JP2003504308A - 膜貫通受容体の細胞質ドメインのための構造モデル - Google Patents
膜貫通受容体の細胞質ドメインのための構造モデルInfo
- Publication number
- JP2003504308A JP2003504308A JP2001500666A JP2001500666A JP2003504308A JP 2003504308 A JP2003504308 A JP 2003504308A JP 2001500666 A JP2001500666 A JP 2001500666A JP 2001500666 A JP2001500666 A JP 2001500666A JP 2003504308 A JP2003504308 A JP 2003504308A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- paxillin
- cytoplasmic domain
- integrin
- polypeptide
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70546—Integrin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70546—Integrin superfamily
- C07K14/7055—Integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
Abstract
(57)【要約】
一連の７残基反復に付着した膜貫通ドメインおよび選択された細胞質ドメインを模擬する一連の７残基反復を含むポリペプチドを提供し、これを、占められたおよび密集したトランフメンブランタンパク質の構造および活性を評価し、治療的化合物を同定するための構造モデルの構成において用いることができる。
Description
【０００１】序論
本発明は、国立衛生研究所(NIM)により後援された研究の経過においてなされ
た。米国政府は、本発明においてある種の権利を有し得る。
た。米国政府は、本発明においてある種の権利を有し得る。
【０００２】発明の背景
真核細胞において、多くのタンパク質が、細胞膜にわたって存在(extend)し、
従って細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含む。これらの
タンパク質の多くは、シグナル伝達、細胞接着および細胞−細胞相互作用に関与
する。
従って細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含む。これらの
タンパク質の多くは、シグナル伝達、細胞接着および細胞−細胞相互作用に関与
する。
【０００３】
このカテゴリー内にあるタンパク質の中に、インテグリンがある。インテグリ
ンは、血栓症、炎症および癌を含む、多くの病理学的および生理学的プロセスに
関与する。細胞接着性の変化を含む他の生理学的および病理学的症状はまた、イ
ンテグリンにより媒介される。
ンは、血栓症、炎症および癌を含む、多くの病理学的および生理学的プロセスに
関与する。細胞接着性の変化を含む他の生理学的および病理学的症状はまた、イ
ンテグリンにより媒介される。
【０００４】
多くの膜貫通タンパク質は、オリゴマーであり、２種または３種以上の異なる
タイプのポリペプチドサブユニットの非共有的会合である。特に、インテグリン
は、αおよびβで示す２種の異なるタンパク質サブユニットのヘテロ二量体であ
る。αサブユニットは、１２０〜１８０ｋＤａの大きさで変化し、各々βサブユ
ニットと非共有的に会合している。インテグリン分子の細胞外ドメインは、リガ
ンド結合部位を形成する；αおよびβサブユニットの両方は、リガンド結合部位
の形成に伴われる。インテグリンのための多くの種々のリガンドが知られており
、これには、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、補体
成分、トロンボスポンジン、並びに免疫グロブリンスーパーファミリーの統合さ
れた膜タンパク質、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＶＣＡＭ−１が含
まれる。
タイプのポリペプチドサブユニットの非共有的会合である。特に、インテグリン
は、αおよびβで示す２種の異なるタンパク質サブユニットのヘテロ二量体であ
る。αサブユニットは、１２０〜１８０ｋＤａの大きさで変化し、各々βサブユ
ニットと非共有的に会合している。インテグリン分子の細胞外ドメインは、リガ
ンド結合部位を形成する；αおよびβサブユニットの両方は、リガンド結合部位
の形成に伴われる。インテグリンのための多くの種々のリガンドが知られており
、これには、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、補体
成分、トロンボスポンジン、並びに免疫グロブリンスーパーファミリーの統合さ
れた膜タンパク質、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＶＣＡＭ−１が含
まれる。
【０００５】
インテグリンは、これらのリガンドにおける種々の短いペプチド配列を認識す
る。これらの例は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（ＫＱＡＧＤＶ；配列番号１）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ（ＤＧＥＡ；配列番号２）およびＧｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ｖａｌ（ＥＩＬＤＶ；配列番号３）である。インテグリン機能における変化
は、しばしば、インテグリンの細胞外ドメインのリガンド結合親和性の変化によ
り生じる(J.S. Bennett & G. Vilaire J. Clin. Invest. 64:1393-1401 (1979);
Altieri et al., J. Cell Biol. 107:1893-1900 (1988); Faull et al., J. Ce
ll Biol. 121:155-162 (1993); Lollo et al., J. Biol. Chem. 268:21693-2170
0 (1993))。
る。これらの例は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（ＫＱＡＧＤＶ；配列番号１）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ（ＤＧＥＡ；配列番号２）およびＧｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ｖａｌ（ＥＩＬＤＶ；配列番号３）である。インテグリン機能における変化
は、しばしば、インテグリンの細胞外ドメインのリガンド結合親和性の変化によ
り生じる(J.S. Bennett & G. Vilaire J. Clin. Invest. 64:1393-1401 (1979);
Altieri et al., J. Cell Biol. 107:1893-1900 (1988); Faull et al., J. Ce
ll Biol. 121:155-162 (1993); Lollo et al., J. Biol. Chem. 268:21693-2170
0 (1993))。
【０００６】
インテグリンαＩＩｂβ３（血小板ＧＰＩＩｂーＩＩＩａ）、即ち２種のＩ型
膜貫通タンパク質サブユニットのヘテロ二量体は、リガンド結合親和性において
高度に調節された変化を明示する。親和性状態特異性抗体、例えばＰＡＣ１(Sha
ttil et al., J. Biol. Chem. 260:1107-1114 (1985))は、異種の細胞における
組換えαＩＩｂβ３の分析に有用である(O'Toole et al., Cell Regulation 1:8
83-893 (1990))。血小板アゴニストは、αＩＩｂβ３の親和性（活性化）を、お
そらく細胞外ドメインの構成の変化を生じることにより、増大する(O'Toole et
al., Cell Regulation 1:883-893 (1990); Sims et al., J. Biol. Chem. 266:7
345-7352 (1991))。ヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質、リン脂質代謝およびセ
リン−トレオニンキナーゼを伴う細胞質シグナル伝達経路は、細胞外ドメインの
これらの構成の変化を開始する；これらの変化はまた、カルシウム流動、チロシ
ンキナーゼおよび低分子量ＧＴＰ結合タンパク質を伴い得る(Sims et al., J. B
iol. Chem. 266:7345-7352 (1991); Shattil et al., J. Biol. Chem. 267:1842
4-18431 (1992); S.J. Shattil & J.S. Brugge Curr. Opin. Cell Biol. 3:869-
879 (1991); Ginsberg et al., Cold Spring Harbor Symposium of Quantitativ
e Biology: The Cell Surface 57:221-231 (1992); Ginsberg et al., Curr. Op
in. Cell Biol. 4:766-771 (1992); Nemoto et al., J. Biol. Chem. 267:20916
-20920 (1992))。
膜貫通タンパク質サブユニットのヘテロ二量体は、リガンド結合親和性において
高度に調節された変化を明示する。親和性状態特異性抗体、例えばＰＡＣ１(Sha
ttil et al., J. Biol. Chem. 260:1107-1114 (1985))は、異種の細胞における
組換えαＩＩｂβ３の分析に有用である(O'Toole et al., Cell Regulation 1:8
83-893 (1990))。血小板アゴニストは、αＩＩｂβ３の親和性（活性化）を、お
そらく細胞外ドメインの構成の変化を生じることにより、増大する(O'Toole et
al., Cell Regulation 1:883-893 (1990); Sims et al., J. Biol. Chem. 266:7
345-7352 (1991))。ヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質、リン脂質代謝およびセ
リン−トレオニンキナーゼを伴う細胞質シグナル伝達経路は、細胞外ドメインの
これらの構成の変化を開始する；これらの変化はまた、カルシウム流動、チロシ
ンキナーゼおよび低分子量ＧＴＰ結合タンパク質を伴い得る(Sims et al., J. B
iol. Chem. 266:7345-7352 (1991); Shattil et al., J. Biol. Chem. 267:1842
4-18431 (1992); S.J. Shattil & J.S. Brugge Curr. Opin. Cell Biol. 3:869-
879 (1991); Ginsberg et al., Cold Spring Harbor Symposium of Quantitativ
e Biology: The Cell Surface 57:221-231 (1992); Ginsberg et al., Curr. Op
in. Cell Biol. 4:766-771 (1992); Nemoto et al., J. Biol. Chem. 267:20916
-20920 (1992))。
【０００７】
細胞質シグナルが、いかにして、インテグリンの細胞外ドメイン（「内から外
への(inside-out)シグナル伝達」）の構成およびリガンド結合親和性の変化を生
じるかは、未知のままである。αＩＩｂβ３の膜貫通および細胞外ドメインに接
合した種々のαおよびβサブユニットの細胞質ドメインを含むキメラについての
研究は、インテグリン細胞質ドメインが、リガンド結合親和性を調節する細胞タ
イプ特異性シグナルを伝達することを示す。これらのシグナルは、インテグリン
のαおよびβ細胞質尾部の両方において、活性細胞プロセスを必要とし、このこ
とは、これらが、生理学的に適切なシグナルを反射することを示唆する。さらに
、高度に保護されたモチーフ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ＧＦ
ＦＫＲ；配列番号４）の、αサブユニット細胞質ドメインのアミノ末端における
欠失はまた、インテグリンαＩＩβ３に対するリガンドの高親和性結合を生じた
。キメラとは対照的に、ＧＦＦＫＲ欠失突然変異体への高親和性リガンド結合は
、細胞代謝、細胞のタイプおよびβサブユニット細胞質ドメインの嵩(bulk)とは
独立であった。従って、インテグリン細胞質尾部(tails)は、インテグリン親和
性の調節のための標的である。
への(inside-out)シグナル伝達」）の構成およびリガンド結合親和性の変化を生
じるかは、未知のままである。αＩＩｂβ３の膜貫通および細胞外ドメインに接
合した種々のαおよびβサブユニットの細胞質ドメインを含むキメラについての
研究は、インテグリン細胞質ドメインが、リガンド結合親和性を調節する細胞タ
イプ特異性シグナルを伝達することを示す。これらのシグナルは、インテグリン
のαおよびβ細胞質尾部の両方において、活性細胞プロセスを必要とし、このこ
とは、これらが、生理学的に適切なシグナルを反射することを示唆する。さらに
、高度に保護されたモチーフ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ＧＦ
ＦＫＲ；配列番号４）の、αサブユニット細胞質ドメインのアミノ末端における
欠失はまた、インテグリンαＩＩβ３に対するリガンドの高親和性結合を生じた
。キメラとは対照的に、ＧＦＦＫＲ欠失突然変異体への高親和性リガンド結合は
、細胞代謝、細胞のタイプおよびβサブユニット細胞質ドメインの嵩(bulk)とは
独立であった。従って、インテグリン細胞質尾部(tails)は、インテグリン親和
性の調節のための標的である。
【０００８】
しかし、技術的困難により、これらのタンパク質の構造の決定のための高度な
分割手法の適用が大いに限定された。実際に、分子構造は、２種のみの無傷の膜
貫通タンパク質、即ち細菌光反応中心(Deisenhofer et al., Nature 318:618-62
4 (1985))およびポーリン(Weiss et al., FEBS Lett. 267:268-272 (1990))に有
用である。受容体細胞外ドメインの構造は、可溶性短縮細胞外ドメインをモデル
として用いて決定された(DeVos et al., Science 255:306-312 (1992); Milburn
et al., Science 254:1342-1347 (1991))。これらの構造は、リガンド認識の基
礎の理解に寄与したが、シグナル伝達の機構に比較的少ない見識を提供した。シ
グナルを伝達する多くの膜タンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質ファミリーの要
素であり、この定義的特徴は、単一膜延在(spanning)領域である。
分割手法の適用が大いに限定された。実際に、分子構造は、２種のみの無傷の膜
貫通タンパク質、即ち細菌光反応中心(Deisenhofer et al., Nature 318:618-62
