JPH11509089A - ｐ５３と転写因子ＤＰ−１との相互作用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 p53と転写因子DP-1（および他のDPファミリーメンバー）またはE2F-1（またはE2F-5までの他のE2Fタンパク質）との複合体を開示する。この新規複合体は、p53アゴニストまたはアンタゴニスト、特に、DP-1および／またはE2F-1に対するp53の正常の結合を妨げることにより細胞周期の進行をモジュレーションするアゴニストまたはアンタゴニストである潜在的化学療法剤に関してアッセイするために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 p53 と転写因子DP-1との相互作用 本発明は、転写モジュレーターであるタンパク質p53とDPタンパク質（例えば、D P1）またはE2Fタンパク質（例えば、E2F-1）との複合体に関する。特に、本発明 は、潜在的治療剤に関するアッセイにおける、これらの複合体の用途に関する。 細胞転写因子DRTF-1/E2Fおよび癌抑制タンパク質p53は、初期の細胞周期事象の 制御において重要な役割を果たしている。DRTF1/E2Fは、細胞周期を制御する遺 伝子（例えば、ＤＮＡ合成に関与するもの）の転写を調整し統合するが、これは 、その転写活性をモジュレーションする網膜芽細胞腫癌抑制遺伝子産物（pRb） などの調節タンパク質の働きによると考えられている。これに対し、p53は、染 色体ＤＮＡの完全性を監視し、例えばＤＮＡ損傷に応答して、適宜、細胞周期の 進行を妨げると考えられている。一般的なDRTF1/E2FのＤＮＡ結合活性および転 写活性化は、２つの異なるタンパク質ファミリーのメンバーが、DP/E2F（例えば 、DP-1とE2F）のヘテロ二量体として相互作用する場合に生じる。多くの細胞型 では、DP-1が、DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性の一般的な成分であり、これが高レベ ルで発現されると、胚繊維芽細胞を発癌的にトランスフォームする。 G1期からＳ期への移行段階は、細胞周期の進行において重要な調節点である。な ぜなら、その移行段階においては、細胞が細胞周期を通じて維持されるために、 多数の遺伝子が転写的に活性化される必要があるからである。これらの遺伝子の 多くは、それらの制御配列内に、初期の細胞周期の進行における転写を調節する のに重要な役割を果たしていると一般に考えられている細胞性転写因子DRTF1/E2 Fのための結合部位を含有する（La Thangue，1994）。 細胞周期制御におけるDRTF1/E2Fの潜在的な役割は、その転写活性に影響を及ぼ すことが知られているタンパク質の特性により強調される。例えば、網膜芽細胞 腫癌抑制遺伝子タンパク質（pRb）およびその類縁体であるp107およびp130（ポ ケットタンパク質と総称される）などの細胞周期を負に調節する一群のタンパク 質は、DRTF/E2Fに結合し、その転写活性を不活性化する（BandaraおよびLa Than gue，1991；Chellappanら，1991；Schwarzら，1993；Cobrinikら，1993）。これ らの相互作用は、癌細胞においては、例えば、アデノウイルスE1a（Nevins，199 2）などのウイルス癌タンパク質の作用により調節解除されることがあり、さら に、細胞周期の進行により一時的に影響を受けることが公知である。（Shirodka rら，1992；Cobrinikら，1993）。細胞周期の移行を調節するもう１つの分子群 であるサイクリンおよびそれらの触媒調節サブユニットは、DRTF1/E2Fと相互作 用する（Bandaraら，1991；Mudryjら，1991；Devotoら，1992；Leesら，1992） 。サイクリンＡ、ＥおよびＤは、適当な触媒サブユニットと共に、ポケットタン パク質の活性に影響を及ぼすと考えられており（Hindsら，1992；Sherrら，1993 ）、サイクリンＡ−cdk2キナーゼによる直接的リン酸化は、DRTF1/E2FのＤＮＡ 結合活性を抑制する（Dynlachtら，1994；Krekら，1994）。全般的には、標的遺 伝子の性質および輸入性シグナル伝達タンパク質の生理学的特性から、DRTF1/E2 Fの活性が、初期の細胞周期の進行の調節および調整において非常に重要な役割 を果たしていると示唆される。 現在、哺乳動物細胞抽出物において定義される一般的なDRTF1/E2FのＤＮＡ結合 活性は、２つの異なるタンパク質ファミリーであるE2FおよびDPからなる一連の ヘテロ二量体（生理的DRTF1/E2Fを構成するE2F/DPヘテロ二量体）から生じるこ とが公知である。現在のところ、E2Fファミリーの５つのメンバー（E2F-1からE2 F-5）が定義されており、これらはE2F/DPヘテロ二量体として、相互作用するポ ケットタンパク質を決定する（Helinら，1992；Ivey-Hoyleら，1993；Kaelinら ，1992；Shanら，1992；Leesら，1993；Beijersbergenら，1994；Ginsbergら，1 994；Sardetら，1995；Buckら，1995；Hijmansら，1995）。タンパク質E2F-4お よびE2F-5は、それぞれ、国際特許出願第PCT/GB95/00868号および第PCT/GB95/00 869号の主題となっている。DPファミリーの３つのメンバー（すなわち、DP-1、D P-2およびDP-3）の存在が公知である（Girlingら，1993および1994；Ormondroyd ら，1995）。これらのうち、DP-1が、例えば3T3細胞において細胞周期中に生じ るDRTF1/E2Fの種々のあらゆる形態に存在することがこれまでに明らかにされて いる（Bandaraら，1994）DRTF1/E2Fの最も一般的なメンバーである（Bandaraら ，1993および1994）。 E2FおよびDPタンパク質は共に、原癌活性を有することが種々のアッセイで示さ れているため、それらは増殖促進活性を有する（Singhら，1994；Ginsbergら，1 994；Johnsonら，1994；Xuら，1995；Joossら，1995）。例えば、DP-1またはDP- 2の過剰発現は、活性化Ha-rasと共に、ラット胚繊維芽細胞のトランスフォーメ ーションを引き起こすが、興味深いことに、これは、コトランスフェクションさ れたE2Fファミリーメンバーの不存在下で明らかに認められる（Joossら，1995） 。Martinら（1995）は、原癌遺伝子MDM2が、E2FファミリーメンバーE2FおよびDP -1と複合体を形成しうると報告している。したがって、この相互作用は、細胞周 期のＳ期への進行を刺激する。MDM2遺伝子産物は、p53の機能をダウンモジュレ ーションすると考えられており、この癌抑制タンパク質のダウンモジュレーショ ンは、MDM2の過剰発現が見出される多数の腫瘍型において何らかの役割を果たし ていると考えられている。Xiaoら（1995）は、MDM2とpRBとの相互作用を示して いる。 本出願では、DP-1が、ＤＮＡ結合特性が異なる少なくとも２つの異なる形態で存 在することを示す。さらに、本発明者らは、p53がDP-1と相互作用することを見 出した。機能的には、p53は、抑制によりDP-1/E2F-1ヘテロ二量体により駆動さ れる転写を調節する。したがって、DP-1は、pRbおよびp53癌抑制タンパク質の活 性により媒介される増殖制御の２つの異なる経路における共通の細胞標的である 。さらに、p53およびMDM2とDP-1との統合は、p53およびMDM2が細胞周期の進行に 影響を及ぼす際の潜在的な経路を明らかにする。 したがって、p53とDP-1/E2Fヘテロ二量体との相互作用の機能的結果は、E2F結合 部位により駆動される転写の不活性化であるが、それに対して、MDM2タンパク質 は、DP-1/E2F依存性転写を活性化する。したがって、DP-1は、増殖制御の２つの 異なる経路における共通の細胞標的であるらしく、pRbおよびp53癌抑制タンパク 質により調節されるこれらの経路が今度は機能的に統合されるらしい。 したがって、本発明は、p53がDP-1と相互作用し、それによりDP/E2F複合体のト ランス活性化活性をモジュレーションしうるという驚くべき知見に基づく。 したがって、本発明は、その第1の態様において、p53とDPまたはE2Fタンパク質 とを含んでなる複合体（好ましくは、実質的に単離された形態のもの）を提供す る。 「DPタンパク質」なる語は、DP-1だけでなく、DP-2およびDP-3および類似の活性 を有する関連タンパク質も包含する意である。「E2Fタンパク質」は、E2Fファミ リーの５つの公知のメンバー（E2F-1からE2F-5まで）、および類似の活性を有す る関連タンパク質を包含する意である。しかしながら、哺乳動物、好ましくはヒ トまたはマウス由来のDP-1タンパク質が好ましい。 これらは共に、さらに、天然に存在する該タンパク質の突然変異体、対立遺伝子 変異体、（別のタンパク質との）融合体または種ホモログを含む。それらは、さ らに、天然に存在する該タンパク質と少なくとも70％相同なタンパク質を含むが 、この場合、その相同タンパク質はp53と複合体を形成する能力を有する。 したがって、「DPタンパク質」なる表現は、 （a）DPタンパク質（例えば、DP-1、DP-2またはDP-3）、 （b）（a）の突然変異体、対立遺伝子変異体または種ホモログ、 （c）（a）または（b）と少なくとも70％相同なタンパク質、 （d）p53またはMDM2と複合体を形成しうる（a）から（c）のいずれかの断片、 （e）少なくとも18アミノ酸長の（a）から（d）のいずれかの断片、または （f）別の（例えば、異種）タンパク質と融合した（a）から（e）のいずれかで 定義されるタンパク質を含む融合タンパク質を含む。 