CH694204A5 - Mit dem IGF-1 Rezeptor wechselwirkende Proteine (IIPs), Nukleinsaeuren, die fuer diese codieren, und deren Verwendungen - Google Patents

Description

  



   Die vorliegende Erfindung betrifft mit dem IGF-1-Rezeptor wechselwirkende  Proteine (IGF-1 receptor interacting proteins, IIPs), Nukleinsäuren,  die für diese Proteine codieren, deren Verwendung für diagnostische  und therapeutische Zwecke, insbesondere bei Krebserkrankungen. Inbesondere  betrifft die Erfindung die Diagnose solcher Gene in Säugerzellen,  insbesondere in bösartigen Tumorzellen, des Weiteren Therapiemethoden  zur Inhibierung der Wechselwirkung zwischen dem IGF-1-Rezeptor und  lIPs, Verfahren zum Screenen für potenzielle Krebstherapiemittel,  sowie Zelllinien und Tiermodelle, die für das Screening und für die  Auswertung potentiell nützlicher pharmazeutischer Mittel, welche  die Wechselwirkung zwischen IIPs und dem IGF-1-Rezeptor hemmen, geeignet  sind. 



   Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Klonierung und  Charakterisierung des Gens IIP-10 und dessen Genprodukte. Die Genprodukte  (Polypeptide, mRNA) sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass  sie die Fähigkeit besitzen, die Signalübertragung durch den IGF-1-Rezeptor  modulieren zu können. Die Funktion dieser erfindungsgemässen Genprodukte  ist somit die Modulierung der Signaltransduktion durch den IGF-1-Rezeptor.  Eine erzwungene Aktivierung von IIPs korreliert somit mit erhöhter  Tumorzellproliferation, Überleben dieser Zellen und dem Nichteintreten  der Apoptose. 



   Das IGF-1-Rezeptorsignalsystem spielt bei der Tumorproliferation  und dem Überleben von Tumoren eine wichtige Rolle. Möglicherweise  ist es auch an der Inhibierung der Tumorapoptose beteiligt. Zusätzlich  und unabhängig von ihren mitogenen Eigenschaften kann die IGF-1-R-Aktivierung  in vitro und in vivo vor einem programmierten Zelltod schützen oder  diesen zumindest    verzögern (Harrington et al., EMBO J. 13 (1994)  3286-3295; Sell et al., Cancer Res. 55 (1995) 303-305; Singleton  et al., Cancer Res. 56 (1996) 4522-4529). Es wurde ebenfall gezeigt,  dass eine Abnahme der IGF-1-R-Konzentration unterhalb der Wildtypkonzentrationen  in vivo eine massive Apoptose von Tumorzellen hervorruft (Resnicoff  et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469; Resnicoff et al., Cancer  Res. 55 (1995) 3739-3741).

   Die Überexpression entweder des Liganden  (IGF) und/oder des Rezeptors ist eine Eigenschaft von verschiedenen  Tumorzelllinien und kann in Tiermodellen zur Tumorbildung führen.  Eine Überexpression von humanem IGF-1R führte zu einem ligandenabhängigen,  ankerunabhängigen Wachstum von NIH 3T3 oder Rat-1-Fibroblasten. Wurden  nackte (engl. "nude") Mäuse mit diesen Zellen inokuliert, erfolgte  eine rasche Tumorbildung (Kaleko et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990)  464-473; Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2181-2185).  Transgene Mäuse, die IGF-II spezifisch in den Milchdrüsen überexprimieren,  entwickeln Milchdrüsenadenokarzinome (Bates et al., Br. J.

   Cancer  72 (1995) 1189-1193), und transgene Mäuse, die IGF-II unter der Kontrolle  eines allgemeineren Promotors überexprimieren, entwickeln eine erhöhte  Anzahl und ein weites Spektrum von Tumorarten (Rogler et al., J.  Biol. Chem. 269 (1994) 13779-13784). Kleinzellenlungenkarzinmoe (Small  Cell Lung Carcinomas) sind ein Beispiel unter vielen für IGF-l oder  IGF-II mit sehr hoher Frequenz (> 80%) überexprimierende humane  Tumore (Quinn et al., J. Biol. Chem. 21 (1996) 11477-11483). Die  Signalübertragung durch das IGF-System scheint ebenfalls für die  Transformierungsaktivität bestimmter Onkogene erforderlich zu sein.  Fötale Fibroblasten mit einem fehlerhaften IGF-1-R-Gen können nicht  mit dem SV40-T-Antigen, aktiviertem Ha-ras, einer Kombination von  den beiden transformiert werden (Sell et al., Proc. Natl. Acad. Sci.  USA 90 (1993) 11217-11221; Sell et al., Mol.

   Cell. Biol. 14 (1994)  3604-3612), und auch das E5-Protein des Rinderpapillomavirus ist  nicht mehr transformierend (Morrione et al., J. Virol. 69 (1995)  5300-5303). Es wurde gezeigt, dass eine Störung des IGF/IGF-1R-Systems  auch den transformierten Phenotyp umkehrt und Tumorwachstum hemmt  (Trojan    et al., Science 259 (1993) 94-97; Kalebic et al., Cancer  Res. 54 (1994) 5531-5534; Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA  91 (1994) 2181-2185; Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994), 2218-2222;  Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 4848-4850; Resnicoff et al.,  Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469).

   Beispielsweise entwickeln mit Prostataadenokarzinomzellen  aus der Ratte (PA-III) injizierte Mäuse, die mit Antisense cDNA (729  bp) gegen IGF-1 transfiziert worden waren, 90% kleinere Tumoren als  Kontrolltiere, oder sie blieben auch nach 60 Tagen Beobachtung tumorfrei  (Burfeind et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996) 7263-7268). Ein  IGF-1R-vermittelter Apoptoseschutz ist unabhängig von der de-novo-Genexpression  und Proteinsynthese. Somit übt der IGF-1 seine antiapoptotische Funktion  wahrscheinlich über die Aktivierung von bereits gebildeten cytosolischen  Mediatoren aus. 



   Einige an IGF-1-R-bindende Signalsubstrate wurden bereits beschrieben  (z.B. IRS-1, SHC, p85 PI3 Kinase etc., siehe unten). Keiner dieser  Signalüberträger ist jedoch spezifisch für den IGF-1R und kann somit  nicht ausschliesslich für die einzigartigen biologischen Eigenschaften  des IGF-1R im Vergleich mit anderen Rezeptortyrosinkinasen, einschliesslich  des Insulinrezeptors, verantwortlich sein. Dies zeigt, dass spezifische  Zielsubstanzen des IGF-1R (oder zumindest der IGF-Rezeptorunterfamilie)  existieren könnten, welche das Überleben auslösen und der Apoptose  entgegenwirken und somit ausgezeichnete pharmazeutische Zielsubstanzen  für eine Antikrebstherapie wären. 



   Mithilfe des Hefen-Zweihybridensystems (yeast two-hybrid system)  wurde gezeigt, dass p85, die regulatorische Domäne der Phosphatidylinositol-3-Kinase  (PI3K) mit dem IGF-1R wechselwirkt (Lamothe, B., et al., FEBS Lett.  373 (1995) 51-55; Tartare-Deckert, S., et al., Endocrinology 137  (1996) 1019-1024). Man beobachtet jedoch auch eine Bindung von p85  an viele andere Rezeptortyrosinkinasen fast aller Familien. Ein weiterer  Bindungspartner des IGF-1R, der mithilfe des Zwei-Hybridenscreenings    identifiziert wurde, ist SHC. SHC bindet auch andere Tyrosinkinasen,  wie etwa trk, met, EGF-R und den Insulinrezeptor (Tartare-Deckert,  S., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 23456-23460). Das Insulinrezeptorsubstrat  1 (IRS-1) und das Insulinrezeptorsubstrat 2 (IRS-2) binden sowohl  an den IGF-1R als auch an den Insulinrezeptor (Tartare-Deckert, S.,  et al., J. Biol.

   Chem. 270 (1995) 23456-23460; He, W., et al., J.  -Biol. Chem. 271 (1996) 11641-11645; Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol.  10 (1996) 631-641). Grb 10, welches mit dem IGF-1R wechselwirkt,  besitzt auch viele Tyrosinkinasen als Bindepartner, z.B. met, Insulinrezeptor,  kit und abl (Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641;  Morrione, A., et al., Cancer Res. 56 (1996) 3165-3167). Auch die  Phosphatase PTP1D (syp) zeigt eine starke Promiskuität in ihrer Bindungsfähigkeit,  d.h. sie bindet an IGF-1R, den Insulinrezeptor, met und andere (Rocchi,  S., et al., Endocrinology 137 (1996) 4944-4952). Kürzlich wurden  mSH2-B und vav als Bindepartner des IGF-1R beschrieben, man beobachtet  jedoch auch eine Wechselwirkung mit anderen Tyrosinkinasen, z.B.  bindet mSH2-B auch an ret und den Insulinrezeptor (Wang, J. und Riedel,  H., J. Biol. Chem. 273 (1998) 3136-3139).

   Insgesamt stellen die bisher  beschriebenen IGF-1-R-Bindungsproteine relativ unspezifische Ziele  für therapeutische Ansätze dar, oder sie sind, wie z.B. im Fall von  Insulinrezeptorsubstraten (IRS-1, IRS-2) für Insulin-gesteuerte Aktivitäten  unerlässlich. 



   Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Gene bereitzustellen,  welche für Bindungsproteine des IGF-1R codieren, sowie die entsprechenden  Polypeptide bereitzustellen, welche die Basis für eine neue Krebstherapie  auf der Grundlage der Modulierung (bevorzugt der Inhibition) der  Wechselwirkung zwischen IGF-1R und IIPs gemäss der Erfindung bilden.                                                           



   Die Erfindung umfasst bevorzugt eine Nukleinsäure, die für ein Protein  (IIP-10) codiert, welches an den IGF-1-Rezeptor bindet, ausgewählt  aus der Gruppe umfassend   a) die in SEQ ID NO:5 dargestellten  Nukleinsäuren oder eine dazu komplementäre Nukleinsäuresequenz,  b) Nukleinsäuren, welche unter stringenten Bedingungen mit einer  der Nukleinsäuren aus a) hybridisieren, die für ein Polypeptid codieren,  welches mindestens 75% Homologie mit dem Polypeptid der SEQ ID NO:6  aufweist, oder c) Sequenzen, welche auf Grund der Degeneration  des genetischen Codes für IIP-10-Polypeptide mit der Aminosäuresequenz  der von den Sequenzen von a) und b) codierten Polypeptide codieren.                                                            



   Die cDNA von IIP-10 codiert für ein neues Protein mit 226 Aminosäuren  mit einem berechneten Molekulargewicht von 25.697. IIP-10 ist ein  lysinreiches Protein (11%). IIP-10 enthält eine N-Glykosylierungsstelle,  mehrere N-Myristoylierungsstellen, Ck2- und PKC-Phosphorylierungsstellen,  eine Tyrosinkinasephosphorylierungsstelle und ein putatives Kernlokalisierungssignal  (Fig. 5). Die cDNA-Sequenz von IIP-10 zeigt 65% Homologie mit der  cDNA-Sequenz des Gallus Gallus Thymozytenproteins cthy28kD (EMBL  Datenbank, Zugriffsnummer GG34350). Die Aminosäuresequenzen von IIP-10  und cthy28kD zeigen 70% Identität. Die Nukleotidpositionen 383 bis  584 der IIP-10-cDNA sind zu 94% identisch mit einer Teil-cDNA, die  in WO 95/14772 beschrieben ist (human gene signature HUMGS06271;  Zugriffsnummer T24253).

