JPH10502252A

JPH10502252A - Ｄｐ−１及びその他のｄｐタンパク質の阻害剤のアッセイ

Info

Publication number: JPH10502252A
Application number: JP8503745A
Authority: JP
Inventors: サング，ニコラスバリーラ
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-07-03
Publication date: 1998-03-03
Also published as: DK0769144T3; FI965289A; EP0769144A2; NZ288712A; EP0769144B1; FI965289A0; NO965584D0; WO1996001425A2; AU698473B2; WO1996001425A3; US5871901A; AU2803695A; DE769144T1; GB9413327D0; NO317397B1; NO965584L; ATE186119T1; DE69513025T2; CA2193091A1; DE69513025D1

Abstract

(57)【要約】 DP-1/E2F-1転写因子複合体の部分であるDP-1、並びにDP-2及びDP-3は、細胞分裂周期進行の間に制御されるそのリン酸化レベルを有する。この知見により、特にDPのリン酸化状態に影響し得る物質についての、DPタンパク質のリン酸化状態の変化に基づいたアッセイが可能となる。DP-1は、低リン酸化状態のときＤＮＡに対してより高いアフィニティを有することが見出された。DP-1上でリン酸化部位を認識する抗体も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 DP-1及びその他のDPタンパク質の阻害剤のアッセイ本発明は、転写因子DP-1及び細胞分裂周期の制御におけるその役割に基づく。また本発明は、細胞増殖を阻害するDP-1、DP-2及びDP-3阻害剤についての、並びにDPタンパク質のリン酸化状態の調節剤についてのアッセイに関する。細胞の転写因子DRTF1/E2F は、細胞の増殖の重要なレギュレーターによる循環的な相互作用を介して転写装置で細胞分裂周期の事象を統合する。２つの配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質DP-1及びE2F-1は、DP-1/E2F-1ヘテロダイマーにおいて相乗的に相互作用するDRTF1/E2Fの成分である。この出願においては、DP-1が細胞分裂周期の進行の間に存在するＤＮＡ結合活性のすべての形態において存在することから、DP-1が3T3 細胞におけるDRTF1/E2Fの、非常に頻繁にみられ、おそらくは普遍的な成分であることを示す。さらに、リン酸化されているDP-1ポリペプチドは細胞分裂周期の間にリン酸化に依存して移動が変化し、細胞分裂周期の進行の間にリン酸化のレベルが制御されることが示唆されている。この所見は、DP-1のリン酸化状態の変化を検出するためのアッセイにおいて使用することができる。DP-1のC-末端領域はpRbと相互に作用することができ、これはDP-1/E2F- 1ヘテロダイマーとの関連においてpRb 結合の効率に寄付する。DP-1/E2F-1ヘテロダイマーは、アデノウイルスタイプ5 E4 orf 6/7タンパク質と特異的に相互作用し、アデノウイルス感染の間のE4 orf 6/7によるDRTF1/E2Fの制御に似た形態で、２つの適切に配置されたE2F部位に共働的に結合し、それらを介して転写を活性化させるＤＮＡ結合活性を生成する。また、DP-1はよく見られるDRTF1/E2F の細胞分裂周期被制御成分であり、DP-1/E2F-1ヘテロダイマーにおいてはそれが pRb及びE4 orf 6/7タンパク質による認識に機能上重要であるとも結論することができる。遺伝子発現が細胞分裂周期の進行と同調し得るようにするためには、その細胞分裂周期の間に起こる分子事象を転写装置で統合する必要がある。細胞分裂周期の制御は、哺乳動物及び両生類を含む真核生物の成長及び維持の基本となるものである。典型的な細胞が分裂できる（有糸分裂を起こす）ためには、それはその前に質量において２倍になり、その内容物の全てが複製されなければならない。分裂の準備において起こる作業の大部分は、細胞分裂周期の増殖期の間に認識されずに続き、間期と称される。間期は、３つの期間に分けられる。G₁は、前の分裂の完了とＤＮＡ合成の開始の間の合間を示すのに使用される。 G₁の長さは変化し得、細胞は数時間、数日あるいはそれより長い期間静止した状態に保持され得る。そのような静止した状態にある細胞は、G₀相にあると言われることもある。 G₁に続いて、細胞はＤＮＡ合成が起こるＳ期に入る。この後に、２番目の合間、即ちG₂があり、その後にＭ期、即ち有糸分裂が続く。一般に、細胞がＳ期に入ると、有糸分裂に集中される。従って、制御されたあるいは制御されない細胞の増殖についての理解の重要な点は、細胞がG₁からＳ期への遷移を経るメカニズムを理解することである。最近、DRTF1あるいはE2Fと呼ばれる転写因子が同定され、網膜芽細胞腫感受性遺伝子、抗オンコジーンあるいは腫瘍サプレッサー遺伝子のタンパク質生成物、 pRbに結合することが示された（例えばWagner and Green，Nature 352，189-190 , 1991を参照）。細胞転写因子DRTF1/E2Fは、網膜芽細胞腫遺伝子生成物(pRb)、 P107、サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼのような重要な細胞分裂周期制御タンパク質と関連し、さらにその転写活性は、アデノウイルスEla、SV40巨大Ｔ抗原及びヒト乳頭腫ウイルスE7タンパク質のようなある種のウイルスの腫瘍タンパク質によって調節されるので、それは細胞分裂周期制御において鍵となる成分として機能すると広く考えられている。そして細胞の転写因子DRTF1/E2Fは、網膜芽細胞腫腫瘍サプレッサー遺伝子生成物(pRb)、pRb関連タンパク質p107、サイクリンとp33^cdk2のような細胞増殖の重要なレギュレーターとの相互作用を介して、細胞分裂周期の進行をコーディネートすることにおいて中枢的な役割を果たすと広く考えられている(Bandara and La Thangue，1991; Bandaraら.，1991，1992; Chellappan ら，1991; Mudryjら．，1991; Devoto ら，1992）。さらに、DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性は細胞分裂周期の進行の間(Mudryj ら，1991; Shirodkar ら，1992; Schwartzら.，1993)及び分化の間(La Thangue and Rigby，1987)に制御され、これらはその制御配列中に E2F部位を含む遺伝子、例えばデヒドロ葉酸レダクターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ α及びcdc2の転写活性と相関するプロセスである(Meansら，1992; Blake and Az izkhan，1989; Dalton，1992)。またその活性は、DRTF1/E2FからpRb 及び他の関連タンパク質を隔離する、アデノウイルスElaタンパク質、SV40巨大Ｔ抗原及びヒト乳頭腫ウイルスE7タンパク質のようなある種のウイルスの腫瘍タンパク質によって制御され、転写作用に不活性な形態から活性な形態に変える(Hiebertら， 1992; Zamanian and La Thangue，1992，1993)。DRTF1/E2Fの脱制御がこれらの腫瘍タンパク質の形質転換及び不死化機能にとって重要である可能性が高い(Bag chi ら，1991; Bandara and La Thangue，1991; Zamanian and La Thangne，19 92)。 DRTF1/E2Fのもう一つの重要な特徴は、その活性がウイルスタンパク質との直接の相互作用を介して調節されるアデノウイルス感染細胞におけるその制御に関する(Huang and Hearing，1989; Martonら.，1990)。即ち、アデノウイルス感染細胞においては、E2aプロモーターにおける２つのE2F部位の協働的認識のために、アデノウイルスE2aプロモーターへのDRTF1/E2Fの結合は、非感染細胞におけるものより非常に安定している(Hardy and Shenk，1989; Raychaudhuriら，1990) 。この協働現象は、E2F結合部位が、E2aプロモーターに存在する配置のように正確な間隔をあけ、配向されていることを必要とする(Hardy and Shenk，1989)。この効果を発揮するウイルスタンパク質は、E4領域の産物であるorf 6/7タンパク質であり、これは感染細胞においてはDRTF1/E2Fと直接相互に作用する(Huang and Hearing，1989; Martonら，1990)。この相互作用が共働的な認識をもたらすので、orf 6/7のタンパク質の一つの機能はDRTF1/E2Fの２つのＤＮＡ結合ユニットを複合体へ隔離する可能性が高く、これは細胞プロモーターに代えてウイルスプロモーターを認識するのに好適である。しかし、orf 6/7によって認識されるD RTF1/E2F ＤＮＡ結合活性の組成、及びorf 6/7により誘発される転写活性についての共働事象の有意性は、まだ正式には確立されていない。 DRTF1/E2Fを含むタンパク質の同定において進歩があった。E2F-1と呼ばれる、最初に特性化されたものは、直接pRbに結合するその能力により単離された(Heli nら，1992; Kaelinら，1992; Shanら，1992)。これに対してDP-1は、DRTF1のF9 胎児癌(EC)細胞からの生化学的精製によりDRTF1/E2Fの成分として定義された(Gi rlingら，1993)。 DP-1はまた、HeLa細胞DRTF1/E2F(Bandaraら，1993)の成分であって、pRb及びp 107- 関連DRTF1/E2Fの両方に存在する(Girlingら，1993)。E2F-1及びDP-1タンパク質はいずれも類似の小領域を含み(Girlingら，1993)、これによりそれらは互いに相互作用することができ、相乗的な形態でE2F結合部位を介して転写を効率的に認識して活性化するヘテロダイマーDNA 結合活性を生成する(Bandaraら，19 93; Helinら，1993)。DP-1/E2F-1ヘテロダイマーはHela細胞に存在するが(Banda raら，1993)、DP-1タンパク質の分布及び制御は知られていない。本発明においては、DP-1のいくつかの重要な性質の特性化を報告する。3T3細胞においては、DP-1は一般的ではないとしてもよく見られるDRTF1/E2FのＤＮＡ結合成分である。さらにリン酸化されているDP-1は、細胞分裂周期進行の間、リン酸化依存性の移動の変化を示す。DP-1/E2F-1ヘテロダイマーはpRbと効率的に相互に作用し、DP-1のドメインはpRbに結合することができるものとして定義され、おそらくは直接の結合を介してpRb のヘテロダイマーとの相互作用に影響を及ぼす。アデノウイルスorf 6/7 タンパク質は、DP-1/E2F-1ヘテロダイマーに結合し、DRTF1/E2F のアデノウイルス感染細胞形態の生化学的及び機能的特性を有するＤＮＡ結合活性を生成する。このように、DP-1はDRTF1/E2Fのよく見られる成分であり、そのリン酸化レベルは細胞分裂周期の間の調節され、pRb 及びorf 6/7 タンパク質による認識に機能的に重要である。 DP-1をコードしているｃＤＮＡの配列は、本明細書中では配列番号１として示す。DP-1は、国際特許出願公開WO-A-94/10307においてさらに記載されており、この内容は引用により本明細書の一部とする。本発明は特に、DP-1が細胞分裂周期の間にリン酸化され、DP-1は低リン酸化状態においてはＤＮＡに結合するという知見に基づく。言い換えると、DP-1がリン酸化されているときは、リン酸化されていないか低リン酸化状態にある場合のようなＤＮＡに対する高いアフィニティを持たないということである。これはまた、活性がリン酸化によって調節されていると考えられる他のDPタンパク質（例えばDP-2及びDP-3）にもあてはまる。