「E2Fタンパク質」なる表現も同様の意義を有するが、勿論、前記（a）の代わり に、E2Fタンパク質（E2F-1からE2F-5まで）が入ることとなる。哺乳動物、好ま しくはヒトまたはマウスのE2F-1が好ましい。 突然変異体は、アミノ酸残基の付加、欠失または置換である１以上の突然変異を 有する。好ましくは、これらの突然変異は、該タンパク質の構造および／または 機能および／または特性に、全くまたは実質的に影響を及ぼさない。一般には、 突然変異体は依然として、必要に応じてp53と複合体を形成する能力を有する。 突然変異体は、天然に存在するもの（すなわち、天然起源から精製または単離さ れているもの）であっても、あるいは合成物（例えば、コードするＤＮＡ上で部 位特異的突然変異誘発を行なうことによるもの）であってもよい。本発明の複合 体中で使用するタンパク質が、天然に存在するものであっても、あるいは組換え 体であってもよいことは明らかであろう。 同様に、「p53」なる語は、DPおよびE2Fタンパク質に関して記載し定義したのと 同様に、断片、突然変異体、対立遺伝子変異体および種ホモログなどを含む。個 々のp53突然変異体は、腫瘍中で見出されるp53突然変異体（例えば、R175、G245 、R248、R249、R273、R282で置換されているもの）の他に、領域100〜150での突 然変異体も含む。 単純化のために、p53タンパク質（およびその突然変異体、対立遺伝子変異体お よび種ホモログなど）を、転写モジュレーターと称することとする。「DPタンパ ク質」および「E2Fタンパク質」に包含されるタンパク質を、転写因子と称する こととする。したがって、本発明の複合体においては、該転写モジュレーターは 、該転写因子に（例えば、可逆的に）結合している。該転写モジュレーターまた は転写因子の１つに対する結合能も複合体形成能も有さないタンパク質は、本発 明の複合体には含まれない。 本発明者らは、DP-1が、免疫化学的試薬を用いて定義される２つの形態で存在す ることを確認した。その２つの形態は、リン酸化の程度で異なることがある。p5 3は、該形態に優先的に結合し、生じる複合体は、DP-1の増殖不活性化作用に寄 与するらしい。 転写モジュレーターまたは転写因子が、相手と複合体を形成するか否かを判定す ることは、その２つのタンパク質を準備し、例えば、SDS-PAGEなどの方法により 該複合体の分子量を測定することにより、あるいは、より好ましくは、タグまた は標識を用いて該複合体の一部を形成する融合タンパク質を検出することにより 複合体が形成された否かを判定することにより可能である。 本発明の複合体が、その天然環境（例えば、体内）で結合しうる他のポリペプチ ドを含まない形態である場合、該複合体は、実質的に単離された形態である。該 複合体は、該複合体の意図される目的を妨げない担体または希釈剤と混合しても よいと理解され、そのような場合であっても依然として、実質的に単離されてい るとみなされる。 本発明の複合体はまた、実質的に精製された形態であってもよく、この場合、そ れが該複合体を含む調製物においては、一般に、該調製物中のタンパク質の90％ 以上、例えば95％、98％または99％が本発明の複合体により構成されている。 対立遺伝子変異体は、同じ動物中に天然に存在し、本明細書中に記載するタンパ ク質と実質的に同様に機能する変異体である。 同様に、種ホモログは、別の種において天然に存在し、本明細書中に記載するタ ンパク質と同等の機能を果たす等価なタンパク質である。ホモログは、任意の１ つの種内で、いくつかの対立遺伝子変異体として存在していてもよく、これらは すべて、ホモログとみなされる。 天然に存在するタンパク質と少なくとも70％相同なタンパク質が、本発明の複合 体における使用で意図され、少なくとも80または90％、より好ましくは少なくと も95％相同なタンパク質も同様である。これは、一般に、少なくとも20個、好ま しくは少なくとも30個、例えば少なくとも40、60または100個またはそれ以上の 連続したアミノ酸の領域に及ぶ。タンパク質の相同性の測定方法は、当該分野で 公知であり、当業者であれば本文脈内で理解できるであろう。相同性は、通常、 アミノ酸の同一性に基づいて計算する（「硬相同性（hard homology）」と称さ れることがある）。 一般に、複合体を形成しうるその突然変異体、断片、対立遺伝子変異体または種 ホモログは、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、例えば、20、25、30、40 、50または60アミノ酸長である。 本発明の複合体は、表示的または検出可能な標識で標識してもよい。該（表示的 ）標識は、該複合体の検出を可能にする任意の適当な標識であってもよい。適当 な標識としては、放射性同位元素、例えば¹²⁵Ｉ、酵素、抗体、リンカー（例え ば、ビオチン）などが挙げられる。本発明の標識された複合体は、イムノアッセ イなどの診断方法において使用することができる。 また、本発明の複合体（または標識複合体）は、固相、例えばイムノアッセイ皿 の壁に固定してもよい。 本発明の第２の態様は、 （a）第１の態様で定義した転写モジュレーターおよび転写因子をコードする 配列、 （b）（a）に相補的な配列、 （c）（a）または（b）における配列と少なくとも80％（例えば、90％）相同 な配列を含んでなるポリヌクレオチド（適切には、実質的に単離された形態のも の）に関する。 また、該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含んでいてもよい。また、それは、その 中に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。オリ ゴヌクレオチドに対する種々の多数の型の修飾が当該分野で公知である。これら には、メチルスルホナートおよびホスホロチオナートバックボーン、該分子の３ 'および／または５'末端でのアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が含まれる。 本発明の目的のためには、本明細書に記載のヌクレオチドは、当該分野で利用可 能な任意の方法により修飾してもよいと理解されるべきである。治療方法で使用 される本発明のポリヌクレオチドのin vivo活性または寿命を増すために、その ような修飾を行なってもよい。 本発明の複合体が、その天然環境（例えば、体内）で結合しうる他のポリペプチ ドを含まない形態である場合、該複合体は、実質的に単離された形態である。該 複合体は、該複合体の意図される目的を妨げない担体または希釈剤と混合しても よいと理解され、そのような場合であっても依然として、実質的に単離されてい るとみなされるであろう。 本発明のポリヌクレオチドは、放射性または非放射性標識を用いる通常の手段に より、例えば表示的または検出可能な標識で標識してもよいし、あるいは、ベク ター中にクローニングしてもよい。 本発明のＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、組換え的、合成的 または当業者に利用可能な任意の手段により製造することができる。また、本明 細書に開示する技術を参照して、それをクローニングすることもできる。 本発明は、本発明のポリヌクレオチドとその相補体とを含んでなる二本鎖ポリヌ クレオチドを含む。 本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、特にＤＮＡま たはＲＮＡポリヌクレオチドの複製および発現に適した（例えば、発現）ベクタ ーに関する。該ベクターは、例えば、複製起点、所望により該ポリヌクレオチド の発現のためのプロモーターおよび所望により該プロモーターの調節体を有する プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってもよい。該ベクターは、 １以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐 性遺伝子または哺乳動物ベクターの場合にはネオマイシン耐性遺伝子を含有して いてもよい。該ベクターは、例えばＲＮＡの製造にin vitroで使用してもよいし 、宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するのに使用してもよい。該 ベクターは、例えば遺伝子治療法にin vivoで使用するように適合させてもよい 。 第３の態様のベクターは、好ましくは、複製可能な組換えベクターである。した がって、該ベクターを使用して該ＤＮＡを複製することができる。好ましくは、 該ベクター中のＤＮＡは、宿主細胞による該コード配列の発現を付与しうる制御 配列に作動可能的に結合している。「作動可能的に結合している」なる語は、記 載されている成分が、それらを意図されているように機能させうる関係で並んで いる状態を意味する。コード配列に「作動可能的に結合している」制御配列は、 該制御配列に適合した条件下で該コード配列の発現が達成されるように連結され ている。本発明の複合体中の成分タンパク質を発現させるために、そのようなベ クターを、適当な宿主細胞中へ形質転換またはトランスフェクションしてもよい 。本発明のベクターは、該転写モジュレーターおよび該転写因子をコードする配 列に作動可能的に結合した別々のプロモーターを含んでいてもよいし、あるいは 、該ベクターは、該モジュレーターと因子の両方を含む単一のコード配列を含ん でいてもよい。この場合、該因子およびモジュレーター配列は、どのような順序 であってもよい。