SE526919C2 - Nukleinsyra (IIP) som kodar för en IGF-1 receptorbindande polypeptid samt användning därav i en metod för detektion av proliferationspotentialen hos en cancercell eller för att identifiera föreningar som inhiberar interaktionen mellan IIP-1 och IGF-1R - Google Patents

Description

525 919 2 tumörcellinjer och kan leda till tumörbildning i djurmodeller. Överexpressíon av human IGF-1R resulterade i ligandberoende förankrings-oberoende tillväxt av NIH 3T3 eller rått- 1 -fihroblaster och innkulering av dessa celler orsakade en snabb tu- mörbildning hos nakna möss (Kaleko et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 464-473; Pra- ger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 ( 1994) 2181-2185). Transgena möss som överuttrycker IGF-II specifikt i bröstkörteln utvecklar bröstadenokarcinom (Bates et al., Br. J. Cancer 72 (1995) 1189-1193) och transgena möss som överuttrycker IGF- Il under kontroll av en mer allmän promotor utvecklar ett förhöjt antal och brett spektrum av tumörtyper (Rogler et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 13779-13784). Ett exempel bland många för humana tumörer som överuttrycker IGF-I eller IGF-II vid mycket hög frekvens (>80°/0) är smàcelliga lungkarcinom (Quinn et al., J. Biol.

Chem. 271 (1996) 11477-11483). Signalering genom IGF-systemet förefaller också att krävas för den transformerande aktiviteten hos vissa onkogener. Fetala fibrob- laster med ett avbrott på IGF-IR-genen kan inte transfonneras av SV40 T-antigenet, aktiverad Ha-ras, en kombination av båda (Sell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 1 1217-11221; Sell et al., Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 3604-3612) och också E5- proteinet från bovint papilomvirus är inte heller längre transformerande (Morrione et al., J. Virol. 69 ( 1995) 5300-5303). lnterferens med IGF/IGF- lR-systemet visade sig också reversera den transformerade fenotypen och inhibera tumörtillväxt (Tro- jan et al., Science 259 (1993) 94-97; Kalebic et al., Cancer Res. 54 ( 1994) 5531- 5534; Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2182-2185; Resnicofi' et al., Cancer Res. 54 (1994) 2218-2222; Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 4848- 4850; Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469). Exempelvis utvecklade möss injicerade med adenokarcinomceller från råttprostata (PA-III) transfekterade med IGF-IR antisense-cDNA (729 bp) tumörer som var 90% mindre än kontroller eller förblev tumörfria efter 60 dagars observation (Burfeind et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 93 (1996) 7263-7268). IGF-lR-medierat skydd mot apoptos år oberoende av de-novo-genexpression och proteinsyntes. Således utövar IGF-1 sarmolikt dess anti-apoptotiska funktion via aktivering av förformade cytosoliska mediatorer.

Vissa signaleringssubstrat som binder till IGF- lR (tex.IRS-1, SHC, p85 PIS-kinas _ etc., för detaljer se nedan) har beskrivits. Emellertid är inga av dessa omvandlare unika för IGF- IR och skulle således kunna vara exklusivt ansvariga för de unika biologiska sârdragen hos IGF-IR jämfört med den andra tyrosirlkinasreceptorn in- 526 919 3 nefattande insulinreceptorn. Detta indikerar att specifika mål för IGF-1R (eller åt- minstone IGF-receptor subfarniljen) skulle kunna föreligga som påverkar överlevnad och motverkar apoptos och således är huvudsakliga farmaceutiska mål för anti- cancerterapi.

Med användning av jäst två-hybridsystemet visade det sig att p85, den regulator-is- ka domänen hos fosfatidylinositol-S-kinas (Pl3K) interagerar med IGF- lR (Lamothe, B., et al., FEBS Lett. 373 (1995) 51-55; Tartare-Decker, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 10 19- 1024). Emellertid förefaller bindning av p85 också att förekommai många andra tyrosinlcinasreceptorer från så gott som alla familjer. En annan bind- ningspartner för IGF- lR som definieras genom två-hybridscreening är SHC som också binder till andra tyrosinkinaser såsom trk, met, EGF-R och insulinreceptorn (Tartare-Deckert, S., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 23456-23460). Insulinrecep- torsubstrat l (IRS-1) och ínsulinreceptorsubstrat 2 (IRS-2) befanns också interagera både med IGF-1R såväl som insulinreceptorn (Tartare-Deckert, S., et al., J. Biol.

Chem. 270 (1995) 23456-23460; He, W., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 1 1641- 11645; Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641). Grb 10 som interage- rar med IGF-IR delar också många tyrosirikinaser som bindningspartner, t.ex. met, ínsulinreceptor, ldt och abl (Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641; Morrione, A., et al., Cancer Res. 56 ( 1996) 3165-3167). Fosfatas PTPlD (syp) visar också en mycket kraftig bindningsförmåga, dvs. binder till IGF- lR, ínsulinreceptor, met och andra (Rocchi, S., et al., Endocrinologyv 137 (1996) 4944-4952). Mer nyligen har mSH2-B och har beskrivits som bindare av IGF-lR, men interaktion ses också med andra tyrosinkinaser, t.ex. mSH2-B binder också till ret och insulinreceptorn (Wang, J. och Riedel, H., J. Biol. Chem. 273 (1998) 3136-3139). Sarnmantaget re- presenterar de hittills beskrivna IGF- lR bindningsproteinema relativt ospecifika mål för terapeutiska tillvägagångssätt eller år i fallet med insulinreceptorsubstraten (IRS-1, IRS-2) oumbärliga för insulíndrivna aktiviteter.

Det är ett syfte för uppfinningen att tillhandahålla nya gener som kodar för bind- ningsproteiner till IGF-1R såväl som de motsvarande polypeptiderna som är grun- den för ny cancerterapi baserad på modulering (företrädesvis, ínhibition) av interak- tionen mellan IGF-1R och IIP:er enligt uppfirmingen. 526 919 4 Uppfinningen innefattar företrädesvis en nukleinsyra som kodar för ett protein som binder till IGF- 1-receptor (IIP-10) vald från gruppen innefattande a) nukleinsyrorna som visas i Sekv. 1D nr. 5 eller en nukleinsyrasekvens som är komplementår därtill, b) nukleinsyror som hybridiserar under stringenta betingelser med en av nukle- insyroma från a) som kodar för en poly-peptid som visar att åtminstone 75% homologi med polypeptiden enligt Sekv. ID nr. 6 eller c) sekvenser som på grund av den genetiska kodens degenererade natur kodar för IIP-10-polypeptider som har aminosyrasekvensen enligt polypeptiderna som kodas av sekvenserna enligt a) och b). cDNA för IIP- 10 kodar för ett nytt protein av 226 aminosyror med en beräknad mo- lekylvikt på 25 697. IIP-10 är ett lysinrikt protein (1 1%). IIP-10 innehåller ett N- glykosyleringsstâlle, flera N-myristoyleringsstållen, Ck2 och PKC fosforyleringsstål- len, ett tyrosinkinasfosforyleringsställe och en förmodad nukleâr lokaliseringssignal (Fig. 5). cDNA-sekvensen av IIP-10 visar 65% homologi med cDNA-sekvensen från Gallus Gallus tymocytprotein cthy28kD (EMBL åtkomstnr. GG34350). Aminosyra- sekvenserna för IIP-10 och cthy28kD visar 70% identitet. Nt 383 till nt 584 av IIP- 10 cDNA är 94% identiska med ett partiellt cDNA beskrivet i WO 95/ 14772 (human gensignatur I-lUMGSO627 1; åtkomstnr. T24253). Genom immunofluorescens visar flagrnärkt IIP- 10 både en cytoplasmisk och en nukleâr lokalisation i NlH3T3-celler som överuttrycker lGF-l-receptornflidare visade jäst två-hybridanalys att IIP- 10 interagerar på fosforyleringsberoende sätt med IGF- 1-receptom. IIP- 10 interagerar inte med insulinreceptorn. Deletionsanalys av IIP-10 visade att aminosyra 19 till aminosyra 226 år tillräckliga för bindning till IGF-l-receptorn.

"Interaktion eller bindning mellan IIP- 10 och IGF-1-receptorn" avser en specifik bindning av llP- IO-polypeptiden till IGF- l-receptorn men inte till kontrollproteiner såsom lamin i jäst två-hybridsystemet. Specifik bindning till IGF- l-receptom kan demonstreras med användning av glutation-S-transferas (GST)-IIP-fusionsproteiner som uttrycks i bakterier och IGF-l-receptorer som uttrycks i däggdjursceller. Vida- re kan en association mellan ett Flag-märkt IIP- IO-fusionsprotein (jfr. Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176) och IGF-l-receptorn övervakas i dâggdjurscellsy- 526 919 5 stem. För detta ändamål används eukaryota expressionsvektorer för att transfekte- ra respektive cDNAl Interaktion mellan proteinerna visualiseras genom sam- immuro recipitaionsexperiment eller subcellulåra lokalisationsstudíer med an- P vändning av anti-Flag eller anti-IGF-l-receptorantikroppar.

Vidare tillhandahåller uppfinningen prover och primrar för generna enligt uppfin- ningen såväl som nukleinsyror som kodar för antigena determinanter av genpro- dukterna enligt uppfinningen. Följaktligen innefattar föredragna utíöringsformer nukleinsyror med företrädesvis 10 till 50, eller mer föredraget 10 till 20 konsekutiva nukleotider av de beskrivna sekvensema.

Termen "nukleinsyra" avser en polynukleotid som exempelvis kan vara ett DNA, RNA eller derivatiserat aktivt DNA eller RNA. DNA och mRNA-molekyler föredras emellertid.

Termen "hybridiserar under stringenta betingelser" avser att två nukleinsyrafrag- ment har förmåga till hybridisering med varandra under standarclhybridiseringsbe- tingelser som beskrivs i Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.

Närmare bestämt avser "stringenta betingelser" som används här hybridisering i 5,0 x SSC, 5 x Denhardt, 7% SDS, 0,5 M fosfatbuffert pH 7,0, 10% dextransulfat och 100 pg/ ml laxsperma-DNA vid cirka 50-68°C, följt av två tvåttsteg med 1 x SSC vid 68°C. Vidare kan temperaturen i tvâttsteget ökas från låga stringensbetingelser vid rumstemperaturer, cirka 22°C, till höga stringensbetingelser vid cirka 68°C.

