ES2255152T3 - Composiciones y metodo de proteinas de activacion sinaptica. - Google Patents
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Abstract
Se describen secuencias de codificación de nucleótidos y secuencias de polipéptidos para proteínas de unión de activación sin ptica, que se caracterizan por la inducción del sistema nervioso central después de la actividad neuronal en hipocampo de rata. Dichas proteínas se identifican por (i) una homología sustancial a nivel de secuencia de nucleótido o proteína con secuencias de codificación o proteínas específicamente definidas en rata, humano o ratón, (ii) la capacidad de unirse y afectar a la actividad de proteínas efectoras del SNC, tales como los receptores de glutamato metabotrópico, (iii) la especificidad de unión de una secuencia de unión particular, y (iv) la presencia en la secuencia de un dominio de tipo PDZ. Los nucleótidos y polipéptidos de la invención son útiles en ensayos de cribado y diagnóstico.
Description
Composiciones y método de proteínas de activación
sináptica.
La presente invención se refiere a una nueva
familia de proteínas activadas sinápticamente, y en particular, una
proteína que se une específicamente y altera la función de los
receptores de metabotrópicos glutamato.
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La localización espacial y el agrupamiento de
proteínas de membrana son críticos para el desarrollo neuronal y la
plasticidad sináptica. Las proteínas que interactúan con las
proteínas de la membrana celular, según se cree, afectan a la
distribución espacial de tales proteínas de membrana. Estas
interacciones pueden ser importantes en la regulación de
la(s) función(ones) de las proteínas de membrana,
tales como los receptores de neurotransmisores, que controlan la
actividad sináptica en el sistema nervioso central.
La presente invención se refiere al
descubrimiento de una nueva familia de proteínas que son ricas en el
sistema nervioso central de mamíferos y que interactúan con las
proteínas implicadas en la función sináptica.
Estas proteínas están implicadas en la función
sináptica, como se prueba por su inducción por la activación
neuronal, tales como convulsiones, estimulación, intoxicación aguda
de cocaína, trauma y otros similares. Estas proteínas son llamadas
en conjunto "proteínas de activación sináptica".
Una nueva proteína dendrítica, llamada
"Homer", ejemplifica la presente invención. Esta proteína
contiene un solo dominio de unión del tipo PDZ y se une
específicamente al extremo C de los receptores metabotrópicos de
glutamato. Los receptores metabotrópicos de glutamato liberan calcio
intracelular a la fosfolipasa C, que cataliza la hidrólisis de los
fosfoinositidos de membrana. Sin embargo, a diferencia de las que
contienen un dominio del tipo PDZ, la proteína Homer por otra parte
no se parece a las conocidas proteínas PDZ y tiene una identidad de
secuencia de menos del 10% con la proteína PDZ más parecida. Además,
la proteína Homer está regulada como un gen de actividad inmediata.
Este control dinámico transcripcional sugiere que Homer media un
nuevo mecanismo celular que regula la señalización del glutamato
metabotrópico.
Las propiedades señaladas para la proteína Homer
caracterizan a una nueva familia de proteínas, proteínas de
activación sináptica, que forman la base para la presente invención.
Como estas proteínas están implicadas en la función sináptica,
tienen utilidades particulares, por ejemplo, en los ensayos de
rastreo para los fármacos que afectan a la función sináptica y que
son, por lo tanto, activos centralmente, como se describe más
abajo.
La presente invención se refiere a una nueva
familia de proteínas que están presentes en el sistema nervioso
central de mamíferos. Estas proteínas se caracterizan
particularmente por (i) su mayor expresión en tejidos del sistema
nervioso central en mamíferos en respuesta a la activación
sináptica, y (ii) un nuevo dominio de unión del tipo PDZ.
La nueva familia de proteínas se ilustra por una
proteína de rata, llamada "Homer" (SEQ ID NO: 2). Otros
miembros de la familia tienen una secuencia que es sustancialmente
idéntica (80% o mayor identidad de secuencia) a la de la proteína de
rata, o a los miembros humanos y los de ratón de la familia. Los
miembros de la familia pueden identificarse por una
hibridaciónmoderada, PCR un cebador degenerado, u otros métodos que
detecten secuencias de nucleótido o aminoácidos que son al menos en
un 80% idénticas a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2,
respectivamente.
Las proteínas de la invención son particularmente
útiles para uso en ensayos de rastreo para fármacos centralmente
activos. Las proteínas son también componentes útiles de ensayos
diagnósticos para medir la inducción de la activación sináptica,
como puede ocurrir en respuesta a múltiples estímulos que causan la
activación sináptica. Asimismo los fragmentos de péptidos de tales
proteínas, particularmente los fragmentos peptídicos derivados del
sitio de unión entre tales proteínas y sus parejas de unión del
efector sináptico, tienen utilidad como inhibidores a largo plazo
como consecuencia de su activación sináptica anormal.
En una realización relacionada, la invención
incluye polipéptidos como los descritos anteriormente, pero que
además exhiben una capacidad de unirse selectivamente a una proteína
de membrana sináptica que tiene una región peptídica del extremo C
seleccionada del grupo que consiste en SSSL y SSTL.
En un aspecto relacionado, la invención también
incluye secuencias de nucleótidos que codifican para los miembros de
la nueva familia de la proteína descrita en este documento. En
consecuencia, las secuencias de nucleótidos que tienen una
identidad sustancial a la proteína Homer descrita que codifica
secuencias (tales como SEQ ID NO: 1), así como las propias
secuencias descritas, también están incluidas dentro de la
invención.
También forma parte de la invención vectores que
contienen las secuencias de polinucleótidos descritas anteriormente.
Tales vectores son útiles, por ejemplo, en la producción de las
proteínas reivindicadas por técnicas recombinantes.
En un aspecto relacionado, la invención también
incluye un método para seleccionar un compuesto que interfiere con
la unión de una proteína de activación sináptica en una proteína de
unión celular en el sistema nervioso central de mamíferos. El
método incluye añadir de un compuesto de ensayo a una mezcla de
reacción que contiene (i) una proteína de activación sináptica
aislada que tiene una identidad sustancial frente a uno o varios
polipéptidos que tienen una identidad de secuencia sustancial para
el polipéptido que tiene una secuencia presentada como SEQ ID NO: 2,
(ii) una proteína de unión aislada a la cual la proteína de
activación sináptica se une, y (iii) medios para detectar la unión
entre la proteína de activación sináptica y dicha proteína de
unión. La unión de la proteína de unión a la proteína de activación
sináptica se mide en presencia de un compuesto de ensayo y se
compara con la unión medida en ausencia del compuesto de ensayo. Un
compuesto de ensayo se selecciona para uso como fármaco en el centro
activo si tal comparación revela una diferencia sustancial en la
unión en estas condiciones.
En una realización particular, la proteína de
unión en el método de ensayo es un polipéptido del receptor
metabotrópico de glutamato que incluye una secuencia seleccionada
del grupo que consiste en SSSL y SSTL. En otra realización
particular, la proteína de unión es un mGluR unido a
fosfoinositidasa C. En otra realización más, mGluR se expresa en
células, y la unión entre el receptor y la proteína de unión se mide
midiendo la actividad de fosfoinositidasa C en células.
Estos y otros objetos y propiedades de la
invención se harán evidentes más totalmente cuando la siguiente
descripción detallada de la invención sea leída junto con los
dibujos que la acompañan.