該配列は、所望により、その２つのコード化ポリヌクレオチド 配列が、天然で見出される様態でフォールディングしうるよう設計されたさらに 別の配列（例えば、リンカー配列）により作動可能的に結合している。あるいは 、それは、その２つのコード化ポリペプチド配列の分離を可能とする選択的に切 断できるリンカー配列であってもよい。前者の型のリンカーの一例としては、Ig Gヒンジ領域が挙げられ、一方、後者の型の切断可能な配列は当該分野で十分に 自体公知である。 したがって、本発明の第４の態様は、第３の態様のベクターで形質転換またはト ランスフェクションされた、あるいは、第１の態様で定義した転写モジュレータ ーおよび転写因子の両方をコードするＤＮＡ配列を発現しうる宿主細胞に関する 。 これにより、本発明のポリヌクレオチドの複製および発現が可能となるかもしれ ない。該細胞は、該ベクターに適合するよう選択され、例えば、細菌、酵母、昆 虫または哺乳動物であってもよい。好ましい宿主には、3T3細胞およびSAOS-2細 胞が含まれる（後者の細胞は、機能的な網膜芽細胞腫（pRb）タンパク質およびp 53を欠く）。 第４の態様の宿主細胞は、該転写モジュレーターおよび転写因子（これらの語は 、第１の態様で既に定義されている）の両方を発現し、好ましくは分泌する。好 ましくは、該転写モジュレーターおよび因子は合体して、第１の態様の複合体を 形成するが、そのような相互作用は、細胞の内または外（該宿主細胞を包囲する 培地中（それが存在する場合））で生じる。 そのような発現は、転写モジュレーターおよび転写因子を共にコードする単一の ベクター（例えば、第３の態様のもの）を用いることにより達成することができ る。あるいは、宿主細胞を、２以上のベクターで形質転換またはトランスフェク ションすることができる。第１のベクターは、該転写モジュレーターをコードし 、第２のベクターは、該転写因子をコードする。ついで、両ベクターを、宿主細 胞中にコトランスフェクションして、第４の態様の細胞を作製する。 また、アンチセンスＲＮＡを製造するために、本発明のポリヌクレオチドを前記 ベクター中にアンチセンス配向で挿入してもよい。また、アンチセンスＲＮＡま たは他のアンチセンスポリヌクレオチドを合成的手段により製造してもよい。そ のようなアンチセンスポリヌクレオチドを、細胞中の該転写モジュレーター（DP タンパク質および／またはE2Fタンパク質）のレベルを制御する方法で使用して もよい。そのような方法は、E2F-5 ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳レベルを抑 制または減少させるのに有効な量の該アンチセンスポリヌクレオチドを該細胞中 に導入することを含んでいてもよい。該細胞は、腫瘍細胞などの非制御的に増殖 する細胞であってもよい。 したがって、本発明は、第５の態様において、該複合体の成分タンパク質をコー ドするコード配列の発現を付与し該転写モジュレーターが該転写因子に結合する のを可能とする条件下で、第４の態様の宿主細胞（好ましくは第３の態様の（発 現）ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞）を培養し、そ して、該複合体を回収することを含んでなる、本発明の複合体の製造法を提供す る。 本発明の第６の態様は、第１の態様の複合体、第２の態様のポリヌクレオチド、 第３の態様のベクターおよび第４の態様の宿主細胞の、医学的用途のための使用 に関する。すなわち、そのようなすべての物質（第１の態様から第５の態様まで ）は、ヒトまたは動物の体を療法により治療するための方法に有用である。 意図される用途は、細胞増殖の抑制、または転写の阻害である。したがって、こ の場合の最終的な用途には、癌などの増殖性疾患の治療が含まれる。 該転写モジュレーターは、第１の態様で説明したとおり、天然に存在するp53タ ンパク質でなくてもよい。実際、本発明のスクリーニング方法（後記）を用いて 、天然に存在するタンパク質以外の、同様の特性を有する物質を同定することが できる。また、ついでこれらは、p53タンパク質そのものと同じまたは同様の方 法で使用することができる。 したがって、本発明の第７の態様では、第１の態様の複合体、第２の態様のポリ ヌクレオチド、第３の態様のベクターまたは第４の態様の宿主細胞と、それぞれ 医薬上または獣医学上許容される担体または希釈剤とを含んでなる医薬または獣 医組成物を提供する。 医薬上または獣医学上許容される担体または希釈剤には、経口、直腸、鼻内、局 所（頬、舌下など）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、脊髄内、 硬膜外など）投与に適した製剤中で用いるものが含まれる。該製剤は、単位投与 形で提供されるのが好都合であり、薬学分野でよく知られた任意の方法により製 造することができる。そのような方法は、有効成分を、１以上の補助成分を構成 する担体と一緒にする工程を含む。一般に、該製剤は、有効成分と液体担体また は微小固体担体またはその両方とを均一かつ十分に混合し、ついで該生成物を必 要に応じて成型することにより製造する。 例えば、非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および意図 される受容者の血液に対して該製剤を等張にする溶質を含有していてもよい水性 または非水性の無菌注射溶液；および懸濁化剤および粘稠化剤、および該ポリペ プチドを血液成分または１以上の器官へ標的化するように設計されているリポソ ームまたは他の微小粒子系を含んでいてもよい水性または非水性の無菌懸濁液が 含まれる。 本発明の複合体または転写モジュレーターは、ヒトを含む哺乳動物における増殖 性疾患などの状態の治療、調節または診断に使用してもよい。そのような状態に は、DPまたはE2Fタンパク質または関連ファミリーメンバーなどの１以上の転写 因子の異常な（例えば、異常に高いまたは低いレベルの）および／または異常な （例えば、遺伝子配列の突然変異によるもの）発現に関連したものが含まれる。 前記複合体またはペプチドによる状態の治療または調節には、通常、そのような 治療を必要とする受容者にその複合体またはポリペプチドの有効量を適宜投与す ることが含まれる。 本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の複合体をコードする核酸を保持するベ クターを、遺伝子治療方法で使用してもよい。そのような遺伝子治療は、細胞の 増殖を抑制または阻害し、それにより細胞（例えば、腫瘍細胞）の非制御増殖を 治療することを目的としてもよい。遺伝子治療の方法は、治療が必要な患者中の 細胞内で本発明のいずれかのアンチセンスポリヌクレオチドを発現する能力を有 するベクターの有効量を該細胞へ輸送して、E2FまたはDPｍＲＮＡから対応する タンパク質への翻訳を阻害または抑制することを含み、それにより、DPタンパク 質または関連ファミリーメンバーに対するE2Fタンパク質の結合が阻害されうる 。そのようなベクターは、適切には、ウイルスベクターである。該ウイルスベク ターは、腫瘍細胞へ標的化するのに当該分野で利用可能な適当な任意のベクター であってもよい。例えば、Huberら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1991）88，8 039）は、ヘパトーム、乳、結腸または皮膚細胞の形質転換に両種指向性レトロ ウイルスを使用することを報告している。また、Culverら（Science(1992)256； 1550-1552）は、Ramら（Cancer Research(1993)53；83-88）と同様、ウイルス指 向性酵素プロドラッグ療法（virus-directed enzyme prodrug therapy）でレト ロウイルスベクターを使用することを記載している。Englehardtら（Nature Gen etics(1993)4；27-34）は、嚢胞性繊維症膜貫通産物（CFTR）を細胞中へ輸送す るのに、アデノウイルスに基づくベクターを使用することを記載している。 本発明の第８の態様では、細胞の非制御性増殖（例えば、癌）、ウイルス性疾患 、 心疾患、自己増殖性障害および自己免疫障害（例えば、乾癬）を治療するための 医薬の製造における、本発明の （a）第１の態様の複合体、 （b）第２の態様のポリヌクレオチド、 （c）第３の態様のベクター、または （d）第４の態様の宿主細胞 の使用を提供する。 もう１つの態様において本発明は、増殖性またはウイルス性疾患の治療のための 推定化学療法剤を同定するための新規アッセイであって、DPタンパク質、E2Fタ ンパク質および推定化学療法剤を接触させ、そして、該剤がDP/E2Fタンパク質複 合体の形成を阻害する程度を測定することを含んでなる新規アッセイを提供する 。このアッセイでは、剤の不存在下のアッセイ条件下でDP-1および／またはE2F タンパク質がヘテロ二量体を形成するよう各タンパク質が十分に準備されている 限り、完全なDPおよび／またはE2Fタンパク質を使用する必要はないかもしれな い。DP-1（およびE2F1、2および3）のクローニングおよび配列決定は、当該分野 で公知であり、これらのタンパク質の組換え発現のための方法は、当業者に公知 であろう。 本発明の第９の態様では、潜在的または推定化学療法剤を同定するためのスクリ ーニング方法またはアッセイであって、転写モジュレーターおよび潜在的または 推定化学療法剤を準備し、そして、該剤が該転写モジュレーターに結合しうる程 度、または該剤が該モジュレーターと本発明の複合体を形成するか否かを測定す ることを含んでなる方法またはアッセイを提供する。 また、この第９の態様は、該転写モジュレーターが転写因子で置換される同様の 方法に拡張される。該転写モジュレーターおよび因子は、本発明の第１の態様で 定義したとおりである。 