Vidare innefattar uppfinningen rekombinanta expressionsvektorer som år lämpliga för expression av IIP- 10, rekombinanta vârdceller transfekterade med sådana ex- pressionsvektorer, såväl som ett förfarande för rekombinant produktion av ett pro- tein som kodas av IIP- IO-genen.

Uppfirrningen innefattar dessutom syntetiska och rekombinanta polypeptider som kodas av nukleinsyrorna enligt uppfinningen och företrädesvis kodas av DNA- sekvensen som visas i Sekv. ID nr. 5 såväl som peptídomimetika baserade därpå. 526 919 6 Sådana peptidomimetika har en hög affinitet för cellrnembraner och tas snabbt och enkelt upp av cellerna. Peptidomimetika är företrädesvis föreningar som härstam- mar från peptider och proteiner och erhålls genom strukturell modifikation med användning av icke-naturliga aminosyror, konformationsbegränsningar, isosterisk placering, cyklisering etc. De är företrädesvis baserade pä 24 eller färre, företrädes- vis 20 eller färre, aminosyror, varvid en bas av cirka 12 aminosyror föredras i synnerhet.

Polypeptiderna och peptidomimetika kan definieras genom deras motsvarande DNA-sekvenser och genom arninosyrasekvenserna härledda därur. Den isolerade IIP-polypeptiden kan förekomma i naturliga allela variationer som skiljer sig från individ till individ. Sådana variationer av aminosyrorna år vanligen aminosyrasub- stitutioner. Emellertid kan de också vara deletioner, insättningar eller additioner av aminosyror till den totala sekvensen som leder till biologiskt aktiva fragment. IIP- proteinet enligt uppfinningen - beroende, både med hänsyn till graden och typen, på cellen och celltypen i vilken det uttrycks - kan vara i glykosylerad eller icke- glykosylerad form. Polypeptider med tumorisid och/ eller metastatisk aktivitet kan enkelt identifieras genom en tumörprogressionsinhibitions-analys med användning av karcinomceller som uttrycker polypeptider och mätning av proliferationskapaci- teten och apoptos i förhållande till karcinomceller som inte uttrycker nämnda poly- peptider.

"Polypeptid med lIP- 10-aktivitet eller IIP- 10" avser därför proteiner med mindre aminosyravariationer men med väsentligen samma aktivitet som IIP- 10. Väsentligen samma avser att aktiviteterna har samma biologiska egenskaper och polypeptider- na visar åtminstone 75% homologi (identitet) i aminosyrasekvenser med IIP-10. Mer föredraget är aminosyrasekvensema åtminstone 90% identiska. Homologi enligt uppfinningen kan bestämmas med hjälp av dataprogrammen Gap eller BestFit (University of Wisconsin; Needleman och Wunsch, J. Biol. Chem. 48 (1970) 443- 453; Smith och Waterman, Adv. Appl. Math 2 (1981) 482-489).

Andra IIP:er enligt, och som används av, uppfinningen är i syrmerhet: 526 919 IIP-1 Ett cDNA som kodar för ett IGF- l-receptorinteragerande protein som betecknades IIP-l (Sekv. ID nr. 1) isolerades. cDNA för IIP-1 kodar för ett nytt protein av 333 aminosyror med en beräknad molekylvikt av 35 727. IIP-1 är ett glycinrikt protein (13%). IIP-1 innehåller flera N-myristoyleringsstållen, PKC och Ck2-fosforylerings- ställen och två förmodade nukleära lokalisationssignaler. En andra i isoform, IIP-1 (p26), av 236 aminosyrors längd med en beräknad molekylvikt av 26 071 identifie- rades som förmodligen bildades genom alternativ splitsning (Fig. 3). Båda isoformer binder till IGF- 1 -receptom. cDNA-sekvenser för llP- 1 har rapporterats tidigare (Databas EMBL nr. AF0898 18 och AF061263; DeVries, L,, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12340- 12345). Två överlappande cDNA-kloner (Fig. 4) identifierades som visar hög homo- logi med humant TlP-2 partiellt cDNA (GenBank åtkomstnr. AF028824) (Rousset, R., et al., Oncogene 16 (1998) 643-654) och betecknades IIP-la och IIP-lb. IIP- la- cDNA:t motsvarar nt l17 till 751 av TIP-2. IIP-lb-cDNA:t visar förutom TIP-2- sekvenser (nt 1 till 106) ytterligare 5'-sekvenser som år homologa med sekvens Y2H35 av WO 97/27296 (nt 25 till 158).

IIP-la och IIP-lb har båda sekvensen som kodar för PDZ-domånen av TIP-2 (nt 156 till 410) som år en känd protein-proteininteraktionsdomän (Ponting, C.P. et al., BioEssays 19 (1997) 469-479). Genom deletionsanalys bestämdes PDZ-domänen som den essentiella och tillräckliga IGF- 1-receptorbindande domänen av IlP-l (Fig. 4). ' Ytterligare jäst två-hybridanalys visar att bindningen av IIP- l-proteinet till IGF- 1- receptorn är specifik för denna tyrosinldnasreceptor. Ingen interaktion sågs till in- sulinreceptorn eller Ros. Tyrosinkinasreceptorer av andra familjer interagerade inte med IIP-1 (Lex. Met, Ret, Kit, Fms, Neu, EGF-receptor). Således är IIP-1 sannolikt det första ínteraktionsproteinet som visats vara specifikt för IGF-1- tyrosinkinasreceptorn. IIP-1 binder också till den kinasinaktiva mutanten av IGF- 1- receptom. 526 919' IIP-2 IIP-2 identifierades som en ny bindare av den cytoplasmatiska delen IGF- l- receptorn som motsvarar human APS (EMBL åtkomstnr. HSAB520). APS har tidiga- re isolerats i en jäst två-hybridscreen med användning av den onkogena c-kit- kinasdomänen som bete (Yokouchi, M., et al., Oncogene 15 (1998) 7-15). IIP-2 in- teragerar med IGF-l-receptorn på ett kinasberoende sâtt. Bindning av IIP-2 obser- verades också till andra medlemmar av insulinreceptorfarriiljen (insulinreceptor, Ros) men inte till en orelaterad tyrosinkinasreceptor (Met). Regionen av IIP-2 som befanns interagera med IGF- I-receptom motsvarar human APS (nt 1126 till 1674, EMBL åtkomstnr. AB000520) innehåller SH2-domânen av APS (nt 1249 till 1545).

IIP-S IIP-3 isolerades som ett nytt IGF- l-receptorinteragerande protein och är identiskt med PSM (GenBank åtkomstnr. AFO20526). PSM är känd som ett PH och SH2- domân innehållande signaltransduktionsprotein som binder till den aktiverade in- suliiïreceptom (Riedel, H., et al., J. Biochem. 122 (1997) 1 105-1 1 13). En variant av PSM har också beskrivits (Riedel, H., et al., J. Biochem. 122 (1997) 1105-1113).

Bindning av IIP-3 till IGF-1-receptom år beroende på tyrosylfosforylering av recep- tørn.

En cDNA-klon som motsvarar nt 1862 till 2184 av den varianta formen av PSM identifierades. Den isolerade cDNA-klonen visade sig koda för IGF- 1- receptorbindningsregionen. SH2-domânen av PSM (nt 1864 till 2148, EMBL åt- komstrir. AFO20526) kodas av sekvensen av IIP-3 partiella cDNA-klonen som isole- rades.

IIP-4 IIP-4 isolerades som ett nytt interagerande protein av den cytoplasmatiska domä- nen av IGF-l-receptorn. IIP-4 motsvarar p59fyn, ett src-liknande tyrosixilcinas (EMBL åtkomstnr. MMU70324 och humant fyn EM_HUM l:HS66Hl4) (Cooke, M.P. och Perlmutter, R.M., New Biol. 1 (1989) 66-74). IIP-4 binder på ett kínasberoende sätt till IGF- 1-receptorn och till flera andra tyrosinkinasreceptorer såsom insulinre- ceptom och Met. Regionen av lIP-4 som interagerar med IGF- l-receptorn (nt 665 till 1044) innehåller SHZ-domånen av p59fyn (EMBL åtkomstnr. U70324). 526 919 9 IIP-5 lIP-S isolerades som ett nytt IGF- l-receptorinteragerande protein. IIP-5 visar en hög homologi med zinkfingerproteinet Zfp38 (EMBL åtkornstnr. MMZFPTA) och är åt- minstone 80% homolog med den motsvarande humana genen. Zfp-38 är känd som en transkriptionsfaktor (Chowdhury, K., et al., Mech. Dev. 39 (1992) 129-142). IIP-S interagerar exklusivt med den aktiverade och fosforylerade IGF-1-receptorn men inte med en kinasinaktiv mutant. Förutom bindning av IIP-5 till IGF-1-receptorn observerades interaktion av IIP-5 med tyrosinreceptorer av insulinreceptorfamiljen (insulinreceptor, Ros). IIP-5 binder inte till den mer avlägset besläktade tyrosirilci- nasreceptorn Met.

En cDNA-klon som binder till IGF- 1-receptorn som kodar för nt 756 till 1194 av Zfp38 (EMBL åtkomstnnMMZFPTA) och innehåller det första zinkfingret (nt 1075 till 1158) isolerades. Denna domän är tillräcklig för bindning till den aktiverade IGF- 1 -receptorn IIP-6 IIP-6 identifierades som ett nytt IGF-1-receptorinteragerande protein. IIP-6 visar ringa likhet med zinkfingerdomânen av Zfp29 (EMBL åtkomstnr. MMZFP29). Zfp29 består av en N-terminal transkriptionsaktiveringsdomän och 14 C-terminala CySQI-Iisfl-zinlcfingrar (Denny, P., och Ashworth, A., Gene 106 (1991) 221-227).

Bindning av IIP-6 till IGF-1-receptorn beror på fosforyleríng av IGF- l-receptorkinas.

IIP-6 binder också till insulinreceptom men interagerar inte med Met. Regionen av IIP-6 som befunnits interagera med IGF-1-receptorn (Sekv. ID nr. 3, Sekv. ID nr. 4) innehåller två zinlcñngerdomåner av Cys2I-lis2-typ.

