NO317397B1 - Assay for inhibitorer av DP-1- og DP-proteiner - Google Patents
Assay for inhibitorer av DP-1- og DP-proteiner Download PDFInfo
- Publication number
- NO317397B1 NO317397B1 NO19965584A NO965584A NO317397B1 NO 317397 B1 NO317397 B1 NO 317397B1 NO 19965584 A NO19965584 A NO 19965584A NO 965584 A NO965584 A NO 965584A NO 317397 B1 NO317397 B1 NO 317397B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- protein
- assay
- cell
- dna
- binding
- Prior art date
Links
- CPMBELNSUCVCNT-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4-dihydroxy-5-propan-2-ylphenyl)-4-[1-(2-piperidin-4-ylethyl)indol-5-yl]-1H-1,2,4-triazol-5-one Chemical compound C1=C(O)C(C(C)C)=CC(C=2N(C(O)=NN=2)C=2C=C3C=CN(CCC4CCNCC4)C3=CC=2)=C1O CPMBELNSUCVCNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 233
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 192
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 183
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 53
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 129
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 82
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 51
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 40
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 38
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims description 38
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 claims description 9
- 102100024027 Transcription factor E2F3 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 101710138752 Transcription factor E2F3 Proteins 0.000 claims description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 5
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 abstract description 25
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 12
- 102000004853 Transcription Factor DP1 Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090001097 Transcription Factor DP1 Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000015699 E2F1 Transcription Factor Human genes 0.000 abstract 1
- 108010063774 E2F1 Transcription Factor Proteins 0.000 abstract 1
- 101710155964 Diuretic hormone 1 Proteins 0.000 description 233
- 101000639778 Drosophila melanogaster RNA polymerase-associated protein Rtf1 Proteins 0.000 description 85
- 101000666370 Homo sapiens Transcription factor Dp-1 Proteins 0.000 description 85
- 102100038130 Transcription factor Dp-1 Human genes 0.000 description 85
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 84
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 70
- 102100038042 Retinoblastoma-associated protein Human genes 0.000 description 64
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 46
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 39
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 34
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 description 28
- 239000000306 component Substances 0.000 description 27
- 201000009051 Embryonal Carcinoma Diseases 0.000 description 17
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 16
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 16
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 241000894007 species Species 0.000 description 14
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 10
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 10
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 9
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 8
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 230000009848 hypophosphorylation Effects 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 108010057856 Adenovirus E2 Proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 6
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 5
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 5
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 102000002554 Cyclin A Human genes 0.000 description 4
- 108010068192 Cyclin A Proteins 0.000 description 4
- 108010093502 E2F Transcription Factors Proteins 0.000 description 4
- 102000001388 E2F Transcription Factors Human genes 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 3
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- -1 pl07 Proteins 0.000 description 3
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 241000944683 Bandara Species 0.000 description 2
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 2
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 101500026142 Homo sapiens Processed cyclic AMP-responsive element-binding protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010057576 Papillomavirus E7 Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000288049 Perdix perdix Species 0.000 description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- 102400000755 Processed cyclic AMP-responsive element-binding protein 3 Human genes 0.000 description 2
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150012716 CDK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023444 Centromere protein K Human genes 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023033 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000003909 Cyclin E Human genes 0.000 description 1
- 108090000257 Cyclin E Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 102000019274 E2F Family Human genes 0.000 description 1
- 108050006730 E2F Family Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101100059559 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) nimX gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100380508 Homo sapiens ATF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000904150 Homo sapiens Transcription factor E2F3 Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101710107921 Secreted protein BARF1 Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 101100273808 Xenopus laevis cdk1-b gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000002737 cell proliferation kit Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N ensulizole Chemical compound N1C2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C2N=C1C1=CC=CC=C1 UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- UGQQAJOWXNCOPY-VBCJEVMVSA-N i1osj03h46 Chemical compound C([C@H]12)C[C@H]3[C@@](C4(Cl)Cl)(Cl)C(Cl)=C(Cl)[C@@]4(Cl)[C@H]3CC[C@@H]1[C@]1(Cl)C(Cl)=C(Cl)[C@@]2(Cl)C1(Cl)Cl UGQQAJOWXNCOPY-VBCJEVMVSA-N 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000007180 physiological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920009537 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 102000023888 sequence-specific DNA binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008420 sequence-specific DNA binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører transkripsjonsfaktoren DP-1 og dens rolle i kontroll av cellesyklus.
Oppfinnelsen tilveiebringer et assay for et potensielt vekst-hemmende, -inhiberende eller -økende middel særpreget ved de trekk som står i krav 1 og 2's karakteriserende deler. Videre tilveiebringer oppfinnelsen et assay for et potensielt DP-protein fosforylerende og modulerende middel særpreget ved de trekk som står i krav 6's karakteriserende del. Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som gjenkjenner DP-1 i hypofosforylert tilstand i samsvar med krav 8, samt et fragment av et DP-protein i samsvar med kravene 11 og 12.
Den cellulære transkripsjonsfaktor DRTF1/E2F integrerer cellesyklusbegivenneter med transkripsjonsapparatet gjennom sin sykliske interaksjon med viktige regulatorer for cellulær proliferasjon. To sekvensspesifikke DNA-bindende proteiner, DP-1 og E2F-1, er komponenter av DRTF1/E2F som virker synergistisk med en DP-1/E2F-1 heterodimer. I foreliggende søknad er det vist at DP-1 er en hyppig, muligens universal, komponent av DRTF1/E2F i 3T3-celler, siden den er til stede i alle former av DNA-bindende aktivitet som opptrer ved cellesyklusprogresjon. Ytterligere vil det fosforylerte DP-l-polypeptid undergå et fosforyleringsavhengig mobilitetsshift i løpet av cellesyklusen, hvilket antyder at fosforyleringsnivået er regulert gjennom cellesyklusprogresjonen. Dette kan benyttes i assayer for å de-tektere endringer i den fosforylerte form av DP-1. Et C-terminal område i DP-1 kan virke med pRb som innenfor ram-men av DP-1/E2F-1 heterodimeren bidrar til effektiv pRb binding. DP-1/E2F-1 heterodimeren virker spesifikt med adenovirus type 5 E4 orf 6/7-protein for å produsere en DNA-bindende aktivitet som binder kooperativt til og aktiveres transkripsjonelt gjennom to passende posisjonerte E2F-seter på en måte som ligner regulering av DRTF1/E2F ved E4 orf 6/7 under adenovirusinfeksjon. En kan også konkludere at DP-1 er en hyppig og cellesyklusregulert komponent av DRTF1/E2F, og at den i DP-1/E2F-1 heterodimeren er funksjonelt viktig for gjenkjenning av pRb og E4 orf 6/7-protein.
De molekylære begivenheter som inntreffer i løpet av cellesyklusen må integreres med transkripsjonsapparatet, slik at genekspresjonen kan synkroniseres med cellesyk-lusprogresj on.
Kontroll av cellesyklus er fundamental for vekst og opp-rettholdelse av eukaryote organismer, inklusive pattedyrs og amfibiske. Før en typisk celle kan dele seg (gjennomgå mitose), må den doble sin masse og duplikere hele sitt innhold. Mesteparten av arbeidet involvert i forberedelse til deling foregår usynlig under vekstfasen av cellesyklus, kalt interfasen. Interfasen er delt i tre perioder. GL betegner bruddet mellom fullførelse av tidligere deling og start av DNA-syntese. Varigheten av Gx kan variere, og celler kan holdes i hvilende tilstand i timer, dager eller lengre. Celler i en slik hvilende fase sies noen ganger å være i G0-fasen.
Etter fasen går cellene inn i S-fasen, hvori DNA synte-tiseres. Dette påfølges av et ytterligere brudd, G2, som følges av en M-fase,- dvs. mitose. Generelt er cellene for-pliktet til mitose idet de går inn i S-fasen.
Et viktig aspekt for å forstå og kontrollere ukontrollert cellevekst er følgelig forståelsen av de mekanismer celler gjennomgår ved overgang fra Gx- til S-fasen.
Nylig har en transkripsjonsfaktor kalt DRTF1 eller E2F blitt identifisert og vist å bindes til pRb, proteinpro-duktet av gener som disponerer for retinoblastom, et anti-onkogen eller tumorsuppressoren (se for eksempel Wagner og Green, Nature, 352, 189-190, 1991). Den allmenne oppfat-ning er at den cellulære transkripsjonsfaktor DRTF1/E2F fungerer som en nøkkelkomponent i cellesykluskontroll fordi den assosieres med viktige cellesyklusregulerende proteiner, så som retinablastom genproduktet (pRb), pl07, cykliner og cyklinavhengige kinaser, samt at dens transkripsjonene aktivitet moduleres av visse virale onkoproteiner, så som adenovirus Ela, SV40 stor T antigen og det humane papillomavirus E7-protein.
Det er generelt antatt at den cellulære transkripsjonsfaktor DRTF1/E2F spiller en vesentlig rolle ved koordinering av cellesyklusprogresjon gjennom sine interaksjoner med viktige regulatorer av celleproliferasjon, så som retino-blastomtumorsuppressor genprodukt (pRb), det pRb-relaterte protein pl07, cykliner og p33<cdka> (Bandara og La Thangue, 1991; Bandara et al., 1991, 1992; Chellappan et al., 1991; Mudryj et al., 1991; Devoto et al., 1992). DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet er ytterligere regulert ved cellesyklusprogresjon (Mudryj et al., 1991, Shirodkar et al., 1992; Schwartz et al., 1993) og differensiering (La Thangue og Rigby, 1987), prosesser som korrelerer med den transkripsjonene aktivitet av noen av genene som inneholder E2F-seter i deres kontrollsekvenser, for eksempel di-hydrofolat reduktase, DNA polymerase å og cdc2 (Means et al., 1992, Blake og Azizkhan, 1989, Dalton, 1992). Dens aktivitet er også regulert ved visse virale onkoproteiner, så som adenovirus Ela protein, SV 4 0 stor T-antigen og det humane papillomavirus E7-protein, som avsondrer pRb og de andre assosierte proteiner fra DRTF1/E2F og konverterer det fra en transkripsjonen inaktiv form til en aktiv form (Hiebert et al., 1992; Zamanian og La Thangue, 1992, 1993) . Det er sannsynlig at deregulering av DRTF1/E2F er viktig for de transformerende og immortaliserende funk-sjoner av disse onkoproteiner (Bagchi et al., 1991; Bandera og La Thangue, 1991; Zamanian og La Thangue, 1992).
Et annet viktig trekk ved DRTF1/E2F vedrører dens regulering av adenovirusinfiserte celler, hvori dens aktivitet er modulert ved en direkte interaksjon med et viralt protein (Huang og Hearing, 1989; Marton et al., 1990). Grun-net kooperativ gjenkjenning av de to E2F-setene i E2a-promotoren, er således binding av DRTF1/E2F til adenovirus E2a- promotoren i adenovirusinfiserte celler mye mer sta-bil enn i ikke-infiserte celler (Hardy og Shenk, 1989; Raychaudhuri et al., 1990). Denne kooperativitet krever at E2F-bindingssetene har korrekt avstand og er korrekt ori-entert, slik som anordningen som opptrer i E2a promotoren (Hardy og Shenk, 1989). Det virale protein som er ansvar-lig for denne effekt, er orf 6/7-proteinet, et produkt av E4-regionen, som samvirker direkte med DRTF1/E2F i infiserte celler (Huang og Hearing, 1989; Martom et al. 1990). Siden denne interaksjonen medfører kooperativ gjenkjenning, er det sannsynlig at en funksjon av 6/7-proteinet er å avsondre to DNA-bindende enheter av DRTF1/E2F i et kompleks, slik at gjenkjenning av virale promotorer favori-seres over cellulære. Imidlertid gjenkjennes sammenset-ningen av DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet av orf 6/7, og betydningen av orf 6/7-indusert kooperativitet for transkripsjonen aktivitet er enda ikke formelt kartlagt.
En viss fremgang har blitt gjort med hensyn til å identifisere proteiner som omfatter DRTF1/E2F. Det første som ble karakterisert, referert til som E2F-1, ble isolert gjennom sin evne til å binde direkte til pRb (Helin et al., 1992: Kaelin et al., 1992, Shan et al., 1992). I motsetning til dette ble DP-1 definert som en komponent av DRTF1/E2F etter biokjemisk rensing av DRTFl fra F9 embry-onal karsinom (EC) celler (Girling et al., 1993).
DP-1 er også en komponent av HeLa-celle DRTF1/E2F (Bandara et al., 1993) og inntreffer både i pRb- og pl07-assosiert DRTF1/E2F (Girling et al., 1993). Både E2F-1- og DP-l-proteiner inneholder et lite område med likhet (Girling, et al., 1993), hvilket tillater dem å reagere med hverandre for å danne en heterodimer DNA-bindende aktivitet som på en synergistisk måte effektivt gjenkjenner og aktiverer transkripsjon gjennom E2F-bindingssetet (Bandara et al., 1993; Helin et al., 1993). Selv om DP-1/E2F-1 heterodimeren er til stede i HeLa celler (Bandara et al., 1993), er ikke fordeling og regulering av DP-1 proteinet kjent.
Flere ulike egenskaper ved DP-1 er rapportert i foreliggende oppfinnelse. I 3T3-celler er DP-1 en hyppig, men ikke generell, DNA-bindende komponent av DRTF1/E2F. Videre gjennomgår fosforylert DP-1 et fosforyleringsavhengig mobilitetsskift i løpet av cellesyklusprogresjon. DP-1/E2F-1 heterodimeren interagerer effektivt med pRb, og et domene i DP-1 er definert som kan bindes til pRb, og som påvirker interaksjonen mellom pRb og heterodimer, muligens ved direkte binding. Adenovirus orf 6/7-proteinet bindes til DP-1/E2F-1-heterodimeren, hvilket resulterer i en DNA-bindende aktivitet som har de biokjemiske og funksjonelle egenskaper av den adenovirusinfiserte celle dannet av DRTF1/E2F. DP-1 er således en hyppig komponent av DRTF1/E2F, hvis fosforyleringsnivå reguleres under cellesyklusen og som er funksjonelt viktig for gjenkjenning av pRb og orf 6/7 proteinet.