4 (1985))およびポーリン(Weiss et al., FEBS Lett. 267:268-272 (1990))に有
用である。受容体細胞外ドメインの構造は、可溶性短縮細胞外ドメインをモデル
として用いて決定された(DeVos et al., Science 255:306-312 (1992); Milburn
et al., Science 254:1342-1347 (1991))。これらの構造は、リガンド認識の基
礎の理解に寄与したが、シグナル伝達の機構に比較的少ない見識を提供した。シ
グナルを伝達する多くの膜タンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質ファミリーの要
素であり、この定義的特徴は、単一膜延在(spanning)領域である。
【０００９】
これらは、Ｔ細胞受容体(A. Weiss Cell 73:209-212 (1993))；成長因子受容
体(L. Patthy Cell 61:13-14 (1990))およびサイトカイン受容体(Miyajima et a
l., TIBS 17:378-382 (1992))を含む。一般的に、これらのタンパク質の細胞質
ドメインは、シグナル伝達に臨界的に重要である。従って、このような受容体に
よりシグナル伝達を理解するために、細胞質ドメインの構造および機能を理解す
ることが必須である。これは、マルチサブユニットＩ型タンパク質については、
特に困難である。
体(L. Patthy Cell 61:13-14 (1990))およびサイトカイン受容体(Miyajima et a
l., TIBS 17:378-382 (1992))を含む。一般的に、これらのタンパク質の細胞質
ドメインは、シグナル伝達に臨界的に重要である。従って、このような受容体に
よりシグナル伝達を理解するために、細胞質ドメインの構造および機能を理解す
ることが必須である。これは、マルチサブユニットＩ型タンパク質については、
特に困難である。
【００１０】
マルチサブユニット膜貫通受容体の細胞質ドメインの構造的モデルの化学的合
成のための計画は、以前に提案された(Muir et al., Biochemistry 33:7701 (19
94))。インテグリンαＩＩｂβ３の細胞質ドメインは、一連の同一の７残基反復
から構成されたらせん状二重コイルにより、共有結合した。二重コイル三次構造
を用いて、推定されたらせん状膜延在ドメインを模擬し、および位相的制約とし
て、２つのインテグリン尾部を、適切な垂直のねじれ(stagger)を有する平行な
配向に固定した(Muir et al., Biochemistry 33:7701 (1994))。しかし、この合
成方法は、ポリペプチドの長さに対する制限を配置し、比較的少ない収量を有す
る。
成のための計画は、以前に提案された(Muir et al., Biochemistry 33:7701 (19
94))。インテグリンαＩＩｂβ３の細胞質ドメインは、一連の同一の７残基反復
から構成されたらせん状二重コイルにより、共有結合した。二重コイル三次構造
を用いて、推定されたらせん状膜延在ドメインを模擬し、および位相的制約とし
て、２つのインテグリン尾部を、適切な垂直のねじれ(stagger)を有する平行な
配向に固定した(Muir et al., Biochemistry 33:7701 (1994))。しかし、この合
成方法は、ポリペプチドの長さに対する制限を配置し、比較的少ない収量を有す
る。
【００１１】
従って、マルチサブユニット膜貫通受容体の細胞質ドメインの構造的モデルを
生成する、改善された方法に対する必要性がある。これらのモデルは、インテグ
リンおよび他の膜貫通タンパク質の活性を制御し、調節する剤を評価し、これら
の活性を検出し、これらの活性を調節して、生理学的条件を検出し、制御するの
に、有用である。
生成する、改善された方法に対する必要性がある。これらのモデルは、インテグ
リンおよび他の膜貫通タンパク質の活性を制御し、調節する剤を評価し、これら
の活性を検出し、これらの活性を調節して、生理学的条件を検出し、制御するの
に、有用である。
【００１２】発明の要約
本発明において、多量体(multimeric)膜貫通タンパク質、例えばインテグリン
の細胞質面の構造的モデルまたは模擬に用いるためのタンパク質を製造する方法
を提供する。本発明のタンパク質は、組換え的にまたは合成的に製造することが
できる。しかし、組換えタンパク質を用いることにより、従来技術の最初の合成
方法において遭遇した、ポリペプチドの長さの制限および少ない収量が、回避さ
れる。従って、本発明の構造的モデルの少なくとも一部を、組換え的に製造する
のが好ましい。本発明のモデルにおいて、β細胞質ドメインの二量体の性質は、
これらのドメインの共有ヘテロ二量体を用いることにより、模擬される。らせん
状二重コイル構造により、尾部の所望の平行な位相および垂直なねじれが提供さ
れる。
の細胞質面の構造的モデルまたは模擬に用いるためのタンパク質を製造する方法
を提供する。本発明のタンパク質は、組換え的にまたは合成的に製造することが
できる。しかし、組換えタンパク質を用いることにより、従来技術の最初の合成
方法において遭遇した、ポリペプチドの長さの制限および少ない収量が、回避さ
れる。従って、本発明の構造的モデルの少なくとも一部を、組換え的に製造する
のが好ましい。本発明のモデルにおいて、β細胞質ドメインの二量体の性質は、
これらのドメインの共有ヘテロ二量体を用いることにより、模擬される。らせん
状二重コイル構造により、尾部の所望の平行な位相および垂直なねじれが提供さ
れる。
【００１３】
モデルは、膜貫通タンパク質、例えばインテグリンとのタンパク質相互作用を
研究し、インテグリン阻害活性のための剤をスクリーニングし、インテグリン細
胞質ドメインの構造を得るのに有用である。例えば、α４細胞質尾部を含むモデ
ルを用いて、現在では、パキシリンおよびパキシリン関連分子、例えばロイパキ
シンおよびＨｉｃ−５が、α４インテグリンとの高度な親和性相互作用を有する
ことが見いだされた。従って、パキシリンおよびパキシリン関連分子とα４イン
テグリンとの相互作用を阻害する剤は、α４インテグリンに関連する生物学的応
答を阻害するのに有用であると考えられている。従って、これらの剤は、正常な
α４インテグリン活性、例えば瘢痕に至り得る創傷の治癒において生じるものを
阻害するのに有用であり得る。これらの剤はまた、α４インテグリンの病理学的
応答、例えばアテローム硬化症並びに、炎症腸疾患、関節炎、多発性硬化症およ
び喘息を含むがこれらには限定されない症状と関連する免疫応答を阻害するのに
用いることができる。
研究し、インテグリン阻害活性のための剤をスクリーニングし、インテグリン細
胞質ドメインの構造を得るのに有用である。例えば、α４細胞質尾部を含むモデ
ルを用いて、現在では、パキシリンおよびパキシリン関連分子、例えばロイパキ
シンおよびＨｉｃ−５が、α４インテグリンとの高度な親和性相互作用を有する
ことが見いだされた。従って、パキシリンおよびパキシリン関連分子とα４イン
テグリンとの相互作用を阻害する剤は、α４インテグリンに関連する生物学的応
答を阻害するのに有用であると考えられている。従って、これらの剤は、正常な
α４インテグリン活性、例えば瘢痕に至り得る創傷の治癒において生じるものを
阻害するのに有用であり得る。これらの剤はまた、α４インテグリンの病理学的
応答、例えばアテローム硬化症並びに、炎症腸疾患、関節炎、多発性硬化症およ
び喘息を含むがこれらには限定されない症状と関連する免疫応答を阻害するのに
用いることができる。
【００１４】発明の詳細な説明
本発明は、占められたおよび密集した膜貫通タンパク質、例えば、選択された
マルチサブユニット膜貫通受容体、例えばインテグリンの細胞質ドメインに接続
された膜貫通ドメインを模擬する、一連のαヘリックス７残基反復を、好ましく
は２〜２０個、一層好ましくは３〜６個、最も好ましくは４個含むポリペプチド
からなるインテグリンの細胞質面の模擬の生成に関する。「模擬」により、一連
の７残基反復が、膜貫通ドメインの構造的特徴を模擬または置換することを意味
する。１つの態様において、固定化(immobilizing)エピトープ、例えばＨｉｓ−
Ｔａｇ配列またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼは、アフィニティーク
ロマトグラフィーにおけるポリペプチドの固定化のためのＮ末端に結合している
。この態様において、固定化エピトープは、Ｃｙｓ−Ｇｌｙリンカーによりポリ
ペプチドに結合するのが好ましい。また、好都合のために、原核または化学的開
裂部位、例えばトロンビン開裂部位を、この結合部位においてポリペプチド中に
導入することができる。
マルチサブユニット膜貫通受容体、例えばインテグリンの細胞質ドメインに接続
された膜貫通ドメインを模擬する、一連のαヘリックス７残基反復を、好ましく
は２〜２０個、一層好ましくは３〜６個、最も好ましくは４個含むポリペプチド
からなるインテグリンの細胞質面の模擬の生成に関する。「模擬」により、一連
の７残基反復が、膜貫通ドメインの構造的特徴を模擬または置換することを意味
する。１つの態様において、固定化(immobilizing)エピトープ、例えばＨｉｓ−
Ｔａｇ配列またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼは、アフィニティーク
ロマトグラフィーにおけるポリペプチドの固定化のためのＮ末端に結合している
。この態様において、固定化エピトープは、Ｃｙｓ−Ｇｌｙリンカーによりポリ
ペプチドに結合するのが好ましい。また、好都合のために、原核または化学的開
裂部位、例えばトロンビン開裂部位を、この結合部位においてポリペプチド中に
導入することができる。
【００１５】
本発明のために、「αヘリックス７残基反復」により、繰り返し中の選択され
た位置、好ましくは図１に示す位置ａおよびｄにおいて疎水性残基を有する実質
的にらせん状の両親媒性アミノ酸からなる配列を意味する。このような態様にお
いて、各々の繰り返しは、第１のおよび第４の位置において疎水性残基を有する
７個のアミノ酸である。例えば、好ましい態様において、７残基反復は、アミノ
酸配列Ｇ−Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｘ３−Ｌ−Ｘ４−Ｇ（配列番号１４）を含み、ここ
で、Ｘ１は、リシン、アルギニンまたはオルニチンであり、Ｘ２およびＸ４は、
グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、Ｘ３は、アラニン、セリンまたはト
レオニンである。ポリペプチドの７残基反復は、好ましくは同一である。しかし
、いくつかの態様において、各々の７残基反復は、アミノ酸配列において異なり
得る。
た位置、好ましくは図１に示す位置ａおよびｄにおいて疎水性残基を有する実質
的にらせん状の両親媒性アミノ酸からなる配列を意味する。このような態様にお
いて、各々の繰り返しは、第１のおよび第４の位置において疎水性残基を有する
７個のアミノ酸である。例えば、好ましい態様において、７残基反復は、アミノ
酸配列Ｇ−Ｘ１−Ｌ−Ｘ２−Ｘ３−Ｌ−Ｘ４−Ｇ（配列番号１４）を含み、ここ
で、Ｘ１は、リシン、アルギニンまたはオルニチンであり、Ｘ２およびＸ４は、
グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、Ｘ３は、アラニン、セリンまたはト
レオニンである。ポリペプチドの７残基反復は、好ましくは同一である。しかし
、いくつかの態様において、各々の７残基反復は、アミノ酸配列において異なり
得る。
【００１６】
好ましい態様において、膜貫通受容体、例えばインテグリンの細胞質尾部は、
７残基反復に、７残基反復のＣ末端においてグリシン残基により結合している。
この態様において、ポリペプチドは、生理学的条件下で平行な二重コイル二量体
を形成すると予測される。しかし、三量体および四量体もまた、二重コイルタン
パク質設計について現在の方法に基づいて設計することができる。これらの二重
コイル構造は、天然のシステムにおける膜貫通らせんの近接を一層良好に模擬し
、また定義された位相幾何学が、αおよびβ細胞質尾部の間で維持されることを
確実にする傾向がある。
７残基反復に、７残基反復のＣ末端においてグリシン残基により結合している。
この態様において、ポリペプチドは、生理学的条件下で平行な二重コイル二量体
を形成すると予測される。しかし、三量体および四量体もまた、二重コイルタン
パク質設計について現在の方法に基づいて設計することができる。これらの二重
コイル構造は、天然のシステムにおける膜貫通らせんの近接を一層良好に模擬し
、また定義された位相幾何学が、αおよびβ細胞質尾部の間で維持されることを
確実にする傾向がある。
【００１７】
言い換えると、αヘリックス７残基反復の二重コイルは、インテグリンまたは
他の膜貫通タンパク質の細胞質ドメインが付着する構造的鋳型として作用するこ
とができる。このことは、２つの細胞質尾部が、互いに関して、無傷のタンパク
質に近接するようにしてねじれることを確実にする。シスチン架橋は、この二量
体構成内の二重コイル配列の平行な配向および正確なねじれを確実にする。用い
ることができるインテグリンの細胞質尾部の例には、インテグリンβサブユニッ
ト、例えばβ１Ａ（配列番号８）、β１Ａ（Ｙ７８８Ａ）（配列番号９）、β１
Ｂ（配列番号１０）、β１Ｃ（配列番号１１）、β１Ｂ（配列番号１２）、β７
（配列番号１３）およびβ３並びにαインテグリンサブユニット、例えばαＩＩ
ｂ、α４、α３Ａ、α５またはα６Ａが含まれるが、これらには限定されない。
他の膜貫通タンパク質の細胞質ドメインが付着する構造的鋳型として作用するこ
とができる。このことは、２つの細胞質尾部が、互いに関して、無傷のタンパク
質に近接するようにしてねじれることを確実にする。シスチン架橋は、この二量
体構成内の二重コイル配列の平行な配向および正確なねじれを確実にする。用い
ることができるインテグリンの細胞質尾部の例には、インテグリンβサブユニッ
ト、例えばβ１Ａ（配列番号８）、β１Ａ（Ｙ７８８Ａ）（配列番号９）、β１
Ｂ（配列番号１０）、β１Ｃ（配列番号１１）、β１Ｂ（配列番号１２）、β７
（配列番号１３）およびβ３並びにαインテグリンサブユニット、例えばαＩＩ
ｂ、α４、α３Ａ、α５またはα６Ａが含まれるが、これらには限定されない。
【００１８】
本発明の模擬において用いられるポリペプチドの少なくとも一部が、組換え的
に製造されるのが好ましい。ポリペプチドの組換え製造により、従来技術の最初
の合成方法において遭遇したポリペプチドの長さの制限および少ない収量が克服
される。ポリペプチドの少なくとも一部の組換え製造の方法は、業界において十
分知られている。また、模擬のポリペプチドまたはこの一部を、合成的に製造す
ることができる。ポリペプチドの合成的製造の方法は、業界において十分知られ
ている。さらに、合成的におよび組換え的に製造されたペプチドの部分を、単一
のポリペプチド中に組み合わせる方法が知られている。本発明において、模擬の
両方のポリペプチドを、合成的に製造する場合には、二重コイル配列を形成する
一連の７残基反復における少なくとも１つの７残基反復は、一連における他の７
残基反復と、アミノ酸配列において異ならなければならない。
に製造されるのが好ましい。ポリペプチドの組換え製造により、従来技術の最初
の合成方法において遭遇したポリペプチドの長さの制限および少ない収量が克服
される。ポリペプチドの少なくとも一部の組換え製造の方法は、業界において十
分知られている。また、模擬のポリペプチドまたはこの一部を、合成的に製造す
