である ことを理解すべきである。したがって、当業者には、本発明の精神および請求の 範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更および均等物が 可能であることが明らかである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８

【提出日】１９９５年１０月６日

【補正内容】 請求の範囲 １．ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼをコードするヌクレオチド配列を 含む単離された核酸であって、 （ａ） 配列番号１のコーディング領域； （ｂ） ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）の核酸また は（ａ）の核酸の相補体にハイブリダイズする核酸；および （ｃ） 遺伝コードの縮重のためにコドン配列において（ａ）および（ｂ）の核 酸とは異なる核酸； からなる群より選択される核酸。 ２．前記ＰＴＰＬ１が配列番号２を含む、請求項１記載の単離された核酸。 ３．前記ヌクレオチド配列が配列番号１を含む、請求項１記載の単離された核酸 。 ４．前記ヌクレオチド配列が、ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼをコー ドするｍＲＮＡが発現されるように制御配列に作動可能なように連結されている 、請求項１−３のいずれかに記載の単離された核酸。 ５．前記ヌクレオチド配列が、ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼをコー ドするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡが発現されるように制御配列 に作動可能なように連結されている、請求項１−３のいずれかに記載の単離され た核酸。 ６．請求項１−５のいずれかに記載の単離された核酸がその中に導入されている トランスジェニック宿主。 ７．前記宿主がＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、繊維芽細胞、卵母細胞および 胚幹細胞からなる群より選択される、請求項６記載のトランスジェニック宿主。 ８．ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼを含む実質的に純粋な蛋白質であ って、前記ＰＴＰＬ１が配列番号２および配列番号２の対立遺伝子変異体からな る群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする蛋白質。 ９．前記アミノ酸配列が配列番号２を含む、請求項８記載の実質的に純粋な蛋白 質。 １０．請求項８記載のＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼのエピトープに 選択的に結合しうる実質的に純粋な抗体。 １１．請求項９記載のＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼのエピトープに 選択的に結合しうる実質的に純粋な抗体。 １２．請求項８または９に記載のＰＴＰＬ１の発現または活性を変更しうる化合 物を検出する方法であって、 （ａ） ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼをコードする核酸を細胞内に 導入し； （ｂ） 前記細胞または前記細胞の子孫を、前記ＰＴＰＬ１の発現を可能とする 時間および条件下で増殖させ； （ｃ） 前記細胞または前記細胞の前記子孫を試験化合物と接触させ； （ｄ） 前記細胞または前記細胞の前記子孫について、前記ＰＴＰＬ１の活性の 指標に関してアッセイを実施する； の各工程を含む方法。 １３．さらに、前記細胞または前記細胞の前記子孫を前記試験化合物と接触させ る前に、前記細胞または前記細胞の前記子孫について、前記ＰＴＰＬ１の活性の 指標に関してアッセイを実施する工程を含む、請求項１２記載の方法。 １４．ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼをコードするヌクレオチド配列 を含む単離された核酸であって、 （ａ） 配列番号３のコーディング領域； （ｂ） ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）の核酸また は（ａ）の核酸の相補体にハイブリダイズする核酸；および （ｃ） 遺伝コードの縮重のためにコドン配列において（ａ）および（ｂ）の核 酸とは異なる核酸： からなる群より選択される核酸。 １５．前記ＧＬＭ−２が配列番号４を含む、請求項１４記載の単離された核酸。 １６．前記ヌクレオチド配列が配列番号３を含む、請求項１４記載の単離された 核酸。 １７．前記ヌクレオチド配列が、ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼをコ ードするｍＲＮＡが発現されるように制御配列に作動可能なように連結されてい る、請求項１４−１６のいずれかに記載の単離された核酸。 １８．前記ヌクレオチド配列が、ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼをコ ードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡが発現されるように制御配 列に作動可能なように連結されている、請求項１４−１６のいずれかに記載の単 離された核酸。 １９．請求項１４−１８のいずれかに記載の単離された核酸がその中に導入され ているトランスジェニック宿主。 ２０．前記宿主がＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、繊維芽細胞、卵母細胞およ び胚幹細胞からなる群より選択される、請求項１９記載のトランスジェニック宿 主。 ２１．ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼを含む実質的に純粋な蛋白質で あって、前記ＧＬＭ−２が配列番号４および配列番号４の対立遺伝子変異体から なる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする蛋白質。 ２２．前記アミノ酸配列が配列番号４を含む、請求項２１記載の実質的に純粋な 蛋白質。 ２３．請求項２１記載のＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼのエピトープ に選択的に結合しうる実質的に純粋な抗体。 ２４．請求項２２記載のＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼのエピトープ に選択的に結合しうる実質的に純粋な抗体。 ２５．請求項２１または２２に記載のＧＬＭ−２の発現または活性を変更しうる 化合物を検出する方法であって、 （ａ） ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼをコードする核酸を細胞内に 導入し； （ｂ） 前記細胞または前記細胞の子孫を、前記ＧＬＭ−２の発現を可能とする 時間および条件下で増殖させ； （ｃ） 前記細胞または前記細胞の前記子孫を試験化合物と接触させ； （ｄ） 前記細胞または前記細胞の前記子孫について、前記ＧＬＭ−２の活性の 指標に関してアッセイを実施する； の各工程を含む方法。 ２６．さらに、前記細胞または前記細胞の前記子孫を前記試験化合物と接触させ る前に、前記細胞または前記細胞の前記子孫について、前記ＧＬＭ−２の活性の 指標に関してアッセイを実施する工程を含む、請求項２５記載の方法。