本発明はこの所見を、例えばDP-1の低リン酸化を阻害するか抑制する物質、あるいは、DP-1のようなDPタンパク質のリン酸化を増強する物質のアッセイに使用するものである。そのような物質は、G₁からＳ期へ細胞分裂周期が入るのを防ぎ、あるいは遅らせるために使用することができる。また、細胞分裂周期の間にリン酸化の変化を受けるDP-1の領域に対する抗体をそのようなアッセイに使用し、増殖する細胞を同定することもできる。従って本発明は、第一の形態として、増殖を防止、抑制あるいは増強する可能性がある物質のアッセイを提供するものであり、該アッセイは、 (i)物質を細胞（例えばDP-1あるいは別のDPタンパク質を含んでいる）と接触させ、 (ii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む。本発明はまた、そのようなアッセイから得られる物質を包含する。そのような物質は、自由な細胞増殖を制御する方法で使用することができる。そのような方法は、自由な細胞増殖をしている細胞を有する個体に前記物質の有効な量を与えることを含むものとすることができる。より単純な形態においては、第二の形態の本発明のアッセイは、 (i)低リン酸化状態のDPタンパク質を含む媒体（例えば細胞からの抽出物）を用意し、 (ii)その媒体を物質と接触させ、 (iii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む。このアッセイは、DP-1をリン酸化するキナーゼを活性化し、それによりそのＤＮＡに対するアフィニティを低下させる能力を持つ物質をスクリーニングするために使用することができるる。第三の形態においては本発明のアッセイは、 (i)リン酸化状態のDPタンパク質を含む媒体（例えば細胞からの抽出物）を用意し、 (ii)その媒体を物質と接触させ、 (iii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む。本発明の第四の形態は、可能性があるDPタンパク質リン酸化調節物質のアッセイに関し、該アッセイは、 (i)低リン酸化またはリン酸化状態のDPタンパク質を含む細胞あるいは細胞からの抽出物であってよい媒体及びリン酸化及び／または脱リン酸化酵素（例えばキナーゼあるいはホスファターゼ）を接触させ、 (ii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む。このアッセイは、リン酸化された状態にDP-1を維持するか、あるいはDP-1の低リン酸化を防ぐ能力を持つ物質をスクリーニングするために使用することができる。リン酸化を抑制し得る物質は、キナーゼ（リン酸化剤）アンタゴニストあるいはホスファターゼ（脱リン酸化剤）アゴニストであり得、リン酸化を活性化するか、刺激するか、増強する物質はキナーゼアゴニストあるいはホスファターゼアンタゴニストであり得る。ここで意図される物質は、キナーゼまたはホスファターゼの断片、変異体あるいは相同体を含み得る。キナーゼ及びホスファターゼのソースは、組換えタンパク質、精製タンパク質あるいは細胞抽出物からの生化学的フラクションである。本明細書で使用される「DPタンパク質」は、DP-1が好ましいが、それだけではなく、DP-2及びDP-3及び同じ活性を持っている同じファミリーの他の関連タンパク質も示す。DP-1をタンパク質として選択したが、本発明はDP-1に限定されるものではない（その文脈が別の内容を意味しない限り）。アッセイについての記載において、用語「DP-1」は、配列番号２のアミノ酸配列、その相同体、その断片及びその相同体であって、哺乳類の転写因子として機能することができるものを含み得る。特に、用語「DP1」は、 (a)配列番号２のタンパク質、 (b)その対立遺伝子変異体あるいは相同種、 (c)(a)に少くとも70% 相同なタンパク質、 (d)E2F-1、E2F-2、E2F-3、E2F-4あるいはE2F-5と複合体を形成することができる (a)〜(c)のいずれかの断片、あるいは、 (e)少くとも15アミノ酸の(a)〜(c)のいずれかの断片、を含み得る。これらのタンパク質は、低リン酸化形態にあってもよく、部分的あるいは完全にリン酸化された形態にあってもよい。またそのようなポリペプチドの標識された形態も含まれる(8ページを参照)。その文脈において特に別のものを意味するものではないかぎり、以下この定義の範囲内のすべてのポリペプチドはDP-1と称する。用語「DP-2」及び「DP-3」も同様に解されるべきもので、もちろん(a)の部分がそれぞれアミノ酸配列DP-2及びDP-3を示すように訂正されたものである。対立遺伝子変異体は、マウス動物において天然に存在する変異体であり、例えばDP-1についての配列番号２のように、天然タンパク質のタンパク質と実質的に同様の形態で遺伝子発現を調節するように機能する。同様に、相同種は、ヒトを含む別の種に存在する等価のタンパク質であり、その種においてマウスにおける DPタンパク質(DP-1、配列番号２の配列)と等価の機能を果たす。任意の一つの種内で相同体はいくつかの対立遺伝子変異体として存在し得、これらはすべてタンパク質(例えばDP-1についての配列番号2)の相同体であると考えられる。対立遺伝子変異体及び種相同体は、例えばDP-1についての配列番号２のようなポリペプチドの製造のために本明細書中に記載された手順に従い、適当な細胞ソース、例えば対立遺伝子変異体を有する齧歯動物あるいは別の種からのソースについてそのような手順を実行することによって得られる。そのポリペプチドは発生の過程で保存されているようであることから、例えばDP-1ヌクレオチド配列を使用して齧歯動物細胞あるいは他の細胞から製造されたライブラリーをプロービングし、対立遺伝子あるいは種変異体をコードしているクローンを得ることも可能である。そのクローンを従来の技術によって操作して本発明のポリペプチドを同定し、そしてそれをそれ自体公知の組換えまたは合成法により生成することができる。好ましい種相同体は、哺乳動物または両生類の種相同体を含む。配列(例えば配列番号2)に少くとも70 %相同なタンパク質は、少くとも20、好ましくは少くとも30、たとえば少くとも40、60または100 以上の連続するアミノ酸の領域にわたって、タンパク質(例えば配列番号2)に好ましくは少なくとも80 あるいは90 %、より好ましくは少くとも95 %相同である。タンパク質の相同性を測定する方法は当分野で公知であり、本明細書において相同性はアミノ酸の同一性に基づいて計算される（「確実な相同性」と呼ばれることもある）ことは当業者に理解されるであろう。一般に、E2Fタンパク質E2F-1〜E2F-5 の一つと複合体を形成することができる DPタンパク質(例えばDP-1についての配列番号2)またはその対立遺伝子変異体または種相同体の断片は、少くとも10、好ましくは少くとも15、例えば少くとも20 、25、30、40、50または60アミノ酸長である。 E2Fタンパク質とDPタンパク質が交差活性化転写因子（適用できるならば）を通常形成する条件下にE2Fタンパク質及び断片を置き、複合体が形成されるかどうかを判定することにより、断片がE2Fタンパク質と複合体を形成するかどうかを判定できる。その判定は、例えばその複合体のE2F結合部位に結合する能力をi n vitroで測定することによって行うことができ、あるいはSDS-PAGEのような方法により推定の複合体の分子量を測定することにより行うことがきる。好ましい断片は、E2F-1またはその関連するファミリーのメンバーと交差活性化複合体を形成することができるものを含む。例えば、その断片を、DPタンパク質/E2F-1複合体によって活性化されるように適応させられたリポーター遺伝子構築物の存在下でE2F-1に加えることができる。そのような実験により、その断片が必要な活性を持つかどうかが判定される。 DPタンパク質は、検出用標識で標識することができる。検出用標識はそのポリペプチドを検出するのを可能とする任意の標識とすることができる。適当な標識としてはラジオアイソトープ、例えば¹²⁵I、酵素、抗体、ビオチンのようなリンカー等がある。また、DPタンパク質（任意に標識された）は、例えば免疫アッセイディッシュの壁のような固相に固定されていてもよい。次に、低リン酸化あるいはリン酸化が抑制されるか増強されるかどうかを判定する物質の存在下で、細胞抽出物をそのディッシュかその他の固相環境に加えることができる。本発明の最初の形態においては、その物質を接触させる細胞は、DPタンパク質が発現された任意の細胞とすることができる。これは、哺乳動物（ヒト、霊長類及び齧歯動物を含む）細胞及び両生類細胞（アフリカツメガエル細胞を含む）を含む。その細胞は、in vitro培養中で維持される細胞であってもよい。アッセイの実施においては、細胞は静止状態（例えばG₀）に維持することができる。これは無血清培地中で増殖している細胞により得られる。これを行うための方法は当分野で周知であり、適当な培地が市販品として入手可能である。これは、同調培養において維持される細胞の集団についてアッセイを実施し、細胞分裂周期の任意の特定の時点でDPタンパク質のリン酸化状態に影響を及ぼすことについての物質の効果が測定することができるので望ましい。その細胞は、一次細胞、形質転換細胞あるいは腫瘍細胞とすることができる。 DPタンパク質は、その細胞の天然タンパク質であってもよく、組換えＤＮＡ構築物によってその細胞内で発現されてもよい。その発現は、細胞質因子からの一時的なものでもよく、あるいはその細胞においては安定に一体化された組換えＤＮＡからのものでもよい。構築物は、宿主細胞に適合するプロモーターに作用可能なように結合したDPタンパク質をコードするＤＮＡを含み得る。そのような構築物は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual，1989)において開示されたような従来の組換えＤＮＡ技術を使用して製造することができる。本発明のすべての形態において、DPタンパク質のリン酸化状態は、当業者に利用できる任意の適当な技術によって測定することができる。例えば、SDS/ポリアクリルアミドゲルの上のDPタンパク質の移動は、そのリン酸化状態に依存している。DP-1はそのようなゲル上で約55,000のみかけ分子量を有する。しかしそれは「p55U」（上）と「p55L」（下）と呼ばれる２つの形態で現れる。それらの形態は、そのリン酸化の程度において異なっており、p55Uはp5 5Lよりも高いレベルを有する。他の細胞タイプにおいては、55kdタンパク質が、やはりリン酸化の相違による他の形態で現れることがありえる。このように、本発明のアッセイを受けた細胞からの抽出物の電気泳動とその後の免疫ブロッティングを使用して、試料中のp55L及びp55Uの相対量、従ってDP-1のリン酸化状態を測定することができる。また、DPタンパク質（例えばDP-1）は、その細胞内において自然のプロセスによりDP-1に結合し得る標識されたリン酸基を含む媒体中で、アッセイの前に増殖する細胞によりアッセイすることができる。次いで物質の存在下あるいは不存在下において標識されたDP-1の量を測定でき、例えば、抗DP-1抗体を使用してDP-1 を免疫沈降させ、次に沈澱させられた標識の量を測定して測定することができる。DP-1抗体は、WO-A-94/10307を参照して得ることができる。 DPタンパク質を分析する別の方法は、E2F-1(あるいは、E2Fファミリーの別のメンバー)と複合体を形成するその能力を測定し、任意に転写を活性化する複合体の能力を測定することである。これはWO-A-94/10307に記載された技術によって行うことができる。本発明の一つの態様においては、候補となる物質を、リン酸化されたDPタンパク質の断片（そのような断片に対応する合成あるいは組換えペプチドを含む断片をいう）を使用して分析することができる。この態様においては、リン酸化された断片の存在下で細胞またはその抽出物を物質と接触させ、生成した断片の脱リン酸化の量を測定することができる。例えばDP-1の断片は、好ましくはDP-1のC-末端領域に由来する。例えば、それは配列番号２の最後の100 アミノ酸(例えば90、80、60、50、40あるいは30)の範囲内の連続する配列に由来する20〜50のアミノ酸（例えば25、30あるいは40アミノ酸）の断片を含み得る。