ることができる。ポリペプチドの合成的製造の方法は、業界において十分知られ
ている。さらに、合成的におよび組換え的に製造されたペプチドの部分を、単一
のポリペプチド中に組み合わせる方法が知られている。本発明において、模擬の
両方のポリペプチドを、合成的に製造する場合には、二重コイル配列を形成する
一連の７残基反復における少なくとも１つの７残基反復は、一連における他の７
残基反復と、アミノ酸配列において異ならなければならない。
【００１９】
本発明のモデルのポリペプチドは、好ましくは、逆相Ｃ１８高圧液体クロマト
グラフィーにより測定して、＞９０％の相同性であり、エレクトロスプレー質量
分析法により測定して、所望の単量体配列のものから０．１％より小さく変化す
る単量体質量を有する。この態様において、水性溶液中の共有二量体の形成を、
質量分析法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察して、従ってらせんの平行な配向
を確認することができる。
グラフィーにより測定して、＞９０％の相同性であり、エレクトロスプレー質量
分析法により測定して、所望の単量体配列のものから０．１％より小さく変化す
る単量体質量を有する。この態様において、水性溶液中の共有二量体の形成を、
質量分析法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察して、従ってらせんの平行な配向
を確認することができる。
【００２０】
この態様において、インテグリン細胞質ドメイン配列の開始は、第５の７残基
反復の疎水性残基を提供する（図１）。従って、αヘリックス７残基反復の二重
コイル配列の直接の結合は、尾部において、らせん構造を誘発し得る。この可能
性に向けるために、αヘリックス７残基反復と細胞質ドメイン配列との間に追加
のグリシンを含むタンパク質モデルの態様が、合成された（図１）。７残基反復
と細胞質ドメインとの間で、１つのみのグリシン（Ｇ１−β１Ａ）または３つの
追加のグリシン（Ｇ４−β１Ａ）のいずれかを含むβ１インテグリン構造のＣＤ
スペクトルについて、比較を実施した。グリシンの挿入は、最小２０８および２
２２ｎｍで急激に減少した。従って、タンパク質モデルの予測されたαヘリック
ス含量は、６５％から３６％まで減少した。４つの７残基反復は、構造の質量の
２７％を構成し；従って３６％のらせん含量が、これらの繰り返しに限定された
らせん構造と整合する。従って、Ｇｌｙ挿入は、細胞質ドメイン二重コイル配列
において誘発されたαヘリックス構造を解消すると見られる。
反復の疎水性残基を提供する（図１）。従って、αヘリックス７残基反復の二重
コイル配列の直接の結合は、尾部において、らせん構造を誘発し得る。この可能
性に向けるために、αヘリックス７残基反復と細胞質ドメイン配列との間に追加
のグリシンを含むタンパク質モデルの態様が、合成された（図１）。７残基反復
と細胞質ドメインとの間で、１つのみのグリシン（Ｇ１−β１Ａ）または３つの
追加のグリシン（Ｇ４−β１Ａ）のいずれかを含むβ１インテグリン構造のＣＤ
スペクトルについて、比較を実施した。グリシンの挿入は、最小２０８および２
２２ｎｍで急激に減少した。従って、タンパク質モデルの予測されたαヘリック
ス含量は、６５％から３６％まで減少した。４つの７残基反復は、構造の質量の
２７％を構成し；従って３６％のらせん含量が、これらの繰り返しに限定された
らせん構造と整合する。従って、Ｇｌｙ挿入は、細胞質ドメイン二重コイル配列
において誘発されたαヘリックス構造を解消すると見られる。
【００２１】
Ｇｌｙ挿入により誘発された構造的変化の可能な影響を研究するために、１つ
、２つおよび３つの追加のＧｌｙ残基が、７残基反復モチーフ（Ｇ２−、Ｇ３−
、Ｇ４−β１Ａ）の後に挿入されたβ１Ａ細胞質ドメインを有するタンパク質モ
デルを生成し、Ｇ１−β１Ａ構造と比較した。追加の対照として、Ｇ４−β１Ａ
ペプチドの変種を、膜近接ＮＰＸＹモチーフ（Ｇ４−β１Ａ−Ｙ７８８Ａ）中の
ＴｙｒからＡｌａへの置換により生成した（図１）。この突然変異は、病巣付着
の標的およびインテグリンの活性化に干渉する。精製されたタンパク質は、これ
らのＮ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇにより、Ｎｉ２＋樹脂に結合し、ＮＨＳビオチン標識
ヒト血小板の溶解物と共にアフィニティークロマトグラフィー実験において用い
た。タンパク質結合のパターンの顕著な変化が、Ｇｌｙ挿入の結果観察された。
４５、５６、５８、１４０および２４０ｋＤａにおいて移動するポリペプチドは
、Ｇｌｙ挿入を有する模擬のみに結合した。Ｇ４−β１Ａ構造におけるＹ７８８
Ａ突然変異（ＹＡ）は、２４０ｋＤａでの相互作用を抑制したが、他の成分との
相互作用を抑制しなかった。
、２つおよび３つの追加のＧｌｙ残基が、７残基反復モチーフ（Ｇ２−、Ｇ３−
、Ｇ４−β１Ａ）の後に挿入されたβ１Ａ細胞質ドメインを有するタンパク質モ
デルを生成し、Ｇ１−β１Ａ構造と比較した。追加の対照として、Ｇ４−β１Ａ
ペプチドの変種を、膜近接ＮＰＸＹモチーフ（Ｇ４−β１Ａ−Ｙ７８８Ａ）中の
ＴｙｒからＡｌａへの置換により生成した（図１）。この突然変異は、病巣付着
の標的およびインテグリンの活性化に干渉する。精製されたタンパク質は、これ
らのＮ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇにより、Ｎｉ２＋樹脂に結合し、ＮＨＳビオチン標識
ヒト血小板の溶解物と共にアフィニティークロマトグラフィー実験において用い
た。タンパク質結合のパターンの顕著な変化が、Ｇｌｙ挿入の結果観察された。
４５、５６、５８、１４０および２４０ｋＤａにおいて移動するポリペプチドは
、Ｇｌｙ挿入を有する模擬のみに結合した。Ｇ４−β１Ａ構造におけるＹ７８８
Ａ突然変異（ＹＡ）は、２４０ｋＤａでの相互作用を抑制したが、他の成分との
相互作用を抑制しなかった。
【００２２】
モノクローナル抗体を用いて、２４０ｋＤａおよび４５ｋＤａタンパク質を、
それぞれフィラミンおよびアクチンとして同定した。富んだ５６、５８および１
４０ｋＤａポリペプチドは、同定されず、ウエスタンブロット実験においてｐｐ
６０ｓｒｃ、パキシリン、ｐｐ１２５ｆａｋ、α−アクチニン、ビンキュリンお
よびｐｐ７２ｓｙｋに特異性の抗体と反応しなかった。タリンは、Ｇ１−および
Ｇ４−β１Ａ構造に結合したが、Ｙ７８８Ａ−Ｇ４β１Ａ構造に結合しなかった
。従って、グリシンの二重コイルモチーフおよびインテグリン細胞質ドメイン配
列中への挿入により誘発したモデルの構造的変化は、これらのタンパク質の細胞
成分との相互作用を変化させる。細胞骨格相互作用を遮断するβ１Ａ尾部の変化
、例えばＹ７８８突然変異並びにβ１Ｂ−およびβ１Ｃスプライシング変種はま
た、タリンおよびフィラミンへの結合を妨げる。従って、観察されたインビトロ
相互作用は、生物学的に関連する傾向がある。
それぞれフィラミンおよびアクチンとして同定した。富んだ５６、５８および１
４０ｋＤａポリペプチドは、同定されず、ウエスタンブロット実験においてｐｐ
６０ｓｒｃ、パキシリン、ｐｐ１２５ｆａｋ、α−アクチニン、ビンキュリンお
よびｐｐ７２ｓｙｋに特異性の抗体と反応しなかった。タリンは、Ｇ１−および
Ｇ４−β１Ａ構造に結合したが、Ｙ７８８Ａ−Ｇ４β１Ａ構造に結合しなかった
。従って、グリシンの二重コイルモチーフおよびインテグリン細胞質ドメイン配
列中への挿入により誘発したモデルの構造的変化は、これらのタンパク質の細胞
成分との相互作用を変化させる。細胞骨格相互作用を遮断するβ１Ａ尾部の変化
、例えばＹ７８８突然変異並びにβ１Ｂ−およびβ１Ｃスプライシング変種はま
た、タリンおよびフィラミンへの結合を妨げる。従って、観察されたインビトロ
相互作用は、生物学的に関連する傾向がある。
【００２３】
本発明のモデルはまた、筋肉特異性スプライシング変種β１Ｄおよびβ７イン
テグリンサブユニット（図１）のＧ１およびＧ４ポリペプチドで構成されて、種
々のインテグリン結合タンパク質の結合相互作用を研究した。ＮＨＳビオチニル
化血小板溶解物と共に用いた際には、β１Ａと比較して、β１Ｄ構造は、一層多
くのタリンと結合し、β７構造は、一層多くのフィラミンと結合した。さらに、
結合のこれらの差異は、ヒトＴ細胞白血病細胞系（ジャーカット）の溶解物、ヒ
ト線維肉腫細胞系（ＨＴ１０８０）およびマウス筋芽細胞系（Ｃ２Ｃ１２）から
誘導された分化した筋管を、アフィニティークロマトグラフィー用に用いた際に
、一貫して観察された。さらに、β１Ｄ構造のタリンへの一層強い結合およびβ
７構造のフィラミンへの一層強い結合は、モデルタンパク質のＧ１およびＧ４変
種の両方と共に独立して観察され、このことは、Ｇｌｙ挿入により誘発された構
造的変化が、これらの分化相互作用に強く影響しないことを示す。
テグリンサブユニット（図１）のＧ１およびＧ４ポリペプチドで構成されて、種
々のインテグリン結合タンパク質の結合相互作用を研究した。ＮＨＳビオチニル
化血小板溶解物と共に用いた際には、β１Ａと比較して、β１Ｄ構造は、一層多
くのタリンと結合し、β７構造は、一層多くのフィラミンと結合した。さらに、
結合のこれらの差異は、ヒトＴ細胞白血病細胞系（ジャーカット）の溶解物、ヒ
ト線維肉腫細胞系（ＨＴ１０８０）およびマウス筋芽細胞系（Ｃ２Ｃ１２）から
誘導された分化した筋管を、アフィニティークロマトグラフィー用に用いた際に
、一貫して観察された。さらに、β１Ｄ構造のタリンへの一層強い結合およびβ
７構造のフィラミンへの一層強い結合は、モデルタンパク質のＧ１およびＧ４変
種の両方と共に独立して観察され、このことは、Ｇｌｙ挿入により誘発された構
造的変化が、これらの分化相互作用に強く影響しないことを示す。
【００２４】
次に、これらのタンパク質の精製した調製物を用いて、細胞抽出物中のタリン
およびフィラミンとの観察された相互作用が直接的であることを例証した。モデ
ルタンパク質に結合した、精製されたフィラミンおよびタリンの相対的量は、細
胞溶解物について観察されたものと類似した。特に、β１Ｄ構造は、β１Ａタン
パク質モデルよりも多くのタリンと結合し、β７構造は、多くのフィラミンと結
合した。さらに、両方の細胞骨格タンパク質の、Ｇ４−Ｙ７８８Ａ−β１Ａ構造
並びにＧ４−β１ＢおよびＧ４−β１Ｃ変種への結合は、Ｇ４−β１Ａと比較し
て機能的に減少した。さらに、β１Ａ、β１Ｄおよびβ７インテグリン細胞質ド
メインのＧ４構造は、対応するＧ１構造よりも多くの精製されたフィラミンに結
合した。
およびフィラミンとの観察された相互作用が直接的であることを例証した。モデ
ルタンパク質に結合した、精製されたフィラミンおよびタリンの相対的量は、細
胞溶解物について観察されたものと類似した。特に、β１Ｄ構造は、β１Ａタン
パク質モデルよりも多くのタリンと結合し、β７構造は、多くのフィラミンと結
合した。さらに、両方の細胞骨格タンパク質の、Ｇ４−Ｙ７８８Ａ−β１Ａ構造
並びにＧ４−β１ＢおよびＧ４−β１Ｃ変種への結合は、Ｇ４−β１Ａと比較し
て機能的に減少した。さらに、β１Ａ、β１Ｄおよびβ７インテグリン細胞質ド
メインのＧ４構造は、対応するＧ１構造よりも多くの精製されたフィラミンに結
合した。
【００２５】
しかし、Ｇ１−β７モデルタンパク質は、なおＧ４−β１ＡまたはＧ４−β１
Ｄより多くのフィラミンと結合する。クマシーブルーで染色したゲルのデンシト
メトリー評価は、β１Ｄ構造が、β１Ａモデルタンパク質よりも約９倍多くのタ
リンと結合し、β７構造が、８．４倍多くのフィラミンと結合したことを示した
。これらの実験において、タリンおよびフィラミンの量に対して、＞１０倍のモ
ル過剰のモデルタンパク質があった。従って、フィラミンについてのβ１Ａの親
和性は、β７のものよりも少なくとも８倍低く、タリンについてのこの親和性は
、β１Ｄのものよりも少なくとも９倍低い。
Ｄより多くのフィラミンと結合する。クマシーブルーで染色したゲルのデンシト
メトリー評価は、β１Ｄ構造が、β１Ａモデルタンパク質よりも約９倍多くのタ
リンと結合し、β７構造が、８．４倍多くのフィラミンと結合したことを示した
。これらの実験において、タリンおよびフィラミンの量に対して、＞１０倍のモ
ル過剰のモデルタンパク質があった。従って、フィラミンについてのβ１Ａの親
和性は、β７のものよりも少なくとも８倍低く、タリンについてのこの親和性は
、β１Ｄのものよりも少なくとも９倍低い。
【００２６】
また、α４インテグリンの細胞質ドメイン模擬を、本発明に従って製造した。
α４インテグリンサブユニットは、胚形成、造血および免疫応答に必須である(S
tewart et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7, 690-696 (1995); Shimizu et al.,
Adv. Immunol. 72, 325-380 (1999))。免疫応答におけるこれらの中心的な役割
のために、α４インテグリンは、炎症腸疾患、関節炎、多発性硬化症および喘息
のための有効な治療的標的として強く示される。α４が、細胞移動、細胞骨格機
構化および遺伝子発現を、他のインテグリンαサブユニットとは異なって調節し
得ることが示唆された(Hemler et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quant
itative Biology: The Cell Surface 57, 213-220 (1992))。これらの生物学的
特性は、α４細胞質ドメインに依存する(Stewart et al., Curr. Opin. Cell Bi
ol. 7, 690-696 (1995); Hemler et al., Cold Spring Harbor Symposia on Qua
ntitative Biology: The Cell Surface 57, 213-220 (1992); Newton et al., J
. Leukocyte Biol. 61, 422-426 (1997))。α４細胞質尾部を含む本発明の構造
的模擬を製造し、用いて、α４インテグリン特異的シグナル伝達に伴う分子を同
定した。
α４インテグリンサブユニットは、胚形成、造血および免疫応答に必須である(S
tewart et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7, 690-696 (1995); Shimizu et al.,
Adv. Immunol. 72, 325-380 (1999))。免疫応答におけるこれらの中心的な役割
のために、α４インテグリンは、炎症腸疾患、関節炎、多発性硬化症および喘息
のための有効な治療的標的として強く示される。α４が、細胞移動、細胞骨格機
構化および遺伝子発現を、他のインテグリンαサブユニットとは異なって調節し
得ることが示唆された(Hemler et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quant
itative Biology: The Cell Surface 57, 213-220 (1992))。これらの生物学的
特性は、α４細胞質ドメインに依存する(Stewart et al., Curr. Opin. Cell Bi
ol. 7, 690-696 (1995); Hemler et al., Cold Spring Harbor Symposia on Qua
ntitative Biology: The Cell Surface 57, 213-220 (1992); Newton et al., J
. Leukocyte Biol. 61, 422-426 (1997))。α４細胞質尾部を含む本発明の構造