   Mit einem Immunofluoreszenz-Flag markiertes  IIP-10 zeigt sowohl cytoplasmatische Lokalisation als auch Kernlokalisation  in NIH3T3-Zellen, welche den IGF-1-Rezeptor überexprimieren. Weitere  Hefen-Zweihybriden-Analysen zeigten, dass IIP-10 auf eine phosphorylierungsabhängige  Weise mit dem IGF-1-Rezeptor wechselwirkt. IIP-10 bindet nicht an  den Insulinrezeptor. Eine Deletionsanalyse von IIP-10 zeigte, dass  für eine Bindung an den IGF-1-Rezeptor die Aminosäuren 19 bis 226  ausreichend sind. 



   "Wechselwirkung oder Bindung zwischen IIP-10 und IGF-1-Rezeptor"  bedeutet eine spezifische Bindung des IIP-10-Polypeptids an den IGF-1-   Rezeptor, jedoch nicht an Kontrollproteine, wie etwa Lamin, im  Hefen-Zweihybriden-System. Eine spezifische Bindung an den IGF-1-Rezeptor  kann unter Verwendung von Glutathion-S-Transferase(GST)-IIP-Fusionsproteinen,  die in Bakterien exprimiert werden, und IGF-1-Rezeptoren, die in  Säugerzellen exprimiert werden, gezeigt werden. Des Weiteren kann  in Säugerzellsystemen eine Bindung zwischen einem Flag-markierten  IIP-10-Fusionsprotein (siehe Weidner, M., et al., Nature 384 (1996)  173-176) und dem IGF-1-Rezeptor überwacht werden. Zu diesem Zweck  werden eukaryontische Expressionsvektoren verwendet, um die jeweiligen  cDNAs zu transfizieren.

   Die Wechselwirkung zwischen den Proteinen  wird durch Coimmunopräzipitationsexperimente oder Studien zur subzellulären  Lokalisation unter Verwendung von Anti-Flag- oder Anti-IGF-1-Rezeptor-Antikörpern  sichtbar gemacht. 



   Weiterhin stellt die Erfindung Sonden und Primer für die erfindungsgemässen  Gene, sowie Nukleinsäuren, welche für antigene Determinanten der  erfindungsgemässen Genprodukte codieren, bereit. Daher umfassen bevorzugte  Ausführungsformen Nukleinsäuren mit bevorzugt 10 bis 50 oder stärker  bevorzugt 10 bis 20 aufeinander folgenden Nukleotiden einer der offenbarten  Sequenzen. 



   Der Ausdruck "Nukleinsäure" bedeutet ein Polynukleotid, welches beispielsweise  eine DNA, RNA oder derivatisierte aktive DNA oder RNA sein kann.  DNA- und mRNA-Moleküle sind jedoch bevorzugt. 



   Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen hybridisieren" bedeutet,  dass zwei Nukleinsäurefragmente in der Lage sind, unter Standard-Hybridisierungsbedingungen,  die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989)  Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA beschrieben sind,  miteinander zu hybridisieren. 



     Genauer ausgedrückt bedeutet "stringente Bedingungen", wie hierin  verwendet, eine Hybridisierung in 5,0 x  SSC, 5 x  Denhardt, 7% SDS,  0,5 M Phosphatpuffer pH 7,0, 10% Dextransulfat und 100  mu g/ml Lachsspermien-DNA  bei ungefähr 50 DEG C bis 68 DEG C, gefolgt von zwei Waschschritten  mit 1 x  SSC bei 68 DEG C. Zusätzlich kann die Temperatur im Waschschritt  von Bedingungen geringer Stringenz bei Raumtemperatur, ungefähr 22  DEG C, auf Bedingungen hoher Stringenz bei ungefähr 68 DEG C erhöht  werden. 



   Die Erfindung umfasst weiterhin rekombinante Expressionsvektoren,  welche für die Expression von IIP-10 geeignet sind, rekombinante  Wirtszellen, die mit derartigen Expressionsvektoren transfiziert  sind, sowie ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Proteins,  welches von dem IIP-10-Gen codiert wird. 



   Die Erfindung umfasst weiterhin synthetische und rekombinante Polypeptide,  welche von den erfindungsgemässen Nukleinsäuren codiert werden, und  bevorzugt solche, die von der in SEQ ID NO:5 dargestellten DNA-Sequenz  codiert werden, sowie Peptidmimetika, die auf diesen Polypeptiden  basieren. Solche Peptidmimetika haben eine hohe Affinität für Zellmembranen  und werden von den Zellen rasch aufgenommen. Peptidmimetika sind  bevorzugt Verbindungen, die von Peptiden und Proteinen abgeleitet  sind, und werden durch strukturelle Modifizierung unter Verwendung  von nicht natürlichen Aminosäuren, Konformationsbeschränkungen, isosterische  Stellung, Zyklisierung usw. erhalten. Sie basieren bevorzugt auf  24 oder weniger, bevorzugt 20 oder weniger Aminosäuren, wobei eine  Basislänge von ungefähr 12 Aminosäuren besonders bevorzugt ist. 



   Die Polypeptide und Peptidmimetika können durch ihre entsprechende  DNA-Sequenz und durch die davon abgeleitete Aminosäuresequenz definiert  werden. Das isolierte IIP-Polypeptid kann in natürlichen allelischen  Variationen auftreten, welche von Individuum zu Individuum verschieden  sind. Solche Variationen der Aminosäuren sind im Allgemeinen    Aminosäuresubstitutionen.  Sie können jedoch auch Deletionen, Insertionen oder Additionen von  Aminosäuren zu der Gesamtsequenz sein, die zu biologisch aktiven  Fragmenten führen. Das erfindungsgemässe IIP-Protein kann je nach  Zelle und Zelltyp, in dem es exprimiert wird, sowohl bezüglich des  Ausmasses und Typs in glykosylierter oder nicht-glykosylierter Form  vorliegen.

   Polypeptide mit tumorizider und/oder metastatischer Aktivität  können leicht durch einen Tumorprogressionsinhibitionsassay unter  Verwendung von Karzinomzellen, welche die Polypeptide exprimieren,  und durch Messen der Proliferationsfähigkeit und Apoptose in Bezug  auf Karzinomzellen, welche die Polypeptide nicht exprimieren, identifiziert  werden. 



   "Polypeptid mit IIP-10-Aktivität oder IIP-10" bezeichnet daher Proteine  mit kleineren Aminosäurevariationen, jedoch mit im Wesentlichen derselben  Aktivität wie IIP-10. Im Wesentlichen dieselbe bedeutet hier, dass  die Aktivitäten die gleichen biologischen Eigenschaften aufweisen,  und dass die Polypeptide in ihren Aminosäuresequenzen mindestens  75% Homologie (Identität) mit IIP-10 zeigen. Besonders bevorzugt  sind die Aminosäuresequenzen mindestens 90% identisch. Homologie  im Sinne der Erfindung kann mithilfe von Computerprogrammen, wie  etwa Gap oder BestFit (University of Wisconsin; Needleman und Wunsch,  J. Biol. Chem. 48 (1970) 443-453; Smith und Waterman, Adv. Appl.  Math. 2 (1981) 482-489) bestimmt werden. 



   Weitere erfindungsgemässe IIPs, welche für die Erfindung geeignet  sind, sind insbesondere:  IIP-1  



   Es wurde eine cDNA isoliert, die für ein mit dem IGF-1-Rezeptor wechselwirkendes  Protein codierte, welches IIP-1 genannt wurde (SEQ ID NO:1). Die  cDNA von IIP-1 codiert für ein neues Protein von 333 Aminosäuren  Länge mit einem berechneten Molekulargewicht von 35.727. 



     JIP-1 ist glycinreiches Protein (13%). IIP-1 enthält mehrere N-Myristoylierungsstellen,  PKC- und Ck2-Phosphorylierungsstellen und zwei putative Kernlokalisationssignale.  Eine zweite Isoform, IIP-1 (p26) mit 236 Aminosäuren Länge und mit  einem berechneten Molekulargewicht von 26.071 wurde ebenfalls identifiziert.  Dieses Produkt wurde wahrscheinlich durch alternatives Spleissen  (Fig. 3) erzeugt. Beide Isoformen binden an den IGF-1-Rezeptor. 



   Es wurden bereits cDNA-Sequenzen von IIP-1 veröffentlicht (EMBL-Datenbank-Zugriffsnummern  AF089818 und AF061263; DeVries, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.  USA 95 (1998) 12340-12345). Es wurden zwei überlappende cDNA-KIone  (Fig. 4) identifiziert, welche mit einer partiellen TIP-2-cDNA (GenBank-Zugriffsnummer  AF028824) (Rousset, R., et al., Oncogene 16 (1998) 643-654) starke  Homologie zeigten und als IIP-1a und IIP-1b bezeichnet wurden. Die  IIP-1a-cDNA entspricht den Nukleotidpositionen 117 bis 751 von TIP-2.  Die IIP-1b-cDNA zeigt neben TIP-2-Sequenzen (Nukleotidposition 1  bis 106) zusätzliche 5'-Sequenzen, welche zu der Sequenz Y2H35 in  WO 97/27296 (Nukleotide (nt) 25 bis 158) homolog sind. 



   IIP-1a und IIP-1b weisen beide die Sequenz auf, welche für die PDZ-Domäne  von TIP-2 codiert (Nukleotide 156 bis 410), welche bekanntlich eine  Domäne für eine Protein-Protein-Wechselwirkung ist (Ponting, CD.,  et al., BioEssays 19 (1997) 469-479). Die PDZ-Domäne wurde mithilfe  von Deletionsanalysen als die essentielle und ausreichende IGF-1-Rezeptorbindungsdomäne  von IIP-1 identifiziert (Fig. 4). 



