JP3462498B2 - レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のｃＤＮＡクローニング方法及びｈＧＲＢタンパク質 - Google Patents

レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のｃＤＮＡクローニング方法及びｈＧＲＢタンパク質

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 分子及び細胞生物学の分野におけるこの発明は、レセ
プターチロシンキナーゼのカルボキシ末端ドメインに結
合しかつ主要シグナル伝達経路内でこの酵素のための基
質として役立つことのできる細胞タンパク質を識別する
ための、直接発現クローニングに基づく新しい方法に関
する。本発明は同様に、この方法を用いて識別された新
しいタンパク質にも関する。
背景技術の説明 さまざまなポリペプチド性成長因子及びホルモンが、
チロシンキナーゼ酵素活性をもつ細胞表面レセプターと
相互作用することによってその細胞効果を媒介する（総
説として、Williams,L.T.et al.,Science 243:1564−15
70（1989年）;Ullrich,A.et al.,Cell 61:203−212（19
90年）;Carpenter,G.et al.,J.Biol.Chem.265:7709−77
12（1990年）を参照）。これらのリガンドとそのレセプ
ターの相互作用は、レセプターの二量体化及びタンパク
質チロシンキナーゼ活性の刺激を含む一連の事象を誘発
する。上皮成長因子レセプター（EGFR）ならびに血小板
由来成長因子レセプター（PDGFR）といったようなチロ
シンキナーゼ活性をもつその他のレセプターについて
は、キナーゼ活性化及びレセプター自己リン酸化反応の
結果として、レセプターはいくつかの細胞質基質と物理
的に会合することになる（Ullrich et al.,前出） EGFRキナーゼのための２つの基質が現在最終的に生体
細胞内で同定されている。すなわち、（ａ）ホスファチ
ジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ−ガンマ（PL
C−ガンマ）及び（ｂ）rasタンパク質のエフェクタール
ープ内にある可能性のあるタンパク質であるGTPase活性
化タンパク質（GAP）である（Margolis,B.et al.,Cell
57:1101−1107（1989年ｂ）;Meisenhelder,J.et al.,Ce
ll 57:1109−1122（1989年）;Molloy,C.J.et al.,Natur
e 342:711−714（1989年）;Wohl,M.I.et al.,J.Biol.Ch
em.265:3944−3948（1990年）;Ellis,C.et al.,Nature
343:377−381（1990年）;Kaplan,D.R.et al.,Cell 61.1
21−133（1990年））。
同様に、活性化されたPDGFRは、チロシンをリン酸化
すること、又pp60srcといった細胞チロシンキナーゼ、P
LG−ガンマ、GAPと会合した状態になることが示され
た。（Gould,K.L.et al.,Mol.Cell.Biol.８:3345−3356
（1988年）;Meisenhelder,J.et al.,Cell 57:1109−112
2（1989年）;Molloy,C.J.et al.,Nature 342:711−714
（1989年）;Kaplan,D.R.et al.,Cell 61:121−133（199
0年）;Kazlauskas,A.et al.,Science 247:1578−1581
（1990年）;Krypta,R.M.et al.,Cell 62:481−492（199
0年）;Margolis,B.et al.,Science 248:607−610（1990
年））。PLC−ガンマ又はGAPと、EGFRとの会合に関与す
る正確な部位は完全に解明されているわけではないが、
最近の研究は、この会合に寄与するレセプターと基質の
両方の上のドメインを識別し始めてきた。
SH2（src homology 2）ドメインが、活性化された成
長因子レセプターといくつかのチロシンキナーゼ基質と
の会合に関与するドメインであると思われる。SH2ドメ
インは、pp60src、PLC−ガンマ、GAP及びｖーcrkといっ
た細胞質性非レセプターチロシンキナーゼの中に発見さ
れた、保存された約100個のアミノ酸の配列である（May
er,B.J.et al.,Nature 332:272−275（1988年）;Pawso
n,T.,Oncogene 3:491−495（1988年））。異なる触媒ド
メインを有するものの、これらの分子は全て、保存され
たSH2及びSH3（srchomology 3）ドメイン及びチロシン
キナーゼ活性をもつレセプターと会合する能力を共有す
る（Anderson,D.et al.,Science 250:979−982（1990
年））。
チロシンキナーゼ活性化及びレセプター自己リン酸化
反応は、成長因子レセプターとSH2ドメイン含有タンパ
ク質との間の会合の必須条件である（Margolis,B.et a
l.,Mol.Cell.Biol.10:435−441（1990年）;Kumjian et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8232−8239（1989
年）;Kazlanskas,A.et al.,Science 247:1578−1581（1
990年））。特に、既知の自己リン酸化反応部位を全て
含むEGFRのカルボキシ末端（Ｃ−末端）フラグメント
は、特異的にGAP及びPLC−ガンマのSH2ドメインに結合
する（以下参照）。したがって、これらの基質タンパク
質のSH2ドメインとEGFRのチロシンリン酸化されたＣ末
端テールの間に、主要な会合部位が存在する。
活性化されたチロシンキナーゼレセプターに対する結
合がいくつかの基質タンパク質の間で保存されるという
ことを認識した上で、これらの特性を共有するさらなる
基質を同定するための努力が払われた。活性化されたレ
セプターに対して結合する標的タンパク質は、成長因子
レセプターと共に免疫沈降するか又は固定化マトリック
スに付着されたレセプターに結合するタンパク質の分析
によって同定された（Morrison,D.K.et al.,Cell 58:64
9−657（1989年）;Kazlauskas,A.et al.,EMBO J.９:327
9−3286（1990年））。これらのタンパク質のいくつか
のアイデンティティは既知であるものの、これらのアプ
ローチを利用して検出されたその他のいくつかのタンパ
ク質は、完全に特徴づけされていない。さらに、活性化
されたレセプターと相互作用する希な標的分子が、これ
らの技術の限られた感度のために検出されなかったとい
うことも考えられる；実際の結合化学量論は低いもので
あってよく、タンパク質を可溶化するのに必要な界面活
性剤溶液は結合を粉砕しうる。
これらのタンパク質を単離しクローニングするための
従来のアプローチはマイクロシークエンシング及びそれ
に続く従来のcDNAクローニングのために充分な量のタン
パク質を精製するべく、大量の組織又は株細胞の使用を
必要とする骨の折れる方法であった。したがって、これ
らのタンパク質のクローニング及びそれに続く単離及び
同定のための新しいアプローチに対する必要性が当該技
術分野において認識されている。
発明の要約 細胞の成長及び発がんの調節を理解しそれを制御でき
るようになろうという我々の研究努力における最も切迫
した必要性の１つは、 チロシンキナーゼのための標的タンパク質を識別する能
力をもつことである。
本発明者は、チロシンキナーゼタイプの細胞レセプタ
ーに対する標的タンパク質の迅速なクローニングのため
の新たな発現／クローニングシステムを開発してきた。
このクローニング方法は、或る種のクラスの基質がも
つ、上皮成長因子レセプター（EGFR）のチロシンリン酸
化カルボキシ末端（Ｃ末端）に特異的に結合する能力に
基づいている（以下の例VI;Margolis,B.et al.,EMBO J.
９:4375−4380（1990年）参照）。
本発明者が考案したアプローチは、マイクロシークエ
ンシング分析のために潜在標的タンパク質を精製する、
骨が折れコストのかかる作業を回避することを含め、従
来のクローニング方法に比べて重要な利点を有する。そ
の上、本発明のアプローチは、従来の他の技術を用いて
は活性化レセプターとのその会合を検出することができ
なかったような希な標的分子を識別するための方法を提
供する。さらに、この方法によると、DNAレベルでは相
同性が低いものでしかないものの、チロシンキナーゼ活
性をもつ活性化されたレセプターに対するその結合特性
において類似のものであるような、構造的又は機能的に
関連したタンパク質の識別が可能となる。後者の能力
は、関連する遺伝子を識別するのに使用された従来のス
クリーニング方法が、典型的にストリンジェンシーの低
い核酸ハイブリダイゼーションに基づいていることか
ら、重要なものである。実際、このようなハイブリダイ
ゼーションに基づくスクリーニングは、DNAレベルでの
類似性の欠如のために、本発明の新しいタンパク質すな
わちGRB−１とGRB−２をクローニングし同定する上で成
功しなかったであろうと思われる。
本発明者のアプローチの根源は、以前にDNA結合タン
パク質及びjun結合タンパク質をクローニングするのに
利用されてきた方法にある（Singh,H.et al.,Cell 52:4
15−423（1988年）;MacGregor,P.F.et al.,Oncogene
５:451−458（1990年））。
本発明の方法は、チロシン残基がリン酸化されるEGFR
タンパク質のＣ末端が基質を結合できるという発明者の
考え及び観察を利用している（以下参照）。チロシンが
32Pでリン酸化されている標識プローブを作製すること
によって、本発明者は、ヒトのさまざまな組織からのλ
gt11cDNA発現ライブラリーをスクリーニングし、EGFRの
リン酸化されたＣ末端と会合した状態となる数多くのタ
ンパク質を同定した。本発明者は、この要領で発見した
タンパク質を「GRB」（Growth Factor Receptor Bound
の略）と名付けた。本発明のクローニング方法は、「CO
RT」（Cloning of Receptor Targets（レセプター標的
クローニング）の略）と名付けた。
本発明の方法は、チロシンキナーゼに対する標的分子
の識別及びクローニングのための一般性と迅速性の両方
を有する新しいアプローチとして提案されている。
したがって本発明は、レセプターチロシンキナーゼの
標的であり、レセプターチロシンキナーゼのチロシンリ
ン酸化されたポリペプチド部分に結合することができる
タンパク質の発現を、発現ベクターを宿す細胞によって
検出するための方法において、 （ａ）細胞、その抽出物、そのライセート（溶解物）又
はその上清を、固相担体と接触させて、担体に対するタ
ンパク質の結合をひき起こすこと； （ｂ）チロシン−リン酸化されたポリペプチドと共に担
体に結合したタンパク質をインキュベートし、ポリペプ
チドが担体結合タンパク質に結合できるようにするこ
と； （ｃ）担体に結合していない物質を除去すること；及び （ｄ）担体に結合したチロシンリン酸化ポリペプチドの
存在を検出するか又はその量を測定すること、 を特徴とし、かくしてそのタンパク質の発現を検出する
方法に関する。
好ましい一実施態様においては、レセプターは、上皮
成長因子レセプター、血小板由来成長因子レセプター又
は線維芽細胞成長因子レセプターである。
この方法は、好ましくは、原核細胞、最も好ましくは
E.coli（大腸菌）といった細菌細胞を用いて行なわれ
る。細胞は同様に、酵母又は哺乳動物細胞といったよう
な真核細胞であってもよい。
好ましくは、リン酸化されたポリペプチドは、例えば
32Pのような放射線標識を用いて、検出可能な形に標識
付けされる。
固相担体は、好ましくはニトロセルロース膜であり、
λgt11ライブラリーをスクリーニングするときには溶菌
された細菌細胞から放出されたタンパク質が、この膜に
トランスファーされる。
本発明は同様に、レセプターチロシンキナーゼ分子の
チロシンリン酸化されたポリペプチド部分に結合できる
タンパク質をコードする遺伝子を、ヒト染色体にマッピ
ングするための方法において、 （ａ）ヒト遺伝子発現ライブラリーで細菌細胞を感染さ
せること； （ｂ）請求項１に記載の方法を用いて、タンパク質を発
現するクローンを検出すること； （ｃ）クローンのDNAを配列決定すること；及び （ｄ）ヒト染色体に対しその配列をマッピングするこ
と、 を特徴とする方法をも提供する。
本発明は同様に、レセプターチロシンキナーゼのチロ
シンリン酸化ポリペプチド部分に結合することのできる
タンパク質の発現の検出に有用なポリペプチドプローブ
にも関する。このプローブは、レセプター分子のチロシ
ンリン酸化部分から誘導されたアミノ酸配列又はその機
能的誘導体を含み、チロシンキナーゼドメインが欠如し
ており、この配列は少なくとも１つのホスホチロシン残
基、好ましくは４個又は５個のホスホチロシンを含んで
いなければならない。プローブは、好ましくは32Pで検
出可能な形に標識されるべきである。
好ましいプローブは約25〜250個のアミノ酸残基を有
する。
本発明のプローブは、上皮成長因子レセプター、血小
板由来成長因子レセプター及び線維芽細胞成長因子レセ
プターを含むレセプターチロシンキナーゼに対する標的
タンパク質を検出するために有用である。
本発明は同様に、上述のプローブを調製するための方
法において、 （ａ）チロシンキナーゼによってリン酸化されうる少な
くとも１つのチロシン残基を含むチロシンリン酸化ドメ
インとチロシンキナーゼドメインを両方有する、レセプ
ター又は遺伝子工学的に処理されたレセプター様の誘導
体を実質的に純粋な形で提供すること、 （ｂ）チロシン残基のリン酸化を可能にする条件下で
〔ガンマ−32P〕アデノシン三リン酸と共にレセプター
又はレセプター様の誘導体をインキュベートし、チロシ
ン残基のリン酸化をひき起こすこと、 を特徴とし、かくしてプローブを産生する方法をも含ん
でいる。好ましい一実施態様において、この方法は （ｃ）チロシンキナーゼドメインとチロシン−リン酸化
ドメインの間で分子を切断することのできる作用物質
で、リン酸化レセプター分子をさらに処理する、工程を
含んでいる。
好ましい切断作用物質は、臭化シアンである。
また別の実施態様においては、上述の方法には、作用
物質がその切断部位で切断できる酵素であり、チロシン
リン酸化ドメインをコードするDNA配列に連結している
選択的酵素的切断部位をコードするDNA配列に連結して
いるチロシンキナーゼをコードするDNA配列を含むDNA分
子によってコードされたポリペプチドである、遺伝子工
学的に処理されたレセプター様の誘導体が関与する。好
ましい酵素は、Xa因子とトロンビンである。
同様に提供されているのは、レセプターチロシンキナ
ーゼ分子のチロシンリン酸化ポリペプチド部分に結合す
ることのできるタンパク質を、複雑な混合物から精製す
るための方法において、 （ａ）プローブが結合されている固相担体と複雑な混合
物とを接触させ、タンパク質のプローブへの結合を可能
にすること、 （ｂ）担体に結合していない物質を除去すること、及び （ｃ）担体から結合タンパク質を溶出することを特徴と
し、かくしてタンパク質を精製する方法である。
本発明は同様に、図４に示されているアミノ酸配列を
もつタンパク質GRB−１にも関する。本発明は、図17に
示されているアミノ酸配列を含むタンパク質、GRB−２
を含む。
本発明は同様に、GRB−１タンパク質をコードするDNA
分子、及びGRB−２タンパク質をコードするDNA分子にも
関する。これらのタンパク質の機能的誘導体をコードす
るDNA分子も本発明に含まれる。DNA分子が天然のもので
ある場合、それは、それが生来会合するヌクレオチド配
列を実質的に有さない。本発明のDNA分子はプラスミド
といった発現運搬体であってよい。
同様に提供されるのは、上述のDNA分子の各々で形質
転換された宿主である。
本発明は同様に、各々が天然に会合しているその他の
タンパク質を実質的に含まないGRB−１又はGRB−２タン
パク質、又はその機能的誘導体を調製する方法におい
て、 （ａ）培養条件下でタンパク質を発現することのできる
宿主細胞を培養すること、 （ｂ）タンパク質又は機能的誘導体を発現させること、
及び （ｃ）培養からタンパク質又は機能的誘導体を回収する
こと、 を特徴とする方法をも含んでいる。