IIP-7 IIP-7 isolerades som ett nytt IGF- l-receptorinteragerande protein som motsvarar Pax-3 (EMBL åtkomstnr. MMPAX3R och humant Pax3 EM-HUM2:S69369). Pax-S känt som ett DNA-bindande protein som uttrycks under tidig embryogenes (Goul- djng, M.D., et al., EMBO J. 10 (1991) 1 135-1147). IIP-7 binder på ett fosforylerings- beroende sätt till IGF-l-receptorn. IIP-7 interagerar också med insulinreceptorn och Met. En partiell IIP-7-cDNA-klon visade sig klona för den IGF-1-receptorbindande 526 919 10 domänen av Pax3 (nt 815 till 1199, EMBL ätkomstnr. MMPAXSR). Denna region innehåller den PaXS-parade domänoktapeptiden (nt 853 till 876) och homeodomä- nen (nt 952 till 1134) av parad typ.

IIP-8 IIP-8 kodar för fullängds-cDNA av Grb7 (EMBL àtkomstnr. MMGRB7P, humant Grb7 EM_HUMl:ABO08789). Grb7, en pH-domän och en SH3-domän som innehål- ler signaltransduktionprotein, publicerades först som ett IGF-1-receptorbindande protein (Margolis, B.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 8894-8898). IIP-8 interagerar inte med den kinasinaktiva mutanten av IGF- 1-receptorn. Bindning av IIP-8 till flera andra tyrosinkinasreceptorer (Lex. insulinreceptor, Ros och Met) ob- serverades också..

IIP-9 IIP-9 identifierades som ett nytt IGF-l-receptorinteraktíonsprotein. IIP-9 är identisk med nok-beta (EMBL åtkomstnr. AFO43260). Nck är ett cytoplasmiskt signaltrans- duktionsprotein bestående av SH2- och SHS-domäner (Lehmann, J.M., et al., Nuc- leic Acids Res. 18 (1990) 1048). IIP-9 interagerar med IGF-l-receptorn pä ett fosfo- ryleringsberoende sätt. Nck binder till den region av lGF-l-receptom som ligger in- till membranet. Förutom bindning av IIP-9 till IGF-l-receptorn, sågs också interak- tion med insulinreceptom men inte med Ros eller Met.

Ett föredraget mål för uppfinningen är polypeptider som är homologa, och mer före- draget, polypeptider som är väsentligen identiska med polypeptidema enligt Sekv.

ID nr. 6 (IIP-10). Homologí kan undersökas med användning av FastA-algoritmen beskriven av Pearson, W.R., Methods in Enzymology 183 (1990) 63-68, Academic Press, San Diego, US. Med "väsentligen identisk" avses en aminosyrasekvens som endast skiljer sig med konservativa aminosyrasubstitutioner, t.ex. substitutioner av en aminosyra istället för en annan av samma klass (t.ex. valin istället för glycin, arginin istället för lysin, etc.) eller genom eller flera icke-konservativa aminosyra- substitutioner, deletioner eller insättningar belägna vid positioner av aminosyrase- kvensen som inte förstör polypeptidens biologiska funktion. Detta innefattar substi- tution av alternativa kovalenta peptídbíndningar i polypeptiden. Med "polypeptid" avses godtycklig kedja av aminosyror oberoende av längd eller posttranslationell 526 919 ll modifikation (t.ex. glykosylering eller fosforylering) och kan användas utbytbart med termen "protein".

Enligt uppfinningen avser "biologiskt aktivt fragment" ett fragment som kan utöva en fysiologisk effekt på det naturligt förekommande fullångdsproteinet (t.ex. bind- ning till dess biologiska substrat, orsakande av ett antigent svar etc.).

Uppfinningen innefattar också fragment av polypeptiden enligt uppfinningen som år antigena. Termen "antigen" som används här avser fragment av proteinet som kan inducera ett specifikt immunogent svar, t.ex. ett irnmunogent svar som ger an- tikroppar vilka specifikt binder till proteinet enligt uppfinningen. Fragmenten är företrädesvis åtminstone 8 aminosyror och företrädesvis upp till25 aminosyror långa. I en föredragen utföringsform innefattar fragmenten domänen som är ansva- rig för bindning av llPzerna till IGF-l-receptom (dvs. PDZ-domänen av IIP- 1). Med "domän" avses den region av aminosyror i ett protein som är direkt inblandade i interaktionen med dess bindningspartner. PDZ-domäner är cirka 90 rester upprep- ningar som finns i ett antal proteiner som är inblandade i jon-, kanal och receptor- klusterbildning och länkning av receptorer till effektorenzymer. Sådana PDZ be- skrivs i allmänhet av Cabral, J.H., et al., Nature 382 (1996) 649-652.

Uppfinningen innefattar vidare en metod för att producera ett protein enligt uppfin- ningen vars expression eller aktivering är korrelerad med tumörproliferation, genom att uttrycka ett exogent DNA i prokaryota eller eukaryota vârdceller och att isolera det önskade proteinet eller att uttrycka det exogena DNA:t in vivo för farmaceutiska ändamål, varvid proteinet företrädesvis kodas av en DNA-sekvens som kodar för IIP-10, företrädesvis DNA-sekvensen som visas i Sekv. ID nr. 5.

Polypeptiderna enligt uppfinningen kan också produceras rekombinant eller synte- tiskt. Icke-glykosylerad IIP- 10-polypeptid erhålls när den produceras rekombinant i prokaryoter. Med hjälp av nukleinsyrasekvenser som tillhandahålls av uppfinning- en år det möjligt att söka efter IIP-10-genen eller dess varianter i genomer från god- tyckliga önskade celler (t.ex. förutom humana celler, också i celler från andra dägg- djur) för att identifiera dessa och isolera den önskade genen som kodar för IIP- 10- proteinet. Sådana förfaranden och lämpliga hybridiseringsbetingelser (se också 526 919 12 ovan, "stringenta betingelser") är kända för fackmannen på teknikområdet och har t.ex. beskrivits av Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA och Hannes, B.D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England. I detta fall används vanligen standard protokollen som beskrivs i dessa publiceringar för experimenten.

Användning av rekombinant DNA-teknologi möjliggör produktion av flera aktiva IIP- lO-derivat. Sådana derivat kan t.ex. modifieras i individuella eller flera aminosyror genom substitution, deletion eller addition. Derivatiseringen kan exempelvis utföras genom siteriktad mutagenes. Sådana variationer kan enkelt utföras av fackmannen pà teknikområdet (J. Sambrook, B.D. Harnes, loc. cit.). Det behöver endast säker- ställas med hjälp av nedan angivna tumörcellstillvâxtinhibitionsanalys att de karak- täristiska egenskaperna hos IIP- 10 bevaras.

Med hjälp av sådana nukleinsyror som kodar för ett IIP- lO-protein, kan proteinet enligt uppfinningen erhållas på ett reproducerbart sätt och i stora mängder. För expression i prokaryota eller eukaryota organismer, såsom prokaryota vârdceller eller eukaryota värdceller, integreras nukleinsyran i lämpliga expressionsvektorer, enligt metoder som är kända för fackmannen på telmikområdet. En sådan expres- sionsvektor innehåller företrädesvis en reglerbar/índucerbar promotor. Dessa re- kombinanta vektorer introduceras därefter för expression i lämpliga vårdceller så- som t.ex. E. coli som en prokaryot vårdcell eller Saccharomyces cerevisiae, terato- karcinomcellinje PA-1 sc 9117 (Bütmer et al., Mol. Cell. Bio. 11 (1991) 3573-3583), insektsceller, CHO- eller COS-celler såsom eukaryota vårdceller och de transfonne- rade eller transducerade värdcellerna odlas under betingelser som möjliggör expres- sion av den heterologa genen. isoleringen av proteinet kan utföras enligt kända me- toder från värdcellen eller från kultursupernatanten från värdcellen. Sådana meto- der beskrivs t.ex. av Ausubel 1., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992), John Wiley ös Sons, New York. Dessutom kan reaktivering av proteinet vara nöd- våndig om den inte finns i löslig form i celllculturen.

Därför avser uppfinningen vidare en IIP-polypeptid som är en produkt från prokary- ot eller eukaryot expression av ett exogent DNA. (526 919 13 Proteinet kan isoleras från cellema eller kultursupernatanten och renas genom kromatografiska medel, företrädesvis genom jonbytarkromatografi, afiinitets~ kromatografi och / eller omvänd fas HPLC.

IIP- 10 kan renas efter rekombinant produktion genom afiinitetsluomatografi med användning av kända proteinreningstekniker, innefattande immunoprecipitatíon, gelfiltrering, jonbytarkromatografi, kromatofokusering, isoelektrisk fokusering, se- lektiv precipitationplektrofores och liknande.

Díagnostiska metoder: Uppfinningen innefattar vidare en metod för att detektera en nukleinsyramolekyl som kodar för en IIP-gen, innefattande att inkubera ett prov (t.ex. kroppsvätskor såsom blod, cellysat) med en nukleinsyramolekyl enligt uppfinningen och att be- stämma hybridisering under stringenta betingelser av nukleinsyramolekylen til] en målnukleinsyramolekyl för bestämning av närvaron av en nukleinsyramolekyl som år nämnda IlP-gen och därför en metod för identifiering av IGF- lR-aktivering eller inhibition i däggdjursceller eller kroppsvåtskor.

Följaktligen innefattar uppfinningen också en metod för detektion av proliferations- potentialen hos en tumörcell innefattande a) att inkubera ett prov av kroppsvätska från en patient som har cancer, ett prov av cancerceller, eller ett prov av ett cellextrakt eller en cellkultursupernatant från cancercellerna, varvid provet innehåller nukleinsyror med en nukleinsyr- aprobe som är selekterad från gruppen bestående av (i) nukleinsyror som visasi Sekv. ID nr. 1, 3 eller 5 eller en nukleinsyra som är komplementär därtill och (ii) nukleinsyror som hybridiserar under stringenta betingelser med en av nukleinsyror-na från (i) och 526 919 14 b) att detektera hybridisering med hjälp av en ytterligare bindningspartner för nukleinsyran från provet och/ eller nukleinsyraproben eller genom röntgenra- diografi.