La figura 1 muestra la secuencia de codificación
de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) de una proteína de
activación sináptica derivada de rata (SEQ ID NO: 1);
La figura 2 muestra la secuencia amino deducida
de rata ("Homer"; SEQ ID NO: 2), y compara las secuencias de
aminoácidos derivadas de los EST de proteínas de activación
sináptica en humanos (SEQ ID NO: 3) y en ratón (SEQ ID NO: 4);
La figura 3 muestra una imagen generada por
ordenador de una transferencia Northern de ARN total (10 \mug) a
partir de cerebro de rata (hipocampo, corteza) y otros órganos
indicados, mostrando una inducción rápida y transitoria por
convulsiones de la proteína de unión de mGluR de 6,5 kb (aprox.) en
el hipocampo y la corteza;
La figura 4 muestra una imagen generada por
ordenador de un inmunoensayo de las proteínas de unión de cadena
entera expresadas en células HEK-293 como una
proteína de 28 kDa (banda "Homer") y como un doblete de 28/29
kDa en el hipocampo de ratas estimuladas por convulsiones, como se
indica por la flecha;
La figura 5 muestra una imagen generada por
ordenador de un inmunoensayo de mGluR5 (banda de 140 kDa) expresada
en células HEK-293 (ruta 2) comparado con células
transfectadas con el vector solo (banda 1), de fracciones de elución
de una columna de afinidad GST (banda 4), y las fracciones de
elución de una columna de afinidad de GST-Homer
(banda 5), en el que ambas columnas fueron cargadas con extractos
del hipocampo (banda 3), ilustrando que la proteína Homer eluida se
une a mGluR5;
La figura 6 muestra una imagen generada por
ordenador de un inmunoensayo que muestra la inmunoprecipitación de
mGluR5 a partir de extracto de hipocampo (banda 1) por suero
preinmune (banda 2) antisuero de proteína antiHomer (banda 3), y
suero antiHomer preabsorbido (banda 4), ilustrando que la proteína
Homer y mGluR5 interactúan in vivo;
Las figuras 7A y 7B muestran las imágenes
generadas por ordenador de inmunotinción de tejido de corteza
parietal de rata usando antisuero antiHomer (7A) y antisuero
anti-mGluR5 (7B) en una amplificación 100 x;
Las figuras 7C-7F muestran la
inmunoreactividad de la proteína Homer en la corteza de ratas
adultas detectada por el control del método de la peroxidasa (C) y
4 horas después de una convulsión (D), en el que la convulsión
induce la inmunotinción y se enriquece en las neuronas piramidales
de las capas II/III y V (amp. 100x); (E) ilustrando que la
inmunoreactividad está presente a lo largo de los ejes dendríticos
(flechas) y en cuerpos celulares, pero no en el núcleo (cabeza de
flecha; amp. 600 x); las dendritas distales poseen perfiles del tipo
espina (F, amp. 1000x);
Las figuras 8A y 8B muestran una doble
localización inmunofluorescente del receptor de glutamato del tipo
AMPA, GluR1 y Homer en neuronas de cultivo primario del hipocampo
(amp. 600x); en el que las flechas indican el modelo de puntos de
tinción Homer que se colocaliza extensivamente con GluR1,
demostrando que la proteína Homer dirige la sinápsis
estimulante;
Las figuras 9 (A-E) muestran los
diez aminoácidos del extremo C de los receptores metabotrópicos de
glutamato mGluR1\alpha (9A), mGluR2 (9B; SEQ ID NO: 6), mGluR3
(9C; SEQ ID NO: 7), mGluR4 (9D; SEQ ID NO: 8), y mGluR5 (9E; SEQ ID
NO: 9);
Las figuras 10A-10D muestran las
imágenes generadas por ordenador de un inmunoensayo de unión in
vitro por la proteína Homer de receptores metabotrópicos de
glutamato mGluR1 (10A), mGluR2 (10B), mGluR3 (10C), mGluR5 y mGluR5
truncado (10D) a la proteína Homer, demostrando la unión selectiva
de la proteína Homer a mGluR1\alpha y mGluR5;
Las figuras 10E-10F muestran los
resultados del inmunoensayo de ensayos de unión in vitro
usados para examinar las estructuras de deleción de
GST-Homer para unir el extremo C de mGluR5
myc-marcado (195 aa) expresado en células
HEK-293, en el que los marcadores de banda indican
la parte de Homer expresada, en el que el inmunoensayo mostrado en
la figura 10E fue sometido a inmunoensayo para myc y demuestra la
unión de mGluR5 a la cadena entera de Homer (1-186)
y al fragmento 1-131, pero no al fragmento
109-186, y en el que la imagen mostrada en la figura
10F es tinción de Comassie de estrucuturas de deleción de Homer;
La figura 11 muestra una imagen generada por
ordenador de un inmunoensayo Northern (10 \mug de ARN total) que
muestra el aumento de mRNA de Homer post-parte en el
cerebro anterior de rata;
Las figuras 12 (A-F) muestran las
imágenes generadas por ordenador de secciones coronarias tomadas de
crías de rata criadas en la oscuridad sacrificadas en la oscuridad
(12B, 12C) o expuestas a un espacio de luz ambiental durante 30 de
la misma edad envejecidas criadas en condiciones normales diurnas
(12D, 12E) y sometidas a hibridación in situ con una sonda de
ARN antisentido radiomarcada específica para la región no traducida
3' de Homer;
La figura 13 muestra una imagen generada por
ordenador de un experimento de hibridación in situ que
demuestra el efecto de una inyección uniocular de tetrodotoxina
(TTX) en el ojo de las ratas antes del sacrificio;
La figura 14 muestra una imagen generada por
ordenador que muestra un experimento de hibridación in situ
que demuestra la inducción de mRNA de Homer en asociación con una
potentiación a largo plazo (LTP), en el que la flecha indica la
expresión inducida de ARN de Homer en células granulares del
hipocampo después de un estímulo sináptico que produjo la LTP; y
La figura 15 muestra una imagen generada por
ordenador que muestra un experimento de hibridación in situ
que demuestra la inducción en el cuerpo estriado de Homer por la
administración de cocaína (10 mg/kg) intraperitonealmente 2 horas
antes del sacrificio.
El término "polinucleótido" según se usa en
este documento se refiere a una molécula polimérica que tiene una
estructura que sustenta las bases capaces de formar puentes de
hidrógeno con polinucleótidos típicos, en el que la estructura
polimérica presenta las bases de una manera que permite tales
puentes de hidrógeno de una manera de secuencia específica entre la
molécula polimérica y un polinucleótido típico (por ejemplo, ADN
monocatenario). Tales bases son típicamente inosina, adenosina,
guanosina, citosina, uracilo y timidina. Las moléculas poliméricas
incluyen ARN y ADN monocatenario y bicatenario, y sus modificaciones
estructurales, por ejemplo, enlaces de metilfos-
fonato.
fonato.
El término "vector" se refiere a una
secuencia de nucleótidos que puede asimilar nuevos ácidos nucleicos,
y propagar las nuevas secuencias en un huésped apropiado. Los
vectores incluyen, pero no están limitados, a plásmidos
recombinantes y virus. El vector (por ejemplo, el plásmido o el
virus recombinante) que comprende el ácido nucleico de la invención
puede estar en un vehículo, por ejemplo, un plásmido complejado con
la proteína, un plásmido complejado con sistemas de transducción de
ácidos nucleicos con base lipídica, u otros sistemas de vehículos
no
virales.
virales.
El término "polipéptido" según se usa en
este documento se refiere a un compuesto hecho de una sola cadena de
residuos de aminoácidos unidos según enlaces peptídicos. El término
"proteína" puede ser sinónimo del término "polipéptido" o
puede referirse, además, a un complejo de dos o más
polipéptidos.
Según se usa en este documento, las expresiones
"homología sustancial" o "identidad sustancial", y sus
declinaciones, se refiere a la concordancia de una secuencia de
aminoácidos con otra secuencia de aminoácidos o de una secuencia de
polinucleótidos con otra secuencia de polinucleótidos de al menos
70% o preferiblemente, al menos 80%, en el que tales secuencias se
disponen en la alineación que mejor se ajuste. En el caso de
secuencias de nucleótidos, los términos o las expresiones también
implican que la secuencia de nucleótidos en cuestión es capaz de ser
detectada en un ensayo de rastreo por una sonda de hibridación
derivada de la secuencia de nucleótidos definida como SEQ ID NO: 1
(secuencia de codificación de Homer) en condiciones de severidad
moderadas. (Ausubel)
Una "alineación" se refiere a la disposición
de dos o más aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos de tal
modo que se alineen las áreas de las secuencias que comparten
propiedades comunes. El grado de similitud u homología entre las
secuencias es predicho computacionalmente o estadísticamente basado
en los pesos asignados a los elementos alineados entre las
secuencias.
El porcentaje (%) de identidad, en lo que
concierne a dos secuencias de aminoácidos, se refiere al tanto por
ciento de los residuos que son idénticos en las dos secuencias
cuando las secuencias se alinean óptimamente. La alineación óptima
se define como la alineación que da la puntuación de identidad en
porcentaje más alta. Tales alineaciones pueden ser realizadas usando
el programa "GENEWORKS". De forma alternativa, las alineaciones
pueden ser realizadas usando el programa de alineación local LALIGN
con un ktup de 1, parámetros estándar y PAM estándar. En el contexto
de la presente invención, cuando se explicita que una proteína o
ácido nucleico tiene una identidad del 80% de una secuencia dada, es
implícito que esto se refiere a la secuencia entera de la más larga
de las dos proteínas. Así, por ejemplo el producto de traducción
deducido de un EST que es idéntico a la longitud de la secuencia
completa de SEQ ID NO: 2 para la longitud del producto EST, pero
donde el producto de EST es sólo el 25% de la longitud de la
secuencia de la cadena entera, no se considera que cae dentro
de una secuencia reivindicada definida teniendo el 80% o más
identidad de secuencia de SEQ ID NO: 2.
La expresión el dominio de unión del "tipo
PDZ" se refiere a una parte de un polipéptido que contiene una o
varias repeticiones del aminoácido GLGF y, preferiblemente, un
aminoácido básico precedente, tal como una arginina,
preferiblemente, separada de GLGF por 1-10
residuos.
Según se usa en este documento, la expresión
"receptor metabotrópico de glutamato" o "mGluR" se refiere
a un sitio de unión del glutamato que se une funcionalmente a la
adenilato ciclasa (AC) o fosfoinositidasa c
(PI-PLC). Se han identificado al menos cinco
receptores neuronales metabotrópicos de glutamato: MGluR1 y mGluR5
se unen a PLC; mGluR2 y mGluR4 regulan la actividad de AC.
Según se usa en este documento, la expresión
"proteína de unión del receptor metabotrópico de glutamato" se
refiere a un polipéptido que se une a uno o varios receptores
metabotrópicos de glutamato, como se prueba por
coinmunoprecipitación de la proteína de unión y mGluR por un
anticuerpo Anti-mGluR, o por unión in vitro
comparando con una proteína de control no relevante. Una afinidad de
unión típica para esta interacción es de al menos aproximadamente
10^{-6} M.
La expresión "sistema nervioso central"
(CNS) se refiere al cerebro y a la médula espinal, incluyendo el
fluido cerebrospinal (CSF).
La expresión "variante de corte y empalme"
se refiere a una proteína que se codifica por un gen común, pero que
tiene una secuencia que se cambia debido al corte y empalme
alternativo del mRNA antes de la traducción.
Un "marcador de secuencia expresada" o EST
(siglas en inglés) es un segmento corto (típicamente
200-300 bp) derivado de una secuencia de cDNA, cuya
secuencia es única, como se prueba por la capacidad de ser
amplificada selectivamente usando cebadores específicos en una
reacción en cadena de la polimerasa. Los EST generalmente no
representan secuencias de cadena enteras.
Los residuos de aminoácidos se remiten en este
documento por sus notaciones de letras estándar únicas: A, alanina;
C, cisteína; D, ácido aspártico; E, ácido glutámico; F,
fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; L,
leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R,
arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptófano; X,
hidroxiprolina; Y, tirosina.
\newpage
Es un descubrimiento de la presente invención que
la activación de la actividad sináptica estimulante en el cerebro
causa una mayor expresión de una familia nueva de proteínas,
denominadas en este documento "proteínas de activación
sináptica", y que son ilustradas por una proteína de rata
denominada en este documento "Homer". Junto con sus variantes
de corte y empalme y sus homólogos de otras especies, esta proteína
define la nueva familia de proteínas de activación sináptica que se
unen y afectan a la actividad de cierto efectores fisiológicos (por
ejemplo, receptores, canales iónicos, proteínas de transporte,
enzimas) en el sistema nervioso central.
a. Identificación de la secuencia
codificante. Por vía del ejemplo, la proteína de rata denominada
en este documento la proteína Homer de rata fue identificada al
principio por rastreo diferencial sobre la base de su rápida
inducción de la expresión durante la actividad sináptica estimulante
en el hipocampo y la corteza. Proteínas de activación sináptica
adicionales pueden ser identificadas por este método o por los
métodos de rastreo de homología descritos en la Sección 2,
debajo.