したがって、本発明は、第10の態様において、潜在的または推定化学療法剤を同 定するためのスクリーニング方法またはアッセイであって、 （Ａ）以下の成分： （i）DPタンパク質および／またはE2Fタンパク質、 （ii）p53ポリペプチド、および （iii）潜在的または推定化学療法剤を準備し、成分（i）および（ii）が（iii ）の不存在下で複合体を形成する条件下でそれらを接触させ、そして、 （Ｂ）成分（iii）が該複合体を妨害または阻害し、成分（i）または（ii）の結 合を阻害または促進し、または該複合体の活性に影響を及ぼす程度を測定するこ とを含んでなる方法またはアッセイを提供する。 このアッセイでは、アッセイの結果を測定できるよう、該成分のいずれかの１以 上を、例えば放射活性または比色標識により標識してもよい。推定化学療法剤に は、本発明の第１の態様で記載した転写モジュレーターおよび因子が含まれる。 DPおよびE2Fタンパク質の突然変異体、ホモログおよび断片は、MDM2およびp53転 写モジュレータータンパク質の突然変異体、ホモログおよび断片に対応する形で 既に定義されており、それらのすべては、本発明のアッセイで有用である。 そのようなアッセイは、DPタンパク質を要することなく行なうことができる。し かしながら、DPおよびE2Fの両タンパク質が存在する場合、（i）と（ii）との複 合体は、例えば、それがE2F ＤＮＡ結合部位にin vitroで結合する能力により測 定してもよい。あるいは、該アッセイは、レポーター遺伝子に結合したE2F結合 部位を含むプロモーターを該複合体が活性化する能力を測定するin vivoアッセ イであってもよい。該in vivoアッセイは、例えば、酵母、昆虫、両生類または 哺乳動物細胞で行なってもよい。 したがって、本発明のアッセイは、２成分アッセイ（第９の態様のもの）および ３成分アッセイ（第１０の態様のものなど）の両方を含むことがわかるであろう 。２成分または３成分系のいずれにおいても（好ましくは前者においては）、該 成分の一方または両方は、融合タンパク質を含んでいてもよい。その融合タンパ ク質は、前記のとおり、p53、DPおよびE2Fタンパク質なる語に含まれる。 例えば、関心のある第１のタンパク質を、GAL-4ドメインなどの外来性ＤＮＡ結 合ドメインを含むタンパク質に融合させてもよい。そのタンパク質はＤＮＡに結 合すると考えられるが、単独では不活性であり、それは転写を活性化しないであ ろう。関心のある第２のタンパク質（例えば、第１のタンパク質が転写モジュレ ーターである場合は、DPタンパク質）をついで、GAL-4アクチベーターなどの外 来性活性化ドメインを含むタンパク質に融合させてもよい。化学療法剤の不存在 下では、関心のある第１および第２のタンパク質（これは、通常、転写モジュレ ーターおよび転写因子であろう）は、複合体を形成するであろう。それぞれの融 合タンパク質（例えば、外来性ＤＮＡ結合ドメインおよび外来性活性化ドメイン ）が存在する場合、それらは協同して活性化を引き起こすであろう。ついで、化 学療法剤がこの方法に及ぼす影響をモニターする。該剤は、通常、細胞の周囲の 培地に添加され、一方、細胞内では、その２つの融合タンパク質が発現される。 したがって、本発明の複合体に有用なタンパク質は、それ自体が融合タンパク質 であってもよい。それらは、その融合タンパク質を検出するための標識またはタ グとして作用しうる別の（異なる）タンパク質に融合させてもよい。適当なタグ には、GSTおよび連続したヒスチジン残基（例えば、６個）が含まれ、後者はニ ッケルに結合しうる。 該タンパク質を精製したり、それをアッセイで使用できるようにするために、そ ような融合タンパク質を使用してもよい。該融合タンパク質またはタグは、別の タンパク質または物質（これは、カラム上に存在していてもよい）または抗体に 対して親和性を有していてもよい。例えば、該タンパク質をGSTに融合させた場 合、これは、グルタチオンセファロース（商標）ビースを用いてそれを精製する 場合に有用かもしれない。あるいは、融合タンパク質上のタグに特異的な抗体を 使用してもよい。 該アッセイで測定しうる候補化学療法剤には、第１の態様で記載した転写モジュ レーターおよび転写因子だけでなく、特に、 （a）p53タンパク質、 （b）その対立遺伝子変異体または種ホモログ、または （c）（a）と少なくとも70％相同なタンパク質 の10アミノ酸以上の断片も含まれる。 本発明のアッセイは、標準的な技術を用いて行なうことができ、成分（i）およ び（ii）は、公知の公的に入手可能な起源から得られる。しかしながら、１つの 好ましい方法における利点は、宿主細胞（例えば、第４の態様のもの）により発 現されるタンパク質が組換え体で得られることである。in vitroで行なうアッセ イにおいて、宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換することができる 。本発明では、いくつかのアッセイが意図される。大まかに言って、これらは以 下のとおり分類することができる。 １．該転写モジュレーターと該転写因子との間の相互作用に影響を及ぼす物質 を同定するためにアッセイを行なう。そのような物質は、トランス活性化抑制特 性を阻害または変化させるかもしれない。そのような物質は、天然分子そのもの より有効かもしれない。例えば、それらは、p53より有効に、転写活性を抑制す るかもしれない。一方、それらは、p53より低レベルの転写抑制活性を有するか もしれない。したがって、そのような物質は、適宜、p53のアゴニストまたはア ンタゴニストのいずれかとして作用するかもしれない。該物質は、該転写モジュ レーターと転写因子との相互作用または結合を阻害するかもしれないし、あるい は、転写モジュレーターまたは因子タンパク質のいずれかに擬態することにより 、この相互作用または該転写モジュレーターと因子との複合体の形成を競合阻害 するかもしれない。 そのようなアッセイは、p53のアゴニストである化合物、または増殖を阻害する と考えられるp53により認識されるDP-1形態の細胞内存在を促進する他の物質を 同定するのに特に有用かもしれない。例えば、そのような化合物は、p53に擬態 してDP-1に結合するかもしれない。あるいは、該化合物は、DP-1に対するp53の 結合を促進するかもしれない。また、DP-1に結合する能力を腫瘍細胞中で喪失し ているp53突然変異体のそのような能力を回復させる化合物に関してアッセイす るために、該アッセイにおいてp53突然変異体（例えば、前記に記載されている もの）を併用してもよい。 ２．E2Fタンパク質トランス活性化の阻害剤（すなわち、転写の活性化の阻害 ）を見つけるためにアッセイを行なう。したがって、この阻害剤は、E2Fタンパ ク質がＤＮＡ（通常はE2F結合部位）に結合するのを阻害する。適当と考えられ る阻害剤は、タンパク質であり、p53と同様または同じ作用を有する。したがっ て、第１の態様の複合体での定義と同様、適当な阻害分子は、p53の断片、突然 変異体、対立遺伝子変異体または種ホモログを含んでいてもよい。 ３．DP-1に対するp53の結合を擬態する（ヘテロ）二量体化の阻害剤に関する アッセイ。E2Fタンパク質に対するDP-1の結合は、細胞増殖を促進し、したがっ て、p53は、DP-1に対する結合に関してE2Fと競合する。そのような阻害剤は、E2 Fタンパク質（例えば、E2F-1）とDPタンパク質（例えば、DP1）との二量体化を 妨げるかもしれない。該アッセイは、p53および／またはE2Fが相互におよび阻害 剤候補と競合する能力を測定することにより結合の阻害の程度を測定することが できる。勿論、該阻害剤は、第１の態様の複合体で定義されたDPまたはE2Fタン パク質の断片、突然変異体、対立遺伝子変異体または種ホモログであってもよい 。したがって、本発明では、細胞の非制御性増殖に基づく疾患または非制御性増 殖が疾患の重要なまたは必須の病理学的態様である疾患の治療または予防のため の物質の同定が意図される。これは、癌、ウイルス性疾患、自己増殖そのもの、 および自己免疫疾患（例えば、乾癬）を含む。この場合に意図される化合物には 、p53アゴニストが含まれるであろう。 また、分裂細胞（例えば、造血幹細胞および／または骨髄細胞）の増殖を一時的 に阻害したいこともあるかもしれない。これらの態様においては、一般に、E2F タンパク質の活性を抑制、阻害または妨害することが求められる。 これに対して、いくつかの疾患および状態は、E2F発現を増加させることにより 、例えば、過剰発現を促進または誘導することにより治療することができる。そ れは、p53アンタゴニストを使用することにより達成することができるであろう 。これは、好ましくは、アポトーシス（これはプログラムされた細胞死としても 公知である）を引き起こす。E2Fタンパク質の過剰発現は、細胞死を引き起こす ため（Qinら，1994）、この態様は、癌の治療においても使用することができる 。したがって、E2Fおよびp53は、相互の活性をモジュレーションするらしく、ア ンタゴニストによる該相互作用の阻害は、E2Fで認められるアポトーシス効果を 促進するかもしれない。 以下、実施例による例示により、本発明を説明することとする。 実施例１ 免疫化学： モノクローナル抗体421およびSMP14は、既に記載されている（Harlowら，1981； Picksleyら，1994）。抗DP-1（A）は、DP-1のＮ末端領域を表現するペプチドに 対して産生されたウサギポリクローナル抗ペプチド血清であり、既に記載されて いる（Girlingら，1993；Bandaraら，1994）。抗DP-1（D）ウサギポリクローナ ル抗ペプチド血清（Bandaraら，1994）およびモノクローナル抗体32.3を、DP-1 中のＣ末端領域（残基385〜400）を表現するペプチドに対して産生させた。