Hybridisering mellan proben och nukleinsyrorna från provet indikerar närvaro av RNA från sådana proteiner. Dessa metoder är kända för fackmannen på teknikom- rådet och har t.ex. beskrivits i WO 89 / 06698, EP-A 0 200 362, USP 2915082, EP- A 0 063 879, EP-A O 173 251, EP-A O 128 018. l en föredragen utföringsform av uppfinningen amplifieras den kodande nukleinsy- ran i provet före testet, t.ex. med hjälp av den kända PCR-tekniken. Vanligen an- vänds en derivatiserad (märkt) nukleinsyraprobe inom ramarna för nukleínsyradia- gnostik. Denna probe förs i kontakt med ett denaturerat DNA eller RNA från provet som år bundet till en bärare och i denna process väljs temperaturen, jonstyrkan, pH och andra buffertbetingelser - beroende på längden och sammansättningen av nukleinsyraproben och den resulterande smälttemperaturen av den förväntade hy- briden - så att det märkta DNA:t eller RNA:t kan binda till homologt DNA eller RNA (hybridisering se även Wahl, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 3683- 3687). Lämpliga bärare är membran eller bärarmaterial baserade på nitrocellulosa (t.ex. Schleicher och Schüll, BA 85, Amersham Hybond, C.), förstärkt eller bundet nitrocellulosai pulverform eller nylonmembran derivatiserat med olika funktionella grupper (t.ex. nitrogrupper) (t.ex. Schleicher och Schüll, Nytran; NEN, Gene Screen; Amersham Hybond M _; Pall Biodyne).

Hybridiserande DNA eller RNA detekteras därefter genom inkubering av bäraren med en antikropp eller antikroppsfragment efter noggrann tvättning och mättning för att förhindra ospecifik bindning. Antikroppen eller antikroppsfragmentet är rik- tat mot substansen som införlivats under derivatisering in i nukleinsyraproben. An- tikroppen är i sin tur märkt. Emellertid är det också möjligt att använda direkt märkt DNA. Efter inkubering med antikroppar-na tvättas den igen i syfte att endast detektera specifikt bundna antikroppskonjugat. Bestämningen utförs därefter enligt kända metoder med hjälp av markören på antikroppen eller antikroppsfragmentet.

Detektionen av expressionen kan utföras såsom t.ex.: 526 919 15 - in situ-hybridisering med fixerade hela celler, med fixerade våvnadsutstryk och isolerade metafaslcromosomer, - kolonihybridisering (celler) och plackhybridisering (fager och virus), - Southern-hybridisering (DNA-detektion), - Northern-hybridisering (RNA-detektion), - serumanalys (t.ex. celltypanalys av celleri serum genom slot-blot-analys), - efter amplifiering (Lex. PCR-teknik).

Företrâdesvis inkuberas nukleinsyraproben med nukleinsyran i provet och hybridi- sering detekteras valfritt med hjälp av en ytterligare bindningspartner för nuklein- syran i provet och/ eller nukleinsyraproben.

Nukleinsyrorna enligt uppfinningen är således värdefulla progçnostiska markörer vid diagnos av den metastatiska och progressionspotentialen hos tumörceller från en patient.

Screening fór antagonister och agonister av llPzer eller inhibitorer Enligt uppfinningen kan antagonister av IIP- 10 eller inhibitorer för expression av IIP (tex. antisensenukleinsyror) användas för att inhibera tumörprogression och ge upphov till massiv apoptos av tumörceller in vivo, företrädesvis genom somatisk genterapi.

Följaktligen avser föreliggande uppfinning också metoder för screening av potentiel- la terapeutiska medel för cancer, diabetes, neurodegenerativa rubbningar, bensjuk- domar, metoder för behandling av sjukdom och cellinjer och djurmodeller som âr användbara för screening och utvärdering av potentiellt användbara terapier för sådan sjukdom. Därför är ett annat syfte för uppfinningen metoder för att identifie- ra föreningar som ár användbara vid behandling av ovan nämnda och besläktade sjukdomar. Dessa metoder innefattar metoder för att modulera expression av poly- peptiderna enligt uppfinningen, metoder för att identifiera föreningar som selektivt kan binda till proteinerna enligt uppfinningen och metoder för att identifiera före- ningar som kan modulera aktiviteten hos nämnda polypeptider. Dessa metoder kan 326 919 16 utföras in vitro och in vivo och kan använda de transformerade cellinjema och transgena djurmodellema enligt uppfinningen.

En antagonist av IIP:er eller en inhibitor av IIP definieras som en substans eller fö- rening som inhiberar interaktionen mellan IGF- lR och IIP, företrädesvis IIP- 10.

Följaktligen minskar de biologiska aktiviteterna av IGF- lR i närvaro av en sådan förening. I allmänhet innefattar screeningsprocedurer för IIP-antagonister att föra kandidatsubstanser i kontakt med IIP-bärande värdceller under betingelser som år gfnnsamrna för bindning och mätning av graden av minskande receptormedierad signalering (i fallet med en antagonist). En sådan antagonist är användbar som ett farmaceutiskt medel för användning vid tumörterapi. För behandling av diabetes, neurala sjukdomar eller bensjukdomar, krävs stimulering av den signalerande vä- gen, dvs. screening för agonister är användbart.

IIP-aktivering kan mätas på flera sätt. Vanligen är aktiveringen uppenbar genom en förändring i cellfysiologi såsom en ökning eller minskning i tillväxthastighet eller genom en förändringi differentieringstillståndet eller genom en förändring i cellme- tabolismen som kan detekteras i standardcellanalyser, t.ex. MTP- eller XTT- analyser (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland).

Nukleinsyrorna och proteinerna enligt uppfinningen kan därför också användas för att identifiera och utforma läkemedel som interferar med interaktionerna av IGF-IR och IIP:er. Exempelvis kan ett läkemedel som interagerar med ett av proteinerna företrädesvis binda till detta istället för att tillåta bindning till dess naturliga mot- part. Godtyckligt läkemedel som binder till IGF- l-receptom och, därigenom, för- hindrar bindning av en IIP, eller vice versa, binder till en IIP och därigenom förhind- rar bindning av IGF-1-receptorn. l båda fallen, moduleras signaltransduktion av IGF- l-receptorsystemet (företrädesvis inhiberas). Screening av läkemedel för denna förmåga ger genom att upprätta en kompetitiv analys (analys som är standard på teknikornrådet) mellan testföreningen och interaktionen av IIP och IGF- 1-receptorn och med användning av renat protein eller fragment med samma egenskaper som bindningspartnerna. 526 919 17 Proteinet enligt uppfinningen är lämpligt för användning i en analysprocedur för identifiering av föreningar som modulerar aktiviteten hos proteiner enligt uppfin- ningen. Modulering av aktiviteten som beskrivs här innefattar inhibition eller akti- vering av proteinet och innefattar direkt eller indirekt påverkan av den normala re- gleringen av proteinalttiviteten. Föreningar som modulerar proteinaktiviteten inne- fattar agonister, antagonister och föreningar som direkt eller indirekt påverkar re- gleringen av aktiviteten hos proteinet enligt uppfinningen. Proteinet enligt uppfin- ningen kan erhållas från både nativa och rekombinanta källor för användning i en analysprocedur för att identifiera modulatorer. I allmänhet kommer en analyspro- cedur för att identifiera modulatorer att innehålla IGF-receptorn, ett protein enligt föreliggande uppfinning och en testförening eller prov som innehåller en förmodad modulator av nämnda proteinaktivitet. Testföreningarna eller provenkan testas di- rekt på, t.ex. renat protein enligt uppfinningen, oberoende om det är nativt eller re- kombinant, subcellulära fraktioner av celler som producerar proteinet, oberoende om de är nativa eller rekombinanta, och / eller hela celler som uttrycker proteinet, oberoende om de är nativa eller rekombinanta. Testföreningen eller provet kan till- sättas till proteinet enligt uppfinningen i närvaro eller frånvaro av kända modulato- rer för nämnda protein. Den modulerande aktiviteten hos testföreningen eller provet kan bestämmas genom t.ex. analysering av förmågan hos testföreriingen eller provet att binda till proteinet, aktivera proteinet, inhibera dess aktivitet, inhibera eller för- höja bindningen av andra föreningar till proteinet, modifiera receptorreglering eller att modifiera intracellulär aktivitet.

Identifieringen av modulatorer för proteinaktivitet är användbar vid behandling av sjukdomstillstånd innefattande proteinaktivitet. Andra föreningar kan vara använd- bara för att stimulera eller inhibera aktiviteten hos proteinet enligt uppfinningen.

Sådana föreningar kan användas vid behandling av sjukdomar i vilka aktivering eller inaktivering av proteinet enligt uppfinningen resulterar i antingen cellulär pro- liferation, celldöd, icke-proliferation, induktion av cellulära neoplasmiska transfor- mationer eller metastatisk tumörtillväxt och kan således användas vid förebyggande och/ eller behandling av cancrar såsom t.ex. prostata- och bröstcancer. Isolering och rening av en DNA-molekyl enligt föreliggande uppfinning kan vara användbart för att fastställa vävnadsdistributionen för proteinet såväl som för att upprätta ett « 526 919 18 förfarande för att idenfifiera föreningar som modulerar aktiviteten hos proteinet och/ eller dess expression.

Följaktligen är en ytterligare utföringsform av uppfinningen en metod för att scree- na en förening som inhiberar interaktionen mellan IGF- lR och IIP-1 eller IIP- 10, innefattande a] att kombinera IGF- IR och IIP- 1- eller IIP-10-polypeptid med en lösning inne- hållande en kandidatförening så att IGF- lR och IIP- 1- eller IIP- lO-polypeptiden har fönnåga att bilda ett komplex, och b) att bestämma mängden komplex i förhållande till den förutbestämda nivån av bindning i frånvaro av kandidatföreningen och därur utvärdera förmågan hos kandidatföreningen att inhibera bindning av IGF- IR till IIP-l- eller IIP- 10- polypeptid.

En sådan screeningsanalys utförs företrädesvis som en ELISA-analys varvid IGF-IR eller IIP-l eller IIP- 10 är bundet på en fast fas.

En ytterligare utföringsform av uppfinningen är en metod för produktion av ett te- rapeutiskt medel för behandling av karcinom hos en patient, innefattande att kom- binera en terapeutiskt effektiv mängd av en förening som inhiberar interaktionen mellan IGF- IR och IIP i biokemiska och /eller cellulåra analyser till en grad av åt- minstone 5O%.V Biokemiska analyser är företrädesvis ELISA-baserade analyser eller homogena analyser. I fallet med ELISA-systemet används antikroppar specifika för de två bindningspartnerna för detektion av komplexen. I fallet med den homogena analysen är åtminstone en bindningspartner märkt med fluoroforer vilket möjliggör analys av komplexen. Cellulära analyser år företrädesvis analyser där tumörceller eller celler transfekterade med expressionskonstruktioner av IGF-lR och respektive bindningsproteiner behandlas med eller utan läkemedel varefter komplexbildning mellan de två komponenterna därefter analyseras med användning av standardcell- analyser. 526 919 19 En föredragen utföringsfonn av uppfinningen är en metod för produktion av ett te- rapeutiskt medel för behandling av karcinom hos en patient, innefattande att kom- binera en farmaceutiskt accepterbar bärare med en terapeutiskt effektiv mängd av en förening som inhiberar interaktionen mellan IGF- lR och IIP-1 eller IIP-10 i en cellulår analys, varvid i den cellulâra analysen tumörceller eller celler transfektera- de med expressionskonstruktioner av IGF-IR och av respektive IIP behandlas med föreningen, och komplexbildning mellan IGF- lR och respektive IIP analyseras, var- vid graden av komplexbildning i fallet med inhibition inte överskrider 50% i förhål- lande till 100% för komplexbildning utan föreningen i samma cellulära analys.