El ejemplo 1 proporciona los detalles del método
de rastreo diferencial usado para identificar la proteína Homer de
rata. Brevemente, fue extraído Poli(A)^{+} ARN de
cerebros de animales que tenían convulsiones activas y fue usado
para preparar cDNA. Este cDNA estimulado fue hibridado hasta ARN en
exceso de los cerebros de los animales control no estimulados. El
cDNA preparado a partir del mRNA restante fue usado después para
construir una genoteca, en la que fue identificada la proteína Homer
de rata. Como se discute en este documento, esta proteína tiene
características de secuencia particulares y las propiedades de unión
que definen una familia de unión sináptica o proteínas de
activación.
En un procedimiento de rastreo diferencial, un
total de 16 clones nuevos independientes fueron identificados que
parecían tener niveles más altos en el hipocampo de rata estimulado
que en el control. El análisis Northern estándar confirmó la
expresión diferencial del mRNA. La proteína Homer de rata fue
producida como un producto de la traducción de uno de estos clones
expresados diferencialmente. El análisis Northern demostró que el
mRNA Homer era de 6,5 kilobytes de longitud. Varias cadenas enteras
de cDNAs de la proteína Homer de rata fueron identificadas
rastreando una genoteca de bacteriófago (\lambda Zap II) que fue
especialmente preparada para contener cDNAs grandes. Ambas cadenas
de dos clones independientes fueron secuenciados y fue identificado
un marco de lectura abierto (ORF) de 558 nucleótidos. El ORF fue
confirmado por análisis del tamaño del producto proteico generado
por transcripción in vitro y traducción in vitro de
mRNA preparado a partir de clones de supuestas longitud completas y
comparando esto con la proteína preparada con mRNA a partir de los
clones que carecían de metionina al principio. El ORF además fue
confirmado preparando antisuero policlonal de conejo contra una
proteína de fusión bacteriana de cadena entera Homer o contra un
péptido sintético que representa el extremo C de la proteína Homer.
Estos antisueros fueron usados para confirmar la presencia de una
proteína medida en su tamaño de manera apropiada en el cerebro que
se induce rápidamente después de convulsiones electroconvulsivas
máximas (MECS).
Se muestra la secuencia de codificación de
nucleótidos de la proteína Homer aislada a partir de cerebro de rata
en la figura 1 como SEQ ID NO: 1. La secuencia de codificación tiene
un marco de lectura abierto (ORF) de 558 nucleótidos (figura 1A; SEQ
ID NO: 1). Como se menciona anteriormente, el mRNA de 6,5 kilobytes
derivado de este ADN codifica para una proteína de 186 aminoácidos
(figura 2A; SEQ ID NO: 2). Un 3'UTR largo (Nº. de entrada del
GENBANK:: U92079) codifica múltiples repeticiones AUUUA, tal como se
han implicado en la desestabilización del mRNA de genes de actividad
inmediata (IEG, siglas en inglés). La secuencia de aminoácidos
predice una proteína soluble que contiene una secuencia sola de GLGF
y arginina precedente (figura 2), un denominado "dominio del tipo
PDZ" que es predicho por tener ciertas propiedades de unión,
basado en su caracterización en diferentes proteínas no
emparentadas, tal como PSD-95. La secuencia de la
proteína Homer es, por otra parte, nueva e imprevisible a partir de
secuencias más cortas tales como EST. Hay identidad de secuencia de
aminoácidos de menos del 10% entre los miembros de la rata de Homer
y los publicados de la familia PDZ (Doyle, et al., 1996).
Los marcadores de secuencia expresada (EST) de
humano (Z17805) y ratón (AA166092 y AA013888) fueron identificados
que eran 84% y 72% idénticos a las regiones de las secuencias que
codificaban para el ORF para la proteína Homer (figura 2; humano,
SEQ ID NO: 3 y ratón, SEQ ID NO: 4). La traducción de los EST indica
que las secuencias de aminoácidos de los EST y de ratón humano son
idénticas entre sí en su región limitada de traslapo pero los EST de
ratón son divergentes de la proteína Homer de rata en esta región,
sugiriendo que los EST son homólogos de miembros de familia
adicionales. Con base al presente descubrimiento de Homer de rata,
pueden ser ampliadas las secuencias de proteína de humano y de ratón
para incluir la secuencia de rata y/o sus sustituciones
conservadoras, como se describe en este documento. Tales secuencias
ampliadas caerán dentro de la definición de un miembro de la
familia de la proteína de activación sináptica, como se define en
este documento.
Los miembros de la familia de la proteína de
activación sináptica adicionales pueden identificarse usando un
protocolo de rastreo diferencial similar al descrito en el Ejemplo
1, junto con sondas basadas en las secuencias descritas en este
documento, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. De forma
alternativa o además, tales proteínas son identificadas por (i) la
homología sustancial en el nivel de la secuencia de nucleótidos o
proteína respecto a la secuencia de codificación de Homer de rata o
a la proteína, (ii) la capacidad de unirse y de afectar a la
actividad de proteínas efectoras en el CNS, tales como los
receptores metabotrópicos de glutamato, (iii) la especificidad de
unión para una secuencia de unión particular, y (iv) la presencia
en la secuencia del dominio tipo PDZ de Homer. Según se implica por
su expresión diferencial en el cerebro de rata estimulado, como se
discute anteriormente, y como se describe además debajo, la
expresión del gen es estimulada por la actividad sináptica
estimulante. Estos atributos de las proteínas de activación
sináptica son descritos en las secciones que siguen.
b. Identificación de homólogos de proteína de
activación sináptica. A partir de la presente descripción de las
secuencias de codificación y polipéptidos de Homer de rata, la
identificación de los miembros adicionales de la familia de
polipéptidos de Homer que tienen una homología sustancial a Homer
puede ser lograda por uno o varios métodos conocidos para las
personas expertas en la técnica que se comentan debajo.
Por ejemplo, usando sondas de nucleótidos
derivadas de SEQ ID NO: 1, los miembros de la familia son
identificados rastreando las genotecas apropiadas. En particular,
las sondas de hibridación derivadas de nt 558-nt
1127 del cDNA de longitud casi completa mencionado en la Genoteca
(Nº. de entrada: U92079) pueden ser sintetizadas con sintetizadores
de ADN disponibles en el comercio (por ejemplo, el modelo 381A de
Applied Biosystems) utilizando técnicas estándar conocidas en la
técnica (Ausubel, et al., 1992). Una genoteca particularmente
apropiada es una genoteca del CNS o cerebral, tales como las
genotecas cerebrales humanas que están disponibles en el comercio de
Stratagene (La Jolla, CA) y en InVitrogen (San Diego, CA). La sonda
es típicamente hibridada a 65ºC y lavada a 55ºC (condiciones de
severidad medias). Los clones identificados por este método son
aislados y sus secuencias de codificación son determinadas, de
acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Los clones además se
seleccionan si sus secuencias de aminoácidos deducidas incluyen en
un grado mínimo a la región del dominio tipo PDZ de Homer, como se
discute anteriormente.
Una caracterización más de clones seleccionados
se lleva a cabo por la inserción de regiones de codificación
aisladas en vectores para la expresión en un sistema de expresión
apropiado, tal como cualquiera u otros de los sistemas descritos en
el Ejemplo 3, o en otros sistemas apropiados conocidos en la
técnica. Los productos traducidos entonces son aislados, tal como
por los métodos descritos en el Ejemplo 4, y son analizados por su
capacidad de unirse a proteínas objetivo específicas en el CNS y por
la especificidad de unión para una secuencia de unión del péptido
particular, tal como la secuencia SSTL o SSSL, como se discute en la
Sección III.C., debajo.
Además, usando las secuencias de proteína
presentadas como SEQ ID NO: 2 (Homer de rata), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID
NO: 4, mostradas en las figuras 2 (A-C), como
plantillas, se aprecia que los miembros de la familia adicionales
pueden identificarse basado en (i) la variación
inter-secuencia y entre los polipéptidos y (ii) la
sustitución conservadora de aminoácidos dentro de las
secuencias.
Así, mirando la región del extremo N de los
polipéptidos mostrados en la figura 2, es evidente que los 30
primeros aminoácidos son invariantes entre las tres secuencias. Sin
embargo, las posiciones 31-34 se diferencian. La
secuencia de rata es AVTV, mientras que las proteínas de humano y de
ratón comparten la secuencia GHRF. De esta variación, es posible
construir polipéptidos en los cuales las posiciones
31-34 tienen las secuencias variables: A/G V/F T/R
V/H. Las otras regiones de variabilidad son evidentes a partir de la
inspección de las secuencias alineadas. Ciertas regiones de la
proteína Homer de rata han sido identificadas y son significativas
en el contexto de su función. Por ejemplo, la secuencia GLGF del
dominio del tipo PDZ y la arginina precedente en las posiciones
87-90 y 81, respectivamente, pueden formar "una
bolsa de unión", basada en la bolsa de unión conocida de la
proteína de unión sináptica PSD95 (Kornau, et al., 1995).
Conforme a las directrices precedentes acerca de la sustitución,
esta región es invariante entre las tres proteínas de activación
sináptica ejemplificadas y por lo tanto debería conservarse en
cualquier secuencia deducida a partir de estas proteínas.
Otra sustitución de las posiciones variables
identificadas puede hacerse haciendo sustituciones de aminoácidos
conservadoras. Es decir, si dos o más de los aminoácidos posibles en
una posición variante están en una clase de sustitución común, la
sustitución en aquella posición por un aminoácido dentro de aquella
clase puede conservar la conformación y la función del polipéptido.