的模擬を製造し、用いて、α４インテグリン特異的シグナル伝達に伴う分子を同
定した。
【００２７】
α４インテグリンのシグナル伝達特性についての生化学的基準を同定するため
に、細胞タンパク質の、二量体化したα４インテグリン細胞質ドメインの構造的
模擬への結合を分析した。これらの構造的模擬は、α４またはβ１Ａサブユニッ
トの細胞質尾部を、二重コイル二量体を形成する４つの７残基反復配列を含むＮ
末端配列に融合させて、細胞質ドメインが、平行して二量体化され、固定された
垂直のねじれ中に保持されるようにすることにより、形成した。
に、細胞タンパク質の、二量体化したα４インテグリン細胞質ドメインの構造的
模擬への結合を分析した。これらの構造的模擬は、α４またはβ１Ａサブユニッ
トの細胞質尾部を、二重コイル二量体を形成する４つの７残基反復配列を含むＮ
末端配列に融合させて、細胞質ドメインが、平行して二量体化され、固定された
垂直のねじれ中に保持されるようにすることにより、形成した。
【００２８】
次に、ジャーカットＴリンパ芽球の溶解物を、固定化されたα４細胞質ドメイ
ン模擬と共にインキュベートした。結合タンパク質を、前に同定したインテグリ
ン細胞質ドメイン結合タンパク質についてイムノブロットすることにより、検出
した。結合したフラクション内で、パキシリンは、細胞溶解物と比較して、５７
倍より大きく富んでいたことが見出された。対照的に、β１Ａ細胞質ドメインが
パキシリンと結合した一方、細胞溶解物に対する豊富はなかった。α４およびβ
１Ａ尾部の両方との相互作用は、結合が、タンパク質を有しない樹脂に対しても
、αＩＩｂ細胞質ドメインに対しても見られなかったため、特異的であった。α
４β１Ａ尾部のヘテロ二量体はまた、生成した。これらのヘテロ二量体は、同様
の量のパキシリンを、α４尾部のみに結合した。α４尾部はまた、少量のアクチ
ン結合タンパク質フィラミンおよび尾部に結合した。しかし、これらのタンパク
質は、細胞溶解物に対して富んでいなかった。さらに、α４尾部は、ビンキュリ
ンまたはα−アクチニンに結合しなかった。
ン模擬と共にインキュベートした。結合タンパク質を、前に同定したインテグリ
ン細胞質ドメイン結合タンパク質についてイムノブロットすることにより、検出
した。結合したフラクション内で、パキシリンは、細胞溶解物と比較して、５７
倍より大きく富んでいたことが見出された。対照的に、β１Ａ細胞質ドメインが
パキシリンと結合した一方、細胞溶解物に対する豊富はなかった。α４およびβ
１Ａ尾部の両方との相互作用は、結合が、タンパク質を有しない樹脂に対しても
、αＩＩｂ細胞質ドメインに対しても見られなかったため、特異的であった。α
４β１Ａ尾部のヘテロ二量体はまた、生成した。これらのヘテロ二量体は、同様
の量のパキシリンを、α４尾部のみに結合した。α４尾部はまた、少量のアクチ
ン結合タンパク質フィラミンおよび尾部に結合した。しかし、これらのタンパク
質は、細胞溶解物に対して富んでいなかった。さらに、α４尾部は、ビンキュリ
ンまたはα−アクチニンに結合しなかった。
【００２９】
αインテグリンサブユニット細胞質尾部中には、７つの保護されたＮ末端残基
がある(Hemler et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biolog
y: The Cell Surface 57, 213-220 (1992); Williams et al., Trends Cell Bio
l. 4, 109-112 (1994)；並びにSastry S.K.およびHorwitz, A.F. Curr. Opin. C
ell Biol. 5, 819-831 (1993))。従って、パキシリンのα４細胞質尾部との相互
作用の特異性を、一連のα細胞質ドメインに結合するパキシリンを試験すること
により、決定した。パキシリンは、αＩＩｂ、α３Ａ、α５またはα６Ａ尾部に
結合しなかった。従って、インテグリンα細胞質ドメインによるＮ末端の７つの
残基の保護は、パキシリン結合を媒介するのに十分であるとは考えられない。
がある(Hemler et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biolog
y: The Cell Surface 57, 213-220 (1992); Williams et al., Trends Cell Bio
l. 4, 109-112 (1994)；並びにSastry S.K.およびHorwitz, A.F. Curr. Opin. C
ell Biol. 5, 819-831 (1993))。従って、パキシリンのα４細胞質尾部との相互
作用の特異性を、一連のα細胞質ドメインに結合するパキシリンを試験すること
により、決定した。パキシリンは、αＩＩｂ、α３Ａ、α５またはα６Ａ尾部に
結合しなかった。従って、インテグリンα細胞質ドメインによるＮ末端の７つの
残基の保護は、パキシリン結合を媒介するのに十分であるとは考えられない。
【００３０】
パキシリンに加えて、また、実験を実施して、パキシリン関連タンパク質Ｈｉ
ｃ−５およびロイパキシンもまたα４細胞質尾部に結合するか否かを決定した。
いくつかの実験において、主要でない５５Ｋのバンド、Ｈｉｃ−５の大きさを、
α４カラムに結合したと観察した。Ｈｉｃ−５の給源として血小板抽出物を用い
ることにより、細胞溶解物と比較して７．４倍の豊富が観察された。ジャーカッ
ト細胞における同様の実験において、出発溶解物と比較して１．９倍の豊富が、
ロイパキシンについて観察された。
ｃ−５およびロイパキシンもまたα４細胞質尾部に結合するか否かを決定した。
いくつかの実験において、主要でない５５Ｋのバンド、Ｈｉｃ−５の大きさを、
α４カラムに結合したと観察した。Ｈｉｃ−５の給源として血小板抽出物を用い
ることにより、細胞溶解物と比較して７．４倍の豊富が観察された。ジャーカッ
ト細胞における同様の実験において、出発溶解物と比較して１．９倍の豊富が、
ロイパキシンについて観察された。
【００３１】
また、実験を実施して、パキシリンがまた、無傷のα４インテグリンおよび無
傷のα４β１インテグリンと関連することを確認した。これらの実験において、
ジャーカット細胞溶解物を、それぞれα４、β１またはα５インテグリンサブユ
ニットと反応性のモノクローナル抗体あるいはパキシリンまたは無関連ＩｇＧと
反応性のモノクローナル抗体と共に免疫沈殿した。パキシリンは、α４およびβ
１免疫沈殿物中に存在したが、α５抗体または無関連ＩｇＧで形成した免疫沈殿
物中には存在しなかった。表面ビオチン標識細胞の免疫沈殿物は、α４β１の免
疫沈殿をα４抗体により、α５β１をα５抗体により、およびこれらの２種とα
１の可動度を有するバンドとの混合物を抗β１抗体により確認した。パキシリン
または無関連ＩｇＧに対するモノクローナル抗体で免疫沈殿した細胞溶解物にお
いて、α４β１インテグリン（しかしα５β１インテグリンではない）は、パキ
シリンと同時沈殿した。α４β１は、無関連ＩｇＧと同時沈殿しなかった。
傷のα４β１インテグリンと関連することを確認した。これらの実験において、
ジャーカット細胞溶解物を、それぞれα４、β１またはα５インテグリンサブユ
ニットと反応性のモノクローナル抗体あるいはパキシリンまたは無関連ＩｇＧと
反応性のモノクローナル抗体と共に免疫沈殿した。パキシリンは、α４およびβ
１免疫沈殿物中に存在したが、α５抗体または無関連ＩｇＧで形成した免疫沈殿
物中には存在しなかった。表面ビオチン標識細胞の免疫沈殿物は、α４β１の免
疫沈殿をα４抗体により、α５β１をα５抗体により、およびこれらの２種とα
１の可動度を有するバンドとの混合物を抗β１抗体により確認した。パキシリン
または無関連ＩｇＧに対するモノクローナル抗体で免疫沈殿した細胞溶解物にお
いて、α４β１インテグリン（しかしα５β１インテグリンではない）は、パキ
シリンと同時沈殿した。α４β１は、無関連ＩｇＧと同時沈殿しなかった。
【００３２】
パキシリンのα４尾部との密な会合およびこのα４インテグリンとの容易な単
離は、細胞中のパキシリンと関連するα４β１の顕著な部分を示す。このフラク
ションを決定するために、表面ビオチンで標識したジャーカット細胞溶解物を、
抗パキシリン抗体または無関連ＩｇＧで続いて免疫沈殿した。抗パキシリン抗体
でのウエスタンブロッティングは、事実上すべてのパキシリンの欠乏を確認した
。パキシリン欠乏の結果、溶解物中のα４のほぼ完全な損失が生じた。対照的に
、α５の欠乏はほとんどなかった。無関連ＩｇＧでの免疫沈殿により、α４β１
またはα５β１のいずれの顕著な損失にも至らなかった。従って、α４の大部分
またはすべてが、パキシリンと物理的に関連すると考えられる。
離は、細胞中のパキシリンと関連するα４β１の顕著な部分を示す。このフラク
ションを決定するために、表面ビオチンで標識したジャーカット細胞溶解物を、
抗パキシリン抗体または無関連ＩｇＧで続いて免疫沈殿した。抗パキシリン抗体
でのウエスタンブロッティングは、事実上すべてのパキシリンの欠乏を確認した
。パキシリン欠乏の結果、溶解物中のα４のほぼ完全な損失が生じた。対照的に
、α５の欠乏はほとんどなかった。無関連ＩｇＧでの免疫沈殿により、α４β１
またはα５β１のいずれの顕著な損失にも至らなかった。従って、α４の大部分
またはすべてが、パキシリンと物理的に関連すると考えられる。
【００３３】
次に、αＩＩｂ細胞外および膜貫通ドメイン並びにα４細胞質ドメインからな
るキメラを構成して、α４細胞質尾部のみが、パキシリンをインテグリンに結合
させるのに十分であるか否かを決定した。適切なβ尾部パートナーを提供するた
めに、β３の細胞外および膜貫通ドメインを、β１Ａまたはβ７細胞質ドメイン
に接合した。αＩＩｂα４β３β１ＡおよびαＩＩｂα４β３β７キメラインテ
グリンを、ＣＨＯ細胞中に発現した。α６Ａ細胞質ドメインが、αＩＩｂに接合
され、ＣＨＯ細胞中にαＩＩｂα６Ａβ３β１Ａキメラとして発現したキメラを
用いた(Hughes et al., Cell 88, 521-530 (1997))。これらの細胞からの溶解物
を、αＩＩｂβ３の細胞外ドメインに対する抗体と共に免疫沈殿させた際に、同
様の量の組換えインテグリンが、各々の細胞系から沈殿した。α４尾部含有キメ
ラインテグリンを含む細胞のみが、実質的なパキシリン同時免疫沈殿を明示した
。従って、α４細胞質ドメインは、無傷のインテグリンのパキシリンとの関連を
媒介しなければならない。
るキメラを構成して、α４細胞質尾部のみが、パキシリンをインテグリンに結合
させるのに十分であるか否かを決定した。適切なβ尾部パートナーを提供するた
めに、β３の細胞外および膜貫通ドメインを、β１Ａまたはβ７細胞質ドメイン
に接合した。αＩＩｂα４β３β１ＡおよびαＩＩｂα４β３β７キメラインテ
グリンを、ＣＨＯ細胞中に発現した。α６Ａ細胞質ドメインが、αＩＩｂに接合
され、ＣＨＯ細胞中にαＩＩｂα６Ａβ３β１Ａキメラとして発現したキメラを
用いた(Hughes et al., Cell 88, 521-530 (1997))。これらの細胞からの溶解物
を、αＩＩｂβ３の細胞外ドメインに対する抗体と共に免疫沈殿させた際に、同
様の量の組換えインテグリンが、各々の細胞系から沈殿した。α４尾部含有キメ
ラインテグリンを含む細胞のみが、実質的なパキシリン同時免疫沈殿を明示した
。従って、α４細胞質ドメインは、無傷のインテグリンのパキシリンとの関連を
媒介しなければならない。
【００３４】
次に、α４尾部の機能的効果を、細胞接着およびαＩＩｂβ３リガンド、フィ
ブリノーゲン上への拡散をアッセイすることにより、試験した。α４尾部は、α
ＩＩｂβ３依存性細胞接着を変化させなかった。しかし、α４尾部は、αＩＩｂ
β３依存性細胞拡散に対抗した。これらの２つの細胞系は、内因性α５β１フィ
ブロネクチンについてのリガンド上に接着し、同等に十分に拡散し、このことは
、効果が、組換えインテグリンに特異的であることを確認した。α４尾部内のパ
キシリン結合部位のアッセイにおいて、パキシリンの結合を崩壊させたアミノ酸
残基Ｙ９９１Ａを、同定した。この突然変異を、α４キメラ中に導入し、αＩＩ
ｂα４（Ｙ９９１Ａ）β３β１Ａを、ＣＨＯ細胞中に発現した。この突然変異は
、αＩＩｂβ３依存性細胞拡散を回復したが、フィブロネクチン上のαＩＩｂβ
３依存性細胞接着または細胞拡散のいずれをも変化させなかった。従って、α４
尾部のパキシリンとの相互作用の結果、細胞拡散が減少する。
ブリノーゲン上への拡散をアッセイすることにより、試験した。α４尾部は、α
ＩＩｂβ３依存性細胞接着を変化させなかった。しかし、α４尾部は、αＩＩｂ
β３依存性細胞拡散に対抗した。これらの２つの細胞系は、内因性α５β１フィ
ブロネクチンについてのリガンド上に接着し、同等に十分に拡散し、このことは
、効果が、組換えインテグリンに特異的であることを確認した。α４尾部内のパ
キシリン結合部位のアッセイにおいて、パキシリンの結合を崩壊させたアミノ酸
残基Ｙ９９１Ａを、同定した。この突然変異を、α４キメラ中に導入し、αＩＩ
ｂα４（Ｙ９９１Ａ）β３β１Ａを、ＣＨＯ細胞中に発現した。この突然変異は
、αＩＩｂβ３依存性細胞拡散を回復したが、フィブロネクチン上のαＩＩｂβ
３依存性細胞接着または細胞拡散のいずれをも変化させなかった。従って、α４
尾部のパキシリンとの相互作用の結果、細胞拡散が減少する。
【００３５】
パキシリンが、細胞拡散のα４阻害に必要であることを確認するために、α４
サブユニットを、野生型またはパキシリン欠乏マウスから誘導された一次線維芽
細胞中で発現させ、ＶＣＡＭ−１、即ちα４インテグリン特異性リガンド上での
細胞拡散をアッセイした。２つのパキシリンヌル胚からの一次マウス胚線維芽細
胞は、同腹の野生型胚からのものが拡散しない箇所において拡散した。
サブユニットを、野生型またはパキシリン欠乏マウスから誘導された一次線維芽
細胞中で発現させ、ＶＣＡＭ−１、即ちα４インテグリン特異性リガンド上での
細胞拡散をアッセイした。２つのパキシリンヌル胚からの一次マウス胚線維芽細
胞は、同腹の野生型胚からのものが拡散しない箇所において拡散した。
【００３６】
他の細胞質ゾルタンパク質が、全体の細胞抽出物中のα４複合体へのパキシリ
ンの観察された結合を媒介することができるか否かを決定するために、組換えヒ
トパキシリン−ＧＳＴ融合タンパク質を調製した。精製した組換えパキシリン−
ＧＳＴ融合タンパク質は、α４細胞質ドメインに定量的に結合した。対照的に、
パキシリン結合は、αＩＩｂ尾部においては検出可能ではなかった。さらに、α
４尾部へのＧＳＴの結合はなかった。両方の結合パートナーが、組換え細菌タン
パク質であるため、パキシリンのα４尾部との直接の相互作用におけるチロシン
リン酸化に対する要求を、排除することができる。α４尾部へのパキシリン結合
は、飽和性であり、親和性が高い。
ンの観察された結合を媒介することができるか否かを決定するために、組換えヒ
トパキシリン−ＧＳＴ融合タンパク質を調製した。精製した組換えパキシリン−
ＧＳＴ融合タンパク質は、α４細胞質ドメインに定量的に結合した。対照的に、
パキシリン結合は、αＩＩｂ尾部においては検出可能ではなかった。さらに、α
４尾部へのＧＳＴの結合はなかった。両方の結合パートナーが、組換え細菌タン
パク質であるため、パキシリンのα４尾部との直接の相互作用におけるチロシン
リン酸化に対する要求を、排除することができる。α４尾部へのパキシリン結合
は、飽和性であり、親和性が高い。
【００３７】
本発明の構造的模擬についてのこれらの実験は、パキシリンが、α４細胞質尾
部に直接かつ密に結合することを例証する。従って、パキシリンは、α４インテ
グリンのシグナル伝達特性において重要な役割を奏すると考えられる。特に、パ