好ましい断片はこの配列のアミノ酸385〜400まで、及びこの領域を含む（あるいは囲む）ペプチド、例えば375〜410 、375〜405、375 〜400、380〜410、380〜405、380〜400も望ましい。配列番号２の残基385-400に対応する合成ペプチド(D)に対して生成されたモノクローナル抗体（抗DP-1(D)）は、DP-1をその低リン酸化状態で認識する（この合成ペプチドがリン酸化されていないことによる）が、リン酸化された場合はDP -1にそれほどうまく結合しないことが見出された。これは、DP-1の低リン酸化がそのタンパク質のこの領域の少なくとも部分において起こることを示している。従ってDP-1断片を使用するアッセイにおいては、その断片は適当なリン酸化部位、例えば388Thrまたは391Serでリン酸化され得る。リン酸化は、適当なキナーゼ酵素を使用して酵素的に行うか、化学的に行い得る。リン酸化のための方法は当分野において知られている。 DPタンパク質またはその断片は、例えば放射標識により標識されたリン酸基によりリン酸化することができる。その後物質の存在下で起こる脱リン酸化の量を適当な技術によって測定することができる。例えば、DPタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルあるいはHPLCカラムのような適当なマトリックス上でのサイズ分離で細胞または抽出物の混合物から回収することができ、標識されたDPタンパク質の量を測定する。依然として標識されているDP-1の量を、物質を使用していない対照と比較することができる。媒体中の遊離の標識リン酸の量を測定することもできる。DPタンパク質の低リン酸化を防止する活性を有する物質は、DP-1タンパク質から放出される遊離のリン酸の量を減らす。前記の標識は、DPタンパク質に融合したタンパク質(例えばGST)の形態とし（融合タンパク質を形成する）、DPの精製及び／または検出において役立つようにすることができる。また、DP-1、DP-2あるいはDP-3のリン酸化状態は、リン酸化されたものではなく、リン酸化されていない形態を認識する抗体を使用して測定してもよい。先に記載したように、低リン酸化状態のDP-1を認識する、配列番号２の残基385-400 に対応する合成ペプチド（以下ペプチドD と称する）に対する抗体を生成した。そのような抗体は、ハイブリドーマの製造のための標準的な技術を使用して製造でき、まず最初に標識されたDP-1と候補の物質を細胞またはその抽出物に加え、得られた混合物をインキュベートし（いずれにおいても典型的には0.5〜60分、例えば1〜30または5〜15分、10〜40℃の間、例えば約20、25、30あるいは37℃で）、抗体を混合物に加えて生成したDP-1の脱リン酸化の量を測定することにより、本発明のアッセイに使用することができる。抗体は、DP-1の当初量に対してモル過剰で加え、生成されたすべての標識されていないDP-1を結合するようにしなければならない。あるいは、DPタンパク質をDPタンパク質をリン酸化するキナーゼが存在する活性を含んでいる抽出物の存在下で分析する場合、その抗体を同様な方法で使用してリン酸化の量を測定することができる。可能性がある活性、毒性あるいは溶解性のレベルのような因子に依存して、アッセイにおいて使用できる物質の量は広範囲に変化し得る。細胞またはその抽出物に接触させる場合、物質の典型的な濃度は約1 nM〜100 mM、例えば10 nM から 10 mMである。アッセイをDPタンパク質の断片を使用して行う場合、断片の量は、約1 nM〜10 0 mM、例えば10 nM〜10 mMの範囲である。適当な候補の物質は、C-末端断片を含むDP-1（合成あるいは組換え手段によって生成されるかどうかに関係なく）のペプチド断片を含む。そのような断片は、上記したC-末端断片を含む。アッセイにおいて活性を持つ物質については、分子モデルリングあるいはペプチドスキャンニングのような方法によって高い活性の物質を生成するように洗練し開発することができる。その他の物質としては、DPタンパク質のリン酸化状態を変えることができる酵素の活性に作用することができるか、影響を及ぼすことができるものを含む。意図される酵素としてはキナーゼ（リン酸化する）及びホスファターゼ（脱リン酸化する）がある。従って、候補となる物質はキナーゼ及び／またはホスファターゼのアゴニストかアンタゴニストであり得、DPタンパク質リン酸化を調節することができるものとし得る。本発明において使用するための細胞の抽出物は、上記の細胞のタイプからの抽出物であることが適当であり、好ましくは同調培養中の細胞から得たもので、従って例えばG₁あるいはS のような細胞サイクルの明確な段階のものである。これには、DPタンパク質をコードしている組換えＤＮＡで形質転換されたかトランスフェクトされた細胞が含まれる。抽出物は、放射性リン酸で標識された細胞から得ることができ、DP-1のリン酸化状態は本発明の最初の形態に記載した方法により測定することができる。細胞タンパク質の適当な抽出物を製造する方法は当分野において周知である。本発明の第五の形態によれば、配列番号２のC-末端領域に対応するペプチドを免疫原として使用して得られるモノクローナル抗体が提供され、この抗体はその低リン酸化状態においてDPタンパク質を認識するが、リン酸化されている場合にはそのようにうまくDPタンパク質に結合しない。これは、DP-1の低リン酸化がそのタンパク質のこの領域の少なくとも部分において起こることを示している。このように企図される抗体は、低リン酸化DP（即ちリン酸基を持たない）に結合するが、リン酸化された形態にはしないものである。 DP-1のC-末端領域は、好ましくは配列番号２の最後の100 アミノ酸(例えば90 、 80、60、50、40あるいは30アミノ酸)の範囲内の連続する配列に由来する20〜50 のアミノ酸（例えば25、30あるいは40アミノ酸）の断片である。好ましい断片はこの配列のアミノ酸385〜400、及びこの領域を含むあるいは囲むペプチド、例えば375〜410 、375〜405、375〜400、380〜410、380〜405、380 〜400も好ましい。配列385〜400を免疫原(ペプチドD)として使用すると、モノクローナル抗体、抗DP-1(D)が得られる。この製造は後に記載する。第五の形態は、リン酸化部位を含む免疫原に対して特異的な、即ちそれを使用して生成された抗体も包含し、そのような抗体はリン酸化部位を含むDPタンパク質の部分に結合し得る。特に、DP-1の配列385-400を、これがリン酸化部位Thr³⁸ ⁸ 及びSer³⁹¹を含むことから（図９を参照）、本明細書で取り上げる。このモノクローナル抗体は、適当な哺乳動物ソース、例えばマウスあるいはラットに由来するものとし得る。本発明においては、用語「抗体」は、そうではないものと記載しない限り、腫瘍ターゲット抗原に対する結合活性を保持する全抗体の断片を含む。そのような断片は、Fv、F(ab')及びF(ab')₂断片並びに単鎖抗体を含む。さらに、そのような抗体及びその断片は、例えばEP-A-0239400に記載されるようなヒト化抗体であってもよい。この抗体は慣用のハイブリドーマ技術によって製造でき、あるいは修飾された抗体または断片の場合は、組換えＤＮＡ技術、例えばプロモーターに機能しうるよう連結した、改変された抗体またはその断片をコードしているDNA構築物の適当な宿主ベクターにおける発現によって生成することができる。適当な宿主細胞には、細菌(例えばE．coli)、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞が含まれる。本発明のアッセイがDPタンパク質をコードしている細胞に導入されたベクターを使用する場合、DPをコードしているヌクレオチド配列は、例えば配列番号１あるいは配列番号１の相補物に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチドの連続配列を含んでもよい。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むものとすることができる。配列番号１のＤＮＡに選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列は、少くとも20、好ましくは少くとも30、例えば40、60、100あるいはそれ以上の連続するヌクレオチドの領域にわたって上記配列番号１のＤＮＡと一般に少くとも70 %、好ましくは少なくとも80あるいは90% 、より好ましくは少くとも 95% 相同である。ヌクレオチド配列はまた、配列番号２のタンパク質またはその断片をコードする配列を含むことができる。ＤＮＡヌクレオチド配列のようなヌクレオチド配列は、組換え法により、合成により、あるいは当業者に利用可能な任意の手段により製造することができる。 WO-A-94/10307において開示された技術によりクローン化してもよい。 DPタンパク質のリン酸化を刺激するか低リン酸化の進行を抑制すると確認された物質は、医薬組成物として提供できる。そのような組成物は、薬学的に許容される担体あるいは希釈剤と共にその物質を含む。薬学的に許容される担体または希釈剤としては、経口、経直腸、経鼻、局所（口内及び舌下を含む）、経膣あるいは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下、硬膜外を含む）投与に適当な組成物において使用されるものを含む。組成物は投与単位形態にするのが好適であり、調剤の分野において周知の方法の任意のものにより製造することができる。そのような方法は、一以上の修飾成分を含む担体を活性成分と合わせる段階を含む。一般に、液体の担体あるいは細かく粉砕された固体担体、またはその両方を活性成分と均一に緊密に混合し、必要により生成物を成形することにより組成物を製造する。例えば、非経口投与に適当な組成物としては、抗酸化剤、バッファー、静菌剤及びその組成物を意図された受容個体の血液と等張にする溶質を含み得る、水性及び非水性の殺菌注射溶液、懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性殺菌懸濁液、及び前記ポリペプチドを血液成分あるいは一以上の器官に向かわせるように設計されたリポソーム及びその他のマイクロカプセル系等がある。本発明により同定された物質、及び上記のようなその組成物は、ヒトを含む哺乳類において、増殖性疾患を含む症状の治療、制御あるいは診断のために使用することができる。そのような症状としては、E2F 因子(Helinらによりクローン化された)のような一以上の転写因子、あるいは配列番号２のタンパク質、E2F-1タンパク質、あるいは関連するファミリーのメンバーの非正常（例えば異常に高いか低いレベル）及び／または異常（例えば遺伝子配列における突然変異による）な発現に関連するものを含む。また、遺伝子産物が配列番号２のタンパク質によって調節される遺伝子の異常な発現によって引き起こされるものもそのような症状に含まれる。上記の物質及び組成物による症状の治療あるいは制御には、通常、そのような治療の必要性がある受容個体に、ポリペプチド、抗体、その断片あるいは組成物の有効な量を投与することを含む。一つのグループの好ましい物質は、配列番号２のアミノ酸160-220の領域に基づくポリペプチドである。前記タンパク質のこの領域は、Helin ら（上出）によって記載されたE2F-1タンパク質の同様な領域に約40 %の相同性を有し、いずれの領域もα-ヘリックス領域と推定される。特定の理論により拘束されることを望むものではないが、DP-1及びE2Fのヘテロダイマー化はこれらの相同領域により媒介されていると思われる。本発明の第六の形態は、リン酸化部位（これは所望によりリン酸化されていてもよく、あるいはリン酸化されていなくてもよい）を含むDPタンパク質の断片に関する。好ましい部位はDP-1に見られるThr³⁸⁸及びSer³⁹¹を含む。好ましい断片は上記に既に挙げた（12及び13頁を参照）。以下の実施例及び添付の図面により、例示としてさらに本発明を説明する。これらは本発明を説明するためのものであり、限定的なものと解してはならない。図面は以下の通りである。図１は、DP-1の特性化を示す。抗DP-1(A)を、相同ペプチドA（トラック１）あるいは対照ペプチド１の存在下で免疫ブロットによってF9 EC細胞抽出物に対する反応性について分析した（トラック１及び２）。p55が示されるが、p55Lは認識可能である程度であり、p55U が優勢なポリペプチドである。