図面の簡単な説明 図１は、ニトロセルロースフィルター上に固定化され
たGAP−SH2とEGFRのカルボキシ末端が相互作用するのを
示すフィルターブロットパターンである。細菌により発
現されたtrpE/GAP−SH2融合タンパク質又は対照として
のtrpEを、さまざまな濃度でニトロセルロースフィルタ
ー上にスポットした。フィルターを〔32P〕−標識され
たEGFRのＣ−末端ドメインを用いて一晩ハイブリダイゼ
ーションに付した。オートラジオグラフィは２時間であ
った。
図２は、レセプター標的のクローニング方法（CORT）
を表わす概略図である。EGFRのＣ末端ドメインを、放射
線標識されたリンでリン酸化させる。λgt11ライブラリ
ーを150mlのプレートあたり４×104プラークの密度でプ
レーティングした。プラークに、IPTG含浸したニトロセ
ルロースフィルターを12時間かぶせ、その後プラークを
ニトロセルロースへとトランスファーし、標識されたプ
ローブと共にインキュベートした。次にさらなる分析の
ため陽性コロニーを選択する。
図３は、GRB−１タンパク質を発現するファージのオ
ートラジオグラムを示す。Ａ）プレーティングされた4
0,000ファージのうちの１つの陽性シグナル（矢印）を
立証する一次スクリーン。Ｂ）GRB−１を発現するファ
ージのプラーク精製。全てのプラークが〔32P〕標識さ
れたEGFRのＣ末端ドメインに結合した。
図４は、GRB−１のDNA配列及び予想されたアミノ酸配
列を示す。このタンパク質は、724アミノ酸残基を有す
る。
図５は、類似のモチーフをもつその他のタンパク質と
GRB−１のSH2ドメインの配列を比較する。Ａ）GRB−
１、ｃ−src、ｖ−ab1、ウシPLC−ガンマ、GAP、及びｖ
−crkのSH2ドメイン。Ｎ及びＣは、それぞれＮ末端及び
Ｃ末端SH2ドメインを表わしている。保存アミノ酸置換
は、Schwartz及びDayhoffにより定義づけされている通
りである：すなわち（Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｔ）；（Ｌ、
Ｉ、Ｖ、Ｍ）；（Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ）；（Ｋ、Ｒ、Ｈ）；
（Ｆ、Ｙ、Ｗ）；及びＣ。太字はこれらの位置が同じで
あったか、又は５カ所以上に保存的アミノ酸置換が存在
していることを識別している。囲みは、保存されたモチ
ーフを識別している。Ｂ）GRB−１のSH3ドメインの類似
の比較。
図６は、SH2及びSH3ドメインの構造組織を比較する概
略図である。この図には、ｃ−src、ｖ−crk、PLC−ガ
ンマ、GAP1及びGRB−１といった、SH2及びSH3ドメイン
を含む既知のタンパク質が含まれている。
図７は、GRB−１プローブを用いたサルmRNAのノーザ
ンブロットである。さまざまなサルの組織から得たポリ
（Ａ）+mRNA5μｇを、1.2％/2.2Mのアガロース−ホルム
アルデヒドゲル上で電気泳動した。ブロットを、クロー
ンki4からの挿入物に相応する〔32P〕−ニックトランス
レーションを受けたDNAプローブとハイブリダイゼーシ
ョンした。
図８は、生合成的に標識された細胞からの85kDaのタ
ンパク質をGRB−１に対する抗体が免疫沈降させること
を示すゲルパターンである。細胞を、〔35S〕メチオニ
ンで代謝的に標識し、その後ライセートを調製し、免疫
（Ｉ）又は前免疫（Ｐ）血清のいずれかで免疫沈降させ
た。免疫沈降されたタンパク質を、８％のSDS/PAGE上で
分離した。オートラジオグラフィは一晩行なった。使用
した細胞系統には、ヒトのグリオブラストーマ（多形性
神経膠芽腫）細胞系統、U1242、ラット膀胱がん細胞系
統、NBT−II及びNIH3T3細胞が含まれている。
図９は、研究に使用したいくつかの野生型及び突然変
異タンパク質を描いている。（Ａ）その既知の又は予想
された自己リン酸化部位を伴うEGFレセプター構築体。
野生型（W.T.）、キナーゼ陰性（K721A）、及びカルボ
キシ末端欠失（CD126）が、−300,000EGFレセプターを
発現する前述のトランスフェクションを受けたNIH3T3細
胞から免疫沈降された。EGFR−Ｃは、バキュロウイルス
感染SF9細胞によって産生されたEGFレセプターの細胞質
ドメインを含む欠失突然変異体を表わす。（Ｂ）SH2及
びH3ドメイン及びPLC−ガンマチロシンリン酸化部位の
場所を示すPLC−ガンマ及びtrpE/GAP SH2タンパク質の
構造。
図10は、EGFR突然変異体とPLC−ガンマの会合を示す
ゲルパターンである。野生型（HER14）、カルボキシ末
端欠失（CD126）又はキナーゼ陰性（K721A）EGFRを、抗
EGFRmAb108で免疫沈降させた。レセプターを、〔ガンマ
−32P−ATPで自己リン酸化させた。同時にEGFR−Ｃをタ
ンパク質Ａ−セファロースビーズ単独、又はATPを含む
かもしくは含まない免疫沈降されたK721Aレセプターに
添加した。ATPを除去するためさらに洗浄した後、PLC−
ガンマを過剰発現する−15×106個の3T−P1細胞のライ
セートを添加し、90分間４℃で混合した。未結合のPLC
−ガンマを除去するため洗浄した後、６％のSDS−ゲル
上でタンパク質を分離し、免疫ブロット法のためニトロ
セルロースにトランスファーした。抗−PTyrブロット法
のためには試料の８分の１を利用し、残りを抗−PLC−
ガンマブロット法のために利用した（露出時間14時
間）。
図11は、PLC−ガンマのリン酸化がEGFレセプターに対
するその結合を低減させることを示すゲルパターンであ
る。mAb108で全長EGFRを免疫沈降させ、自己リン酸化さ
せた。PLC−ガンマを過剰発現する3T−P1細胞のライセ
ートを添加し、90分間４℃で混合した。結合後、試料の
２分の１に対してATPを添加し、PLC−ガンマ分子がEGF
レセプターによってリン酸化されうるようにした。次に
EGFR−PLC−ガンマ複合体の半分に対しSDS−PAGE試料緩
衝液を添加し（「洗浄なし」、左側パネル）、直接６％
のゲル上に負荷した。もう半分はHNTGで３度洗浄し、次
にゲル上に負荷した（「洗浄あり」、右側パネル）。試
料を重複してSDS−PAGEで泳動した後、タンパク質をニ
トロセルロースにトランスファーし、抗−PLC−ガンマ
及び〔125I〕タンパク質Ａでプローブ探査した。ひき続
きニトロセルロースからバンドを切り出し、ガンマカウ
ンターで定量した。HNTGで３回洗浄した後、50±５％
（平均±SEM、ｎ＝４）のリン酸化されていないPLC−ガ
ンマがEGFRに結合した状態で残り、一方残ったリン酸化
されたPLC−ガンマは22±４％にすぎなかった（露出時
間:12時間）。
図12は、EGFR−ＣのtrpEタンパク質に対する結合を示
すゲルパターンである。（Ａ）EGFR−Ｃ（0.5μｇ）
を、抗体Ｃで免疫沈降させ、洗浄した。次に単独のMnCl
2又はMnCl2とATPを添加して自己リン酸化を容易にし
た。trpE又はtrpE/GAP SH2（約２μｇ）。免疫沈降物
を10％のSDS−ゲル上で分離し、ニトロセルロースへと
トランスファーし、抗−trpEを用いて免疫ブロット法を
行なった。比較を目的として、約0.1μｇのtrpE又はtrp
E/GAP SH2のライセートを直接ゲルに負荷した（Ａの右
側パネル）。（Ｂ）抗−trpE抗体を用いてtrpE又はtrpE
/GAP SH2を免疫沈降させ、洗浄した。次に、リン酸化
された又はリン酸化されていないEGFR−Ｃ（0.5μｇ）
を添加して上述のとおり結合させた。洗浄の後、10％の
ゲル上で試料を分離し、ニトロセルロースへとトランス
ファーし、抗体Ｃでプローブ探査した。右側の２つの試
料は、直接ゲル上に負荷したリン酸化された及びリン酸
化されていないキナーゼ0.5μｇを表わす（露出時間:2
時間）。
図13は、野生型及び突然変異EGFRに対するtrpE/GAP
SH2の結合を示すゲルパターンである。（Ａ）野生型レ
セプター（HER14）又はカルボキシ末端欠失CD126レセプ
ターをmAb108で免疫沈降させた。次にMnCl2単独又はMnC
l2とATPをレセプター含有試料の自己リン酸化された半
分に対して添加した。１セットのCD126を同様に0.5μｇ
のEGFR−Ｃと交叉リン酸化した。次に４℃で90分間、tr
pE/GAPSH2を添加し、さらに３回洗浄した後SDS−PAGEに
負荷した。ニトロセルロースに対するトランスファーの
後、抗−trpE（左側パネル）、抗−EGFRRK2（中央パネ
ル）又は抗−PTyr（右側パネル）を用いてブロットをプ
ローブ探査した。RK2及び抗−PTyrは両方共総試料の８
分の１であり、７％のSDS−PAGE上で分離した。残りの
試料を、抗−trpEブロットのため10％のゲル上に負荷し
た（露出時間14時間）。（Ｂ）EGFRを全く含まないNIH3
T3 2.2細胞（3T3）又はキナーゼ陰性レセプターを有す
る細胞（K21A）からのライセートを、mAb108で免疫沈降
させた。全ての免疫沈降物に対して、0.5μｇのEGFR−
Ｃを添加し、次に単独MnCl2又はMnCl2とATPを添加し
た。trpE/GAP SH2を添加し、（Ａ）の場合と同じよう
に試料を調製し、免疫ブロットに付した（露出時間:19
時間）。
図14は、EGFRのCNBr切断Ｃ末端フラグメントに対する
PLC−ガンマ及びtrpE/GAP SH2の結合を示すゲルパター
ンである。EGFR−Ｃ（10μｇ）を、担体タンパク質とし
て100μｇのBSAを含むpH7.5の20mMHEPES中でCentricon
30の中でインキュベートした。次に、リン酸化された及
びリン酸化されていないEGFR−Ｃを、各々２つに分割
し、半分を緩衝液中に保管する一方、もう半分をCNBrで
切断した。次にATPを含む又は含まない、又CNBrを含む
又は含まない４つの試料を、各々500μｌの１％トリト
ンＸ−100溶菌緩衝液中にもって行き、２つに分け、抗
−Ｃ抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物を洗浄した後、
PLC−ガンマ又はtrpE/GAP SH2を含むライセートを添加
した。次に、抗−trpE又は抗−PLC−ガンマを用いて上
述のとおり試料について免疫ブロット法を実行した。右
側パネルについては、切断された及び切断されていな
い、EGFR−Ｃの１分画（0.1μｇ）を、免疫沈降無しに
直接ゲル上に負荷し、RK2で免疫ブロットに付した（露
出時間14時間）。抗−trpEプロットの全てのラインに見
られる黒いバンドは、およそ40kDaあたりにあり（図13
にも見られる）、免疫沈降抗体の重鎖に結合する
〔125I〕タンパク質Ａを表わす。
図15は、trpEに対してではなくtrpE/GAP SH2に対す
るチロシンリン酸化されたＣ末端EGFRフラグメントの結
合を示すゲルパターンである。EGFR−Ｃ（５μｇ）を、
〔ガンマ−32P〕ATP1の添加によって自己リン酸化させ
た。リン酸化されたEGFR−ＣをCentricon 30の中で濃縮
し、次に70％蟻酸中のCNBrで切断させた。試料の半分
（350,000cpm）を図12Bにある通りにtrpE又はtrpE/GAP
SH2に結合させ、洗浄して、10％のSDS−ゲルで泳動し
た。（Ａ）リン酸化されたCNBr切断EGFR−ＣのtrpEに対
する結合、（Ｂ）リン酸化されたCNBr切断EGFR−Ｃのtr
pE GAP SH2に対する結合、（Ｃ）3,000cpmのCNBr−切
断EGFR−Ｃ、（Ｄ）比較のための3,000cpmの切断EGFR−
Ｃ（露出時間20時間）。EGFR984/1186は、CNBrによって
生成されたチロシン自己リン酸化フラグメントの配列を
示している。
図16は、GRB−２の部分的ヌクレオチド配列及び予想
されるアミノ酸配列を示している。
好ましい実施態様の詳細な説明 本発明者は、レセプターチロシンキナーゼ分子、特に
上皮成長因子レセプター（EGFR）のチロシンリン酸化さ
れたＣ末端テールに結合するという特徴をもつタンパク
質をコードするDNAの迅速な発現クローニングのための
新しいプローブ及びその利用方法を開発した。
「発現」という語は、タンパク質分子を生み出すため
の、タンパク質をコードするDNA配列の転写及び翻訳の
ことを意味する。発現クローニングは、クローニングさ
れるDNAがあるタンパク質をコードするような方法であ
る。典型的にはcDNAライブラリーの形態の望ましいDNA
は、その発現及びそれがコードするタンパク質の直接検
出を用いて検出される。発現クローニングシステムは、
当該技術分野において周知のものである（参考:Sambroo
k,J.et al.,「MolecularCloning:A Laboratory Manua
l」第２版、Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHar
bor,NY（1989年）、なおこれは本明細書中に参考として
組込まれる）。典型的には、タンパク質は、λgt11発現
ベクターでの細菌感染を介して、λgt11ライブラリーと
いったライブラリーから発現される。バクテリオファー
ジプラークの部域内に放出された発現タンパク質は、ニ
トロセルロースフィルターへとトランスファーされ、典
型的にはフィルターを染色すべく抗体を用いて検出され
る。新しいタンパク質、抗体を調製するのに充分な量で
入手できないタンパク質又は親和力に基づく検出のため
の既知のリガンドをもたないタンパク質については、こ
のような従来の発現クローニング方法は使用できない。
本発明の発現クローニング方法は、その他の数多くの
レセプターシステムに対し容易に適用できる。例えば、
いくつかの標的分子は、PDGFRのチロシンリン酸化部分
及びコロニー刺激因子−１（CSF−１）に結合する（Cou
ghlin,S.R.et al.,Science 243:1191−1194（1989年）;
Kazlauskas,A.et al.,Cell 58:1121−1133（1989年）;S
hurtleff,S.A.et al.,EMBO J.９:2415−2421（1990
年）;Reedjik,M.et al.,Mol.Cell.Biol.10:5601−5608
（1990年））。これら２つのレセプターにおいて、チロ
シンリン酸化反応は、EGFRの場合のようにＣ末端ドメイ
ン内ではなく、キナーゼ挿入ドメイン内で起こる。した
がって、PDGFR又はCSF−１レセプターのいずれかのキナ
ーゼ挿入ドメイン又はその機能的誘導体（以下に規定の
もの）を利用する特異的プローブも、同様に、発現クロ
ーニングのために利用することができる。両者共PLC−
ガンマといったSH2含有タンパク質と相互作用すること
もできる線維芽細胞成長因子（FGF）レセプター（これ
はＣ末端ドメイン内でチロシンリン酸化される）又はHE
R2/neuレセプターについても、類似のプローブを構築す
ることが可能である。インシュリンレセプターといった
ようなその他のレセプターにおいては、チロシンリン酸
化反応は、キナーゼドメイン自体の中で起こる。
かくして、例えばEGFR内のＣ末端ドメイン、インシュ
リンレセプター内のキナーゼドメイン及びPDGFR内のキ
ナーゼドメイン挿入物といったように、異なるタンパク
質内で異なる部位がチロシンリン酸化されるということ
がわかると思われるものの、本発明は、これらの構造全
ての共通の特徴、単数又は複数のホスホチロシンの存在
及び単数又は複数のホスホチロシンを含むポリペプチド
に対する親和力をベースとした或る種の細胞タンパク質
の結合能力を認識する。一般的に以下ではEGFRを基準と
してＣ末端ドメインであるプローブを基準にしているも
のの、この言葉は制限的な意味をもつものではなく、上
述のその他全ての代替的チロシンリン酸化ドメインを内
含すべく意図されたものである。
本発明の方法及びアプローチは、上述の活性化された
リン酸化レセプターなどのようなチロシンリン酸化ポリ
ペプチドと、特異的な形で相互作用することのできる全
ての標的分子のクローニング及び識別に適用することが
できる。例えば、Ｒ−PTPasesといったようなチロシン
特異的ホスファターゼなどのチロシンリン酸化された配
列に対して結合するさらなるタンパク質（Sap,J.et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6112−6116（1990年）;
Kaplan,R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:7000−70
04（1990年））。これらの方法は同様に、セリン／トレ
オニン特異的ホスファターゼの場合のようにリン酸化さ
れたセリン／トレオニン残基に結合するタンパク質のク
ローニング及び識別においても適用可能である。