En ytterligare utföringsform av uppfinningen är en metod för att behandla en pati- ent som har karcinom med en terapeutiskt effektiv mängd av en förening-som inhi- berar interaktionen mellan IGF-IR och IIP-l eller IIP-10 i en cellulär analys, varvid i den cellulâra analysen tumörceller eller celler transfekterade med expressionskon- struktionerna av IGF- lR och av respektive IIP behandlas med föreningen, och kom- plexbildning mellan IGF-IR och respektive IIP analyseras, varvid graden av kom- plexbildning i fallet med inhibition inte överskrider 50% i förhållande till 100% för komplexbildning utan föreningen i samma cellulära analys.

En ytterligare utföringsform av uppfinningen år en antikropp mot IIP-l eller IIP-10 enligt uppfinningen.

Antikroppar bildades från humana, mus- eller råttpolypeptider. Antikroppar som specifikt känner igen IIP- 1 eller IIP- 10 innefattas i uppfinningen. Sådana antikrop- par tas fram med användning av immunologiska standardtekniker. Antikropparna kan vara polyklonala eller monoklonala eller kan produceras rekombinant såsom för en humaniserad antikropp. Ett antikroppsfragment som bibehåller förmåga att interagera med IIP-l eller IIP- 10 tillhandahålls också. Ett sådant fragment kan pro- duceras genom proteolytisk klyvning av en fullângdsantikropp eller produceras ge- nom rekombinanta DNA-procedurer. Antikroppar enligt uppfinningen är användba- ra i diagnostiska och terapeutiska tillämpningar. De används för att detektera och kvantifiera IIP-1 eller IIP- 10 i biologiska prov, i synnerhet vâvnadsprov och kropps- vâtskor. De används också för att modulera aktiviteten av IIP-l eller IIP- 10 genom att verka som en agonist eller som en antagonist. 526 919 20 Följande exempel, referenser, sekvenslistning och ritning tillhandahålls för at un- u-lrlårrn nvnfånn annne 1. Ånlvi- .musa uaunuuas uanßvu a »av v; f” .då ÛÅ««GÅA1~A~\ nu» A0-, unna-ÅA nuaanøuuu-:vun :vara :fn Å>§fl QÅÖQÄI V ÅÜÅ. Ul-ÅssÉJ-ÃKÅÅ' UlPP-lJ-LLÅÅJJJ-s, VG-LÖ VBA.

.J -..I 24+- uuiiauua Lu fogade kraven. Det är underförstått attmodifikationer kan göras i procedurema som anges utan att avvika från uppfinningens idé.

Figpgbeskrivning Fig. 1 Domänstruktur för jäst två-hybrid beten som användes för att screena cDNA-bibliotek för cytoblasmatiska bindningsproteiner av IGF- IR- receptorn. LexA-DNA-bindningsdomänen fuserades till den cytoplasmiska (cp) domänen (nt 2923 till 4154) av vildtyp-IGF-l-recptorn (a) eller den ki- nasiiiaktiva mutanten (K/A-mutation vid as 1003) (b) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512, Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173- 176). N ukleotid- och arninosyrasekvensen för två olika linkers insatta mel- lan LexA-DNA-bindningsdomånen och receptordomänen visas nedan. Il (vt IGF- 1-receptor) och Kl (kinasinaktiv mutant IGF- I-receptor) konstruktioner innehåller en ytterligare prolin och glycín jämfört med 12- och K2- konstruktionema.

Fig. 2 Modifikation av jäst två-hybrid LexA/IGF-1-receptorbeteskonstruk-tionen. a) Schematisk illustration av det cytoplasmatiska bindningsstället för IGF- l-recpeptorn. a-subenhetema av IGF- l-receptom år bundna till ß- kedjorna via disulfidbindningar. Den cytoplasmatiska delen av ß-kedjan innehåller bindníngsstâllen för substrat intill membranet och den C- terminala domänen. _ b) Dornänstruktur av två-hybrid betet som endast innehåller IGF-l- receptorbindningsställena intill membranet. Domänen intill membranet av IGF-I-receptom (nt 2923 till 3051) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) (2503-2512) fuserades till lcinasdomänen av ptrmet (nt 3456 till 4229) (GenBank åtkomstnr. HSU 19348). c) Domânstruktur för två-hybridbetet innehållande endast de C-terminala IGF- l-receptorbindande ställena. Den C-terrninala domänen av IGF-1- receptorn (nt 3823 till 4149) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) (2503- Fig. 3 Fig. 4 Fig. 5 r526 919 21 2512) fuserades till kinasdomänen av trpmet (nt 3456 till 4229) (Gen- Bank åtkomstnr. HSU 19348).

Isoformer av IIP- 1. a) Beslaivning av cDNA-sekvensema för IIP-l och IIP- 1 (p26). Nukleotider- na är numrerade ovanför. Det potentiella translationsinitieringsstället inuti IIP- 1 cDNA är vid position 63. Det första ATG som potentiellt trans- lationsinitieringsställe i den alternativa splitsningsvarianten IIP-l (p26) är vid position 353. Båda cDNA innehåller stoppkodoner vid position 1062. b) Domänstruktur för IIP-l och IIP-1 (p26). Aminosyrapositionerna anges ovanför. I jämförelse med IIP- 1 (p26) innehåller IIP-1 ytterligare 97 ami- nosyror vid N-terminalen. Båda isoformerna av IIP-1 innehåller en PDZ- domän som spänner över en region mellan aminosyrorna 129 och 2 13.

Beslaivning av IGF-l-receptorbindande domän av IIP-1.

Fullängds-HP- l, dess partiella cDNA-kloner (IIP- la och IIP- lb) och dele- tionsmutanter (IIP- la/mu 1 , IIP- la/mu2, IIP- la / mu3, IIP- lb /mu 1) under- söktes för interaktion med IGF- l-reccptom i jäst två-hybridsystemet. Jäst- celler samtransfekterades med en LexA IGF- l-receptorfiisionskons-truktion och en aktiveringsplasmid som kodar för IIP-1 eller de olika IIP- 1- mutanterna fuserade till VPl6 aktivenngsdomânen. Interaktion mellan IIP- _1 eller dess mutanter och IGF- 1-receptom analyserades genom att övervaka tillväxt av jâsttransfektanter utplattade på histidindeficientrnedium och in- kuberade under 6d vid 30°C (diameter av jästkolonier; +++,> 1 mm pà 2d, ++,> l mm på 4d; +, > 1 mm på 6d; -, ingen detekterad tillväxt). PDZ- domånen kan definieras som essentiell och tillräcklig för att mediera inter- aktionerna med IGF- l-receptom. Nukleotídposítíoner med hänsyn till fullängds-IIP-l anges ovanför.

Proteinsekvensmotiv av IIP- 10.

Aminosyrasekvensen för IIP- 10 analyserades med användning av datapro- grammet "Motifs" som letar för proteinmotiv genom att avsöka proteinse- 526 919 22 kvenser för regelbundna expressionsmönster beskrivna i PRO SITE- uppslagsverket.

Sekv. ID nr. 1 Nukleotidsekvens för IIP-1 (cDNA).

Sekv. ID nr. 2 Förväntad aminosyrakevens för IIP-l.

Sekv. ID nr. 3 Nukleotidsekvens för IIP-6 partiell cDNA-klon.

Sekv. ID nr. 4 Härledd aminosyraskekvens för IIP-6 partiell cDNA-klon. Cystein- och histidinrester av de två Cyszl-Iisz-zinkfingerdomänerna är ami- nosyrorna 72, 75, 88, 92, 100, 103, 116 och 120.

Sekv. ID nr. 5 Nukelotidsekvens för IIP- 10 (dCNA).

Sekv. ID nr. 6 Hârledd arninosyrasekvens för IIP-10.

Sekv. ID nr. 7 Primer TIP2c-s.

Sekv. ID nr. 8 Primer TIPZb-r.

Sekv. ID nr. 9 Primer I-lctliy-s.

Sekv. ID nr. 10 Primer Hcthy-r.

EXEMPEL 1 Isolering och karaktäriseríng av IGF-IR bindningsproteiner Jäst två-hybridsystemet (Fileds, S. och Song, O., Nature 340 (1989) 245-246) an- vändes för att isolera okända cytosoliska IGF~1-receptorbindningsproteineln För screening användes en modifierad version av jäst två-hybridsystemet som möjliggör interkedjetyrosylfosforylering av receptorema i jäst.

J âst två-hybridbetesplasmiden (BTMl 16-cpIGF- l-reccptor) konstruerades genom att fusera den cytoplasmatiska domänen av ß-subenheten hos IGF- l-receptom (nt 2923 till 4154) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) (2503-2512) till LexA DNA- bíndningsdomânen som bildar dimerer och härmar situationen för den aktiverade vildtypreceptorn (if. Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176). Genom att in- föra en prolín-glycinspacer mellan LexA DNA-bindande domänen och receptordo- 526 919 23 mänen ökade förmågan hos betet att binda kända substrat för IGF- l-receptom märkbart ijârnförelse med andra spacerarnjnosyror (Fig. l).

Alternativt konstruerades ett bete innehållande endast regionen intill membranet eller den C-terminala regionen av lGF-l-receptorn (nt 2923 till 3051 eller nt 3823 till 4 146) (Ulh-ich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) (2503-2512) fuserade till kinasdomâ- nen av en icke-relaterad, mycket potentiell tyrosirildnasreccptor. Hår användes ki- nasdomânen av tprrnet (nt3456 till 4229) (GenBank åtkomstnr. HSUl9348) (Fig. 2).

På detta sätt är det möjligt att beskriva regionema av IGF-1-receptom som medie- rar bindning till nedströms belägna efiektorer.