キシリンのα４尾部への直接の結合は、α４依存性細胞拡散に対抗すると考えら
れる。従って、α４のパキシリンへの結合の遮断は、α４媒介細胞移動を阻害し
なければならない。α４の主要な機能が、白血球の移動および交換であるため、
パキシリンのα４への結合の阻害は、免疫応答を遮断するのに有用であると予測
される。α４インテグリン活性化はまた、アテローム硬化症と関連した。従って
、活性化を阻害する剤はまた、アテローム硬化症を阻害するのに有用である。α
４インテグリンのさらなる活性化は、創傷治癒の間に生じる。さらに特に、α４
インテグリン活性化は、単球をシグナル伝達して、創傷部位において凝集させる
。しかし、この凝集は、瘢痕を生じ得る。従って、α４インテグリン活性化の阻
害はまた、創傷治癒中の瘢痕の阻害において有用である。
部に直接かつ密に結合することを例証する。従って、パキシリンは、α４インテ
グリンのシグナル伝達特性において重要な役割を奏すると考えられる。特に、パ
キシリンのα４尾部への直接の結合は、α４依存性細胞拡散に対抗すると考えら
れる。従って、α４のパキシリンへの結合の遮断は、α４媒介細胞移動を阻害し
なければならない。α４の主要な機能が、白血球の移動および交換であるため、
パキシリンのα４への結合の阻害は、免疫応答を遮断するのに有用であると予測
される。α４インテグリン活性化はまた、アテローム硬化症と関連した。従って
、活性化を阻害する剤はまた、アテローム硬化症を阻害するのに有用である。α
４インテグリンのさらなる活性化は、創傷治癒の間に生じる。さらに特に、α４
インテグリン活性化は、単球をシグナル伝達して、創傷部位において凝集させる
。しかし、この凝集は、瘢痕を生じ得る。従って、α４インテグリン活性化の阻
害はまた、創傷治癒中の瘢痕の阻害において有用である。
【００３８】
この構造的モデルを用いて、パキシリンおよびα４尾部の結合の阻害剤として
のα４細胞質ドメインから誘導された１５量体ペプチドであるＳＩＬＱＥＥＮＲ
ＲＤＳＷＳＹＩ（配列番号１５）を同定した。このペプチドによるパキシリンお
よびα４尾部の相互作用の阻害のＩＣ５０は、１５０μＭであった。追加の１５
量体ペプチドであるＫＡＧＦＦＫＲＱＹＫＳＩＬＱＥ（配列番号１６）およびＲ
ＲＤＳＷＳＹＩＮＳＫＳＮＤＤ（配列番号１７）を用いた同様の実験は、阻害を
示さなかった。また、アラニンを含む配列番号１５内の種々の単一のアミノ酸の
他の置換により、阻害活性が消失した。従って、１５量体ペプチドＳＩＬＱＥＥ
ＮＲＲＤＳＷＳＹＩ（配列番号１５）による阻害は、構造的に特異的である。こ
のペプチドの核の活性配列は、９個のアミノ酸配列ＥＮＲＲＤＳＷＳＹ（配列番
号１８）を含むと決定された。この核の配列およびこの構造についての知識は、
α４インテグリン生物学的応答を阻害する治療剤の合理的な設計において有用で
ある。
のα４細胞質ドメインから誘導された１５量体ペプチドであるＳＩＬＱＥＥＮＲ
ＲＤＳＷＳＹＩ（配列番号１５）を同定した。このペプチドによるパキシリンお
よびα４尾部の相互作用の阻害のＩＣ５０は、１５０μＭであった。追加の１５
量体ペプチドであるＫＡＧＦＦＫＲＱＹＫＳＩＬＱＥ（配列番号１６）およびＲ
ＲＤＳＷＳＹＩＮＳＫＳＮＤＤ（配列番号１７）を用いた同様の実験は、阻害を
示さなかった。また、アラニンを含む配列番号１５内の種々の単一のアミノ酸の
他の置換により、阻害活性が消失した。従って、１５量体ペプチドＳＩＬＱＥＥ
ＮＲＲＤＳＷＳＹＩ（配列番号１５）による阻害は、構造的に特異的である。こ
のペプチドの核の活性配列は、９個のアミノ酸配列ＥＮＲＲＤＳＷＳＹ（配列番
号１８）を含むと決定された。この核の配列およびこの構造についての知識は、
α４インテグリン生物学的応答を阻害する治療剤の合理的な設計において有用で
ある。
【００３９】
これらの例により例証されたように、本発明の構造モデルは、インビトロでの
インテグリン尾部との種々のタンパク質会合の分析およびインテグリンの細胞質
面の構造的観点のための新規な実験的手段を提供する。従って、本発明の構造モ
デルは、インビボで優勢な構成と同等であるかまたはこれに類似する構成におけ
る構造の細胞質尾部を維持し、一方水性系、即ちねじれた、平行なおよび近接し
た位相における可溶性および安定性を維持するこの能力に基づいて、多くの用途
を有する。本明細書において例示されているように、これらのモデルを用いて、
内から外へのシグナル伝達によりインテグリンを結合し、シグナルを調節するこ
とができる細胞内分子を検出することができる。あるいはまた、これらの分子を
インビボで用いて、これらの組換えモデルの細胞質ドメインが、細胞内分子につ
いて、天然のインテグリンと競合するように、細胞を結合することにより、内か
ら外へのシグナル伝達を崩壊させるかまたは調節することができる。
インテグリン尾部との種々のタンパク質会合の分析およびインテグリンの細胞質
面の構造的観点のための新規な実験的手段を提供する。従って、本発明の構造モ
デルは、インビボで優勢な構成と同等であるかまたはこれに類似する構成におけ
る構造の細胞質尾部を維持し、一方水性系、即ちねじれた、平行なおよび近接し
た位相における可溶性および安定性を維持するこの能力に基づいて、多くの用途
を有する。本明細書において例示されているように、これらのモデルを用いて、
内から外へのシグナル伝達によりインテグリンを結合し、シグナルを調節するこ
とができる細胞内分子を検出することができる。あるいはまた、これらの分子を
インビボで用いて、これらの組換えモデルの細胞質ドメインが、細胞内分子につ
いて、天然のインテグリンと競合するように、細胞を結合することにより、内か
ら外へのシグナル伝達を崩壊させるかまたは調節することができる。
【００４０】
これらの構造モデルが、インテグリンの細胞外リガンド結合部位を含まないた
め、これらは次に内から外へのシグナル伝達を崩壊させる。これは、インテグリ
ンの過剰活性、例えば炎症、血栓症および悪性疾患を伴う条件において、特に有
用である。これは、このような症状またはこれらの続発症を治療する新規な方法
を提供する；これらの分子が、膜内の天然のインテグリンの配向を模擬するため
、これらは、膜構造を崩壊させず、従って一層良好に許容され、副作用を回避す
る。さらに、本発明の構造モデルを用いて、インテグリンの細胞内または細胞質
ドメインおよび他の膜貫通分子に、インビボで、例えばアフィニティークロマト
グラフィーにより結合することができる分子を検出することができる。従って、
これらのモデルは、選択された細胞質ドメインのための種々の治療化合物の同定
において有用である。
め、これらは次に内から外へのシグナル伝達を崩壊させる。これは、インテグリ
ンの過剰活性、例えば炎症、血栓症および悪性疾患を伴う条件において、特に有
用である。これは、このような症状またはこれらの続発症を治療する新規な方法
を提供する；これらの分子が、膜内の天然のインテグリンの配向を模擬するため
、これらは、膜構造を崩壊させず、従って一層良好に許容され、副作用を回避す
る。さらに、本発明の構造モデルを用いて、インテグリンの細胞内または細胞質
ドメインおよび他の膜貫通分子に、インビボで、例えばアフィニティークロマト
グラフィーにより結合することができる分子を検出することができる。従って、
これらのモデルは、選択された細胞質ドメインのための種々の治療化合物の同定
において有用である。
【００４１】
「治療的化合物」により、モデルの選択された細胞質ドメインに結合すること
が見出された分子、モデルの細胞質ドメインに結合するタンパク質に結合する分
子および分子自体を含むが、これらには限定されないことを意味する。例えば、
１つの態様において、α４インテグリン細胞質尾部を含む構造モデルまたは模擬
を、高投入量スクリーニングアッセイにおいて用いて、パキシリンのα４細胞質
尾部への結合を阻害する剤を同定することができる。このアッセイにおいて、α
４インテグリン細胞質尾部を含む構造モデルを、パキシリンまたはパキシリン関
連分子に、試験剤の存在下または不存在下で暴露する。次に、パキシリンまたは
パキシリン関連分子の構造モデルへの、試験剤の存在下または不存在下での結合
を決定する。
が見出された分子、モデルの細胞質ドメインに結合するタンパク質に結合する分
子および分子自体を含むが、これらには限定されないことを意味する。例えば、
１つの態様において、α４インテグリン細胞質尾部を含む構造モデルまたは模擬
を、高投入量スクリーニングアッセイにおいて用いて、パキシリンのα４細胞質
尾部への結合を阻害する剤を同定することができる。このアッセイにおいて、α
４インテグリン細胞質尾部を含む構造モデルを、パキシリンまたはパキシリン関
連分子に、試験剤の存在下または不存在下で暴露する。次に、パキシリンまたは
パキシリン関連分子の構造モデルへの、試験剤の存在下または不存在下での結合
を決定する。
【００４２】
パキシリンまたはパキシリン関連分子の構造モデルへの試験剤の不存在下での
結合と比較した、パキシリンまたはパキシリン関連分子の構造モデルへの結合を
減少させる試験剤は、α４インテグリンに関する生物学的応答を阻害することが
できる。例えば、これらの剤は、瘢痕に至り得るα４インテグリンの正常な創傷
治癒応答を阻害するのに有用であり得る。また、これらの剤を、α４インテグリ
ンの病理学的応答、例えばアテローム硬化症に伴う応答並びに症状、例えば炎症
性腸疾患、関節炎、多発性硬化症および喘息における免疫応答の阻害において用
いることができる。このような剤および既知の薬学的に受け入れられるビヒクル
を含む組成物は、α４インテグリンの生物学的応答を阻害するのに、治療的に有
用であると考えられている。
結合と比較した、パキシリンまたはパキシリン関連分子の構造モデルへの結合を
減少させる試験剤は、α４インテグリンに関する生物学的応答を阻害することが
できる。例えば、これらの剤は、瘢痕に至り得るα４インテグリンの正常な創傷
治癒応答を阻害するのに有用であり得る。また、これらの剤を、α４インテグリ
ンの病理学的応答、例えばアテローム硬化症に伴う応答並びに症状、例えば炎症
性腸疾患、関節炎、多発性硬化症および喘息における免疫応答の阻害において用
いることができる。このような剤および既知の薬学的に受け入れられるビヒクル
を含む組成物は、α４インテグリンの生物学的応答を阻害するのに、治療的に有
用であると考えられている。
【００４３】
以下の例を、例示目的のみのために提供し、本発明を限定することを意図しな
い。
い。
【００４４】例 例１ 抗体およびｃＤＮＡ
細胞質ドメインモデルタンパク質に結合するタンパク質のウエスタンブロット
における分析用の抗体は、以下のものを含んでいた：フィラミンに対するヤギ血
清(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、αアクチニンに対するウサギ血清(Si
gma Chemical Co.)、タリンに対するｍＡｂ（クローン８ｄ４）(Sigma Chemical
Co.)、ビンキュリン（クローンｈＶＩＮ−１）(Sigma Chemical Co.)、パシリ
ン（クローンＺ０３５）(Zymed Laboratories Inc., S. San Francisco, CA)、
フィラミン（ＭＡＢ１６８０）(Chemicon International Inc. Temecula, CA)、
αアクチニン（ＭＢ７５．２）(Sigma Chemical Co.)、アクチン（クローンＣ４
）(Boehringer-Mannheim Corp., Indianapolis, IN)、ｐｐ６０ｓｒｃに対する
ｍＡｂ（クローン３２７）、ｐｐ１２５ＦＡＫ（ＢＣ３）およびウサギ抗ｐｐ７
２ｓｙｋに対するポリクローナルウサギ血清、ヒトβ１インテグリンに対するｍ
Ａｂ（Ｂ−Ｄ１５、BioSource, International）、ヒトα４インテグリンに対す
るｍＡｂ（ＨＰ２／１、ImmunoTech）、ヒトα５インテグリンに対するｍＡｂヒ
ト(PharMingen)、ＨＡ−ｔａｇに対するｍＡｂ（１２Ｃ５、ＡＴＣＣ）、パキシ
リンに対するｍＡｂ（クローン３４９、Transduction Laboratories）およびＧ
ＳＴに対するｍＡｂ（Ｂ−１４、Santa Cruz）。
における分析用の抗体は、以下のものを含んでいた：フィラミンに対するヤギ血
清(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、αアクチニンに対するウサギ血清(Si
gma Chemical Co.)、タリンに対するｍＡｂ（クローン８ｄ４）(Sigma Chemical
Co.)、ビンキュリン（クローンｈＶＩＮ−１）(Sigma Chemical Co.)、パシリ
ン（クローンＺ０３５）(Zymed Laboratories Inc., S. San Francisco, CA)、
フィラミン（ＭＡＢ１６８０）(Chemicon International Inc. Temecula, CA)、
αアクチニン（ＭＢ７５．２）(Sigma Chemical Co.)、アクチン（クローンＣ４
）(Boehringer-Mannheim Corp., Indianapolis, IN)、ｐｐ６０ｓｒｃに対する
ｍＡｂ（クローン３２７）、ｐｐ１２５ＦＡＫ（ＢＣ３）およびウサギ抗ｐｐ７
２ｓｙｋに対するポリクローナルウサギ血清、ヒトβ１インテグリンに対するｍ
Ａｂ（Ｂ−Ｄ１５、BioSource, International）、ヒトα４インテグリンに対す
るｍＡｂ（ＨＰ２／１、ImmunoTech）、ヒトα５インテグリンに対するｍＡｂヒ
ト(PharMingen)、ＨＡ−ｔａｇに対するｍＡｂ（１２Ｃ５、ＡＴＣＣ）、パキシ
リンに対するｍＡｂ（クローン３４９、Transduction Laboratories）およびＧ
ＳＴに対するｍＡｂ（Ｂ−１４、Santa Cruz）。
【００４５】
ＦＡＫに対するポリクローナル抗体（Ｃ−２０、Santa Cruz）もまた用いた。
ビオチン標識抗パキシリン抗体を、市販の抗パキシリン（クローン３４９）をＮ
ＨＳ−ビオチン(Pierce)で製造者の指示に従って標識することにより、調製した
。ウサギポリクローナル抗ロイパキシンを、ヒトロイパキシンのＮ末端１４アミ
ノ酸に対して上昇させた(Lipsky et al., J. Biol. Chem. 273 11709-11713 (19
98))。
ビオチン標識抗パキシリン抗体を、市販の抗パキシリン（クローン３４９）をＮ
ＨＳ−ビオチン(Pierce)で製造者の指示に従って標識することにより、調製した
。ウサギポリクローナル抗ロイパキシンを、ヒトロイパキシンのＮ末端１４アミ
ノ酸に対して上昇させた(Lipsky et al., J. Biol. Chem. 273 11709-11713 (19
98))。
【００４６】
これらの実験において用いたヒトｃＤＮＡは、以下のものを含んでいた：β１
ＣｃＤＮＡ、点突然変異を有するβ１ｃＤＮＡ、Ｙ７８８Ａ１；心臓筋肉全ＲＮ
ＡのＲＴ−ＰＣＴにより得られたヒトインテグリンβ１Ｄの細胞質ドメインにつ
いてのｃＤＮＡ；ヒトインテグリンβ７のｃＤＮＡ；およびヒトβ１Ｂ配列を含
む部分的に重複する逆オリゴヌクレオチドを有するヒトβ１Ａベクターを用いて
ＰＣＲ反応において合成されたヒトβ１Ｂサブユニット細胞質ドメインをコード
するｃＤＮＡ。
ＣｃＤＮＡ、点突然変異を有するβ１ｃＤＮＡ、Ｙ７８８Ａ１；心臓筋肉全ＲＮ
ＡのＲＴ−ＰＣＴにより得られたヒトインテグリンβ１Ｄの細胞質ドメインにつ
いてのｃＤＮＡ；ヒトインテグリンβ７のｃＤＮＡ；およびヒトβ１Ｂ配列を含
む部分的に重複する逆オリゴヌクレオチドを有するヒトβ１Ａベクターを用いて
ＰＣＲ反応において合成されたヒトβ１Ｂサブユニット細胞質ドメインをコード
するｃＤＮＡ。
【００４７】例２ 組換え細胞質ドメインモデル
オリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲ反応において用いて、αヘリックス７残
基反復タンパク質配列ＫＬＥＡＬＥＧＲＬＤＡＬＥＧＫＬＥＡＬＥＧＫＬＤＡＬ
ＥＧ（配列番号６）Ｇ１−（［７残基］４）のためのｃＤＮＡを作成した。Ｃ末
端における１〜３個の追加のＧｌｙ残基（Ｇ２−４−（［７残基］４））を含む
変種を、アンチセンスオリゴヌクレオチドの変性により合成した。これらのｃＤ
ＮＡを、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限改変ｐＥＴ１５ｂベクター(Novagen, Ma
dison, WI)中につないだ。インテグリン細胞質ドメインを、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントとして、ヘリックスに接合した。Ｎ末端配列ＧＳＳＨＨＨ
ＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＣＧ（配列番号５）［７残基］４をコードする最
終的な構成を、インテグリンの細胞質ドメインに結合させた。種々の細胞質ドメ
インｃＤＮＡを、停止コドンの直後に５’−ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する前方
オリゴヌクレオチドおよび３’−ＢａｍＨＩ部位を作成する逆オリゴヌクレオチ
ドを用いて、適切なｃＤＮＡからのＰＣＲにより、クローン化した。
基反復タンパク質配列ＫＬＥＡＬＥＧＲＬＤＡＬＥＧＫＬＥＡＬＥＧＫＬＤＡＬ
ＥＧ（配列番号６）Ｇ１−（［７残基］４）のためのｃＤＮＡを作成した。Ｃ末
端における１〜３個の追加のＧｌｙ残基（Ｇ２−４−（［７残基］４））を含む
変種を、アンチセンスオリゴヌクレオチドの変性により合成した。これらのｃＤ
ＮＡを、ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限改変ｐＥＴ１５ｂベクター(Novagen, Ma
dison, WI)中につないだ。インテグリン細胞質ドメインを、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントとして、ヘリックスに接合した。Ｎ末端配列ＧＳＳＨＨＨ
ＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＣＧ（配列番号５）［７残基］４をコードする最
終的な構成を、インテグリンの細胞質ドメインに結合させた。種々の細胞質ドメ
インｃＤＮＡを、停止コドンの直後に５’−ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する前方
オリゴヌクレオチドおよび３’−ＢａｍＨＩ部位を作成する逆オリゴヌクレオチ
ドを用いて、適切なｃＤＮＡからのＰＣＲにより、クローン化した。
【００４８】
ＰＣＲ生成物を、先ずＴＡクローニング（登録商標）キット(Invitrogen Corp
., San Diego, CA)を用いてｐＣＲ（登録商標）ベクターにつないだ。配列決定
後、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ挿入体を、改変したｐＥＴ１５ｂベクター中に
つないだ。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞(Novagen)における組換え発現お
よび組換え生成物の精製を、逆相Ｃ１８ＨＰＬＣカラム(Vydac, Hesperia, CA)
上での追加の最終精製工程を有するｐＥＴシステムマニュアル(Novagen)に従っ
て実施した。生成物を、ＡＰＩ−ＩＩＩ４部構成分光計(Sciex, Toronto, Ontar
io, Canada)におけるエレクトロスプレー質量分析法により分析した。
., San Diego, CA)を用いてｐＣＲ（登録商標）ベクターにつないだ。配列決定
後、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ挿入体を、改変したｐＥＴ１５ｂベクター中に
つないだ。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞(Novagen)における組換え発現お
よび組換え生成物の精製を、逆相Ｃ１８ＨＰＬＣカラム(Vydac, Hesperia, CA)
上での追加の最終精製工程を有するｐＥＴシステムマニュアル(Novagen)に従っ
て実施した。生成物を、ＡＰＩ−ＩＩＩ４部構成分光計(Sciex, Toronto, Ontar
io, Canada)におけるエレクトロスプレー質量分析法により分析した。
【００４９】例３ 紫外線円二色性分光
遠ＵＶＣＤスペクトルを、ペプチドを５０ｍＭのホウ酸、ｐＨ７．０に溶解し
て、ＡＶＩＶ６０ＤＳ分光旋光計上で記録した。データを、緩衝液のみを用いて
得られ、定量的アミノ酸分析による同一の試料から決定されたタンパク質濃度に
関連させたスペクトルについて補正した。これらの値から、らせん状二次構造の
百分率を、Muir et al., Biochemistry 33:7701 (1994)により記載された手順に
従って計算した。
て、ＡＶＩＶ６０ＤＳ分光旋光計上で記録した。データを、緩衝液のみを用いて
得られ、定量的アミノ酸分析による同一の試料から決定されたタンパク質濃度に
関連させたスペクトルについて補正した。これらの値から、らせん状二次構造の
百分率を、Muir et al., Biochemistry 33:7701 (1994)により記載された手順に
従って計算した。
【００５０】例４ 細胞および細胞溶解物
ヒト血小板を、新たに採取した血液試料を１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離
し、得られた血小板に富む血漿を２６００ｒｐｍで１５分間沈降させることによ
り、得た。これらを、０．１２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１２９Ｍクエン酸三ナトリ
ウム、０．０３Ｍグルコース、ｐＨ６．５で２回、およびヘペス−生理食塩水（
３．８ｍＭヘペス、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２，７ｍＭ ＫＣｌ、５．６ｍＭ
Ｄ−グルコース、３．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．３〜７．４）で１回洗
浄した。ヒトジャーカットおよびＨＴ１０８０細胞並びにマウスＣ２Ｃ１２細胞
を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collect
ion)(Rockville, MD)から得、ＲＰＭＩ１６８０（ジャーカット）または１０％
胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で培養した。筋管への分化のために、Ｃ２Ｃ１２
筋芽細胞を、５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ中で、６日間融合性に保持した。培養
した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳ中の１ｍＭ
ＮＨＳ−ビオチン(Pierce)で３０分間室温でビオチニル化した。
し、得られた血小板に富む血漿を２６００ｒｐｍで１５分間沈降させることによ
り、得た。これらを、０．１２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１２９Ｍクエン酸三ナトリ
ウム、０．０３Ｍグルコース、ｐＨ６．５で２回、およびヘペス−生理食塩水（
３．８ｍＭヘペス、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２，７ｍＭ ＫＣｌ、５．６ｍＭ
Ｄ−グルコース、３．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．３〜７．４）で１回洗
浄した。ヒトジャーカットおよびＨＴ１０８０細胞並びにマウスＣ２Ｃ１２細胞
を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collect
ion)(Rockville, MD)から得、ＲＰＭＩ１６８０（ジャーカット）または１０％
胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で培養した。筋管への分化のために、Ｃ２Ｃ１２
筋芽細胞を、５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ中で、６日間融合性に保持した。培養
した細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳ中の１ｍＭ
ＮＨＳ−ビオチン(Pierce)で３０分間室温でビオチニル化した。
【００５１】
血小板を、ヘペス−生理食塩水でビオチニル化した。ＴＢＳでさらに２回洗浄
した後、細胞を氷上で、１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、０．５％デオキシコー
ル酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤（１／１００体積
のアプロチニン(Sigma A-6379)、５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ
）を含む緩衝液Ａ（１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、４０ｍＭピロリ
ン酸Ｎａ、１０ｍＭピペス、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭスクロース、ｐＨ
６．８）で溶解した。血小板溶解物に、０．１ｍＭのカルパイン阻害剤Ｅ−６４
(Boehringer Mannheim)を追加で加えた。溶解物を、アストラソン超音波プロセ
ッサー(Heart Systems, Farmingdale, NY)を用いて３の設定において氷上で１０
秒間、５回超音波処理した。３０分後、溶解物を、１２，０００ｇで３０分間遠
心分離することにより、分類した。
した後、細胞を氷上で、１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、０．５％デオキシコー
ル酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテアーゼ阻害剤（１／１００体積
のアプロチニン(Sigma A-6379)、５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ
）を含む緩衝液Ａ（１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５０ｍＭ ＮａＦ、４０ｍＭピロリ
ン酸Ｎａ、１０ｍＭピペス、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭスクロース、ｐＨ
６．８）で溶解した。血小板溶解物に、０．１ｍＭのカルパイン阻害剤Ｅ−６４
(Boehringer Mannheim)を追加で加えた。溶解物を、アストラソン超音波プロセ
ッサー(Heart Systems, Farmingdale, NY)を用いて３の設定において氷上で１０
秒間、５回超音波処理した。３０分後、溶解物を、１２，０００ｇで３０分間遠
心分離することにより、分類した。
【００５２】例５ インテグリン細胞質ドメイン模擬でのアフィニティークロマトグラフィー 実験
精製した組換え細胞質ドメインタンパク質（５００μｇ）を、５ｍｌの２０ｍ
Ｍピペス、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８および１ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ３．５の混合物に溶解し、Ｎｉ２＋飽和Ｈｉｓ結合樹脂(Novagen)８
０μｌに一夜結合させた。対照実験において、これにより、ペプチドを有する樹
脂のおよその飽和に至ることが見いだされた。樹脂を、２０ｍＭピペス、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８で２回洗浄し、１体積のこの緩衝液と共に懸濁液とし
て０．１％アジ化ナトリウムと共に４℃で貯蔵した。５０マイクロリットルのこ
のような懸濁液を、０．０５％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、３ｍＭのＭｇＣｌ２ およびプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液Ａで１０倍に希釈した細胞溶解物４．５
ｍｌに加えた。
Ｍピペス、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８および１ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ３．５の混合物に溶解し、Ｎｉ２＋飽和Ｈｉｓ結合樹脂(Novagen)８
０μｌに一夜結合させた。対照実験において、これにより、ペプチドを有する樹
脂のおよその飽和に至ることが見いだされた。樹脂を、２０ｍＭピペス、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８で２回洗浄し、１体積のこの緩衝液と共に懸濁液とし
て０．１％アジ化ナトリウムと共に４℃で貯蔵した。５０マイクロリットルのこ
のような懸濁液を、０．０５％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、３ｍＭのＭｇＣｌ２ およびプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液Ａで１０倍に希釈した細胞溶解物４．５
ｍｌに加えた。
【００５３】
４℃で一夜インキュベートした後、樹脂を、この緩衝液で５回洗浄し、最後に
ＳＤＳ ＰＡＧＥのために還元試料緩衝液５０μｌ中で加熱した。試料を、４〜
２０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル(NOVEX)上で分離し、クマシーで染色し
たか、またはイモビロン(Immobilon)Ｐ膜(Amersham Corp., Arlington Hts, IL)
に移送した。膜を、ＴＢＳ、５％非脂肪温和粉末で遮断し、ストレプトアビジン
ペルオキシダーゼ(VECTASTAIN)または特異的な抗体で染色した。結合したペルオ
キシダーゼを、増強化学ルミネセンスキット(Amersham)で検出した。
ＳＤＳ ＰＡＧＥのために還元試料緩衝液５０μｌ中で加熱した。試料を、４〜
２０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル(NOVEX)上で分離し、クマシーで染色し
たか、またはイモビロン(Immobilon)Ｐ膜(Amersham Corp., Arlington Hts, IL)
に移送した。膜を、ＴＢＳ、５％非脂肪温和粉末で遮断し、ストレプトアビジン
ペルオキシダーゼ(VECTASTAIN)または特異的な抗体で染色した。結合したペルオ
キシダーゼを、増強化学ルミネセンスキット(Amersham)で検出した。
【００５４】例６ 精製したタリンおよびフィラミンへの結合
ヒト子宮フィラミン（ＡＢＰ−２８０）を、０．６Ｍ ＫＣｌ、０．５ｍＭ