   Weitere Hefen-Zweihybriden-Analysen offenbarten, dass die Bindung  von IIP-1-Protein an den IGF-1-Rezeptor spezifisch für diese Rezeptortyrosinkinase  ist. Man beobachtete keine Wechselwirkung mit dem Insulinrezeptor  oder Ros. Rezeptortyrosinkinasen anderer Familien binden nicht an  IIP-1 (z.B. Met, Ret, Kit, Fms, Neu, EGF-Rezeptor). Somit ist IIP-1    höchstwahrscheinlich das erste Bindungsprotein, für welches gezeigt  wurde, dass es für die IGF-1-Rezeptortyrosinkinase spezifisch ist.  IIP-1 bindet ebenfalls an die kinaseinaktive Mutante des IGF-1-Rezeptors.  IIP-2  



   IIP-2 wurde als neues Bindungsprotein für den cytoplasmatischen Teil  des IGF-1-Rezeptors identifiziert, welches dem humanen APS entspricht  (EMBL-Zugriffsnummer: HSAB520). APS war zuvor in einem Hefen-Zweihybriden-Screen-Experiment  isoliert worden, wobei die onkogene c-kit-Kinasedomäne als Köder  verwendet wurde (Yokouchi, M., et al., Oncogene 15 (1998) 7-15).  IIP-2 bindet an den IGF-1-Rezeptor auf kinaseabhängige Art und Weise.  Es wurde ebenfalls eine Bindung von IIP-2 an andere Mitglieder der  Insulinrezeptorfamilie beobachtet (Insulinrezeptor, Ros), aber nicht  an eine nicht verwandte Rezeptortyrosinkinase (Met). Die Region von  IIP-2, von der sich herausstellte, dass sie mit dem IGF-1-Rezeptor  wechselwirkt, entspricht dem humanen APS (Nukleotide 1126 bis 1674,  EMBL-Zugriffsnummer AB000520) und enthält die SH2-Domäne von APS  (Nukleotide 1249 bis 1545).  IIP-3  



   IIP-3 wurde als neues an den IGF-1-Rezeptor bindendes Protein isoliert  und ist mit PSM identisch (GenBank-Zugriffsnummer AF020526). PSM  ist als Signaltransduktionsprotein bekannt, welches PH- und SH2-Domänen  enthält und welches an den aktivierten Insulinrezeptor bindet (Riedel,  Hl., et al., Biochem. 122 (1997) 1105-1113). Es wurde ebenfalls eine  Variante von PSM beschrieben (Riedel, H., et al., J. Biochem. 122  (1997) 1105-1113). Die Bindung von IIP-3 an den IGF-1-Rezeptor ist  abhängig von einer Tyrosylphosphorylierung des Rezeptors. 



   Es wurde ein den Nukleotiden 1862 bis 2184 der Variante von PSM entsprechender  cDNA-Klon identifiziert. Es stellte sich heraus, dass der isolierte  cDNA-Klon für die IGF-1-Rezeptorbindungsregion codiert. Die    Sequenz  des isolierten cDNA-Teilklons von IIP-3 codiert für die SH2-Domäne  von PSM (Nukleotide 1864 bis 2148, EMBL-Zugriffsnummer AF020526).  IIP-4  



   IIP-4 wurde als neues mit der cytoplasmatischen Domäne des IGF-1-Rezeptors  wechselwirkendes Protein isoliert. IIP-4 entspricht p59fyn, einer  src-artigen Tyrosinkinase (EMBL-Zugriffsnummer MMU70324 und humanes  fyn EM_HUM1:HS66H14) (Cooke, M.P., und Perlmutter, R.M., New Biol.  1 (1989) 66-74). IIP-4 bindet auf kinaseabhängige Weise an den IGF-1-Rezeptor  und an mehrere weitere Rezeptortyrosinkinasen, wie auch an den Insulinrezeptor  und Met. Die an den IGF-1-Rezeptor (Nukleotide 665-1044) bindende  Region von IIP-4 enthält die SH2-Domäne von p59fyn (EMBL-Zugriffsnummer  U70324).  IIP-5  



   IIP-5 wurde als neues an den IGF-1-Rezeptor bindendes Protein isoliert.  IIP-5 zeigt eine starke Homologie mit dem Zinkfingerprotein Zfp38  (EMBL-Zugriffsnummer MMZFPTA) und ist mindestens 80% homolog zu dem  entsprechenden humanen Gen. Zfp-38 ist als Transkriptionsfaktor bekannt  (Chowdhury, K., et al., Mech. Dev. 39 (1992) 129-142). IIP-5 bindet  ausschliesslich an den aktivierten und phosphorylierten IGF-1-Rezeptor,  jedoch nicht an eine kinaseinaktive Mutante. Zusätzlich zur Bindung  von IIP-5 an den IGF-1-Rezeptor beobachtete man eine Wechselwirkung  von IIP-5 mit Rezeptortyrosinkinasen der Insulinrezeptorfamilie (Insulinrezeptor,  Ros). IIP-5 bindet nicht an die entfernter verwandte Rezeptortyrosinkinase  Met. 



   Es wurde ein cDNA-Klon isoliert, welcher an den IGF-1-Rezeptor bindet  und der für Nukleotide 756 bis 1194 von Zfp38 codiert (EMBL-Zugriffsnummer  MMZFPTA) und welcher den ersten Zinkfinger (Nukleotide 1075 bis 1158)  enthält. Diese Domäne ist ausreichend für eine Bindung an den aktivierten  IGF-1-Rezeptor.  IIP-6  



   IIP-6 wurde als neues an den IGF-1-Rezeptor bindendes Protein identifiziert.  IIP-6 zeigt eine schwache Ähnlichkeit mit der Zinkfinger-Domäne von  Zfp29 (EMBL-Zugriffsnummer MMZFP29). Zfp29 besteht aus einer N-terminalen  Transkriptionsaktivierungs-Domäne und 14 C-terminalen Cys<2>His<2>-Zinkfingern  (Denny P., und Ashworth A., Gene 106 (1991) 221-227). Die Bindung  von IIP-6 an den IGF-1-Rezeptor hängt von der Phosphorylierung der  IGF-1-Rezeptorkinase ab. IIP-6 bindet ebenfalls an den Insulinrezeptor,  jedoch nicht an Met. Die Region von IIP-6, welche an den IGF-1-Rezeptor  bindet (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4), enthält zwei Zinkfingerdomänen  des Typs Cys<2>His<2>.  IIP-7  



   IIP-7 wurde als neues an den IGF-1-Rezeptor bindendes Protein isoliert,  welches Pax-3 entspricht (EMBL-Zugriffsnummer MMPAX3R und humanes  Pax3 EM-HUM2:S69369). Pax-3 ist als DNA-bindendes Protein bekannt  und wird während der frühen Embryogenese exprimiert (Goulding, M.D.,  et al., EMBO J. 10 (1991) 1135-1147). IIP-7 bindet auf phosphorylierungsabhängige  Weise an den IGF-1-Rezeptor. IIP-7 bindet ebenfalls an den Insulinrezeptor  und an Met. Ein Teilklon der IIP-7-cDNA codiert für die IGF-1-Rezeptorbindungsdomäne  von Pax3 (Nukleotide 815 bis 1199, EMBL-Zugriffsnummer MMPAX3R).  Diese Region enthält das Octapeptid für die gepaarte Domäne von Pax3  (Pax3 paired domain) (Nukleotide 853 bis 876) und die Homöodomäne  des gepaarten Typs (paired-type homeo domain) (Nukleotide 952 bis  1134).  IIP-8  



   IIP-8 codiert für die vollständige cDNA von Grb7 (EMBL-Zugriffsnummer  MMGRB7P, humanes Grb7 EM-HUM1:AB008789). Grb7, ein eine PH-Domäne  und eine SH3-Domäne enthaltendes Signaltransduktionsprotein wurde  zuerst als EGF-Rezeptor-bindendes Protein veröffentlicht (Margolis,  B.L., et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 89 (1992) 8894-8898). IIP-8  bindet    nicht an die kinaseinaktive Mutante des IGF-1-Rezeptors.  Es wurde auch eine Bindung von IIP-8 an mehrere weitere Rezeptortyrosinkinasen  (z.B. den Insulinrezeptor, Ros und Met) beobachtet.  IIP-9                                                             



   IIP-9 wurde als neues an den IGF-1-Rezeptor bindendes Protein identifiziert.  IIP-9 ist identisch mit nck-beta (EMBL-Zugriffsnummer AF043260).  Nck ist ein cytoplasmatisches Signaltransduktionsprotein, welches  aus SH2- und SH3-Domänen besteht (Lehmann, J.M., et al., Nucleic  Acids Res. 18 (1990) 1048). Die Bindung von IIP-9 an den IGF-1-Rezeptor  ist phosphorylierungsabhängig. Nck bindet an die membranangrenzende  Region des IGF-1-Rezeptors. Ausser der Bindung von IIP-9 an den IGF-1-Rezeptor  beobachtete man eine Bindung an den Insulinrezeptor, aber nicht an  Ros oder Met. 



   Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sind Polypeptide, welche  mit den Polypeptiden der SEQ ID NO:6 (IIP-10) homolog, und stärker  bevorzugt im Wesentlichen identisch sind. Die Homologie kann unter  Verwendung des von Pearson, W.R., Methods in Enzymology 183 (1990)  63-68, Academic Press, San Diego, US beschriebenen FastA-Algorithmus  untersucht werden. "Im Wesentlichen identisch" bedeutet, dass die  Aminosäuresequenz sich nur durch konservative Aminosäuresubstitutionen  unterscheidet, beispielsweise durch Substitutionen einer Aminosäure  für eine andere derselben Klasse (z.B.

   Valin für Glycin, Arginin  für Lysin etc.), oder dass sie sich durch eine oder mehrere nicht-konservative  Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Insertionen unterscheidet,  die sich an Positionen der Aminosäuresequenz befinden, welche die  biologische Funktion des Polypeptids nicht zerstören. Dies umfasst  eine Substitution von alternativen kovalenten Peptidbindungen im  Polypeptid. "Polypeptid" bedeutet eine Kette von Aminosäuren, wobei  die Länge oder die posttranslationale Modifikation (z.B. Glykosylierung  oder Phosphorylierung)    nicht ausschlaggebend sind, und kann auch  durch den Begriff "Protein" ausgetauscht werden. 



   Erfindungsgemäss bedeutet ein "biologisches aktives Fragment" ein  Fragment, welches die physiologische Wirkung des vollständigen natürlich  vorkommenden Proteins ausüben kann (beispielsweise die Bindung an  sein biologisches Substrat, Verursachen einer Antigenantwort usw.).                                                            



   Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Fragmente des erfindungsgemässen  Polypeptids, welche antigen sind. Der Ausdruck "antigen", wie er  hierin verwendet wird, bezeichnet Fragmente des Proteins, welche  eine spezifische immunogene Antwort auslösen können, z.B. eine Immunantwort,  welche Antikörper hervorruft, die spezifisch an das erfindungsgemässe  Protein binden. Die Fragmente sind bevorzugt mindestens 8 Aminosäuren  lang, bevorzugt bis zu 25 Aminosäuren. In einer bevorzugten Ausführungsform  umfassen die Fragmente die Domäne, welche für die Bindung der IIPs  an den IGF-1-Rezeptor verantwortlich ist (d.h. die PDZ-Domäne von  IIP-1). "Domäne" bedeutet die Region von Aminosäuren in einem Protein,  welche direkt an der Bindung mit seinem Bindepartner beteiligt ist.