IGF- l-receptorbetesplasmiden användes för att screena aktiveringsdomän-cDNA- bibliotek (Lex. VPl6- eller Gal4-baseradr aktiveringsdomâner) íjf. Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176). Betes- och bytes (prey) -plasmidema samtransfek- terades i Saccharomyces cerevisiae-stam L40 innehållande HlS3- och lacZ- reportergen. Biblioteksplasmider isolerades från jästkolonier som växte på histidin- deficientmedium, sekvenserades och återiníördes i jäststam L40. Genom sarntrans- fekteringsexperiment med olika testbeten, dvs. BTM l 16-plasmid som kodar för en kinasinaktiv mutant av IGF- l-receptorn (Ll033A) eller den cytoplasmatiska domä- nen av tyrosinkinasreceptorn av insulinreceptorfaniiljen (insulinreceptor, Ros) och av icke-relaterade tyrosirildnasreceptorfaniiljer (Met, EGF-receptor, Kit, Fms, Neu) uwärderades specificiteten för de förmodade bete-byte-iriteraktionerna. Flera cDNA identifierades som kodar för tidigare okända IGF- l-receptorinteragerande proteiner (llPzer). Vidare fann man bindningsdomäner av kända substrat för IGF- 1-receptom såsom den C-terrninala SH2-domänen av p85PI3K och SH2-domänen av Grbl0.

Resultaten visas i Tabell l. 526 919 24 TABELL 1 II? vv* IGF- IR mi: IGF- IR IR Ros Met IIP-1 + + - - - IIP-2 + - + + - IIP-3 + - + + + IIP-4 + - + eb + IIP-S + - + + - IIP-6 + - + eb - IlP-7 + _ + eb + IIP-s + ' - + + + IIP-9 + - + - - lIP- 10 + - - eb eb Beskrivning av bindningsspecificíteten för IIP:erna med hänsyn till olika tyrosinki- nasreceptorer i jäst två-hybridsystemet. Jästceller samtransfekterades med en LexA-fusionskonstruktion som kodar för de olika tyrosinkinasreceptorerna och en aktivexingsplasniid som kodar för de olika IIP:ema fuserade till VP16 aktiverings- domånen. Interaktion mellan IIP:ema och de olika tyrosinkinasreceptorerna analy- serades genom att man övervakade tillväxten av jästtransfektanter utplattade på histidjndeficientmedium och inkuberade under 3d vid 30°C (vt IGF-lR, kinasaktiv IGF- l-receptor; mu IGF- lR, kinasinaktiv mutant IGF- l-receptor; IR, insulinrecep- tor; Ros tyrosinkinasreceptor; Met, Met tyrosinlsinasreceptor, +,“ tillväxt av jäst- transfektanter inom 3 dagar större än l mm i diameter; -, ingen detekterad tillväxt; eb, ej bestämt.

EXEMPEL 2 Analyssystem: A) In vitro / biokemiska analyser: ELISA-baserad /homogen analys IGF-IR och bindningsproteinema (llPzema) uttrycks med eller utan Tag-enzymer i E.coli eller eukaryota och renas till homogenitet. Interaktion av IGF- lR och respek- tive bindningsproteiner analyseras i närvaro eller frånvaro av läkemedel. Föreningar 526 919 25 som antingen inhiberar eller befrämjar bindning av IGF- 1R och respektive bind- ningsproteiner selekteras. I fallet med ELISA-systemet används antikroppar som år specifika för de två bindningspartnerna för detekfion av komplexen. I fallet med den homogena analysen märks åtminstone en bindningspartner med fluoroforer som möjliggör anlays av komplexen. Alternativt används anti-Tag-antiltroppar för att fastställa intreralction.

B) Cellulâra analyser: Tumörceller eller celler transfekterade med expressionskonstruktioner av IGF-1R och respektive bindningsproteíner behandlas med eller utan läkemedel och kom- plexbildning mellan de två komponenterna analyseras därefter med användning av standardanalyser.

EXEMPEL 3 cDNA-kloníng av IIP-l och IIP-10 (och RT-PCR-analys) Nukleotídsekvensen för fullângds-IIP-l alignerades med användning av databasin- formation (ESTs) och sekvenser för de partiella cDNA-klonerna av IIP-l (IIP- la, IIP- lb). cDNA som klonar för fullängds-IIP-l utfördes genom RT PCR på total RNA iso- lerat från en MCWADR-bröstcellinje. PT PCR med två oligonukleotídprinirar: TIP2c-s (Sekv. ID nr. 7) och TIP2b-r (Sekv. ID nr. 8) resulterade i amplifiering av tvâ DNA- fragment av 1,0 kb (IIP-l) och 0,7 kb (IIP-l(p26)).

Nukleotidsekvensen för fullängds-llP-IO alignerades med användning av databasin- formation (ESTs) och sekvensen för den partiella cDNA-klonen av IIP- 10. cDNA- kloning av IIP- 10 utfördes på total-RNA isolerat från colon-cancercellinjen SW480.

RT PCR med två oligonuldeotidprimrar: Hcthy-s (Sekv. ID nr. 9) och Hcthy-r (Sekv.

ID nr. 10) resulterade i arnplifiering av ett cDNA-fragment av 676 bp (IIP-lO).

DNA-sekvensering utfördes med användning av dideoxynukleotid- kedjetermineringsmetoden på ABI 373A-sekvenserare med användning av Ampli Taq® FS Dideoxyterminatorkitet (Perkin Elmer, Foster City, CA). Jämförelse av cDNA och de härledda proteinsekvenserna utfördes med användning av Advanced 526 919 26 Blast Search (Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410; Altschul, S.F., et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402).

EXEMPEL 4 Western blot-analys av IIP-l och IlP-IO Totala cellysat framställdes i en buffert innehållande 50 mM Tirs pH 8,0, 150 mM N aCl, 1% NP40, O,5°/o deoxykolsyra, 0, 1% SDS och 1 mM EDTA pH och klarordes genom centrlfugering under 15 minuter vid 4°C. Supematantens proteinkoncentra- tion mättes med användning av Micro BCA Protein Assay Kit (Pierce Chamical Co., Rockford, IL) enligt tillverkarens manual. IGF-1-receptorer immunoprecipiterades med användning av anti-IGF- 1-receptor-antikroppar (SantaCruz). Proteiner 'frak- tíonerades genom SDS-PAGE och överfördes elektroforefiskt till nitrocellulosfilter.

Nitrocellulosafilter förinkuberades med 10% (vikt / volym) fettfritt mjölkpulver i 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,2% Tween-ZO. Bindning av en mus-monoklonal antikropp riktad mot flagepitopen detekterades genom pepparrotsperoxidasmärkt get-anti-mus IgG antiserum (Biorad, München, Tyskland) och visualiserades med användning av ett förhöjt chemoluniscens-detektionssystem ECLTM (Amersham, Braunschweig, Tyskland).

EXEMPEL 5 Överexpression av IIP-1 till IIP-10 i däggdjursceller genom liposom- medierad transfektion cDNA för IIP-1 till -10 klonades i NotI-stâllet av pBAT-flag eller pcDNA3flag (Weid- ner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176; Behrens, J., et al., Nature 382 (1996) 638-642; Behrens, J., et al., Science 280 (1998) 596-599). NIH3T3-celler eller andra mottagarceller transfekterades med pcDNAflagIIP-l till -10 eller alternativt med pBATflag llP-1 till -10 med användning av FuGENEö (Roche Biochemicals) som transfektionsmedel. Celler selekterades i 0,4 mg/ ml G418. Enskilda kloner plocka- des och analyserades för expression av IIP-1 till -10 och karaktäriserades funktio- nellt med hänsyn till prolíferation. 526 919 27 Northern blot-analys Northern blots med humana och murina mRNA från flera vävnader köptes från Clontech (Palo Alto, CA, US). En cDNA-probe som spårmer över llP-IO nt343-nt676 av kodníngsregionen märktes med DIG-dUTP med användning av PCR DIG märk- ningsmíxen (Roche Díagnostics GmbH, Tyskland). En digoxygenirimârkt aktin-RNA- probe köptes från Roche Diagnostics GmbH, Tyskland. Hybridisering utfördes med användning av DIG EasyHyb hybridiseringslösningen (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland). IIP- 10 mRNA detekterades med DIG-specifika antikroppar konjugerade till alkaliskt fosfatas och CSPD-substratet (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland).

EXEMPEL 6 Detektion av mRNA i cancerceller I syfte att detektera huruvida proteiner uttrycks i cancerceller som kodas av nukle- insyror vilka hybridiserar med Sekv. ID nr. 1 eller Sekv. ID nr. 5 eller den komple- mentâra sekvensen och följaktligen huruvida mRNA är närvarande, är det möjligt att å ena sidan utföra etablerade metoder för nukleinsyrahybridisering såsom Northern-hybridisering, in situ-hybridisering, dot- eller slot-hybridisering och dia- gnostiska tekniker hârledda från dessa (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England; WO 89/ 06698; EP-A O 200 362; EP-A 0 063 879; EP-A 0 173 251; EP-A 0 128 018). Å andra sidan är det möjligt att använda metoder från den breda repertoaren av amplífieringstekniker med användning av specifika primrar (PRC Protocols - A Guide to Methods and Applications (1990), publ. M.A. lnnis, D.H. Gelfand, J .J . Sninsky, T.J. White, Academic Press Inc.; PCR - A Practical Approach (1991), publ. M.J. McPherson, P. Quirke, G.R. Tay- lor, IRL Press).

RNA:t för detta isoleras från cancervävnaden genom metoden enligt Chomcs- zynski och Sacchi, Anal. Biochem. 162 (1987) 156-159. 20 pg total-RNA separe- rades på. en 1,2% agarosformaldehydgel och överfördes på nylonmembran (Amersham, Braunschweig, Tyskland) genom standardmetoder (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Labora- 526 919 28 tory Press, New York, USA). DNA-sekvensen Sekv. ID nr. 1 eller Sekv. ID nr. 5 märktes radioaktivt som prober (Feinberg, A.P. och Vogelstein, B., Anal. Bio- x SSC, 5 x . (1984) 266267). Hybridiserlngen uaö. des *rid 68°C i 5 Denhardt, 7% SDS / 0,5 M fosfatbuffert pH 7,0, 10% dextransulfat och 100 pg laxsperma-DNA. Därefter tvättades membranen två gånger under 1 timme var- dera i 1 x SSC vid 68°C och exponerades därefter för röntgenfilm.