Las clases de sustitución estándar que pueden usarse en este
análisis son las seis clases basadas en las propiedades de cadena
lateral comunes y la frecuencia más alta de sustitución en las
proteínas homólogas en la naturaleza, según se determina, por
ejemplo, por una matriz de intercambio de frecuencia de Dayhoff
estándar (Dayhoff, 1972). Estas clases son la Clase I: C; Clase II:
S, T, P, X, A y G que representan pequeñas cadenas laterales
alifáticas y cadenas laterales del grupo OH; Clase III: N, Q, D y
C, que representan cadenas laterales neutras y negativamente
cargadas capaces de formar enlaces de hidrógeno; Clase IV: H, R y
K, que representan cadenas laterales básicas polares; Clase V: I, V
y L, que representan cadenas laterales ramificadas alifáticas, y
Met; y Clase VI: F, Y y W, que representan cadenas laterales
aromáticas. Además, cada grupo puede incluir a análogos de
aminoácidos emparentados, tales como ornitinina, homoarginina,
N-metil-lisina,
dimetil-lisina o
tri-metil-lisina en la Clase IV, y
ciclohexilalanina o una tirosina halogenada en el Grupo VI. Además,
las clases pueden incluir tanto a los isómeros L como a los D,
aunque los L-aminoácidos son preferidos para las
sustitu-
ciones.
ciones.
Las secuencias de polipéptido diseñadas de
acuerdo con las directrices precedentes pueden ser producidas, por
ejemplo, por expresión recombinante. El ORF seleccionado se clona
como una fusión con la
glutationiona-S-transferasa (GST) y
se expresa en bacterias. De forma alternativa, el ORF puede ser
clonado en un vector de expresión de mamíferos y expresarse en
células de mamífero, de acuerdo con métodos conocidos en la
técnica.
c. Preparación de oligonucleotidos de proteína
de activación sináptica/vectores. Basado en las secuencias de
proteína reveladas por el análisis precedente, los nucleótidos que
codifican las proteínas de activación sináptica pueden ser diseñados
de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Como se discute
debajo, tal diseño puede incluir consideraciones del tipo de las
células usadas para la expresión de la proteína.
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden ser diseñadas para cambiar la secuencia que
codifica para la proteína por una variedad de motivos, incluyendo,
pero no limitado, a las alteraciones que modifican la clonación, el
procesamiento y/o la expresión del producto génico. Por ejemplo,
pueden ser introducidas alteraciones usando técnicas que son
conocidas en la técnica, por ejemplo, mutagénesis dirigida, insertar
nuevos sitios de restricción, cambiar el modelo de glicosilación,
cambiar la preferencia del codon, producir variantes de corte y
empalme, etc.
La presente invención también incluye estructuras
recombinantes que comprenden una o varias de las secuencias que se
describen de forma amplia anteriormente. Las estructuras comprenden
un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el que una
secuencia de la invención ha sido insertada, en una orientación
directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la
estructura además comprende secuencias reguladoras, incluyendo, por
ejemplo, un promotor, unido de forma operativa a la secuencia. Se
conocen muchos vectores adecuados y promotores para los expertos en
la técnica, y están disponibles en el comercio. Los vectores de
clonación apropiados y de expresión para uso con huéspedes
procariotas y eucariotas también son descritos en Sambrook, et
al., 1989.
Como se detalla en el Ejemplo 2, una estructura
de expresión de mamífero de la proteína Homer de rata de cadena
entera fue preparada clonando el fragmento 5' de EcoRI (1,6
kilobytes) en el vector de expresión de mamífero pRK5. El vector fue
usado para transfectar células eucariotas de mamífero (riñón humano
embrionario; células HEV293).
Pueden usarse vectores alternativos para la
transfección de diferentes tipos de células. Por ejemplo, para la
expresión de una proteína de fusión que contenía el polipéptido de
Homer de rata fusionado a GST, el ORF de Homer fue clonado en los
vectores bacterianos pGEX. Para la expresión en un sistema de
levadura, fue clonado el ORF de Homer en pPC86.
a. Expresión de proteínas de activación
sináptica. Pueden producirse proteínas de activación sináptica
recombinantemente por cualquiera de los métodos disponibles para la
expresión de proteínas. Por vía del ejemplo, el Ejemplo 3
proporciona los métodos que han sido usados para expresar la
proteína Homer de rata en un sistema de transcripción/traducción de
células libres.
Para la producción a gran escala, la expresión de
la proteína Homer y los homólogos del miembro de la familia de la
proteína de activación sináptica puede llevarse a cabo en cualquiera
de los sistemas de expresión celulares. Las posibles células huésped
incluyen, pero no son restringidas, a células bacterianas, de
levadura, insecto y mamífero. Puede apreciarse que la expresión en
un sistema particular puede ser optimizada adaptando los codones al
tipo de célula particular cuya expresión debe ocurrir. De ahí que
los polinucleótidos abarcados según la presente invención incluyan
los polinucleótidos que codifican para la proteína de interés, como
los modificados para la expresión óptima en cualquier sistema de
expresión dado, sin tener en cuenta la identidad de la secuencia
total en SEQ ID NO: 1. Tal diseño puede ser efectuado con la ayuda
del uso del codon o se conocen tablas de preferencia tales como las
conocidas en la técnica. Como se muestra en la figura 5, el mGluR5
fue expresado en células HEK-293 (banda 2) y fue
comparado con las células transfectadas con el vector solo (banda
1). Aquí, mGluR5 emigra como una banda principal de 140 kDa con un
50 fragmento de división secundario de presumiblemente 50 kDa. En
los extractos de hipocampo (banda 3), la banda superior (peso
molecular más alto) aparece como un doblete. En estos experimentos,
los extractos del hipocampo también fueron pasados por columnas de
gel Affigel que contenían GST o la proteína de fusión de
GST-Homer y fueron eluidos con tampón de carga SDS
(rutas 4 y 5). La inmunotransferencia positiva con el anticuerpo
anti-GluR5 demuestra la asociación de la proteína
Homer de rata con el receptor mGluR5 en el extracto.
b. Purificación de extractos celulares de
proteína Homer de rata. La proteína Homer y sus análogos pueden
purificarse a partir de extractos celulares estándar utilizando
procedimientos preparatorios. La purificación de la etapa final
puede llevarse a cabo por cualquiera de los métodos estándar,
incluyendo la purificación por inmunoafinidad en columna usando
anticuerpos preparados contra la proteína Homer o sus fragmentos,
como se describe en el Ejemplo 4.
En los experimentos llevados a cabo en apoyo de
la presente invención, se ha determinado que la expresión de
proteínas de activación sináptica está enriquecida sumamente en el
sistema nervioso central. Por ejemplo, como se demuestra en los
datos mostrados en la figura 3, el mRNA de Homer de rata fue
encontrado casi exclusivamente en el tejido nervioso central.
Además, la expresión de mRNA de Homer está
fuertemente regulada en el hipocampo por la activación neuronal
inducida por convulsiones. La expresión de mRNA máxima ocurre 1 hora
después de la convulsión en el hipocampo (figura 3). La proteína
Homer está enriquecida en los extractos de hipocampo y emigra como
un doblete con un peso molecular aparente de 28/29 kDa (figura 3)
que es inducida rápidamente por la convulsión.
El ejemplo 6 proporciona métodos ejemplares que
pueden usarse para medir los niveles de expresión de la proteína
Homer. Los modelos anatómicos y celulares de la expresión de
proteína Homer en rata fueron examinados por análisis
inmunohistoquímicos realizados en el cerebro de ratas adultas.
Compatible con su regulación como un IEG, la inmunotinción de Homer
en la corteza aumentó notablemente 4 horas después de una convulsión
(figura 4).
De acuerdo con una propiedad importante de la
presente invención, los miembros de la familia de la proteína de
activación sináptica se unen a receptores del sistema nervioso
central específicos o a parejas de unión y modifican la función de
tales proteínas. Como un ejemplo, y como se discute debajo, la
proteína Homer de rata se une a dos subtipos del receptor
metabotrópico de glutamato (mGluR) encontrado en el sistema nervioso
central mGluR1\alpha y mGluR5.
Las parejas de unión del sistema nervioso central
adicionales para las proteínas de unión de activación sináptica
específicas identificadas como se discute en la Sección II,
anteriormente, pueden identificarse usando las metodologías
descritas en la Sección A, debajo. Las Secciones B y C describen los
métodos usados para caracterizar la interacción de una proteína de
unión de activación sináptica específica con su pareja(s) de
unión celular.
Los sitios de unión de la proteína de activación
sináptica en el tejido nervioso central pueden identificarse usando
un ensayo de interacción de proteína doble híbrido (Ausubel, et
al., 1992). Este método de ensayo proporciona un medio simple y
sensible para detectar la interacción entre dos proteínas en células
vivas. Tal ensayo es descrito en el Ejemplo 5, dado que fue usado
para identificar ciertas parejas de unión funcionales para la
proteína Homer de rata. Se usaron ensayos análogos para determinar
los sitios de unión celulares de las proteínas de ratón y humanas,
y otras proteínas homólogas de acuerdo con la presente
invención.
El sistema de rastreo doble híbrido está basado
en la observación de que una interacción proteína - proteína puede
ser detectada si dos proteínas que interactúan potencialmente son
expresadas como fusiones o quimeras. Una primera proteína de fusión
contiene una de un par de proteínas que interactúan fusionadas a un
dominio de unión de ADN, y una segunda proteína de fusión contiene
el otro de un par de proteínas que interactúan fusionadas a un
dominio de activación de transcripción. Las dos proteínas de fusión
se expresan por separado en la misma célula, y la interacción entre
las partes de la "proteína que interactúa" de las fusiones
reconstituye la función del factor de activación de transcripción,
que es detectado por la activación de la transcripción de un gen
indicador. Para uso en la presente invención, la primera proteína de
fusión contiene la proteína de unión de activación sináptica. La
segunda proteína de fusión contiene una de una genoteca expresada de
proteínas específicas del sistema nervioso central, como se describe
debajo.
Hay varias configuraciones posibles del ensayo de
rastreo doble híbrido que pueden usarse en el contexto de la
presente invención (Ausubel, et al., 1992). En una de estas,
un sistema doble híbrido de GAL4 de levadura, son detectadas las
interacciones proteína - proteína, basado en la reconstitución de la
función de GAL4, un activador transcripcional de levadura, por la
activación de un gen indicador GALI-lacZ.