    PDZ-Domänen sind Repeats mit ungefähr 90 Resten und finden sich in  einer Anzahl von Proteinen, die möglicherweise in Ionen-, Tunnel-  und Rezeptor-Clustering und bei der Bindung von Rezeptoren an Effektorenzyme  eine Rolle spielen. Solche PDZ sind allgemein in Cabral, J.H., et  al., Nature 382 (1996) 649-652 beschrieben. 



   Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines  erfindungsgemässen Proteins, dessen Expression oder Aktivierung mit  der Tumorproliferation korreliert, wobei eine exogene DNA in prokaryontischen  oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert wird und das gewünschte  Protein isoliert wird, oder indem die exogene DNA in vivo für pharmazeutische  Mittel exprimiert wird, wobei das Protein bevorzugt von    einer  DNA-Sequenz, die für IIP-10 codiert, codiert wird. Bevorzugt handelt  es sich dabei um die in SEQ ID NO:5 dargestellte DNA-Sequenz. 



   Die erfindungsgemässen Polypeptide können auch auf rekombinante Art  und Weise oder synthetisch hergestellt werden. Ein nicht-glykosyliertes  IIP-10-Polypeptid wird erhalten, wenn es rekombinant in Prokaryonten  erzeugt wird. Mithilfe der durch die Erfindung bereitgestellten Nukleinsäuresequenzen  ist es möglich, in Genomen jedweder gewünschten Zelle nach dem IIP-10-Gen  oder seinen Varianten zu suchen (z.B. ausser in humanen Zellen auch  in Zellen anderer Säugetiere), um diese zu identifizieren und das  erwünschte für das IIP-10-Protein codierende Gen zu isolieren. Solche  Verfahren und geeignete Hybridisierungsbedingungen (siehe oben, "stringente  Bedingungen") sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise  bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)  cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, und bei Harnes,  B.

   D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach  (1985) IRL Press, Oxford, England, beschrieben. In diesem Fall werden  im Allgemeinen für die Experimente die in diesen Publikationen beschriebenen  Standardprotokolle verwendet. 



   Die Verwendung gentechnologischer Methoden ermöglicht die Herstellung  von vielen aktiven IIP-10-Derivaten. Solche Derivate können beispielsweise  an einzelnen oder mehreren Aminosäuren modifiziert sein, beispielsweise  durch Substitution, Deletion oder Addition. Die Derivatisierung kann  beispielsweise mithilfe von ortsspezifischer Mutagenese durchgeführt  werden. Solche Variationen können vom Fachmann auf dem Gebiet leicht  durchgeführt werden (J. Sambrook, B.D. Harnes, supra). Es muss lediglich  mithilfe des unten erwähnten Inhibitionsassays für Tumorzellwachstum  sichergestellt werden, dass die charakteristischen Eigenschaften  von IIP-10 erhalten bleiben. 



     Mithilfe solcher für ein IIP-10 Protein codierende Nukleinsäuren  kann das erfindungsgemässe Protein auf reproduzierbare Art und Weise  und in grossen Mengen erhalten werden. Für die Expression in prokaryontischen  oder eukaryontischen Organismen, wie etwa prokaryontischen Wirtszellen  oder eukaryontischen Wirtszellen, wird die Nukleinsäure in geeignete  Expressionsvektoren integriert, wobei der Fachmann auf dem Gebiet  mit solchen Methoden vertraut ist. Ein solches Expressionsvektor  enthält bevorzugt einen regulierbaren/induzierbaren Promotor. Diese  rekombinanten Vektoren werden dann für die Expression in geeignete  Wirtszellen eingebracht, beispielsweise E.coli als prokaryontische  Wirtszelle oder Saccharomyces cerevisiae, die Teratokarzinomzelllinie  PA-1 sc 9117 (Büttner et al., Mol. Cell.

   Biol. 11 (1991) 3573-3583),  Insektenzellen, CHO- oder COS-Zellen als eukaryontische Wirtszellen.  Die transformierten oder transduzierten Wirtszellen werden unter  Bedingungen kultiviert, welche die Expression des heterologen Gens  erlauben. Die Isolierung des Proteins aus der Wirtszelle oder aus  dem Kulturüberstand der Wirtszelle kann nach bekannten Verfahren  durchgeführt werden. Solche Verfahren sind beispielsweise bei Ausubel  I., Frederick M., Current Protocols in Molecular Biology (1992),  John Wiley and Sons, New York, beschrieben. Es kann auch eine In-vitro-Reaktivierung  des Proteins notwendig sein, wenn es sich in der Zellkultur nicht  in löslicher Form befindet. 



   Die Erfindung betrifft daher auch ein IIP-Polypeptid, welches das  Produkt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Expression einer  exogenen DNA ist. 



   Das Protein kann aus den Zellen oder dem Kulturüberstand isoliert  werden und mithilfe von chromatografischen Verfahren, bevorzugt durch  lonenaustauschchromatografie, Affinitätschromatografie und/oder Reverse-Phase-HPLC  aufgereinigt werden. 



     IIP-10 kann nach der rekombinanten Produktion mithilfe von Affinitätschromatografie  unter Verwendung von bekannten Protein-Aufreinigungs-Techniken, einschliesslich  Immunopräzipitation, Gelfiltration, lonenaustauschchromatografie,  Chromatofokussierung, isoelektrischer Fokussierung, selektiver Präzipitation,  Elektrophorese oder dgl. erhalten werden.  Diagnostische Verfahren:  



   Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren für die Detektion eines  für ein IIP-Gen codierenden Nukleinsäuremoleküls, umfassend Inkubieren  einer Probe (beispielsweise Körperflüssigkeiten, wie etwa Blut, Zellysate)  mit einem erfindungsgemässen Nukleinsäuremolekül und Bestimmen der  Hybridisierung des Nukleinsäuremoleküls mit einem Zielnukleinsäuremolekül  unter stringenten Bedingungen zur Bestimmung des Vorhandenseins eines  Nukleinsäuremoleküls, welches das IIP-Gen ist. Somit betrifft die  Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung der IGF-1R-Aktivierung  oder -Inhibition in Säugerzellen oder Körperflüssigkeiten. 



   Daher umfasst die Erfindung ebenfalls ein Verfahren für die Detektion  des Proliferationspotenzials einer Tumorzelle, umfassend a) Inkubieren  einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Patienten, der unter Krebs  leidet, einer Probe von Krebszellen oder einer Probe eines Zellextrakts  oder eines Zellkulturüberstands der Krebszellen, worin die Probe  Nukleinsäuren enthält, mit einer Nukleinsäuresonde, die ausgewählt  ist aus der Gruppe bestehend aus (i) die in SEQ ID NO:1, 3 oder  5 dargestellten Nukleinsäuren oder dazu komplementären Nukleinsäuren  und (ii) Nukleinsäuren, welche unter stringenten Bedingungen mit  einer der Nukleinsäuren aus (i) hybridisieren und 



     b) Detektieren der Hybridisierung mithilfe eines weiteren Bindungspartners  der Nukleinsäure der Probe und/oder der Nukleinsäuresonde oder mithilfe  von Röntgen-Radiografie. 



   Die Hybridisierung zwischen der Sonde und Nukleinsäuren aus der Probe  zeigt das Vorhandensein der RNA solcher Proteine an. Solche Verfahren  sind dem Fachmann bekannt und sind beispielsweise in WO 89/06698,  EP-A 0 200 362, USP 2 915 082, EP-A 0 063 879, EP-A 0 173 251, EP-A  0 128 018 beschrieben. 



   In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die codierende  Nukleinsäure der Probe vor dem Test amplifiziert, beispielsweise  mithilfe der bekannten PCR-Technik. Im Allgemeinen wird im Rahmen  der Nukleinsäurediagnostik eine derivatisierte (markierte) Nukleinsäuresonde  verwendet. Diese Sonde wird mit einer denaturierten DNA oder RNA  aus der Probe, welche an einen Träger gebunden ist, in Kontakt gebracht,  und es werden die Temperatur, die lonenstärke, der pH-Wert und andere  Puffer-Bedingungen in diesem Verfahren so ausgewählt - je nach der  Länge und Zusammensetzung der Nukleinsäuresonde und der resultierenden  Schmelztemperatur des erwarteten Hybrids - dass die markierte DNA  oder RNA an die homologe DNA oder RNA binden kann (zur Hybridisierung  siehe auch Wahl, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 76 (1979)  3683-3687).

   Geeignete Träger sind Membranen oder Trägermaterialien  auf Nitrocellulosebasis (z.B. Schleicher und Schüll, BA 85, Amersham  Hybond, C.), verstärkte oder gebundene Nitrocellulose in Pulverform  oder Nylonmembranen, die mit verschiedenen funktionellen Gruppen  derivatisiert sind (z.B. Nitrogruppen) (z.B Schleicher und Schüll,  Nytran; NEN, Gene Screen; Amersham Hybond M.; Pall Biodyne). 



   Die Hybridisierung von DNA oder RNA wird dann durch Inkubieren des  Trägers mit einem Antikörper oder einem Antikörperfragment detektiert,    nachdem zuvor ausgiebig gewaschen und gesättigt wurde, um unspezifische  Bindungen zu vermeiden. 



   Der Antikörper oder das Antikörperfragment ist gegen die Substanz  gerichtet, die während der Derivatisierung in die Nukleinsäuresonde  eingebracht wurde. Der Antikörper ist ebenfalls wiederum markiert.  Es ist jedoch auch möglich, eine direkt markierte DNA zu verwenden.  Nach der Inkubation mit den Antikörpern werden wieder Waschschritte  vorgenommen, um lediglich spezifisch gebundene Antikörperkonjugate  zu detektieren. Die Bestimmung wird dann nach bekannten Verfahren  mithilfe der Markierung auf dem Antikörper oder dem Antikörperfragment  durchgeführt. 



   Die Detektion der Expression kann beispielsweise wie folgt durchgeführt  werden: - in situ-Hybridisierung mit fixierten ganzen Zellen, mit  fixierten Gewebeabstrichen und isolierten Metaphasechromosomen,  - Koloniehybridisierung (Zellen) und Plaquehybridisierung (Phagen  und Viren), - Southern-Hybridisierung (DNA-Detektion), - Northern-Hybridisierung  (RNA-Detektion), - Serumanalyse (z.B. Zelltypanalyse von Zellen  im Serum durch Slot-Blot-Analyse), - nach der Amplifikation (z.B.  PCR-Technik). 



   Die Nukleinsäuresonde wird bevorzugt mit der Nukleinsäure der Probe  inkubiert, und die Hybridisierung wird gegebenenfalls mithilfe eines  weiteren Bindungspartners für die Nukleinsäure in der Probe und/oder  die Nukleinsäuresonde detektiert. 