本発明のプローブを使用すると、遺伝子発現ライブラ
リーからの、DNAのクローニング及びコードされたタン
パク質の識別を迅速に行なうことが可能になる。この方
法は、特に、バクテリオファージλgt11ライブラリーの
場合に有用である。ヒトの胎児脳λgt11発現ライブラリ
ーをスクリーニングすることにより、本発明者は２つの
遺伝子をクローニングし、それらがコードするタンパク
質を特徴づけすることができた。そのうちの１つのGRB
−１と呼ばれるものは、完全に配列決定され、２つのSH
2ドメインと１つのSH3ドメインを含む約85kDaの分子量
をもつ新しいヒトタンパク質をコードすることがわかっ
た（図４及び図５）。部分的に配列決定されたGRB−２
も同様にユニークSH2及びSH3ドメインを含んでいる。
GAP及びPLCガンマタンパク質内にあるようなSH2ドメ
インは、EGFRのリン酸化されたＣ末端とこれらのタンパ
ク質の会合に関与する（以下の第VI例参照）。したがっ
て、SH2ドメインの１つの機能は、効果的なチロシンリ
ン酸化反応を容易にするため、レセプターチロシンキナ
ーゼ分子の細胞内部分とその基質を並置することであ
る。
本発明の方法を用いて識別された本発明のcDNAクロー
ンのうちのひとつ、GRB−１を詳細に分析することによ
り、２つのSH2ドメインと１つのSH3ドメインを含む新し
い配列が明らかにされる。このタンパク質は、さまざま
な組織及び細胞系統において発現される。その予想され
た分子量85kDaは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）上でのその移動と
一貫性をもつ。
「レセプターチロシンキナーゼ」という語は、チロシ
ンキナーゼ酵素活性をもつドメインを含む単数又は複数
の細胞内ドメインと細胞外レセプタードメインをもつ膜
貫通タンパク質を意味する。さらなる細胞内ドメイン
は、SH2に対する配列相同性を有しうる。これらの分子
は、当該技術分野において周知のものである（William
s,L.T.et al.,Science 243:1564−1570（1989年）;Ullr
ich,A.et al.,Cell 61:203−212（1990年）;Carpenter,
G.et al.,J.Biol.Chem.265:7709−7712（1990年））。
レセプターチロシンキナーゼと相互作用しこのレセプ
ターチロシンキナーゼによってリン酸化されうるタンパ
ク質は、細胞外レセプタードメインに結合するこれらの
レセプターに対する「リガンド」とは区別して、これら
のレセプターに対する「標的」タンパク質と呼ばれる。
本発明に従うと、発現クローニング方法は、λgt11と
いったような遺伝子発現ライブラリー上で直接実施され
る。好ましい実施態様においては、DNAはヒトcDNAであ
る。より好ましくは、DNAはヒト胎児脳のDNAである。ヒ
トの遺伝子のクローニングのための出発物質としてこの
ような供給源を使用することは、大量の組織を取って抗
体を産生するか又はタンパク質を精製し部分的に配列決
定しオリゴヌクレオチドプローブをこの配列から調製し
たゲノムDNA又はcDNAライブラリーをスクリーニングす
るのに用いる代替的手段に比べ、著しい利点を有する。
これらの工程を回避することの利点は、胎盤を除き、組
織が一般に大量に入手できないことから、ヒト遺伝子の
場合に最も適切である。
発現ライブラリーは、単一の工程でスクリーニングさ
れる。好ましくは、λプラークは、感染した細菌内で発
現され担体にトランスファーされるライブラリーDNAに
コードされたタンパク質のトランスファーを可能にする
べく、固体担体、好ましくはニトロセルロース上にブロ
ッティングされる。この担体は、次に、本明細書に記述
しているように、本発明のプローブと共にインキュベー
トされる。プローブは、チロシン−リン酸化ポリペプチ
ドに対する結合能力を有するタンパク質に結合すること
ができる。プローブに用いられる標識、好ましくは放射
性同位元素32Pに基づいて、問題のタンパク質を含むプ
ラークを識別するために適切な検出システムが用いられ
る。このときこれらのプラーク内のファージが選択さ
れ、それらの中のDNA挿入物を再クローニングし、切り
出し、当該技術分野において周知のようにタンパク質の
大規模な発現のために使用されるその他のベクター内な
どに入れることができる。
当業者であれば、使用されるシステムの精確な性質に
応じて濃度、時間、温度を変化させることができること
がわかるであろうし、又、過度の実験無しに該当するパ
ラメーターを変化させる方法がわかるだろう。さらに、
この分野における一般的方法は、Sambrook et al.,（前
出）の中に記述されている。
固相担体を作製できる材料としては、ニトロセルロー
ス、セルロース、紙、置換型ポリスチレン、アクリロニ
トリル、ポリカーボネート、ポリペンテン、酸化シリコ
ーンが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
本発明のプローブは、レセプターチロシンキナーゼ、
好ましくはEGFRのＣ末端ドメインから誘導されたチロシ
ンリン酸化ポリペプチド分子である。ポリペプチドは、
約25個から約250個のアミノ酸の長さを有していてよ
い。プローブは、リン酸化された天然配列又はその機能
的誘導体（以下に規定）でありうる。１個から５個のチ
ロシン残基でＣ末端ドメインを自己リン酸化するため、
レセプター分子上に存在するチロシンキナーゼドメイン
を用いることによって、きわめて効率の良いリン酸化反
応が得られる。チロシン残基をリン酸化するためには
（例Ｉに詳細に記述されている）既知の方法及び条件が
用いられる。好ましい基質は〔γ−P32−アデノシン三
リン酸〕である。プローブを作るために原材料として用
いられるレセプター分子の供給源としては、組織又は細
胞から化学的に精製された分子又は組換えDNA法により
産生された分子が考えられる。
組換え技術を用いる場合、天然型レセプターを産生さ
せてもよいし、或は又代替的には、レセプター様の誘導
体を産生させてもよい。好ましいレセプター様の誘導体
としては、Ｃ末端ドメインに連結されたチロシンキナー
ゼドメインが挙げられる。また別の実施態様において
は、別々の分子として２つのドメインを産生させ、混合
してＣ末端由来ポリペプチドのチロシンリン酸化を達成
することができる。
本明細書に記述するようなレセプターチロシンキナー
ゼのチロシンリン酸化されたＣ末端部分を含むプローブ
は、融合タンパク質の形で組換え手段によって産生され
うる。
本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」という
のは、SH2ドメインを有するタンパク質といった、細菌
性タンパク質及び問題のポリペプチドを含む融合された
タンパク質のことであってよい。代替的には、融合タン
パク質は同様に、キナーゼによってリン酸化されうる単
数又は複数のチロシン残基をもつレセプターチロシンキ
ナーゼＣ末端ドメインに連結されている選択的酵素的切
断部位に、チロシンキナーゼドメインをコードするDNA
配列が連結されている、人工的に構築されたレセプター
チロシンキナーゼ様誘導体であってもよい。このタイプ
の「融合タンパク質」をコードするこのような遺伝子構
築物を、発現運搬体中に挿入して、細菌又は真核生物の
宿主内で発現させることができる。ひとたび発現される
と、このような融合タンパク質は自己リン酸化すること
ができ、ここでキナーゼはＣ末端ドメイン内でチロシン
残基をリン酸化するべく作用する。このリン酸化反応に
続いて、適切な酵素を使用することによって選択的に切
断部位における切断が起こり、かくしてＣ末端リン酸化
ポリペプチドをＮ末端キナーゼから分離し、これをプロ
ーブとして役立てることができる。
Itakura et al.（Science 198:1056−1063（1977
年））及びRiggs（米国特許第4,366,246号（1982年））
は、外来性タンパク質の細胞内崩壊を妨げる融合タンパ
ク質の形での外来性タンパク質の細菌発現のための方法
を教示した。さらに、過剰に発現された融合タンパク質
は、往々にして細菌細胞内に細胞封入体として貯えられ
ており、したがって単離及び精製が比較的容易である
（Marston,Biochem.J.240:1−12（1986年））。これら
の参考文献は、選択的切断部位の概念に基づく代替的切
断方法を示唆していた。すなわち、メチオニンが望まれ
る接合部に挿入されて臭化シアンのための標的部位とし
て役立つことができたのと全く同じように、アミノ酸特
異性をもつタンパク質分解酵素による攻撃を受けうる特
異的アミノ酸部位も導入することができた。Nagai et a
l.（Nature309:810−812（1984年））は、血液凝固因子
Xaのための切断部位として役立つ４つのアミノ酸の配列
を導入することによる融合タンパク質における望ましい
遺伝子産物の産生を開示していた。Xa因子による切断は
同様に、従来の方法によりE.coliの中で発現された大部
分の真核性タンパク質の中に存在する開始コドンによっ
てコードされる余分なＮ末端メチオニンも除去した。Xa
因子又はトロンビンによって認識される酵素的切断部位
を、望まれるタンパク質の細菌内での発現を強化しその
精製をさらに容易にするために使用することを記述した
その他の参考文献（Germino et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 81:692−4696（1984年）;Scholtissek et al.,Ge
ne 62:55−64（1988年）;Smith et al.,Gene67:31−40
（1988年）;Knott et al.,Eur.J.Biochem.174:405−410
（1988年）；及びDykes et al.,Eur.J.Biochem.174:411
−416（1988年））。
「選択的切断部位」という語は、化学物質又は酵素の
いずれかによって選択的に切断され、予想可能な形で切
断を達成することのできる単数又は複数のアミノ酸残基
のことを意味する。選択的酵素的切断部位は、タンパク
質分解酵素により認識され、加水分解されるアミノ酸又
はペプチド配列である。このような部位の例としては、
トリプシン又はキモトリプシン切断部位が含まれる。本
発明の好ましい一実施態様においては、選択的切断部位
は、血液凝固Xa因子によって認識され切断される配列Il
e−Glu−Gly−Argから成る。また別の実施態様において
は、選択的切断部位は、トロンビンによって認識され切
断される配列Leu−Val−Pro−Argを有する。
レセプター様の誘導体を構築するにあたっては、酵素
認識部位をコードする配列に対して５′にあるオリゴヌ
クレオチド配列を含ませることができ、又長さを変化さ
せてもよい。例えば、１つの実施態様においては、Ile
に対するコドン（Xa因子認識部位の開始）とチロシンキ
ナーゼドメインをコードする配列の３′末端の間に、13
のヌクレオチドを位置させている。
したがって、本発明の一実施態様においては、チロシ
ンキナーゼドメインとＣ末端ドメインの間に、Ile−Glu
−Gly−Arg配列が導入されている。また別の実施態様に
おいては、Leu−Val−Pro−Arg配列が導入される。この
切断部位をもつタンパク質は、標準方法を用いて細菌内
で発現させられる。その後、好ましくは〔ガンマ32P〕
アデノシン三リン酸を用いたＣ末端ドメインの自己リン
酸化反応が起こることができ、それに続いて、例えばXa
因子といった適切な切断作用物質を用いたチロシンリン
酸化Ｃ末端ドメインの選択的切断が起こる。
本発明は同様に、特定のヒト染色体に対して、レセプ
ターチロシンキナーゼのための標的タンパク質（例えば
本明細書に規定されているようなGRBタンパク質）をコ
ードする遺伝子、好ましくはヒト遺伝子をマッピングす
る方法も提供している。この方法は本明細書に記されて
いる新しい発現クローニング方法と、特定の染色体にあ
る遺伝子をマッピングするためのいくつかの既知の技術
のうちの１つを組合わせている。かくして、本発明に従
うと、λgt11クローンといったGRBタンパク質をコード
するDNA挿入物を含むクローンが、本明細書に開示され
ている発現クローニング方法を用いて識別される。挿入
物は、望まれる場合、当該技術分野で周知の方法ならび
に、クローンの核酸の直接標識か又はクローンの配列の
ユニーク部分に相応するオリゴヌクレオチドプローブを
産生することによって構築されたプローブを用いて、さ
らにサブクローニングされうる（参考:Sambrook,J.et a
l.Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、C
oldSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY（1989
年））。この標識されたプローブは、次に、ヒト−ハム
スター体細胞ハイブリッドのパネルからのDNAを含むBio
s Corporation（New Haven,Connecticut）製のChromoso
me Blotといった市販のブロットを用いたハイブリダイ
ゼーション検定において使用できる（Kouri,R.E.et a
l.,Cytogenet.Cell Genet.51:1025（1989年））。その
ヒト−ハムスターハイブリッド細胞内にどのヒト染色体
が残っているかと、問題のGRB遺伝子に特異的なプロー
ブのハイブリダイゼーションとを比較することによっ
て、遺伝子は特定のヒト染色体にマッピングされる。こ
のようにして、この染色体上に存在する既知のヒト遺伝
子（又はその中の突然変異によりひき起こされる疾病）
に対するリンケージが立証される。より細かいマッピン
グのために当該技術分野において周知の方法、例えば既
知のヒト欠失突然変異を使用して、GRB遺伝子をさらに
精確にその他のヒト遺伝子に対してマッピングすること
ができる。
本発明のチロシンリン酸化されたレセプターチロシン
キナーゼＣ末端プローブポリペプチド及び本発明のGRB
タンパク質、ならびに本発明の方法を用いて発見される
さらなるまだ未知のGRBタンパク質は、レセプターチロ
シンキナーゼを通したシグナル伝達を介して起る細胞成
長制御を調整することのできるその他の作用物質及び薬
物をスクリーニングするための方法において有用であ
る。チロシンリン酸化プローブポリペプチド又はGRBタ
ンパク質あるいはそれらのフラグメントを固相担体マト
リックスに付着させることによって、その親和力プロー
ブに結合することのできる複雑な混合物から分子を単離
し精製するのに使用可能な親和力プローブが作り出され
る。さらに、このような親和力プローブは、チロシンリ
ン酸化プローブ又はGRBタンパク質を結合できる分子の
生物学的流体中における存在を検出するためにも有用で
ある。同様にして、このプローブ又はGRBと相互作用す
るその能力について、化学的作用物質をテストすること
も可能である。
固相に対してタンパク質及びペプチドをカップリング
させるための方法、これらの方法において有用な固相物
質及び溶出手段は、当業者にとって周知のものである。
EGFR、PDGFR及びFGFRを含む、レセプターチロシンキ
ナーゼである成長因子レセプターの場合、チロシンリン
酸化反応は細胞成長及び発がん性形質転換に連関してい
る。細胞内のGRBの作用の妨害は、成長を妨げるか又は
抑制する可能性があり、又腫瘍の発達を妨げる手段とし
ても役立ちうる。さらに、レセプターチロシンキナーゼ
又はGRBのＣ末端部分の突然変異あるいはその相互作用
の調節不良は、ガンの可能性を促進しうる。
インシュリンレセプター（InsR）も同様にレセプター
チロシンキナーゼであり、InsRを担持する細胞内のチロ
シンリン酸化反応は、正常な生理学的機能と結びつけら
れる。細胞成長及びガンの場合とは対照的に、GRB及び
レセプターのチロシンリン酸化部分の正常な相互作用の
妨害はインシュリンの効果を妨げることになる。GRBタ
ンパク質の正常以下のレベル又は活性は、正常な対調節
メカニズムを無くするように作用しうる。恐らくは、GR
Bタンパク質の過剰発現又は過剰活性は、細胞に対する
インシュリンの作用を抑制するか又は完全に妨げる可能
性があり、かくして糖尿病（インシュリン抵抗性の）へ
と導きうる。したがって、糖尿病に対する罹病性は、GR
B−１又はGRB−２タンパク質の調節不良と結びつけるこ
とができる。
したがって、正常な又は突然変異体のGRBタンパク質
遺伝子を識別するためのあるいは細胞内のGRB−１又はG
RB−２の存在又はその量を検出するための本発明の方法
は、レセプターチロシンキナーゼ経路によって媒介され
る細胞代謝における変化と関連するがん、糖尿病その他