EP 669,976 beskriver en screeningsmetode for deteksjon av agenser som er i stand til å forstyrre dannelsen av, eller hemme aktiviteten av et kompleks mellom proteinene DP-1 og E2F. Slike agenser vil være nyttig for behandling av pro-liferativ- eller virussykdom. Aminosyresekvensen av DP-1 polypeptid er tilveiebrakt som sekv. ID nr.:2.
Sekvensen av cDNA-kodende DP-1 er presentert her som sekv. ID nr. 1. DP-1 er ytterligere beskrevet i den internasjo-nale patentpublikasjon WO-A-94/10307, hvorav innholdet er inkorporert ved referanse heri.
BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse er spesielt basert på at det er funnet at DP-1 er fosforylert under cellesyklusen og at DP-1 bindes til DNA i den hypofosforylerte tilstand. Med andre ord har ikke DP-1 i fosforylert tilstand samme affinitet for DNA som når den er i ikke-fosforylert eller hypofosforylert tilstand. Dette kan utvides til å omfatte andre DP-proteiner (f. eks. DP-2 og DP-3), hvis aktivitet tilsynelatende også er regulert ved fosforylering.
Foreliggende oppfinnelse anvender denne oppdagelsen til å utprøve agenser som forebygger eller inhiberer hypofosforylering, f. eks. av DP-1, eller som øker fosforylering av DP-proteiner, så som DP-1. Slike agenser kan anvendes til å forhindre eller forsinke cellesyklusens overgang til S-fasen fra G1. Antistoffer mot de regioner av DP-1 som gjennomgår en endring i fosforylering under cellesyklusen, kan også anvendes i slike forsøk og for å identifisere proliferative celler.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således i et før-ste aspekt et assay for et potensielt veksthemmende, inhiberende eller -økende middel, hvilket assay omfatter: (i) å bringe middelet i kontakt med en celle som inneholder et DP-protein; og (ii) å observere fosforyleringstilstanden av DP-proteinet.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også en agens som kan erholdes fra et slikt assay. Agensen kan anvendes i en metode for kontroll av ukontrollert celleformering. En slik metode kan omfatte administrering av effektiv mengde agens til et individ som gjennomgår ukontrollert celleproliferasjon.
I en enklere form omfatter et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse: (i) å tilveiebringe et ekstrakt fra en celle som inneholder et DP-protein;
(ii) å bringe ekstraktet i kontakt med middelet; og
(iii) å observere f osf oryleringst Ustanden av DP-proteinet.
I en annen utførelse av oppfinnelsen inneholder celleekstraktet et DP-protein i hypofosforylert tilstand, og i en annen utførelse er sistnevnte fosforylert. Assayet kan benyttes til å screene agenser som har evnen til å aktivere kinasen som fosforylerer DP-1, for derved å redusere dens affinitet for DNA.
Et videre aspekt ved oppfinnelsen vedrører et assay for et potensielt DP-protein-fosforylerende og -modulerende middel, hvilket assay omfatter: (i) å bringe et medium som inneholder et hypofosforylert eller et fosforylert DP-protein og et fosforylerende eller defosforylerende enzym i kontakt med middelet; og (ii) å observere fosforyleringstilstanden av DP-proteinet.
Dette assayet kan anvendes til å screene agenser som har evnen til å opprettholde DP-1 i fosforylert tilstand eller alternativt forhindre hypofosforylering av DP-l.
Agenser som kan inhibere fosforylering, kan være en kina-seantagonist (en fosforylator) eller en fosfataseagonist (en defosforylator), mens agenser som aktiverer, stimuler-er eller fremmer fosforylering kan være kinaseagonister eller fosfataseantagonister. Agenser som er betraktet heri kan innbefatte fragmenter, mutanter og homologer av kinaser eller fosfataser.
Kilder for kinaser og fosfataser er rekombinante proteiner, rensede proteiner eller biokjemiske fraksjoner fra celleekstrakter.
Et "DP-protein" som anvendt heri, refererer ikke bare til DP-1, selv om dette er foretrukket, men også til DP-2 og DP-3 og andre relaterte proteiner av samme familie med samme aktivitet. Selv om DP-1 er det valgte protein i henhold til foreliggende oppfinnelse, er oppfinnelsen ikke begrenset til DP-1 (dersom ikke annet er påkrevd fra sammenhengen).
Benevnelsen "DP-1" i forbindelse med assayer, kan omfatte aminosyresekvensen av sekv. ID nr. 2, homologer derav og fragmenter av sekvensen og dens homologer, som evner å fungere som et pattedyrs transkripsjonsfaktor. Spesielt kan benevnelsen "DP-1" omfatte: (a) proteinet med sekv. ID nr. 2;
(b) en allel variant eller artshomologer derav,
(c) et protein som er minst 70 % homologt med (a),
(d) et fragment av ethvert av (a) og (c) som evner å danne kompleks med E2F-1, E2F-2, E2F-3, E2F-4 eller E2F-5, (e) et fragment av et hvilket som helst av (a), (b) eller (c) med minst 15 aminosyrer.
Disse proteiner kan være i hypofosforylerte, delvis fosforylerte eller fullstendig fosforylerte former. Også innbe-fattet er merkede former av slike polypeptider (se side 11) .
Alle polypeptider omfattet av denne definisjonen refereres heretter til som DP-1, så fremt sammenhengen ikke spesifikt påkrever noe annet. Benevnelsene "DP-2" og "DP-3" skal oppfattes likeledes, dog med del (a) endret slik at den refererer til aminosyresekvens av henholdsvis DP-2 og DP-3.
En allel variant vil være en variant som opptrer naturlig i murine dyr og som vil regulere genekspresjon på en måte som i det vesentlige ligner proteinet av det naturlige protein for eksempel sekv. ID nr. 2 for DP-1. Tilsvarende vil en artshomolog være det ekvivalente protein som opptrer naturlig i andre arter, inklusive mennesket, og som utfører en ekvivalent funksjon i disse artene sammenlignet med DP-proteinet (for DP-1 sekvensen av sekv. ID nr. 2) i murine dyr. Innen enhver art kan en homolog eksistere som flere allele varianter, og disse vil betraktes som homologe av proteinet (for eksempel sekv. ID nr. 2 for DP-1). Allel varianter og artshomologer kan erholdes i henhold til de påfølgende metoder, som heri er beskrevet for pro-duksjon av polypeptidet for eksempel av sekv. ID nr. 2 for DP-1, og slike prosedyrer utføres på en egnet cellekilde, f. eks. fra en gnager som bærer en allel variant eller andre arter. Da polypeptidet tilsynelatende er evolusjons-messig konservert, vil det også være mulig å anvende for eksempel en DP-l-nukleotidsekvens for å probe et bibliotek laget fra en gnager eller andre celler for å oppnå kloner som koder for de allel varianter eller fra andre arter. Ved hjelp av konvensjonelle teknikker kan klonene mani-puleres for å identifisere polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, hvilke peptider da kan produseres ved tidligere kjente rekombinante eller syntetiske teknikker. Foretrukne artshomologer innbefatter pattedyrs eller amfibiske artshomologer.
Et protein som er minst 70 % homologt med sekvensen (for eksempel sekv. ID nr. 2), vil fortrinnsvis være minst 80 % eller 90 %, og mer foretrukket minst 95 % homolog med proteinet (for eksempel sekv. ID nr. 2) over en regiom på minst 20, fortrinnsvis 30, for eksempel minst 40, 60 eller 100 eller flere sammenhengende aminosyrer. Metoder for å måle proteinhomologi er velkjent innenfor faget, og det vil forståes av fagmannen at homologi i denne sammenhengen er basert på aminosyreidentitet (noen ganger referert til som "hard homologi").
Generelt vil fragmenter av DP-proteinet (for eksempel sekv. ID nr. 2 for DP-l) eller dets allele varianter aller artshomologer derav som evner å danne et kompleks med ett av E2F-proteinene E2F-1 eller E2F-5, være minst 10, fortrinnsvis 15, for eksempel 20, 25, 30, 40, 50 eller 60 aminosyrer i lengden.
Det vil være mulig å bestemme om fragmentene danner et kompleks med et E2F-protein ved å bringe E2F-proteinet og fragmentet under betingelser hvor E2F-proteinet og DP-proteinet normalt danner en transaktiverende transkripsjonsfaktor (dersom passende) og fastslå hvorvidt et kompleks er dannet. Dette kan gjøres for eksempel ved å måle evnen komplekset har til å binde et E2F-bindende sete in vi tro eller alternativt ved å bestemme molekylvekt av det an-tatte komplekset ved for eksempel SDS-PAGE.
Foretrukne fragmenter innbefatter de som evner å danne et transaktiverende kompleks med E2F-1 eller dets beslektede familiemedlemmer. For eksempel kan fragmentet tilsettes E2F-1 i nærvær av en reportergenkonstrukt tilpasset slik at den aktiveres av DP-protein/E2F-l-komplekset. Et slikt eksperiment vil bestemme hvorvidt fragmentet har den på-krevde aktivitet.
DP-proteinet kan merkes med en egnet markør som muliggjør detektering av polypeptidet. Egnede markører innbefatter radioisotoper, f. eks. <12>SI, enzymer, antistoffer og link-ere, så som biotin.
DP-proteinet (eventuelt merket) kan også fikseres i en fast fase som for eksempel veggen i en immunassayskål. Celleekstraktet kan settes til skålen eller annen fast-faseomgivelse i nærvær av agensen for å bestemme om hypofosforylering eller fosforylering er hemmet eller for-sterket .
I det første aspekt ved foreliggende oppfinnelse kan cellen som agensen bringes i kontakt med,, være enhver celle hvori DP-proteinet er uttrykt. Dette innbefatter pattedyrs-(inklusive humane, primat- og gnager-) celler og amfibiske celler (innbefattende Xenopus celler).
Cellen kan være en celle som er bevart i en in vitro kultur. Ved utførelsen av assayet kan cellen holdes i en hvilende tilstand (f. eks. i G0) . Dette kan oppnåes ved å dyrke cellene i et serumfritt medium. Teknikker for å oppnå dette er velkjente innenfor faget, og egnede media er kommersielt tilgjengelige. Dette vil være ønskelig idet assayet kan utføres på en populasjon av celler som er holdt i en synkron kultur, slik at påvirkningseffekter av agensen på fosforyleringstilstanden av DP-proteinet ved ethvert spesielt punkt i cellesyklusen kan bestemmes. Cellen kan være en primærcelle, en transformert celle eller en tumorcelle.
DP-proteinet kan være cellens native protein, eller proteinet kan være uttrykt ved en rekombinant DNA-konstrukt inni cellen. Ekspresjonen kan være transient fra et eks-trakromosomalt bestanddel eller fra et stabilt integrert rekombinant DNA i cellen. Konstruktene kan omfatte et DNA som koder for et DP-protein som er operativt bundet til en promotor kompatibel med vertscellen. Slike konstrukter kan lages ved anvendelse av konvensjonelle rekombinante DNA-teknikker så som de angitt i Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).
Ved alle aspekter av foreliggende oppfinnelse kan fagmannen måle fosforyleringstUstanden av DP-proteinet ved hjelp av tilgjengelig egnet teknikk.
For eksempel avhenger DP-proteinets mobilitet på en SDS/- polyakrylamidgel av fosforyleringstUstanden. På slike ge-ler har DP-1 tilsynelatende en molekylvekt på omtrent 55.000. Imidlertid opptrer proteinet i to former som be-nevnes "p55U" (øvre) og "p55L" (nedre). Formene er ulike i deres grad av fosforylering; p55D har et høyere fosforyleringsnivå enn p55L. I andre typer celler kan 55 kD proteinet opptre i andre former som også skyldes ulikheter i fosforyleringsgrad. Følgelig kan elektroforese av et ekstrakt fra cellene som undersøkes i henhold til foreliggende oppfinnelse og deretter immunblottes, anvendes for å bestemme de relative mengder av p55L og p55U i en prøve og således fosforyleringstilstand av DP-1.
DP-proteinet (f. eks. DP-1) kan også undersøkes ved å dyrke celler i et medium som inneholder en merket fosfatgruppe som kan festes til DP-l via de naturlige prosesser i cellen. Mengden av merket DP-1 i nærvær eller fravær av agensen kan deretter måles for eksempel ved immunfelling av DP-1 ved bruk av et anti-DP-1 antistoff og påfølgende måling av mengden av merket presipitat. DP-l antistoffer kan erholdes ved referanse til WO-A-94/10307.
En annen metode for å undersøke DP-protein er å måle dets
evne til å danne et kompleks med E2F-1 (et annet medlem av E2F familien) og eventuelt bestemme kompleksets evne til å aktivere transkripsjon. Dette kan gjøres med referanse til teknikkene beskrevet i WO-A-94/10307.
I en utførelsesform av oppfinnelsen kan agensen som utprø-ves, undersøkes ved bruk av et DP-protein (referanse til et fragment innbefatter syntetiske eller rekombinante peptider som tilsvarer et slikt fragment) som har blitt fosforylert. Ved denne utførelsesformen kan cellen, eller et ekstrakt derav, bringes i kontakt med en agens i nærvær av et fosforylert fragment, og grad av inntruffet defosforylering av fragment kan måles.
Fragmentet fra f. eks. DP-1 avledes fortrinnsvis fra den C-terminale område av DP-1. For eksempel kan den innbefatte et fragment på 20-50 aminosyrer (f. eks. 25, 30 eller 40 aminosyrer) avledet fra en sammenhengende sekvens innenfor de endelige 100 (f. eks. 90, 80, 60, 50, 40 eller 30) aminosyrene ifølge sekvensen sekv. ID nr. 2. Et foretrukket fragment er aminosyre 385-400 i denne sekvensen, og peptider som omfatter denne regionen, for eksempel 375-410, 375-405, 375-400, 380-410, 380-405, 380-400, er også ønskelige.
Det er funnet at et monoklonalt antistoff (anti-DP-1 (D)) fremskaffet mot et syntetisk peptid (D), tilsvarende residuene 385-400 i sekv. ID nr. 2, gjenkjenner DP-1 i dets hypofosforylerte tilstand (siden det syntetiske peptid ikke er fosforylert), men binder mindre bra til DP-1 når denne er fosforylert. Dette antyder at hypofosforylering av DP-1 i det minste skjer delvis innenfor denne regionen av proteinet.
Ved anvendelse av et DP-l-fragment i et assay, kan fragmentet følgelig være fosforylert i et egnet fosforyleringssete, for eksempel 388Thr eller 391Ser. Fosforylering kan utføres enzymatisk ved anvendelse av egnet kinaseenzym eller kjemisk. Fosforyleringsteknikker er kjent innenfor faget.