＊は、P65 を示す（本文参照）。精製されたDRTF 1/E2F ＤＮＡ結合活性を含む種々のフラクションにおけるp55の存在をトラック４、５及び６に示す（比較のためにF9 EC細胞抽出物中のp55及びp65をトラック３に示す）。DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性は以前に記載されたようにして精製した (Girlingら，1993)。p55の存在がDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性とと相関する点に注目されたい。図２は、3T3細胞におけるDP-1の細胞分裂周期制御を示す。 a)DP-1は、細胞分裂周期進行の間に頻繁に見られるDRTF1/E2FのＤＮＡ結合成分である。 3T3細胞を血清飢餓状態とした後に刺激し、その細胞分裂周期を進行させた。培養は４時間毎に回収し、抽出し、DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性についてアッセイした（約８μｇ）（トラック２〜17）。平行した培養において、Ｓ期への進行は BrdUの取込みを使用して分析し、サイクル中の細胞の大多数が８〜12時間の間にＳ期に入ることが示された。DRTF1/E2F ＤＮＡ結合複合体におけるDP-1のの存在を、対照（ペプチド１；トラック10〜17）あるいは相同（ペプチドＡ；トラック２〜９）ペプチドの存在下において、抗DP-1(A)（トラック２〜17）の効果を調べることにより試験した。抗DP-1は、検出可能なDRTF1/E2F ＤＮＡ結合複合体の大部分と反応した。 b)3T3細胞分裂周期の間のDRTF1/E2F 中のサイクリンA a)においてアッセイした同調3T3細胞抽出物を、ウサギポリクローナル抗サイクリンA を使用してDRTF1/E2F中のサイクリンA の存在を試験し（下の区画）、予備免疫化対照血清（上の区画）と比較した。この抗サイクリンAの効果は、DRT Fla（最も遅い移動）複合体のより速い移動を起こすことである。例えば、０〜下では見られなかった（上及び下の区画のトラック１、２及び３の比較による）。 c)3T3 細胞分裂周期の間のDRTF1/E2F 中のp107 DRTF1/E2F におけるp107の存在について、p107モノクローナル抗体上清（下の区画）を使用して同調3T3細胞抽出物を調べ、無関係の対照モノクローナル抗体 d)DP-1は、DRTF1/E2Fの細胞分裂周期被制御ＤＮＡ結合成分である。同調3T3細胞抽出物を、抗DP-1(A)で免疫ブロットした。各微量抽出物の約40μ g を分析した。p55U（上）とp55L（下）と称するDP-1 p55の２つの形態が分離されたことに注目されたい。p55Lは血清刺激の８〜12時間後に顕著になり、従って DRTF1/E2F の転写活性形態、DRTF1b/cの誘導と相関していた((a)におけるトラック4及び5)。交差反応p65ポリペプチドを* によって示す。 e)F9 EC細胞の分化の間のDP-1の制御抗DP-1(A)を、F9 EC(トラック1)または分化F9 PE(分化誘導の７日後、トラック2)細胞から調製した抽出物に対する反応性について免疫ブロットにより分析した。p55の２つの形態(UとL)が検出可能であり、いずれも分化プロセスの間に下方制御されたことに注目されたい。交差反応ポリペプチド(*)は変化しないままである。図３は、DP-1がリン酸化されたタンパク質であることを示す。 a)抗DP-1(D)の特性化：抗DP-1(D)を、相同ペプチド、D(トラック２)あるいは無関係なペプチド、1(トラック3)の存在下において、DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性に対する効果について調べた(トラック2及び3)。抗DP-1(D)がDRTF1/E2Fと反応した点に注目されたい(トラック3)。抗DP-1(D)のGST-DP-1融合タンパク質との反応性を、無関係なペプチド、１（トラック４）または相同ペプチド、D(トラック5)の存在下において調べた。 b)抗DP-1による免疫沈降：³²P オルトリン酸代謝放射標識細胞溶解物からの免疫沈降を、相同ペプチド、A(トラック1)または無関係なペプチド、1(トラック2)の存在下に、抗DP-1(A)(トラック1及び2)で行った。ペプチド1(トラック２)の存在下において行った免疫沈降物からポリペプチドが放出され、抗DP-1(D)により(トラック3及び4)、相同ペプチド、Ｄ（トラック３）または無関係なペプチド、1( トラック4)のいずれかの存在下で再免疫沈降させた。DP-1(p55)とp70を示す。平行して、最初の免疫沈降において抗DP-1(A)によりDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性を試験し（トラック５及び６）、再免疫沈降後に示した競合ペプチドの存在下において抗DP-1(D)でDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性を試験した（トラック７及び８）。二番目の免疫沈降において無関係なペプチド１またはペプチドD(それぞれトラック９及び10)の存在下に抗DP-1(D)で分離したポリペプチドを、F9 EC細胞抽出物を使用して抗DP-1(A)で免疫ブロットすることにより定義されたもの（トラック1 1）と比較した。免疫沈降したp70のサイズは、抗DP-1(A)で定義された交差反応ポリペプチドよりもかなり大きい（トラック10を11の比較による。交差反応ポリペプチドは●により示す）。標準の分子量をトラック12に示す。トラック１、２、３及び４は、一つのポリアクリルアミドゲルを露出することにより得られ（トラック１及び２はより短い露出である）、トラック９、10、11及び 12は同じポリアクリルアミドゲルに由来することに注意されたい。 c)3T3細胞抽出物のホスファターゼ処理：免疫ブロッティングを、ホスファターゼで処理した（トラック２）あるいは処理していない（トラック１）3T3細胞抽出物を使用して抗DP-1(A)で行った(33 頁参照)。対照処理（トラック２）においては、p55U及びp55Lはいずれも非特異的ポリペプチド(*)と共に分離される。ホスファターゼによる処理の後(トラック1)、p55Lはより明確でなくなる。図４は、DP-1のpRb との相互作用を示す。 a)野性型（WT）DP-1（約10ng；トラック３及び９）または種々の突然変異DP-1タンパク質（約10ng；トラック４〜７及び10〜13）を、E2F-1(約5 ng)とのヘテロダイマーとして、E2F部位ＤＮＡ結合活性及び野性型GSTpRb^379-928（約5 ng；トラック２〜７）またはGST-Δ22（約5 ng；トラック８〜13）と相互作用する能力について分析した。Rb-DP1/E2F-1複合体を示す。E2F-1単独の活性は、トラック２と８に、プローブ単独の場合はトラック１に示す。DP-1Δ211/E2F-1 ヘテロダイマーとのGST-pRb の相互作用は、野生型のDP-1/E2F-1複合体よりも低かった点に注意されたい。DP-1タンパク質の番号はC-末端残基の位置を示し、Δ73-340は、N-及びC-末端領域からのタンパク質配列を欠いている。 b)示したタンパク質、DP-1（トラック１〜５及び12）、E2F-1（トラック６〜８）、Ela（トラック９〜11及び13〜15）及びCREBP1（トラック16〜19）をin vitr oで転写し、GSTタンパク質（トラック２及び19）、GST-pRb(トラック３、６、９、13及び18)、GST-C→F(706)（トラック４、７、10、14及び17）、GST-Δ22(トラック５、８、11、15及び16)、GST-E2F-1(トラック12)またはセファロースビーズ単独(トラック1)に対する結合活性を調べた。in vitro翻訳されたCREBP1はトラック20に示す。トラック13、14及び15はトラック10、11と12の照射を低下させたものを示す。 c)示したDP-1タンパク質(WT、Δ341 、Δ327 、Δ73-340及びΔ211)をin vitro 転写及び翻訳して、GST-pRb(トラック１〜５)またはGST タンパク質単独（トラック６〜10）のいずれかに対する結合活性について試験した。この実験において使用したin vitro翻訳されたΔ211 ポリペプチドはトラック11に示す。GST-pR b と相互作用するΔ211 の能力が低下していることに注意されたい。b)及びc)においては、約２μg のGSTまたはGST-融合タンパク質を翻訳されたポリペプチドを含む網状赤血球溶解物と混合した。すべてのポリペプチドは、ほぼ等しい効率で翻訳された。(c)で示した区画は、同じ実験の、同じ時間露出されたオートラジオグラフに由来した。図５は、アデノウイルスタイプ5 orf 6/7タンパク質がDP-1/E2F-1ヘテロダイマーに結合することを示す。 in vitro翻訳されたDP-1またはE2F-1タンパク質のＤＮＡ結合活性を、単独で( DP-1についてトラック３及び７、E2F-1についてトラック4及び8)、または一緒に（トラック５及び９〜１７）、精製したorf 6/7 融合タンパク質の存在下で試験した（トラック６〜13）。その溶解物の活性はトラック２及び６において調べた。抗DP-1（トラック11及び15）、抗E2F-1(トラック12及び16)、抗orf 6/7タンパク質（トラック13及び17）あるいは対照抗体（c;トラック10及び14）を結合反応に含め、DP1/E2F-1ヘテロダイマーに各タンパク質を存在させた。DP-1及びE2F-1 をウサギ網状赤血球抽出物におけるin vitro翻訳後に与え、アデノウイルスE2a プロモーター(-96から+68)上でアッセイを行った。orf 6/7の二重部位複合体を、トラック９において* によって示す。図６は、orf 6/7タンパク質が、DP-1/E2F-1ヘテロダイマーによってプロモーター依存形態で生起された転写を調節することを示す。 a)構築物の概要：pDP-1 、pE2F-1及びpE4 orf 6/7は完全長タンパク質を発現し、p3xWTはタンデムに組み込まれた3つのE2F部位を含む(Zamanian and La Thangu e, 1992)。矢印は、E2F部位の配置を示す。 b)キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)SL2細胞を、p3xWT及び示した発現ベクターでトランスフェクトした。以前に観察されたように、DP-1及び E2F-1はE2F部位依存性転写活性化において相乗的に相互作用し（トラック７）、 orf 6/7タンパク質の存在は転写活性に有意な影響を及ぼさなかった(トラック８ )。図７は、orf 6/7タンパク質がアデノウイルスE2aプロモーターと関連してDP-1 /E2F-1ヘテロダイマーによって生起された転写を活性化することを示す。 a)構築物の概要：pDP-1、pE2F-1及びpE4 orf 6/7は完全長タンパク質を発現し、 pE2aはAd5 野性型 E2aプロモーター配列(-96〜+68)を含む。矢印は、E2F部位の配置を示す。 b)及びc)キイロショウジョウバエSL2細胞をpE2a及び示した発現ベクターでトランスフェクトした。DP-1/E2F-1ヘテロダイマーとともにorf 6/7タンパク質が存在すると、pE2aの活性が増強された（レーン７と８の比較による）。すべての値は、便宜的に1.0の値としたpE2a単独に対する相対値で表し、少くとも３つの別々の実験を代表するものとした。図８は、3T3細胞における細胞分裂周期進行の間のDRTF1/E2Fの組成と制御を表すモデルを示す。細胞分裂周期の進行の間、pRb及びp177（図表においてppで示す）のようなタンパク質が結合して、明確なDP-1/E2Fヘテロダイマーの活性を調節し（E2FはE2F -1またはDP-1とヘテロダイマー化することができる別のタンパク質であり得る。異なる影により示す。）、ppの特性はE2F成分によって示される。この実験において示された結果に基づくと、DP-1は細胞分裂周期進行の間に改変されることがあり得た。図９は、モノクローナル抗体で低リン酸化ペプチドDを認識するELISAアッセイの結果を示す棒グラフである。mAB はDP-1の、低リン酸化状態の形態に結合し、リン酸化されたものにはしない。実施例ＤＰ−１の免疫化学的特徴付けＤＰ−１は、F9 ECおよびHeLa細胞抽出物中に存在するDRTF1/E2FのＤＮＡ結合成分である。これは、これら抽出物中に分解されたE2F部位特異的ＤＮＡ結合複合体が抗ＤＰ−１抗体と反応する(Bandaraら，1993; Girlingら，1993)という事実に基づく結論である。DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性における変化がＤＰ−１タンパク質の特性に反映されるかどうかを確認し、したがってDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性が調節される２つの状況、すなわち F9 EC細胞の分化の間(La ThangueおよびRigby，1987)および細胞周期の進行中(Mudryjら，1991; Shirodkarら，1992) におけるＤＰ−１の特徴付けを選択することが決意された。このため、N-末端ペプチド抗ＤＰ−１(A)に対して産生された抗ＤＰ−１血清を使用した。この血清はペプチドアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、細胞抽出物を釣り上げるのに用いた。F9 EC細胞抽出物中に分子量が65,000 および55,000である２つの別個のポリペプチド（それぞれｐ６５およびｐ５５として言及されている）が示され、これらは２つとも抗ＤＰ−１によって特異的に認識された。なぜなら、相同的ではあるが非関連ではないペプチドが抗体反応に含まれた場合、これらのポリペプチドは存在しなかったからである（図１、トラック１と２を比較されたい）。F9 EC細胞抽出物中で、ｐ５５は相接して泳動するダブレット（図１、トラック２にのみ見える）として分解されており、これは３Ｔ３細胞（後出）等の他のタイプの細胞から調製される抽出物において特に明らかな特徴であった。これら２つの形態のｐ５５は、以下ｐ５５Ｕおよびｐ５５Ｌと称する。F9 EC細胞抽出物中に、ｐ５５Ｕは通常ｐ５５Ｌよりもはるかに大量に存在した。ｐ５５はＤＰ−１遺伝子の産物であると考えられる。なぜなら、ｐ５５はＤＰ −１タンパク質の他の領域（例えば図３ｂ参照）から誘導されたペプチドに対して産生された幾つかの抗ＤＰ−１抗血清によって認識されるからである。他方、ｐ６５は抗ペプチドＡによってのみ明示され、ｐ６５が交差反応性ポリペプチドであることを示唆した。ｐ５５がDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性と相互関連していることを立証する、ここに提示する結論は、ｐ５５はＤＰ−１遺伝子の産物であるという考えと一致する。なぜなら、ＤＰ−１ｍＲＮＡをin vitroで翻訳して誘導される主要なポリペプチドは分子量が約55,000であるという事実があるからである（図４ｂ参照）。さらに、DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性のアフィニティー精製から誘導されるクロマトグラフィー画分を釣り上げるのに抗ＤＰ−１を用いた場合、ｐ６５ではなくｐ５５がＥ２Ｆ部位ＤＮＡ結合活性と相互関連していた（図１、トラック３、４、５および６参照）。したがって、ｐ５５はＤＰ−１タンパク質であるように思われる。ＤＰ−１は細胞周期および分化によって調節される。細胞周期によるＤＰ−１の調節を調べるために選択された系は、血清を枯渇させた３Ｔ３細胞の刺激後の細胞周期の進行であった。この細胞系では、DRTF1/E2 F ＤＮＡ結合活性は細胞周期に依存する一連の変化を受ける。例えば、血清枯渇（Ｇ０）細胞中では、DRTF1a(複合化DRTF1/E2F)がＤＮＡ結合活性の主要な種であった（図２ａ、トラック２参照）。しかし、血清刺激後、そして一旦細胞周期が進行すると、DRTF1b/c（DRTF1/E2Fの転写的に活性な形態）がＧ１の終りに増加し、Ｓ期において最大レベルに達した（刺激後１２時間；図２ａ、トラック５参照）。DRTF1a複合体の移動度における変化もまた細胞周期の進行中に起こった。例えば、刺激後０から４時間の間に、DRTF1aのよりゆっくり泳動する形態が見えてきた（図２ａ、トラック２と３を比較されたい）。これは残りの周期を通じて持続し、その出現はDRTF1aにおけるサイクリンＡの存在に相互関連していた。なぜなら、結合反応への抗サイクリンＡの添加は、このゆっくり泳動する複合体の出現を妨げたからである（図２ｂ、DRTF1aの移動度をトラック１と２の間で、上部パネルおよび下部パネルについて比較されたい；矢印で示されている）。他方、Ｒｂ関連タンパク質p107を含有するDRTF1a複合体は、細胞周期の進行の間中（Ｇ０抽出物を含めて）存在した。なぜなら、抗p107はすべての時点でよりゆっくり泳動する複合体の出現を引き起こしたからである（図２ｃ；上部および下部パネルを比較されたい；変化した複合体は矢印によって示される）。細胞周期の調節およびここに観察されるDRTF1/E2Fという組成物は、他者によって達成された研究と全般に一致する(Mudryjら，1991; Shirodkarら，1992; Schwartzら，19 93)。以前の研究はＤＰ−１がDRTF1/E2Fによくある成分であると示唆したが、これらの実験は、細胞の非同調培養物から調製した抽出物を用いて実施された(Girli ngら，1993; Bandara ら，1993)もので、そして、それにもかかわらずDRTF1/E2F におけるＤＰ−１の存在が細胞周期によって調節されていた可能性を排除することはできない。細胞周期のある１つの期の間にＤＰ−１がDRTF1/E2F中に存在するかどうかを確認するため、同調化した３Ｔ３細胞の抽出物における抗ＤＰ−１の効果をアッセイした。抗ＤＰ−１は、３Ｔ３細胞周期の間に生じるDRTF1/E2F ＤＮＡ結合複合体の殆どに影響を及ぼした(図２ａ、トラック10〜17)。これらの効果は、相同的ペプチド（ペプチドＡ）によって競合されたが非関連ペプチドによっては競合されなかったので（ペプチド１；図２ａ、トラック２〜９をトラック19〜17と比較されたい）、特異的であった。したがって、ＤＰ−１はDRTF1/E2 Fによくある、そしてこれらの結果に基づくなら、恐らく３Ｔ３細胞DRTF1/E2Fに必ずある成分である。ＤＰ−１タンパク質が細胞周期の進行中に修飾される可能性はあるが、上記の結果はＤＰ−１がDRTF1/E2Fのよくある成分であることを示唆する。同調化３Ｔ３細胞抽出物の同一のセットをイムノブロットすることにより、上記の可能性をしらべた。細胞周期が進行して細胞がＳ期に入る時、Ｇ１の終りにｐ５５Ｌが現れたが、血清枯渇３Ｔ３抽出物中ではｐ５５Ｕが分解された（図２ｄ、トラック２、３および４を比較されたい）。このように、ｐ５５Ｌの出現は細胞周期のこの段階において明らかな、増大したDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性とよく相互関連していた（図２ａ、トラック５参照）。３Ｔ３細胞周期においてＤＰ−１はDRTF1/ E2F のよくある成分であり、またこれは細胞周期が進行する間に修飾されるようである、と結論された。次の文節において、提示されるデータはｐ５５Ｌの出現がリン酸化レベルの変化によってもたらされることを示唆する。 DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性は、F9 EC細胞の分化プロセスの間にダウンレギュレーションされる(La Thangue およびRigby，1987; PartridgeおよびLa Thangue ,1991)。これは増殖速度の低下に相互関連する調節的な側面である。DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性がダウンレギュレーションされている分化中のＦ９細胞から調製された抽出物をイムノブロッティングに用いた場合、分化した細胞（分化誘導の７日後）における低下したＤＮＡ結合活性が、ｐ５５Ｕおよびｐ５５Ｌの両方の減少したレベル（図２ｅ、トラック１と２を比較されたい）と相互関連することが明白であった。これは、細胞周期の進行中のｐ５５の調節と対照をなす側面である（図２ｄ）。それゆえ、細胞周期の進行および分化は別個の様式でＤＰ−１に影響を及ぼすと結論された。ＤＰ−１はリン酸化タンパク質である。細胞周期進行中のＤＰ−１ｐ５５の調節について可能な説明は、それがｐ５５の翻訳後修飾を反映するというものであり、一つの可能性は、そのリン酸化レベルであった。ＤＰ−１がリン酸化されているかどうかを試験した。この可能性を調べるため、２つの異なる抗ＤＰ−１ペプチド抗血清を用いた。先に記述したように、抗ＤＰ−１(A)はＤＰ−１のＮ−末端領域のペプチド配列を認識し、他方、抗ＤＰ−１(D)はＤＰ−１の最も遠いＣ−末端領域のペプチド配列に対して産生されていた（材料および方法の項を参照）。抗ＤＰ−１(D)は、ゲル遅延条件下でDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性（図３ａ、トラック2と3を比較されたい）、およびGST-DP-1融合タンパク質（図３ａ、トラック4と5を比較されたい）と特異的に反応した。ＤＰ−１がリン酸化されているかどうかを試験するために適合させた戦略は、第一に³²P-オルトリン酸塩で代謝的に放射性標識した細胞から調製した抽出物から、抗ＤＰ−１(A)を用いて免疫沈降させることであった。ペプチドＡ（すなわち抗血清を調製するのに用いたペプチド）と競合させることにより免疫沈降させたタンパク質を抗ＤＰ−１(A)複合体から解放し、そして抗ＤＰ−１(D)を用いて再度免疫沈降させた。第２回の免疫沈降後に分解したポリペプチドはＤＰ−１またはＤＰ−１結合タンパク質のはずである。第１回の免疫沈降において、幾つかのポリペプチドが抗ＤＰ−１(A)によって特異的に免疫沈降した（図３ｂ、トラック1と2を比較されたい）。解放されたポリペプチドの抗ＤＰ−１(D)を用いた再免疫沈降は、類似のパターンを示し、分子量が55,000および70,000である２つのリン酸化ポリペプチドを優勢的に分解した（図３ｂ、トラック3と4を比較されたい）。免疫沈降させたポリペプチドと、抗ＤＰ−１(A)を用いたイムノブロッティングにより明らかにされたポリペプチドとの比較は、分子量55,000のポリペプチドがＤＰ−１ｐ５５と同時泳動することを示した（図３ｂ、トラック10と11を比較されたい）。したがって、このポリペプチドはＤＰ−１である可能性が非常に高い。このレベルの分析では、ｐ５５Ｕとｐ５５Ｌを区別することは不可能であった。両方の抗ＤＰ−１血清を用いて実施した免疫沈降に分子量70,000のポリペプチド（図３ｂ、トラック４にｐ７０として示されている）が存在したので、これは恐らく物理的にＤＰ−１に結合している。ｐ７０の大きさが先に論じた交差反応性ポリペプチドｐ６５（図３ｂ、トラック11に●として示されている）よりかなり大きいことに注意することが重要である。抗ＤＰ−１(A)および抗ＤＰ−１(D)の両方はDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性を免疫沈降させ（図３ｂ、トラック５から８）、この形態のＤＰ−１（恐らくｐ７０と複合している）がＥ２Ｆ部位への結合に関与していることを示唆した。ＤＰ−１はリン酸化されており、またＤＰ−１は少なくとも１個の他のリン酸化ポリペプチドと物理的に結合している、と結論することが可能である。ｐ７０に比較し、ＤＰ−１のリン酸化のレベルは低かった。この結果は、ＤＰ−１が低リン酸化部位でＤＮＡに結合するという考えと一致する。ｐ５５Ｕとｐ５５Ｌの間の移動度の相違はリン酸化によって影響されたかどうかを試験するため、３Ｔ３細胞の非同調培養物から調製した抽出物をホスファターゼで処理することの効果を評価した。ホスファターゼの不在下では、ｐ５５Ｕおよびｐ５５Ｌの両方が分解され得た（図３ｃ、トラック２）。しかし、抽出物をホスファターゼで処理した後は、ｐ５５Ｌを犠牲にしてｐ５５Ｕがより明らかとなり（図３ｃ、トラック１と２を比較されたい；ｐ５５Ｕおよびｐ５５Ｌが指示されている）、ｐ５５Ｕとｐ５５Ｌの相違はリン酸化によって影響されることを示唆した。ｐＲｂのDP-1/E2F-1ヘテロ二量体への増強された結合ここに提示する細胞周期試験と以前の研究を結びつけると、ＤＰ−１はDRTF1/ E2Fによくある成分であることが示唆される(Bandaraら，1993; Girlingら，1993 )。