     Die Nukleinsäuren gemäss der vorliegenden Erfindung sind somit  wertvolle prognostische Marker bei der Diagnose des metastatischen  und Progressionspotenzials von Tumorzellen eines Patienten.   Screening für Antagonisten und Agonisten von IIPs oder Inhibitoren  



   Gemäss der Erfindung können Antagonisten von IIP-10 oder Inhibitoren  der Expression von IIP (z.B. Antisense-Nukleinsäuren) verwendet werden,  um die Tumorprogression zu hemmen und um massive Apoptose von Tumorzellen  in vivo zu verursachen, bevorzugt mithilfe von somatischer Gentherapie.                                                        



   Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zum Screenen  für potenzielle Therapeutika für Krebs, Diabetes, neurodegenerative  Krankheiten, Knochenkrankheiten. Sie betrifft auch Verfahren für  die Behandlung von Krankheiten sowie Zelllinien und Tiermodelle,  die für das Screenen und die Beurteilung von potentiell nützlichen  Therapien solcher Krankheiten geeignet sind. Es war daher eine weitere  Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen  bereitzustellen, welche bei der Behandlung der erwähnten Krankheiten  und verwandten Krankheiten von Nutzen sind.

   Diese Verfahren umfassen  Verfahren zur Modulierung der Expression der erfindungsgemässen Polypeptide,  Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche selektiv an  die erfindungsgemässen Proteine binden können, und Verfahren zur  Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität der Polypeptide  modulieren können. Diese Verfahren können in vitro und in vivo durchgeführt  werden und können die erfindungsgemässen transformierten Zelllinien  und transgenen Tiermodelle zum Einsatz kommen lassen. 



   Ein Antagonist von IIPs oder ein Inhibitor von IIP wird als Substanz  oder Verbindung definiert, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R  und IIP, bevorzugt IIP-10, hemmt. Daher nimmt die biologische Aktivität  des IGF-1R    in Gegenwart einer solchen Verbindung ab. Im Allgemeinen  beinhalten Screeningverfahren für IIP-Antagonisten das In-Kontakt-Bringen  von möglichen Substanzen mit IIP-enthaltenden Wirtszellen unter eine  Bindung begünstigenden Bedingungen, und Messen des Ausmasses der  abnehmenden Rezeptor-vermittelten Signalübertragung (im Fall eines  Antagonisten). Ein solcher Antagonist ist als pharmazeutisches Mittel  für den Einsatz in der Tumortherapie geeignet. Für die Behandlung  von Dia-betes, neuronalen Krankheiten oder Knochenkrankheiten ist  eine Stimulierung des Signalübertragungsweges erforderlich, d.h.

    das Screening für Agonisten ist hier nützlich. 



   Die IIP-Aktivierung kann auf verschiedene Art und Weise gemessen  werden. Im Allgemeinen zeigt sich die Aktivierung durch eine Veränderung  in der Zellphysiologie, beispielsweise durch eine Zunahme oder Abnahme  der Wachstumsrate oder durch eine Veränderung im Differenzierungsstadium  oder durch eine Veränderung des Zellmetabolismus, welcher mit Standard-Zell-Assays,  z.B. MTT- oder XTT-Assays (Roche Diagnostics GmbH, DE) detektiert  werden kann. 



   Die erfindungsgemässen Nukleinsäuren und Proteine könnten daher zur  Identifizierung und Entwicklung von Arzneimitteln verwendet werden,  welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und IIPs stören. Beispielsweise  könnte ein Mittel, welches an eines der Proteine bindet, bevorzugt  dieses Protein binden, anstatt eine Bindung mit seinem natürlichen  Bindepartner zu erlauben. Jedes Mittel, welches an den IGF-1-Rezeptor  binden kann und daher die Bindung eines IIPs verhindern kann, oder  umgekehrt an ein IIP bindet und dadurch die Bindung an den IGF-1-Rezeptor  verhindern kann, wäre denkbar. In beiden Fällen würde eine Signaltransduktion  des IGF-1-Rezeptorsystems moduliert (bevorzugt inhibiert).

   Das Screening  für Substanzen mit dieser Fähigkeit geschieht durch Aufstellen eines  Kompetitionsassays (Assay ist Standard im Stand der Technik) zwischen  der Testverbindung und der Wechselwirkung mit IIP und    dem IGF-1-Rezeptor  unter Verwendung von aufgereinigtem Protein oder Fragmenten mit denselben  Eigenschaften wie die Bindungspartner. 



   Das erfindungsgemässe Protein ist geeignet für die Verwendung in  einem Assayverfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche  die Aktivität der erfindungsgemässen Proteine modulieren. Die hier  beschriebene Modulierung der Aktivität umfasst die Inhibition oder  Aktivierung des Proteins und umfasst die direkte oder indirekte Beeinflussung  der normalen Regulierung der Proteinaktivität. Verbindungen, welche  die Proteinaktivität modulieren, umfassen Agonisten, Antagonisten  und Verbindungen, welche einen direkten oder indirekten Einfluss  auf die Regulierung der Aktivität des erfindungsgemässen Proteins  ausüben. Das erfindungsgemässe Protein kann sowohl aus nativen und  rekombinanten Quellen zur Verwendung in einem Assay-Verfahren zur  Identifizierung von Modulatoren erhalten werden.

   Im Allgemeinen enthält  ein Assay-Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren den IGF-Rezeptor,  ein Protein der vorliegenden Erfindung und eine Testverbindung oder  eine Probe, welche einen putativen Modulator der besagten Proteinaktivität  enthält. Die Testverbindungen oder Proben können direkt auf beispielsweise  aufgereinigtem erfindungsgemässem Protein getestet werden, wobei  es gleich ist, ob dieses nativ oder rekombinant ist. Weiterhin können  sie auf subzellulären Fraktionen von Zellen, welches das Protein,  welches wiederum nativ oder rekombinant sein kann, produzieren, und/oder  auf ganzen Zellen, die das Protein in nativer oder rekombinanter  Form exprimieren, getestet werden. Die Testverbindung oder die Probe  kann dem erfindungsgemässen Protein in Gegenwart oder Abwesenheit  von bekannten Modulatoren des Proteins zugefügt werden.

   Die Modulierungsaktivität  der Testverbindung oder der Probe kann beispielsweise durch Analyse  der Fähigkeit der Testverbindung oder der Probe, an das Protein zu  binden, das Protein zu aktivieren, seine Aktivität zu inhibieren,  die Bindung von anderen Verbindungen an das Protein zu inhibieren  oder zu verstärken, die Rezeptorregulierung zu modifizieren oder  die intrazelluläre Aktivität zu modifizieren, bestimmt werden. 



     Die Identifizierung von Modulatoren der Proteinaktivität ist nützlich  für die Behandlung von Krankheitszuständen, bei denen die Proteinaktivität  eine Rolle spielt. Weitere Verbindungen können zur Stimulierung oder  Inhibition der Aktivität des erfindungsgemässen Proteins nützlich  sein. Solche Verbindungen könnten für die Behandlung von Krankheiten  eingesetzt werden, bei denen die Aktivierung oder Inaktivierung des  erfindungsgemässen Proteins zu einer Zellproliferation, Zelltod,  Nichtproliferation, Induktion von zellulären neoplastischen Transformationen  oder metastatischem Tumorwachstum führt, und könnten somit für die  Prävention und/oder Behandlung von Krebskrankheiten, wie etwa z.B.  Prostata- und Brustkrebs, verwendet werden.

   Die Isolierung und Aufreinigung  eines für das erfindungsgemässe Protein codierenden DNA-Moleküls  wäre geeignet zur Bestimmung der Gewebeverteilung der Proteine sowie  für die Entwicklung eines Verfahrens zur Identifizierung von Verbindungen,  welche die Aktivität des Proteins und/oder seine Expression modulieren.                                                        



   Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher ein Verfahren  zum Screenen einer Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen  IGF-1R und IIP-1 oder IIP-10 inhibiert, umfassend a) In-Kontakt-Bringen  von IGF-1R und eines IIP-1- oder IIP-10-Polypeptids mit einer Lösung,  die eine in Frage kommende Verbindung enthält, sodass der IGF-1R  und das IIP-1- oder IIP-10-Polypeptid in der Lage sind, einen Komplex  zu bilden, und b) Bestimmen der Menge an Komplexen in Bezug auf  das vorbestimmte Ausmass an Bindung in Abwesenheit der in Frage kommenden  Verbindung und daraus Bewerten der Fähigkeit der in Frage kommenden  Verbindung, die Bindung zwischen dem IGF-1 R und dem IIP-1 oder IIP-10  Polypeptid zu hemmen. 



     Ein solcher Screening-Assay wird bevorzugt als ELISA-Assay durchgeführt,  wobei der IGF-1R oder IIP-1 oder IIP-10 an eine feste Phase gebunden  sind. 



   Eine weitere Ausführung der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren  zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung von  Karzinomen in einem Patienten, umfassend Kombinieren einer therapeutisch  wirksamen Menge einer Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen  IGF-1R und IIP in biochemischen und/oder zellulären Assays mindestens  bis zu 50% inhibiert. Biochemische Assays basieren bevorzugt auf  ELISA-Assays oder homogenen Assays. Im Falle des ELISA-Systems werden  zur Detektion der Komplexe Antikörper verwendet, die spezifisch für  die beiden Bindungspartner sind. Im Falle des homogenen Assays wird  mindestens ein Bindungspartner mit Fluorophoren markiert, wodurch  die Analyse der Komplexe ermöglicht wird.

   Zelluläre Assays sind bevorzugt  Tests, in denen Tumorzellen oder mit den Expressionskonstrukten des  IGF-1R und der jeweiligen Bindungsproteine transfiziert wurden, mit  oder ohne Substanzen behandelt werden und die Komplexbildung zwischen  den beiden Komponenten unter Verwendung von Standard-Zellassays analysiert  wird. 



   Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur  Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung von Karzinomen  in einem Patienten, umfassend In-Kontakt-Bringen eines pharmazeutisch  annehmbaren Trägers mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer  Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und IIP-1 oder  IIP-10 in einem zellulären Assay inhibiert, wobei in dem zellulären  Assay Tumorzellen oder mit Expressionskonstrukten des IGF-1R und  der jeweiligen IIPs transfizierte Zellen mit der Verbindung behandelt  werden und die Komplexbildung zwischen IGF-1R und dem jeweiligen  IIP analysiert wird, und das Ausmass der Komplexbildung im Fall einer  Inhibition 50% nicht übersteigt, wobei man für die Komplexbildung  ohne die Verbindung im selben zellulären Assay 100% annimmt. 



     Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur  Behandlung eines Patienten, der unter einem Karzinom leidet, mit  einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, welche die  Wechselwirkung zwischen IGF-1R und IIP-1 oder IIP-10 in einem zellulären  Assay inhibiert, wobei in dem zellulären Assay Tumorzellen oder mit  Expressionskonstrukten des IGF-1R und des jeweiligen IIPs transfizierte  Zellen mit der Verbindung behandelt werden und eine Komplexbildung  zwischen 1GF-1R und dem jeweiligen IIP analysiert wird und das Ausmass  der Komplexbildung im Fall einer Inhibition 50% nicht übersteigt,  bezogen auf 100% für die Komplexbildung ohne die Verbindung im selben  zellulären Assay. 



   Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Antikörper gegen  erfindungsgemässes IIP-1 oder IIP-10. 



   Antikörper wurden aus humanen, Mäuse- oder Rattenpolypeptiden erzeugt.  Durch die Erfindung mit umfasst sind Antikörper, welche IIP-1 oder  IIP-10 spezifisch erkennen. Solche Antikörper werden unter Verwendung  von standardmässigen immunologischen Techniken hergestellt. Die Antikörper  können polyklonal oder monoklonal sein und können auch rekombinant  hergestellt werden, wie z.B. für einen humanisierten Antikörper.  Ein Antikörperfragment, welches die Fähigkeit zur Wechselwirkung  mit IIP-1 oder IIP-10 beibehält, wird ebenfalls durch die vorliegende  Erfindung bereitgestellt. Ein solches Fragment kann durch die proteolytische  Spaltung eines vollständigen Antikörpers oder auf gentechnologische  Weise hergestellt werden. Erfindungsgemässe Antikörper sind geeignet  für diagnostische und therapeutische Anwendungen.

   Sie werden zur  Detektion und Quantifizierung von IIP-1 oder IIP-10 in biologischen  Proben, insbesondere in Gewebeproben und Körperflüssigkeiten verwendet.  Sie werden ebenfalls zur Modulierung der Aktivität von IIP-1 oder  IIP-10 eingesetzt, indem sie entweder als Agonist oder Antagonist  fungieren. 



     Die folgenden Beispiele, Verweise, Sequenzprotokolle und Zeichnungen  sollen dem Verständnis der vorliegenden Erfindung dienen, deren Schutzumfang  durch die zugehörigen Ansprüche dargestellt ist. Es versteht sich  von selbst, dass in den hier beschriebenen Verfahren Modifizierungen  vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.   Beschreibung der Figuren und Sequenzen        Fig.  1 Domänenstruktur von Hefen-Zweihybriden-Ködern, die für das Screening  von cDNA-Bibliotheken verwendet wurden, um cytoplasmatische Bindungsproteine  des IGF-1-Rezeptors zu finden.

   Die -LexA-DNA-Bindungsdomäne wurde  mit der cytoplasmatischen (cp) Domäne (Nukleotide 2923 bis 4154)  des Wildtyp-IGF-1-Rezeptors (a) oder der kinaseinaktiven Mutante  (K/A-Mutation an Aminosäureposition 1003) (b) (Ullrich, A., et al.,  EMBO J. 5 (1986) 2503-2512; Weidner, M., et al., Nature 384 (1996)  173-176) fusioniert. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von zwei  verschiedenen zwischen die LexA-DNA-Bindungsdomäne und die Rezeptordomäne  inserierten Linkern ist unten gezeigt. Die I1-(Wildtyp-IGF-1-Rezeptor)  und K1- (kinaseinaktive Mutante des IGF-1-Rezeptors) Konstrukte enthalten  ein zusätzliches Prolin und Glycin im Vergleich zu den I2- und K2-Konstrukten.     Fig. 2 Modifizierung des Hefen-Zweihybriden-LexA/IGF-1-Rezeptor-Köderkonstrukts.  a) Schmeatische Darstellung der cytoplasmatischen Bindungsstellen  des IGF-1-Rezeptors.

   Die  alpha -Untereinheiten des IGF-1-Rezeptors  sind über Disulfidbindungen mit den  beta -Ketten verbunden. Der  cytoplasmatische Teil der  beta -Kette enthält   Bindungsstellen  für Substrate in der membranangrenzenden Region und der C-terminalen  Domäne. b) Domänenstruktur des Zweihybriden-Köders, die lediglich  die membranangrenzenden IGF-1-Rezeptorbindungsstellen enthält. Die  membranangrenzende Domäne des IGF-1-Rezeptors (Nukleotide 2923 bis  3051) (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512) wurde mit  der Kinasedomäne von tprmet (Nukleotide 3456 bis 4229) (GenBank-Zugriffsnummer  HSU19348) fusioniert. c) Die Domänenstruktur des Zweihybriden-Köders,  der lediglich die C-terminalen IGF-1-Rezeptorbindungsstellen enthält.

    Die C-terminale Domäne des IGF-1-Rezeptors (Nukleotide 3823 bis 4149)  (Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512) wurde mit der Kinasedomäne  von tprmet (Nukleotide 3456 bis 4229) (GenBank-Zugriffsnummer HSU  19348) fusioniert.     Fig. 3 Isoformen von IIP-1. a) Darstellung  der cDNA-Sequenzen von IIP-1 und IIP-1 (p26). Die Nukleotide sind  oben nummeriert. Die potenzielle Translationsstartstelle innerhalb  der IIP-1-cDNA befindet sich an Position 63. Das erste ATG als potenzielle  Translationsstartstelle in der alternativen Spleissvariante IIP-1  (p26) befindet sich an Position 353. Beide cDNAs enthalten ein Stopcodon  an Position 1062. b) Domänenstruktur von IIP-1 und IIP-1 (p26).  Die Aminosäurepositionen sind oben angezeigt. Im Vergleich zu IIP-1  (p26) enthält IIP-1 zusätzliche 97 Aminosäuren am N-Terminus.

   Beide  Isoformen von IIP-1 enthalten eine PDZ-Domäne, welche sich in der  Region zwischen Aminosäuren 129 und 213 befindet.     Fig. 4 Darstellung  der IGF-1-Rezeptorbindungsdomäne von IIP-1.   Es wurden vollständiges  IIP-1, seine cDNA-Teilklone (IIP-1a und IIP-1b) sowie Deletionsmutanten  (IIP-1a/mu1, IIP-1a/mu2, IIP-1a/mu3, IIP-1 b/mu1) auf eine Wechselwirkung  mit dem IGF-1-Rezeptor im Hefen-Zweihybridensystem untersucht. Hefezellen  wurden mit einem LexA-IGF-1-Rezeptor-Fusionskonstrukt und einem Aktivierungsplasmid,  welches für mit der VP16-Aktivierungs-Domäne fusioniertes IIP-1 oder  verschiedene IIP-1-Mutanten codiert, kotransfiziert.

   Die Bindung  zwischen IIP-1 oder seinen Mutanten und dem IGF-1-Rezeptor wurde  durch Überwachung des Wachstums von Hefetransfektanten analysiert,  die auf Histidin-defizientes Medium plattiert worden und für 6 Tage  bei 30 DEG C inkubiert worden waren (Durchmesser der Hefekolonien:  + + +, > 1 mm in 2 Tagen, + +, > 1 mm in 4 Tagen; +, > 1  mm in 6 Tagen; -, kein Wachstum detektiert). Die PDZ-Domäne kann  als essentiell und ausreichend für das Zu-Stande-Kommen einer Bindung  an den IGF-1-Rezeptor definiert werden. Die Nukleotidpositionen bezüglich  des vollständigen IIP-1 sind oben angezeigt.     Fig. 5 Proteinsequenzmotive  von IIP-10.

       Die Aminosäuresequenz von IIP-10 wurde unter Verwendung  des Computerprogramms "Motifs" analysiert, welches nach Proteinmotiven  sucht, indem es nach im PROSITE Dictionary beschriebenen Proteinsequenzen  für reguläre Expressionsmuster sucht.  



    <tb><TABLE> Columns = 2  <tb><SEP> SEQ ID NO:1<SEP> Nukleotidsequenz  von IIP-1 (cDNA). <tb><SEP> SEQ ID NO:2<SEP> Erwartete Aminosäuresequenz  von IIP-1. <tb><SEP> SEQ ID NO:3<SEP> Nukleotidsequenz des partiellen  cDNA-Klons von IIP-6. <tb><SEP> SEQ ID NO:4<SEP> Abgeleitete Aminosäuresequenz  des partiellen cDNA-Klons von IIP-6. Cystein- und Histidinreste der  zwei Cys 2 His 2 -Zinkfingerdomänen sind die Aminosäuren 72, 75,  88, 92, 100, 103, 116 und 120. <tb><SEP> SEQ ID NO:5<SEP> Nukleotidsequenz  von IIP-10 (cDNA). <tb><SEP> SEQ ID NO:6<SEP> Abgeleitete Aminosäuresequenz  von IIP-10. <tb><SEP> SEQ ID NO:7<SEP> Primer TIP2c-s. <tb><SEP>  SEQ ID NO:8<SEP> Primer TIP2b-r. <tb><SEP> SEQ ID NO:9<SEP> Primer  Hcthy-s. <tb><SEP> SEQ ID NO:10<SEP> Primer Hcthy-r.  <tb></TABLE>  Beispiel 1   Isolierung und Charakterisierung von IGF-1R-Bindeproteinen  



   Es wurde das Hefen-Zweihybridensystem (Fields, S., und Song, O.,  Nature 340 (1989) 245-246) verwendet, um unbekannte cytosolische  IGF-1-Rezeptorbindeproteine zu isolieren. Für das Screening wurde  eine modifizierte Version des Hefen-Zweihybridensystems verwendet,  welche in der Hefe eine Tyrosylphosphorylierung der Rezeptoren zwischen  den Ketten (interchain tyrosyl phosphorylation) erlaubt. 



   Das Hefen-Zweihybriden-Köderplasmid (BTM116-cplGF-1-Rezeptor) wurde  durch Fusion der cytoplasmatischen Domäne der  beta -Untereinheit  des IGF-1-Rezeptors (Nukleotide 2923 bis 4154) (Ullrich, A., et al.,  EMBO J. 5 (1986) 2503-2512) mit der LexA-DNA-Bindedomäne fusioniert,  welche Dimere bildet und die Situation des aktivierten Wildtyprezeptors  nachahmt (siehe    Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176).  Durch Einführung eines Prolin-Glycin-Spacers zwischen die LexA-DNA-Bindedomäne  und die Rezeptordomäne wurde die Fähigkeit des Köders, bekannte Substrate  des IGF-1-Rezeptors zu binden, bemerkenswert erhöht im Vergleich  mit anderen Spaceraminosäuren (Fig. 1). 



   Alternativ hierzu wurde ein Köder konstruiert, der nur die membranangrenzende  oder C-terminale Region des IGF-1-Rezeptors enthält (Nukleotide 2923  bis 3051 oder Nukleotide 3823 bis 4146) (Ullrich, A., et al., EMBO  J. 5 (1986) 2503-2512) fusioniert mit der Kinasedomäne einer nicht  verwandten, sehr potenziellen Rezeptortyrosinkinase. Es wurde hier  die Kinasedomäne von tpr met (Nukleotide 3456 bis 4229) (GenBank-Zugriffsnummer  HSU19348) (Fig. 2) verwendet. Somit war es möglich, die Region des  IGF-1-Rezeptors, welche die Bindung an Downstream-Effektoren steuert,  darzustellen. 