ＡＴＰ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５に溶解した１
．５ｍｇ／ｍｌ溶液として調製した。例５に記載したように結合アッセイを実施
するために、この溶液を、緩衝液Ａ、０．０５％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、
３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤（例５参照）
で１／１２に希釈し、５０ｍＭ ＮａＣｌを省略し（例５参照）、結合したモデ
ルタンパク質を含む樹脂を加えた。ＢＳＡを含まず、さらに５０ｍＭ ＫＣｌを
含むこの緩衝液において、洗浄を実施した。
ＡＴＰ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５に溶解した１
．５ｍｇ／ｍｌ溶液として調製した。例５に記載したように結合アッセイを実施
するために、この溶液を、緩衝液Ａ、０．０５％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、
３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤（例５参照）
で１／１２に希釈し、５０ｍＭ ＮａＣｌを省略し（例５参照）、結合したモデ
ルタンパク質を含む樹脂を加えた。ＢＳＡを含まず、さらに５０ｍＭ ＫＣｌを
含むこの緩衝液において、洗浄を実施した。
【００５５】
タリンを、リンセルロース上のクロマトグラフィーを用いる追加の精製工程を
有する十分知られている手順に従って、ヒト血小板から精製し、１ｍｇ／ｍｌに
おいて、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５０％グリセロール中に貯蔵した。この溶液を、
緩衝液Ａ、０．０５％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍｇ
／ｍｌ ＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害剤（例５参照、０．１ｍＭ Ｅ−６４を
含む）で、８７または１７μｇ／ｍｌのタリンに希釈し、細胞溶解物での結合ア
ッセイにおいて示したように、加工した。デンシトメトリー分析のために、クマ
シー染色ゲルの走査を、プログラムＮＩＨ−イメージ(NIH, Bethesda, MD)を用
いて加工した。ゲルの等しい負荷を、樹脂からリガンドと同時溶出した組換え細
胞質ドメインポリペプチドのクマシー染色したゲルにおいて、制御した。
有する十分知られている手順に従って、ヒト血小板から精製し、１ｍｇ／ｍｌに
おいて、１０ｍＭ ＮａＣｌ、５０％グリセロール中に貯蔵した。この溶液を、
緩衝液Ａ、０．０５％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍｇ
／ｍｌ ＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害剤（例５参照、０．１ｍＭ Ｅ−６４を
含む）で、８７または１７μｇ／ｍｌのタリンに希釈し、細胞溶解物での結合ア
ッセイにおいて示したように、加工した。デンシトメトリー分析のために、クマ
シー染色ゲルの走査を、プログラムＮＩＨ−イメージ(NIH, Bethesda, MD)を用
いて加工した。ゲルの等しい負荷を、樹脂からリガンドと同時溶出した組換え細
胞質ドメインポリペプチドのクマシー染色したゲルにおいて、制御した。
【００５６】例７ キメラ形成
αＩＩｂα４およびαＩＩｂα４＊Ｙ９９１Ａ）キメラを、ヒトαＩＩｂ細胞
外および膜貫通ドメインをヒトα４またはα４（Ｙ９９１Ａ）細胞質ドメインに
接続することにより、形成した。β３β１Ａまたはβ３β７キメラを、ヒトβ３
細胞外および膜貫通ドメインをヒトβ１Ａまたはβ７細胞質ドメインに接続する
ことにより、形成した。αＩＩｂα４β３β１Ａ、αＩＩｂα４（Ｙ９９１Ａ）
β３β１Ａを安定に発現するＣＨＯ細胞またはこれらのキメラを発現する細胞系
を、Hughes et al., Cell 88, 521-530 (1997)により記載されたように、トラン
スフェクトし、単離した。パキシリンヌルおよび同腹整合野生型胚からの一次マ
ウス胚線維芽細胞を、標準的な方法、例えばThomas et al., Nature 376 (6537)
, 267-71 (1995)により記載された方法により、単離した。
外および膜貫通ドメインをヒトα４またはα４（Ｙ９９１Ａ）細胞質ドメインに
接続することにより、形成した。β３β１Ａまたはβ３β７キメラを、ヒトβ３
細胞外および膜貫通ドメインをヒトβ１Ａまたはβ７細胞質ドメインに接続する
ことにより、形成した。αＩＩｂα４β３β１Ａ、αＩＩｂα４（Ｙ９９１Ａ）
β３β１Ａを安定に発現するＣＨＯ細胞またはこれらのキメラを発現する細胞系
を、Hughes et al., Cell 88, 521-530 (1997)により記載されたように、トラン
スフェクトし、単離した。パキシリンヌルおよび同腹整合野生型胚からの一次マ
ウス胚線維芽細胞を、標準的な方法、例えばThomas et al., Nature 376 (6537)
, 267-71 (1995)により記載された方法により、単離した。
【００５７】例８ 免疫沈殿およびウエスタンブロット分析
ジャーカットＴ細胞またはＣＨＯ細胞を、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン(Pierce)
で、製造者の指示に従って細胞表面標識した。細胞溶解物を調製し、免疫沈殿を
、Chen et al., Blood 84, 1857-1865 (1994)により記載されたように実施した
。沈殿した細胞表面ビオチン標識ポリペプチドを、非還元条件下で分離し、スト
レプトアビジンペルオキシダーゼ、続いてＥＣＬ(Amersham)で検出した。同時沈
殿したパキシリンの検出のための免疫沈殿を、細胞をビオチンで表面標識しなか
った以外は前述のようにして実施し；免疫沈殿したタンパク質を、還元条件下で
分離し、パキシリン同時沈殿を、ビオチンで標識した抗パキシリンで検出した。
α４β１のパキシリンとの同時沈殿のために、表面ビオチン標識したジャーカッ
ト細胞溶解物を、パキシリン、α４、α５または無関連ＩｇＧに反応性の抗体と
共に沈殿した。
で、製造者の指示に従って細胞表面標識した。細胞溶解物を調製し、免疫沈殿を
、Chen et al., Blood 84, 1857-1865 (1994)により記載されたように実施した
。沈殿した細胞表面ビオチン標識ポリペプチドを、非還元条件下で分離し、スト
レプトアビジンペルオキシダーゼ、続いてＥＣＬ(Amersham)で検出した。同時沈
殿したパキシリンの検出のための免疫沈殿を、細胞をビオチンで表面標識しなか
った以外は前述のようにして実施し；免疫沈殿したタンパク質を、還元条件下で
分離し、パキシリン同時沈殿を、ビオチンで標識した抗パキシリンで検出した。
α４β１のパキシリンとの同時沈殿のために、表面ビオチン標識したジャーカッ
ト細胞溶解物を、パキシリン、α４、α５または無関連ＩｇＧに反応性の抗体と
共に沈殿した。
【００５８】
免疫沈殿物を、非還元条件下で６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、表面ポリペ
プチドを、ストレプトアビジンペルオキシダーゼおよびＥＣＬで検出した。パキ
シリン欠乏アッセイのために、細胞表面ビオチニル化ジャーカットＴ細胞溶解物
のアリコートに、変化する回数の免疫沈殿を、抗パキシリン抗体または無関連Ｉ
ｇＧを用いて施した。細胞溶解物中のパキシリン欠乏の程度を、ウエスタンブロ
ット分析により評価した。パキシリンが欠乏した、または欠乏していない、およ
び無関連ＩｇＧ沈殿を有する細胞溶解物を、次に抗α４またはα５抗体のいずれ
かで免疫沈殿した。表面タンパク質の免疫沈殿物を、非還元条件下で６％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ上で分離し、ポリペプチドを、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ
およびＥＣＬで検出した。
プチドを、ストレプトアビジンペルオキシダーゼおよびＥＣＬで検出した。パキ
シリン欠乏アッセイのために、細胞表面ビオチニル化ジャーカットＴ細胞溶解物
のアリコートに、変化する回数の免疫沈殿を、抗パキシリン抗体または無関連Ｉ
ｇＧを用いて施した。細胞溶解物中のパキシリン欠乏の程度を、ウエスタンブロ
ット分析により評価した。パキシリンが欠乏した、または欠乏していない、およ
び無関連ＩｇＧ沈殿を有する細胞溶解物を、次に抗α４またはα５抗体のいずれ
かで免疫沈殿した。表面タンパク質の免疫沈殿物を、非還元条件下で６％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ上で分離し、ポリペプチドを、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ
およびＥＣＬで検出した。
【００５９】例９ 細胞付着および拡散アッセイ
異なるＣＨＯ細胞系についての細胞接着およびフィブリノーゲンまたはフィブ
ロネクチン上での拡散のアッセイを、Ylanne et al., J. Cell Biol. 122, 223-
233 (1993)により記載された手順に従って実施した。マウス線維芽細胞の細胞拡
散アッセイのために、パキシリンノックアウトおよび野生型細胞を、レトロウイ
ルス感染を用いてヒトα４インテグリンサブユニットでトランスフェクトした。
トランスフェクションの４８時間後に、野生型およびノックアウト細胞における
α４インテグリンの等しい発現を、ＦＡＣＳにより抗α４抗体を用いて観察した
。ＤＭＥＭと１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中に再懸濁させた細胞を、１０μｇ／ｍｌの
ＶＣＡＭ−１(Biogen Inc. Cambridge MA)またはフィブロネクチン(Sigma Chemi
cal Co.)のいずれかで被覆したカバーグラス上にまき、３７℃で１時間インキュ
ベートした。付着していない細胞を、ＰＢＳで洗浄除去した。付着した細胞を、
３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、相顕微鏡検査法により試験した。写真
画像を、センシス(Sensys)冷却ＣＣＤビデオカメラを備えたニコンダイアフォト
顕微鏡で撮影した。
ロネクチン上での拡散のアッセイを、Ylanne et al., J. Cell Biol. 122, 223-
233 (1993)により記載された手順に従って実施した。マウス線維芽細胞の細胞拡
散アッセイのために、パキシリンノックアウトおよび野生型細胞を、レトロウイ
ルス感染を用いてヒトα４インテグリンサブユニットでトランスフェクトした。
トランスフェクションの４８時間後に、野生型およびノックアウト細胞における
α４インテグリンの等しい発現を、ＦＡＣＳにより抗α４抗体を用いて観察した
。ＤＭＥＭと１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中に再懸濁させた細胞を、１０μｇ／ｍｌの
ＶＣＡＭ−１(Biogen Inc. Cambridge MA)またはフィブロネクチン(Sigma Chemi
cal Co.)のいずれかで被覆したカバーグラス上にまき、３７℃で１時間インキュ
ベートした。付着していない細胞を、ＰＢＳで洗浄除去した。付着した細胞を、
３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、相顕微鏡検査法により試験した。写真
画像を、センシス(Sensys)冷却ＣＣＤビデオカメラを備えたニコンダイアフォト
顕微鏡で撮影した。
【００６０】例１０ 組換えパキシリンの生成および結合
組換えヒトパキシリンを、Salgia et al., J. Biol. Chem. 270, 5039-5047 (
1995)により記載された手順に従って発現させ、単離した。組換えＧＳＴ−パキ
シリンまたはＧＳＴ単独のアリコートを、３００μｌの緩衝液Ａと２０μｇ／ｍ
ｌのアプロチニン、５μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＰＭＳＦ、０．１％
のトライトンＸ−１００、３ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと混
合し、モデルタンパク質負荷樹脂に加え、室温で２時間のローテーションでイン
キュベートした。結合したおよび結合していないタンパク質の両方を採集し、Ｈ
Ａ−ｔａｇまたはＧＳＴに特異性の抗体で検出した。α４尾部へのパキシリン結
合のＥＣ５０の決定のために、種々の量の組換えパキシリンを、α４またはαＩ
Ｉｂ尾部負荷樹脂に加え、結合したパキシリンを、前述のようにアッセイした。
1995)により記載された手順に従って発現させ、単離した。組換えＧＳＴ−パキ
シリンまたはＧＳＴ単独のアリコートを、３００μｌの緩衝液Ａと２０μｇ／ｍ
ｌのアプロチニン、５μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＰＭＳＦ、０．１％
のトライトンＸ−１００、３ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡと混
合し、モデルタンパク質負荷樹脂に加え、室温で２時間のローテーションでイン
キュベートした。結合したおよび結合していないタンパク質の両方を採集し、Ｈ
Ａ−ｔａｇまたはＧＳＴに特異性の抗体で検出した。α４尾部へのパキシリン結
合のＥＣ５０の決定のために、種々の量の組換えパキシリンを、α４またはαＩ
Ｉｂ尾部負荷樹脂に加え、結合したパキシリンを、前述のようにアッセイした。
【配列表】
【図１】
インテグリン細胞質ドメインの組換えモデルタンパク質のアミノ酸配列を例示
する。図１Ａは、すべての構成に共通するＮ末端（配列番号５）および７残基反
復（配列番号６）構造を示す。示す例において、これらは、Ｇ１−β１Ａ細胞質
ドメイン（配列番号７）に接続する。矢印は、７残基反復の位置ａおよびｄに対
応する疎水性残基の位置を示す。Ｇ２−、Ｇ３−およびＧ４−構造における追加
のＧｌｙ挿入の位置もまた示す。図１Ｂは、Ｂ１Ａ（配列番号８）、Ｂ１Ａ（Ｕ
７８８Ａ）（配列番号９）、Ｂ１Ｂ（配列番号１０）、Ｂ１Ｃ（配列番号１１）
、Ｂ１Ｄ（配列番号１２）およびＢ７（配列番号１３）を含む、本明細書中に記
載した実験において用いられる構成のインテグリン特異性配列を示す。すべての
インテグリンペプチドは、報告されたヒトインテグリン配列に対応する。
する。図１Ａは、すべての構成に共通するＮ末端（配列番号５）および７残基反
復（配列番号６）構造を示す。示す例において、これらは、Ｇ１−β１Ａ細胞質
ドメイン（配列番号７）に接続する。矢印は、７残基反復の位置ａおよびｄに対
応する疎水性残基の位置を示す。Ｇ２−、Ｇ３−およびＧ４−構造における追加
のＧｌｙ挿入の位置もまた示す。図１Ｂは、Ｂ１Ａ（配列番号８）、Ｂ１Ａ（Ｕ
７８８Ａ）（配列番号９）、Ｂ１Ｂ（配列番号１０）、Ｂ１Ｃ（配列番号１１）
、Ｂ１Ｄ（配列番号１２）およびＢ７（配列番号１３）を含む、本明細書中に記
載した実験において用いられる構成のインテグリン特異性配列を示す。すべての
インテグリンペプチドは、報告されたヒトインテグリン配列に対応する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 17/02