しかし、DRTF1/E2Fはヘテロ二量体的ＤＮＡ結合活性である可能性が非常に高い(Girlingら，1993; Bandaraら，1993; Helinら，1993)。可能性のある生理学的パートナーは、Ｅ２Ｆ−１タンパク質である。なぜなら、DP-1/E2F-1ヘテロ二量体がin vivo で検出され、また両タンパク質はin vitroで相乗的に相互作用してヘテロ二量体的ＤＮＡ結合複合体を形成するからである(Bandaraら，1993; Helinら，1993)。種々のタンパク質、例えばpＲｂ、p107、サイクリンＡおよびＥ、並びにｐ３３^cdk2がDRTF1/E2Fと相互作用できるので(Mudryjら，1991; Shir odkarら，1992; Leesら，1992; Schwartzら，1993)、ＤＰ−１がDP-1/E2F-1ヘテロ二量体という関係においてどのようにしてこれらの相互作用に影響を及ぼすかを理解するのは興味深かった。ｐＲｂのDP-1/E2F-1ヘテロ二量体への結合を調べることを決定した。野性型ｐＲｂ（残基379から928までのｐＲｂ配列を含有するＧＳＴ融合タンパク質としての）がDP-1/E2F-1ヘテロ二量体に結合する効率を評価し、Ｅ２Ｆ−１を単独で用いた場合の結合活性と比較した。以前の報告(Banda ra ら，1993; Helinら，1993)と一致して、E2F-1は、単独でアッセイした場合、低いＤＮＡ結合活性を有した（図４ａ、トラック８）。しかし、同量のＥ２Ｆ− １をＤＰ−１の存在下でアッセイした場合、この活性は有意に大きくなった（図４ａ、トラック８と９を比較されたい）。DP-1/E2F-1ヘテロ二量体へのＧＳＴ- ｐＲｂの添加は、よりゆっくり泳動するＤＮＡ結合複合体をもたらした（図４ａ、トラック３を９と比較されたい）。pRb-E2F-1 複合体の強度はDP-1/E2F-1ヘテロ二量体を用いた場合より小さかったが（これは部分的にＥ２Ｆ−１単独の低いＤＮＡ結合活性の影響である）、ＧＳＴ-ｐＲｂもまたＥ２Ｆ−１複合体と結合した（図４ａ、トラック２と３を比較されたい）。ｐＲｂのDP-1/E2F-1ヘテロ二量体への増強された結合は、ＤＰ−１とｐＲｂの相互作用によって助けられることが考えられた。この相互作用は、以前に文献化されたｐＲｂによるＥ２Ｆ−１の認識(Helinら，1992; Kaelinら，1992; Shanら，1992)に加え、ｐＲｂの上記ヘテロ二量体への結合を安定させるのを助ける。I n vitroで翻訳されたＤＰ−１とＧＳＴ-ｐＲｂとの相互作用を評価する結合アッセイであって、ＤＰ−１とＥ２Ｆ−１との相互作用を試験するために以前に用いられた(Bandaraら，1993)アッセイを用いて、上記の考えを試験した。このアッセイの特異性の対照として、Ｅ２Ｆ−１およびＥ１ａのｐＲｂとの相互作用を評価した。Ｅ２Ｆ−１およびＥ１ａは両方ともポケット(pocket)の組み込みに依存する様式でｐＲｂに結合することが知られている(Huら，1990; Helin ら，1992; Kaelinら，1992)。我々は、野性型ｐＲｂ、および１つのアミノ酸置換（残基706においてＣからＦへ）を有するか、またはエキソン22によってコードされるタンパク質領域を欠損する、天然に存在する突然変異対立遺伝子によってコードされる２つのｐＲｂタンパク質へのそれらの結合を比較した。Ｅ２Ｆ− １およびＥ１ａは両方ともポケット依存性の様式でｐＲｂに結合した。なぜなら、それらの野性型ｐＲｂとの相互作用は突然変異タンパク質とのそれよりも大きかったからである（図４ｂ、トラック６を７および８と、トラック９を10および 11、並びにトラック13、14および15の減少した暴露と比較されたい）。さらに、そして以前の結果と一致して(Bandaraら，1993)、ＤＰ−１およびＥ２Ｆ−１は特異的に相互作用することが可能であった（図４ｂ、トラック1、2と12を比較されたい）。ＤＰ−１と野性型ｐＲｂとの相互作用を評価した時、有意なレベルの結合活性が検出された（図４ｂ、トラック２と３を比較されたい）。しかし、この活性はＧＳＴタンパク質への結合もグルタチオンビーズへの結合も減少が見られたので（図４ｂ、トラック１、２および３を比較されたい）ｐＲｂタンパク質配列の存在には依存していたが、ｐＲｂのポケット領域の組み込みに依存していなかった。なぜなら、ＤＰ−１は野性型ｐＲｂおよび突然変異ｐＲｂタンパク質の両方に同等の効率で結合したからである（図４ｂ、トラック３、４および５を比較されたい）。それにもかかわらず、ＤＰ−１はポケット依存性の様式でｐＲｂと特異的に相互作用することができると結論できる。ｐＲｂ-ＤＰ−１相互作用を制御するため、２つのアプローチが採用された。第１に、非関連タンパク質のｐＲｂとの相互作用を評価した。このため、我々はこのアッセイの条件下ではＧＳＴタンパク質と効率的に相互作用しないと同様、野性型ｐＲｂとも突然変異Ｒｂタンパク質とも効率的に相互作用しない（図４ｂ、トラック16、17、18を19と比較されたい）CREBP1(cAMP応答エレメント結合タンパク質；Maekawaら，1989)を選択した。第２に、野性型ｐＲｂまたはＧＳＴ単独を用いて、パネルに掲げた突然変異ＤＰ−１タンパク質（図４ｃ）の結合活性を評価した。アッセイしたＤＰ−１突然変異タンパク質の殆どはＧＳＴ単独よりもより効率的にｐＲｂに結合した（図４ｃ、トラック１、２、３および４を６、７、８および９と比較されたい）。しかし、ＤＰ−１タンパク質配列Ｃ-末端を残基211から欠く突然変異体△211 はｐＲｂと相互作用しなかった（図４ｃ、トラック５を10と比較されたい; このアッセイに用いた翻訳された△211ポリペプチドがトラック11に示されている）。これら突然変異ＤＰ−１タンパク質もまた、Ｅ２Ｆ−１およびｐＲｂと相互作用する能力についてゲル遅延アッセイにより評価された（図４ａ）。すべての突然変異ＤＰ−１タンパク質がＥ２Ｆ部位ＤＮＡ結合活性においてＥ２Ｆ−１と相乗的に相互作用することができた（図４ａ、トラック９から13）。△211の活性は、野性型ＤＰ−１よりもわずかに低く（図４ａ、トラック９を13と比較されたい）、ＤＰ−１における残基204から249の間の領域はDP-1/E2F-1ヘテロ二量体のＤＮＡ結合活性に寄与する(Bandaraら，1993)と指示する以前の研究と一致する。先に指摘した通り、DP-1/E2F-1ヘテロ二量体はｐＲｂと効率的に相互作用する（図４ａ、トラック３）。結合アッセイにおいてｐＲｂと相互作用することができた突然変異ＤＰ−１タンパク質（図４ｃ）はまた、ｐＲｂと相互作用が可能な DP-1/E2F-1ヘテロ二量体を生成することができた（図４ａ、トラック３、４、５および６を比較されたい）。結合アッセイにおいてｐＲｂと相互作用しなかった △211によってもたらされたDP-1/E2F-1ヘテロ二量体（図４ｃ，トラック５）は、ｐＲｂ結合活性を低下させた（図４ａ、トラック３と７を比較されたい）。△ 211/E2F-1ヘテロ二量体のわずかに低下したＤＮＡ結合活性は、ｐＲｂのＤＰ− １△211/E2F-1ヘテロ二量体への結合効率における劇的な減少より遙かに小さかった（図４ａ、トラック６を７と、12を13と比較されたい）。２つの異なるアッセイを用いた突然変異ＤＰ−１タンパク質に関する試験から得られたこれらのデータは、ＤＰ−１がｐＲｂと相互作用することができ、また残基211から327の間の領域がこの相互作用に影響を及ぼすことを示唆している。アデノウイルスE4 orf 6/7タンパク質はDP-1/E2F-1ヘテロ二量体に結合し、このＤＮＡ結合複合体に協同的Ｅ２Ｆ部位ＤＮＡ結合の特性を付与する。アデノウイルス orf 6/7産物がDP-1/E2F-1ヘテロ二量体に結合できるかどうかを確認することを決定した。アデノウイルス感染の間に、orf 6/7 タンパク質は DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性を有する２個の分子と相互作用し(HuangおよびHearin g，1989; Martonら，1990)、これがＥ２ａプロモーターにおいて起こるような(H ardyおよびShenk，1989; Raychaudhuriら，1990)２個の正しく間隔を置いて配向されたＥ２Ｆ結合部位の協同的認識をもたらすため、この相互作用を試験した。したがって、orf 6/7 とDP-1/E2F-1との相互作用は、重要な生理学的相互作用の別の例を表すであろう。これを試験するため、ＤＰ−１およびＥ２Ｆ−１タンパク質をin vitroで翻訳し、Ｅ２ａプロモーターに関するそれらのＤＮＡ結合活性をゲル遅延により試験した。ここでもまた、両方のタンパク質の存在下でのみ、有意なＤＮＡ結合活性が観察された（図５、トラック２、３、４を５と比較されたい）。DP-1/E2F-1ヘテロ二量体へのorf 6/7 の添加は、よりゆっくり泳動するＤＮＡ結合複合体の出現を引き起こした（図５、トラック９に＊で示してある）。この複合体は、ＤＰ −１またはＥ２Ｆ−１単独に対してorf 6/7 を加えた時には明らかではなかった（図５、トラック６、７および８を９と比較されたい）。この効果は、Ｅ２ａプロモーターにおける２個のＥ２Ｆ結合部位の配置に対して特異的であった。なぜなら、orf 6/7 によって誘導される変化は、１個のＥ２Ｆ結合部位を用いた場合（データはここに示さない）には明らかでなかったからである。それゆえ、これはＥ２ａプロモーターにおけるＥ２Ｆ部位の立体配置を認識するＤＮＡ結合複合体を表す可能性が非常に高い。これらの結果は、orf 6/7 タンパク質はDP-1/E2F -1ヘテロ二量体と特異的に相互作用し、そして、そうしながらアデノウイルス感染細胞形態のDRTF1/E2F の適切な生化学的特性を有するＤＮＡ結合活性を創出することを示している。それゆえ、orf 6/7 タンパク質とDP-1/E2F-1ヘテロ二量体との相互作用は、in vivo現象の要点を繰り返している。各タンパク質を特異的に認識する抗血清を用いて、二重部位複合体におけるＤＰ−１、Ｅ２Ｆ−１およびorf 6/7 タンパク質の存在を確証した。抗ＤＰ−１および抗Ｅ２Ｆ−１は、orf 6/7 タンパク質の不在下でも存在下でも、DP-1/E2F-1 ヘテロ二量体と反応した（図５、トラック10、11および12、ならびに14、15および16を比較されたい）。対照的に、抗orf 6/7 はDP-1/E2F-1ヘテロ二量体の活性に影響を及ぼさなかった（図５、トラック13を17と比較されたい）が、orf 6/7 タンパク質の添加により明らかになる二重部位複合体の出現を妨げた（図５、トラック10を13と比較されたい）。したがって、ＤＰ−１、Ｅ２Ｆ−１およびorf 6/7 タンパク質は二重部位複合体中に存在すると結論することができる。適切な立体配置のＥ２Ｆ部位と結合したDP-1/E2F-1ヘテロ二量体は、orf 6/7 によるＥ２Ｆ部位依存性転写の活性化に必要である。 DP-1/E2F-1ヘテロ二量体とorf 6/7 との相互作用の機能的重要性を立証するため、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)ＳＬ２細胞を用いて以前に開発されたアッセイ系(Bandaraら，1993)を使用した。ＳＬ２細胞は、Ｅ２Ｆ部位依存性転写の分析に特に適している。なぜなら、多くの哺乳動物細胞とは対照的に、ＳＬ２細胞は非常に低レベルの内因性Ｅ２Ｆ部位ＤＮＡ結合活性を有し(Bandaraら，1993)、したがってトランスフェクトされたＥ２Ｆ部位エフェクター分子の、トランスフェクトされたベクターから発現された活性が容易に評価されることを可能とするからである。これらの細胞内で、ＤＰ−１およびＥ２Ｆ −１は、個々のタンパク質単独では殆ど活性化しない条件下で、Ｅ２Ｆ部位依存性転写活性化において相乗的に相互作用する(p3xWTレポーターによりアッセイした場合)ことが以前に示された(Bandaraら，1993; 図６ｂ，レーン３および４を７と比較されたい）。orf 6/7 とＤＰ−１またはＥ２Ｆ−１単独との同時発現、または両タンパク質の存在下では、p3xWTの転写活性に有意に影響しなかった（図6b、レーン3と4、4と5、および7と8を比較されたい）。これはp3xWTにおけるＥ２Ｆ部位の配置から予想された結果であった。なぜなら、p3xWT はアデノウイルスＥ２ａプロモーター由来の遠位的なＥ２Ｆ部位を、タンデムに３コピー有し、それゆえorf 6/7 依存性二重部位複合体の形成にとって不適切な配置だからである(HardyおよびShenk，1989)。アデノウイルス感染細胞内にorf 6/7-二重部位複合体の形成を可能とするＥ２Ｆ部位の構成(organization)（図７に矢印で指示）を有する野性型アデノウイルスＥ２ａプロモーター(HardyおよびShenk，1989;および図５参照)を用いて同様のアッセイを実施した時、ＤＰ−１およびＥ２Ｆ−１は、共に存在すると各タンパク質単独の場合よりも効率的に転写を活性化した（図7bおよびc、レーン７を３および４と比較されたい）。しかし、orf 6/7 のp3xWTへの効果（図6b、レーン７と８を比較されたい）とは対照的に、orf 6/7 とＤＰ−１およびＥ２Ｆ−１との同時発現はＥ２ａプロモーターの転写活性における顕著な増加をもたらした（図7bおよびc、レーン７と８を比較されたい）。ＤＰ−１またはＥ２Ｆ−１が単独で発現された場合はorf 6/7 はプロモーター活性に影響を及ぼさなかったので、この効果はDP-1/E2F-1ヘテロ二量体に特異的であった（図7bおよびc、トラック３を６と、トラック４を５と比較されたい）。したがって、orf 6/7 による転写活性化は、ＤＰ−１およびＥ２Ｆ−１タンパク質の存在に依存しており、そしてさらに、感染細胞内でorf 6/7 タンパク質がその生物学的効果を達成するのに必要であることが以前に示されたＥ２Ｆ部位の構成を必要とする。それゆえ、 orf 6/7 とDP-1/E2F-1ヘテロ二量体との相互作用は、アデノウイルス感染細胞におけるＥ２Ｆ部位依存性転写の調節の要点を繰り返している。ＤＰ−１：DRTF1/E2Fの、よくある、そして増殖によって調節されるＤＮＡ結合成分。ＤＰ−１は、最初 F9 EC細胞中のＥ２Ｆ部位ＤＮＡ結合ポリペプチドであり、またｐＲｂおよびp107結合DRTF1/E2Fの成分であると定義された(Girlingら，199 3)。さらに、F9 EC およびHeLa細胞の非同調培養物より調製した抽出物中で、抗ＤＰ−１抗体は明らかに示しうる(definable)ＤＮＡ結合複合体の殆どに影響を及ぼす(Bandaraら，1993)。本発明においては、DRTF1/E2Fが、ｐＲｂおよびp107 （「ポケット」タンパク質と称する）、サイクリン並びにサイクリン依存性キナーゼ等のタンパク質(Nevins，1992; La Thangue，1994に総説されている)との調節された一連の相互作用を受ける３Ｔ３細胞周期の間にＤＰ−１タンパク質の特性を調べることにより、ＤＰ−１タンパク質の分析が継続された。その結果は、３Ｔ３細胞における細胞周期の進行中、ＤＰ−１は、DRTF1/E2F の、普遍的でないにしても非常によくあるＤＮＡ結合成分であることを明確に立証した。これは、Ｅ２Ｆ−１はDRTF1/E2F の幾つかの種に存在するがすべての種には存在しないので、幾分より珍しいＤＮＡ結合成分であると示唆する、Ｅ２Ｆ−１タンパク質について実施した試験の結果と対照をなす(Chittendenら，1993)。したがって、ＤＰ−１は、細胞周期の間に恐らくＥ２Ｆ−１に関連している他のタンパク質とヘテロ二量体を形成し、ヘテロ二量体的Ｅ２Ｆ部位ＤＮＡ結合活性を有する他の種（図８に示すモデル中に指示されている）を生成することができる。入手可能な証拠に基づくと、Ｅ２Ｆ結合部位を認識する多数のＤＮＡ結合ヘテロ二量体が存在し、またある細胞（例えばF9 EC、HeLaおよび３Ｔ３）は可変的なそのパートナー（この試験ではＥ２Ｆ−１によって例示される）と共にＤＰ−１をよくある成分として有するように思われる。特にＤＮＡ結合ドメイン内のＥ２Ｆ−１に関連するタンパク質(Ivey-Hoyleら，1993; Leesら，1993)で、そしてそれゆえＤＰ −１に適当なパートナーであるタンパク質の単離は、そのようなモデルと一致する。ＤＰ−１は３Ｔ３細胞周期を通じてDRTF1/E2F のよくあるＤＮＡ結合成分であるが、それにもかかわらず、ＤＰ−１ＤＮＡ結合ポリペプチド（ｐ５５）は細胞周期改変を受ける。なぜなら、それは細胞周期の進行中にわずかな移動度変化を受けたからである（ｐ５５Ｕからｐ５５Ｌへ）。この現象に対して可能な説明は、細胞周期が進行する間、ｐ５５のリン酸化レベルが調節されているという、ｐ５５Ｌの移動度を変化させたホスファターゼの効果（図3c）と調和した考えである。これは、ＤＰ−１の産物であるｐ５５（ある種の細胞においてこれはDRTF 1/E2F のよくある成分である）が細胞周期の進行中に示差的にリン酸化されることを示唆する。この機能的重要性、残基の位置、およびこのプロセスに関与するキナーゼおよびホスファターゼの性質はまだわかっていない。ＤＰ−１が別のリンタンパク質ｐ７０と物理的に結合していることは注目すべきである。ＤＰ−１に比較して、ｐ７０はより高いレベルのリン酸化を示した。これは、ＤＰ−１およびｐ７０は異なる生理学的合図に応答するという考えと調和する観察である。ＤＰ−１におけるｐ７０の存在は、相互関連するDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性を免疫沈降させる。したがって、DP-1/P70複合体はヘテロ二量体的Ｅ２Ｆ部位特異的ＤＮＡ結合複合体でありうる。しかし、ｐ７０がＥ２Ｆ−１であるとは思われない。なぜなら、種々の抗Ｅ２Ｆ−１抗血清がｐ７０と反応しなかったからである。このことは、ｐ７０がＥ２Ｆ−１に関連していて、そして例えばより最近になって明らかにされたＥ２Ｆ−１関連タンパク質の１つでありうることを排除するものではない(Ivey-Hoyleら，1993; Leesら，1993)。細胞周期進行中のＤＰ−１の調節と対照的に、ＤＰ−１は分化のプロセスにおいてダウンレギュレーションされ、したがってこの点でＤＰ−１のレベルは細胞増殖の速度と相互関連する。実際、ＤＰ−１のレベルが細胞増殖の速度に直接影響することが考えられる。なぜなら、プロモーター領域にＥ２Ｆ結合部位を有する多数の遺伝子は、細胞周期の進行に必要なタンパク質をコードしているからである(Nevins，1992)。ＤＰ−１はｐＲｂに結合する。上記の結果は、ＤＰ−１がポケットの組み込みに依存しない様式でｐＲｂに結合できることを示す。これはＥ２Ｆ−１およびウイルス腫瘍タンパク質とｐＲｂとの相互作用と対照的である。なぜなら、これらの結合活性はポケット領域が完全な時より効率的だからである。ＤＰ−１のＣ−末端の半分に限定されるタンパク質ドメインは、ｐＲｂのＤＰ−１単独またはDP-1/E2F-1ヘテロ二量体への結合活性効率に影響を及ぼす。これは、このドメインがｐＲｂの増大した結合の媒介に関与していることを示唆する。しかし、このドメインが相互作用にとって十分であると思われると暗示したいのではく、むしろ、このドメインはｐＲｂとＥ２Ｆ−１のＣ−末端ドメインとの間で起こるポケット依存性相互作用と協同するようである(Helinら，1993)。ｐＲｂ△22は結合アッセイにおいてはDP-1/E2F-1ヘテロ二量体と効率的に結合することができたが、ゲル遅延アッセイにおいてはそれと効率的に結合しなかった(図4aおよびb)。これは、ＤＰ−１とｐＲｂとの相互作用が弱いことを示唆している。または、Ｅ２Ｆ−１がDP-1/E2F-1ヘテロ二量体の関係において、ＤＰ−１の△22と相互作用する能力を妨害している可能性がある。さらなる実験がこれらの問題を明らかにするであろう。したがって、ｐＲｂのDP-1/E2F-1ヘテロ二量体への結合に影響することにおいて、Ｅ２Ｆ−１は主要な決定要素であるが、しかしこの結合活性はｐＲｂの非ポケット依存性領域とＤＰ−１のＣ−末端領域との相互作用によって高められる。 p107-DRTF1/E2F 複合体にＤＰ−１もまた存在するとすれば、ＤＰ−１もまたp10 7のヘテロ二量体への結合を助けることが考えられる。もしそうであれば、ＤＰ −１を認識することはポケットタンパク質の一般的な特性であるのかもしれない。これらの考えを試験し、ＤＰ−１に結合するｐＲｂのドメインを確認することは非常に興味深い。 orf 6/7 タンパク質とDP-1/E2F-1ヘテロ二量体との相互作用は生理的調節の要点を繰り返す。上記の結果はまた、DP-1/E2F-1ヘテロ二量体はorf 6/7 によって認識されるDR TF1/E2Fの生理的に適切な形態であることを示唆している。ヘテロ二量体の形成およびＥ２Ｆ部位の適切な配置（例えばＥ２ａプロモーター内における）は、or f 6/7 による転写活性化のための必要条件である。これは、DP-1/E2F-1ヘテロ二量体がDRTF1/E2Fの感染細胞型の重要な印(hallmarks)を有することを示している。HeLa細胞のアデノウイルス感染の間にorf 6/7 タンパク質がDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性と安定な複合体を形成することは文献によく示されている(Hardyおよび Shenk，1989; HuangおよびHearing，1989)。DP-1/E2F-1ヘテロ二量体がHeLa細胞中に存在するとすると(Bandaraら，1993)、普通の溶菌感染の間にorf 6/7 タンパク質はこの複合体と相互作用する可能性が非常に高い。それゆえ、ひとはアデノウイルス感染の間に起こるDRTF1/E2Fの一形態との相互作用の成分を定義し、そして再構築されたのだと思う。しかし、E2F-1、-2および-3の間に高度の類似性が与えられるならば、他のDP-1/E2Fヘテロ二量体、例えばDP-1/E2F-2およびDP -1/E2F-3もまたorf 6/7 と相互作用することができるようである(Ivey-Hoyleら，1993; Leesら，1993)。さらに、E2F-1 がE2F-2 およびE2F-3 に関連している( Girling，OrmondroydおよびLa Thangue、未刊行の考察)ようにＤＰ−１に高度に関連している他のＤＰタンパク質は、E2F類(例えばE2F-1)の適当なパートナーである。二重Ｅ２Ｆ部位ＤＮＡ結合複合体の創出へのorf 6/7 タンパク質の寄与は比較的明らかであるが、転写活性化におけるorf 6/7 の役割は殆ど分かっていない。データは、orf 6/7 タンパク質はあるとしても極わずかの転写刺激しか提供しないことを示唆している。この見解は、orf 6/7 タンパク質はDP-1/E2F-1ヘテロ二量体の転写活性を約２倍に高める（図７）という事実に基づいている。それゆえ、最も単純な解釈は、orf 6/7 タンパク質は２つの部位（orf 6/7 の不在下で起こるらしい１つの部位ではなく）の占領に便宜を与える、そして増強された転写活性はorf 6/7 からの直接的寄与によるものではなく、二重部位占領（すなわち２個のDP-1/E2F-1ヘテロ二量体）によってもたらされる、というものである。したがって、orf 6/7 は、DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性（例えばDP-1/E2F-1ヘテロ二量体等）に特異的な、ウイルス的にコードされる二量体化ドメインとして優勢に機能する、ということが示唆される。アデノウイルス溶菌感染の間、ウイルスによって引き出される少なくとも２つの作用機構がDRTF1/E2F の正常な調節を侵害する。第１に、正常であればDRTF1/ E2F の転写活性を抑制するｐＲｂ等のタンパク質をＥ１ａタンパク質が隔離し、そしてたぶん不活性化する。そこで転写的に活性なDRTF1/E2Fは、細胞性遺伝子を活性化することが可能である。細胞性遺伝子の幾つかはウイルス複製に必要なタンパク質をコードしている。第２に、orf 6/7 タンパク質はDP/E2Fからなるこの１個のＥ２Ｆ部位活性を標的とし、これをＥ２ａ（その遺伝子は、複製に必要なウイルスタンパク質をコードする。）等のウイルスプロモーター中に存在する部位の構成を優先的に認識する形に変換し、そのようにして必須なウイルス遺伝子の発現をウイルス複製サイクルの間維持する。要約すると、３Ｔ３細胞においてＤＰ−１はDRTF1/E2F のよくある成分であり、そしてＤＰ−１のリン酸化レベルは細胞周期制御のもとにあることが示された。さらに、DRTF1/E2F におけるＤＰ−１の存在は、ｐＲｂとの相互作用を増大させ、そしてorf 6/7 タンパク質による認識にとって機能的に極めて重要である。したがって、ＤＰ−１はウイルス性および細胞性タンパク質をDRTF1/E2F と相互作用することを可能にするうえで、極めて重要な役割を果たす。