【手続補正書】特許法第１８４条の８

【提出日】１９９５年１１月３０日

【補正内容】 請求の範囲 １．ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼをコードするヌクレオチド配列を 含む単離された核酸であって、 （ａ） 配列番号１のコーディング領域； （ｂ） （ａ）の核酸または（ａ）の核酸の相補体と実質的に類似または相同で ある核酸；および （ｃ） 遺伝コードの縮重のためにコドン配列において（ａ）および（ｂ）の核 酸とは異なる核酸； からなる群より選択される核酸。 ２．前記ＰＴＰＬ１が配列番号２を含む、請求項１記載の単離された核酸。 ３．前記ヌクレオチド配列が配列番号１を含む、請求項１記載の単離された核酸 。 ４．前記ヌクレオチド配列が、ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼをコー ドするｍＲＮＡが発現されるように制御配列に作動可能なように連結されている 、請求項１−３のいずれかに記載の単離された核酸。 ５．前記ヌクレオチド配列が、ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼをコー ドするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡが発現されるように制御配列 に作動可能なように連結されている、請求項１−３のいずれかに記載の単離され た核酸。 ６．請求項１−５のいずれかに記載の単離された核酸がその中に導入されている トランスジェニック宿主。 ７．前記宿主がＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、繊維芽細胞、卵母細胞および 胚幹細胞からなる群より選択される、請求項６記載のトランスジェニック宿主。 ８．ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼを含む実質的に純粋な蛋白質であ って、前記ＰＴＰＬ１が配列番号２および配列番号２の対立遺伝子変異体からな る群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする蛋白質。 ９．前記アミノ酸配列が配列番号２を含む、請求項８記載の実質的に純粋な蛋白 質。 １０．請求項８記載のＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼのエピトープに 選択的に結合しうる実質的に純粋な抗体。 １１．請求項９記載のＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼのエピトープに 選択的に結合しうる実質的に純粋な抗体。 １２．請求項８または９に記載のＰＴＰＬ１の発現または活性を変更しうる化合 物を検出する方法であって、 （ａ） ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼをコードする核酸を細胞内に 導入し； （ｂ） 前記細胞または前記細胞の子孫を、前記ＰＴＰＬ１の発現を可能とする 時間および条件下で増殖させ； （ｃ） 前記細胞または前記細胞の前記子孫を試験化合物と接触させ； （ｄ） 前記細胞または前記細胞の前記子孫について、前記ＰＴＰＬ１の活性の 指標に関してアッセイを実施する； の各工程を含む方法。 １３．さらに、前記細胞または前記細胞の前記子孫を前記試験化合物と接触させ る前に、前記細胞または前記細胞の前記子孫について、前記ＰＴＰＬ１の活性の 指標に関してアッセイを実施する工程を含む、請求項１２記載の方法。 １４．ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼをコードするヌクレオチド配列 を含む単離された核酸であって、 （ａ） 配列番号３のコーディング領域； （ｂ） （ａ）の核酸または（ａ）の核酸の相補体と実質的に類似または相同で ある核酸；および （ｃ） 遺伝コードの縮重のためにコドン配列において（ａ）および（ｂ）の核 酸とは異なる核酸； からなる群より選択される核酸。 １５．前記ＧＬＭ−２が配列番号４を含む、請求項１４記載の単離された核酸。 １６．前記ヌクレオチド配列が配列番号３を含む、請求項１４記載の単離された 核酸。 １７．前記ヌクレオチド配列が、ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼをコ ードするｍＲＮＡが発現されるように制御配列に作動可能なように連結されてい る、請求項１４−１６のいずれかに記載の単離された核酸。 １８．前記ヌクレオチド配列が、ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼをコ ードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡが発現されるように制御配 列に作動可能なように連結されている、請求項１４−１６のいずれかに記載の単 離された核酸。 １９．請求項１４−１８のいずれかに記載の単離された核酸がその中に導入され ているトランスジェニック宿主。 ２０．前記宿主がＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、繊維芽細胞、卵母細胞およ び胚幹細胞からなる群より選択される、請求項１９記載のトランスジェニック宿 主。 ２１．ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼを含む実質的に純粋な蛋白質で あって、前記ＧＬＭ−２が配列番号４および配列番号４の対立遺伝子変異体から なる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする蛋白質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/16 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 サラス，ヤン スウェーデン王国エス―752 40 ウプサ ラ，リングスベルグスガタン 15ベー (72)発明者 クラエソン−ウエルシュ，レナ スウェーデン王国エス―752 43 ウプサ ラ，グラニトヴァーゲン 16アー (72)発明者 ヘルディン，カール−ヘンリク スウェーデン王国エス―752 63 ウプサ ラ，ハッセルマウス・ヴァグ 35