Como otros factores de activación de transcripción, GAL4 contiene
dos dominios distintos, un dominio de unión de ADN y un dominio de
activación de transcripción. Cada dominio puede ser expresado por
separado como una parte de una proteína de fusión compuesta del
dominio, y una segunda, proteína que interactúa con el "cebo".
Las dos proteínas de fusión entonces se expresan por separado
juntas en una célula. Cuando los dos dominios GAL4 son juntados por
una interacción de unión entre el "cebo" y las proteínas "de
unión", se inicia la transcripción de un gen indicador CON el
control transcripcional de GAL4. El gen indicador típicamente tiene
un promotor que contiene los sitios de unión de la proteína GAL4
(secuencias de activación de GAL corriente arriba, UAS_{G}). Los
genes indicadores ejemplares son los genes indicadores
GAL1-LacZ y
GAL1-HIS3.
Un segundo sistema doble híbrido, descrito
detalladamente por Ausubel, et al., (1992) utiliza a una
proteína represora LexA natural de E. coli, que se une fuertemente a
los operadores apropiados. Se usa un plásmido para expresar una de
un par de proteínas que interactúan (la proteína de "cebo", por
ejemplo, la proteína Homer) como una fusión a LexA. El plásmido que
expresa la proteína de cebo LexA-fusionada se usa
para transformar una cepa de indicador de levadura, tal como EGY48,
que contiene PSH18-34.
En esta cepa, los sitios unión para LexA se
localizan corriente arriba de dos genes indicadores. En el primer
sistema de indicador, las secuencias de activación corriente arriba
del gen cromosómico LEU2 - requerido en la ruta biosintética para la
leucina (Leu) - son sustituidas en EGY48 con operadores de lexA,
permitiendo la selección para la viabilidad cuando las células son
puestas en placas en un medio que carece de Leu. En el segundo
sistema de indicador, EGY48 acoge al plásmido,
pSH18-34, que contiene un gen de fusión
operador-lacZ de lexA, permitiendo la
discriminación basada en el color cuando la levadura se cultiva en
un medio que contiene Xgal (Ausubel, et al.,
1992).
La genoteca de LexA usa el promotor de levadura
inducible GAL1 para expresar proteínas como fusiones a un dominio
ácido ("mancha ácida") que funciona como un motivo de
activación transcripcional portátil ("acto"), y a otros restos
útiles. La expresión de proteínas codificadas por genoteca se induce
poniendo en placas los transformantes en un medio que contiene
galactosa (Gal), de modo que las células de levadura que contienen
las proteínas de la genoteca que no interactúan específicamente con
la proteína de cebo fallan al crecer en ausencia de Leu. Las células
de levadura que contienen las proteínas de la genoteca que
interactúan con las proteína de cebo forman colonias en de 2 a 5
días, y las colonias se vuelven azules cuando las células son
teñidas en un medio que contiene Xgal. Los plásmidos son
aislados y caracterizados por una serie de ensayos para confirmar
la especificidad de la interacción con la proteína de cebo inicial.
Aquellos que son específicos están listos para posteriores análisis
(por ejemplo, secuen-
ciación).
ciación).
En los experimentos llevados a cabo en apoyo de
la presente invención y los descritos en el Ejemplo 5 en este
documento, el sistema doble híbrido GAL4 de levadura fue usado para
identificar a las parejas de unión de la proteína Homer de rata en
una genoteca de cDNA del cerebro de rata (Chevray y Nathans, 1992).
Un producto de la PCR del ORF de Homer de cadena entera con sitios
SmaI flanqueantes fue subclonado en el vector de expresión
de levadura pPC97. Una genoteca de cDNA iniciada arbitraria fue
preparada a partir del hipocampo de rata adulta estimulado por
convulsión y fue clonado en el vector de expresión de levadura
pPC86. La genoteca contiene 2 x 10^{6} cDNAs independientes. Un
total de 1,5 x 10^{6} clones fueron rastreados. Las proteínas que
interaccionan fueron identificadas por la selección en placas que
carecían de leucina, triptófano e histidina, fueron teñidas de
nuevo y se confirmaron usando un ensayo de
\beta-galactosidasa.
Uno de los cDNA que interactúan identificado en
este ensayo codifica para los 195 aminoácidos del extremo C de
mGluR5. Esta región de mGLuR5 es citosólica y está implicada en la
señalización mediada por fosfolipasa (PLC) C en neuronas. La
confirmación y otras caracterizaciones de unión fueron llevadas a
cabo como se describe en la Sección B, debajo.
Conforme al descubrimiento de la presente
invención, las proteínas de activación sináptica se unen a
componentes celulares, tales como los identificados de acuerdo con
los métodos descritos en la Sección A, anterior. Después de la
determinación del candidato pareja de unión celular, la proteína de
activación sináptica además puede ser analizada para unir al
candidato en uno o varios de los ensayos de unión in vitro
como los descritos debajo.
Por ejemplo, la proteína de fusión de GST- Homer
expresada bacterianamente fue analizada para unir al mGluR5 natural
en los extractos detergentes de hipocampo en un ensayo de unión
in vitro como se detalla en el Ejemplo 7A. Como se muestra
en la figura 5, mGluR5 se une a la proteína de fusión de
GST-Homer, pero no a GST solo.
Otro método de evaluar la unión in vitro
es proporcionado por un ensayo de
co-inmunoprecipitación, en el cual un anticuerpo
dirigido a una de las proteínas se usa para evaluar si las dos
proteínas forman un complejo de unión en la solución. La figura 6
muestra los resultados de ensayos que analizan la
co-inmunoprecipitación de mGluR5 con Homer a partir
de hipocampo de acuerdo con métodos detallados en el Ejemplo 7B. En
este caso, los extractos de hipocampo fueron inmunoprecipitados con
suero preinmune, suero antiHomer o con suero antiHomer pretratato
con GST-Homer. Como se muestra, mGluR5
co-inmunoprecipita con el antisuero Homer, pero no
con el suero preinmune. Además, la
co-inmunoprecipitación fue bloqueada por la
preadsorción de antisuero con antígeno Homer (ruta 4), indicando la
especificidad del antisuero para la proteína Homer de rata.
El potencial para la interacción natural entre la
proteína de activación sináptica y la pareja de unión del candidato
además puede ser evaluado in situ y por inmunotinción de las
secciones de tejido cerebral con anticuerpos dirigidos a cada una de
las proteínas. El objetivo de este análisis es establecer que ambas
proteínas son expresadas en las mismas regiones de la célula. Por
ejemplo, las figuras 7A y 7B muestran la inmunotinción de la
proteína Homer de rata con antisuero antiHomer (7A) y la
inmunotinción de mGluR5 con anticuerpos antimGluR5 (7B) en la
corteza parietal de rata adulta. De estos experimentos se observa
que la inmunotinción de mGluR5 y Homer están ambas enriquecidas en
dendritas apicales de neuronas piramidales de la Capa V. Estos datos
proporcionan un soporte anatómico para la interacción in vivo
entre la proteína Homer y mGluR5.
El modelo anatómico y temporal de la
inmunotinción de Homer son análogos, con precisión, en la expresión
de mRNA, como se discute en la Sección IV, debajo. Las neuronas
piramidales de las capas corticales II/III y V mostraron una
inmunotinción más intensa que típicamente rellenaba el soma y que se
extendió en las dendritas apicales en un modelo punteado a lo largo
del perímetro de la dendrita (figura 7C). Perfiles del tipo espina
fueron vistos con frecuencia en las dendritas distales (figura 7D).
La inmunoreactividad de Homer no estaba presente en el núcleo. El
modelo punteado de inmunotinción de Homer fue confirmado en cultivos
primarios de neuronas del hipocampo (figuras 8A, 8B). Además, el
hecho de que Homer estaba extensivamente
co-localizada con inmunotinción para el receptor de
glutamato GluR1 indicó que Homer estaba enriquecida en la sinápsis
estimulante. El modelo anatómico de expresión de Homer coincide
estrechamente con las publicaciones respecto a la inmunoreactividad
de mGluR5. La inmunoreactividad de MGluR5 está enriquecida en las
dendritas de neuronas piramidales corticales, así como en muchas
otras poblaciones neuronales que expresan a Homer, y está presente
en la sinápsis estimulante. La co-distribución
extensa de proteína Homer y mGluR5 en dendritas de neuronas
piramidales y en la sinápsis estimulante, junto con la asombrosa
especificidad de su interacción física, apoya la noción de que estas
proteínas son parejas fisiológicas. La proteína Homer de rata
también se expresa sumamente en células de Purkinje del cerebelo.
Estas células expresan fuertemente mGluR1\alpha, sugiriendo una
complementaridad fisiológica entre los dos tipos de proteína en
estas neuronas.
Los estudios descritos anteriormente en lo que
concierne a la proteína Homer de rata son ilustrativos de los tipos
de experimentos a los que pueden someterse los miembros de la
familia de la proteína de activación sináptica candidatos, para
verificar la inclusión en la familia. En la identificación de la
proteína pareja de unión particular a la que la proteína de
activación sináptica se une, los ensayos funcionales apropiados se
establecen para determinar si tal unión interfiere o realza la
función biológica de la proteína de pareja de unión. Por ejemplo,
en el caso de la proteína Homer de rata, se sabe que mGluR1 y mGluR5
se acoplan con fosfolipasa C y regulan la hidrólisis de
fosfoinositida vía fosfoinositidasa C (PI-PLC),
mientras que mGluR2 y 4 regulan negativamente la adenilato ciclasa
(Nakanishi, 1994; Pin y Duvoisin, 1995). Por lo tanto, para
determinar además si la proteína Homer de rata interfiere o realza
esta actividad funcional, se establece un ensayo para monitorizar la
actividad de PI-PLC dependiente de MGluR en ausencia
o presencia de proteína Homer de rata añadida.
De acuerdo con una propiedad más de la presente
invención, se ha encontrado que los miembros de la familia de la
proteína de activación sináptica, ilustrado por la proteína Homer de
rata, se unen a secuencias peptidicas específicas. Tal especificidad
de la secuencia puede ser dictada por el dominio PDZ, o por otros
dominios presentes en la proteína de activación sináptica.