抗DP -1（A）、抗DP-1（D）または32.3による免疫ブロッティングを、既に記載されて いるとおりに行なった。特異性を評価するために、相同ペプチドまたは対照の無 関係なペプチド（ペプチド１）のいずれかを加えた。 免疫沈降のために、ペプチドの存在下で32.3を加えたLSL緩衝液（50mMトリス−H Cl(pH8.0)、150mM NaCl、0.1％NP40、２μg/mlアプロチニン、0.5mM PMSF）中で 細胞を収穫し、氷上で１時間インキュベートした。免疫複合体をプロテインＡ− セファロースで集め、LSL緩衝液中でよく洗浄し（少なくとも３回）、SDSサンプ ル緩衝液中に遊離させ、電気泳動し、抗DP-1（A）で免疫ブロッティングした。 連続的な免疫沈降および免疫ブロッティングのための方法は、既に記載されてい る（Bandaraら，1993）。 抗DP-1免疫アフィニティークロマトグラフィーのために、２mlの抗DP-1（A）Ab を硫酸アンモニウム（45％）で沈降させ、10mMリン酸ナトリウム（pH7.5）中で 完全に透析した。得られた免疫グロブリンを３mlのCNBr活性化セファロースに結 合させ（製造業者に推奨されているとおりに行なった）、３mlのF9 EC抽出物と 共に４℃で24時間インキュベートした。該カラムを、0.5％ NP40、前溶出緩衝液 を含有するNEP緩衝液（Girlingら，1993）で洗浄し、0.1Mグリシン（pH2.5）を 用いて結合タンパク質を溶出した。サンプルを集め、中和した。ピーク画分をト リクロロ酢酸で沈殿させ、SDSサンプル緩衝液中で可溶化する前にアセトンで洗 浄し、32.3またはSMP14のいずれかで免疫ブロッティングした。 ゲル遅延法： アデノウイルスE2aプロモーターから得たE2F結合部位を用いるF9 EC細胞抽出物 によるゲル遅延法を、既に記載されているとおりに行なった（Girlingら，1993 ）。該結合反応に、競合ペプチドと共にモノクローナル抗体32.3を加え、30℃で 10分間インキュベートした。32.3により免疫沈降するDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性 を評価するために、相同または無関係のいずれかのペプチドの存在下で前記の とおり免疫沈降を行なった。該免疫沈降物をLSL中で洗浄した後、LSL中の競合す る相同ペプチドを加え、ついで上清をDRTF1/E2FＤＮＡ結合活性に関してアッセ イした。 E2F-1/DP-1ヘテロ二量体のE2F部位結合活性に対するp53の効果を、in vitroで転 写され翻訳されたDP-1（pG4DP-1；４）およびE2F-1（pSP72；27）を用いてアッ セイした。in vitro転写および翻訳は、TNT T7/SP6共役網状赤血球ライゼート系 （Promega）で行なった。pH6-mmp53 wtは、His標識完全マウスp53タンパク質（G unnar WeidtおよびWolfgang Deppertに快く提供していただいた）をコードする 。His標識マウスp53は、IPTGで誘導された細菌培養の500mlのペレットから精製 した。該細菌ペレットを10mlの変性緩衝液（100mMリン酸ナトリウム、10mMトリ ス塩基、6.0M塩酸グアニジン、30mMイミダゾール）（pH8.0）に再懸濁し、室温 で穏やかに２時間攪拌した。最終濃度が５mMになるまでMgCl₂を加え、４℃で遠 心分離を繰り返すことにより細胞デブリを除いた。該上清に400μlのニッケルア ガロース（固体）（QIAGEN）を加え、室温で１時間回転させた。該樹脂を、それ ぞれ２×50ml容量の変性緩衝液（pH8.0）、変性緩衝液（pH6.4）および復元緩衝 液（25mMリン酸ナトリウム(pH7.0)、300mM NaCl、10mMβ−メルカプトエタノー ル）（含有する塩酸グアニジンの濃度を１M、ついで0.1Mとし、そして最後に０M とする）で段階的に洗浄する。イミダゾール緩衝液（150mMイミダゾール、100mM NaCl、50mMトリス−HCl(pH8.0)）で連続的に洗浄することによりタンパク質を 該樹脂から溶出させ、SDS-PAGEにより分析した。等量の熱変性または未変性のHi s標識p53を、該結合反応に加えた。 分画： F9 EC細胞抽出物のヘパリン−セファロースおよびE2F結合部位アフィニティーク ロマトグラフィーを、既に記載されているとおりに行なった（Girlingら，1993 ）。DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性に関して分画をアッセイし、記載されているとお りに免疫ブロッテイングした。 p53に関する結合アッセイ： pH6-mmp53 wtは、His標識完全マウスp53タンパク質（Gunnar WeidtおよびWolfga ng Deppertに快く提供していただいた）をコードする。通常の方法により、pH6- mmp53、GST-pRb（Bandaraら，1991）およびGST単独を誘導し、精製した。in vit ro結合アッセイでは、適当なアガロース（グルタチオン−アガロースまたはニッ ケル−アガロース）に結合した15μlの融合タンパク質を、４℃で２時間絶えず 回転させながら、F9 EC全細胞抽出物と共にインキュベートした。該懸濁液を、 遠心し、LSL緩衝液での洗浄を繰り返し、SDSローディング緩衝液に再懸濁し、抗 DP-1（A）で免疫ブロッティングした。 DP-1に関する結合アッセイ： GST-DP-1は、pGEX-3X中でGSTと融合した完全なDP-1タンパク質をコードする。そ れを、通常の方法により誘導し、精製した。E2F-1、E2F-4および野生型p53を、T NT共役ライゼート（Promega）中で、製造業者の推奨に従い、³⁵Ｓメチオニンの 存在下で転写・翻訳した。図５中のin vitro結合アッセイでは、１mM EDTA、１m M DTT、0.5％ Tween 20を含有するPBSA中、該翻訳物に融合タンパク質を加え、3 0℃で30分間インキュベートした。ついで、グルタチオンビーズを加え、さらに3 0分間インキュベートした。ビーズを集め、SDSサンプル緩衝液中で可溶化する前 に、同じ緩衝液中で４回洗浄した。DP-1が結合するp53中の領域をマッピングす るために、p53突然変異体のパネルを作製した。鋳型としてヒトp53（9php53Cl;5 0）を用いるPCRにより、GST-p53、1-73、1-143および1-235を作製した。PCR産物 を、pGEXベクター（Pharmacia）中にフレームを合わせてクローニングした。通 常の方法により、融合タンパク質を誘導し、精製した。in vitro結合反応では、 グルタチオン−アガロースビーズに結合したGSTまたはGST-53融合タンパク質の 約10μgを、溶解緩衝液（50mMトリス(pH8.0)、150mM NaCl、10mg/mlリゾチーム 、0.5mM PMSF、50μg/mlロイペプチン、50μg/mlプロテアーゼ阻害剤、50μg/ml アプロチニンおよび40mM DTTを含有）中のin vitroで転写されたDP-1の15μlに 加えた。４℃で2.5時間インキュベートした後、該ビーズを集め、溶解緩衝液中 で４回洗浄した。タンパク質をSDSサンプル緩衝液中に遊離させ、電気泳動し、 抗DP-1（A）または抗DP-1（D）で免疫ブロッティングした。 MDM2に関する結合アッセイ： pGST-MDM2は、pGEX-3X中でGSTと融合した完全なMDM2タンパク質をコードする。 それを、通常の方法により誘導し、精製した。DP-1および野生型p53を、TNT共役 ライゼート（Promega）中で、製造業者の推奨に従い、³⁵Ｓメチオニンの存在下 で転写・翻訳した。in vitro結合アッセイでは、１mM EDTA、１mM DTT、0.5％ T ween 20を含有するPBSA中、該翻訳物に融合タンパク質を加え、30℃で30分間イ ンキュベートした。ついで、グルタチオンビーズを加え、さらに30分間インキュ ベートした。ビーズを集め、SDSサンプル緩衝液中に可溶化する前に、同じ緩衝 液中で４回洗浄した。 一過性トランスフェクション： レポーター構築物p3xWT-GL、p3xMT-GL、pCMV-βgal、pCMV-E2F-1およびpCMV-DP- 1はすべて、既に記載されている（Girlingら，1994；Joossら，1995）。pC53-SN 3は、CMVエンハンサー／プロモーター領域により駆動される野生型p53をコード する（Bakerら，1990）。pJ4Ω-MDM2は、完全なMDM2タンパク質をコードする（O linerら，1992）。各トランスフェクションにおけるＤＮＡの全量は、p53力価測 定の場合にはpCMV-neoBam、MDM2力価測定の場合にはpJ4Ωによる中空ベクターよ りなるものであった。細胞を、通常のリン酸カルシウム法によりトランスフェク ションした。ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイを、既に記載 されているとおりに行なった（Girlingら，1994）。各処理は２通りの反復実験 で行なった。 結果DP-1 の種々の形態 3T3細胞における細胞周期の進行中に、p55L（下）およびp55U（上）と称される5 5kDの２つの異なるDP-1ポリペプチドを分離することができる。p55Lは、細胞が Ｓ期に進入し始めるG1の終了時の近くに出現する（Bandaraら，1994）。p55のそ の２つの形態をより詳細に特徴づけるために、抗ペプチド（p55Lを認識するモノ クローナル抗体32.3）を調製した。F9 EC細胞の同調培養から調製された抽出物 を免疫ブロッティングすることにより、ポリクローナル抗血清（抗DP-1(A)）はp 55の両方の形態を示し、これに対して、モノクローナル抗体32.3ではp55Lに限定 された。