   Das IGF-1-Rezeptorköderplasmid wurde verwendet, um cDNA-Bibliotheken  auf Aktivierungsdomänen zu screenen (z.B. Aktivierungsdomänen auf  VP16- oder Gal4-Basis) (siehe Weidner, M., et al., Nature 384 (1996)  173-176). Die Köder- und Beuteplasmide wurden in den Saccaromyces  cerevisiae-Stamm L40 cotransfiziert, welcher ein His3- und lacZ-Reportergen  enthält. Bibliothekenplasmide wurden aus in Histidin-defizientem  Medium wachsenden Hefekolonien isoliert, sequenziert und wieder in  den Hefestamm 1140 eingebracht. Mithilfe von Cotransfektionsexperimenten  mit verschiedenen Testködern, d.h.

   BTM116-Plasmiden, die für eine  kinaseinaktive Mutante des IGF-1-Rezeptors (L1033A) oder für die  cytoplasmatische Domäne von Rezeptortyrosinkinasen der Insulinrezeptorfamilie  (Insulinrezeptor, Ros) und für nicht verwandte Rezeptortyrosinkinasenfamilien  (Met, EGF-Rezeptor, Kit, Fms, Neu) codieren, wurde die Spezifität  der putativen Wechselwirkungen zwischen Köder und Beute ausgewertet.  Es wurden mehrere cDNAs identifiziert, welche für zuvor unbekannte  an den IGF-1-Rezeptor-bindende Proteine (IIPs)    codieren. Zusätzlich  wurden Bindungsdomänen von bekannten Substraten des IGF-1-Rezeptors  gefunden, wie etwa die C-terminale SH2-Domäne von p85PI3K und die  SH2-Domäne von Grb10. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.   Tabelle 1  



    <tb><TABLE> Columns = 6  <tb>Head Col 1: IIP <tb>Head Col 2:  wt IGF-1R <tb>Head Col 3: mu IGF-1R <tb>Head Col 4: IR <tb>Head  Col 5: Ros <tb>Head Col 6: Met <tb><SEP> IIP-1<SEP> +<SEP> +<SEP>  -<SEP> -<SEP> - <tb><SEP> IIP-2<SEP> +<SEP> -<SEP> +<SEP> +<SEP>  - <tb><SEP> IIP-3<SEP> +<SEP> -<SEP> +<SEP> +<SEP> + <tb><SEP>  IIP-4<SEP> +<SEP> -<SEP> +<SEP> nd<SEP> + <tb><SEP> IIP-5<SEP> +<SEP>  -<SEP> +<SEP> +<SEP> - <tb><SEP> IIP-6<SEP> +<SEP> -<SEP> +<SEP>  nd<SEP> - <tb><SEP> IIP-7<SEP> +<SEP> -<SEP> +<SEP> nd<SEP> + <tb><SEP>  IIP-8<SEP> +<SEP> -<SEP> +<SEP> +<SEP> + <tb><SEP> IIP-9<SEP> +<SEP>  -<SEP> +<SEP> -<SEP> - <tb><SEP> IIP-10<SEP> +<SEP> -<SEP> -<SEP>  nd<SEP> nd  <tb></TABLE> 



   Darstellung der Bindungsspezifizität der IIPs bezüglich verschiedener  Rezeptortyrosinkinasen, die im Hefen-Zweihybridensystem getestet  wurden. Hefezellen wurden mit einem LexA-Fusionskonstrukt, welches  für verschiedene Rezeptortyrosinkinasen codiert, und einem Aktivierungsplasmid,  welches für verschiedene IIPs codiert, die mit der    VP16-Aktivierungsdomäne  fusioniert sind, cotransfiziert.

   Die Wechselwirkung zwischen den  IIPs und den verschiedenen Rezeptortyrosinkinasen wurde durch Überwachung  des Wachstums von Hefetransfektanten analysiert, die auf Histidin-defizientem  Medium plattiert wurden und für 3 Tage bei 30 DEG C inkubiert wurden  (wt IGF-1R: kinaseaktiver IGF-1-Rezeptor, mu IGF-1R: kinaseinaktive  Mutante des IGF-1-Rezeptors, IR: Insulinrezeptor, Ros: Ros-Rezeptortyrosinkinase,  Met: Met-Rezeptortyrosinkinase; +, Wachstum von Hefetransfektanten  innerhalb von 3 Tagen auf > 1 mm Durchmesser; -, kein Wachstum  nachgewiesen, nd, nicht bestimmt).   Beispiel 2    Assaysysteme:   A) In vitro/biochemische Assays: Assay auf ELISA-Basis/homogener  Assay  



   IGF-1R und die Bindungsproteine (IIPs) werden mit oder ohne Tag-Enzyme  in E.coli oder eukaryontischen Zellen exprimiert und bis zur Homogenität  aufgereinigt. Die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und den jeweiligen  Bindungsproteinen wird in Gegenwart oder Abwesenheit von Substanzen  analysiert. Verbindungen, welche die Bindung zwischen IGF-1R und  den jeweiligen Bindungsproteinen entweder inhibieren oder fördern,  werden ausgewählt. Im Fall des ELISA-Systems werden Antikörper, die  spezifisch für die zwei Bindepartner sind, zur Detektion der Komplexe  ausgewählt. Im Fall des homogenen Assays wird mindestens ein Bindepartner  mit Fluorophoren markiert, was die Analyse der Komplexe erlaubt.  Alternativ hierzu werden Anti-Tag-Antikörper zur Überwachung der  Wechselwirkung verwendet.  B) Zelluläre Assays:  



     Tumorzellen oder Zellen, die mit Expressionskonstrukten des IGF-1R  und den jeweiligen Bindungsproteinen transfiziert wurden, werden  mit oder ohne Substanzen behandelt, und anschliessend wird die Komplexbildung  zwischen den beiden Komponenten unter Verwendung von Standardassays  analysiert.   Beispiel 3  cDNA-Klonierung von IIP-1 und IIP-10  (und RT-PCR-Assay)  



   Unter Verwendung von Datenbankeninformation (ESTs) wurde die Nukleotidsequenz  des vollständigen IIP-1 mit Sequenzen der partiellen cDNA-Klone von  IIP-1 (IIP-1a, IIP-1b) einem Alignment unterzogen. cDNA-Klonierung  von vollständigem IIP-1 wurde mithilfe von RT-PCR auf der Grundlage  von Gesamt-RNA durchgeführt, die aus einer MCF7 ADR -Brustzelllinie  isoliert worden war. RT-PCR mit zwei Oligonukleotidprimern: TIP2c-s  (SEQ ID NO:7) und TIP2b-r (SEQ ID NO:8) führte zur Amplifikation  von zwei DNA-Fragmenten von 1 kb Länge (IIP-1) und 0,7 kb Länge (IIP-1  [p26]). 



   Die Nukleotidsequenz des vollständigen IIP-10 wurde unter Verwendung  von Datenbankeninformationen (ESTs) mit der Sequenz cDNA-Teilklon  von IIP-10 einem Alignment unterzogen. cDNA-Klonierung von IIP-10  wurde auf der Basis von Gesamt-RNA durchgeführt, die aus der Darmkrebszelllinie  SW480 isoliert wurde. RT PCR mit zwei Oligonukleotidprimern Hcthy-s  (SEQ ID NO:9) und Hcthy-r (SEQ ID NO: 10) führte zur Amplifikation  eines cDNA-Fragments von 676 Basenpaaren Länge (IIP-10). 



   DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung der Dideoxynukleotid-Kettenterminationsmethode  auf einem ABI-373A-Sequenzierer durchgeführt unter Verwendung des  Ampli-Taq< <TM> >-FS-Dideoxyterminatorkits (Perkin Elmer, Foster  City, CA). Ein Vergleich zwischen der cDNA und den abgeleiteten Proteinsequenzen  wurde unter Verwendung von Advanced Blast Search    (Altschul, S.F.,  et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410; Altschul, S.F., et al.,  Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402) durchgeführt.   Beispiel  4  Western Blot-Analyse von IIP-1 und IIP-10  



   Gesamtzellysate wurden in einem Puffer, enthaltend 50 mM Tris pH  8,0, 150 mM NaCI, 1% NP40, 0,5% Deoxycholsäure, 0,1% SDS und 1 mM  EDTA pH 8.0 hergestellt und durch Zentrifugieren bei 4 DEG C für  15 Minuten geklärt. Die Proteinkonzentration der Überstände wurde  mit dem Mikro-BCA-Proteinassaykit (Pierce Chemcial Co., Rockford,  IL) nach dem Herstellerhandbuch gemessen. IGF-1-Rezeptoren wurden  unter Verwendung von Anti-IGF-1-Rezeptorantikörpern immunopräzipitiert  (Santa Cruz). Die Proteine wurden durch SDS-PAGE fraktioniert und  elektrophoretisch auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Nitrocellulosefilter  wurden mit 10% (Gewicht/Volumen) fettfreiem Milchpulver in 20 mM  Tris pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,2% Tween-20 vorinkubiert.

   Die Bindung  eines monoklonalen Antikörpers aus der Maus, welcher gegen das Flag-Epitop  gerichtet ist, wurde mit einem Ziegen-Antimaus-lgG-Antiserum, welches  Meerrettich-Peroxidase-markiert war, detektiert (Biorad, München,  DE) und mit einem verstärkten Chemolumineszenzdetektionssystem ECL  <TM>  (Amersham, Braunschweig, DE) visualisiert.   Beispiel 5  Überexpression in IIP-1 bis IIP-10 in Säugerzellen durch Liposom-vermittelte  Transfektion  



   Die cDNAs für IIP-1 bis IIP-10 wurden in die Notl-Stelle von pBATflag  oder pcDNA3flag kloniert (Weidner, M., et al., Nature 384 (1996)  173-176; Behrens, J., et al., Nature 382 (1996) 638-642; Behrens,  J., et al., Science 280 (1998) 596-599). NIH3T3-Zellen oder andere  Empfängerzellen wurden mit pcDNAflagllP-1 bis pcDNAflagllP-10 oder  alternativ mit pBATflagllP-1    bis pBATIfagllP-10 unter Verwendung  von FuGENE6 (Roche Biochemicals) als Transfektionsmittel transfiziert.  Die Zellen wurden in 0,4 mg/ml G418 selektiert. Einzelne Klone wurden  gepickt und auf die Expression von IIP-1 bis IIP-10 analysiert und  bezüglich ihrer Proliferation funktionell charakterisiert.  Northern  Blot Analyse  



   Northern Blots für Multigewebe-mRNA des Menschen und der Maus wurden  von Klontech erhalten (Palo Alto, CA, US). Eine cDNA-Sonde, welche  die Nukleotide 343 bis 676 der codierenden Region für IIP-10 umfasst,  wurde unter Verwendung des PCR-DIG-Labeling Mix (Roche Diagnostics  GmbH, DE) mit DIG-dUTP markiert. Eine Digoxygenin-markierte Aktin-RNA-Sonde  wurde von Roche Diagnostics GmbH, DE, erhalten. Die Hybridisierung  wurde unter Verwendung der DIG EasyHyb Hybridisierungslösung (Roche  Diagnostics GmbH, DE) durchgeführt. IIG-10-mRNA wurde mithilfe von  mit alkalischer Phosphatase konjugierten DIG-spezifischen Antikörpern  und dem CSPD-Substrat (Roche Diagnostics GmbH, DE) detektiert.   Beispiel 6  Detektion von mRNA in Krebszellen  



   Um zu detektieren, ob Proteine, die von Nukleinsäuren codiert werden,  welche mit SEQ ID NO:1 oder mit SEQ ID NO:5 oder den Komplementärsequenzen  davon hybridisieren, in Krebszellen exprimiert werden, und somit  um nachzuweisen, ob mRNA vorhanden ist, ist es auf der einen Seite  möglich, etablierte Verfahren der Nukleinsäurehybridisierung anzuwenden,  wie etwa Northern-Hybridisierung, in situ-Hybridisierung, Dot- oder  Slot-Hybridisierung und davon abgeleitete diagnostische Techniken  (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold  Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B. D., Higgins,  S.G., Nucleic acid hybridisation - a practical approach (1985) IRL  Press,    Oxford, England; WO 89/06698; EP-A 0 200 362; EP-A 0 063  879; EP-A 0 173 251; EP-A 0 128 018).

   Auf der anderen Seite ist es  auch möglich, Verfahren aus dem grossen Repertoire von Amplifikationstechniken  anzuwenden, die spezifische Primer verwenden (PCR Protocols - A Guide  to Methods and Applications (1990), publ. M.A. Innis, D.H. Gelfand,  J.J. Sninsky, T.J. White, Academic Press Inc.; PCR - A Practical  Approach (1991), publ. M. J. McPherson, P. Quirke, G. R. Taylor,  IRL Press). 



   Die RNA für diese Verfahren wird nach der Methode von Chomcszynski  und Sacchi, Anal. Biochem. 162 (1987) 156-159 aus Krebsgewebe isoliert.  20  mu g Gesamt-RNA wurde auf einem 1,2%igen Agarose-Formaldehydgel  aufgetrennt und auf Nylonmembranen übertragen (Amersham, Braunschweig,  DE). Dies geschah nach Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular  Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory  Press, New York, USA). Die DNA-Sequenzen SEQ ID NO:1 oder SEQ ID  NO:5 wurden als Sonden radioaktiv markiert (Feinberg, A.P. und Vogelstein,  B. Anal. Biochem. 137 (1984) 266-267). Die Hybridisierung wurde bei  68 DEG C in 5 x  SSC, 5 x  Denhardt, 7% SDS/0,5 M Phosphatpuffer  pH 7,0, 10% Dextransulfat und 100  mu g/ml Lachsspermien-DNA durchgeführt.

    Anschliessend wurden die Membranen zweimal jeweils für eine Stunde  in 1 x  SSC bei 68 DEG C gewaschen und dann auf Röntgenfilm gelegt.   Beispiel 7  Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren  der Aktivität des erfindungsgemässen Proteins  



   Der Expressionsvektor von Beispiel 5 (entweder für IIP-1 oder IIP-10,  10  mu g/10<6> Zellen) wird unter Verwendung von bekannten Standardverfahren  in NIH 3T3-Zellen eingebracht (Sambrook et al.). Zellen, welche den  Vektor aufgenommen haben, werden durch ihre Fähigkeit, in Gegenwart  der Selektion oder unter selektiven Bedingungen (0,4 mg/ml G418)  zu wachsen, identifiziert. Zellen, welche die für IIP codierende  DNA exprimieren, stellen    RNA her, welche wie in Beispiel 5 beschrieben  durch Northern Blot-Analyse detektiert wird. Alternativ hierzu werden  das Protein exprimierende Zellen durch die Identifizierung des Proteins  durch Western Blot-Analyse unter Verwendung der in Beispiel 4 beschriebenen  Antikörper identifiziert.

   Zellen, die das Protein von dem Expressionsvektor  exprimieren, zeigen eine veränderte Morphologie und/oder verstärkte  Wachstumseigenschaften. 



   Zellen, welche das Protein exprimieren und eine oder mehrere der  oben beschriebenen veränderten Eigenschaften aufweisen, werden mit  und ohne eine putative Modulatorverbindung kultiviert. Durch Screening  von chemischen und natürlichen Bibliotheken können solche Verbindungen  identifiziert werden, indem High-Throughput-Zell-Assays, die Zellwachstum  überwachen, verwendet werden (z.B. Zellproliferationsassays, die  als chromogene Substrate die Tetrazoliumsalze WST-1, MTT oder XTT  verwenden, oder ein ELISA-Detektionssystem zur Detektion von Zelltod  unter Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU), siehe Boehringer Mannheim  GmbH, Apoptosis and Cell Proliferation, 2. Auflage, 1998, S. 70-84).                                                           



   Die Modulatorverbindung verursacht eine Zunahme oder eine Abnahme  der Zellantwort auf die IIP-Proteinaktivität und wird entweder ein  Aktivator oder ein Inhibitor der IGF-Funktion sein. 



   Alternativ hierzu werden putative Modulatoren zu Tumorzellkulturen  hinzugegeben, und die Zellen zeigen eine veränderte Morphologie und/oder  reduzierte oder verstärkte Wachstumseigenschaften. Es wird eine putative  Modulatorverbindung mit und ohne IIP-Protein zu den Zellen hinzugegeben,  und eine Zellantwort wird durch direkte Beobachtung der morphologischen  Charakteristika der Zellen gemessen, und/oder die Zellen werden auf  ihre Wachstumseigenschaften hin überwacht. Die Modulatorverbindung  wird eine Zunahme oder eine Abnahme in der Zellantwort auf das IIP-Protein    verursachen und wird entweder ein Aktivator oder Inhibitor der  IGF-1-Rezeptoraktivität sein.  Literatur  



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Claims (13)

1. Nukleinsäuresequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass sie für ein an den IGF-1-Rezeptor bindendes Protein codieren, ausgewählt aus der Gruppe umfassend: (a) die in SEQ ID NO:5 dargestellte Nukleinsäuresequenz oder Komplementärsequenz dazu, (b) Nukleinsäuresequenz, welche unter stringenten Bedingungen mit einer der Nukleinsäuren aus (a), die für ein Polypeptid mit Homologie zu der in SEQ ID NO:6 dargestellten Polypeptidsequenz codieren, hybridisieren, (c) Nukleinsäuresequenzen, welche auf Grund der Degeneration des genetischen Codes für Polypeptide codieren, welche die Aminosäuresequenz der von einer der Nukleinsäuresequenzen aus (a) und/oder (b) codierten Polypeptide aufweisen.

2. Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz gemäss SEQ ID NO:5 aufweisen.

3.

Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung in 5,0 x SSC, 5 x Denhardt, 7% SDS, 0,5 M Phosphatpuffer pH 7,0, 10% Dextransulfat und 100 g/ml Lachsspermien-DNA bei ungefähr 50 DEG C bis 68 DEG C, gefolgt von zwei Waschschritten mit 1 x SSC bei 68 DEG C durchgeführt wird.

4. Rekombinanter Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er für die Expression einer der Nukleinsäuresequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 geeignet ist.

5. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer der Nukleinsäuresequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, oder einem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 4 transformiert ist.

6.

Rekombinantes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es von einer der Nukleinsäuresequenzen nach einem der Ansprüche 1-3, codiert ist und an den IGF-1-Rezeptor bindet.

7. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches an den IGF-1-Rezeptor bindet, umfassend: Exprimieren einer exogenen DNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen und Isolieren des gewünschten Proteins, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein codiert ist von der in SEQ ID NO:5 dargestellten DNA-Sequenz oder einer Nukleinsäuresequenz, welche unter stringenten Bedingungen mit einer zu der in SEQ ID NO:5 dargestellten Nukleinsäuresequenz komplementären Nukleinsäuresequenz hybridisiert.

8.

Verfahren zur Detektion des Proliferationspotenzials einer Krebszelle, umfassend: (a) Inkubieren einer Probe, ausgewählt aus einer Körperflüssigkeit eines an Krebs leidenden Patienten, Tumorzellen, Zellextrakten und/oder Zellkulturüberständen von Tumorzellen, wobei die Probe Nukleinsäuresequenzen enthält, mit einer Nukleinsäuresequenzsonde, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: (i) der in SEQ ID NO:5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für den IGF-1-Rezeptor bindendes Protein codiert, oder dazu komplementären Nukleinsäuresequenzen, (ii) Nukleinsäuresequenzen, welche mit einer der Nukleinsäuresequenzen aus (i) hybridisieren, und (b) Detektieren der Hybridisierung mithilfe eines weiteren Bindepartners der Nukleinsäuresequenz der Probe und/oder der Nukleinsäuresequenzsonde.

9.

Verfahren nach Anspruch 8, worin eine Hybridisierung mit mindestens einem Nukleinsäure-sequenzfragment der in SEQ ID NO:5 dargestellten Nukleinsäuresequenz oder einem Komplementärsequenzfragment davon bewirkt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin die zu detektierende Nukleinsäuresequenz vor der Detektion amplifiziert wird.

11.

Verfahren zum Screenen einer Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und einem der Polypeptide IIP-1 bis IIP-10 hemmt, umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen von IGF-1R und dem IIP-Polypeptid nach Anspruch 6 mit einer eine in Frage kommende Verbindung enthaltenden Lösung, sodass der IGF-1R und das IIP-Polypeptid in der Lage sind, einen Komplex zu bilden, und (b) Bestimmen der Menge an Komplex im Vergleich zu dem vorbestimmten Ausmass an Bindung in Abwesenheit der Verbindung und daraus Bewerten der Fähigkeit der Verbindung, die Bindung des IGF-1R an das IIP-Polypeptid zu hemmen.

12.

Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Karzinomen in einem Patienten, umfassend: Mischen eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, welche die Wechselwirkung zwischen IGF-1R und dem Polypeptid nach Anspruch 6 in einem Zell-Assay moduliert, wobei in dem Zell-Assay Tumorzellen oder mit Expressionskonstrukten von IGF-1R und IIP transformierte Zellen mit der Verbindung behandelt werden und eine Komplexbildung zwischen IGF-1R und dem jeweiligen IIP analysiert wird und das Ausmass an Komplexbildung im Fall einer Inhibition 50%, bezogen auf 100% Komplexbildung ohne die Verbindung im selben Zell-Assay, nicht übersteigt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Verbindung die Wechselwirkung inhibiert.