DP-proteinet, eller fragmentet derav, kan være fosforylert med en merket, for eksempel radiomerket, fosfatgruppe. Graden av defosforylering som inntreffer i nærvær av agens, kan deretter måles ved egnede teknikker. For eksempel kan DP-proteinet gjenvinnes fra blandingen av celle eller ekstrakt ved affinitetskromatografi eller separasjon på basis av størrelse på en egnet matriks, for eksempel en gel eller HPLC-kolonne, og mengden av merket DP-protein måles. Mengde av DP-1 som fortsatt er merket, kan sammen-lignes med en kontroll hvor ingen agens er benyttet. Mengden av fritt merket fosfat i medium kan også måles. En agens som er aktiv i forebygging av hypofosforylering av DP-proteinet, vil redusere mengden av fritt fosfat frigitt fra DP-l-proteinet.
For å forenkle opprensing og/eller deteksjon av DP kan merkelappen være et protein (f. eks. GST) koplet til DP-proteinet (for å danne et fusjonsprotein).
Fosforyleringsstatus av DP-1, DP-2, DP-3 kan også måles ved anvendelse av et antistoff som gjenkjenner den ikke-fosforylerte, men ikke den fosforylerte form. Som tidligere nevnt har det blitt fremskaffet et antistoff mot et syntetisk peptid som tilsvarer residuene 385-400 i sekv. ID nr. 2 {heretter referert til som peptid D), hvilket antistoff gjenkjenner DP-1 i dets hypofosforylerte tilstand. Et slikt antistoff kan lages ved bruk av stand-ardteknikker for pro-duksjon av hybridomaer og anvendes i et assay ifølge foreliggende oppfinnelse ved først å tilsette det merkede DP-1 og kandidatagens til cellen, eller ekstraktet derav, å inkubere den erholdte blanding (typisk i 0,5-60 min, f. eks. 1-30 eller 5-15 min, i mellom 10-40°C, for eksempel 20, 25, 30 eller 37°C) og deretter sette antistoffet til blandingen for å bestemme grad av inntruffet defosforylering av DP-1. Antistoffet bør settes til startmengden av DP-1 i molart overskudd slik at all produsert mengde umerket DP-1 bindes.
Alternativt kan antistoffet anvendes på analog måte for å bestemme fosforyeringsgrad når DP-proteinet undersøkes i nærvær av et ekstrakt som inneholder en aktivitet, hvori kinasen som fosforylerer et DP-protein er til stede.
Mengden av agens som anvendes i assayet kan variere mye, avhengig av faktorer som for eksempel dens potensielle ak-tivitetsnivå, toksisitet eller løselighet. Typiske konsen-trasjoner av agens når denne bringes i kontakt med cellen eller ekstrakter derav, vil være fra om lag 1 nM til 100 mM, for eksempel 10 nM til 10 mM.
Når assayet utføres med bruk av et fragment av et DP-protein, vil mengde fragment være fra om lag 1 nM til 100 mM, for eksempel 10 nM til 10 mM.
Egnede kandidatagenser innbefatter peptidfragmenter av DP-1 (produsert ved både syntetiske eller rekombinante metoder) , inklusive C-terminal fragmenter. Slike fragmenter innbefatter de ovenfor nevnte C-terminale fragmenter. Agenser som har aktivitet i assayet, kan foredles og ut-vikles til å produsere agenser med høyere aktivitet ved hjelp av metoder som molekylær modellering eller peptid-scanning.
Andre agenser innbefatter dem som kan påvirke aktivitet av enzymer som kan endre DP-proteinets fosforyleringstilstand. Aktuelle enzymer innbefatter kinaser {som fosforylerer) og fosfataser (som defosforylerer). Følgelig kan kandidatagenser være både agonister og antagonister av kinaser og/eller fosfataser og kan være i stand til å modu-lere fosforylering av DP-protein.
Celleekstrakt for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse er egnede ekstrakter fra de oven fornevnte celle-typer, fortrinnsvis erholdt fra celler i synkrone kulturer, og er følgelig i et definert stadium av cellesyklusen, f. eks. Gx eller S. Dette innbefatter celler transformert eller transfektert med et rekombinant DNA-kodende DP-protein. Ekstraktene kan erholdes fra celler som har blitt merket med radioaktiv fosfatase, og fosforyleringstilstand av DP-1 kan måles i henhold til metoden beskrevet i opp-finnelsens første aspekt. Metoder for fremstilling av egnede ekstrakter av cellulære protein er velkjent innen faget.
Et femte aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et monoklonalt antistoff som kan erholdes ved å bruke et peptid som tilsvarer det C-terminale området av seq. ID No 2 som immunogen, hvilket antistoff gjenkjenner DP-proteinet i dets hypofosforylerte tilstand, men bindes dår-ligere til DP-proteinet når det er fosforylert. Dette antyder at hypofosforylering av DP-1 inntreffer i minst én region av proteinet. Påtenkte antistoffer er følgelig de som kan bindes til hypofosforylert DP (dvs. uten fosfat-grupper), men ikke til den fosforylerte form.
Det C-terminale region av DP-1 er fortrinnsvis et fragment av 20-50 aminosyrer (f. eks. 25, 30 eller 40 aminosyrer) avledet fra en kontinuerlig sekvens innenfor de endelig 100 (f. eks. 90, 80, 60, 50, 40 eller 30 aminosyrer) av sekvens ID No. 2. Et foretrukket fragment er aminosyrer 385-400 i denne sekvensen, og peptider som omfatter dette området, f. eks. 375-410, 375-405, 375-400, 380-410, 380-405, 380-400 foretrekkes også. Dersom sekvensen 385-400 anvendes som et immunogen {peptid D), erholdes et monoklonalt antistoff anti-DP-l (D), hvis fremstilling er beskrevet senere.
Det femte aspektet vedrører også antistoffer som er spesifikt for, eller fremskaffet ved anvendelse av et immunogen som inneholder et fosforyleringssete, og slike antistoffer kan følgelig binde seg til en del av et DP-protein som omfatter et fosforyleringssete. Spesielt er sekvensen 385-400 av DP-1 nevnt her da den inneholder fosforylerings-setene 388Thr og 391Ser (se Figur 9).
Det monoklonale antistoffet kan avledes fra en egnet pat-tedyrskilde, f. eks. murin eller rotte. I sammenheng med oppfinnelsen, dersom ikke annet er spesifisert, innbefatter benevnelsen "antistoff" som anvendt heri, fragmenter av hele antistoffer som beholder deres bindingsaktivitet for et tumormålantigen. Slike fragmenter innbefatter Fv, F(ab<1>) og F(ab')a, samt enkelkjedede antistoffer. Antistoffene og fragmentene derav kan ytterligere være hu-maniserte antistoffer, f. eks. som beskrevet i EP-A-0239400.
Antistoffet kan produseres ved konvensjonelle hybridomtek-nikker eller, som i tilfelle med modifiserte antistoffer eller fragmenter, ved rekombinant DNA-teknologi, f. eks. ved ekspresjon i en egnet vertsvektor av en DNA-konstrukt som koder for det modifiserte antistoff eller fragment derav som er operativt bundet til en promotor. Egnede vertsceller innbefatter bakterielle (f. eks. E. coli), gjær-, insekt- og pattedyrsceller.
Når assayet ifølge foreliggende oppfinnelse involverer anvendelse av en vektor introdusert i en celle som koder for et DP-protein, kan nukleotidsekvensen som koder for DP innbefatte en kontinuerlig sekvens av nukleotider som evner å hybridiseres selektivt til f. eks. sekv.. ID nr. l eller til komplementet av sekv. ID nr. 1. Nukleotidsekvensen kan omfatte DNA eller RNA.
En nukleotidsekvens som er i stand til å hybridiseres selektivt til DNA av seq. ID nr. 1 vil generelt være minst 70 %, fortrinnsvis minst 80 eller 90 %, og mer foretrukket minst 95 % homolog med DNA av sekv. ID nr. 1 over en region på minst 20, fortrinnsvis minst 30, for eksempel minst 40, 60, 100 eller flere kontinuerlige nukleotider. Nukleotidsekvensen kan også omfatte en sekvens som koder for et protein av sekv. ID nr. 2 eller et fragment derav.
En nukleotidsekvens, så som en DNA-nukleotidsekvens, kan fremstilles rekombinant, syntetisk, eller ved enhver metode som er tilgjengelig for fagmannen. Den kan også klo-nes ved referanse til teknikkene gitt i WO-A-94/10307.
Agenser som har blitt identifisert enten som en stimulator for fosforylering av et DP-protein eller inhibitor av ut-viklingen av hypofosforylering, kan tilveiebringes som farmasøytiske formuleringer. Slike formuleringer omfatter agensen sammen med et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff eller fortynningsmiddel.
Farmasøytisk akseptable bærerstoff eller fortynningsmidler innbefatter de som er anvendt i formuleringer for oral, rektal, nasal, topiske (inklusive bukkal og sublingval), vaginal eller parenteral (inklusive subkutan, intramusku-lær, intravenøs, intradermal, intratekal og epidural) administrasjon. Formuleringene kan med fortrinn presenteres i form av enhetsdoser og kan fremstilles ved enhver metode kjent innen farmasien. Slike metoder omfatter assosiering av den aktive bestanddel med bærerstoffet, som består av en eller flere ytterligere bestanddeler. Generelt fremstilles formuleringene ved å assosiere den aktive bestanddel uniformt godt med flytende bærere eller finfordelte faste bærere, eller begge, og deretter forme produktet dersom dette er nødvendig.
For eksempel omfatter formuleringer som er egnet for pa-ranteral administrasjon, vandige og ikke-vandige sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde anti-oksidanter, buffere, bakteriostater og oppløsninger som holder formuleringene isotone med blodet til tiltenkt mottaker, og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som kan omfatte suspenderende agenser og fortykningsmidler; og li-posomer eller andre mikropartikulære systemer som er designet for å sikte polypeptidet inn på blodkomponenter eller ett eller flere organer.
Agenser identifisert i henhold til foreliggende oppfinnelse og de ovenfor nevnte sammensetninger derav kan anvendes til behandling, regulering eller diagnostisering av tilstander, innbefattende proliferative sykdommer i patte-dyr, inklusive mennesker. Slike tilstander inkluderer dem som er assosiert med abnormal (f. eks. ved et uvanlig høyt eller lavt) og/-eller avvikende (f. eks. ved mutasjon i gensekvensen) ekspresjon av en eller flere transkripsjons-faktorer, så som E2F faktor (klonet av Helin et al.) eller proteinet av sekv. ID nr. 2 eller E2F-l-proteinet eller relaterte familiemedlemmer. Tilstandene innbefatter også dem som er fremkommet ved abnormal ekpresjon av et gen, hvis genprodukt er regulert ved proteinet med sekv. ID nr. 2. Behandling eller regulering av tilstander med de ovenfor nevnte agenser og sammensetninger vil normalt omfatte administrasjon av en effektiv mengde av et polypeptid, antistoff, fragment derav eller sammensetning til en mottaker som trenger slik behandling.
En gruppe av foretrukne agenser er polypeptid aminosyrere-gion 160-220 av sekv. ID nr. 2. Denne regionen av proteinet er homolog med om lag 4 0 % av en lignende region av E2F-1-proteinet beskrevet av Helin et al. (ibid.), og begge regioner er antatt alfaheliske regioner. Selv om vi ikke ønsker å binde oss til en bestemt teori, er det antatt at heterodimerisering av E2F og DP-1 er mediert gjennom disse homologe regioner.
Et sjette aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et fragment av et DP-protein som omfatter et fosforyleringssete (som dersom det er ønsket, kan være fosforylert eller ikke-fosforylert). Egnede seter inkluderer 388Thr og 393Ser funnet i DP-l. Foretrukne fragmenter har allerede blitt nevnt.
FIGURENE
Foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet ved eksempler med referanse til følgende eksempler og tilhørende tegninger, som skal illustrere oppfinnelsen, men ikke tol-kes som begrensende. I tegningene:
Figur 1 viser karakterisering av DP-1.
Anti-DP-1 (A) ble undersøkt for reaktivitet med et F9 EC celleekstrakt (spor 1 og 2) i nærvær av enten det homologe peptid A (spor 1) eller kontrollpeptid 1 ved immunblotting. p55 er indikert; p55U er det dominerende polypeptid, men p55L er så vidt synlig. <*> antyder p65 (se tekst). Tilstedeværelse av p55 i ulike fraksjoner som inneholder renset DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet, er vist i spor 4, 5 og 6 (til sammenligning er p55 og p65 i et F9 EC celleekstrakt vist i spor 3); DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet ble renset som tidligere beskrevet (Girling et al., 1993). Det bør noteres at opptreden av p55 korrelerer med DRTF1/- E2F DNA-bindende aktivitet.