相同ペプチドの存在下および不存在下、32.3で免疫沈降させ、ついで該 免疫沈降物をポリクローナル抗DP-1（A）でプロービングすることにより、32.3 がp55Lを認識するというさらなる証拠が得られた。免疫沈降したポリペプチドは 、 p55Lと共に移動した。 DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性に対する32.3の効果を調べた。相同ペプチドの存在下 で調製された反応と比べて、F9胚性癌（EC）細胞（European Culture Collectio nから入手）から調製された抽出物では、該結合反応に32.3を加えると、DRTF1/E 2Fのほとんど完全な移動が生じた。多種多様な他の型の細胞から調製された抽出 物において、同様の結果が認められた。さらに、32.3は、F9 EC細胞抽出物から のDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性を免疫沈降させたが、この場合、p55Lが該免疫沈降 物中に存在するDP-1の優勢な形態であった。これらのデータは、p55LがDRTF1/E2 F ＤＮＡ結合活性の主要な成分であることを示唆するものである。 この見解を立証するために、F9 EC細胞抽出物を分画する間に、p55Uおよびp55L のクロマトグラフィー特性を調べ、各ポリペプチドの存在を、各画分内のDRTF1/ E2F ＤＮＡ結合活性の存在と相関させた。F9 EC細胞から調製した抽出物を、ヘ パリン−セファロース上で分画し、ついでゲル遅延法によりＤＮＡ結合活性に関 してアッセイした。ヘパリン−セファロース上を通過させた後に画分上で行なっ た分析は、p55Uでなくp55LがDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性と相関することを示した が、p55Uおよびp55Lは共にF9 EC細胞抽出物中に存在していた。したがって、p55 Ｕは、ＤＮＡ結合活性を欠く画分中で優勢であった。これに対して、DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性は、E2F結合部位アフィニティークロマトグラフィー（Girlingら ，1993）によるさらなる精製の前および後で共に、p55Lと相関していた。E2F結 合部位アフィニティークロマトグラフィーをさらに繰り返しても、その相関は変 化しなかった。 p55Lおよびp55Uを含有する画分（DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性を有するものと有さ ないもの）を一緒に加えた場合には、未分画細胞抽出物中のp55UおよびLのもと の組成物が再構成された。これらのデータを、モノクローナル抗体32.3を用いて 行われた研究から得られた結果と組み合わせると、p55LはDRTF1/E2F ＤＮＡ結合 活性中に存在し、さらに、p55Ｕは、E2F部位に結合できないか又はより低い効率 で結合するDP-1の形態であるらしいことが示唆される。DP-1 はp53と会合する F9 EC細胞から調製された³⁵Ｓ−メチオニン放射能標識抽出物からのDP-1を免疫 沈降させるために、種々のポリクローナル抗DP-1ペプチド抗血清を連続的に使用 したところ、種々の分子量を有する多数のポリペプチドが検出された。このよう に、抗DP-1（A）は、一定範囲の分子量を有する一群のポリペプチドを特異的に 免疫沈降させた。該抗DP-1（A）免疫沈降物を遊離させ、p55Lに対して32.3と同 様の特異性を有する抗DP-1（D）で連続的に再免疫沈降させた場合、抗DP-1（A） と会合したポリペプチドのサブセットが明らかに認められた。したがって、これ らのデータは、多数の細胞ポリペプチドがp55Uと会合することを示唆する。 DP-1と会合するこれらのポリペプチドをさらに詳細に特徴づけるために、同様の 分子量を有する既に同定されているポリペプチドに対する抗血清が、それらを認 識するか否かを評価した。一連の抗血清を調べ、それらの２つに特に関心を持っ た。例えば、免疫沈降法で抗p53モノクローナル抗体（421）を使用し、ついで抗 DP-1（A）で免疫ブロッティングしたところ、p55が現れた。しかしながら、p55L でなくp55Uが、p53と優先的に共免疫沈降した。この結果を立証するために、p53 とDP-1との相互作用に関するさらなる証拠を、p53融合タンパク質をF9 EC細胞抽 出物中でインキュベートするin vitro結合アッセイから得た。これらの条件では 、p53は、F9抽出物中のDP-1と特異的に会合した。予想どおり、F9 EC細胞抽出物 中のDRTF1/E2Fに結合することが知られているpRb融合タンパク質（Bandaraら，1 991）は、同じアッセイ条件でDP-1と相互作用した。全般的に、これらの結果か ら、p53が生理的条件でDP-1と会合し、さらに、p53と相互作用するDP-1の好まし い形態がp55Uであることが示唆される。 同様の実験を、p53トランス活性化の転写アンタゴニストであると一般に考えら れている（Olinerら，1992）MDM2癌遺伝子でコードされるMDM2を認識するモノク ローナル抗体を用いて行なった。これらの実験（データは示していない）は、Ma rtinら（1995）およびXiaoら（1995）も報告している相互作用を確認するもので ある。 DP-1とMDM2との相互作用の効率を、p53とMDM2との結合と比較した。GST融合タン パク質として発現されるMDM2が、in vitroで翻訳されたDP-1およびp53に結合す る能力を評価するアッセイを用いた。p53およびMDM2がこのアッセイ条件で会合 する能力を有し、同様に、DP-1がMDM2と相互作用しうることが判明した。同様の 結果が、DPファミリーの残りのメンバー（DP-2およびDP-3）で得られた。DP-1と MDM2との相互作用の効率は、p53/MDM2相互作用より若干低いようであった（ただ し、DP-1もp53も対照GSTタンパク質に結合できなかったため、両方の相互作用は 特異的であった）。p53融合タンパク質に対するin vitro翻訳DP-1の特異的結合 に関する同様の実験を行なった。全般的に、これらのin vitro結合のデータは、 哺乳動物細胞におけるDP-1とMDM2およびp53との特異的相互作用に関する免疫沈 降研究からの結果を支持するものである。DP-1 の突然変異分析 DP-1とp53とがin vitroで相互作用するか否かを判定し、相互作用の効率をE2Fフ ァミリーメンバーに対するDP-1の結合と比較するために、本発明者らは、in vit roで翻訳されたp53およびE2Fタンパク質にGST融合タンパク質として発現されるD P-1が結合する能力を評価するアッセイを用いた。予想どおり、DP-1は、用いた アッセイ条件で、E2F-1またはE2F-4のいずれとも会合することができた。同様に 、DP-1は、p53と相互作用することができた。同様の結果が、DPファミリーの残 りのメンバー（DP-2およびDP-3）で得られた。DP-1とp53との相互作用は、DP-1 とE2F-1またはE2F-4との相互作用と同程度に効率的であり、また、p53は対照GST タンパク質と結合しなかったため、該相互作用は特異的であった。これらのin v itro結合データは、哺乳動物細胞におけるDP-1とp53との特異的相互作用に関す る免疫沈降研究からの結論を支持するものである。 同様のアッセイを用いて、本発明者らは、p53に結合するのに必要なDP-1中の領 域を決定した。残基172および173で改変されているDP-1タンパク質と共に、Ｎお よびＣ末端トランケート化を表現するDP-1由来の突然変異タンパク質のパネルを 調べた。in vitroで翻訳された野生型DP-1はp53に結合し、該投入DP-1の約20％ が、野生型p53融合タンパク質により維持された。この結合の効率は、DP-1のＮ 末端領域から171アミノ酸残基まで、Ｃ末端領域から79アミノ酸残基までを除去 しても、あるいは残基172および173を突然変異させても、有意な影響を受けなか った。しかしながら、さらに、残基171〜205からのＮ末端欠失、または残基331 〜238からのＣ末端欠失は、p53に対するDP-1の結合活性を有意に減少させた。こ れらのデータから、p53に有効に結合しうるDP-1中の最小領域は、残基171〜331 内で生じるといえる。DP-1のこの領域は、DPファミリーの他のメンバーの間で保 存されているいくつかのドメイン、特に、DCB1およびDCB2（Girlingら，1994；O rmondroydら，1995）、DEFボックス、DP-1とE2Fファミリーメンバーとの間のヘ テロ二量体化に関与する重要な領域を含有する。重要なことは、p53に保持され たE2F-1の量はバックグラウンドレベルであったため、このアッセイ条件では、i n vitroで翻訳されたE2F-1は、p53と相互作用しなかったことである。DRTF1/E2F の場合、DPタンパク質は、p53と相互作用しうる主要成分である。免疫化学的に異なるDP-1形態がp53と会合する DP-1との会合に必要なp53中の領域を明らかにするために、in vitroで翻訳され たDP-1とp53が相互作用する能力をモニターする同様のin vitro結合アッセイを 開発した。前記で得られたデータは、p53が、哺乳動物細胞抽出物からのp55Uと 共に共沈し、さらに、p55Uが、抗DP-1（A）には認識されるが抗DP-1（D）には認 識されないDP-1形態であることを示した。同様に、これらと同じ２つの抗血清を 用いるin vitro翻訳の後、２つの免疫化学的に異なるDP-1形態を明らかにするこ とができた。特に、翻訳された外因性DP-1の不存在下では、抗DP-1（A）は内因 性DP1タンパク質を認識したが、抗DP-1（D）は認識しなかった。