19/02 19/02
25/00 25/00
43/00 １０５ 43/00 １０５
Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00
// Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，
ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ
Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，
ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ
Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ
，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，
ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ
Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ
，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 リウ，シューチャン
アメリカ合衆国 カリフォルニア州92114、
サン ディエゴ、ポルト ド パルマ
＃215、4135
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA63 CA04 DA02
EA04 GA11
4C084 AA17 ZA02 ZA45 ZA59 ZA68
ZA89 ZA96
4H045 AA00 AA30 BA14 BA41 CA40
DA50 DA89 EA50 FA72 FA74
Claims (13)
- 【請求項１】 （ａ）膜貫通ドメインを模擬する一連の７残基反復；および （ｂ）該７残基反復に付着した、選択された細胞質ドメインを含むポリペプチド
であって、 該ポリペプチドの少なくとも一部が組換え的に製造される、前記ポリペプチド。 - 【請求項２】 選択された細胞質ドメインが、インテグリン細胞質ドメイン
である、請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項３】 インテグリン細胞質ドメインが、βまたはαインテグリンサ
ブユニットである、請求項２に記載のポリペプチド。 - 【請求項４】 さらに、７残基反復と選択された細胞質ドメインとの間に挿
入された１つまたは２つ以上のグリシン残基を含む、請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項５】 さらに、Ｃｙｓ−Ｇｌｙリンカーを介してポリペプチドの一
連の７残基反復に結合した固定化エピトープを含む、請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項６】 化学的または原核開裂部位が、固定化エピトープとＣｙｓ−
Ｇｌｙリンカーとの間に挿入されている、請求項５に記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 （ａ）膜貫通ドメインを模擬する一連の７残基反復；および （ｂ）該７残基反復に付着した、選択された細胞質ドメインを含むポリペプチド
であって、 該一連における少なくとも１つの７残基反復が、該一連における他の７残基反復
に対して異なるアミノ酸配列を有する、前記ポリペプチド。 - 【請求項８】 選択された細胞質ドメインを有する選択的に占有され、密集
した膜貫通タンパク質の構造および活性を評価するための、請求項１に記載のポ
リペプチドを含む選択された細胞質ドメインの構造モデル。 - 【請求項９】 選択された細胞質ドメインを有する選択的に占有され、密集
した膜貫通タンパク質の構造および活性を評価するための、請求項４に記載のポ
リペプチドを含む選択された細胞質ドメインの構造モデル。 - 【請求項１０】 治療的化合物の同定において用いるための、請求項１に記
載のポリペプチドを含む選択された細胞質ドメインの構造モデル。 - 【請求項１１】 ポリペプチドが、α４細胞質ドメインを含む、請求項１０
に記載の構造モデル。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載の構造モデルを、パキシリンまたはパキ
シリン関連分子と、試験剤の存在下および不存在下で接触させること；および試
験化合物の存在下および不存在下でのパキシリンまたはパキシリン関連分子の構
造モデルへの結合を決定することを含むα４インテグリン生物学的応答の阻害剤
としての剤を同定する方法であって、試験剤の不存在下での結合と比較して、試
験剤の存在下での構造モデルへのパキシリンまたはパキシリン関連分子の結合の
減少によって、試験剤がα４インテグリン生物学的応答の阻害剤であることが示
される、前記方法。 - 【請求項１３】 α４インテグリン生物学的応答を阻害するための組成物で
あって、α４インテグリンへのパキシリンまたはパキシリン関連分子の結合を阻
害する剤および薬学的に許容され得るビヒクルを含む、前記組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US32344799A | 1999-06-01 | 1999-06-01 | |
| US09/323,447 | 1999-06-01 | ||
| PCT/US2000/015153 WO2000073342A1 (en) | 1999-06-01 | 2000-06-01 | Structural models for cytoplasmic domains of transmembrane receptors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003504308A true JP2003504308A (ja) | 2003-02-04 |
Family
ID=23259240
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001500666A Ceased JP2003504308A (ja) | 1999-06-01 | 2000-06-01 | 膜貫通受容体の細胞質ドメインのための構造モデル |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1180122A4 (ja) |
| JP (1) | JP2003504308A (ja) |
| AU (1) | AU765990B2 (ja) |
| CA (1) | CA2374133A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000073342A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006112738A1 (en) * | 2005-04-19 | 2006-10-26 | Auckland Uniservices Limited | Novel peptides and methods for the treatment of inflammatory disorders |
| WO2008061563A1 (de) * | 2006-11-22 | 2008-05-29 | Aplagen Gmbh | Peptide für die behandlung der multiplen sklerose |
-
2000
- 2000-06-01 WO PCT/US2000/015153 patent/WO2000073342A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-06-01 JP JP2001500666A patent/JP2003504308A/ja not_active Ceased
- 2000-06-01 AU AU51773/00A patent/AU765990B2/en not_active Ceased
- 2000-06-01 CA CA002374133A patent/CA2374133A1/en not_active Abandoned
- 2000-06-01 EP EP00936458A patent/EP1180122A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU765990B2 (en) | 2003-10-09 |
| WO2000073342A1 (en) | 2000-12-07 |
| CA2374133A1 (en) | 2000-12-07 |
| EP1180122A4 (en) | 2003-03-26 |
| EP1180122A1 (en) | 2002-02-20 |
| AU5177300A (en) | 2000-12-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Interaction of the integrin β1 cytoplasmic domain with ICAP-1 protein | |
| Nikolopoulos et al. | Actopaxin, a new focal adhesion protein that binds paxillin LD motifs and actin and regulates cell adhesion | |
| Wegmann et al. | Endothelial adhesion molecule ESAM binds directly to the multidomain adaptor MAGI-1 and recruits it to cell contacts | |
| Gao et al. | Kindlin supports platelet integrin αIIbβ3 activation by interacting with paxillin | |
| JP3560344B2 (ja) | プロトカドヘリンタンパク質およびその使用 | |
| van der Ven et al. | Unusual splicing events result in distinct Xin isoforms that associate differentially with filamin c and Mena/VASP | |
| JPH09510609A (ja) | インテグリンの活性化の阻害剤を同定する方法 | |
| JP4282761B2 (ja) | Ｉｌ−２ｒ結合ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ分子 | |
| Bennasroune et al. | Inhibition by transmembrane peptides of chimeric insulin receptors | |
| JP2001504681A (ja) | 蛋白質相互作用の阻害 | |
| US20160084825A1 (en) | Stabilized low affinity conformation of integrins for drug discovery | |
| US5585463A (en) | β3 integrin subunit specific polypeptides, cDNAs which encode these polypeptides and method of producing these polypeptides | |
| Dye et al. | hShroom1 links a membrane bound protein to the actin cytoskeleton | |
| JP2003504308A (ja) | 膜貫通受容体の細胞質ドメインのための構造モデル | |
| SK170497A3 (en) | Cytoplasmic modulators of integrin regulation/signaling | |
| Kalinin et al. | Breaking the connection: caspase 6 disconnects intermediate filament-binding domain of periplakin from its actin-binding N-terminal region | |
| ES2255152T3 (es) | Composiciones y metodo de proteinas de activacion sinaptica. | |
| WO1997002354A1 (en) | INTERACTION OF p53 WITH TRANSCRIPTION FACTOR DP-1 | |
| US20020127624A1 (en) | INGAP displacement assays | |
| Innamorati et al. | GIP, a G-protein-coupled receptor interacting protein | |
| JPH10502252A (ja) | Ｄｐ−１及びその他のｄｐタンパク質の阻害剤のアッセイ | |
| Archila et al. | The cytoskeletal organizing protein Cdc42-interacting protein 4 associates with phosphorylase kinase in skeletal muscle | |
| JP2001078781A (ja) | 多発性骨髄腫の細胞増殖の阻害手段 | |
| US20020198360A1 (en) | Structural models for cytoplasmic domains of transmembrane receptors | |
| WO2002050249A2 (en) | Protein-protein interactions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040427 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040727 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040803 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040907 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041012 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050111 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050906 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051129 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060110 |
|
| A045 | Written measure of dismissal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A045 Effective date: 20060523 |