Figur 2 viser cellesyklusregulering av DP-1 i 3T3-celler. a) DP-l er en hyppig DNA-bindende komponent av DRTF1/E2F under cellesyklusprogresjon: 3T3-cellene ble sultet for serum og deretter stimulert til å fortsette gjennom cellesyklusen. Kulturene ble høstet hver 4 t, ekstrahert og undersøkt (om lag 8 |^g) for DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet (spor 2-17). I parallell-kulturer ble progresjon inn i S-fasen undersøkt ved in-korporering av BrdU, hvilket antyder at hovedparten av cellesyklusen gikk inn i S-fasen mellom 8 og 12 t. Nærvær av DP-1 i DRTF1/E2F DNA-bindende komplekser ble testet ved å vurdere effekten av anti-DP-1 (A) (spor 2-17) i nærvær av, en kontroll (peptid 1; spor 10-17) eller det homologe peptid (peptid A, spor 2-9). Anti-DP-1 reagerte med mesteparten av de detekterbare DRTF1/E2F DNA-bindende komplekser .
b) Cyklin A i DRTF1/E2F under 3T3-cellesyklusen:
De synkroniserte 3T3-celleekstraktene testet som beskrevet
over i a) ble undersøkt med hensyn på nærvær av cyklin A i DRTF1/E2F ved anvendelse av kanin polyklonal anti-cyklin A (nedre panel), som ble sammenlignet med preimmunt kontrol-lserum (øvre panel). Effekt av dette anticyklin A var å
forårsake raskere migrasjon av DRTFla-kompleks (det lang-somst migrerende). For eksempel var ikke det tregest migrerende DRTFla, som opptrådte mellom 0 og 4 t (indikert
ved ►), til stede i nærvær av anticyklin A (sammenlign spor 1,2 og 3 i øvre og nedre paneler).
c) pl07 i DRTF1/E2F under 3T3-cellesyklusen:
De synkroniserte 3T3-celleekstraktene ble undersøkt i nærvær av pl07 i DRTF1/E2F ved anvendelse av en pl07 monoklonalt antistoffsupernatant (nedre panel) som ble sammenlignet med effekten av en ikke-relatert monoklonal antistoff-supernatantkontroll (øvre panel). Anti-pl07-shiftet er indikert med pilen (>) . d) DP-1 er en cellesyklus-regulert DNA-bindende komponent av DRTF1/E2F: De synkroniserte 3T3-celleekstraktene ble immunblottet med anti-DP-1 (A) . Om lag 40 jag av hvert mikroekstrakt ble un-dersøkt. Legg merke til at to former av DP-1 p55 ble opp-løst og er referert til som p55U (øvre) og p55L (nedre). p55L ble synlig 8-12 t etter serumstimulering og korrelerte følgelig med induksjon av DRTFlb/c, den transkripsjonelt aktive form av DRTF1/E2F (spor 4 og 5 i (a)). Det kryssreagerende p65-polypeptid er angitt med <*>. e) Regulering av DP-1 under differensiering av F9 EC-celler: Anti-DP-l (A) ble immunblottet for å undersøke reaktivitet med ekstrakter fremstilt fra F9 EC (spor l) eller differensierte F9 PE-celler (7 dager etter induksjon av differensiering; spor 2). Bemerk at de to former av p55 (U og L) er påvisbare, og begge er nedregulerte under differensieringsprosessen. Det kryssreagerende polypeptid (<*>) forblir
4
uendret.
Figur 3 viser at DP-1 er et fosforylert protein.
a) Karakterisering av anti-DP-1 (D):
Anti-DP-l (D) ble undersøkt for dets effekter på DRTF1/E2F
DNA-bindende aktivitet (spor 2 og 3) i nærvær av et homologt peptid, D (spor 2) eller det ikke-relaterte peptid 1 (spor 3). Bemerk at anti-DP-1 reagerte med DRTF1/E2F (spor 3). Reaktivitet av anti-DP-1 (D) med et GST-DP-l-fusjonsprotein ble undersøkt i nærvær av det ikke-relaterte peptid, 1 (spor 4) eller homologt peptid, D (spor 5).
b) Immunpresipitering med anti-DP-1:
Immunpresipitering fra "P ortofosfat metabolsk radiomerkede cellelysater ble utført med anti-DP-1 (A) (spor 1 og 2} i nærvær av et homologt peptid, A (spor 1) eller et ikke-relatert peptid, 1 (spor 2). Polypeptider ble frigitt fra immunpresipitåtet dannet i nærvær av peptid 1 (spor 2) og reimmunpresipitert med anti-DP-1 (D) (spor 3 og 4) i nærvær enten av et homologt peptid, D (spor 3) eller et ikke-relatert peptid, 1 (spor 4). DP-l (p55) og p70 er indikert. Parallelt til dette ble DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet i den første immunpresipitering evaluert med anti-DP-1 (A) (spor 5 og 6), og etter reimmunpresipitering ble nevnte aktivitet evaluert med anti-DP-1 (D) (spor 7 og 8) i nærvær av de indikerte, konkurrerende peptider. Poly-peptidene oppløst i den andre immunpresipitering med anti-DP-1 (D) i nærvær av ikke-relatert peptid 1 eller peptid D (henholdsvis spor 10 og 9), ble sammenlignet med dem definert ved immunblotting med et F9 EC-celleekstrakt med anti-DP-l (A) (spor 11). Størrelsen på de immunpresipiterte p70 er vesentlig større enn det kryssreagerende polypeptid definert ved anti-DP-1 (A) (sammenlign spor 10 med 11; kryssreagerende polypeptid indikert ved •) . Standard molekylvekter er vist i spor 12. Bemerk at spor 1, 2, 3 og 4 er avledet ved å eksponere en enkelt polyakrylamid gel
(spor 1 og 2 er eksponert kortere) og at spor 9, 10, 11 og 12 er avledet fra samme polyakrylamid gel. c) Fosfatasebehandling av 3T3-celleekstrakter: Immunblotting ble utført med anti-DP-1 (A) med 3T3-celleekstrakter som hadde vært behandlet med (spor 2) eller uten (spor 1) fosfataser (se side 26). I kontrollbehand-lingen (spor 2) er både p55U og p55L oppløst sammen med et ikke-spesifikt polypeptid (<*>). Etter behandling med fosfatase (spor 1) ble p55L mindre synlig.
Figur 4 viser interaksjon mellom DP-1 og pRb.
a) Enten villtype (WT) DP-1 (om lag 10 ng; spor 3 og 9) eller ulike mutanter av DP-l-proteiner (om lag 10 ng, spor 4-7 og 10-13) som en heterodimer med E2F-1 (om lag 5 ng), ble undersøkt for E2F-sete DNA-bindende aktivitet og evne til å reagere med villtype GST-pRb<379>""<6> (om lag 5 ng; spor 2-7) eller GST-A22 (om lag 5 ng; spor 8-13); ble Rb-DP-1/E2F-1 komplekset indikert. Aktivitet av E2F-1 alene er vist i spor 2 og 8 og proben alene i spor 1. Bemerk at interaksjon av GST-pRb med DP-lA211/E2F-l-heterodimer ble kompromittert i forhold til villtype DP-l/E2F-l-kompleks. Nummereringen av DP-l-proteiner antyder posisjon av den C-terminale enhet; A73-340 mangler proteinsekvens fra N- og C-terminale regioner. b) De indikerte proteiner, DP-1 (spor 1-5 og 12), E2F-1 (spor 6-8), Ela (spor 9-11 og 13-15) og CREBPI (spor 16-19) ble transkribert og translatert in vi tro og undersøkt for aktivitet av binding til enten GST-protein (spor 2 og 19), GST-pRb (spor 3, 6, 9, 13 og 18), GST-C-»F(706) (spor 4, 7, 10, 14 og 17), GST-A22 (spor 5, 8, 11, 15 og 16), GST-E2F-1 (spor 12) eller Sepharose-kuler alene (spor 1).
Zn vitro translatert CREBPI er vist i spor 20, og spor 13, 14 og 15 viser redusert eksponering av spor 10, 11 og 12.
c) De indikerte DP-1 proteiner (WT, A341, A327, A73-340 og A211) ble in vitro transkribert og translatert og
undersøkt for aktivitet av binding til enten GST-pRb (spor 1-5) eller GST-protein alene (spor 6-10). Det in vitro translaterte A211-polypeptidet anvendt i dette eksperiment, er vist i spor 11. Bemerk at A211s evne til å reagere med GST-pRb er kompromittert. I b) og c) er om lag 2 ug av GST og GST-fusjonsprotein blandet med reticulocytt-lysat som inneholder det translaterte polypeptid. Alle polypeptider ble translatert med om lag ekvivalent effektivitet. Panelene vist i (c) ble avledet fra det samme eksperiment, og autoradiografene eksponert like lenge.
Figur 5 viser at adenovirus type 5 orf 6/7-protein binder til DP-l/E2F-l-heterodimer.
DNA-bindende aktivitet av in vitro translaterte DP-1- eller E2F-1 proteiner ble evaluert alene (spor 3 og 7 for DP-1 og spor 4 og 8 for E2F-1) eller sammen (spor 5 og 9-17) i nærvær av renset orf 6/7-fusjonsprotein (spor 6-13). Aktivitet av lysat alene ble evaluert i spor 2 og 6. Anti-DP-l (spor 11 og 15), anti-E2F-l (spor 12 og 16), anti-orf 6/7-protein (spor 13 og 17) eller et kontrollantistoff (c,-spor 10 og 14) ble inkludert i bindingsreaksjonen for å etablere nærvær av hvert protein i DP-l/E2F-l-heterodimeren. DP-1 og E2F-1 ble tilveiebrakt etter in vitro translasjon i kanin-reticulocyttekstrakter, og assayet ble ut-ført på adenovirus E2a-promotor (-96 til +68). Orf 6/7-dobbelsetekomplekset er indikert i spor 9 ved <*.>
Figur 6 viser at orf 6/7-protein regulerer transkripsjon drevet av DP-1/E2F-1-heterodimer på en promotoravhengig måte.
a) Oppsummering av konstrukter:
pDP-1, pE2F-l og pE4 orf 6/7 uttrykker proteiner av full lengde, og p3xWT inneholder tre E2F-seter anbrakt etter hverandre {Zamanian og La Thangue, 1992). Pilene antyder anordning av E2F-seter. b) Drosophila melanogaster SL2-celler ble transfektert med p3xWT og de indikerte ekspresjonsvektorer. Som tidligere observert, virker DP-1 og E2F-1 synergistisk i E2F-seteavhengig transkripsjonen aktivering (spor 7). Nærvær av orf 6/7-protein påvirket ikke transkripsjonen aktivitet vesentlig (spor 8).
Figur 7 viser at orf 6/7-protein aktiverer transkripsjon drevet av DP-l/E2F-l-heterodimer i sammenheng med adenovirus E2a promotor.
a) Oppsummering av konstrukter:
pDP-1, pE2F-l og pE4 orf 6/7 uttrykker proteiner av full
lengde, og pE2a inneholder Ad5 villtype E2a-promotorsek-vens (-96 til +68). Pilene antyder anordning av E2F-seter.
b) og c) Drosophila melanogaster SL2-celler ble transfektert med pE2a og de indikerte ekspresjonsvektorer. Nærvær
av orf 6/7-protein sammen med DP-l/E2F-l-heterodimer for-sterket aktivitet av pE2a (sammenlign spor 7 og 8). Alle verdier er uttrykt relativt til pE2a alene, hvilket ble gitt en vilkårlig verdi lik 1,0 og er representativ for minst tre separate eksperimenter.
Figur 8 viser en modell som fremstiller sammensetning og regulering av DRTF1/E2F under cellesyklusprogresjon i 3T3-celler.
Det er antydet at proteiner, så som pRb og pl07 (indikert med pp i diagrammet), binder til og regulerer aktivitet av distinkte DP-l/E2F-heterodimere (hvor E2F kan være E2F-1 eller andre proteiner som kan heterodimerisere med DP-1, indikert ved ulik skyggelegging) under cellesyklusprogresjon; natur av pp dikteres av E2F-komponenten. Basert på resultatene presentert i denne studie, kan DP-l også modifiseres i løpet av cellesyklusprogresjonen.
Figur 9 er et stolpediagram som viser resultatet av et ELISA-assay hvor et monoklonalt antistoff gjenkjenner hy-pof osf orylert peptid D. mAb binder til det hypofosforylerte, men ikke den ikke-fosforylerte form av DP-1.
Eksempler
Immunokjemisk karakterisering av DP-1
DP-l er en DNA-bindende komponent av DRTF1/E2F i F9 EC- og HeLa-celleekstrakter. Denne konklusjon hviler på det faktum at det E2F-setespesifikke DNA-bindende kompleks opp-løst i disse ekstrakter, reagerer med anti-DP-1 antistoffer (Bandara et al., 1993; Girling et al., 1993). Det ble avgjort å bestemme om endringer i DRTF1/E2F DNA-bindene aktivitet ble gjenspeilet i egenskapene til DP-l-proteinet, og det ble følgelig valgt å karakterisere DP-1 i to situasjoner hvor DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet er regulert; dvs. under differensiering av F9 EC-celler (La Thangue og Rigby; 1987) og cellesyklusprogresjon (Mudryj et al., 1991; Shirodkar et al., 1992).
Et anti-DP-1-serum fremskaffet mot et N-terminalt peptid anti-DP-1 (A) som ble renset ved peptid-affinitetskromatografi og anvendt til å probe celleekstraktene, ble fremstilt for dette. To distinkte polypeptider med molekylvekt på 65.000 og 55.000 (referert til henholdsvis som p65 og p55) ble funnet i F9 EC- celleekstrakter. Begge ble spesifikt gjenkjent av anti-DP-1 fordi de var fraværende da det homologe, men ikke-relaterte peptid ble inkludert i anti-stoffreaksjonen (Figur 1, sammenlign spor 1 og 2). I F9 EC-celleekstraktene ble p55 oppløst som en nært migrerende dublett (knapt synlig i Figur 1, spor 2), et trekk som var spesielt tydelig i ekstrakter fremstilt fra andre typer celler, så som 3T3 celler (omtalt senere). Disse to formene av p55 vil heretter bli referert til som p55U og p55L. I F9 EC-celleekstrakter forekom normalt p55U i mye større mengder enn p55L.
Det er antatt at p55 er produktet av DP-1-genet siden det gjenkjennes av flere anti-DP-l-antisera rettet mot peptider avledet fra andre regioner av DP-1-proteinet (se for eksempel Figur 3b) mens p65 har blitt definert kun med anti-peptid A, hvilket antyder at p65 er et kryssreagerende polypeptid. Resultatene presentert heri er i overensstemmelse med denne ideen idet de viser at p55 korrelerer med DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet. Likeledes samsvarer det faktum at det dominerende polypeptid avledet fra translaterende DP-1 mRNA in vitro har en molekylvekt på om lag 55.000 (se Figur 4b). Når anti-DP-1 ble anvendt for å probe kromatografifraksjoner avledet ved affinitetsrensing av DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet, korrelerer i tillegg p55, ikke p65, med E2F-sete DNA-bindende aktivitet (Figur 1, spor 3, 4, 5 og 6). Det er følgelig sannsynlig at p55 er DP-1 proteinet.
DP-1 er cellesyklus- og differensieringsregulert.