En los estudios llevados a cabo en apoyo de la
presente invención, la especificidad de la interacción entre la
proteína Homer de rata y los receptores metabotrópicos de glutamato
mGluR5 y mGluR1\alpha fue examinada usando ensayos de unión in
vitro.
Los receptores metabotrópicos de glutamato
únicamente poseen largas colas del extremo C citoplásmicas que son
67% idénticas en los 55 últimos aminoácidos y que terminan en
secuencias similares; -RDYTQSSSSL y -RDYKQSSSTL, respectivamente
(figuras 9A-9E). Para medir la interacción de unión,
fueron expresados mGluR5 y mGluR1\alpha en células
HEK-293. Los extractos de célula fueron mezclados
con GST-Homer unido por perlas y después fueron
eluidos con tampón de carga SDS. Ambos mGluR1\alpha y mGluR5 de
cadena entera expresados transitoriamente se unen a la proteína de
fusión de Homer de rata, como se muestra en los figuras 10A y 10D.
Cuando se deleccionaron los 4 aminoácidos del extremo C de mGluR5,
la unión de mGluR5 a Homer fue reducida en más del 70% (FIG. 10D,
rutas 3 y 4). La comparación de las secuencias del extremo C de
otros receptores metabotrópicos de glutamato indica que los
receptores de mGluR2 y mGluR3 comparten un extremo
C-TSSL (figura 8), aunque divergen de mGluR1\alpha
y mGluR5 fuera de esta región. Ni mGluR2 ni mGluR4 se unen a la
proteína Homer (figuras 10B, 10C). Una proteína no emparentada
conocida por poseer el extremo C-TSSL (RSK1) también
fue analizada respecto a la unión, pero esta proteína no se unió a
Homer. Basado en estos datos, se cree que los 4 aminoácidos finales
son importantes, pero no suficientes para la unión.
Los datos precedentes indican que la proteína
Homer interactúa específicamente con los receptores metabotrópicos
de glutamato unidos a PI-PLC, y que la especificidad
de la unión está determinada, al menos en parte, por los 4
aminoácidos del extremo C de estos receptores. Los sitios de unión
específicos para proteínas de activación sináptica adicionales
pueden tener secuencias de aminoácidos similares o divergentes que
pueden ser determinadas empíricamente, usando métodos similares a
los discutidos anteriormente.
El efecto de las mutaciones de delección de la
proteína Homer en su unión a mGluR5 fue examinado midiendo la unión
de la proteína de fusión de Homer-GST de cadena
entera al fragmento de 195 aa del extremo C
myc-marcado de mGluR5 expresado a partir de células
HEK-293. Asimismo, las estructuras de delección que
carecen de los 55 aminoácidos del extremo C también se unieron a
mGluR5. En contraste, la delección de los 108 aminoácidos del
extremo N de la proteína Homer, que incluye la secuencia GLGF,
suprimió la unión a mGluR5. Estas observaciones indican un papel
para la región GLGF en la unión a la secuencia del extremo C de
mGluR5.
Es un descubrimiento de la presente invención que
las proteínas de activación sináptica que pertenecen a la familia
ejemplificada por la proteína Homer de rata pueden ser reguladas
dinámicamente por la actividad neuronal, incluyendo la actividad por
convulsión y la administración aguda de cocaína, como se discute
anteriormente. Además, los experimentos llevados a cabo en apoyo de
la presente invención muestran que la proteína Homer de rata se
regula en el desarrollo con la expresión máxima en el cerebro
anterior de rata de la tercera a la quinta semana después del parto
(figura 11). Durante este período de expresión máxima del
desarrollo, se induce notablemente el mRNA de la proteína Homer en
la corteza cerebral de ratas criadas en la oscuridad a los 30
minutos de la primera experiencia visual (figuras
12A-12F). Además, la privación monocular, por el
bloqueo de la actividad retinal con tetrodotoxina, causa una
reducción rápida del mRNA de Homer en la corteza visual
contralateral (figura 13). Estas observaciones indican que la
expresión en el desarrollo de la proteína de activación sináptica
Homer está regulada en la corteza por actividad sináptica natural.
Se espera que los miembros adicionales de la familia de la proteína
de activación sináptica pueden compartir estas características de
expresión u otras muy similares.
En el adulto, se induce rápidamente mRNA de Homer
en el hipocampo de ratas despiertas por estímulos sinápticos
dependientes de NMDA que inducen la potentiación a largo plazo
(figura 14). La inducción más prominente ocurre en neuronas de
células granulares del hipocampo y es similar en magnitud a la
inducción por convulsión. También se induce rápidamente la proteína
Homer en el cuerpo estriado por la administración de cocaína (figura
15) sugiriendo una regulación debido a mecanismos del receptor de
dopamina. Estos estudios indican que, a diferencia de otras
proteínas PDZ conocidas, la proteína Homer se regula rápidamente por
múltiples formas de actividad neuronal fisiológica.
Las múltiples nuevas propiedades de la proteína
Homer de rata sugieren un papel importante en la plasticidad
sináptica glutamatérgica para Homer y su análogo humano.
Las composiciones de polinucleótido y polipéptido
que forman una parte de la presente invención tienen utilidad como
componentes principales de ensayos diagnósticos y ensayos de rastreo
para identificar fármacos capaces de realzar o inhibir la
interacción entre proteínas de activación sináptica y sus sitios de
unión celulares. Los ejemplos específicos de tales ensayos y cómo
pueden ser éstos usados son proporcionados en las secciones que
siguen.
Las proteínas de activación sináptica descritas
en este documento pueden ser usadas en los ensayos de rastreo para
identificar los compuestos que interfieren o modulan la unión de la
proteína Homer frente a mGluR5 o mGluR1\alpha, y de ahí con la
actividad de mGluR unido a PI. Conforme a la presente invención, los
compuestos identificados por este ensayo de rastreo pueden ser
usados como fármacos para tratar la epilepsia, el desarrollo
cerebral anormal, daño neuronal, trauma y ciertas adicciones
químicas.
Se conocen protocolos de ensayo para medir la
interacción proteína - proteína en la técnica. Por ejemplo, la
proteína de activación sináptica purificada puede ser revestida en
una fase sólida, tal como una placa de microtítulo, seguido por el
bloqueo de los sitios de unión de la placa abiertos, de acuerdo con
métodos estándar. Después se añade mGluR a la placa en ausencia o
presencia de un compuesto de ensayo. La detección de mGluR unido a
la proteína de activación sináptica se logra por el marcaje directo
de mGluR o por la adición subsecuente de un reactivo de unión
específico de mGluR marcado, tal como un anticuerpo. El reactivo de
unión puede ser radiomarcado, por ejemplo, con ^{125}I, o puede
marcarse con un tinte fluorescente, una enzima capaz de generar una
señal (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante), oro o biotina de
acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica (Howard, 1993). La
detección de la unión entonces se lleva a cabo usando métodos
apropiados para la señal generada. Un compuesto de ensayo se
selecciona para el desarrollo del fármaco si altera suficientemente
la unión entre las proteínas.
En consecuencia, los polinucleótidos que forman
parte de la presente invención pueden ser usados en la producción a
gran escala de proteínas de activación sináptica para los ensayos de
rastreo descritos anteriormente.
Usando la interacción entre la forma de rata o
humana de la proteína Homer de activación sináptica con mGluR5 por
ejemplo, puede hacerse un kit de análisis de un ensayo diagnóstico
para medir la inducción de la proteína de activación sináptica. Debe
ser apreciado que la inducción de la proteína de activación
sináptica puede servir como una medida de la activación cerebral,
tal como la actividad convulsiva en el tejido nervioso central. En
este punto, la medida de los niveles de proteína de activación
sináptica puede servir como un indicador del nivel de actividad
convulsiva y/o daño neuronal consiguiente a tal actividad. Tal
medida también puede servir como un indicador del nivel de
intoxicación agudo de cocaína (c.f., Sección IV,
anterior).
Los kits diagnósticos para medir los niveles de
proteína de activación sináptica pueden tomar la forma de un
radioinmunoensayo, en el que los niveles de proteína de la muestra
son medidos por el desplazamiento de la proteína control marcada de
un anticuerpo específico. De forma alternativa, los niveles de
proteína pueden ser medidos en un ensayo del tipo ELISA, en el que
un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo específico de la
proteína de activación sináptica es unido a la fase sólida. La
muestra de ensayo entonces es añadida, seguido por el anticuerpo
monoclonal detectable, dirigido a un epítopo diferente de la
proteína de activación sináptica. La señal detectable es
proporcional a la cantidad de proteína de activación sináptica
presente en la muestra.
Los ejemplos siguientes ilustran, pero de ninguna
manera limitan, la presente invención.
La superinducción de lEB en el hipocampo fue
alcanzada pretratando ratas con cicloheximida y 15 minutos más tarde
administrando repetidamente ataques máximos electroconvulsivos
(MECS), con un total de 12 MECS en un período de tiempo de 3
horas.