EXEMPEL 7 Procedur fór identifiering av modulatorer av aktiviteten hos proteinet en- ligt uppfinningen Expressionsvektorn enligt Exempel 5 (antingen för IIP-1 eller IIP- 10 10 pg/ 106 celler) överförs till NIHSTS-celler genom standardrnetoder kända på tekníkom- rådet (Sambrook et al.). Celler som har tagit upp vektom identifieras genom de- ras förmåga att växa i närvaro av selektion eller under selektiva betingelser (0,4 mg/ ml G418). Celler som uttrycker DNA som kodar för IIP producerar RNA som detekteras genom Northern blot-analys såsom beskrivits i Exempel 5. Altema- tivt identifieras som uttrycker proteinet genom identifiering av proteinet genom Western blot-analys med användning av antikropparna beskrivna i Exempel 4.

Celler som uttrycker proteinet från expressionsvektorn kommer att uppvisa en föränrad morfologi och/ eller förhöjda tillväxtegenskaper.

Celler som uttrycker protein och uppvisar en eller flera av de förändrade. egen- skaperna beskrivna ovan odlas med och utan en förmodad modulatorförening.

Genom screening av kemiska och naturliga bibliotek, kan sådana föreningar identifieras med användning av cellulåra analyser med hög genommatning som övervakar celltillvâxt (cellproliferationsanalyser vilka såsom lcromogena substrat använder tetrazoliumsalterna WST-1, MTT eller XTT eller en celldödsdetektion ELISA med användning av bromodesoxyuridin (BrdU); jf. Boehrlnger Mannheim GmbH, Apoptosis and Cell Proliferation, 2:a utgåvan, 1998, sidorna 70-84).

Modulatorföreningen kommer att ge upphov till en ökning eller en minskningi det cellulåra svaret på IIP-proteinaktivitet och kommer antingen att vara en aktivator eller en inhibitor av IGF-l-receptorfunktion. 1526 919 Alternativt tillsätts fözmodade modulatorer till kulturer av tumörceller varvid celler- nch l/__1_1- uppvisar minskade eller förhöjda till- . _ _ .

*Ifi G 'e “sar en fcreaixflslrad monologa - ha un, .l växtegenskaper. En förmodad rnodulatorförening tillsätts till cellerna med och utan IIP-protein och ett cellulårt svar mäts genom direkt observation av cellernas morfologiska egenskaper och/ eller så övervakas cellerna med avseende på tillväxt- egenskaper. Modulatorföreningen kommer att ge upphov till en ökning eller minsk- ning i det cellulâra svaret på lIP-protein och kommer antingen att vara en aktivator eller en inhibitor av IGF- l-receptoraktivitet. 526 919 30 REF EREN SLISTA Altschul, 5.13., et al., I. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410 Altschul, S.F., et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402 _ Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992), Iohn Wiley and Sons, New York Bates et al., Br. I. Cancer 72 (1995) 1189-1193 Behrens, I., et al., Nature 382 (1996) 638-642 Behrens, I., et al., Science 280 (1998) 596-599 Boehringer Mannheim Gmbl-l, Apoptosis and Cell Proliferation, 2nd edition, 1998, pp.

I 70-84 Burfeind et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 7263-7268 Büttner et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 3573-3583 Cabral, IH., et al., Nature 382 (1996) 649-652 Chomcszynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162 (1987) 156-159 Chowdhury, K., et al., Mech. Dev. 39 (1992) 129-142 Cooke, M.P., and Perlmutter, RM., New Biol. I (1989) 66-74 Database EMBL Nos. AFO89818 and AF061263 Denny, P., and Ashworth, A., Gene 106 (1991) 221-227 DeVries, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12340-12345 Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641 EP-A O 063 879 EP-A 0128018 EP-A 0 173 251 EP-A 0 200 362 Feinberg, A.P., and Vogelstein, B., Anal. Biochern. 137 (1984) 266-267 Fields, S., and Song, O., Nature 340 (1989) 245-246 Goulding, M.D., et al., EMBO I. 10 (1991) 1135-1147 Hames, B.D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England l-larrington et al., EMBO I. 13 (1994) 3286-3295 He, VV., et al., Biol. Chem. 271 (1996) 11641-11645 Kalebic et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534 Kaleko et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 464-473 Lamothe, B., et al., FEBS Lett. 373 (1995) 51-55 Lehmann, I.M., et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990) 10181 Margolis, B.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA S9 (19921 8894-8898 ~526 919 31 Morrione et al., I. Virol. 69 (1995) 5300-5303 Morrione, A., et al., Cancer Res. 56 (1996) 3165-3167 Needleman and Wunsch, I. Biol. Chem. 48 (1970) 443-453 - PCR - A Practical Approach (1991), publ. MJ. McPherson, P. Quirke, GR. Taylor, IRL Press Pearson, W.R., Methods in Enzymology 183 (1990) 63-68. Academic Press, San Diego, US Ponting, C.P., et al., BioEssays 19 (1997) 469-479 Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2181-2185 PRC Protocols - A Guide to Methods and Applications (1990), publ. MA. lnnis, DH.

Gelfand, LI. Sninsky, TJ. White, Academic Press Inc.

Quinn et al., I. Biol. Chem. 271 (1996) 11477-11483 Resnicoffet al., Cancer Res. 54 (1994) 2218-2222 Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 4848-4850 Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469 Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 3739-3741 Riedel, H., et al., I. Biochem. 122 (1997) 1105-1113 Rocchi, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 4944-4952 Rogler et al., I. Biol. Chem. 269 (1994) 13779-13784 Rousset, R., et al., Oncogene 16 (1998) 643-654 Sarnbrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA Sell et al., CancerResJ55 (1995) 303-305 v Sell et al., Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 3604-3612 Sell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 11217-11221 Singleton et al., Cancer Res. 56 (1996) 4522-4529 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2 (1981) 482-489 Tartare-Decker, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 1019-1024 Tartare-Deckert, S., et al., I. Biol. Chem. 270 (1995) 23456-23460 Trojan et al., Science 259 (1993) 94-97 Ullrich, A., et al., EMBO I. 5 (1986) 2503-2512 USP 2915082 Wahl, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 3683-3687 Vl/ang, l., and Riedel, H., I. Biol. Chem. 273 (1998) 3136-3139 Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176 WO 97/27296 526 919 32 WO 89/06698 WO 95/ 14772 Yokouchi, M., et al., Oncogenc 15 (1998) 7-15_ 526 919 33 SEKVENSLISTNING <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <12°> IGF -l-receptorínteragerande proteiner (llPzcr), gener som kodar för dessa och användning därav <13°> FaU20273 <140> <141> <150> EP98122992.5 <151> 1998-12-03 <160> 10 <170> Patentïn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1707 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaaacccaca ggaggcaacc acactagttt agatcttctg gtgaccccac ttctcgctgc 60 tcatgccgct ctgagccagg cggggnnccc tccacaccca aggagctgta gcaccctgaa aggacttcat aggatgcact CCaa99a999 ccattaacgg agctgócccg tgatcagcca gagggaccct ttgaagagaa acacggagct tggccgaggc acgtctgggg tgcgatgatg cccgagcctc gccaggcccc gggtccccgg 9999399939 gccaaactgg ctagtttcct taatgccctc tgacacgagt cccatccctg aacccgccg: <210> 2 <211> 333 <212> PRT 999aCt9999 CC9t99a999 Ccaaatgggc gctggcccat tggcaagatc cacccacaaa cttcgcccac cgggctcacc Cagcgtgatc gcagagcctg aggccgtacc gcgttcagcg gcggctccga ggccattgag ggcagccacc cctggacgaa cgccattggg acccgggcgc cagcctgagc ctgccccgct cccccctgtg cagccaaatt tccctctgtc gacgcaggga acccctcctg ctgctgtgaa gcccagagca cttgaacata cggcggaaaa Ct999C9ï99 ttncnccccc ggcagtccca gccgaggcct gtggacatgg 9t9aa9999C atcacggaca gaccacatcc ctgggctgcc ttcacgctga ggtggccgcc tçccggggcc aasstssars atggtggagc C99Ct999C9 gacgccaagg aacctggtgg ctagctcagc ccactcggta ccctgttccc gggcggccac tccctggggc atacagggga agaggagccc ccccgcaacc 9939993999 aggcgccccc 999a9CCa99 ctcccccagc ctggccgcat tccgcctgcc acaagctcct agcgcaagga aC9999Ct99 acctcatcag ggcactacga agctcacgga ctggctctgg ccgccacggt acctgctgga tgggaaagga actttgcctt tcggccgcta gggcccccag agcccaagga ccatcccctc cacctacctc ccccgcctcc cttgggttct gagggttgtc cctccctgtg tcctccccac agggacgatg tctagtggaa gcccctgggc cctgcggccc Cgagggcttc aactgccgag 999999CCa9 99C99a99t9 ctacgccttc cgtgggcgac sgfisscccsgv gcctcgcaag cccacaactg 99a99atCï9 gagttacatg caaaaggaac ccctgacgag ctaggactgc cagggacact cgatggtgag cctggttccc agctgggtca accactctcc 9ïtï99999t cttcccccca gagcctgtta ctcccacctc 9C995999fifi aëC9a99a99 99ä99C999fi cgcctcgtgt accaacgtca gtgatgttct atcgggctgg ttcaagtcgg atcaagcgca atgatcgagg ctgctcaagg gccttcgaca ggcactggcc ccctctgcct ggtatcaggg ccggatgagc ttcgtctttg ccccggaccc gacgtcagga 999a99fi999 agtctggccg 99CaCa999a accatcagct catgaccttc gcaaatgcaa cctccgcatt tccttccagg tttgtatctg 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 B40 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1707 <400> 2 Met Pro Leu Gly Leu 1 ÅSI! Gly Pro Ala 65 Glu Val Leu Gly Leu 145 Lys Met Glu LSU Ser 225 Gly PID Glu Glu Glu Pro Pro S0 His Leu Met Gly Gln 130 Thr Glu Ile Val Lys 210 Ala Thr Ser SGI' Leu 290 Glu Leu 35 Pro Gly Tyr Phe Gly 115 Arg Ile Gly Glu Ala 195 Leu Gly Leu Ala Tyr 275 Gly Ala 20 Gly PIO Ser Gly Cys 100 Gln Lys Thr SGI' Ala 180 A19 Thr Gly Arg Phe 260 Met Lys 5 Glu Gly Ala Pro Lys 85 Thr Ile Glu Asp Val 165 Ile LBU Glu Arg Leu 245 Glu Gly Asp 526 919 Gly Pro Gly Leu Thr 70 Ile Leu Gly Val Asn 150 Ile ASH Leu_ Pro Pro 230 Arg Glu Ile Lys 211 Arg Gly Gly Arg 55 Gly Ala Asn Leu Glu 135 Gly Asp Gly Lys Arg 215 Gly Ser Lys Arg Arg 295 Arg ÅIQ Ser 40 PIO Arg Glu Thr Glu 120 Val Ala His Gln Glu 200 Lys Ser Arg Ala Asp 280 Asn Lys Gly Gly Arg Ile Ala His 105 Asp Phe Gly Ile Ser 185 Leu Ala Gly Gly Ile 265 Thr PIO Lys 10 Gly Xaa LED.