Systemet som ble valgt for å utforske cellesyklusregulering av DP-1, var progresjon gjennom cellesyklusen etter stimulering av serumsultede 3T3-celler. I dette cellesystemet gjennomgår DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet en serie cellesyklusavhengige endringer. For eksempel-var DRTFla (kompleksert DRTF1/E2F) den prominente art av DNA-bindende aktiviteter i serumsultede (G0)-celler (Figur 2a; spor 2). Etter serumstimulering og igangsatt progresjon gjennom cellesyklus, økte imidlertid DNA-bindende aktivitet av DRTFlb/c (den transkripsjonelt aktive form av DRTF1/E2F) mot slutten av G^ for å oppnå et maksimum i S-fasen (12 t etter stimulering; Figur 2a, spor 5). Endringer i mobilitet av DRTFla-komplekset inntraff også under cellesyklusprogresjon. For eksempel ble en tregere migra-sjonsform av DRTFla synlig 0-4 t etter stimulering (Figur 2a, spor 2 og 3). Dette vedvarte gjennom resten av syklus-en, og dets opptreden korrelerte med nærvær av cyklin A i DRTFla, siden tilsats av anti-cyklin A til bindingsreaksjonen forhindret opptreden av dette langsomt migrerende komplekset (Figur 2b, sammenlign mobilitet av DRTFla mellom spor 1 og 2 for øvre og nedre panel; indikert med pil). På den annen side var DRTFla-komplekset som inneholder det Rb-relaterte protein pl07, til stede gjennom hele cellesyklusprogresjonen, innbefattende G0-ekstrakter, siden anti-pl07 forårsaket opptreden av et langsommere migrerende kompleks ved alle tidspunkter (Figur 2c; sammenlign øvre og nedre paneler; shifted kompleks er indikert med pil). Cellesyklusregulering og sammensetning av DRTF1/E2F som heri observert, er i generell overensstemmelse med studier utført av andre (Mudryj et al., 1991; Shirodkar et al., 1992; Schwartz et al., 1993).
Tidligere studier har antydet at DP-l er en hyppig komponent i DRTF1/E2F, men disse eksperimenter ble utført i ekstrakter preparert fra asynkrone cellekulturer (Girling et al., 1993; Bandara et al., 1993), og en kan ikke ute-lukke muligheten for at nærvær av DP-l i DRTF1/E2F likevel er cellesyklusregulert. For å bestemme om DP-1 er til stede i DRTF1/E2F under en diskret fase av cellesyklusen, ble effekten av anti-DP-1 i ekstrakter av synkroniserte 3T3-celler undersøkt. Anti-DP-1 påvirket mesteparten av de DRTF1/E2F DNA-bindende komplekser som inntreffer i løpet av 3T3-cellesyklusen (Figur 2a, spor 10-17). Disse effekter var spesifikke, da de ble konkurrert med av det homologe peptid (peptid A), men ikke det ikke-relaterte peptid (peptid 1; Figur 2a, sammenlign spor 2-9 med 10-17). DP-1 er følgelig en hyppig og, basert på disse resultater, muligens vanlig komponent av 3T3-celle DRTF1/E2F.
Resultatene antyder at DP-1 er en hyppig komponent i DRTF1/E2F, selv om det er mulig at DP-1-proteinet modifiseres under cellesyklusprogresjon. Denne mulighet ble undersøkt ved å immunblotte samme sett av synkroniserte 3T3-celleekstrakter. I serumsultede 3T3-celleekstrakter ble p55D oppløst selv om p55L ved cellesyklusprogresjon opptrådte mot slutten av G- l idet cellene entret S-fasen (Figur 2d, sammenlign spor 2, 3 og 4). Følgelig korrelerte opptredenen av p55L bra med den økte DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet som inntraff ved dette stadiet av cellesyklusen (Figur 2a, spor 5). Det ble følgelig konkludert med at DP-1 er en hyppig komponent av DRTF1/E2F under 3T3-cellesyklusen, og at den sannsynligvis vil modifiseres i løpet av cellesyklusprogresjonen. I den påfølgende del antyder de presenterte data at opptreden av p55L skyldes endringer i fosforyleringsnivå. DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet er nedadregulert under differensieringsprosessen av F9 EC-celler (La Thangue og Rigby, 1987; Partridge og La Thangue, 1991); en regulatorisk profil som korrelerer med en reduksjon i proliferasjonsraten. Når ekstrakter preparert fra differensierende F9-celler hvori DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet var nedadregulert, ble anvendt for immunblotting, var det tydelig at redusert DNA-bindende aktivitet i differensierte celler (7 dager etter induksjon av differensiering) korrelerte med et lavere nivå både av p55U og p55L (Figur 2e, sammenlign spor 1 og 2); en profil som står i kontrast med regulering av p55 under cellesyklusprogresjon (Figur 2d). Det ble følgelig konkludert med at cellesyklusprogresjon og differensiering påvirker DP-1 på tydelig vis.
DP-1 er et fosforylert protein.
En mulig forklaring på modulering av DP-1 p55 under cellesyklusprogresjon var at den gjenspeiler posttranslasjonal modifikasjon av p55, en mulighet er dets fosforyleringsnivå. Det ble undersøkt om DP-1 var fosforylert. For å un-dersøke denne muligheten ble to ulike anti-DP-1-peptid-antisera anvendt. Som beskrevet tidligere, gjenkjenner anti-DP-l (A) en peptidsekvens i den N-terminale del av DP-1, mens anti-DP-1 (D) ble fremskaffet mot en peptidsekvens lokalisert i den ekstreme C-terminale region av DP-1 (se Materialer og Metoder). Anti-DP-1 (D) reagerte spesifikt med DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet ved gel-retardasjonsbetingelser (Figur 3a, sammenlign spor 2 og 3) og med et GST-DP-1 fusjonsprotein (Figur 3a, sammenlign spor 4 og 5).
Strategien som ble anvendt for å teste om DP-1 var fosforylert, var først å immunpresipitere med anti-DP-1 (A) fra ekstrakter fremstilt fra celler som var metabolsk merket med <32>P-ortofosfat. Immunpresipiterte proteiner ble frigitt fra anti-DP-1 (A)-komplekset ved å konkurrere med peptid A, dvs. peptidet som ble anvendt for å fremstille anti-serumet, og re-immunopresipitert med anti-DP-l (D). Polypeptid oppløst etter den andre immunpresipitasjon, bør enten være DP-1 eller et DP-l-assosiert protein.
I den første immunpresipitasjonen ble flere polypeptider spesifikt immunpresipitert med anti-DP-1 (A) (figur 3b, sammenlign spor 1 og 2). Re-immunpresipitasjon av de fri-gitte polypeptider med anti-DP-1 (D) ga et enklere møn-ster, hvori i hovedsak to fosforylerte polypeptider med molekylvekt på 55,000 og 70,000 var oppløst (Figur 3b, sammenlign spor 3 og 4). Sammenligning av de immunpresipiterte polypetid med de definert ved immunblotting med anti-DP-l (A) antydet at polypeptidet med en molekylvekt på 55.000 komigrerte med DP-1 p55 (Figur 3b, sammenlign spor 10 og 11) og følgelig var antatt å være DP-1. Ved dette analysenivået var det ikke mulig å skille mellom p55U og p55L. Siden polypeptidet med en molekylvekt på 70.000 (referert til som p70 i Figur 3b, spor 4) var til stede i immunpresipitasjon utført med begge anti-DP-sera, er det sannsynligvis fysisk assosiert med DP-1. Det er viktig å legge merke til at størrelsen på p70 var vesentlig større enn på det kryssreagerende polypeptid p65 som er omtalt tidligere (indikert som • i Figur 3b, spor 11) . Både anti-DP-1 (A) og anti-DP-1 (D) immunpresipiterte DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet (Figur 3b, spor 5 og 8), hvilket indikerer at denne form av DP-1, sannsynligvis kompleksert med p70, er involvert ved binding til E2F-setet.
En kan herav slutte at DP-1 er fosforylert og at det fysisk assosierer med minst et annet fosforylert polypeptid. I forhold til p70 har DP-1 et lavt fosforyleringsnivå, hvilket er i overensstemmelse med idéen om at DP-1 bindes til DNA i den hypofosforylerte tilstand.
For å teste om fosforylering påvirker mobilitetsforskjel-ler mellom p55U og p55L, ble effekt av fosfatasebehandling av ekstrakter fremstilt fra asynkrone kulturer av 3T3-celler undersøkt. I fravær av fosfatase kunne både p55U og p55L oppløses (Figur 3c, spor 2). Etter fosfatasebehandling av ekstrakt, ble p55U tydeligere på bekostning av p55L (Figur 3c, sammenlign spor 1 og 2; p55U og p55L er indikert), hvilket antyder at forskjellen mellom p55U og p55L er fos-foryleringsavhengig.
Økt binding av pRb til DP-1/E2F-1 heterodimer.
Når en kombinerer cellesyklusstudier presentert heri med tidligere studier, antydes det at DP-1 er en hyppig komponent av DRTF1/E2F (Bandara et al., 1993; Girling et al., 1993) . DRTF1/E2F er imidlertid mest tilbøyelig til å være en heterodimer DNA-bindende aktivitet (Girling et al, 1993; Bandara et el., 1993, Helin et al., 1993). En po-tensiell fysiologisk partner er E2F-1- proteinet, siden DP-l/E2F-l-heterodimer har blitt detektert in vivo og begge proteiner virker synergistisk in vitro for å danne et heterodimert DNA-bindende kompleks (Bandara et al., 1993; Helin et al., 1993). Da en mengde proteiner kan reagere med DRTF1/E2F, for eksempel pRb, pl07, cyklin A og E og p33<cafc2> (Mudryj et al., 1991; Shirodkar et al., 1992; Lees et al., 1992; Schwartz et al., 1993), var det interessant å forstå hvordan DP-1 influerer disse interak-sjonene i tilknytning til DP-l/E2F-l-heterodimeren. Det ble bestemt å utforske bindingen av pRb til DP-1/E2F-1 heterodimeren. Effektivitet av binding av villtype-pRb (i form av et GST fusjonsprotein som inneholdt pRb-sekvens fra enhet 379-928) til DP-l/E2F-l-heterodimeren ble under-søkt og sammenlignet med aktivitet av binding kun til E2F-1. I overensstemmelse med tidligere rapporter (Bandara et al., 1993; Helin et al., 1993) hadde E2F-1 lav DNA-bindende aktivitet når den ble testet alene (Figur 4a, spor 8). Imidlertid var denne aktiviteten vesentlig høyere når tilsvarende mengde av E2F-1 ble testet i nærvær av DP-1
(Figur 4a, sammenlign spor 3 og 9). GST-pRb bandt også til E2F-1-komplekser, selv om intensitet av pRb-E2F-1-komplekset var mindre enn med DP-l/E2F-l-heterodimeren (Figur 4a, sammenlign spor 2 og 3), en effekt som delvis skyldes den lave DNA-bindende aktivitet av E2F-1 alene.
Det var mulig at den økte binding av pRb til DP-1/E2F-1-heterodimer skyldtes en interaksjon mellom DP-1 og pRb, som i tillegg til den tidligere dokumenterte gjenkjenning av E2F-1 ved pRb (klamme 2, s. 25), bidrar til å stabili-sere binding av pRb til heterodimer. Dette ble utprøvd ved å anvende et bindingsassay hvori interaksjon mellom in vitro translatert DP-1 med GST-pRb ble testet, hvilket bindingsassay tidligere har vært anvendt for å studere interaksjon av DP-1 og E2P-1 (Bandara et al., 1993).
Interaksjon av E2F-1 og Ela med pRb ble testet for å kontrollere assayets spesifisitet. E2F-1 og Ela er begge kjent for å binde til pRb på en måte som avhenger av lommens integritet (Hu et al-, 1990; Helin et al., 1992; Kaelin et al., 1992). Vi sammenlignet deres binding både til villtype-pRb og til pRb-proteiner som blir kodet for ved naturlig forekommende mutantalleler som inneholder enten en enkel aminosyresubstitusjon (C til F ved residu 706) eller mangler regionen av proteinet som er kodet for av exon 22. Både E2F-1 og Ela ble bundet til pRb på en lommeavhengig måte, siden deres interaksjon med villtype-pRb var større enn den med mutantproteinene (Figur 4b, sammenlign spor 6 med 7 og 8, 9 med 10 og 11 og redusert eksponering i spor 13, 14 og 15). I overensstemmelse med tidligere resultater (Bandara et al., 1993) var det ytterligere mulig å binde DP-l og E2F-1 spesifikt til hverandre (Figur 4b, sammenlign spor l, 2 og 12). Når interaksjonen mellom DP-1 og villtype-pRb ble evaluert, ble et vesentlig nivå av bindingsaktivitet detektert (Figur 4b, sammenlign spor 2 og 3). Imidlertid var denne aktiviteten uavhengig av integritet av lommeregionen av pRb, fordi DP-l ble bundet like effektivt til både villtype og mutante pRb-proteiner (Figur 4b, sammenlign spor 3, 4 og 5). Siden binding til GST-protein eller glutation-kulene var redusert, var imidlertid DP-1 avhengig av nærvær av pRb-proteinsekvens (Figur 4b, sammenlign spor 1, 2 og 3). En kan konkludere med at DP-1 kan reagere spesifikt med pRb, om enn på en lommeuavhengig måte.
Det ble anvendt to fremgangsmåter for å kontrollere spesifisitet av pRb-DP-1 interaksjon. Først ble interaksjon av et ikke-relatert protein undersøkt med pRb. CREBPI (et cAMP responselementbindende protein; Maekawa et al., 1989) ble anvendt, men reagerte under betingelsene i henhold til foreliggende assay ikke mer effektivt med villtype-pRb eller mutant pRb-proteiner enn med GST-proteinet {Figur 4b, sammenlign spor 16, 17, 18 med 19). For det andre ble bindingsaktivitet av et panel av muterte DP-l-proteiner (Figur 4c) undersøkt enten med villtype-pRb eller GST alene. Nesten alle DP-l-mutanter som ble undersøkt, bandt mer effektivt til pRb enn til GST alene (Figur 4c, sammenlign spor 1, 2, 3 og 4 med 6, 7, 8 og 9). Imidlertid unnlot mutant A211, som mangler DP-1 proteinsekvens C-terminal fra enhet 211, å reagere med pRb (Figur 4c, sammenlign spor 5 og 10; det translaterte A211 polypeptid anvendt i dette assay er vist i spor 11).