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼの少なくともフラグメントをコー ドするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。 ２．前記ＰＴＰＬ１が配列番号２の少なくともフラグメントを含む、請求項１記 載の単離された核酸。 ３．前記ヌクレオチド配列が配列番号１の少なくともフラグメントを含む、請求 項１記載の単離された核酸。 ４．前記ヌクレオチド配列が、ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼの少な くともフラグメントをコードするｍＲＮＡが発現されるように制御配列に作動可 能なように連結されている、請求項１−３のいずれかに記載の単離された核酸。 ５．前記ヌクレオチドが、ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼの少なくと もフラグメントをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡが発現 されるように制御配列に作動可能なように連結されている、請求項１−３のいず れかに記載の単離された核酸。 ６．請求項１−５のいずれかに記載の単離された核酸がその中に導入されている トランスジェニック宿主。 ７．前記宿主がＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、繊維芽細胞、卵母細胞および 胚幹細胞からなる群より選択される、請求項６記載のトランスジェニック宿主。 ８．ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼの少なくともフラグメントを含む 、実質的に純粋な蛋白質。 ９．前記ＰＴＰＬ１が配列番号２の少なくともフラグメントである、請求項８記 載の実質的に純粋な蛋白質。 １０．ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼの少なくともフラグメントに選 択的に結合しうる実質的に純粋な抗体。 １１．前記ＰＴＰＬ１が配列番号２の少なくともフラグメントである、請求項１ ０記載の抗体。 １２．ＰＴＰＬ１の発現または活性を変更しうる化合物を検出する方法であって 、 （ａ） ＰＴＰＬ１蛋白質チロシンホスファターゼをコードする核酸を細胞内に 導入し； （ｂ） 前記細胞または前記細胞の子孫を、前記レセプターの発現を可能とする 時間および条件下で増殖させ； （ｃ） 前記細胞または前記細胞の前記子孫を試験化合物と接触させ； （ｄ） 前記細胞または前記細胞の前記子孫について、前記ＰＴＰＬ１の活性の 指標に関してアッセイを実施する； の各工程を含む方法。 １３．さらに、前記細胞または前記細胞の前記子孫を前記試験化合物と接触させ る前に、前記細胞または前記細胞の前記子孫について、前記ＰＴＰＬ１の活性の 指標に関してアッセイを実施する工程を含む、請求項１２記載の方法。 １４．ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼの少なくともフラグメントをコ ードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。 １５．前記ＧＬＭ−２が配列番号２の少なくともフラグメントを含む、請求項１ ４記載の単離された核酸。 １６．前記ヌクレオチド配列が配列番号１の少なくともフラグメントを含む、請 求項１４記載の単離された核酸。 １７．前記ヌクレオチド配列が、ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼの少 なくともフラグメントをコードするｍＲＮＡが発現されるように制御配列に作動 可能なように連結されている、請求項１４−１６のいずれかに記載の単離された 核酸。 １８．前記ヌクレオチドが、ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼの少なく ともフラグメントをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡが発 現されるように制御配列に作動可能なように連結されている、請求項１４−１６ のいずれかに記載の単離された核酸。 １９．請求項１４−１８のいずれかに記載の単離された核酸がその中に導入され ているトランスジェニック宿主。 ２０．前記宿主がＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、繊維芽細胞、卵母細胞およ び胚幹細胞からなる群より選択される、請求項１９記載のトランスジェニック宿 主。 ２１．ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼの少なくともフラグメントを含 む、実質的に純粋な蛋白質。 ２２．前記ＧＬＭ−２が配列番号２の少なくともフラグメントである、請求項２ １記載の実質的に純粋な蛋白質。 ２３．ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼの少なくともフラグメントに選 択的に結合しうる実質的に純粋な抗体。 ２４．前記ＧＬＭ−２が配列番号２の少なくともフラグメントである、請求項２ ３記載の抗体。 ２５．ＧＬＭ−２の発現または活性を変更しうる化合物を検出する方法であって 、 （ａ） ＧＬＭ−２蛋白質チロシンホスファターゼをコードする核酸を細胞内に 導入し； （ｂ） 前記細胞または前記細胞の子孫を、前記レセプターの発現を可能とする 時間および条件下で増殖させ； （ｃ） 前記細胞または前記細胞の前記子孫を試験化合物と接触させ； （ｄ） 前記細胞または前記細胞の前記子孫について、前記ＧＬＭ−２の活性の 指標に関してアッセイを実施する； の各工程を含む方法。 ２６．さらに、前記細胞または前記細胞の前記子孫を前記試験化合物と接触させ る前に、前記細胞または前記細胞の前記子孫について、前記ＧＬＭ−２の活性の 指標に関してアッセイを実施する工程を含む、請求項２５記載の方法。