Glu Phe 90 Lys Phe Lys Tyr His 170 Leu Pro Phe Pro Pro 250 Glu Glu Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Gly 75 Arg Val Ile Ser Ala 155 Lvèll LSU A19 Asp Gln 235 Ala Lys Leu Glu Gly Gln Phe 60 Phe Leu Asp Phe Glu 140 Phe Ile Gly Gly Met 220 Leu Thr Val Ala Leu 300 Val Met 45 His Thr Pro Met Ala 125 Asp Ile Ser Cys Arg 205 Ile Gly Val 11811 Gly Gly Thr Asn Thr Asp 110 His Ala Lys Val Arg 190 Thr SBI Thr Glu Asp 270 Thr Glu Val 15 Glu Xaa Gln Val Ala 95 Lys Val Leu Gly 175 His Phe Gln Gly Asp 255 Leu Met Ala Glu PID Xaa Leu Lys 80 Glu Leu Lys Gly Ile 160 Asp Tyr Thr Arg Arg 240 Leu Leu Val Leu 526 919 Asp Glu Arg Leu Gly Asp Phe Ala Phe Pro Asp Glu Phe val Phe Asp 305 310 315 320 Val Trp Gly Ala Ile Gly Asp Ala Lys Val Gly Arg Tyr 325 330 f <210> 3 <211> 330 <212> DNR <213> Homo sapíens <400> 3 gccgaggaag gagaaggggc taaaccttgg agagtggatg gctcaaagga tccccagatc acaccccggg aggatcatgg gcaggagagc ctgttggcag ggctccacgg aacgcatcca ccaaagacaa ggcagaaagt cactgcccaa gccggaggcc ccggggatcc catgcttttt tcaagcccag agacagatga gaagcttttt atatgtgcgc agtgtggcaa aaccttcaac aataccccca acccgagaac gcaccagcgg atccacactg gcgagaagcc ctacatgtgt tccgagtgtg gcaagagttt ctcccggagc tccaaccgca tccggcacga gcgcatccac ccggaagana agcactctga <210> 4 <21l> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Glu Glu Gly Glu Gly Ala Lys Pro Trp Arg Val Asp Gly Ser Lys 1 5 10 15 Asp Ser Gln Ile Thr Pro Arg Glu Asp His Gly Gln Glu Ser Leu Leu 20 25 30 Ala Gly Leu His Gly Thr His Pro Pro Lys Thr Arg Gln Lys Val Thr 35 40 45 Ala G1n'Ala Gly Gly Pro Gly Asp Pro Met Leu Phe Ser Ser Pro Glu 50 55 60 Thr Asp Glu Lys Leu Phe Ile Cys Ala Gln Cys Gly Lys Thr Phe Asn 65 70 75 80 Asn Thr Ser Asn Leu Arg Thr His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys BS 90 95 Pro Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser Ser Asn 100 - 105 110 Arg Ile Arg His Glu Arg Ile His Leu Glu Xaa Lys His Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 678 <2l2> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 60 120 180 240 300 360 380 atgtcgagac cccggaagag 526 36 9Ct99Ct999 aâàrfiharfia zaahrnanaa rPßannfn:fl ____; _ . . . L . _-,_;_= _ L S S =s;=-=== cagaagactt tcagagccag aaagcacagc tcccctagag ccaggcatcg gagaaaaaca gtggatgtac tatcatcaag cagagattat gaaaaggaac <210> 6 <211> 225 <212> PRT <213> HONG <400> 5 Met Ser Arg Pro Arg 1 cagccactaa agagccgcct ccaaacagac ccatgaagct caggactcat atccccatta agtttgttcg ctcacaaagc caatccagcc caagttaa sapiens 5 aaactgtttg agagaaaggt aacatgctgg gggagaagaa gaagatcgtg tgacccatct gatgatgaaa tattggtggc cctgacccag Lys Arg Leu Gly Leu Ser Gly Lys Arg Thr Lys Ala Lys Val 20 Glu Asp Ser Asn Pro 35 Cys Leu Lys 50 40 Asn Leu Ser Ser His S5 Ser Arg Leu Glu Lys Gly Val Asp 65 70 Lys Ala Gln Pro Lys Gln Thr Thr 85 Gln AIa Arg Asn Phe Leu Arg Ala Phe Tyr His 100 Ser Asn Cys Lys Glu 115 Ile Val Lys 130 Pro His Tyr 145 Val Asp Val 120 Glu Ala Tyr Pro Asp 135 Asp Pro Ser Ser Lys 150 Gln Phe Val Arg Met 165 Glu Leu Lys Ser Tyr 180 Lys Asn Met Val Leu 195 His Phe Gln Thr Ala Arg 200 919 acuccuggtt aagaatctaa gtagatgtga gatggtgttc gccttcttct aaagaggctt agcaaagagg cgtttcattc cccttaaaaa gaagagtttg Ala Gly Thr 10 Thr Glu Asn 25 Gln Lys Thr Trp Leu Met Val Lys Phe 75 Cys_Tro Asp 90 Met Lys Leu 105 Pro Gly Ile His Thr Gln Glu Asp Asn 155 Met Lys Arg 170 His Lys Ala 185 CäQâCBagQQ actatcagga r-i-rr-aarr-rl- _: f,-~.-..._uv-- ...nu gcagccactg agttcagcat gtaactacca accatagcaa acccagacca acaaccctaa ccctggctga atatggttct attttgtttt gctgatgaag tgaggatctc ggctcggaac ctgcaaagag cacacagttt gtggtccatg gctcaaatcc cttcactcgc 9¿9CCfi9Që9 Ser Gly Ser Asp Lys Ser Gly Glu 30 15 Ala Leu Ser Ala Thr Lys Asn 45 Lys Ser Glu 60 Ser Ile Glu Gly Val Arg Gly Glu Glu 110 Ala Gly Leu l25 Phe Glu Lys 140 Pro Lys Trp Phe Ile Pro Pro Glu Asp Leu BO Asn Tyr 95 Ala Phe Met Lys Asn Asn Ser Met 160 Leu Ala 175 Thr lr) W H s 1 N M O W m fi) ' *' (f) \ I) n-J - ' *i Q ..

U M w 0 l-v l t- flr U 526 919 s? Thr Gln Glu Glu Phe Asp Phe Val Leu Ser Leu Glu Glu Lys Gíu Pro 210 215 220 Ser 225 _ <210> 7 <211> 18 <212> DNA < 2 13 > Artjficiell sekvens <220> <223 > Beskrivning av artiñciell sekvens: primer TIPQc-s <400> 7 gaaacccaca ggaggeaa <210> B <21l> 18 <212> DNA < 2 1 3 > Axfiñciell sekvens <220> < 223 > Beskrivning av artíficiell sekvens: primer TIPZb-r <400> 8 ggtcatcatc gcagggtc <210> 9 <21l> 33 <212> DNA < 2 1 3 > Artíficiell sekvens <220> <223> Beskrivning av artíficiell sekvens: primer Hcthy-s <4oo> ä agctcgcgge cgeagatgtc gagacccegg aag <210> 10 <211> 40 <212> DNA < 2 13 > Artificiell sekvens <220> <223> Beslwivning av artificiell sekvens: primer Hcthy-r <400> 10 agcttgcggc cgcgaattct taacttggtt: ccttttcctc

Claims (1)

5. 526 919 38 PATENTKRAV Nukleinsyra som kodar för ett protein IIP-1 som binder till en IGF-1-receptor, varvid nukleinsyran är isolerad och innefattar sekv. ID nr. 1. Rekombinant expressionsvektor för expression av en polypeptid innefattande sekv. ID nr. 2, varvid den rekombinanta expressionsvektorn innefattar en nukleinsyra enligt patentkrav 1. Värdcell transformerad med en nukleinsyra enligt patentkrav l. Metod för produktionen av ett protein som binder till en IGF- l-receptor, varvid metoden innefattar att uttrycka ett exogent DNA i prokaryota eller eukaryota värdceller och att isolera proteinet, varvid det exogena DNA:t innefattar en nukleinsyra enligt patentkrav

1. Metod för detektionen av proliferationspotentjalen hos en cancercell innefattande a) att inkubera ett prov innehållande nukleinsyror från cancercellerna med en nukleinsyraprobe som är vald från gruppen bestående av Sekv. ID nr. l och nukleinsyror som är komplementära med denna; och b) att detektera hybridisering med hjälp av en ytterligare bindningspartner för åtminstone en av nukleinsyrorna från provet och nukleinsyraproben. Metod enligt patentkrav 5, varvid provet är valt ur gruppen bestående av kroppsvätska från en patient som har cancer; tumörceller; ett tumörcellextrakt; och en cellkultursupernatant från tumörcellerna. Metod enligt patentkrav 5, vari hybridiseringen utförs åtminstone med nukleinsyrafragmentet av Sekv. ID nr. 1 eller det komplementära fragmentet. Metod enligt patentkrav 5, vari nukleinsyran som skall detekteras amplifieras före detektionen. 526 919 39 Metod för att screena en förening som inhibera: interaktionen mellan IGF- l- receptor och en polypeptid som kodas av en nukleinsyra enligt patentkrav 1 (IIP- 1) , innefattande: a) att kombinera íGF-l-receptor och líP-l-polypeptid 111661 en lösning innehållande en kandidatförening så att IGF-l-receptor och IIP- 1- polypeptiden har förmåga att bilda ett komplex och b) att bestämma mängden komplex i förhållande till den förutbestämda nivån av bindning i frånvaro av föreningen och dänir utvärdera förmågan hos föreningen att inhibera bindning av IGF- 1-receptor till nämnda IIP-1.