El ARN total fue aislado del hipocampo de ratas
tratadas con MECS y cicloheximida. Poli(A)^{+} ARN
fue seleccionado por cromatografía de columna con oligo dT. El ARN
entonces fue convertido a cDNA utilizando un iniciador de oligo
dT/XhoI y fue clonado direccionalmente en \lambda Zap II
(Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con el protocolo del
fabricante. La complejidad de esta genoteca fue - 2 x 10^{6}
clones independientes. Esta genoteca familiar estimulada entonces
fue usada para preparar una genoteca sustraída enriquecida para
genes inducidos en el hipocampo después de la convulsión. La
genoteca estimulada fue puesta en placas en una densidad de 50000
pfu/placa (40 placas totales) y fue preparado el ADN del
bacteriófago. Este ADN fue linealizado en el extremo 3' del injerto
de cDNA usando Xhol y luego fue usado como plantilla en
presencia de T3 ARN Polimerasa para sintetizar cantidades grandes de
cRNA in vitro. Para eliminar las transcripciones incompletas
y las secuencias del vector, Poli(A)^{+} cRNA fue
aislado del cRNA por cromatografía de columna con oligo dT. El cRNA
fue convertido a cDNA utilizando un iniciador oligo dT/Xhol
y la transcriptasa inversa de SUPERSCRIPT (Gibco BRL, Ground Island,
Nueva York). La plantilla de ARN fue eliminada por desnaturación
baja seguido de cromatografía de columna en "SEPHADEX
G-50" (Pharmacia, Piscataway, NJ) y este cDNA fue
restado frente a Poli(A)^{+} ARN aislado de cerebro
de rata normal adulta. Para la substracción del
Poli(A)^{+} ARN "conductor" cerebral fue
biotinilado usando biotina de "PHOTOPROBE" (brazo largo)
(Laboratorios Vector, Inc., Burlingame, CA). Para la primera ronda
de substracción fue hibridado un exceso de 20 veces ARN de cerebro
de conductor biotinilado (200 \mug) con el cDNA estimulado (10
\mug) durante 48 horas a 68ºC. Los híbridos de cDNA/bioRNA no
diferenciales fueron eliminados por la adición de estreptavidina
(Laboratorios Vector, Inc., Burlingame, CA) seguido de la
extracción con fenol y el cDNA monocatenario fue recuperado en la
fase acuosa. La primera ronda de substracción eliminó el 80% del
cDNA inicial y el cDNA restante monocatenario fue hibridado durante
48 horas adicionales a 68ºC con un exceso de 100 veces de ARN de
hígado de conductor biotinilado (200 \mug). Esta segunda ronda de
substracción eliminó un 16% adicional del cDNA inicial estimulado.
El material restante fue fraccionado por tamaños por cromatografía
de columna en "SEPHADEX G-50" (Pharmacia,
Piscataway, NJ) para eliminar los cDNA degradados y pequeños. El
cDNA restado monocatenario "estimulado" fue convertido a
bicatenario utilizando "SEQUENASE" ADN Polimerasa (USB) y el
iniciador SK (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la digestión con
EcoRI y Xhol, y el fraccionamiento por tamaños por
cromatografía de columna, el cDNA restado fue clonado
direccionalmente en \lambda ZAPII (subtraído/MECS y
cicloheximida/hipocampo). La complejidad de esta genoteca de cDNA
restada era de \sim5 x 10^{6} clones independientes. Esta
genoteca de bacteriófago entonces fue puesta en placas a una
densidad de \sim1000 bacteriófagos/placa de 15 cm y fueron
obtenidos los brotes de replicado. Los brotes fueron entonces
hibridados con cDNA radiomarcado con ^{32}P-dCTP
preparado a partir de Poli(A)^{+} ARN de hipocampo
de ratas control sin tratamiento o de ratas que recibieron el
estímulo MECS/cicloheximida. El cDNA monocatenario fue preparado
usando "SUPERSCRIPT" de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Después de la desnaturación de base de la plantilla de
ARN el cDNA fue radiomarcado con una actividad específica de 4 x
10^{9} cpm/\mug por el método de cebadura aleatorio. Los filtros
fueron hibridados durante 2 días a 65°C con una sonda de cDNA
restada y luego se lavaron con 0,5X SSC/0,2%SDS a 65°C y se
expusieron a la película de rayos X a -80°C con rastreo
intensificador.
Una estructura de expresión de mamífero de Homer
de cadena entera fue preparada clonando los fragmentos 5' de
EcoRI (1,6 kilobytes) en pRK5 (Genentech, South San
Francisco, CA), de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica
(Ausubel).
La proteína Homer fue expresada en células de
riñón embrionario humano (IDEK293). El vector de expresión eucariota
de Homer (sRK5 Homer) fue transfectado en células
HEK-293 por el método del precipitado con fosfato de
calcio estándar. Las células fueron cultivadas 24-48
horas después de la transfección.
La proteína Homer ha sido expresada usando varias
estrategias. Primero fue expresada Homer a partir del cDNA clonado
en pBSKS- (Stratagene, La Jolla, CA) usando T3 polimerasa y
transcripción in vitro y el método de traducción de acuerdo
con las instrucciones del fabricante (Promega Biotech, Madison, WI).
Esta técnica fue usada para evaluar el tamaño de Homer (Homer
emigra en SDS-PAGE con una masa molecular aparente
de 28 kDa), confirmando el tamaño predicho por el ORF. Este método
también puede ser usado para preparar la proteína Homer para otros
usos descritos en este documento.
Las proteínas de fusión bacterianas de Homer
fueron preparadas clonando el ORF en pTrkHis (InVitrogen, San Diego,
CA) y pGEX (Pharmacia, Piscataway, NJ). Las proteínas de fusión
fueron expresadas en bacterias y fueron purificadas en una columna
de afinidad apropiada de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes.
Homer fue expresada en células eucariotas
(células humanas embrionarias de riñón, Colección de Cultivo
Americana, Rockville, MD) clonando el fragmento de restricción de 2
kilobytes de EcoRI que incluía el ORF en el vector pRK5
(Genentech, South San Francisco, CA), de acuerdo con los
procedimientos estándar conocidos en la técnica. El vector de
expresión eucariota (pRK4 Homer) fue transfectado en células
HEK-293 por los métodos de precipitado con fosfato
de calcio estándar. Las células fueron cultivadas
24-48 horas después de la transfección. Las
proteínas aisladas a partir de estas células fueron usadas en los
ensayos de unión y para confirmar el tamaño de la proteína
natural.
Homer también fue expresada en levadura. El ORF
fue clonado en pPC86 (Chevray y Nathans, 1992) y fue usado para
rastrear las proteínas que interactúan con Homer. Este rastreo
primero determinó que Homer interactúa con el receptor metabotrópico
de glutamato del tipo 5.
Anticuerpos monoclonales son acoplados a perlas
de proteína A o G (dependiendo del isotipo de Ig) (disponible en el
comercio de Pharmacia, Piscataway, NJ) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y los complejos de perla son recogidos
en una columna de inmunoafinidad. Los extractos de células enteras
limpias se preabsorben a perlas de agarosa, se pasan por la columna
de inmunoafinidad, se lavan con varios volúmenes de tampón de
lavado, entonces la proteína de interés se eluye de la columna
usando una condición tampón predeterminada. Comúnmente, altas
condiciones salinas son usadas para tal elución.
De forma alternativa, los anticuerpos pueden ser
unidos directamente a un reactivo en fase sólida de cromatografía,
tal como "SEPHAROSE 4B-200" (Pharmacia,
Piscataway, NJ) de acuerdo con métodos conocidos en la técnica
(Garvey, et al., 1977).
El ORF de Homer de cadena entera con sitios SmaI
flanqueantes fue subclonado en el vector de expresión de levadura
pPC97. Una genoteca de cDNA cebado aleatorio fue preparada a partir
de hipocampo de rata adulta estimulada con convulsión y fue clonado
en el vector de expresión de levadura pPC86. La genoteca contiene 6
x 10^{6} cDNA independientes y un total de 1,5 x 10^{6} fueron
rastreados. Las proteínas que interaccionaban fueron identificadas
por la selección de colonia en placas que carecían de leucina,
triptófano e histidina y fue confirmada usando un ensayo de
\beta-galactosidasa (Ausubel, et al.,
1992). De forma alternativa, puede ser usado un sistema de detección
disponible en el comercio de 2 híbridos para detectar interacciones
proteína - proteína, por ejemplo, "HYBRID HUNTER" (InVitrogen,
San Diego, CA).
El antisuero policlonal de conejo para los
receptores de mGluR fue generado contra péptidos del extremo C;
mGluR1 como se discute antes, mGluR2/3 (Chemicon Internacional
Inc.), mGluR4 (Wyeth Ayerst Investigación, Princeton, NJ), y mGluR5
contra un péptido de 21 aa del extremo C. El antisuero policlonal de
conejo antiHomer fue generado usando el ORF de Homer de cadena
entera como una fusión de GST o un péptido de 18 aa del extremo C.
Ambos antisueros detectaron una proteína de 28 kDa cuando Homer fue
expresado en células HEK293 y una proteína de doblete de 28/29 kDa
inducible por convulsión en el hipocampo.
Mezclas de proteína fueron separadas por
SDS-PAGE de acuerdo con métodos estándar. Después de
la electrofóresis el gel fue lavado extensivamente, y las proteínas
entonces fueron transferidas a nitrocelulosa de acuerdo con métodos
conocidos en la técnica (Ausubel, et al., 1992). Entonces fue
incubada la nitrocelulosa con antisuero policlonal
Anti-mGluR5 de conejo policlonal diluido de acuerdo
con criterios de detección predeterminados. La tinción fue lavada,
luego fue incubada con antisuero de anticonejo radiomarcado o unido
por enzima. Los geles secados fueron sometidos a
autoradiografía.
Fue preparado un extracto de hipocampo sonicando
a partir del hipocampo de ratas de 21 días (3 x 10 segundos) en PBS
y 1% de Triton con inhibidores de proteasa, centrifugando durante 10
minutos a 15.000 g, y prelimpiando con perlas de CL4B de sefarosa
(Pharmacia, Piscataway, NJ). Las columnas de afinidad de Homer
fueron preparadas por entrecruzamiento irreversible de proteína de
fusión de GST de Homer a perlas de agarosa de Affigel (1 mg de
proteína Homer por 1 ml del volumen de lecho; Laboratorios BioRad,
Richmond, CA). 40 ml de perlas entonces fueron incubadas con un
extracto de hipocampo durante una hora a 4ºC, fueron lavadas tres
veces con PBS, y el mGluR5 unido fue eluido hirviendo en 3 x tampón
de carga.
Para los experimentos que examinan la
especificidad de la unión de Homer a los receptores metabotrópicos
de glutamato, fueron transfectadas células HEK-293
transitoriamente con estructuras de expresión de mGluR1\alpha,
mGluR2, mGluR4 o mGluR5, fue raspado en PBS + 1% de Triton X100,
fueron sonicadas 2 x 10 segundos, centrifugadas a 15.000 g durante
10 minutos a 4ºC y pre-aclaradas. El extracto de la
mitad de una placa de 10 cm fue incubado con 50 \mul de perlas
unidas a 250 ng de proteína y se lavó como antes. Las muestras
fueron analizadas por análisis Western blot usando el anticuerpo
policlonal de mGluR apropiado. Las estructuras de delección de Homer
fueron preparadas por PCR y fueron clonadas como estructuras de
fusión con GST en pGEX (Pharmacia, Piscataway, NJ).
Fue preparado extracto de hipocampo como antes.
El suero de conejo antiHomer o el suero preinmune fueron unidos
irreversiblemente a perlas de agarosa "AFFIGEL" (Laboratorios
BioRad, Richmond, CA) y se lavaron extensivamente con PBS. Fueron
incubadas perlas de 50 \mul con extracto de un hipocampo de la
noche a la mañana a 4ºC, fueron lavadas 2x con PBS con 1% de Triton
y 2x con PBS, fueron resuspendidas en 3x tampón de carga SDS y
fueron analizadas por electrofóresis de gel y análisis Western
blot. En los experimentos de control, la coinmunoprecipitación de
mGluR5 fue bloqueada preincubando las perlas unidas de antiHomer con
50 \mug de proteína de fusión GST Homer durante 1 hora a 4ºC.
Fueron anestesiadas ratas de seis semanas y
fueron perfundidas con paraformaldehído del 4%. Los cerebros enteros
fueron eliminados y colocados en fijador durante una hora y luego en
sacarosa del 30% durante 72 horas. Fueron cortadas secciones de 35
\mum usando un micrótomo de cortes, fueron bloqueadas y
permeabilizadas durante una hora en 1% de leche en polvo y 5% de
suero de cabra normal en PBS con 0,1% de Triton. Las secciones
fueron incubadas en anticuerpo primario durante 24 horas, fueron
lavadas y fue realizada tinción con inmunoperoxidasa con el kit ABC
de Vectastain Elite (Laboratorios Vector, Inc., Burlingame, CA). La
eliminación del primario o la preadsorción de Homer o antisuero de
mGluR5 con los péptidos inmunogénicos bloqueó completamente la
tinción. Los cultivos primarios del hipocampo fueron preparados a
partir de crías de rata de 4 días después del parto. La tinción con
GluR1 fue realizada usando el fragmento de FAB Cy3 marcado de un
anticuerpo generado contra el péptido sintético correspondiente a
los aminoácidos 251-269. Las células fueron fijadas
en paraformaldehído del 4% durante 1 h, fueron permeabilizadas con
0,1% de Triton y fueron incubadas con antisuero antiHomer de
afinidad purificado a 4ºC de noche. Homer fue detectado por el
anticuerpo de anticonejo de cabra acoplado a FITC (Laboratorios
Vector, Inc., Burlingame, CA).
Se anestesian ratones Balb/c por inyección
pentobarbital. Después del afeitado de la piel de la zona esplénica,
la zona se limpia con etanol del 70% y se reviste con una gasa
estéril impregnada de solución salina estéril isotónica. Una
incisión cutánea de aproximadamente 1 cm en longitud se hace en la
línea izquierda mediocapsular, seguido por la incisión de la vía
abdominal y el peritoneo. Usando fórceps, un disco de nitrocelulosa,
escindido de una mancha de nitrocelulosa de un gel que contiene la
proteína Homer separada, se inserta en el bazo por la escisión y se
mueve con cuidado distalmente hacia el extremo caudal hasta que el
disco sea encajado completamente en el tejido esplénico. De forma
alternativa, la proteína extraída se inyecta intraplenicalmente en
un volumen de menos de 5 microlitros, o intraperitoneal, de acuerdo
con métodos estándar. El bazo se observa para asegurarse de que no
sangra excesivamente, y se devuelve a la cavidad peritoneal. La
pared abdominal y la piel se suturan separadamente con
4-0 suturas interrumpidas de seda. De ocho a diez
días más tarde los ratones son desangrados y el suero se analiza
para obtener el título del anticuerpo contra las proteínas
emparejadas por el peso molecular fraccionadas por electrofóresis
preparatoria con SDS (Western blot). Si el título del anticuerpo es
bajo, el procedimiento se repite.
Entonces, un anticuerpo que produce hibridoma se
produce usando protocolos estándar. Por ejemplo, células de mieloma
p3 x 63-Ag8.653 que provienen de ratones Balb/c
(mieloma no secretante, resistentes a 8-azaguanina,
HPRT) se fusionan de acuerdo con el protocolo de fusión estándar de
PEG4000 (Merck, Filadelfia, PA) con esplenocitos inmunizados en una
relación de mieloma:linfocito de 10:1 y las células se colocan en
microplacas en un medio que contiene HAT, y 10% de medio
condicionado a partir de línea de macrófago de murina J774. 1
pulsada con LPS.
Polipéptidos relevantes separados en
SDS-PAGE preparatoria y eluidos a partir de ahí son
usados para comprobar la especificidad de los anticuerpos
monoclonales generados. Por lo general, el eluato que contiene de 30
a 80 \mug/ml de proteína parcialmente purificada se aplica a los
pocillos del microtítulo y se incuban, por ejemplo, durante 2 horas
a 37ºC seguido por 2 horas a 4ºC. Después del lavado, el
sobrenadante de cada pocillo de hibridoma se añade y se incuba
durante 1 hora a 4ºC, luego se lava varias veces con PBS. El
"segundo" anticuerpo de inmunoglobulina de
cabra-anti-ratón fluorinado se
añade, luego se lava, y la unión se controla por fluorometría.
Los clones de hibridoma positivos se amplian, se
clonan de nuevo, y se inyectan en ratones Balb/c tratados con
pristano para la producción a gran escala del anticuerpo (ascitis).
El anticuerpo del fluido de ascitis se purifica en columnas de
proteína A o G (de acuerdo con el isotipo de Ig).
La Homer de rata purificada se diluye en un
tampón de dilución estándar de revestimiento, tal como solución
salina tamponada de fosfato (PBS) y se reviste en una fase sólida,
tal como una placa de microtítulo, seguido por el bloqueo de los
sitios de unión de la placa abiertos con una proteína no emparentada
tal como albúmina de suero bovino o caseína, de acuerdo con métodos
estándar. mGluR entonces se añade a la placa en ausencia o presencia
de un compuesto de ensayo. La detección de mGluR unido a la proteína
de activación sináptica se logra por marcaje directo del mGluR o
por adición subsecuente de un reactivo de unión marcado, específico
a MGluR, tal como un anticuerpo monoclonal o policlonal específico
para mGluR. Un compuesto de ensayo se selecciona para el desarrollo
del fármaco si éste altera considerablemente la unión entre las
proteínas.
<110> The Johns Hopkins University
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composiciones y método de proteínas
de activación sináptica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D 2451 EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US98/04983
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1998-03-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 558
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)... (558)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Eucariota
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-terminal del
receptor metabotrópico del glutamato,
mGluR1-alfa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Asp Tyr Lys Gln Ser Ser Ser Thr
Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Eucariota
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-terminal del
receptor metabotrópico del glutamato, mGluR2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Val Asp Ser Thr Thr Ser Ser
Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Eucariota
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-terminal del
receptor metabotrópico del glutamato, mGluR3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Leu Asp Ser Thr Thr Ser Ser
Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Eucariota
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-terminal del
receptor metabotrópico del glutamato, mGluR4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Tyr Val Thr Tyr Thr Asn His Ala
Ile}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Eucariota
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-terminal del
receptor metabotrópico del glutamato, mGluR5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Asp Tyr Thr Gln Ser Ser Ser Ser
Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Eucariota
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de unión peptídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Thr Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Eucariota
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de unión peptídica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Ser Leu}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> posiciones 31-34 de
SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Thr Val}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)... (0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> posiciones 31-34 de
SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly His Arg Phe}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> dominio similar a PDZ
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Gly Phe}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido de unión al
C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ser Ser Leu}
Claims (13)
1. Un polipéptido, caracterizado por (i)
expresión enriquecida durante la actividad sináptica en el cerebro
de mamíferos, (ii) la presencia de un dominio de unión tipo PDZ, y
(iii) una secuencia que es al menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 2.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, que
además exhibe una capacidad de unirse selectivamente a una proteína
de membrana sináptica que tiene una región peptídica del extremo C
seleccionada del grupo que consiste en SSSL y SSTL.
3. El polipéptido de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicha identidad de secuencia es de al
menos aproximadamente el 90%.
4. El polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polipéptido tiene la
secuencia SEQ ID NO: 2.
5. Un polinucleótido capaz de codificar un
polipéptido como el expuesto en cualquiera de las reivindicaciones 1
a 4.
6. Un vector que contiene un polinucleótido como
se define según la reivindicación 5.
7. El vector de la reivindicación 6, en el que
dicho polinucleótido tiene la secuencia SEQ ID NO: 1.
8. Un método para seleccionar un compuesto que
interfiere con la unión de una proteína de activación sináptica a
una proteína de unión celular en el sistema nervioso central de
mamíferos, que comprende:
- (a)
- añadir un compuesto de ensayo a una mezcla de reacción que contiene: (i) una proteína de activación sináptica definida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, (ii) una proteína de unión a la cual dicha proteína de activación sináptica se une, y (iii) un medio para detectar la unión entre dicha proteína de activación sináptica y dicha proteína de unión;
- (b)
- medir la unión entre dicha proteína de activación sináptica y dicha proteína de unión,
- (c)
- seleccionar dicho compuesto si la unión medida es mayor o menor que la unión medida en ausencia de dicho compuesto de ensayo.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
dicha proteína de unión es un receptor metabotrópico de glutamato
que incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
SSSL y SSTL.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
dicha proteína de unión de mGluR se expresa en células, y dicha
unión entre dicho receptor y dicha proteína de unión se mide
midiendo la actividad de fosfoinositidasa C (PI-PLC)
en dichas células.
11. Un kit que comprende un polipéptido de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un polinucleótido de la
reivindicación 5 o un vector de la reivindicación 7.
12. El kit de la reivindicación 11 que es un kit
de diagnóstico.
13. El uso de un kit de las reivindicaciones 11 ó
12 para medir los niveles de la proteína de activación sináptica o
para identificar fármacos capaces de realzar o inhibir la
interacción entre proteínas de activación sináptica y sus sitios de
unión celulares.
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