Disse mutant-DP-1-proteinene ble også testet for deres evne til å reagere med E2F-1 og pRb i gelretardasjons-assayet {Figur 4a). Alle de mutante DP-1-proteinene kunne reagere synergistisk med E2F-1 i E2F-sete DNA-bindende aktivitet {Figur 4a, spor 9-13). Aktivitet av A211 var minimalt mindre enn den av villtype DP-l {Figur 4a, sammenlign spor 9 med 13), hvilket samstemmer med tidligere studier som indikerte at region mellom enhet 204 og 249 i DP-1 bidrar til DNA-bindende aktivitet av DP-1/E2F-1- heterodimer (Bandara et al., 1993).
Som påpekt tidligere, reagerer DP-l/E2F-l-heterodimeren effektivt med pRb {Figur 4a, spor 3) . De mutant-DP.-l-proteiner som kan reagere med pRb i bindingsassayet (Figur 4c) evnet også å produsere DP-l/E2F-l-heterodimere som kunne reagere med pRb (Figur 4a, sammenlign spor 3, 4, 5 og 6). DP-l/E2F-l-heterodimer produsert med 211, som ikke reagerte med pRb i bindingsassayet (Figur 4c, spor 5), hadde redusert pRb-bindingsaktivitet (Figur 4a, sammenlign spor 3 og 7). Reduksjon i bindingsaktivitet av A211/E2F-1-heterodimer var mye mindre enn den dramatiske reduksjon i bindingseffektivitet av pRB til DP-1 A211/E2F-1- heterodimer (Figur 4a, sammenlign spor 6 med 7 og 12 med 13). Disse data, som er avledet fra studier på mutante DP-l-proteiner i to ulike assay, antyder at DP-l kan reagere med pRb og at regionen mellom enhet 211 og 327 påvirker denne interaksjon.
Adenoviniset E4 orf 6/7-protein binder til DP-l/E2F-l-heterodimer og overdrar evnen til ko-operativ E2F-sete DNA-binding til DNA-bindende kompleks
Det ble bestemt å kartlegge hvorvidt adenovirus orf 6/7-produktet kan binde til DP-1/E2F-1-heterodimer. Denne interaksjon ble studert fordi orf 6/7-proteinet reagerer med to molekyler av DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet under adenovirusinfisering (Huang og Hearing, 1989; Marton et al., 1990), hvilket fører til den ko-operative gjenkjenning av to korrekt romlig plasserte og orienterte bin-dingsseter, så som de som opptrer i E2a-promotoren (Hardy og Shenk, 1989; Raychaudhuri et al., 1990), og følgelig ville en interaksjon mellom orf 6/7 og DP-l/E2F-l-heterodimer representere et annet eksempel på en viktig fysiologisk interaksjon.
For å teste dette ble DP-1- og E2F-l-proteiner translatert in vitro, og deres DNA-bindende aktivitet på E2a-promotor studert ved geiretardasjon. Igjen ble signifikant DNA-bindende aktivitet kun observert i nærvær av begge proteiner (Figur 5, sammenlign spor 2, 3, 4 med 5). Tilsats av orf 6/7-proteinet til DP-1/E2F-1- heterodimer forårsaket opptreden av et DNA-bindende kompleks som migrerte langsommere (Figur 5, indikert ved <*> i spor 9). Dette komplekset var ikke synlig når orf 6/7 ble satt til DP-1 eller E2F-1 alene (Figur 5, sammenlign spor 6, 7 og 8 med 9). Denne effekten var spesifikk for anordningen av de to E2F-bind-ingssetene i E2a-promotoren, siden det orf 6/7-induserte shift ikke var synlig når et enkelt E2F-bindingssete ble anvendt (data ikke vist). Det er derfor meget sannsynlig at det representerer et DNA-bindende kompleks som gjenkjenner konfigurasjon av E2F-setene i E2a-promotor.
Disse resultater antyder at orf 6/7-proteinet reagerer spesifikt med DP-1/E2F-1-heterodimer og derved danner en DNA-bindende aktivitet med de egnede biokjemiske egenskaper av den adenovirusinfiserte celle dannet av DRTF1/E2F. Interaksjon av orf 6/7 med DP-1/E2F-1 heterodimer rekapitulerer følgelig in vivo fenomenet.
Nærvær av DP-1-, E2F-1- og orf 6/7-proteinet i dobbeltsetekomplekset ble etablert ved anvendelse av antisera som spesifikt gjenkjenner hvert protein. Anti-DP-1 og anti-E2F-1 reagerte med DP-1/E2F-1-heterodimeren enten i fravær eller i nærvær av orf 6/7-proteinet (Figur 5, sammenlign spor 10, 11 og 12 og 14, 15 og 16). Derimot påvirket ikke anti-orf 6/7 aktivitet av DP-l/E2F-l-heterodimeren (Figur 5, sammenlign spor 13 med 17), men forhindret opptreden av dobbeltsetekomplekset som var synlig ved tilsats av orf 6/7-proteinet (Figur 5, sammenlign spor 10 med 13). En kan følgelig konkludere med at DP-1-, E2F-1- og orf 6/7-proteinet er til stede i dobbeltsetekomplekset.
En DP-l/E2F-l-heterodimer kombinert med en egnet konfigurasjon av E2F-seter er nødvendig for aktivering av E2F-seteavhengig transkripsjon ved orf 6/7.
For å kartlegge de funksjonelle konsekvenser av interaksjon mellom DP-1/E2F-1-heterodimer og orf 6/7, har et assay-system som ble anvendt, tidligere blitt utviklet i Drosophila melanogaster SL2-celler (Bandara et al., 1993). SL2-celler er spesielt egnet for analyse av E2F-seteav-hengig transkripsjon, fordi de i motsetning til pattedyrs celler inneholder et meget lavt nivå av endogen E2F-sete DNA-bindende aktivitet (Bandara et al., 1993) og følgelig besørger at aktivitet av transfekterte E2F-sete-effektor-molekyler uttrykt fra transfekterte vektorer lett kan un-dersøkes. I disse cellene er det tidligere blitt vist at DP-l og E2F-1 virker synergistisk i E2F-seteavhengig transskripsjonen aktivering (når undersøkt med p3xWT reporter) under betingelser hvor hvert protein aktiverer dårlig alene (Bandara et al., 1993; og Figur 6b, sammenlign spor 3 og 4 med 7). Ko-ekspresjon av orf 6/7 med enten DP-l eller E2F-1 alene, eller i nærvær av begge proteiner, unnlot å påvirke transkripsjonen aktivitet av p3xWT vesentlig (Figur 6b, sammenlign spor 3 med 6, 4 med 5, og 7 med 8). Dette var det forventede resultat basert på anordning av E2F-setene i p3xWT, siden denne inneholder tre kopier av det distale E2F-sete fra adenovirus E2a-promotor anordnet etter hverandre. Dette er følgelig en ueg-net anordning for dannelse av orf 6/7-avhengig dobbelt-setekompleks (Hardy og Shenk, 1989).
Villtype adenovirus E2a-promotor inneholder en organisering av E2F-seter (indikert ved piler i Figur 7) som tillater dannelse av orf 6/7-dobbeltsetekomplekset i adeno-virusinf iserte celler (Hardy og Shenk, 1989; se Figur 5). Når et assay lignende det nevnt ovenfor ble utført på nevnte villtype adenovirus E2a- promotor, aktiverte DP-l og E2F-1 transkripsjon mer effektivt sammen enn hvert protein alene (Figur 7b og c, sammenlign spor 7 med 3 og 4). Imidlertid forårsaket ko-ekspresjon av orf 6/7 sammen med DP-1 og E2F-1 en markert økning i transkripsjonen aktivitet av E2a-promotor (Figur 7b og c, sammenlign spor 7 og 8) i motsetning til effekt av orf 6/7 på p3xWT (Figur 6b, sammenlign spor 7 og 8). Denne effekt var spesifikk for DP-1/E2F-1-heterodimer fordi orf 6/7 ikke påvirket promotoraktivitet når DP-1 eller E2F-1 ble uttrykt alene (Figur 7b og c, sammenlign spor 3 og 6 med 4 og 5). Transkripsjonen aktivitet ved orf 6/7 avhenger følgelig av til stedeværelse av DP-1- og E2P-1-proteiner og krever ytterligere en organisering av E2F-seter som tidligere har vist seg å være nødvendige for at orf 6/7-protein kan utøve sine biologiske effekter på infiserte celler. Interaksjon av orf 6/7 med DP-1/E2F-1-heterodimer oppsummerer følgelig regulering av E2F-seteavhengig transkripsjon i adenovirus-inf iserte celler.
DP-1: en hyppig og proliferasjons-regulert DNA-bindende komponent av DRTF1/E2F
DP-1 ble opprinnelig definert som et E2F-sete DNA-bindende polypeptid i F9 EC-celler, og en komponent av pRb- og pl07- assosiert DRTF1/E2F {Girling efc al., 1993). Videre påvirker anti-DP-1 antistoffer mesteparten av de definer-bare DNA-bindende kompleksene i ekstrakter fremstilt fra asynkrone kulturer av F9 EC- og HeLa-celler {Bandara et al., 1993). I foreliggende oppfinnelse har analysen av DP-1 proteinet videre blitt utført ved å undersøke dets egenskaper under 3T3-cellesyklusen hvor DRTF1/E2F gjennomgår en regulert serie av interaksjoner med proteiner, så som pRb og pl07 {referert til som "lommeproteiner", cykliner og cyklin-avhengige kinaser (redegjort for i Nevins, 1992; La Thangue, 1994) . Resultatene slår klart fast at DP-1 er en hyppig, om ikke universell, DNA-bindende komponent av DRTF1/E2F under cellesyklusprogresjon av 3T3-celler. Dette avviker fra studier utført på E2F-l-proteinet, hvilke studier antyder at E2F-1 er en noe sjeldnere DNA-bindende komponent, da det er til stede i noen, men ikke i alle arter av DRTF1/E2F (Chittenden et al., 1993). Det er derfor mulig at DP-1 kan danne heterodimere med andre protein i løpet av cellesyklusen, hvilke proteiner muligens er relatert til E2F-1 og som produserer andre arter av heterodimere E2F-sete DNA-bindende aktiviteter (indikert i modellen i Figur 8). Basert på tilgjengelige bevis, synes det sannsynlig at det finnes en rekke DNA-bindende heterodimere som gjenkjenner E2F-bindingssetet og at visse celler (for eksempel F9 EC, HeLa og 3T3) har DP-1 som en hyppig komponent med varierende partner, eksemplifisert i denne studien ved E2F-1. Isolering av proteiner som er relatert til E2F-1 (Ivey-Hoyle et al., 1993; Lees et al., 1993), spesielt innen det DNA-bindende domene og som derfor er sannsynlige partnere for DP-l, er i overensstemmelse med en slik modell.
Selv om DP-1 er en hyppig DNA-bindende komponent av DRTF1/E2F under 3T3-cellesyklusen, er det DP-1 DNA-bindende polypeptid (p55) likevel utsatt for cellesyklus-modifisering siden det gjennomgikk et lite mobilitetsshift ved cellesyklusprogresjon (fra p55U til p55L). En mulig forklaring på dette fenomen er at fosforyleringsnivå av p55 er regulert under cellesyklusprogresjon, en idé som er i overensstemmelse med effekten av endret mobilitet av p55L ved fosfatasebehandling {Figur 3c). Dette antyder at produktet av DP-1, p55, som er en hyppig komponent av DRTF1/E2F i visse typer celler, er differensielt fosforylert under cellesyklusprogresjonen. De funksjonelle konsekvenser, lokalisering av enheter og natur av kinaser og fosfataser som er involvert i prosessen er ennå ikke bestemt .
Det er verdt å merke seg at DP-1 assosierer fysisk med et annet fosforprotein, p70. I forhold til DP-1 innehar p70 et høyere fosforyleringsnivå, en observasjon som er i overensstemmelse med idéen om at DP-1 og p70 reagerer på ulike fysiologiske signal. Tilstedeværelse av p70 i DP-1-immunopresipitater korrelerer med DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet, og det er følgelig mulig at DP-l/p70-komplekset er et heterodimert E2F-setespesifikt DNA-bindende kompleks. Imidlertid synes ikke p70 å være E2F-1, siden ulike anti-E2F-l antisera ikke reagerer med denne. Dette ute-lukker ikke at p70-kompleks er relatert til E2F-1, og det kunne for eksempel være en av de senere definerte E2F-1-relaterte protein (Ivey-Hoyle et al., 1993; Lees et al., 1993) .
I motsetning til regulering av DP-1 gjennom cellesyklusprogresjon, er DP-1 nedregulert under differensieringsprosessen, og følgelig korrelerer i denne sammenheng dette nivået med hastigheten av cellulær proliferasjon. Det er faktisk mulig at nivået av DP-1 virker direkte inn på has-tighet av cellulær proliferasjon, siden mange gener som inneholder E2F-bindingsseter i sine promotorregioner, koder for proteiner som er nødvendige for celleprogresjon (Nevins, 1992).
DP-1 binder til pRb.
Resultatene viser at DP-1 kan binde til pRb på en måte som ikke avhenger av lommens integritet. Dette står i motsetning til interaksjon av E2F-1 og virale onkoproteiner med pRb, fordi deres bindingsaktivitet er mer effektiv når lommen er intakt.
Et proteindomene definert i den C-terminale halvdel av DP-1 påvirker bindingseffektivitet av pRb enten til DP-l alene eller til DP-1/E2F heterodimer, hvilket antyder at domenet er involvert i mediering av økt binding av pRb. Imidlertid ønskes det ikke å antyde at dette domene er tilstrekkelig for interaksjon, men snarere at det er til-bøyelig til å ko-operere med den lomme-avhengige interaksjon som inntreffer mellom pRb og det C-terminale domene i E2F-1 (Helin et al., 1993). Selv om pRb Å22 bandt til DP-1/E2F-1-heterodimeren i bindingsassayet, evnet den ikke å gjøre dette i geiretardasjonsassayet (Figur 4a og b), hvilket antyder at interaksjonen mellom DP-1 og pRb er svak. Alternativt er det mulig at E2F-1 kan forstyrre DP-ls evne til å virke med Å22 i forbindelse med DP-1/E2F-1-heterodimer. Ytterligere eksperimenter vil klargjøre dette.
Det er følgelig antatt at E2F-1 er den avgjørende faktor ved påvirkning av pRb til DP-l/E2F-l-heterodimer, men at denne bindingsaktiviteten økes gjennom en interaksjon mellom en ikke-lommeavhengig region i pRb og en C-terminal region i DP-l. Gitt at DP-1 også er til stede i pl07-DRTF1/E2F-komplekset, er det mulig at DP-l også bistår binding av pi07 til heterodimeren. Dersom dette er tilfelle, kan det å gjenkjenne DP-1 være en generisk egenskap for lommeproteiner. Det vil være interessant å utforske disse idéer og bestemme det domene i pRb som binder til DP-l.