細胞系からの抽出物の調製、ゲル遅延、および免疫化学的技法：抽出物は以前に記述されたように調製した(PartridgeおよびLa Thangue，1991 )。ゲル遅延反応は、アデノウイルス5 型 E2aプロモーター(ヌクレオチド-71 から-50)より取った遠位のＥ２Ｆ結合部位を有するオリゴヌクレオチド、または２つのＥ２Ｆ部位を有する完全な野性型Ｅ２ａプロモーター(ヌクレオチド-96 から+68)を用いて実施した。抗血清および競合するペプチド（ＤＰ−１ペプチドに対し約2nモル）は以前に記述された通り行った(Girlingら，1993)。イムノブロッティングは標準的手順により実施し、アフィニティー精製抗ＤＰ−１(A)をイムノブロッティングに用いた。アフィニティー精製は、ペプチドＡが臭化シアン活性化SepharoseCL4Bに結合させたペプチドＡアフィニティーマトリックスを用いて実施した。使用した他の抗体は、抗ＤＰ−１(D)、抗ｐ１０７に対するＳＤ１５(Dysonら，1993)、抗Ｅ２Ｆ−１に対する１３４(Bandaraら，1993)、ウサギポリクローナル抗orf 6/7(Boccoら，1993)、およびウサギポリクローナル抗サイクリンＡ(Bandaraら，1991)であった。対照として、免疫前血清または非関連モノクローナル抗体を用いた。DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性は、Ｅ２Ｆ結合部位アフィニティーマトリックスへ繰り返しロードすることにより、以前に記述された通りに正確にアフィニティー精製した(Girlingら，1993)。細胞抽出物の脱リン酸化は、ヒト胎盤ホスファターゼ(4.0U)、ジャガイモ酸ホスファターゼ(1.2 U)および仔ウシ腸ホスファターゼ(20U)を添加し、次に37℃で40分間インキュベートすることにより実施した。対照の処理にはホスファターゼを添加しなかった。次に、抗ＤＰ−１(A)を用いて抽出物をイムノブロッティングした。融合タンパク質およびin vitro翻訳：ＤＰ−１、Ｅ２Ｆ−１、ｐＲｂ、ｐＲｂ△22およびｐＲｂＣ→Ｆ 706をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、以前に記述されたように精製した(Bandaraら，1993; Girlingら，1993)。ＤＰ−１、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ１ａおよびCREBP1(Maeka waら，1989)をコードする配列を、網状赤血球溶解液を用いて転写および翻訳し( Promega; Bandaraら，1993)、そしてorf 6/7 タンパク質を以前に記述されたように発現させて精製した(Boccoら，1993)。またこのタンパク質はJose Bocco及びClaude Kedingerにより親切に提供された。タンパク質結合アッセイ（図４）において、ポリペプチドを翻訳し、³⁵S メチオニンを用いて放射性標識し、そして適切なＧＳＴ融合タンパク質と共に30℃で30分間インキュベートし、グルタチオン-アガロース(Sigma)を用いて回収し、PBSAに溶解した0.1% NP40を用いて繰り返し洗浄した。結合タンパク質は、以前に記述されたようにSDSサンプル緩衝液中で変性して放出し、10% ポリアクリルアミドゲル中で分解した(Bandaraら， 1993)。各ポリペプチドについて翻訳の効率を評価した。△341および△327は、ｐＧＤＰ−１(Bandaraら，1993)をそれぞれBam H1及びKpn1で消化するとにより作製した。△73-340は、効率的なリボソーム結合部位を組み込んでいる5'オリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ・チェーン・リアクションにより作製した。 △211は、Promega Erase-a-Base系を用いた3'末端由来のＤＰ−１ｃＤＮＡのエキソヌクレアーゼIII消化により作製した。代謝放射性標識： 3mCiの³²P-オルトリン酸塩(Amersham International)を用いてF9 EC細胞（約1 x10⁶）を４時間放射性標識し、溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaC l，0.1% NP40，２μg/ml Aprotonin，0.5 mM PMSF)中で回収した。２つの異なる抗ＤＰ−１抗体を用いて、細胞溶解液を２工程で免疫沈降させた。第１に、相同ペプチド（ペプチドＡ；2nモル）または非関連ペプチド（ペプチド１；2nモル）の存在下で、抗ＤＰ−１(A)を放射性標識溶解液に１時間にわたって添加した。その後、プロテインＡ Sepharoseビーズ(Pharmacia)を添加し、さらに１時間インキュベートした。Sepharoseビーズを回収し、溶解緩衝液で繰り返し洗浄した。非関連ペプチド（ペプチド１）の存在下で達成された免疫沈降物に相同ペプチド（ペプチドＡ；（ＤＰ−１の残基３から15）2nモル）を添加することにより、抗ＤＰ−１(A)と共に免疫沈降したタンパク質を放出した。相同ペプチド（ペプチドＤ；2nモル）または非関連ペプチド（ペプチド１；2nモル）の存在下で抗ＤＰ−１(D)を用いて、放出されたタンパク質の再免疫沈降を実施した。反応液を１時間インキュベートし、その後プロテインＡ Sepharoseビーズを添加し、さらに１時間インキュベートした。結合タンパク質をSDSゲル電気泳動により分解した。DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性の分析のため、免疫沈降物（相同ペプチドまたは非関連ペプチドを含有する；2nモル）をゲル遅延緩衝液で処理し、次に競合的突然変異Ｅ２Ｆ部位の存在下におけるＥ２Ｆ部位へのＤＮＡ結合活性についてアッセイした。ショウジョウバエ組織培養細胞のトランスフェクション：レポーター構築体 p3xWTおよび p3xMTが以前に記述されている(ZamanianおよびLa Thangue，1992)。pE2aはＣＡＴ遺伝子を駆動させる野性型Ｅ２ａプロモーター配列(-96から+68)を含有するもので、以前に記述されている(SivaRamanおよびThimmappaya，1987)。pDP-1 およびpE2F-1 は完全なＤＰ−１およびＥ２Ｆ− １タンパク質を含有する(Bandaraら，1993)。pE4 はＥ４プロモーターに制御される完全なAd5 orf 6/7 ｃＤＮＡを含有するもので、これはClaude Kedingerより親切に提供された。トランスフェクションおよびＣＡＴアッセイは以前に記述されたように実施した(Bandaraら，1993)。細胞周期分析：細胞周期分析（図２参照）のため、NIH 3T3 細胞を0.1%ウシ胎児血清(FCS)を含有する培地(DMEM)で36時間培養した。次に各培養物を洗浄し、10% FCSを含有するDMEMを添加した。そして、その後適当な時（４時間ごと）に細胞を採集した。細胞増殖キット(Amersham International)を用いて、製造者の指示に従って、ＤＮＡ合成について細胞を評価した。すなわち、ブロモデオキシウリジン(BrdU) の存在下で無菌のカバースリップ上で細胞を増殖させ、適切な時間間隔をおいてカバースリップを除去して、抗BrdUを用いて製造者の指示にしたがって免疫染色を実施した。ゲル遅延およびイムノブロッティングによる分析用に、平行培養物を調製した。この細胞系において、ＤＮＡ合成は血清刺激後８時間目に始まり、約12時間目にピークに達した。細胞は血清刺激後20時間目に分裂し始めた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年８月１９日【補正内容】請求の範囲１．増殖を防止、抑制あるいは増強する可能性のある物質についてのアッセイであって、 (i)前記物質をDPタンパク質を含んでいる細胞と接触させ、 (ii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む、前記アッセイ。２．増殖を防止、抑制あるいは増強する可能性のある物質についてのアッセイであって、 (i)DPタンパク質を含む細胞からの抽出物を用意し、 (ii)その抽出物を前記物質と接触させ、 (iii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む、前記アッセイ。３．細胞抽出物が、低リン酸化状態のDPタンパク質を含む、請求項２に記載のアッセイ。４．細胞抽出物が、リン酸化状態のDPタンパク質を含む、請求項２に記載のアッセイ。５．細胞抽出物が、同調培養中の細胞から得られたものである、請求項２〜４のいずれかに記載のアッセイ。６．可能性のあるDPタンパク質リン酸化調節物質についてのアッセイであって、 (i)低リン酸化またはリン酸化状態のDPタンパク質及びリン酸化または脱リン酸化酵素をを含む媒体を前記物質と接触させ、 (ii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む、前記アッセイ。７．DPタンパク質のリン酸化状態の観察が、DPタンパク質中の³²P の量を測定するか、抗体の抗-DP-1(D)のDP-1に対する結合の程度を測定するか、あるいはSDS/ ポリアクリルアミドゲル上でのDPタンパク質の移動を測定することを含む、請求項１〜６のいずれかに記載のアッセイ。８．低リン酸化状態のDP-1を認識するが、リン酸化されているときはDP-1にそれほどよく結合しない抗体。９．DP-1の残基385-400 に対応するペプチドに結合することができる、請求項８に記載の抗体。 10．リン酸化部位を含むDPタンパク質の部分または断片に結合することができるモノクローナル抗体である、請求項８または９に記載の抗体。 11．配列RVETPVSYVGEDDDD から実質的になるDP-1の断片。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．増殖を防止、抑制あるいは増強する可能性のある物質についてのアッセイであって、 (i)前記物質をDPタンパク質を含んでいる細胞と接触させ、 (ii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む、前記アッセイ。２．増殖を防止、抑制あるいは増強する可能性のある物質についてのアッセイであって、 (i)低リン酸化状態のDPタンパク質を含む細胞からの抽出物を用意し、 (ii)その抽出物を前記物質と接触させ、 (iii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む、前記アッセイ。３．増殖を防止、抑制あるいは増強する可能性のある物質についてのアッセイであって、 (i)リン酸化状態のDPタンパク質を含む細胞からの抽出物を用意し、 (ii)その抽出物を前記物質と接触させ、 (iii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む、前記アッセイ。４．可能性のあるDPタンパク質リン酸化調節物質についてのアッセイであって、 (i)低リン酸化またはリン酸化状態のDPタンパク質及びリン酸化及び／または脱リン酸化酵素を含む媒体を前記物質と接触させ、 (ii)DPタンパク質のリン酸化状態を観察することを含む、前記アッセイ。５．DPタンパク質のリン酸化状態の観察が、DPタンパク質中の³²P の量を測定するか、抗体の抗-DP-1(D)のDP-1に対する結合の程度を測定するか、あるいはSDS/ ポリアクリルアミドゲル上でのDPタンパク質の移動を測定することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ。６．配列番号２のC-末端領域に対応するペプチドを免疫原として使用して得られ、低リン酸化状態のDP-1を認識するが、DP-1がリン酸化されているときはそれほどは結合しないモノクローナル抗体。７．DP-1の残基385-400 に対応するペプチドに特異的な（即ちそれを免疫原とする）、請求項６に記載の抗体。８．リン酸化部位を含むDPタンパク質の部分または断片に結合することができるモノクローナル抗体。９．DP-1の部分に結合する、抗-DP-1(D)である請求項６〜８のいずれかに記載の抗体。 10．リン酸化されているか、またはされていないリン酸化部位を含むDPタンパク質の断片。 11．DP-1の断片であり、リン酸化部位Thr³⁸⁸またはSer³⁹¹を含む、請求項10に記載の断片。