の病気に対する罹病性を識別するための方法として役立
つことができる。
本発明は、被検者体内の正常又は突然変異体GRB−１
又はGRB−２タンパク質の存在及びそのレベルを評価す
るための方法を提供する。被検者体内のこれらのタンパ
ク質の変調した発現又は突然変異体GRBタンパク質の存
在は、発ガン性形質転換及びガンの発病に対する罹病性
の重要な予測物として役立ちうる。代替的には、GRBタ
ンパク質の変調した発現は、糖尿病に対する罹病性の重
要な予測物として役立つことができる。
GRBタンパク質をコードするDNA又はRNA配列の存在に
ついて被検者からの細胞をテストするのに、GRBタンパ
ク質のさまざまな部分をコードするオリゴヌクレオチド
プローブが用いられる。好ましいプローブは、本発明の
GRB−１又はGRB−２タンパク質の少なくとも４個のアミ
ノ酸残基、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸残基を
コードする核酸配列に対し向けられたものである。この
ようなプローブを使用して、定性的又は定量的検定を行
なうことができる。例えば、細胞又は組織の調製物にお
けるGRBタンパク質のmRNAの発現を測定するためには、
ノーザン分析（以下の例IIIを参照のこと）が使用され
る。
このような方法は、選択的増幅技術の使用の後、被検
者から得られるきわめて少量のDNAを用いてさえ利用で
きる。精製された核酸フラグメントを増幅することので
きる組換えDNA法が長い間認知されてきた。典型的にこ
のような方法には、DNA又はRNAベクター内への核酸フラ
グメントの導入、ベクターのクローン増幅、及び増幅さ
れた核酸フラグメントの回収を含む。このような方法論
の例は、Cohen他（米国特許第4,237,224号）、Sambrook
et al.（前出）などによって提供されている。
最近、このような望ましい核酸分子の濃度を増大させ
ることのできるインビトロ酵素法が記述されてきた。こ
の方法は、「ポリメラーゼ連鎖」反応又は「PCR」とし
て呼称されてきた（Mullis,K.et al.,Cold Spring Harb
or Symp.Quant.Biol.51:263−273（1986年）;Erlich,H.
et al.,EP 50,424;EP 84,796,EP 258,017,EP 237,362;M
ullis,K.,EP 201,184;Mullis,K.et al.,US4,683,202;Er
lich,H.,US 4,582,788;及びSaiki,R.et al.,US 4,683,1
94）。
ポリメラーゼ連鎖反応は、その配列が予め精製されて
おらずかつ特定の試料内に単一のコピーでしか存在しな
い場合でさえ、特定の核酸配列の濃度を選択的に増大さ
せるための方法を提供する。この方法は、１本鎖又は２
本鎖DNAのいずれかを増幅するために使用できる。この
方法の核心には、望まれる核酸分子の鋳型依存型のポリ
メラーゼ媒介複製のためのプライマーとして役立つ２つ
のオリゴヌクレオチドプローブの使用が関与している。
PCR法の２つのオリゴヌクレオチドプローブの精確さ
は、この方法の成功にとってきわめて重要である。周知
のように、DNA又はRNAの分子は、分子のリン酸基の５′
−３′連鎖を通して付与される指向性を有する。DNA又
はRNAの配列は、１つの配列の５′末端リン酸基と第２
の配列の３′末端ヒドロキシル基の間のホスホジエステ
ル結合の形成を通して連結される。核酸分子のポリメラ
ーゼ依存型増幅は、核酸分子の３′ヒドロキシル末端に
対する５′ヌクレオチド三リン酸の付加によって進行す
る。かくしてポリメラーゼの作用は、核酸分子の３′末
端を伸長させる。これらの固有の特性は、PCRのオリゴ
ヌクレオチドプローブの選択において活用されている。
PCR法のプローブのオリゴヌクレオチド配列は、それ
が、増幅の望まれる特定の核酸配列のフランキング配列
と同一の又はそれに相補的な配列を含んでいるように選
択される。
さらに具体的に言うと、「第１の」プローブのオリゴ
ヌクレオチド配列は、望ましい配列に対し３′に位置す
るオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズできるよう
に選択されており、一方「第２の」プローブのオリゴヌ
クレオチド配列は、それが望ましいドメインに対し５′
のところに存在するものと同一のオリゴヌクレオチド配
列を含むような形で選択される。両方のプローブは共に
３′ヒドロキシル基を有し、したがって核酸合成のため
のプライマーとして役立つことができる。
PCRにおいては、反応条件は、ハイブリダイゼーショ
ン及び核酸重合の助けとなる条件及び二重鎖分子の変性
を結果としてもたらす条件の間で循環させられる。反応
の第１段階では、試料の核酸は一時的に加熱され、次に
冷却されて、存在しうるあらゆる２本鎖分子が変性され
る。次に「第１の」及び「第２の」プローブは、望まれ
る核酸分子の濃度をはるかに上回る濃度で試料に添加さ
れる。試料が、ハイブリダイゼーション及び重合の助け
となる条件下でインキュベーションされると、「第１
の」プローブは、増幅されるべき配列に対して３′の位
置で試料の核酸分子とハイブリダイズすることになる。
試料の核酸分子が当初２本鎖であった場合、「第２の」
プローブは、増幅が望まれている配列の相補体である配
列に対して３′の位置において核酸分子の相補鎖とハイ
ブリダイズすることになる。ポリメラーゼを添加した時
点で、「第１の」及び（核酸分子が２本鎖である場合に
は）「第２の」プローブの３′末端は伸長されることに
なる。「第１の」プローブの伸長は結果として、望まれ
る核酸の正確な配列をもつオリゴヌクレオチドの合成を
もたらすことになる。「第２の」プローブの伸長は、結
果として、望まれる核酸の相補体の正確な配列をもつオ
リゴヌクレオチドの合成をもたらす。
PCR反応は、「第１の」プローブの伸長産物が必然的
に「第２の」プローブの配列に相補的な配列を含み、か
くして「第２の」プローブの伸長産物の産生のための鋳
型として役立つことから、特異的核酸配列の指数増幅を
行なうことができる。同様に、「第２の」プローブの伸
長産物は、必然的に、「第１の」プローブの配列に対し
て相補的な配列を含み、かくして「第１の」プローブの
伸長産物の産生のための鋳型として役立つことができ
る。したがって、重合及び変性のサイクルを可能にする
ことにより、望まれる核酸分子の濃度の幾何学的増加を
達成することが可能である。PCRに関する総説は、Mulli
s,K.B.（Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263
−273（1986年））;Saiki,R.K.et al.,（Bio/Technolog
y 3:1008−1012（1985年））；及びMullis,K.B.et al.
（Meth.Enzymol.155:335−350（1987年））に提供され
ている。
１つの実施態様においては、本発明は、天然のGRB−
１及びGRB−２タンパク質に向けられている。また別の
実施態様においては、本発明は、組換え型GRB−１及びG
RB−２タンパク質に向けられている。本発明は、天然に
関連しているその他のタンパク質を実質的に含まない天
然のタンパク質分子を提供している。「その他のタンパ
ク質又は糖タンパク質を実質的に含まない」というの
は、そのタンパク質が少なくとも90パーセント（重量ベ
ースで）以上さらには望ましくは少なくとも99パーセン
ト以上の天然に関連するその他のタンパク質及び糖タン
パク質から精製され切っており、したがって実質的にこ
れらを含まないことを意味している。これはGRB−１又
はGRB−２タンパク質を含む細胞、組織又は流体を、そ
のタンパク質に対して反応するモノクローナル抗体を担
持する免疫吸着剤カラムといった標準的なタンパク質精
製技術に付すことによって達成することが可能である。
GRB−１遺伝子のヌクレオチド配列、及びGRB−１タン
パク質のアミノ酸配列は、図４に示されている。GRB−
２の部分的ヌクレオチド配列及び部分的アミノ酸配列
は、図16に示されている。
好ましい実施態様においては、GRB−１又はGRB−２あ
るいは未知のGRBタンパク質は、レセプターチロシンキ
ナーゼのチロシンリン酸化Ｃ末端ドメイン、又はその機
能的誘導体である本発明のプローブを、親和性プローブ
として用いることによって、単離かつ精製することがで
きる。
代替的には、硫酸アンモニウム沈殿、分子ふるいクロ
マトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなど
の標準的な方法の組合せにより、精製を達成することが
できる。
本発明のGRB−１及びGRB−２タンパク質が、さまざま
な細胞又は組織供給源から生化学的に精製可能であるこ
とが理解できるだろう。天然のGRBタンパク質の調製の
ためには、哺乳動物の胎盤又は脳といった組織が好まれ
る。
もう１つの方法として、GRB−１及びGRB−２の遺伝子
が単離又は合成できるため、このポリペプチドは、要す
れば、他のタンパク質すなわち原核生物中の哺乳動物起
源又は非哺乳動物真核生物における糖タンパク質類を実
質的に含まないように合成することができる。本発明に
おいて意図されているように、トランスフェクションに
よって生産されたCOS、NIH−3T3又はCHO細胞のような哺
乳動物細胞において生産される組換えGRB−１又はGRB−
２分子は、例えば、天然に存在するタンパク質配列であ
るか、あるいは、その機能的誘導体である。天然産のタ
ンパク質又は糖タンパク質が組換え手法によって生産さ
れる場合、それは、それが本来結びついている他のタン
パク質及び糖タンパク質を実質的に含まない形で提供さ
れる。
さらには、固相支持体上で所望の配列を有するポリペ
プチドを合成し、次いでその支持体から分離するいくつ
かの方法が良く知られている。特に、本発明のチロシン
−リン酸化Ｃ末端ドメインプローブ又はその機能的誘導
体は、ホスホチロシンがチロシンの代りに提供されるポ
リペプチド合成法を用いることによって合成することが
でき、その結果、ポリペプチドのリン酸化されたものが
直接合成されることになる。
本発明は、チロシン−リン酸化Ｃ−末端ドメインポリ
ペプチド及び／又はGRB−１及びGRB−２タンパク質の
「機能的誘導体」を提供する。
「機能的誘導体」とはGRBタンパク質の「断片」、
「変種」、「類縁体」又は「化学的誘導体」を意味する
が、これらの用語については、以下に定義する。機能的
誘導体は、本発明による有用性を与える本来のタンパク
質の機能を少なくとも一部分を保持している。
本発明のいかなるタンパク質又はポリペプチド類の
「断片」も、該分子のサブセットすなわち短鎖ポリペプ
チドのことを言う。
該タンパク質の「変種」とは、完全ペプチド又はその
断片に実質的に類似した分子のことを言う。変種ペプチ
ドは、当業界で周知の方法を用いることによって、変種
ペプチドの直接化学合成によって好都合に調製すること
ができる。
もう１つの場合として、該タンパク質のアミノ酸配列
の変異種は、合成ペプチドをコードするDNA中の突然変
異によって調製することができる。そのような変異種に
は、例えば、該アミノ酸配列内の残基の欠失体、又は、
その挿入体もしくは置換体が含まれる。欠失、挿入及び
置換のいかなる組合せも、最終構成体が目的とする活性
を備えているかぎり、最終構成体に到達するために、適
用することができる。明らかに変異ペプチドをコードす
るDNAにおいて起きる突然変異は、リーディング・フレ
ームを変化させてはならず、二次的なmRNA構造を産出す
ることが可能な相補性領域を創出しないことが好ましい
（ヨーロッパ特許公報第EP75,444参照）。
遺伝学的レベルにおいては、これらの変異種は、通
常、ペプチド分子をコードするDNAにおけるヌクレオチ
ドの部位特異的変異誘発によって調製され（例えばAdel
manら、DNA ２:183（1983））、それにより、該変異種
をコードするDNAを生成し、その後、組換え細胞培養中
でDNAを発現させ（下記参照）。これらの変異種は、通
常、非変異ペプチドと同じ定性的な生物学的活性を示
す。
チロシン−リン酸化ポリペプチド又はGRBタンパク質
の「類縁体」とは、完全分子又はその断片に実質的に類
似した非天然分子のことを言う。
チロシン−リン酸ポリペプチド又はGRBタンパク質の
「化学的誘導体」は、通常はこのペプチドの一部分では
ない付加的な化学的部分を含む。このペプチドの共有結
合変異（体）も本発明の範囲に含まれる。そのような変
異（修飾）は、該ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択
された側鎖又は末端残基と反応することができる有機誘
導体化剤と反応させることによって、その分子中に導入
することができる。
システインニル残基は、殆どの場合、アルファ−ハロ
アセテート類（及び対応するアミン類）、例えば、クロ
ロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応させられ、カルボ
キシメチル又はカルボキサミドメチル誘導体を与える。
システインニル残基は、また、ブロモトリフルオロアセ
トン、アルファ−ブロモ−ベータ−（５−イミダゾリ
ル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−
アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジル・ジ
スルフィド、メチル・２−ピリジル・ジスルフィド、ｐ
−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロ−マーキ
ュリ−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベ
ンゾ−２−オキサ−1,3−ダイアゾールとの反応によっ
ても誘導体化される。
ヒスチジル残基は、pH5.5〜7.0におけるジエチルプロ
カーボネートとの反応によって誘導体とすることができ
る。というのは、この試薬が、ヒスチジル側鎖に対し比
較的特異性があるからである。パラブロモフェナシルブ
ロミドもまた有用であり、反応は、0.1Mカコジル酸ナト
リウム中、pH6.0で行うのが好ましい。
リジニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸又は他
のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬による
誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果があ
る。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するに適した
他の試薬には、メチル・ピコリンイミデートのようなイ
ミドエステル類、ピリドキサール・ホスフェート、ピリ
ドキサール、クロロ水素化ホウ素、トリニトロベンゼン
スルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、2,4−ペンタンジ
オンが含まれ、さらには、グリオキシレートとのトラン
スアミナーゼ触媒による反応を適用してもよい。
アルギニル残基は、一又は数種の従来の試薬、中で
も、フェニルグルオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2
−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応に
よって修飾される。アルギニン残基の誘導体化には、グ
アニジン官能基の高pKa値のために、アルカリ性条件で
反応を行うことが必要である。さらには、これらの試薬
は、リジンの基とも、あるいは、アルギニンのイプシロ
ンアミノ基とも反応することができる。
チロシル残基そのものの特異的修飾については、芳香
族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応
によってチロシル残基中へスペクトルに掛る標識（ラベ
ル）を導入する特定の関心を持って、広汎に研究が行わ
れている。殆どの場合、Ｎ−アセチルイミダゾール及び
テトラニトロメタンが用いられ、Ｏ−アセチル・チロシ
ル体及び３−ニトロ誘導体を、それぞれ生成する。
カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）
は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−
（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−
（４−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル）カルボジイ
ミドのようなカルボジイミド類（Ｒ′−Ｎ−Ｃ−Ｎ−
Ｒ′）との反応によって、選択的に修飾される。さらに
は、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウム
・イオンとの反応によって、アスパラギニル及びグルタ
ミニル残基に変換される。
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、しばしば脱
アミノ化されて、相当するグルタミル及びアスパルチル
残基となる。あるいはまた、これらの残基は、穏やかな
酸性条件下で脱アミノ化される。これらの残基のいずれ
の形態も、本発明の範囲に入る。
二官能性試薬による誘導体化は、水不溶性支持体マト
リックス又は他の巨大分子担体へ、ペプチドを架橋結合
させるのに有用である。通常使用される架橋剤として
は、例えば、1,1−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェ
ニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル類（例えば、４−アジドサリチル酸
とのエステル類）、3,3′−ジ−チオビス（スクシンイ
ミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエ
ステル類をはじめとするホモ二官能性イミドエステル
類、及びビス−Ｎ−マレイミド−1,8−オクタンのよう
な二官能性マレイミド類が挙げられる。メチル−３−
〔（ｐ−アジドフェニル）ジチオ〕プロピオイミデート
のような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成するこ
とができる光活性化可能な中間体を生成する。もう一つ
の方法として、シアノゲン・ブロミド活性化炭化水素の
ような反応性水不溶性マトリックス並びに米国特許第3,
969,287;3,691,016;4,195,128;4,247,642;4,229,537;及
び4,330,440に記載された反応性基材がタンパク質の不
溶化に用いられる。
他の修飾反応としては、プロリン及びリジンのヒドロ
キシル化（水酸化）、セリルもしくはスレオニル残基の
ヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒ
スチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（T.E.Cr
eighton,Proteins:Structure and Molecule Propertie
s,W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco,pp.79−86（198
3））、Ｎ末端アミンのアセチル化、そして、いくつか
の場合には、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が挙げら
れる。
そのように誘導体化された部分は、溶解性、吸収、生
物学的寿命（耐久性）などを改善しうるであろう。かか
る部分は、一方で、該タンパク質等の望ましくない副作
用を除去ないしは軽減する。このような効果をもたらす
部分については、例えば、Remington's Pharmaceutical
Sciences,16th編、Mack Publishing Co.,Easton,PA（1
980）に開示されている。
本発明のための好ましい細菌宿主はE.coli.（イー・
コリ）である。他の実施態様においては、他の細菌の種
を使用することができる。さらに他の実施態様において
は、真核細胞、例えば、酵母、糸状菌等を利用すること
ができる。これらのタイプの細胞の使用は、当業界で周
知である。いかなる宿主も、発現プラスミド中のレプリ
コン及び制御配列と適合性があるタンパク質を発現する
ために用いられる。一般的に、宿主細胞と適合する種か
ら誘導された、レプリコン及びコントロール配列を含む
ベクターが、該宿主と関連付けて用いられている。ベク
ターは、通常、レプリコン部位及び感染されるか形質転
換された細胞において表現型の選択を与えることができ
る特定の遺伝子を有している。融合タンパク質の発現も
また、形質転換されない状態にある生物に相同的であり
うる他の調節配列の制御下に置くことができる。
本発明は、また、GRB−１又はGRB−２タンパク質のエ
ピトープに特異的な抗体、及び細胞、細胞もしくは組織
抽出物、又は生物学的流体中のGRBタンパク質の存在を
検出するか、又はその量もしくは濃度を測定するため
の、かかる抗体の使用にも関する。
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体（mAbs）、キメラ抗体及び抗イディオタイ
プ（抗−Id）抗体を含むことを意図している。
ポリクローナル抗体は、抗原により免疫された動物の
血清から誘導された抗体分子の不均一集団である。
モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の実
質的に均一な集団である。mAbsは、当業者に公知の方法
で得ることができる。例えば、Kohler及びMilstein,Nat
ure 256:495−497（1975）並びに米国特許第4,376,110
号参照。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、GILD
及びそれらのサブクラスをはじめとする免疫グロブリン
のいかなるクラスのものであってもよい。本発明のmAbs
を産生するハイブリドーマは、生体外（in vitro）又は
生体内（in vivo）で培養することができる。生体内で
の高い力価のmAbsの産生は、この方法を、しばしば、現
在のところ好ましい産生方法にしている。簡潔に言う
と、個々のハイブリドーマからの細胞をプリスタンで感
作したBALB/cマウスの腹腔内に注射し、目的とするmAbs
を高濃度で含む腹水を産生させる。IgM又はIgGイソタイ
プのmAbsは、そのような腹水から、あるいは培養上清か
ら、当業者に周知のカラムクロマトグラフィーを用いる
ことによって、精製することができる。
キメラ抗体は、その異なった部分が異なった動物種か
ら誘導される分子、例えば、マウスmAbsから誘導される
可変領域及びヒトイムノグロブリンの定常領域を有する
ものである。キメラ抗体及びその製造方法は、公知であ
る（Cabillyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3273−327
7（1984）;Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:68
51−6855（1984）;Boulianneら、Nature 312:643−646
（1984）;Cabillyら、ヨーロッパ特許出願第125023（19
84年11月14日公開）;Neubergerら、Nature 314:268−27
0（1985）;Taniguchiら、ヨーロッパ特許出願第171496
号（1985年２月19日公開）;Morrisonら、ヨーロッパ特
許出願第173494号（1986年３月５日公開）;Neuberger
ら、PCT出願第WO 86/01533（1986年３月13日公開）;Ku
doら、ヨーロッパ特許出願第184187（1986年６月11日公
開）;Morrisonら、ヨーロッパ特許出願第173494（1986
年３月５日公開）;Sahaganら、J.Immunol.137:1066−10
74;Robinsonら、国際公開＃PCT/US86/02269（1987年５
月７日公開）;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439
−3443（1987）;Sunら、Proc.Nat.Sci.USA 84:214−218
（1987）;Betterら、Science 240:1041−1048。これら
の参考文献は、ここに引用によって、組み込まれる。
抗イディオタイプ（抗−Id）抗体は、一般に抗体の抗
原結合部位に関連している独特の決定基を認識する抗体
である。Id抗体は、mAbのソースと同じ種及び遺伝学的
タイプ（例：マウスの株）の動物を、それに対する抗−
Idを作ろうとしているmAbで免疫することにより調製す
ることができる。免疫された動物は、イディオタイプの
決定基に対する抗体（抗−Id抗体）を産生することによ
り、免疫抗体のイデオタイプの決定基を認識し、それに
応答する。
抗−Id抗体は、また、さらに他の動物における免疫応
答を誘起して、いわゆる抗−抗−Id抗原を産生させる
「免疫原」として用いることもできる。この抗−抗−Id
は、抗−Idを誘起した元のmAbに、エピトープ的に同一
でありうる。かくして、mAbのイディオタイプの決定基
に対する抗体を用いることにより、同一の特異性の抗体
を発現する他のクローンを同定することができる。
したがって、本発明のGRBタンパク質に対して産生し
たmAbsはBALB/cマウスのごとき適当な動物中で抗−Id抗
体を誘起するために用いることができる。そのような免
疫されたマウスからの脾細胞は抗−IdmAbsを分泌する抗
−Idハイブリドーマを産生するために使用される。さら
に、この抗−IdmAbsはキーホールリンペットヘモシアニ
ン（KLH）のような担体に結合させて、さらなるBALB/c
マウスを免疫することができる。これらのマウスからの
血清は、GRBタンパク質のエピトープに特異的な元のmAb
の結合性能（結合能）を有する抗−抗−Id抗体を含むで
あろう。
この抗−IdmAbsは、かくして、それら自身のイディオ
タイプのエピトープ、すなわち、GRBタンパク質−αの
ような評価さるべきエピトープに構造的に類似した「イ
ディオトープ」を有する。
「抗体」という用語は、また、完全な分子はもとよ
り、例えば、抗原に結合することができるFab及びＦ（a
b′）２のような、その断片（フラグメント）をも含む
ことを意味する。Fab及びＦ（ab′）２フラグメント
は、完全抗体のFcフラグメントを欠き、循環系からより
速く除去され、そして、完全抗体よりもより少ない非特
異的組織結合能を有することができる（Wahlら、J.Nuc
l.Med.24:316−325（1983））。
本発明に有用な抗体のFabやＦ（ab′）２及びその他
のフラグメントは、本明細書において、完全抗体分子に
ついて開示された方法に従って、GRBタンパク質の検出
及び定量に使用することができる。このようなフラグメ
ントは、通常、パパイン（Fabフラグメント類を産生す
る）又はペプシン（Ｆ（ab′）２フラグメント類を産生
する）のような酵素を用いる、タンパク質分解による切
断によって産生される。
抗体は、もしそれがある分子と特異的に反応して、そ
れにより、該抗体に該分子を結合させることができる場
合に、該分子に「結合能を有する」と言われる。「エピ
トープ」なる用語は、抗体によって認識もされうる、抗
体によって結合される分子のその部分のことを言うこと
を意味する。エピトープすなわち「抗原決定基」は、通
常、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な
表面群からなり、特定の三次元構造特性と特定の電荷特
性を有する。
「抗原」は、抗体によって結合されることができる分
子又は分子の部分であり、それは、さらに該抗原のエピ
トープに結合可能な抗体を産生するように動物を誘起す
ることができる。抗原は、一つ又はそれ以上のエピトー
プを有することができる。上述した特異的反応とは、該
抗原が、高度に選択的な形で、その対応する抗原と反応
はするが、他の抗原によって誘発されうる他の抗体の多
くのものとは反応しないことを示すことを意味する。
本発明において有用な抗体もしくは抗体のフラグメン
トは、GRBタンパク質を発現する細胞の存在を定量的又
は定性的に検出するために用いることができる。これ
は、光学顕微鏡による測定、フローサイトメトリーによ
る測定又は蛍光分析による測定と一緒に、蛍光標識抗体
（以下参照のこと）を用いる免疫蛍光技術によって達成
される。
本発明において有用な抗体（又はそのフラグメント
類）は、GRBタンパク質をin situ検出するために、免疫
蛍光又は免疫電子顕微鏡的分析におけるように、組織学
的に使用することができる。in situ検出は、患者から
組織標本を取り出してそのような標本に本発明の標識抗
体を合わせることにより達成することができる。これら
の抗体（又はフラグメント）は、生物学的試料に標識抗
体（又はフラグメント）を塗るか、積層することによっ
て提供するのが好ましい。そのような手法を使用するこ
とにより、GRBタンパク質の存在だけでなく、試験され
た組織におけるその分布をも検出することができる。本
発明を用いるに当って、当業者は、そのような、その場
での検出を達成するために広汎な組織学的方法（例え
ば、染色方法）を修正することができることを容易に了
解するであろう。
GRBタンパク質のこのような試験法は、通常、GRBタン
パク質を同定することができる検出可能なように標識化
された抗体の存在下で、生物学的流体、組織抽出物、リ
ンパ球もしくは白血球のごとき新たに摂取された細胞又
は組織培養でインキュベートされた細胞のような生物学
的試料をインキュベートし、数多くの周知技術のいずれ
かによって該抗体を検出することを特徴とする。
生物学的試料は、ニトロセルロースのような固相支持
体又は細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質類を不溶化
することができる他の固体支持体によって処理すること
ができる。該支持体を、次いで好適な緩衝液で洗浄し、
検出可能なように標識されたGRBタンパク質特異的抗体
で処理することができる。該固相支持体は、次に、非結
合抗体を除去するために、緩衝液で再度洗浄することが
できる。該固体支持体上の結合標識の量を、次に、従来
法を用いて検出することができる。
「固相支持体」とは、抗原又は抗体と結合することが
できるものならいかなる支持体であってもよい。周知の
支持体もしくは担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリ
プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、
アミラーゼ類、天然もしくは修飾セルロース、ポリアク
リルアミド、はんれい岩（gabbro）及びマグネタイトが
含まれる。担体の性質は、本発明の目的に照らして、あ
る程度可溶性であってもよく、あるいは、不溶性であっ
てもよい。この支持体の材料は、結合した分子が抗原又
は抗体を結合することができるかぎり、実際上、いかな
る可能な構造上の形態をとってもよい。かくして、支持
体の形状は、ビーズのように球形であってもよく、ある
いは、試験管の内側壁又はロッドの外壁のようにシリン
ダー状であってもよい。さらには、表面は、シート、試
験片等々のごとく、平坦であってもよい。好ましい支持
体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者
ならば、抗体又は抗原を結合するための他の多くの適当
な担体を知っているであろうし、日常的実験によってそ
れを確認することができるであろう。
抗−GRB−１及び抗−GRB−２抗体の与えられたロット
の結合活性は、周知の方法によって測定することができ
る。当業者は、日常的な実験を用いて各測定用の操作上
の最適条件を決定することができるであろう。
洗浄、撹拌、震盪、濾過等のごとき他の操作を、個々
の場合、通常行われるごとく、あるいはまた、必要に応
じて、試験法に付加することができる。
GRB特異性抗原が検出可能であるように標識化できる
一つの方法は、それを酵素に結合させて、酵素免疫試験
法（EIA）において使用することである。この酵素は、
次に、後にしかるべき基質に触れた場合、該基質と反応
して、例えば分光光度測定法、蛍光測定法あるいは、肉
眼による方法によって検出できる化学的部分を生成す
る。抗体を検出可能なように標識するために用いること
ができる酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ス
タフィロコッカル・ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロ
イド・イソメラーゼ、イーストアルコール・デヒドロゲ
ナーゼ、アルファ−グリセロホスフェート・デヒドロゲ
ナーゼ、トリオースホスフェート・イソメラーゼ、ホー
スラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、アルパラギナーゼ、グルコース・オキシダー
ゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウ
レアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェート
・デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチル
コリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定され
るものではない。検出は、酵素に対する色原性基質を用
いる比色測定法によって遂行することができる。検出
は、また、基質の酵素反応の程度を同様に調製された標
準と目視比較することによってもなされる。
検出は、種々の他の免疫試験法のいずれかを用いて行
うことができる。例えば、放射能で抗体又は抗体のフラ
グメントを標識化することにより、ラジオイムノアッセ
イ（RIA）を用いてＲ−PTPaseを検出することができ
る。RIAについての良き記述は、Work,T.S.ら、North Ho
lland Publishing Company,NY（1978）によるLaborator
y Techniques and Biochemistry in Molecular Biology
中に見出すことができる。特に、ここに参考文献として
包含する、Chard,T.による「An Introduction to Radio
immune Assay and Related Techniques」の章を参照の
こと。ラジオアイソトープは、ガンマー計数器又はシン
チレーション・カウンターを用いるような手段あるいは
オートラジオオートグラフィーによって検出することが
できる。
抗体は、蛍光化合物によって標識することもできる。
蛍光によって標識された抗体をしかるべき波長の光に曝
すと、その存在は、蛍光によって測定することができ
る。最も普通に用いられる蛍光標識化合物の中には、フ
ルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、フィ
コエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、
ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレスカミンが含まれ
る。
抗体は、また、蛍光を発する金属、例えば152Euやそ
の他のランタノイド系列のものを用いても検出可能なよ
うに標識することができる。これらの金属は、ジエチレ
ントリアミンペンタ酢酸（DTPA）やエチレンジアミン四
酢酸（EDTA）のような金属キレート剤を用いて抗体に着
けることができる。
抗体は、また、それを化学発光性化合物と結合させる
ことによっても検出可能なように標識化することができ
る。化学発光部分をぶら下げた抗体の存在は、次に、化
学反応の過程で発生する発光（ルミネッセンス）の存在
を検出することにより測定される。特に有用な化学発光
性標識化化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、
テロマチック（theromatic）・アクリジウム・エステ
ル、イミダゾール、アクリジウム塩及びシュウ酸エステ
ルである。
同様に、生物発光性化合物も、本発明の抗体を標識す
るために用いられる。生物発光（Bioluminescence）
は、生物学的な系の中に見出される一種の化学発光（Ch
emiluminescence）であり、この場合、触媒性タンパク
質（酵素）が化学発光反応の効率を高める。生物発光性
タンパク質は、ルミネッセンスの存在を検出することに
よって測定される。標識の目的に重要な生物発光性化合
物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエークオリン
（aequorin）である。
本発明の抗体分子は、「二部位（two−site）」法も
しくは「サンドイッチ」法としても知られる免疫測定試
験に利用するために適合させてもよい。典型的な免疫測
定試験法においては、ある量の非標識化抗体（又はその
抗体のフラグメント）を固体支持体に結合させ、検出可
能なように標識された可溶性抗体の一定量を加えると、
固相抗体、抗原及び標識抗体の間に形成される三成分系
コンプレックスの検出及び／又は定量ができる。
典型的で、かつ、好ましい免疫測定試験法は、固相に
結合していた抗体を先ず、テストされるべき試料と接触
させ、二成分系固相抗体−抗原コンプレックスを形成す
ることにより、試料から抗原を抽出する前進試験（“fo
rward assay"）を含む。適当なインキュベーション時間
の後、固体支持体を洗浄して、もし存在するならば未反
応抗原を含む、流体試料の残部を除去し、次に未知量の
標識抗体（それは「リポーター分子」として働く）を含
む溶液と接触させる。標識抗体をして、非標識抗体を介
して固体支持体に結合された抗原と複合体を形成させる
ための第二のインキュベーション時間の後、固体支持体
を再び洗浄して、未反応の標識抗体を除去する。
本発明の抗原についても有用でありうるもう一つの型
の「サンドウィッチ（“sandwitch"）法」においては、
いわゆる同時試験法（simultaneous assay）と逆試験法
（reverse assay）が用いられる。同時試験法は、固体
支持体に結合した抗体と標識抗体を同時に試験さるべき
試料に添加するため、単一のインキュベーション工程を
要する。インキュベーション終了後、固体支持体を洗浄
して流体試料及び複合体を形成しなかった標識抗体を除
去する。固体支持体と結合した標識抗体の存在を、次
に、従来の前進（forward）サンドウィッチ試験におけ
るように測定する。
逆（reverse）試験法においては、段階的添加が行わ
れる。すなわち、先ず流体試料への標識抗体の溶液の添
加と、それに続いて適当なインキュベーション時間の
後、固体支持体に結合した非標識抗体の添加が行われ
る。第２のインキュベーションの後、固相を従来のやり
方で洗浄して、試験されるべき試料の残りと、未反応標
識抗体の溶液を除く。固体支持体と結合した標識抗体の
測定は同時（simultaneous）試験法及び前進（forwar
d）試験法におけるようにして行われる。
例 Ｉ ニトロセルロース・フィルター上に不溶化された、SH
2ドメインを含むタンパク質に対するEGFRのＣ末端ドメ
インの結合の検出可能性を測定するために、研究を行っ
た。この目的のために、細菌によって発現された融合タ
ンパク質へのＣ−末端ドメインの結合について調べた
（Fig.1、参照のこと）。
A. EGFRのカルボキシ末端ドメインの単離と標識化 チロシンキナーゼドメインとカルボキシ末端ドメイン
を含むEGFRの細胞内部分を、先に述べた様に、ヒトEGFR
の細胞内ドメインに相補的なcDNAを発現する組換えバキ
ュロウイルスから精製した（Hsu,C.Y.ら、Cell Growth
and Differentiation １:191−200（1990））。この組
換えタンパク質（２μｇ）を、次に、〔ガンマー32P〕A
TP（200μCi、6,000Ci/mmol）を用い、４℃で、5mM MnC
l2を含むHNTG（200mM HEPES、pH7.5、150mM NaCl、0.1
％Triton Ｘ−100及び10％グリセリン）緩衝液中でリ
ン酸化した。導入されなかった〔γ−32P〕ATPを除去す
るために、100μｇのBSAを含むpH7.5の20mM HEPESで1ml
にまで稀釈し、次いで、Centricon−10中で50μｌの体
積にまで濃縮した。この操作を３回繰返すと、99％を超
える未導入ATPが除去された。キナーゼドメインからＣ
−末端ドメインを分離するために、濃縮されたタンパク
質を、次に、シアノゲン・ブロミド（臭化シアン、CNB
r）で、70％ギ酸中、14時間、室温で消化した（下記例V
Iも参照のこと）。次いで、試料を３回水洗、乾燥し、
結合用緩衝液中、２×106cpm/mlになるように再懸濁さ
せた。
B. ニトロセルロース上に不溶化された細菌によって発
現されたTrpE/GAP−SH2融合タンパク質への、EGFRのＣ
末端ドメインの結合 TrpE及びTrpE/GAP−SH2を、Dr.Tony Pawsonの研究室
から得、そして、以前に述べたようにして調製した（Mo
ran,M.F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8622−8626
（1990））。フィルターへの結合の研究を、発表された
方法（Schneider,W.J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,76:557
7−5581（1979）;Daniel,T.O.ら、J.Biol.Chem.258:460
6−4611（1983））を少し修正したものに従って行っ
た。種々の濃度の、細菌によって発現したTrpE融合タン
パク質か、あるいは、細菌のタンパク質単独をニトロセ
ルロースのフイルターにスポットした。５％カーネーシ
ョン（Carnation）ドライミルクを含むPBS中、４℃で、
１時間フィルターをブロックしたのち、EGFRの32P−標
識Ｃ末端ドメインを添加し、一晩、４℃でインキュベー
ションを続けた。24時間後、ニトロセルロース・フィル
ターを、0.2％Triton Ｘ−100を含むPBSで、室温で３
回洗浄した。フィルターを乾燥し、−80℃でKodak XAR
−５フィルムに曝した。
C. 結果 上述の方法は、細菌によって発現された5ng未満のGAP
−SH2融合タンパク質に対するEGFR Ｃ末端ドメインの
特異的結合の検出を可能にした。結合は特異的であっ
た。というのは、プローブのチロシンリン酸化を必要と
したし、関係がないタンパク質をニトロセルロース・フ
ィルターに塗布しても何も起きなかった。
EGFR Ｃ末端ドメインが、ニトロセルロース・フィル
ター上に不溶化されたSH−２含有タンパク質に対し、特
異的結合することが出来たという事実は、本発明者ら
を、元気づけて、新規なEGFR結合性タンパク質の同定を
最終目的にして本研究をλgt11発現ライブラリーへ応用
させんとした。
例II 発現ライブラリーのスクリーニング及び新規なSH2−含
有タンパク質をコードするcDNAクローンの単離 EGFRのチロシンリン酸化Ｃ−末端尾部を、上述したい
くつかの異ったヒト組織からの発現ライブラリーをスク
リーニングするためのプローブとして用いた。スクリー
ニングの手法は、Fig.2にまとめてある。この手法を用
いて多くの陽性のクローンが、今までに同定されている
が、そのうちで二つを詳細に解析した。
A. cDNAライブラリーのスクリーニング ヒト脳幹から単離されたmRNAから構成されたλgt11
（lambda gt 11）ライブラリーをM.Jayeから入手した。
このライブラリーをスクリーニングするため、λgt11フ
ァージを、150mmの寒天プレート当り４×104プラークが
産生されるに充分な密度で、塗り付けた。全部で６つの
プレートを最初にスクリーニングした。これらのプレー
トを６時間42℃でインキュベートした後、これらのプレ
ート上に、先に述べられたようにして（MacGregor,P.F.
ら、Oncogene ５:451−458（1990））、イソプロピル−
Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）で含浸してお
いたニトロセルロースフィルターを重ねた。インキュベ
ーションを、37℃で一晩続けた。次に、フィルターをと
り出し、tBST（10mMトリス−HCl、pH8、150mM NaCl及び
0.05％TritonX−100）で、室温で洗浄し、次にHBB（20m
M HEPES、pH7.5、5mM Mg/Cl、1mM KCl）緩衝液（５％の
カーネーション・ドライ・ミルクを含む）で、１時間、
４℃で上に述べたようにして（上記MacGregorらの文
献）、洗浄した。ブロッキングに続いて、標識化チロシ
ンリン酸化カルボキシ末端（Ｃ−末端）プローブを1.6
×10-4μg/mlの濃度で添加し、インキュベーションを一
晩続けた。フィルターを、次に0.2％TritonX−100を含
むPBS中、室温で３回洗浄した。フィルターを乾燥し、
−80℃でKodak XAR−５フィルムに曝した。
陽性のクローンに相当する寒天プラグをプレートから
集め、それをSM培地1ml中に入れた。寒天からファージ
を拡散させた後、ファージを再塗布し、上述したように
して再スクリーニングした。次のスクリーニングで富化
（enrichment）を示したファージを単離し、配列を決め
た。λgt11ファージDNAは、Maniatisらに従ってプレー
ト・ライセート法で単離し、EcoR I−消化M13MP19（Man
iatisら、1988）へサブクローニングした。単鎖DNAを単
離し、Sequenase DNA配列決定キット（U.S.Biochemica
l）を用いて、ジデオキシ鎖終了法（dideoxy chain ter
mination method）によって配列を決めた。
一つの実験においては、ヒト脳幹λgt11ライブラリー
からの240,000pfuをスクリーニングした。単一のプラー
ク、クローンki4（Fig.3A）を単離した。次のスクリー
ニングで、このクローンは富化（enrichment）を示し、
第３回目のスクリーニングで全てのプラークがプローブ
に結合した（Fig.3B）。クローンki4は、約900ヌクレオ
チドの挿入物を含み、この挿入物は、IPTGを用いてlac
プロモーターを誘発すると、EGFRに結合可能な融合タン
パク質を産生した。融合タンパク質のサイズ（大きさ）
から、cDNA挿入物が約300アミノ酸のタンパク質（この
サイズは、もしもcDNAが単一の大きなオープンリーディ
ングフレームを含んでいるならば予想された大きさであ
る）をコードしていることが予想された。クローンki4
をより詳しく分析するために、DNAを単離し、ヒトcDNA
挿入物に相当するEcoR IフラグメントをM13中にサブク
ローニングし、配列を決めた。この挿入物からの配列の
翻訳から単一の大きなオープンリーディングフレームが
示され、これは、ジーンバンク（Genbank）のデータベ
ースによれば、他の公知のタンパク質のSH2ドメインと
配列ホモロジーを有する約100アミノ酸の単一伸長部を
含むことが判った（Fig.4及び5A）。しかしながら、他
のドメインには配列ホモロジーは記録されなかった。こ
うして、このスクリーニング法を用いて、EGFRに結合可
能な、新規なSH2含有タンパク質が同定された。
B. 完全長cDNAの単離 単離された最初のクローンはSH2ドメインをコードし
ていたが、遺伝子の３′又は５′末端を含んでいなかっ
た。完全長のcDNAを単離するために、ライブラリーを、
最初の陽性ファージから単離されたDNAを用いて再スク
リーニングした。陽性のクローンを発現した組換えM13
バクテリオファージからのDNAを、温度サイクラー（The
rmal cycler）、Taq Iポリメラーゼ、及びM13ベクター
のEcoR Iフランキング領域に相補的なオリゴヌクレオチ
ドを用いて増幅した。情報（information）中により多
くの５′配列を含むクローンを得るために、最初の単離
されたファージの最も５′側の250ヌクレオチドに相当
する第２の増幅DNA生成物もまた、この領域の両端にお
ける配列に相補的なオリゴヌレオチドを用いて生成させ
た。〔32P〕−標識化DNAプローブを、次に、この増幅生
成物のニックトランスレーションによって調製した。
cDNAライブラリーを再スクリーニングするために、こ
のライブラリーを上述の様にして再塗布した。プレート
を37℃で８時間インキュベートしたのち、プレートを１
時間４℃に冷却、次いでファージDNAをニトロセルロー
スフィルターに移した。フィルターを0.2N NaOHと1.5M
NaClの溶液中で変性させ、次いで、減圧下、２時間、
80℃でベーキングした（Sambrook,J.ら、Molecular Clo
ning:A Laboratory Maunal,2nd Edition,Cold Spring H
arbor Press,Cold Spring Harbor,NY（1989））。この
フィルターを、42℃で１時間プレハイブリダイゼーショ
ンに付した後、32P−標識DNAプローブを添加し、ハイブ
リダイゼーションを、42℃で一晩、５×Denhardt's、50
％ホルムアミド、５×SSC、0.1％SDS、200mM Tris−HC
l、pH7.6及び100μg/mlのサケ精子DNAを含む溶液中で続
けた。これらのフィルターを、次いで、0.1×SSC及び0.
1％SDSを含む溶液中で洗浄し、乾燥し、そして、Kodak
XAR−５フィルムに−70℃で曝した。次いで、陽性クロ
ーンを単離し、上述のようにして配列を決めた。
クローンki4からの挿入物は、遺伝子の３′及び５′
末端を欠いていたため、ライブラリーを、クローンki4
からのDNAを増幅することによって生成した二つのDNAプ
ローブを用いて再スクリーニングした。この手法は、さ
らに５つのクローンの同定を可能にした。
これらのクローンのうち三つが最初のクローンki4か
ら３′伸長しており、それらのうち二つ、すなわち、ク
ローンki2.2及びki2.4は、ポリアデニル化シグナル及び
長い３′非翻訳ドメイン（＞1,000ヌクレオチド）を含
んでいた。さらに、これらのクローンは、第２のSH2ド
メインを含むタンパク質をコードしていた（Fig.4及び5
A）。
他二つのクローン、すなわち、ki3.0及びki5.3は、ク
ローンki4から５′伸長していた。両クローンは、長い
オープンリーディングフレームとKozakによって定義さ
れた翻訳開始基準に合うAUGコドンを含んでいた（Koza
k,M.,J.Cell.Biol.108:229−241（1989））。しかしな
がら、クローンki3.0だけが、タンパク質に翻訳してジ
ーンバンク中の公知の配列と比較したとき、他の公知の
タンパク質中に存在するSH3ドメインに相同な50アミノ
酸のドメインを含んでいることが見出された。重複クロ
ーン、ki2.2及びki3.0によってコードされた完全長タン
パク質の予想された分子量は、約84kDaであった。この
新しいタンパク質をGRB−１と名付けた。
例III GRB−１タンパク質は、SH2及びSH3ドメインを含んでい
る。
GRB−１タンパク質の配列を、ジーンバンクのデータ
ベース中の配列と比較して分析したところ、アミノ酸33
3及び624のところから発する、約100アミノ酸の２本の
伸長部の存在が明らかとなったが、これらは、EGFRと相
互作用することが知られている他のタンパク質のSH2ド
メインと配列の相同性を示していた（Fig.5A）。GRB−
１は、タンパク質のレベルでは、他のSH2ドメインに驚
くべき相同性を示したが、DNAレベルでは、有意な相同
性は明らかにならなかった。GRB−１は、また、Ｎ−末
端ドメインに位置し、SH3ドメインに対する配列の相同
性を有する50アミノ酸のセグメントを含んでいた（Fig.
4及び5B）。
GRB−１の構造的機構の、いくつかの他のSH2/SH3含有
タンパク質との比較を、Fig.6に示した。この模式図か
ら明らかなように、SH2及びSH3ドメインの局在化は、タ
ンパク質毎に異なる。このことにもかかわらず、これら
のSH2含有タンパク質間には、ある類似性と相違が存在
する。GRB−１は、PLC−ガンマ及びGAPのようなEGFRと
相互作用することが判っているいくつかの他の基質と、
GRB−１が２つのSH2ドメインと一つのSH3ドメインを含
んでいるという点で相似ている。しかしながら、これら
の基質とちがって、GRB−１は、公知の触媒性ドメイン
には相同性を示さず、この点でトリ肉腫ウイルスによっ
てコードされたタンパク質ｖ−crkに似ている。
これらのドメイン以外では、ジーンバンクにある他の
タンパク質配列とは何らの配列の相同性はなかった。特
に、GRB−１は、ATP−結合共通ドメインを欠いており、
セリン／トレオニン・キナーゼ又はチロシン・キナーゼ
と配列上の相同性を示さなかった。
このSH2ドメインは、それによって酵素学的に明白な
シグナル分子がチロシンキナーゼ活性を有する活性化レ
セプターに結合しうる共通のモチーフを与えるものと考
えられている（Moran,M.F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
87:8622−8626（1990）;Anderson,D.ら、Science 250:
979−982（1990））。
GRB−１中（Fig.4）及びGRB−２中のSH2ドメインの存
在は、このドメインが、EGFRのＣ−末端尾部とこれらの
タンパク質の相互作用を仲介しているという点で、この
ドメインの重要性を強調する。さらには、チロシン・レ
セプターと相互作用することができる多くのタンパク質
が同定されずにいることから、このことは、このタンパ
ク質のファミリーのさらなるメンバーが発見されるであ
ろうことを示唆している。
GRB−１は、２つのSH2ドメインを含んでいる他に、SH
3ドメインをも含んでいる。SH3ドメインは、多くのSH2
含有タンパク質に共通に見られる、約50個のアミノ酸か
らなる非触媒ドメインである。SH3ドメインは、スペク
トリン（spectrin）やフォドリン（fodrin）のような細
胞骨格タンパク質中にも見出されているので、このドメ
インの機能は、これらのタンパク質を、それらが他の分
子と相互作用するであろう膜もしくはサブメンブランの
細胞骨格に、局在化させんとする点にあり得る。
GRB−１の推定されるアミノ酸配列を、トリのガン遺
伝子ｖ−crkによってコードされたタンパク質生成物と
比較することは、GRB−１の機能を明らかにするかも知
れない。遺伝子ｖ−crkは、一次的にはSH2及びSH3ドメ
インに融合したウイルスのgagタンパク質から構成され
るタンパク質をコードする（Mayer,B.J.ら、Nature 33
2:272−275（1988））。GRB−１及びP47gag-crkタンパ
ク質は公知の触媒ドメインとは相同性がない。しかしな
がら、P47gag-crkで形質転換されたニワトリ胚繊維芽細
胞は、高いレベルのホスホチロシン含有タンパク質を示
す（Mayer,B.J.ら、上記;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2
638−2642（1990））;Matsuda,M.ら、Scince 248:1537
−1539（1990）。
ｖ−crk生成物が、ｖ−crk形質転換細胞中でいくつか
のホスホチロシン含有タンパク質を結合させることが示
されているからには、ｃ−crkの機能は、おそらく、キ
ナーゼと基質の橋渡しをすることであろう。この点で、
GRB−１が、GAP及びPLC−ガンマと同様に、二つのSH2ド
メインを含み、これらの組合せが、他のタンパク質を活
性化されたチロシンキナーゼレセプターに結合させるの
に理想的に適しているということは、興味深い。
例IV GRB−１発現のノーザン分析 A. 方法 全細胞性RNAを、Sambrook,J.ら（上述）によって記載
されたグアニジウムイソシアナート／塩化セリウム法に
より、サルの組織から調製した。Poly（Ａ）＋RNAは、
オリゴ（dT）セルロース・クロマトグラフィーによって
調製した。ノーザン分析のために、RNAを1.2％アガロー
ス/2.2Mホルムアルデヒドゲル中の電気泳動によって大
きさ別に分画し、毛細管作用によってナイロン膜上に移
し、80℃で２時間加熱した。プレ（予備）ハイブリダイ
ゼーションに続き、ブロットを、上述のようにして調製
した〔32P〕−ニックトランスレーションDNAプローブと
ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、42
℃で一晩、50％ホルムアミド、５×SSC、0.1％SDS及び
５×Denhardt'sの存在下、行った。膜（メンブレン）
を、次に、0.1×SSC、0.1％SDSで、42℃で洗浄し、Koda
k XARフィルムに、−70℃で12時間、強化スクリーンを
用いて曝した。
B. 結果 新たに単離されたcDNAに対応するmRNAの発現について
試験するために、クローンki4からの挿入物に対応するD
NAをプローブとして用いる、異なったサル組織mRNAのノ
ーザン・ブロット分析によって、検討した多くの組織中
に4.4kb及び7.0kbの２つの主バンドの存在が示された
（Fig.7）。発現は、脳において最も高く、心臓、脾
臓、肝臓及び胸腺は、次第に低くなって行くレベルの発
現を示した。4.4kbのメッセンジャーは、単離されたク
ローンをコードするであろうトランスクリプト（transc
ript）の予想された大きさに対応する。多の組織におい
て観察された4.4kb及び7.0kbのトランスクリプトとは対
照的に、皮膚は、3.6kb及び6.6kbの２つのわずかに小さ
い大きさのmRNAを含んでいた。
3.6、6.6及び7.0kbのトランスクリプトは、あるい
は、mRNAのスプライシングされた形のものを表わしてい
る可能性もあり、また、別個の、しかしながら関連する
mRNAの種をコードしている可能性がある。
例Ｖ 抗−GRB−１抗体の産生及びGRB−１融合タンパク質の分
析 A. 方法 ポリクローナル抗体を、最初の単離されたファージク
ローンki4によって発現されたβ−ガラクトシダーゼ融
合タンパク質で、ウサギを免疫することにより生産し
た。E.coli CAG 456細菌（Yale UniversityのDr.Michae
l Snyderより入手）を、組換えファージki4で、moi10で
感染させ、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を、1.
5時間後、タンパク質ペレットから回収した。タンパク
質抽出物を調製し、６％SDS−ゲル上で分離し、融合タ
ンパク質に相当するバンドをゲルから切り取り、これを
免疫に使用した。
ヒトのグリオブラストーマ細胞株U1242、ラット膀胱
ガン細胞株NBT II、及びNIH3T3細胞を、10％の子ウシ血
清を補足したDMEM培地で密集状態になるまで成長させ
た。細胞は、0.5％子ウシ血清中、〔35S〕−メチオニン
（50μCi/ml）で標識し、先に述べられているようにし
て、12時間後に溶解させた（Margolis,B.ら、Cell 57:1
101−1107（1989））。タンパク質Ａ−セファロースに
カップリングした抗体10μｌで免疫沈殿を行った後、ビ
ーズを、20mM HEPES、pH7.5、300mM NaCl、10％グリセ
リン、１％TritonX−100、0.1％SDS及び１％ナトリウム
・デオキシコーレートを含む溶液で３回洗浄した。試料
緩衝液中で沸とうさせたのち、タンパク質を、８％SDS
−ゲル上で分離した。
B. 結果 ポリクローナル抗体が、最初の単離されたファージに
よって発現されたβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質
に対して誘起された。生合成的に標識した細胞を用いる
免疫沈殿実験によれば、これらの抗体は、三つの異なっ
た細胞株における85kDaのタンパク質を認識したことが
明らかとなった（Fig.8、“I"と指定されたレーン）。
この抗血清による85kDaタンパク質の認識は特異的であ
る。というのは、プレ免疫血清はこのタンパク質を認識
しなかったからである（“P"と指定されたレーン）。こ
れらの結果は、クローン化GRB−１のアミノ酸配列に基
づく予測された分子量に支持を与えた。
C. 検討 GRB−１の遺伝子は予想された分子量85kDaを有するタ
ンパク質をコードするという知見並びに、GRB−１に対
する抗体が三つの異なった細胞株からの85kDaタンパク
質を免疫沈澱させたという事実は、GRB−１が、以前、
活性化成長因子レセプターと会合（結合）することが以
前から示されている特定のタンパク質、すなわちp85を
表すことができることを示唆している。p85の正確な機
能（役割）は未知であるが、それは、おそらく、ホスフ
ァチジルイノシトール（PI3）−キナーゼであると思わ
れる。というのは、PI3−キナーゼ活性が、PDGFで刺激
された細胞ならびにミドルＴ−抗原（MTAg）で形質転換
された細胞中で見出された85kDaタンパク質と共に精製
されたからである（Kaplan,D.R.ら、Cell 50:1021−102
9（1987）;Whitman,M.ら、Nature 315:239−242（198
5）;Coughlin,S.R.ら、Science 243:1191−1194（198
9））。ATP結合部位の欠除は、GRB−１は、おそらく、
十中八九、ホスホリピッドキナーゼではないことを示
す。GRB−１は、マウス及びウシp85と97％配列が一致し
ている。したがって、GRB−１は、p85のヒトの対応物で
ある。組換えp85は、活性化PDGFR又はEGFRに結合するこ
とはできるが、それ自身本来的なPI3キナーゼ活性を有
さない。しかしながら、p85は、PI3キナーゼの触媒性サ
ブユニットでありうる110kDaのチロシンリン酸化タンパ
ク質と関連を有することが判っている。PI3キナーゼとp
85間の厳密な関係は知られていないものの、p85の過剰
発現（overexpression）はPI3キナーゼとPDGFRの間の相
互作用を調節する。p85は、調節サブユニットとして、
又は活性化されたレセプターとPI3キナーゼ間の橋渡し
として働く可能性がある。
例VI EGFレセプターのチロシンリン酸化カルボキシ末端はGAP
及びPLC−ガンマの結合部位である 以下に述べる研究は、PLC−ガンマと、GAPのSH2及びS
H3ドメインを含む融合タンパク質（trpE/GAP SH2）の
結合が、EGFRの自己リン酸化によって特異的に制御され
ていることを確認する。結果が示すところによれば、PL
C−ガンマのリン酸化は、そのEGFRとの会合を実際に減
少させている。提示された証拠によれば、PLC−ガンマ
及びtrpE/GAPSH2融合タンパク質の両者は、EGFRのチロ
シンリン酸化Ｃ−末端に特異的に結合することが示され
ている。つまり、これらの結果は、SH2/SH3ドメインがE
GFレセプターのホスホチロシン含有ドメインと直接相互
作用することを示している。
A. 材料及び方法 1.細胞株、変異レセプター及び融合タンパク質 細胞株CD126（Margolis,B.L.ら、J.Bio.Chem.264:106
67−10671（1989a））、HER14、K721（Honegger,A.M.
ら、Cell 51:199−209（1987）;Honegger,A.M.ら、Mol.
Cell.Biol.７:4567−4571（1987））を、それぞれ野生
型EGFレセプター、キナーゼ陰性（kin-）EGFレセプター
及びＣ−末端（Ｃ−terminal）を短縮した（truncate
d）EGFレセプターのソースとして用いた。EGFレセプタ
ーの細胞内ドメイン（EGFR−Ｃ）を、バキュロウイルス
の発現システム（Hsu,C.J.ら、Cell Growth Differ.１:
191−200（1990））から精製した（Fig.9A）。3TP1、す
なわちトランスフェクションを受けたPLC−ガンマのcDN
Aを過剰に発現するが、EGFレセプターを持たない細胞株
を、PLC−ガンマのソースとして用いた（Margolis,B.
ら、Science 248:607−610（1990b））。
GAP SH2ドメイン（GAP残基171−448、Fig.9B）を含
むtrpE融合タンパク質の調製については、すでにMoran
らによって記載されている（Moran,M.F.ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 87:8622−8626（1990））。trpE/GAP SH
2融合タンパク質を含むバクテリアのライセートは、1g
のバクテリアを3mlの50mM Tris pH7.5、0.5mM EDTA、0.
1mM PMSFに再懸濁させることによって調製した。1mg/ml
リゾチーム及び0.2％NP−40中、４℃でインキュベーシ
ョンを行ったのち、細胞を５秒間、５回超音波処理し、
ライセートを10,000gで30分間遠心することにより清澄
にした。バクテリアのライセートを、上述したような、
プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含む１％Tr
itonリシス（lysis）緩衝液中で1:100に稀釈し、プロテ
インＡ−セファロースで予めクリアにした。
2.抗体、免疫沈澱及び免疫ブロッティング 次の抗−EGFR抗体（Fig.9A）を用いた。すなわち、 （ａ）mAb108、細胞外ドメインのドメインIII（domai
n III）に対するモノクローナル抗体（Lax,I.ら、EMBO
J.８:421−427（1989））； （ｂ）残基984−996に特異的な抗ペプチド抗体RK2; （ｃ）残基1176−1186に特異的な抗ペプチド抗体C;及
び （ｄ）残基656−676に特異的な抗ペプチド抗体Ｆ trpE融合タンパク質を免疫沈澱させるために、アガロ
ースに結合した抗−マウスIgG（Sigma）に結合したtrpE
に対するマウスのモノクローナル抗体（Oncogene Scien
ce）を利用した。免疫ブロッティング用には、trpEに対
するウサギのポリクローナル抗体を用いた（Moran,M.F.
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8622−8626（199
0））。PLC−ガンマを、先に述べたウサギのポリクロー
ナル抗−ペプチド抗体を用いて免疫ブロッティング及び
免疫沈澱に付した（Margolis,B.ら、Cell 57:1101−110
7（1989b））。
手法については、本発明者らの研究室から出たいくつ
かの文献に記載されている（Margolis,B.L.ら、J.Biol.
Chem.264:10667−10671（1989）;Cell 57:1101−1107
（1989））。刺激されていない細胞を10％子ウシ血清を
含むDulbecco'sModified Eagle培地中で密集状態になる
まで成育させ、プロテイナーゼ及びホスファターゼ阻害
剤を含む１％Triton Ｘ−100リシス用緩衝液中で溶菌
する前に１％ウシ胎児血清中で一晩飢餓状態にした。EG
Fレセプターを、プロテインＡ−セファロースに結合し
た抗体を用いて免疫沈澱させた。レセプター材料をHNTG
（20mM Hepes、pH7.5、150mM NaCl、0.1％TritonX−100
及び10％グリセリン）で洗った後、5mM MnCl2及び30μM
ATPを添加することによって自己リン酸化を誘発した。
対照（コントロール）は、Mn2+のみと共にインキュベー
トした。HNTGでさらに洗浄したのち、PLC−ガンマ（3TP
1細胞から）か、細菌の融合タンパク質のどちらかを含
むライセートを添加した。90分間結合反応を進行させた
のち、HNTGによる洗浄をさらに３回行い、そして試料を
SDSゲル上に流し、免疫ブロッティングに付した。
3.臭化シアン（CNBr）分解 EGFR−Ｃを、４℃で、MnCl2及びATPを用いて、時に
は、〔γ−32P〕ATP（NEN/Dupont、6,000Ci/mmol）の存
在下でリン酸化した。レセプター調製物を、次に、100
μgBSAを含む20mM HEPES、pH7.5中に再懸濁させ、Centr
icon 10（Amicon）中で50μｌに濃縮した。次いで、240
μｌの88％ギ酸を、２粒のCNBrと共に添加し、試料を、
窒素雰囲気下、暗所に、室温で、14時間保存した。試料
をSpeed−Vac（Savant）中で乾燥させ、３回水洗し、次
いで１％Tritonリシス緩衝液中に再懸濁した。
B. 結果 天然型EGFR及び変異EGFRに対するPLC−ガンマの結合
について比較を行った（Fig.9A）。先ず、天然型レセプ
ター及びトランスフェクションされたNIH−3T3細胞から
の変異レセプターを免疫沈澱させ、レセプターの免疫沈
澱のいくつかを、in vitroで、ATP及びMn2+を用いて自
己リン酸化させた（Margolis,B.ら、Mol.Cell.Biol.10:
435−441（1990a））。次に、PLC−ガンマを過大発現す
るNIH−3T3細胞からのライセート（Margolis,B.ら、Sci
ence 248:607−610（1990b））を添加し、結合反応を４
℃で90分間進行させた。免疫沈澱をHNTGで洗浄したの
ち、結合したPLC−ガンマの量を免疫ブロッティングに
よって調べた。
Fig.10に例証されているように、PLC−ガンマはチロ
シンリン酸化天然型レセプターにのみ結合し、非リン酸
化レセプターには結合しなかった。
次に、自己リン酸化の重要性を検証するために、変異
レセプターを用いた２つの研究を行った。最初に調べる
べきことは、Ｃ−末端から126のアミノ酸を欠き（CD12
6、Fig.9A）、かつ、４つの主要な自己リン酸化部位を
欠いた短縮型EGFレセプター（Downward,J.ら、Nature 3
11:483−485（1984））に対するPLC−ガンマの結合であ
った。この短縮型レセプターは、おそらくは、チロシン
992のところで自己リン酸化された（Walton,G.M.ら、J.
Biol.Chem.265:1750−1754（1990））。しかしながら、
このレベルのチロシンの自己リン酸化にもかかわらず、
PLC−ガンマの結合は、完全長レセプターに比べて著し
く減少した。減少した結合は、また、２個の自己リン酸
化部位を含むＣ−末端の63残基を欠く欠失変異EGFレセ
プターであるCD63についても観察された。これらの結果
は、レセプターのＣ−末端が、PLC−ガンマがEGFレセプ
ターに結合したり、あるいは、PLC−ガンマのEGFレセプ
ターへの結合を調節する際に果す役割を示唆している。
Fig.10は、また、PLC−ガンマがkin-変異レセプター
に結合することができないことを示している。この点に
関する自己リン酸化の重要性を精査するために、kin-レ
セプターをCD126レセプター（Honegger,A.M.ら、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 86:925−929（1989））と交差リン酸
化させた。この結果、PLC−ガンマの結合は、天然型レ
ベルまで平準化された。このことは、kin-レセプターの
リン酸化は、PLC−ガンマへの結合を平準化するに充分
であることを示した。
kin-レセプター単独でも、リン酸化ののちには、PLC
−ガンマと結合することができることを確認するため
に、このレセプターを、mAb108には結合しない可溶性
の、バキュロウイルス発現EGFR細胞質ドメイン（EGFR−
Ｃ）と交差リン酸化させた（Fig.9A）。
交差リン酸化は、CD126変異体の場合に比べて強いも
のではなかったけれども、K721A変異体のチロシンのリ
ン酸化及びPLC−ガンマの結合は明らかに検出された。
この知見は、EGFRのチロシンリン酸化がPLC−ガンマの
結合を促進することを確認している。
天然型EGFRとPLC−ガンマ間の相互作用におけるPLC−
ガンマのチロシンリン酸化の役割りを調べた。チロシン
リン酸化PLC−ガンマは、EGFRから、非リン酸化PLC−ガ
ンマよりも容易に解離しうる（Fig.11）が、このこと
は、チロシンリン酸化PLC−ガンマのEGFRに対するアフ
ィニティーが低いことを示している。
これらの知見を、trpE/GAP SH2ドメイン（Fig.9B）
を含む融合タンパク質の、バキュロウイルスによって発
現されたEGFR−Ｃへの結合に関する検討にまで拡げた。
完全長EGFR及びPLC−ガンマの場合のように、trpE/GAP
SH2融合タンパク質ドメインは、チロシンリン酸化EGF
R−Ｃにのみ結合した（Fig.12A）。trpEタンパク質単独
では、EGFR−Ｃに結合しなかった。同様に、リン酸化EG
FR−ＣはtrpE/GAP SH2にのみ結合した。しかしなが
ら、非リン酸化EGFR−Ｃの非特異的結合は高い（Fig.12
B）。これらの結果は、EGFRの結合部位がその細胞内ド
メインに位置することを示している。
一般に、trpE/GAP SH2融合タンパク質は、PLC−ガン
マよりもより高い化学量論で、完全長のEGFRに結合し
た。しかしながら、この融合タンパク質はEGFRによって
チロシンリン酸化がなされなかった。trpE/GAP SH2タ
ンパク質は、CD126欠失変異体（Fig.13A）に比べて、リ
ン酸化完全長レセプターに対し、はるかに良い。Fig.13
Bに示されるように、EGFR−Ｃによるkin-完全長EGFレセ
プターの交差リン酸化によって、それがtrpE/GAP SH2
タンパク質に結合できるようになった。
対照群においては、EGFR−Ｃは、おそらくは、このレ
セプターがすでに最大限にチロシンがリン酸化されてい
るためであろうが、CD126レセプターへの結合能を向上
させないことが示された（Fig.13A）。また、EGFレセプ
ター（Fig.13B）を含まない細胞からのmAb108免疫沈澱
の存在下でEGFR−Ｃを試験したところ、結合は観察され
なかった。このことは、EGFR−Ｃの効果は、セファロー
スに対するチロシンリン酸化EGFR−Ｃの非特異的結合の
せいではあり得ないことを示している。これらの研究
は、結合を仲介する際の自己リン酸化の重要性を確認
し、かつ、EGFレセプター結合については、GAP SH2ド
メインは、そのままのPLC−ガンマに類似した挙動を示
すことを示している。
CD126欠失変異体に対する弱い結合は、分子に対する
結合部位の少なくとも一部分がＣ−末端にあることを示
唆している。レセプターの全体のコンホメーションに対
するこの欠失の効果、おそらくは、アロステリックな効
果を除外することはできなかった。したがって、PLC−
ガンマ及びtrpE/GAP SH2の、EGFRのＣ−末端フラグメ
ントへの結合を調べた。EGFRにおいては、大抵のＣ−末
端メチオニン残基は983位に見出される。したがって、C
NBr分解は、すべての公知のリン酸化部位を含む203アミ
ノ酸のフラグメントを生成する。このタンパク質フラグ
メントは、EGFR Ｃ−末端に特異的な抗体、すなわち抗
−Ｃ（Fig.9A）によって認識される。
このＣ−末端フラグメントを特異的に免疫沈澱に付
し、チロシンをリン酸化すると、それは、PLC−ガンマ
及びtrpE/GAP SH2融合タンパク質に結合した（Figure1
4）。CNBr分解は完全であった。したがって、結合の原
因となりうる完全長のEGFR−Ｃは、タンパク質分解の後
では検出できなかった。繰り返すが、非リン酸化Ｃ−末
端CNBrフラグメントに対する結合は見られなかった。EG
FR−ＣのCNBr分解は、また、抗体Ｆによって同定された
97アミノ酸のＮ−末端ペプチドを生成した（Fig.9A、EG
FR残基645−742）。抗体Ｆによって免疫沈澱されたこの
フラグメントは、trpE/GAP SH2と結合しなかった。さ
らに、EGFR−Ｃを〔γ−32P〕ATPを用いて自己リン酸化
し、32P−標識化CNBr Ｃ−末端フラグメントが生じ
た。Fig.15に示されているように、このフラグメントは
trpE/GAPSH2融合タンパク質に結合したが、trpEには結
合しなかった。総括すると、これらの知見から、チロシ
ンリン酸化Ｃ−末端への直接結合は、少なくとも部分的
には、EGFRへのSH2及びSH3ドメインタンパク質の特異的
結合に寄与していることが示される。
C. 検討 総合して考えると、上記の知見及びいくつかの付加的
な一連の証拠から、ホスホチロシン残基がEGFRのSH2ド
メインに対する実際の結合部位の一部であることが強く
主張される。先ず、P47gag-crkが、ｖ−crk形質転換細
胞中の殆ど全てのホスホチロシン含有タンパク質に結合
することが見出された（Matsuda,M.ら、Science 248:15
37−1539（1990））。第２に、PDGFレセプターにおける
２つの自己リン酸化部位の変異は、GAPの結合を大きく
減少させた（Kazlauskas,A.ら、Science 247:1578−157
1（1990））。最後に、上に示した結果から、EGFRのＣ
−末端に対する特異的結合は、ホスホチロシンが存在す
る場合にのみ示される。したがって、ホスホチロシン残
基は、結合部位の一部を構成するか、あるいは、このド
メインの立体配座を極部的に変化させて、結合を可能に
していることが結論付けられる。ホスホチロシン単独で
結合部位を形成しているとは言えない。例えば、ホスホ
チロシン単独ではP47gag-crkのホスホチロシン−含有タ
ンパク質への結合を干渉することができない（Matsuda
ら、上述）。さらに、PLC−ガンマは、CSF−１レセプタ
ーのようなホスホチロシン残基を含む活性化された全て
の分子に結合するわけではない（Downing,J.R.ら、EMBO
J.８:3345−3350（1989））。同様に、PLC−ガンマのPD
GFRへの結合は、GAP結合と同一であるとは思えない。異
なったSH2とSH3ドメインを含むタンパク質では、結合の
特異性が異なる可能性があるからである（Kazlauskas
ら、上述）。
上記に引用した引例は、特に断りがなくとも、引用に
より全て本明細書中に組み込まれる。
ここまで本発明を充分に記載したけれども、本発明の
精神や範囲を逸脱することなく、また、不当な実験なし
に、広範囲の等価なパラメータ、濃度、条件の内で同じ
ようなことを行うことができるということが当業者によ
って考えられるであろう。
本発明は、具体的な実施態様と関連づけて記載した
が、さらなる修正が可能であることが理解されるであろ
う。本発明は、一般に、本発明の原理に従い、本発明が
係っている技術における公知かつ慣用のプラクティスに
当るような、本明細書の開示からの離脱を含み、かつ、
添付したクレームの範囲に述べた必須の特徴事項に適用
しうる、本発明のいかなる変形、用途、適用をもその範
囲に含むものである。本書において用いた言葉使い、用
語は、記載するためのものであって、限定のためのもの
ではないことを理解すべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 マルゴリス，ベンジャミン・エル アメリカ合衆国、ニューヨーク 10016、 ニューヨーク、アパートメント・エヌ− 17イー、イースト・34番・ストリート 401 (56)参考文献 Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．５，ｐ. 451−458（1990) ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ. ９，Ｎｏ．13 ｐ．4375−4380（1990) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 14/705 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】レセプターチロシンキナーゼの標的であ
    り、かつ、チロシンキナーゼ分子のチロシンがリン酸化
    されたポリペプチド部分に結合することができるタンパ
    ク質の細胞内での発現を検出するための方法であって、
    該方法が、下記： ａ）該細胞、その抽出物、そのライセート又はその上清
    を固相担体と接触させ、該タンパク質の該担体への結合
    を生じさせること、 ｂ）該担体−結合タンパク質を該チロシンがリン酸化さ
    れたポリペプチド部分とインキュベーションし、該ポリ
    ペプチド部分を該担体結合タンパク質へ結合可能にする
    こと、 ｃ）該担体に結合しなかった物質を除去すること、及び ｄ）該担体に結合した該チロシンがリン酸化されたポリ
    ペプチド部分の存在を検出するか又はその量を測定する
    こと、 それによって、該タンパク質の発現を検出すること を含む方法。
  2. 【請求項２】該チロシンキナーゼが、上皮成長因子レセ
    プター、血小板由来成長因子レセプター、繊維芽細胞成
    長因子レセプター、コロニー刺激因子−１レセプター及
    びインスリンレセプターからなる群より選択される、請
    求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】該タンパク質がヒト起源のものである、請
    求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】該リン酸化ポリペプチド部分が、検出可能
    に標識されている、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】該検出可能な標識が、放射線標識である、
    請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】該放射線標識が、32Pである、請求項５に
    記載の方法。
  7. 【請求項７】チロシンキナーゼ分子のチロシンがリン酸
    化されたポリペプチド部分に結合することができるタン
    パク質をコードする遺伝子を、ヒト染色体にマッピング
    するための方法であって、該方法が、下記： ａ）細菌細胞をヒト遺伝子発現ライブラリーで感染させ
    ること、 ｂ）請求項１に記載の方法を用いて該タンパク質を発現
    するクローンを検出すること、 ｃ）該クローンのDNAを配列決定すること、及び ｄ）ヒト染色体に該配列をマッピングすること を含む方法。
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