Interaksjon av orf 6/7- proteinet med DP-1/E2F-1 heterodimer oppsummerer fysiologisk regulering.
Resultatene antyder også at DP-1/E2F-1-heterodimeren er en fysiologisk relevant form av DRTF1/E2F som gjenkjennes av orf 6/7-proteinet. Dannelse av heterodimer og en passende anordning av E2F-seter (for eksempel i E2a-promotoren) er en forutsetning for transkripsjonen aktivitet av orf 6/7, hvilket indikerer at DP-l/E2F-l-heterodimeren innehar de viktige trekk av den infiserte celleform av DRTF1/E2F. Det er godt dokumentert at orf 6/7-proteinet danner et stabilt kompleks med DRTF1/E2F DNA-bindende aktiviteter under ade-novirusinf eks jon av HeLa-celler (Hardy og Schenk, 1989; Huang og Hearing, 1989). Gitt at en DP-1/E2F-1-heterodimer finnes i HeLa-celler (Bandara et al., 1993), er det svært sannsynlig at orf 6/7-proteinet reagerer med kompleks under normal lytisk infeksjon. Det er derfor antatt at en har definert komponentene av og rekonstruert de fysiologiske interaksjoner som inntreffer under adenovirusinfeksjon med en form av DRTF1/E2F. Imidlertid er det sannsynlig at andre DP-l/E2F-heterodimere også kan virke med orf 6/7, f. eks. DP-1/E2F-2 og DP-1/E2F-3, gitt en høy' grad av likhet mellom E2F-1, -2 og -3 (Ivey-Hoyle et al., 1989; Lees et al., 1993). I tillegg er andre DP-proteiner som er like høyt relatert til DP-1 som E2F-1 er til E2F-2 og E2F3 (Girling, Ormondroyd og La Thangue, ikke-publiserte obser-vasjoner) , sannsynlige partnere for ulike E2F (for eksempel E2F-1).
Selv om orf 6/7-proteinets bidrag til dannelse av et dob-belt -E2 F -sete DNA-bindende kompleks er ganske klar, er lite kjent om dets rolle ved transkripsjonen aktivering. Dataene antyder at orf 6/7-proteinet bibringer lite, hvis noe, transkripsjonen stimulering. Dette er basert på det faktum at orf 6/7-proteinet omtrent fordobler den transkripsjonene aktivitet av DP-1/E2F-1- heterodimeren (Figur 7). Den enkleste fortolkning er følgelig at orf 6/7-proteinet favo-riserer okkupering av to seter (snarere enn det ene setet som sannsynligvis vil inntreffe i fravær av orf 6/7) , og den økte transkripsjonene aktivitet skyldes dobbeltsete besittelse (dvs. to DP-l/E2F-l-heterodimere), snarere enn noe direkte bidrag fra orf 6/7. Det er derfor antydet at orf 6/7 i hovedsak fungerer som et viralt kodende dimeriseringsdomene som er spesifikt for DRTF1/E2F DNA-bindende aktiviteter som for eksempel DP-l/E2F-l-heterodimer.
Under lytisk adenovirusinfeksjon vil minst to virusrettede mekanismer usurpere den normale regulering av DRTF1/E2F. For det første vil Ela-proteinet avsondre og sannsynligvis inaktivere proteiner så som pRb, som normalt undertrykker transkripsjonen aktivitet av DRTF1/E2F. Transkripsjonelt aktivt DRTF1/E2F evner deretter å aktivere cellulære gener hvorav noen koder for proteiner som er nødvendig for viral replikasjon. For det andre vil orf 6/7-proteinet sikte seg inn på denne enkle E2F-seteaktiviteten bestående av DP/E2F-heterodimerer, og konvertere denne til en form som fortrinnsvis gjenkjenner organisering av seter som opptrer i virale promotore, så som E2a (hvis gen koder for et viralt protein som er nødvendig for repliaksjon), og således opp- rettholder ekspresjon av vesentlige virale gen er under den virale replikasjonssyklus.
Summa summarum er det heri vist at DP-1 er en hyppig komponent av DRTF1/E2F i 3T3-celler og at dets fosforyleringsnivå er underlagt cellesykluskontroll. Videre forster-ker tilstedeværelse av DP-1 i DRTF1/E2F interaksjon med pRb og er funksjonelt avgjørende for gjenkjenning av orf 6/7-proteinet. DP-1 spiller følgelig en avgjørende rolle ved muliggjøring av interaksjon mellom cellulære protein og DRTF1/E2F.
Fremstilling av ekstrakter fra cellelinjer, geiretardasjon og immunokjemiske teknikker: Ekstrakter ble fremstilt som tidligere beskrevet (Partridge og La Thangue, 1991}. Gelretardasjonsreaksjoner ble utført ved anvendelse enten av et oligonukleotid som inneholdt det distale E2F-bindingssetet som ble tatt fra adenovirustype 5 E2a-promotor (nukleotid -71 til -50) eller den komplette villtype-E2a-promotor (nukleotid -96 til +68) som inneholder to E2F-seter. Antisera og konkurrerende peptider (ca. 2n mol for DP-1 peptidet) ble satt til som tidligere beskrevet (Girling et al., 1993). Immunblotting ble utført ved standardprosedyrer, og affinitetsrenset anti-DP-1 (A) ble anvendt for immunblotting. Affinitetsrensing ble utført ved anvendelse av en peptid A affinitetsmatriks hvori peptid A ble koplet til cyanogen-bromidaktivert Sepharose CL4B. De andre antistoffene som ble anvendt, var anti-DP-1 (D), SD15 for anti pl07 (Dyson et al., 1993), 134 for anti-E2F-l (Bandara et al., 1993), et kanin-polyklonalt anti-orf 6/7 (Bocco et al., 1993) og en kanin polyklonalt anti-cyklin A (Bandara et al., 1991). Preimmune sera eller ikke-relaterte monoklonale antistoff ble anvendt som kontroller. DRTF1/E2F DNA-bindende aktivitet ble affinitetsrenset nøyaktig som tidligere beskrevet ved gjentatte applikasjoner til en E2F-bindingsseteaffi-nitetsmatriks (Girling et al., 1993). Defosforylering av celleekstrakter ble utført ved å sette til human placental fosfatase (4.0U), potetsyre fosfatase (1.2U) og kalvein-testinal fosfatase (20U), etterfulgt av inkubering ved 37°C i 40 min; kontrollbehandlinger manglet fosfatase. Ekstrakter ble deretter immunblottet med anti-DP-1 (A).
Fusjonsproteiner og in vitro translasjon:
DP-1, E2F-1, pRb, pRbA22 og pRb C->F 706 ble uttrykt som GST-fusjonsproteiner og renset som beskrevet (Bandara et al., 1993; Girling et al., 1993). DP-1-, E2F-1-, Ela- og CREBP1-(Maekawa et al., 1989) kodende sekvenser ble transkribert og translatert ved anvendelse av et reticulocytt lysat (Promega; Bandera et al., 1993), og orf 6/7-proteinet tilveiebrakt av José Bocco og Claude Redinger ble uttrykt og renset som tidligere beskrevet (Bocco et al., 1993). I proteinbindingsassayet (Figur 4), ble polypeptider translatert og radiomerket med <35>S metionin og inkubert med et egnet GST fusjonsprotein i 30 min ved 30°C, oppsamlet med glutation-agarose (Sigma) og vasket gjentatte ganger med 0,1 % NP40 i PBSA. Bundet protein ble frigitt ved denaturering i SDS prøvebuffer og oppløst i 10 % polyacrylamidgel som tidligere beskrevet (Bandara et al., 1993). Effektivitet av translasjon ble evaluert for hvert polypeptid. A341 og A327 ble laget ved å spalte pGDP-1 (Bandara et al., 1993) med henholdsvis BamHl og Kpnl. A73-340 ble laget ved polymerase-kjedereaksjon ved anvendelse av et 5<1> oligonukleotid som omfattet et effektivt ribosombindende sete. A211 ble dannet ved eksonuk-lease III-spalting av DP-l-cDNA fra 3'-teminale ende ved anvendelse av et Promega Erase-a-Base system.
Matabolsk radiomerking:
F9 EC-celler {omkring 1 x 10<s>) ble radiomerket i 4 t med 3mCi av <32>P-ortofosfat {Amersham International) og høstet i lysebuffer (50mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% NP40, 2 ug/ml Aprotonin, 0,5 mM PMSP). Cellelysatet ble immunpresipitert i to trinn med to forskjellige anti-DP-l-antistoff. Først ble anti-DP-1 (A) i nærvær av enten det homologe peptid (peptid A; 2 nmol) eller et urelatert peptid (peptid 1, 2 nmol) tilsatt til det radiomerkede lysat ilt, hvoretter protein A Sepharose-kuler (Pharmacia) ble tilsatt og inkubert i ytterligere 1 t. Sepharose-kulene ble høstet og vasket flere ganger med lysebuffer. Proteiner som var immunpresipitert med anti-DP-1 (A) ble frigjort ved å tilsette det homologe peptid (peptid A {residuene 3 til 15 av DP-1); 2 nmol) til immunpresipitatet utført i nærvær av det ure-laterte peptid (peptid 1). Re-immunpresipitat av frigjorte proteiner ble utført med anti-DP-l (D) i nærvær av enten det homologe peptid (peptid D; 2 nmol) eller det urelater-te peptid (peptid 1; 2 nmol). Reaksjonen ble inkubert i 1 t, hvoretter protein A Sepharose-kuler ble tilsatt og inkubert i ytterligere 1 t. Bundne proteiner ble oppløst ved SDS gel-elektroforese. For analyse av DRTF1/E2F DNA-bindingsaktivitet ble immunpresipitatene behandlet med gel-retarderingsbuffer (inneholdende enten homologt eller urelatert peptid; 2 nmol) og deretter ble de assayundersøkt på DNA-bindende aktivitet til E2F-setet i nærvær av konkurrerende mutant EF2-sete.
Transfeksjon av Drosophila vevkulturceller: Reporterkonstruksjon p3xWT og p3xMT har tidligere blitt beskrevet (Zamanian og La Thangue, 1992). pE2a inneholder villtype E2a-promotorsekvenser (-96 til +68) som driver CAT-genet og som tidligere har blitt beskrevet (SivaRaman og Thimmappaya, 1987). pDP-l og pE2F-l inneholder komplette DP-1 og E2F-1 proteiner (Bandara et al., 1993). pE4 tilveieskaffet av Claude Redinger inneholder et fullstendig Ad5 orf 6/7-cDNA regulert ved E4-promotoren. Transfek-sjoner og CAT-assayer ble utført som tidligere beskrevet (Bandara et al., 1993).
Cellesyklus-analyse:
For cellesyklusanalyse (Figur 2) ble NIH 3T3-celler dyrket 36 t i medium (DMEM) som inneholdt 0,1 % føtalt kalveserum (FCS). Deretter ble hver kultur vasket, DMEM inneholdende 10 % FCS ble satt til og celler ble deretter høstet etter et passende tidsrom (hver 4. t). Celler ble evaluert for DNA-syntese ved anvendelse av et Cell Proliferation Kit (Amersham International) i henhold til produsentens in-struksjoner. I korthet ble cellene dyrket på sterile dekk-glass i nærvær av bromdeoksyuridin (BrdU), og etter et egnet tidsrom ble dekkglassene fjernet og immunfarging med anti-BrdU ble utført som anbefalt av produsenten. Paral-lelle kulturer ble fremstilt for analyse ved gelretarda-sjon og immunblotting. I dette cellesystemet begynte DNA-syntese etter 8 t og toppet seg 12 t etter stimulering med serum. Cellene begynte å dele seg om lag 20 t etter stimulering.
Referanser
Bagchi, S., Raychaudhuri, P. and Nevins, J.R. (1990) Cel] 62, 659-669.
Bandara, L.R. and La Thangue, N.B. (1991) Nature 351, 494-497.
Bandara, L.R., Adamczewski, J.P., Hunt, T. and La Thangue, N.B. (1991) Nature 352, 249-251.
Bandara, L.R., Adamczewski, J.P., Poon, R.Y., Zamanian, M., Hunt, T. and La Thangue,
N.B. (1992) J.Cell Sei. 16, 77-85.
Bandara, L.R., Buck, V.M., Zamanian, M., Johnston, J.H. and La Thangue, N.B. (1993)
EMBO J. 12. 4317-4324.
Blake, M.C. and Azizkhan. J.C. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4994-5002.
Bocco, J.L., Reimund, B., Chatton, B. and Kedinger, C. (1993) Oncogene 8, 2977-2986. CheUappan, S.P., Hiebert, S.W., Mudryj, M., Horowitz, I.M. and Nevins, J.R. (1991) Cell
65.1053-1061.
Chinenden, T., Livingsion, D.M. and DeCaprio, J.A. (1993). Mol. Cell. Biol. 13, 3975-.3983. Dalton, S. (1992) EMBO J. 11, 1797-1804.•
Devoto, S.H., M. Mudryj, P. Pines, T. Hunar and J.R. Nevins. (1992). A cyclin A-specific protein kinase complex possesses sequence-specific DNA binding activity:
$ 33" ° is a component of the E2F-cyclin A complex. Cell 68:167-176.
Dyson. N.. Dembskj. M., Fattaey, A., Ngwu. C. Ewen. M. and Helin. K. (1993). J.
Virol. 67. 7641-7647.
Girling, R.. Partridge, J.F.. Bandara. L.R., Burden, N., Totty, N., Hsuan, J.J. and La
Thangue, N.B. (1993) Nature 362, 83-87.
Hardy, S. and Shenk. T. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 4495-4506.
Heibert, S.W.. Chellappan. S.P., Horowitz, J.M. and Nevins, J.R. (1992) Genes Dev. 6,
177-185.
Helin, K.,.Lees, J.A„ Vidal, M., Dyson, N., Harlow, E. and Fattaey, A. (1992) Cell 70,
337-350.
Helin. K.. Wu, C.-L.. Fattaey, A.R., Lees, J.A., Dynlacht, B.D., Ngwu, C. and Harlow.