翻訳の後、両方 の抗血清が、in vitroで翻訳されたDP-1タンパク質を認識し、該外因性ポリペプ チドは、わずかに速い移動度で分離された。 少なくとも２つの免疫化学的に異なるDP-1の形態がin vitro翻訳後に存在する証 拠が、p53との相互作用の研究の際に得られた。該投入翻訳物中には、両血清と 免疫反応性のDP-1が存在していたが、該in vitro翻訳物にp53を加えたところ、 抗DP-1（A）には認識されるが抗DP-1（D）には認識されないDP-1形態がp53によ り保持された。GST部分はDP-1と相互作用しなかった。これらのデータは、in vi tro翻訳の後では、２つのDP-1形態が存在し、さらに、p53は、抗DP-1（A）によ り定義される形態と優先的に相互作用することを示す。重要なことは、この結果 が、p53がp55U（抗DP-1（A）には認識されるが抗DP-1（D）には認識されないDP- 1タンパク質）と共に免疫沈降した哺乳動物細胞抽出物から免疫沈降法により得 られたデータを反映していることである。したがって、該in vitro結合アッセイ におけるDP-1に対するp53の特異性は、哺乳動物細胞における相互作用とある程 度の類似性を有しており、p53が、免疫化学的に異なるDP-1形態と相互作用する という結論を支持する。p53 中のＮ末端領域はDP-1に対する結合に必要である 本発明者らは、会合に必要なp53中のドメインを明らかにするために、p53とDP-1 との相互作用を用いた。DP-1との相互作用に何ら悪影響を及ぼすことなく、250 個ものアミノ酸残基を、p53のＣ末端から検出することができた。残基143〜73か らのさらなる欠失が相互作用を妨げたことから、DP-1に対する結合に必要なp53 中の領域が明らかとなった。したがって、p53のＮ末端領域はMDM2結合ドメイン を含有するため（Picksleyら，1994）、DP-1との相互作用に必要なp53中のドメ インをMDM2結合ドメインから識別することができる。p53 およびMDM2はE2F部位依存的転写をモジュレーションする DP-1はDRTF1/E2Fの一般的な成分であるため（Bandaraら，1993および1994）、い ずれかのp53とDP-1との相互作用の機能的結果を、DP-1およびE2Fにより駆動され るE2F部位特異的転写（両タンパク質が転写活性化においてＤＮＡ結合性ヘテロ 二量体として協同することが知られている状況である(Bandaraら，1993)）に対 する効果を調べることにより評価した。これらのアッセイ条件では、DP-1は単独 では、有意な転写活性を有さない（Bandaraら，1993）。野生型p53発現ベクター を3T3細胞中にコトランスフェクションしたところ、E2F-1単独またはDP-1とE2F- 1とのいずれかにより媒介されるトランス活性化のレベルがp53の濃度に依存して 低下した。また、野生型p53のこの不活性化効果は、突然変異p53対立遺伝子を含 有するヒトSAOS-2細胞で明らかであった。突然変異E2F結合部位により駆動され る比較しうるプロモーター構築物（pxMT-GL）の活性は、p53に有意に影響されな かった。p53 とE2F-1とはDP-1に関して競合する p53とDP-1との相互作用が、DP-1とE2F-1との相互作用と互いに排他的であるか否 かを確認することに関心を持った。この問題を検討するために、本発明者らは、 GST融合タンパク質として発現されるE2F-1が、in vitro結合アッセイ（in vitro で翻訳されたDP-1がp53に結合する条件）においてDP-1に関してp53と競合するか 否かを評価した。GST-E2F-1の量が増加するにつれて、それに伴い、p53に結合し たDP-1のレベルが減少したが、これは、対照GST処理では明らかでなかった効果 である。これらのデータは、p53とE2F-1とが、DP-1に対する結合に関して競合す ることを示し、これは、p53がDP-1の二量体化ドメインと相互作用することを示 す既に得られているデータと一致する。p53とE2F-1とが、DP-1に関して競合する のであれば、DP-1/E2Fヘテロ二量体によるＤＮＡ結合活性の減少が、p53の存在 下で明らかとなるであろう。この可能性を調べるために、DP-1/E2F-1ヘテロ二量 体のＤＮＡ結合活性を測定するバンドシフトアッセイをp53で補った。in vitro 翻訳の後では、DP-1またはE2F-1は、それらを一緒に評価した場合には協同的で あるが、それら単独では、ＤＮＡ結合活性をほとんど有さない。p53のレベルを 該反応中に滴定するにつれて、DP-1/E2F-1ＤＮＡ結合活性の減少が明らかに認め られた。これに対して、不活性化されたp53は、ほとんど影響を及ぼさなかった 。結論としては、p53およびE2F-1は、DP-1に関して競合し、その結果、p53は、D P-1/E2F-1ヘテロ二量体のＤＮＡ結合活性のレベルを減少させうる。 考察DP-1 の種々の形態 DP-1は、生理的DRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性の最も一般的なＤＮＡ結合成分であり （Bandaraら，1993，1994）、この場合、それは、E2Fファミリーメンバーとのヘ テロ二量体で存在することが公知である（Bandaraら，1993；Helinら，1993；Kr ekら，1993）。以前の研究において、DP-1にコードされるポリペプチド（p55） は細胞周期の進行の間に調節されているため細胞周期制御を受けており、その細 胞周期が進行するにつれてp55Lのレベルが増加することが示されている（Bandar aら，1994）。p55Lを効率的に認識する抗血清を用いて、このDP-1形態が、DRTF1 /E2F（多種多様な細胞型で明らかに認められる生理的環境である）中で優勢なＤ ＮＡ結合成分であることを示すことが可能である。これに対して、p55Lを優先的 に認識する抗血清が、生理的DRTF1/E2Fと効率的に反応し、p55Uの存在量が、DRT F1/E2F ＤＮＡ結合活性と逆相関するため、p55Uは、DRTF1/E2Fの一般的な成分で はないらしいことが、そのデータから示唆された。p55UおよびLが互いの翻訳後 誘導体であるという直接の証拠をここでは示していないが、そのような見解は、 DP-1に対するホスファターゼの効果に関する以前の結果（Bandaraら，1994）に 与えられる明らかな可能性の１つである。p53 はDP-1と会合する DP-1との相互作用に必要なp53中の領域は、Ｎ末端の143アミノ酸残基内に存在す る。MDM2結合ドメインを含有する最初の73残基は、その相互作用に不十分である 。以前の研究は、MDM2がDRTF1/E2Fと相互作用しうると示唆しているが、本発明 者らの結果は、この相互作用がDP-1とp53との会合を引き起こすのではないらし いことを暗示している。興味深いことに、p53がDP-1に結合するのに必要な残基7 3〜143の領域は、突然変異53対立遺伝子を保持するヒトの腫瘍細胞において頻繁 に改変されている残基を含有する（Harris，1993）。 種々の細胞性ポリペプチドが、DP-1と共に共沈した。これらのうちの２つを、p5 3およびMDM2として同定した。これらは、細胞周期の進行に影響を及ぼすことが 公知のタンパク質である。したがって、p53タンパク質の特性は、例えばＤＮＡ 損傷に応答する細胞周期の負の調節であり、その遺伝子はヒトの腫瘍細胞中で頻 繁に突然変異している（Levineら，1991）。p53がその増殖調節特性を媒介する メカニズムに関する現在一般的なモデルは、それが、細胞周期進行の停止に関与 する遺伝子の転写アクチベーターとして機能するというものである（E1-Deiryら ，1993）。これに対し、MDM2は、MDM2癌遺伝子にコードされ、MDM2は、あるヒト 腫瘍細胞中で増幅される（Olinerら，1992）。１つには、p53の転写活性化特性 を阻害することにより、その増殖促進活性を媒介すると考えられている（Oliner ら，1993）。 p53およびMDM2がDP-1と会合することが判明したが、どちらのタンパク質も、生 理的DRTF1/ E2FＤＮＡ結合複合体中で検出することは現在のところ不可能である 。本明細書中に示したデータを考慮すると、これらのタンパク質は、DP-1/E2FＤ ＮＡ結合ヘテロ二量体中には一般には存在しないDP-1の集団を標的とすると考え られ、この見解は、p53がp55U（DRTF1/ E2FＤＮＡ結合活性においては有意に存 在しないDP-1の形態）と共に共沈したという結果と一致する。これらの相互作用 により、p53およびMDM2が機能的なDP-1/E2FＤＮＡ結合ヘテロ二量体のレベル、 およびそれによる転写的に活性なDRTF1/ E2Fのレベルに影響を及ぼし、それによ り標的遺伝子の下流の転写活性を調節しうると生理学的に説明するのも可能であ る が、これらの結果の意義を明らかにするためには、さらなる実験が必要である。 p53の共発現は、DP-1/E2F-1ヘテロ二量体により駆動される転写を特異的に不活 性化した。既に得られている結論を考慮すると、これらの結果を説明する可能な モデルは、p53がE2Fファミリーメンバーと相互作用してDP-1/E2Fヘテロ二量体を 形成するのを妨げる状態で、p53がDP-1を保持するというものになるだろう。実 際、p53と相互作用するのに要するDP-1の領域は、DP-1/E2F-1ヘテロ二量体を形 成するのに必要であり、したがって、DP-1に対するp53の結合は、DP-1とE2Fファ ミリーメンバーとの相互作用と互いに排他的となりうるであろう。そのような可 能性についての証拠は、p53とE2F-1とはDP-1に関して競合し、したがってDP-1/E 2F-1ＤＮＡ結合活性のレベルを減少させうることを示すことにより得られた。こ れらのデータは、p53が、DP-1の免疫化学的に異なる形態を標的とし、DP-1/E2F ヘテロ二量体の形成、およびDRTF1/E2F ＤＮＡ結合活性のレベルを調節するとい うモデルと一致する。 DP-1との相互作用に必要なp53中の領域は、天然に生じる突然変異対立遺伝子中 で頻繁に改変される残基を含む。ここで報告されている結果に基づけば、これら の突然変異の可能な生物学的根拠として、それらがp53がDP-1と相互作用するの を妨げ、それにより、機能的なDRTF1/E2Fの形成およびそれによる細胞周期の進 行にp53が課す負の調節を解除するのだと考えることができるであろう。p53 に媒介される増殖停止のための経路 p53は、転写因子の特性、およびp53に媒介される増殖停止に重要と考えられてい るgadd45およびWAF1（Kastanら，1992；E1-Deiryら，1993）などの標的遺伝子の トランス活性化能を有すると考えられているが、p53とDP-1との相互作用は、p53 が細胞周期の進行に理論的に影響を及ぼしうるもう１つの可能な経路を与える。 したがって、DRTF1/E2Fにより調節される遺伝子の多くは、細胞周期の進行に必 要なタンパク質をコードするため、それらの転写ダウンレギュレーションは、細 胞周期の進行を妨げると予想されるだろう。逆に、DRTF1/E2Fの活性の増加は、M DM2癌遺伝子の産物の生理的影響を媒介するのに重要かもしれない。 実際、これまでの種々の研究から、DRTF1/E2Fおよびp53に調節される経路が統合 されることが既に示唆されている。例えば、細胞におけるE2F-1の過剰発現は、p 53依存的にアポトーシスを誘導し（WuおよびLevine，1994）、Rb^-/-マウスの水 晶体繊維細胞におけるアポトーシスレベルの増加は、Rbおよびp53において二重 ヌルとなっている胚においては克服されている。pRbまたはp53を不活性化しうる 腫瘍ウイルスの癌タンパク質を一定の生理的部位に連続的に標的化する研究から 、同様の結論が得られている（Howesら，1994；Morgenbesserら，1994；Panおよ びGriep，1994）。全般的に、そのような研究は、p53が何らかの方法でDRTF1/E2 F経路の状態を監視するモデルと一致している。DP-1とp53との会合がこの過程に 関与している可能性がある。 最後に、DP-1とp53との相互作用は、DP-1が原癌性（proto-oncogenic）活性（コ トランスフェクションされたE2Fファミリーメンバーの不存在下で発現する、DP ファミリーの他のメンバーに共有される特性）を発現するメカニズムの説明に役 立つかもしれない（Joossら，1995）。おそらく、DP-1レベルの増加は、p53を隔 離し、その活性を抑え、それによりp53の増殖調節効果を無効にするのであろう 。この点で、DP-1は、あるウイルス癌タンパク質（例えば、アデノウイルスE1b およびパピローマウイルスE6タンパク質）と同様に作用するのかもしれない。な ぜなら、p53を不活性化するそれらの活性は発癌活性と相関するからである（Mor an，1993）。 参照文献 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/82 14/82 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．p53タンパク質（転写モジュレーター）、およびDPタンパク質およびE2Fタ ンパク質（共に転写因子）の一方または両方を含んでなる複合体。 ２．p53タンパク質が、野生型p53、腫瘍細胞中で見出される突然変異体、また はDPタンパク質またはE2Fタンパク質と複合体を形成しうる前記野生型または突 然変異タンパク質の断片である、請求項１に記載の複合体。 ３．DPまたはE2Fタンパク質が、それぞれ、 （a）DP-1、DP-2、DP-3、またはE2F-1からE2F-5のいずれか、 （b）（a）の突然変異体、対立遺伝子変異体または種ホモログ、 （c）（a）または（b）と少なくとも70％相同なタンパク質、 （d）MDM2タンパク質またはp53タンパク質と複合体を形成しうる（a）から（c） のいずれか１つの断片、 （e）少なくとも15アミノ酸長の（a）から（d）のいずれかの断片、または （f）別のタンパク質と融合した（a）から（e）のいずれかの融合体である、請 求項１または２に記載の複合体。 ４．表示的または検出可能な標識を保持する、前記請求項のいずれか１項に記 載の複合体。 ５．固相に固定された、前記請求項のいずれか１項に記載の複合体。 ６．請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体と、担体または希釈剤とを含 んでなる組成物。 ７．（a）請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体中に存在するタンパク 質をコードする配列、 （b）（a）に相補的な配列、または （c）（a）または（b）における配列と少なくとも80％相同な配列を含んでな るポリヌクレオチド。 ８．ＤＮＡポリヌクレオチドである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。 ９．発現されて請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体を産生する、請求 項７または８に記載のポリヌクレオチド。 10．請求項８または９に記載のポリヌクレオチドとその相補的配列とを含んで なる二本鎖ポリヌクレオチド。 11．表示的または検出可能な標識を保持する、請求項７〜10のいずれか１項に 記載のポリヌクレオチド。 12．請求項７〜10のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベク ター。 13．請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体をコードする１以上のコード 配列を含む複製可能な組換えベクターである、請求項12に記載のベクター。 14．請求項12または13に記載のベクターを保持するか、あるいは、請求項１〜 ３のいずれか１項に記載の転写モジュレーターおよび転写因子を別々にコードす る２つのベクターを保持する宿主細胞。 15．転写モジュレーターおよび転写因子の発現を付与する条件下で請求項14に 記載の宿主細胞を培養し、そして発現された複合体を回収することを含んでなる 請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体の製造法。 16．潜在的または推定化学療法剤を同定するためのスクリーニングアッセイで あって、 （Ａ）成分： （i）DPタンパク質および／またはE2Fタンパク質、 （ii）転写モジュレーター、および （iii）潜在的または推定化学療法剤を準備し、成分（i）および（ii）が（iii ）の不存在下で複合体を形成する条件下でそれらを接触させ、そして、 （Ｂ）成分（iii）が該複合体を妨害または阻害し、成分（i）と（ii）との結合 を阻害または促進し、または該複合体の活性に影響を及ぼす程度を測定すること を含んでなるアッセイ。 17．DPタンパク質およびE2Fタンパク質の両方が存在し、（i）と（ii）との複 合体を、それがE2F ＤＮＡ結合部位にin vitroで結合する能力により測定する、 請求項16に記載のアッセイ。 18．成分（i）が請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体であり、成分（i ）と（ii）との相互作用または結合を、レポーター遺伝子に結合したE2F結合部 位を含むプロモーターをin vivoで活性化する該複合体の能力により測定する、 請求項16に記載のアッセイ。 19．酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞中で該アッセイを行なう、請求項 18に記載のアッセイ。 20．該化学療法剤が、請求項３の（a）から（e）に記載のタンパク質の10個以 上のアミノ酸の断片である、請求項16〜19のいずれか１項に記載のアッセイ。 21．潜在的または推定化学療法剤を同定するためのスクリーニングアッセイで あって、転写モジュレーターまたは転写因子と潜在的または推定化学療法剤とを 準備し、該剤が該モジュレーターまたは因子に結合する程度または該モジュレー ターまたは因子が該剤と複合体を形成するか否かを測定することを含んでなるア ッセイ。 22．ヒトまたは動物の体の治療方法で使用するための、請求項１〜４のいずれ か１項に記載の複合体、請求項７〜11のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド 、請求項12または13に記載のベクター、または請求項14に記載の宿主細胞。 23．ヒトまたは動物の体の治療方法で使用するための、請求項１〜４のいずれ か１項に記載の複合体、請求項７〜11のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド 、請求項12または13に記載のベクター、または請求項14に記載の宿主細胞と、医 薬上許容される担体または賦形剤とを含んでなる医薬組成物。 24．増殖性疾患を治療するための医薬の製造における、 （a）請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体、 （b）請求項７〜11のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、 （c）請求項12または13に記載のベクター、または （d）請求項14に記載の宿主細胞 の使用。