E. (1993). Genes Dev. 7, 1850-1861.
Hu, Q.. Dyson, N. and Harlow, E. (1990). EMBO I. 9, 1147-1155.
Hu. Q., Bautista, C, Edwards, G.. Defeo-Jones, D., Jones, R. and Harlow, E. (1991).
Mol. Cell. Biol. 11, 5792-5799
Huang, M.M. and Hearing. P. (1989) Genes Dev. 3, 1699-1710.
Ivey-Hoyle, M., Conroy, R., Huber, H., Goodhart, P.. Oliff, A. and Heimbrook, D.C.
(1993) Mol. Cell. Biol. 13. 7802-7812.
Kaelin, W.G., Krek, W., Sellers, W.R., DeCaprio, J.A., Ajchenbaum, F., Fuchs, C.S.,
Chittenden. T., Li, Y., Farnham, P.J., Blånar, M.A., Livingston, D.M. and
Flemington. E.K. (1992) CeU 70, 351-364.
La Thangue, N.B. and Rigby, P.W.J. (1987) Cell 49, 507-513.
La Thangue, N.B. (1994). Trends Biochem. Sei. 19,108-114.
Lees, E.t Fana, B., Dulic, V., Reed, S.I. and Harlow, E. Genes Dev. (1992) 7.1850-1861. Lees. J.A.. Saito, M., Vidal, M-, Valentine. M., Look, T., Harlow. E„ Dyson, N. and
Helin, K. (1993). Mol. Cell. Biol. 13, 7813-7825
Manon. M.J., Baim, S.B., Omelles, D.A. and Shenk, T. (1990). J. Virol. 64, 2345-2359. Maekawa, T., Sakura, H., Kanei-Ishii, C, Sudo, T., Yoshimura, T., Fujisawa, J., Yo&hida,
M. and Ishii. S. (1989).. EMBO J. 8, 2023-2028 ' . Means. A.L., Slansky, J.&-, McMahpn, S.L., Knuth, M.W. and Farnham, P.J. (1992) Mol. Cell Biol. 12. 1054-1063.
Mudryj. M., Devoto. S.H.. Hiebert, S.W., Hunter. T., Pines, J. and Nevins. J.R. (1991)
Cell 65, 1243-1253.
Nevins. J.R. (1992) Science 258, 424-429.
Partrid<g>e, J-F. and La Thangue. N.B. (1991) EMBO J. 10, 3819-3827.
Raychaudhuri, P.. Bagchi. S.D., Neill, S. & Nevins, J.R. (1990) J.Virol. 64, 2702-271Q. Schwartz, J.K., Devoto, S.H., Smith, E.J.. Chellappan, S.P., Jakoi, L. and Nevins, J.R.
(1993) EMBO J. 12, 1013-1020.
Shan. B„ Zhu. X., Chen, P.L., Durfee. T.. Yang, Y., Sharp, D. and Lee. W.H. (1992)
Mol. Cell. Biol. 12, 5620-5631.
Shirodkar. S., Ewen, M., DeCaprio, J.A.. Morgan, J„ Livingston. D.M. and Chittenden.
T. (1992) Cell 68, 157-168.
SivaRaman, L. and Thimmappaya, B. (1987). Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 84,6112-6116. Zamanian, M. and La Thangue, N.B. (1992) EMBO J. 11, 2603-2610.
Zamanian, M. and La Thangue, N.B. (1993) Mol. Biol. Cell. 4. 389-396.
Claims (12)
1. Assay for et potensielt veksthemmende, -inhiberende eller -økende middel,
karakterisert ved at nevnte assay omfatter : (i) å bringe middelet i kontakt med en celle som inneholder et DP-protein; og (ii) å observere fosforyleringstUstanden av DP-proteinet, hvori DP-proteinet omfatter: (a) proteinet av sekv. ID Nr. 2; (b) en allel variant eller homolog derav; c) et protein som er minst 70% homologt til (a);
eller (d) et fragment av et hvilket som helst av (a) til (c) i stand til å danne et heterodimer med E2F-1, E2F-2, E2F-3, E2F-4 eller E2F-5;
hvori proteinene ifølge (b), (c), og (d) omdatter et fosforyleringssete.
2. Assay for et potensielt vekst-hemmende, -inhiberende eller -økende middel,
karakterisert ved at nevnte assay omfatter: (i) å tilveiebringe et ekstrakt fra en celle som inneholder et DP-protein; (ii) å bringe ekstraktet i kontakt med middelet; og (iii) å observere fosforyleringstilstanden av DP-proteinet,
hvori DP-proteinet omfatter: (a) proteinet av sekv. ID nr. 2; (b) en allel variant eller homolog derav (c) et protein som er minst 70% homologt til (a); eller (d) et fragment av et hvilket som helst av (a) til (c) i stand til å danne et heterodimer med E2F-1, E2F-2, E2F-3, E2F-4 eller E2F-5
hvori proteinene ifølge (b) , (c), og (d) omdatter et fosforyleringssete.
3. Assay ifølge krav 2,
karakterisert ved at celleekstratet inneholder et DP-protein i hypofosforylert tilstand.
4. Assay ifølge krav 2,
karakterisert ved at celleekstratet inneholder et DP-protein i fosforylert tilstand.
5. Assay ifalge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at celleekstraktet er oppnådd fra celler i synkron kultur.
6. Assay for et potensielt DP-protein fosforylerende og modulerende middel,
karakterisert ved at nevnt assay omfatter: (i) å bringe et medium som inneholder et hypofosforylert eller et fosforylert DP-protein og et fosforylerende eller defosforylerende enzym i kontakt med middelet;
og (ii) å observere fosforyleringstilstanden av DP-proteinet ,
hvor DP-proteinet omfatter: (a) proteinet av sekv. ID nr. 2; (b) en allel variant eller homolog derav; (c) et protein som er minst 70% homologt til (a); eller (d) et fragment av et hvilket som helst av (a) til (c) i stand til å danne et heterodimer med E2F-1, E2F-2, E2F-3, E2F-4 eller E2F-5;
hvori proteinene ifølge (b), (c), og (d) omdatter et fosforyleringssete.
7. Assay ifølge et hvilket som helst av de foregående krav hvori observasjon av DP-proteinets fosforyleringstilstand er
karakterisert ved måling av mengde av "p i DP-proteinet, måling av grad av binding av et antistoff som gjenkjenner DP-1 (Sekv. ID Nr. 2) i dets hypofosforylert tilstand men som binder svakere til fosforylert DP-1, eller måling av mobilitet av DP-protein på en SDS/poly-acrylamid gel.
8. Antistoff som gjenkjenner DP-1 (sekv. ID nr. 2) i dets hypofosforylert tilstand, men som binder svakere til fosforylert DP-1.
9. Antistoff ifølge krav 8 som er i stand til å binde til et peptid tilsvarende residuene 385 til 400 av DP-1.
10. Antistoff ifølge krav 8 eller 9 som er et monoklonalt antistoff.
11. Fragment av et DP-protein ifølge krav 1 som inneholder et fosforyleringssete som er, eller er ikke, fosforylert, hvori fragmentet består av mellom 20 og 50 sammenhengende aminosyrer avledet fra 100 aminosyre C-terminal delen av DP-proteinet.
12. Fragment av DP-1 som består av sekvensen: RVET PVSYVGEDDDDD.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB9413327A GB9413327D0 (en) | 1994-07-01 | 1994-07-01 | Assay for inhibitors of dp-1 |
PCT/GB1995/001567 WO1996001425A2 (en) | 1994-07-01 | 1995-07-03 | Assay for inhibitors of dp-1 and other dp proteins |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO965584D0 NO965584D0 (no) | 1996-12-27 |
NO965584L NO965584L (no) | 1997-02-28 |
NO317397B1 true NO317397B1 (no) | 2004-10-25 |
Family
ID=10757696
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19965584A NO317397B1 (no) | 1994-07-01 | 1996-12-27 | Assay for inhibitorer av DP-1- og DP-proteiner |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5871901A (no) |
EP (1) | EP0769144B1 (no) |
JP (1) | JPH10502252A (no) |
AT (1) | ATE186119T1 (no) |
AU (1) | AU698473B2 (no) |
CA (1) | CA2193091A1 (no) |
DE (2) | DE769144T1 (no) |
DK (1) | DK0769144T3 (no) |
FI (1) | FI965289A0 (no) |
GB (1) | GB9413327D0 (no) |
NO (1) | NO317397B1 (no) |
NZ (1) | NZ288712A (no) |
WO (1) | WO1996001425A2 (no) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6127505A (en) * | 1995-02-02 | 2000-10-03 | Simula Inc. | Impact resistant polyurethane and method of manufacture thereof |
GB9610195D0 (en) * | 1996-05-15 | 1996-07-24 | Medical Res Council | Assay |
US6159691A (en) * | 1996-05-15 | 2000-12-12 | Prolifix Limited | Assay for a putative regulator of cell cycle progression |
EP0963999A4 (en) * | 1996-09-30 | 2004-09-15 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | E2F ACTIVITY INHIBITORS |
US6387649B1 (en) | 1996-09-30 | 2002-05-14 | Prolifix Limited | Assay for a regulator of cell cycle progression |
WO1999053069A2 (en) * | 1998-04-09 | 1999-10-21 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Cell cycle regulatory proteins cdc2 and pitslre from plants |
GB0308711D0 (en) * | 2003-04-15 | 2003-05-21 | Univ The Glasgow | Assay methods |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE181360T1 (de) * | 1992-10-29 | 1999-07-15 | Medical Res Council | Testreihenanalyse-verfahren mit transkriptionsfaktor dp-1 |
WO1994018324A2 (en) * | 1993-02-12 | 1994-08-18 | The Salk Institute For Biological Studies | Phospho-specific antibodies against transcription factors, more specifically against a creb derived peptide |
-
1994
- 1994-07-01 GB GB9413327A patent/GB9413327D0/en active Pending
-
1995
- 1995-07-03 AT AT95923486T patent/ATE186119T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-07-03 CA CA002193091A patent/CA2193091A1/en not_active Abandoned
- 1995-07-03 DE DE0769144T patent/DE769144T1/de active Pending
- 1995-07-03 DE DE69513025T patent/DE69513025T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-03 JP JP8503745A patent/JPH10502252A/ja active Pending
- 1995-07-03 NZ NZ288712A patent/NZ288712A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-07-03 DK DK95923486T patent/DK0769144T3/da active
- 1995-07-03 AU AU28036/95A patent/AU698473B2/en not_active Ceased
- 1995-07-03 EP EP95923486A patent/EP0769144B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-03 US US08/602,846 patent/US5871901A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-03 WO PCT/GB1995/001567 patent/WO1996001425A2/en active IP Right Grant
-
1996
- 1996-12-27 NO NO19965584A patent/NO317397B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-12-31 FI FI965289A patent/FI965289A0/fi not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69513025D1 (de) | 1999-12-02 |
NO965584L (no) | 1997-02-28 |
AU698473B2 (en) | 1998-10-29 |
DE69513025T2 (de) | 2000-04-13 |
DK0769144T3 (da) | 2000-05-08 |
DE769144T1 (de) | 1997-07-10 |
JPH10502252A (ja) | 1998-03-03 |
NZ288712A (en) | 1998-09-24 |
NO965584D0 (no) | 1996-12-27 |
US5871901A (en) | 1999-02-16 |
CA2193091A1 (en) | 1996-01-18 |
WO1996001425A2 (en) | 1996-01-18 |
WO1996001425A3 (en) | 1996-03-14 |
EP0769144A2 (en) | 1997-04-23 |
ATE186119T1 (de) | 1999-11-15 |
FI965289A (fi) | 1996-12-31 |
FI965289A0 (fi) | 1996-12-31 |
AU2803695A (en) | 1996-01-25 |
EP0769144B1 (en) | 1999-10-27 |
GB9413327D0 (en) | 1994-08-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Krek et al. | Negative regulation of the growth-promoting transcription factor E2F-1 by a stably bound cyclin A-dependent protein kinase | |
Chen et al. | A new member of the hsp90 family of molecular chaperones interacts with the retinoblastoma protein during mitosis and after heat shock | |
Bandara et al. | DP‐1: a cell cycle‐regulated and phosphorylated component of transcription factor DRTF1/E2F which is functionally important for recognition by pRb and the adenovirus E4 orf 6/7 protein. | |
Ivey-Hoyle et al. | Cloning and characterization of E2F-2, a novel protein with the biochemical properties of transcription factor E2F | |
Adams et al. | Identification of a cyclin-cdk2 recognition motif present in substrates and p21-like cyclin-dependent kinase inhibitors | |
Welch et al. | A C-terminal protein-binding domain in the retinoblastoma protein regulates nuclear c-Abl tyrosine kinase in the cell cycle | |
Girling et al. | A new component of the transcription factor DRTF1/E2F | |
Kanner et al. | Immunoaffinity purification of tyrosine-phosphorylated cellular proteins | |
US5863757A (en) | Transcription factor DP-1 | |
US6962792B1 (en) | Methods and means for inhibition of Cdk4 activity | |
HUT74839A (en) | A novel nuclear mitotic phosphoprotein | |
JP2006340730A (ja) | 転写因子−e2f−5 | |
JP2001504681A (ja) | 蛋白質相互作用の阻害 | |
NO317397B1 (no) | Assay for inhibitorer av DP-1- og DP-proteiner | |
Dou et al. | Cyclin D1/cdk2 kinase is present in a G1 phase-specific protein complex Yi1 that binds to the mouse thymidine kinase gene promoter | |
CA2301333C (en) | Prb2/p130 peptide inhibitors of cdk2 kinase activity | |
AU709319B2 (en) | Transcription factor E2F-4 | |
Yee et al. | Biochemical characterization of the human cyclin-dependent protein kinase activating kinase: Identification of p35 as a novel regulatory subunit | |
WO1997002354A1 (en) | INTERACTION OF p53 WITH TRANSCRIPTION FACTOR DP-1 | |
US6303335B1 (en) | Transcription factor E2F-4 | |
US7160677B1 (en) | Transcription factor DP-1 | |
CA2603132A1 (en) | Peptide inhibitors of cyclin-dependent kinase activity and uses thereof | |
Blue et al. | 220 and 130 kDa myosin light chain kinases have distinct tissue distributions and intracellular localization patterns | |
JP2008515797A (ja) | オスの避妊標的物としてのtsskファミリーメンバーおよびtsksの評価 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |