WO2000046244A1 - cDNA-SEQUENZ EINES INTERAKTORS FANCIP1 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A - Google Patents
cDNA-SEQUENZ EINES INTERAKTORS FANCIP1 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to the cDNA of an interactor FANCIP1 of the Fanconi anemia protein of the complementation group A (FANCA) and the protein encoded thereby.
- Other subjects include the corresponding gene, antibodies directed against the protein, FANCIP1 -transgenic organisms and cells, and the use of FANCIP1 for effector screening and the pharmaceutical application of the nucleic acid, the protein and the antibodies.
- Fanconi anemia (hereinafter referred to as FA) is an autosomal recessive hereditary disease that is clinically associated with symptoms such as progressive pancytopenia, congenital malformations and an increased risk of FA
- FA cells are cytogenetic due to a hypersensitivity to DNA-cross-linking agents, e.g. Mitomycin C (MMC) and Diepoxybutan (DEB), characterized, which manifests itself in chromosome breaks and aberrations (Auerbach, 1993).
- MMC Mitomycin C
- DEB Diepoxybutan
- FA lymphocytes and fibroblasts show a delay or an arrest in the G2 phase of the cell cycle after treatment with MMC (Kubbies et al., 1985; Seyschab et al., 1995).
- MMC Mitomycin C
- DEB Diepoxybutan
- FA lymphocytes and fibroblasts show a delay or an arrest in the G2 phase of the cell cycle after treatment with MMC (Kubbies et al., 1985; Seyschab et al., 1995).
- increased sensitivity to oxygen can be observed in FA cells (Joenje et al. 1981; Schindler and Hoehn, 1988; Po
- the FANCC interactors so far are the cyclin-dependent kinase cdc2 (Kupfer et al., 1997b), the chaperone GRP94 (Hoshino et al., 1998), the NADPH: cytochrome c reductase (Kruyt et al., 1998) and a new transcription repressor (Hoatlin et al., 1999) published, as the FANCA interactor the Nexin SNX5 (Otsuki et al., 1999), as the FANCA and FANCC interactor ⁇ -spectrin II (McMahon et al., 1999). Fanconi genes 1 and 2 were classified as potentially pathogenesis-relevant (Planitzer et al., 1998; WO98 / 16637 and WO98 / 45428).
- the object of the present invention was to find interactors of the Fanconi anemia proteins FANCA and FANCC. Based on the FA pathogenesis as a model system for mechanisms for maintaining genetic stability, the aim was to identify components of a protein complex or a protein cascade that play a role in DNA repair, cell cycle regulation and / or ontogenesis. Summary of the invention
- the present invention describes the identification of a cDNA encoding a new protein called FANCIP1 ("Fanconi anemia protein interacting protein 1").
- FANCIP1 Fepidermal ANCIP1
- the cDNA sequence was found using an interaction trap version of the yeast two hybrid system (Fields and Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996), with the complementation group A protein (FANCA) serving as bait.
- FANCIP1 cDNA interacts with FANCA and can therefore be part of the complex or the signal transduction cascade, which leads to FA pathogenesis in the event of a defect.
- the FANCIP1 cDNA and the protein encoded by it, but also the corresponding gene and antibodies directed against the protein are therefore suitable as diagnostic, therapeutic or preventive agents for diseases which involve DNA repair defects, cell cycle disorders, cytopenias, tumorigenesis and / or associated with tumor progression. They can also serve as targets for effector screening procedures to develop new drugs for the treatment of the aforementioned diseases.
- the present invention relates to a nucleic acid which
- nucleotide sequence shown in FIG. 1 or a protein-coding section thereof b) a nucleotide sequence corresponding to the sequence from a) within the framework of the degeneration of the genetic code, c) one with the sequences from a) and / or b) under stringent conditions hybridizing nucleotide sequence or d) comprises a sequence complementary to the sequences from a) and / or b).
- the nucleotide sequence shown in FIG. 1 contains an open reading frame which corresponds to a protein with a length of 308 amino acids.
- the amino acid sequence of this protein is shown in Fig. 2.
- NBI National Center for Biotechnology Information
- these access numbers there is no information about a complete open reading frame or
- the present invention also includes a nucleotide sequence which hybridizes with one of the aforementioned sequences.
- the term "hybridization" according to the present invention is used as in Sambrook et al. (1989) used.
- the nucleic acid according to the invention comprises a protein-coding section of the nucleotide sequence shown in FIG. 1 or a sequence which has a homology of more than 65%, preferably more than 80% or a section thereof, preferably at least 15 nucleotides long.
- the nucleotide sequence according to the invention can also comprise an RNA or a nucleic acid analog, for example a peptide nucleic acid.
- Nucleic acids according to the invention can be isolated from mammals according to known techniques using short sections of the nucleotide sequence shown in FIG. 1 as hybridization probes and / or primers according to known methods. Furthermore, nucleic acids according to the invention can also be produced by chemical synthesis, with modified nucleotide building blocks (e.g. methylated or 2'-O-alkylated nucleotides or phosphorothioates) being able to be used instead of the usual nucleotide building blocks. Nucleic acids that are partially or completely modified
- Nucleotide building blocks can be used, for example, as therapeutic agents, e.g. as antisense nucleic acids or as ribozymes.
- the present invention further relates to a vector which contains at least one copy of a nucleic acid according to the invention.
- This vector can be any prokaryotic or eukaryotic vector on which the DNA sequence according to the invention is located and / or which enables expression of the nucleic acid according to the invention in a suitable word cell.
- prokaryotic vectors are chromosomal vectors, such as bacteriophages, and extrachromosomal vectors, such as circular ones
- Plasmid vectors examples of eukaryotic vectors are yeast vectors or vectors suitable for higher cells, such as plasmid vectors or viral vectors.
- the invention also relates to a vector which preferably contains at least a 15 nucleotide long section of the sequence shown in FIG. 1.
- This section preferably has a nucleotide sequence which comes from the protein-coding region of the sequence shown in FIG. 1 or from a region which is essential for the expression of the protein.
- These nucleic acids are particularly suitable for the production of therapeutically usable antisense nucleic acids.
- the present invention further relates to a cell which has been transformed with a nucleic acid or a vector according to the invention.
- the cell can be both a eukaryotic and a prokaryotic cell.
- eukaryotic cells are in particular mammalian cells.
- FANCIPl transgenic organisms such as knock-in or knock-out animal models. Animal models which stably express the product of the nucleic acid are referred to as knock-in animal models and those whose corresponding natural gene has been deliberately destroyed are referred to as knock-out animal models.
- the present invention comprises a protein encoded by a nucleic acid as indicated above.
- This protein has the amino acid sequence shown in FIG. 2 or a homology of more than 60%, preferably more than 70%, to the amino acid sequence shown in FIG. 2.
- the invention also relates to variants and fragments of the protein shown in FIG. 2. Variants are to be understood as sequences which differ from the amino acid sequence shown in FIG. 2 by substitution, deletion and / or insertion of individual amino acids or short amino acid segments.
- This term also includes chemically modified polypeptides. These include polypeptides that are modified on the termini and / or on reactive amino acid side groups by acylation or amidation.
- the invention also relates to methods which lead to the production of the protein according to the invention and to the cultivation accordingly transformed cells as well as the isolation of the protein according to the invention.
- the invention further relates to the use of the polypeptide according to the invention or fragments of this polypeptide as an immunogen for the production of antibodies.
- Antibodies can be produced in a customary manner by immunizing experimental animals with the complete polypeptide or fragments thereof and then obtaining the resulting polyclonal antisera.
- Monoclonal antibodies can be produced by known methods.
- the present invention thus also includes antibodies against FANCIP1 or a variant thereof.
- the FANCIP1 encoded by the nucleic acid according to the invention can be used as a target for a targeted search for effectors.
- Substances which have an inhibitory or activating effect on the protein according to the invention are able to selectively influence the cell functions controlled by the protein. Therefore, when treating the corresponding clinical pictures, such as Cytopenias or tumors.
- the invention thus also relates to a method for identifying effectors of FANCIP1, in which cells which express the protein are treated with different potential
- Effector substances in contact and the cells for changes e.g. cell-activating, cell-inhibiting, cell proliferative and / or cell genetic changes, analyzed.
- FANCIP1 binding domains can be identified in this way.
- the invention relates to pharmaceutically active effector substances determined in the above-mentioned manner.
- the present invention also relates to a pharmaceutical composition which contains nucleic acids, vectors, cells, polypeptides, antibodies and / or effector substances as indicated above as the active component and furthermore pharmaceutically customary excipients, auxiliaries and / or additives and optionally further active components may contain.
- the pharmaceutical composition can be used in particular for the diagnosis, therapy or prevention of diseases associated with DNA repair defects, Cell cycle disorders, cytopenias, tumorigenesis and / or tumor progression are associated. This also applies to the diagnosis of a predisposition to such diseases in individuals, in particular in the diagnosis of a risk for cytopenias and / or tumor diseases. Furthermore, a targeted diagnosis of diseases is made possible which are directly or indirectly linked to changes in the activity of FANCIP1. These investigations can be carried out with the help of specific nucleic acid probes for detection at the nucleic acid level, for example at the gene or transcript level, or with the aid of antibodies against FANCIP1 for the detection at protein level.
- gene therapy treatment can be carried out which involves the transmission of a nucleic acid coding for the FANCIP1 by means of vectors, e.g. viral vectors, into the appropriate target tissue.
- vectors e.g. viral vectors
- gene therapy treatment can take place, which leads to a blocking of this expression.
- the present invention also relates to a method for the diagnosis of the abovementioned diseases, in which a patient or one of a
- a pharmaceutical composition according to the invention and qualitatively or quantitatively determines the nucleotide sequence and / or the expression of the nucleic acid according to the invention.
- These determination methods can be carried out, for example, at the nucleic acid level by using nucleic acid hybridization probes or via reverse transcription / PCR or at the protein level by antibodies using cyto- or histochemical methods.
- the pharmaceutical composition can be used as a marker for the occurrence of cytopenias, tumors or other proliferation-associated diseases or as a predisposition for the pathophysiological changes mentioned.
- the present invention also relates to a method for the therapy or prevention of one of the aforementioned diseases, wherein the patient is administered a pharmaceutical composition according to the invention which contains the active component in an amount effective against the disease.
- a pharmaceutical composition according to the invention which contains the active component in an amount effective against the disease.
- pharmaceutical compositions which are suitable for therapeutic purposes are, for example, bispecific antibodies and antibody toxins or antibody-enzyme conjugates.
- Further preferred pharmaceutical compositions for therapeutic purposes are antisense nucleic acids, gene therapeutic vectors or effector substances, for example in the form of low molecular weight activators or inhibitors.
- the complete coding sequence of the FANCA protein was cloned into the vector pEG202 via the EcoRI interface in the reading frame with the region coding for the LexA DNA-binding domain.
- the vector pJG4-5 was used for the expression of the prey protein, which allows the construction of fusion proteins with the B42-transactivating domain.
- a HeLa cDNA library cloned into this vector as a fusion gene library was screened with the FANCA bait protein.
- the yeast strain EGY48 served as the wrest organism. A positive interaction was demonstrated by transcription activation of the LEU2 gene, resulting in growth of the yeasts on leucine-free medium.
- EGY48 cotransformed with pEG202FANCA and the B42 fusion library were pre-selected on leucine-containing medium to obtain both vectors and recorded.
- To search for interacting yeast clones aliquots were plated on leucine-free medium and incubated for 3 to 5 days at 30 ° C. A total of 1 ⁇ 10 6 transfectant aliquots were screened. The dependence of the transcription activation of positive clones on the expression of the prey protein was checked on leucine-free glucose medium.
- the interactor plasmids were isolated after culturing the yeast in glucose medium without tryptophan, electroporation of the nucleic acid isolate in the E. coli strain XLI blue (Stratagene) and plasmid preparation from the bacterial cells. To confirm the interactions, retransformations of the isolated prey interactor were used in combinations with different ones
- Bait constructs carried out. In combination with ⁇ EG202FANCA, the previously observed interaction was confirmed. In addition, possible interactions with the LexA fusion partner were excluded by co-retransforming on the one hand with the pEG202 empty vector and on the other hand with a LexA-DNA-ligase-bait fusion construct as a negative control.
- the 573 'RACE kit (Boehringer-Roche) was used to determine the 5' partial sequence of the nucleotide sequence found.
- sequence-specific primers FANCIP1-SP1 (5'-GGG GGC AGG AAT ATG AGA GG-3 ')
- FANCIP1-SP2 5'-TTT AGG GGG AAG TGT ACC TG-3'
- the PCR product obtained was purified electrophoretically (JETquick Gel Extraction Kit, GENOMED) and sequenced directly using the T7 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (Amersham-Pharmacia) and the above-mentioned primer FANCIP1-SP2.
- the affiliation of the nucleotide fragment obtained to the plasmid-inserted interactor fragment was confirmed by an overlapping sequence region of 38 nucleotides.
- the composite nucleotide sequence resulted in a 1553 nucleotide long cDNA region which comprises part of the 5'-untranslated region, the entire open reading frame of 924 nucleotides or 308 codons and the almost complete 3'-untranslated region beyond the polyadenylation signal (AATAAA) includes.
- SEQ ID NO. 1 a nucleotide sequence which contains the open reading frame coding for FANCIP1, 12
- FIG. 2 (SEQ ID NO. 2) the amino acid sequence of an open reading frame of the nucleotide sequence shown in FIG. 1,
- Figure 4 shows the nucleic acid primers used for 5'-RACE analysis.
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNA eines Interaktors FANCIP1 des Fanconi-Anämie Proteins der Komplementationsgruppe A (FAA) sowie das davon codierte Protein. Weitere Gegenstände sind das entsprechende Gen, gegen das Protein gerichtet Antikörper, FANCIP1-transgene Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP1 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäure, des Proteins und der Antikörper.
Description
WO 00/46244 PCTtEPOO/00506
cDNA-Sequenz eines Interaktors FANCIP1 des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe A
Beschreibung
Umfang der Erfindung Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNA eines Interaktors FANCIP1 des Fanconi-Anämie Proteins der Komplementationsgruppe A (FANCA) sowie das davon codierte Protein. Weitere Gegenstände sind das entsprechende Gen, gegen das Protein gerichtete Antikörper, FANCIPl -transgene Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP1 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäure, des Proteins und der Antikörper.
Hintergrund der Erfindung
Fanconi-Anämie (im folgenden als FA bezeichnet) ist eine autosomal rezessiv erbliche Erkrankung, die sich klinisch mit Symptomen wie progressive Pancytopenie, angeborene Mißbildungen und erhöhtes Risiko für
Krebserkrankungen manifestiert (Glanz und Fräser, 1982). Mindestens 15% der FA-Patienten entwickeln myeloische Leukämien (Auerbach und Allen, 1991 ).
Cytogenetisch sind FA-Zellen durch eine Hypersensitivität gegenüber DNA- queπternetzenden Agenzien, wie z.B. Mitomycin C (MMC) und Diepoxybutan (DEB), charakterisiert, die sich in Chromosomenbrüchen und -aberrationen manifestiert (Auerbach, 1993). FA-Lymphozyten und -Fibroblasten weisen nach Behandlung mit MMC eine Verzögerung bzw. einen Arrest in der G2-Phase des Zellzyklus auf (Kubbies et al., 1985; Seyschab et al., 1995). Zudem ist bei FA- Zellen eine erhöhte Sauerstoffempfindlichkeit zu beobachten (Joenje et al. 1981 ; Schindler und Hoehn, 1988; Poot et al., 1996).
Anhand somatischer Zellfusionsstudien konnten für FA mindestens acht verschiedene Komplementationsgruppen (A bis H) unterschieden werden (Joenje et al., 1997). Bisher wurden die Gene für drei Komplementationsgruppen identifiziert: FANCC (Strathdee et al., 1992; WO93/22435), FANCA (Lo Ten Foe et
al., 1996; The Fanconi anaemia/Breast cancer consortium, 1996; WO98/14462) und FANCG (Saar et al., 1998; De Winter et al., 1998). Obwohl die molekulare Wirkungsweise der FA-Proteine immer noch unbekannt ist, deutet der zelluläre Phänotyp und das erhöhte Krebsrisiko bei einem Gendefekt auf eine Beteiligung bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklus-Regulation und/oder der Hämatopoiese hin. Die Ähnlichkeit des klinischen und zellulären Phänotyps der verschiedenen Komplementationsgruppen und die Erkenntnis, daß das FANCA- und das FANCC- Protein unter FANCA-Phosphorylierung interagieren und als Komplex in den Zellkern transportiert werden (Kupfer et al., 1997a, Yamashita et al., 1998), lassen auf eine Protein-Kaskade oder ein funktionelles Zusammenwirken in einem Komplex schließen. Für FANCG konnte die Beteiligung an diesem Komplex ebenfalls gezeigt werden (Garcia-Higuera et al., 1999; Waisfisz et al., 1999; Reuter et al., 2000).
Entscheidende Fortschritte bei der Entschlüsselung der molekularen Ursachen der FA-Pathogenese können über die Identifikation der beteiligten Gene bzw. Proteine erzielt werden. Als FANCC-Interaktoren sind bislang die Cyclin-abhängige Kinase cdc2 (Kupfer et al., 1997b), das Chaperon GRP94 (Hoshino et al., 1998), die NADPH:Cytochrom c-Reduktase (Kruyt et al., 1998) und ein neuer Transkriptionsrepressor (Hoatlin et al., 1999) veröffentlicht, als FANCA-Interaktor das Nexin SNX5 (Otsuki et al., 1999), als FANCA- und FANCC-Interaktor α- Spektrin II (McMahon et al., 1999). Als potentiell Pathogenese-relevant wurden die Fanconi-Gene 1 und 2 eingestuft (Planitzer et al., 1998; WO98/16637 und WO98/45428).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Interaktoren der Fanconi- Anämie-Proteine FANCA und FANCC zu finden. Auf Grundlage der FA- Pathogenese als Modellsystem für Mechanismen zur Aufrechterhaltung genetischer Stabilität war das Ziel, Bestandteile eines Proteinkomplexes bzw. einer Proteinkaskade zu identifizieren, die eine Rolle bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklusregulation und/oder der Ontogenese spielen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung einer cDNA, die für ein neues Protein codiert, das mit FANCIP1 ("Fanconi anemia protein interacting protein 1") bezeichnet wurde. Die cDNA-Sequenz wurde unter Verwendung einer Interaction Trap-Version des Hefe-Two Hybrid-Systems (Fields und Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996) gefunden, wobei das Protein der Komplementationsgruppe A (FANCA) als Köder diente. Das durch die FANCIP1 -cDNA codierte Protein interagiert mit FANCA und kann somit Teil des Komplexes bzw. der Signaltransduktionskaskade sein, die bei Defekt zur FA-Pathogenese führt. Die FANCIP1-cDNA und das davon codierte Protein, aber auch das entsprechende Gen und gegen das Protein gerichtete Antikörper sind daher als diagnostische, therapeutische oder präventive Mittel für Erkrankungen geeignet, die mit DNA- Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Sie können weiterhin als Targets für Verfahren zum Effektor-Screening dienen, um neue Medikamente zur Behandlung der zuvor genannten Erkrankungen zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, welche
a) die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Proteincodierenden Abschnitt davon, b) eine der Sequenz aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz, c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder d) eine zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre Sequenz umfaßt.
Die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz enthält einen offenen Leserahmen, der einem Protein mit einer Länge von 308 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins ist in Fig. 2 dargestellt.
In der EST-Sequenzdatenbank am "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) finden sich humane cDNA-Klone, die Teilbereiche der in Fig. 1 angegebenen Nukleotidsequenz enthalten. Folgende homologe humane ESTs seien genannt: Zugangsnummern AA165403, AA455594, AA314472, N34087, AA452340, AA182700, N41615, AA470049, AI751597, AA463289, AA132459, W31487, R56355, H58271 , H16122, W77956, AA193332, AA323923, AA370209, AA296758, W72757, AA093971 , AA385544, AA386175, AA165402, AW085713, H42806, AA093977, AI161152, AA370011 , AI671702, R71215, AA885343, T79297, AI814869, R81567, AI082713, N29615, AW087726, AW075710, AI952608, AI818073, AI784445, AI432812, AI375568, AI372904, AI364106,
AI143379, AA993074, AA953985, AA862385, AA761084, AA576229, AA569223, AA463198, AA452117, AA416877, AA074872, W16851 , W04568, N40176, AW068354, AA857004, H58663, H15819, AW264944, AI923965, AI692214, AI475321 , AI435987, AA961068, AA206059, AI469161 , T84789, AA507257, AA707515, AA132458, AA179262, T79211 , W31505, N25699, T99574, T99363, AI751598, AA713668, T91119, AW105515, AA370208, AI422128, R81568, AI038899, AI971847, AI540650, AI826106, AA885960, R56263, AA825431 , T99147, D31503 und AF049564. Unter diesen Zugangsnummern finden sich jedoch keine Angaben über einen vollständigen offenen Leserahmen oder über eine mögliche biologische Funktion.
Die Suche nach funktionellen Domänen des Proteins FANCIP1 (Abb. 2) unter Verwendung des Profi leScan-Sen ers der ISREC-Bioinformatikgruppe ("Swiss Institute for Experimental Cancer Research") lieferte als signifikantestes Ergebnis eine Esterase/Lipase.HTiioesterase-Domäne.
Die vorliegende Erfindung umfaßt neben der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz und einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz auch noch eine Nukleotidsequenz, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisiert. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (1989) verwendet.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt einen Protein-codierenden Abschnitt der in Fig. 1 dargestellten Nukleotidsequenz oder eine Sequenz, die eine Homologie von mehr als 65%, vorzugsweise mehr als 80 % oder einen vorzugsweise mindestens 15 Nukleotide langen Abschnitt davon aufweist. Weiterhin kann die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz auch eine RNA oder ein Nukleinsäureanalogon, z.B. eine Peptid-Nukleinsäure, umfassen.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können aus Säugern nach bekannten Techniken unter Verwendung kurzer Abschnitte der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz als Hybridisierungssonden und/oder Primer nach bekannten Methoden isoliert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei anstelle der üblichen Nukleotidbausteine auch modifizierte Nukleotidbausteine (z.B. methylierte oder 2'- O-alkylierte Nukleotide oder Phosphorthioate) eingesetzt werden können. Nukleinsäuren, die teilweise oder vollständig aus modifizierten
Nukleotidbausteinen bestehen, können beispielsweise als therapeutische Mittel, z.B. als Antisense-Nukleinsäuren oder als Ribozyme, eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryotischer oder eukaryotischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße DNA-Sequenz befindet und/oder der die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer geeigneten Wrtszelle ermöglicht. Beispiele für prokaryotische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie Bakteriophagen, und extrachromosomale Vektoren, wie zirkuläre
Plasmidvektoren. Beispiele für eukaryotische Vektoren sind Hefevektoren oder für höhere Zellen geeignete Vektoren, wie Plasmidvektoren oder virale Vektoren.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der vorzugsweise mindestens einen 15 Nukleotide langen Abschnitt der in Fig. 1 dargestellten Sequenz enthält. Vorzugsweise besitzt dieser Abschnitt eine Nukleotidsequenz, die aus dem Protein-codierenden Bereich der in Fig. 1 dargestellten Sequenz oder einem für die Expression des Proteins wesentlichen Bereich stammt. Diese Nukleinsäuren
eignen sich besonders zur Herstellung von therapeutisch einsetzbaren Antisense- Nukleinsäuren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryotische als auch eine prokaryotische Zelle sein. Beispiele eukaryotischer Zellen sind insbesondere Säugerzellen. Ebenfalls Gegenstand sind FANCIPl-transgene Organismen, wie z.B. knock-in- oder knock-out-Tiermodelle. Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure stabil exprimieren, werden als knock-in-Tiermodelle, jene, deren entsprechendes natürliches Gen gezielt zerstört wurde, als knock-out-Tiermodelle bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein von einer wie oben angegebenen Nukleinsäure codiertes Protein. Dieses Protein weist die in Fig. 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Homologie von mehr als 60%, vorzugsweise mehr als 70% zu der in Fig. 2 dargestellten Aminosäuresequenz auf. Die Erfindung betrifft auch Varianten und Fragmente des in Fig. 2 dargestellten Proteins. Unter Varianten sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von der in Fig. 2 dargestellten Aminosäuresequenz unterscheiden. Hierunter fallen sowohl natürlich vorkommende allelische Variationen oder Spleißvariationen des FANCIP1 als auch durch rekombinante DNA-Technologie, insbesondere durch in vitro-Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden erzeugte Proteine, die hinsichtlich ihrer biologischen und/oder immunologischen Aktivität dem in Fig. 2 dargestellten Protein im wesentlichen entsprechen. Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch modifizierte Polypeptide. Hierzu gehören Polypeptide, die an den Termini und/oder an reaktiven Aminosäureseitengruppen durch Acylierung oder Amidierung modifiziert sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins führen und sowohl die Kultivierung entsprechend
transformierter Zellen als auch die Isolierung des erfindungsgemäßen Proteins umfassen.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern. Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem vollständigen Polypeptid oder Fragmenten davon und anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach bekannten Methoden können monoklonale Antikörper hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt somit auch Antikörper gegen FANCIP1 oder eine Variante davon.
Das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure codierte FANCIP1 kann als Target für eine gezielte Suche nach Effektoren eingesetzt werden. Substanzen, die auf das erfindungsgemäße Protein inhibitorisch oder aktivierend wirken, sind in der Lage, die durch das Protein gesteuerten Zellfunktionen selektiv zu beeinflussen. Daher können sie bei der Therapie entsprechender Krankheitsbilder, wie z.B. Cytopenien oder Tumoren, eingesetzt werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des FANCIP1 , wobei man Zellen, die das Protein exprimieren, mit verschiedenen potentiellen
Effektorsubstanzen, in Kontakt bringt und die Zellen auf Veränderungen, z.B. zellaktivierende, zellinhibierende, zellproliferative und/oder zellgenetische Veränderungen, analysiert. Zudem können auf diese Weise Bindedomänen des FANCIP1 identifiziert werden. Gegenstand der Erfindung sind auf obengenannte Weise ermittelte pharmazeutisch wirksame Effektor-Substanzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente Nukleinsäuren, Vektoren, Zellen, Polypeptide, Antikörper und/oder Effektor-Substanzen wie zuvor angegeben enthält und weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe sowie gegebenenfalls weitere aktive Komponenten enthalten kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann insbesondere zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Erkrankungen eingesetzt werden, die mit DNA-Reparatur-Defekten,
Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Dies gilt auch für die Diagnostik einer Prädisposition für solche Erkrankungen bei Individuen, insbesondere bei der Diagnostik eines Risikos für Cytopenien und/oder Tumorerkrankungen. Weiterhin wird eine gezielte Diagnostik von Krankheiten ermöglicht, die mit Veränderungen der Aktivität des FANCIP1 direkt oder indirekt verbunden sind. Diese Untersuchungen können mit Hilfe spezifischer Nukleinsäuresonden zum Nachweis auf Nukleinsäureebene, z.B. auf Gen- oder Transkriptebene, oder mit Hilfe von Antikörpern gegen FANCIP1 zum Nachweis auf Proteinebene durchgeführt werden.
Bei Krankheitsbildern, die auf einen Ausfall des FANCIP1 zurückzuführen sind, kann eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche die Übertragung einer für das FANCIP1 codierenden Nukleinsäure mittels Vektoren, z.B. viralen Vektoren, in das entsprechende Zielgewebe umfaßt. Andererseits kann bei Krankheitsbildern, die auf eine unkontrollierte Expression des FANCIP1 zurückzuführen sind, eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche zu einer Blockierung dieser Expression führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnostik der oben genannten Erkrankungen, wobei man einen Patienten oder eine aus einem
Patienten stammende Probe, z.B. eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes, mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in Kontakt bringt und die Nukleotidsequenz und/oder die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure qualitativ oder quantitativ bestimmt. Diese Bestimmungsmethoden können beispielsweise auf Nukleinsäureebene durch Verwendung von Nukleinsäure-Hybridisierungssonden oder über Reverse Transkription/PCR bzw. auf Proteinebene durch Antikörper nach cyto- oder histochemischen Methoden erfolgen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann als Marker für das Auftreten von Cytopenien, Tumoren oder anderer proliferationsassoziierter Erkrankungen oder einer Prädisposition für die genannten pathophysiologischen Veränderungen verwendet werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Therapie oder Prävention einer der zuvor genannten Erkrankungen, wobei man dem Patienten eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die die aktive Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält. Spezifische Beispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen, welche für therapeutische Zwecke geeignet sind, sind beispielsweise bispezifische Antikörper und Antikörper-Toxine bzw. Antikörper-Enzymkonjugate. Weitere bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen für therapeutische Zwecke sind Antisense-Nukleinsäuren, gentherapeutische Vektoren oder Effektor-Substanzen, z.B. in Form niedermolekularer Aktivatoren oder Inhibitoren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Interaction Trap Zur Klonierung von cDNAs, deren Genprodukte mit dem Fanconi-Anämie-Protein FANCA interagieren und damit eine Rolle bei der FA-Pathogenese spielen können, wurde eine Interaction Trap-Version des Hefe-Two Hybrid-Systems (Fields und Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996) eingesetzt.
Für die Konstruktion des FANCA-Köderproteins wurde die komplette codierende Sequenz des FANCA-Proteins in den Vektor pEG202 über die EcoRI-Schnittstelle im Leserahmen mit der für die LexA-DNA-bindende Domäne codierenden Region kloniert. Für die Expression des Beuteproteins wurde der Vektor pJG4-5 verwendet, der die Konstruktion von Fusionsproteinen mit der B42- transaktivierenden Domäne erlaubt. Mit dem FANCA-Köderprotein wurde eine in diesen Vektor als Fusionsgenbank klonierte HeLa-cDNA-Bibliothek durchmustert.
Als Wrtsorganismus diente der Hefestamm EGY48. Der Nachweis einer positiven Interaktion erfolgte durch Trankriptionsaktivierung des LEU2-Gens, woraus Wachstum der Hefen auf Leucin-freiem Medium resultiert.
Vor Durchführung des Interaction Traps wurde durch Ausplattieren pEG202FANCA-transformierter EGY48-Hefen auf Glucose-Medium ohne Histidin
und Leucin sichergestellt, daß keine intrinsische transaktivierende Eigenschaft des FANCA-Köder-Fusionskonstruktes vorliegt.
Mit pEG202FANCA und der B42-Fusionsgenbank cotransformierte EGY48 wurden auf Leucin-haltigem Medium auf Erhalt beider Vektoren vorselektiert und aufgenommen. Für die Suche nach interagierenden Hefeklonen wurden Aliquots auf Leucin-freiem Medium ausplattiert und 3 bis 5 Tage bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden Aliquots entsprechend einer Menge von 1 x 106 Transfektanten durchmustert. Die Abhängigkeit der Transkriptionsaktivierung positiver Klone von der Expression des Beuteproteins wurde auf Leucin-freiem Glucose-Medium überprüft. Die Isolierung der Interaktor-Plasmide erfolgte nach Aufzucht der Hefen in Glucose-Medium ohne Tryptophan, Elektroporation des Nukleinsäure-Isolats im E. coli-Stamm XLI blue (Stratagene) und Plasmidpräparation aus den Bakterienzellen. Zur Bestätigung der Interaktionen wurden Retransformationen des isolierten Beute-Interaktors in Kombinationen mit unterschiedlichen
Köderkonstrukten durchgeführt. In Kombination mit ρEG202FANCA wurde die zuvor beobachtete Interaktion bestätigt. Außerdem wurden mögliche Interaktionen mit dem LexA-Fusionspartner ausgeschlossen, indem einerseits mit dem pEG202- Leervektor co-retransformiert wurde und andererseits mit einem LexA-DNA- Ligase-Köderfusionskonstrukt als Negativkontrolle.
Sequenzanalyse der FANCIP1 -cDNA
Die Länge der Genbank-cDNAs der isolierten Interaktorklone wurde durch
EcoRI/Xhol-Restriktionshydrolyse bestimmt. Die Ansequenzierung der cDNAs erfolgte durch eine automatisierte Cycle Sequencing-Methode (Applied
Biosystems) unter Verwendung des Nukleinsäureprimers Bco I (5'- ACC AGC CTC TTG CTG AGT GGA GAT G-3'). Die vollständige Sequenzierung des Vektors mit inseriertem FANCIP1 -cDNA-Fragment erfolgte mit den Nukleinsäureprimern Bco I und Bco II (5'-GAC AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA G-3') durch die Firma Sequence Laboratories Göttingen.
Zur Ermittlung der 5'-Bereich-Teilsequenz der gefundenen Nukleotidsequenz wurde der 573' RACE Kit (Boehringer-Roche) verwendet. Hierbei kamen die
sequenzspezifischen Primer FANCIP1-SP1 (5'-GGG GGC AGG AAT ATG AGA GG-3') und FANCIP1-SP2 (5'-TTT AGG GGG AAG TGT ACC TG-3') zum Einsatz. Das erhaltene PCR-Produkt wurde elektrophoretisch gereinigt (JETquick Gel Extraction Kit, GENOMED) und unter Verwendung des T7 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (Amersham-Pharmacia) und des oben genannten Primers FANCIP1-SP2 direkt sequenziert. Die Zugehörigkeit des erhaltenen Nukleotidfragments zum Plasmid-inserierten Interaktor-Fragment wurde durch einen überlappenden Sequenzbereich von 38 Nukleotiden bestätigt. Die zusammengesetzte Nukleotidsequenz ergab einen 1553 Nukleotide langen cDNA- Bereich, der einen Teil der 5'-untranslatierten Region, den gesamten offenen Leserahmen von 924 Nukleotiden bzw. 308 Codons und den nahezu kompletten 3'-untranslatierten Bereich bis über das Polyadenylierungssignal (AATAAA) hinaus umfaßt.
Um ähnliche Nukleotidsequenzen in der Sequenzdatenbank des National Center of Biotechnology Information (NCBI) zu finden, wurde die cDNA-Sequenz von FANCIP1 (Fig. 1 ) unter Verwendung des Blast-Programms am NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast? Jform=1 ) analysiert. Nur in der EST-Datenbank ergaben sich signifikante Homologien zu humanen Klonen, die allerdings weder einen vollständigen offenen Leserahmen noch Angaben zu einer möglichen biologischen Funktion enthielten.
Zur Ermittlung potentieller funktioneller Domänen innerhalb des Proteins FANCIP1 wurde die Aminosäuresequenz (Fig. 2) unter Verwendung des ProfileScan- Servers der ISREC-Bioinformatikgruppe (http://www.isrec.isb- sib.ch/software/PFSCAN_form. html) analysiert.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Fig. 1 (SEQ ID NO. 1 ) eine Nukleotidsequenz, die den für FANCIP1 codierenden offenen Leserahmen enthält,
12
Fig. 2 (SEQ ID NO. 2) die Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz,
Fig. 3 (SEQ ID NOs. 3 und 4) die Nukleinsäureprimer, die zur Sequenzierung der Plasmid-inseherten FANCIP1 -Nukleotidsequenz verwendet wurden,
Fig. 4 (SEQ ID NOs. 5 und 6) die Nukleinsäureprimer, die zur 5'-RACE-Analyse verwendet wurden.
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Claims
1. Nukleinsäure, die a) die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Protein- codierenden Abschnitt davon, b) eine der Sequenz aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz, c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder d) eine zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre
Sequenz umfaßt.
2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 , die einen vorzugsweise mindestens 30 Nukleotide umfassenden Protein-codierenden Abschnitt der in Fig. 1 dargestellten Nukleotidsequenz umfaßt.
3. Nukleinsäure, die eine Homologie von mehr als 65% zu der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder einem Abschnitt davon aufweist.
4. Modifizierte Nukleinsäure oder Nukieinsäureanalogon, die eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.
5. Rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Abschnitt davon enthält.
6. Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 5, der die Expression der Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht.
7. Mit einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6 transformierte Zelle, ein entsprechender transgener Organismus oder Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 stabil exprimieren (knock-in) oder deren entsprechendes natürliches Gen gezielt zerstört wurde (knock-out).
8. Polypeptid oder dessen Salz, das von einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.
9. Polypeptid gemäß Anspruch 8, das a) die in Fig. 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder b) eine Homologie von mehr als 60% zu der in Fig. 2 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, oder dessen Salz.
10. Fragment des Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9 mit mindestens 100 Aminosäuren oder dessen Salz.
11. Modifiziertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 8 oder 9 umfaßt.
12. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9, das die Kultivierung von Zellen gemäß Anspruch 7 umfaßt sowie die Isolierung des Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9.
13. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9 oder von Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von
Antikörpern.
14. Antikörper gegen ein Polypeptid gemäß Anspruch 8 oder 9.
15. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren eines Proteins gemäß Anspruch 8 oder 9, mit dessen Hilfe verschiedene potentielle Effektorsubstanzen an Zellen getestet werden können, die das Protein exprimieren.
16. Substanz, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß Anspruch 15 erhalten wurde und die mit mindestens einem Bereich des Proteins gemäß Anspruch 8 oder 9 reagiert und/oder dieses verändert.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente a) eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, b) einen Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6, c) eine Zelle gemäß Anspruch 7, d) ein Polypeptid gemäß Anspruch 8, 9,10 oder 11 , e) einen Antikörper gemäß Anspruch 14 umfaßt oder f) eine Substanz gemäß Anspruch 16 und pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthält.
18. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind, oder einer Prädisposition solcher Erkrankungen.
19. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind.
20. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Gentherapie von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind.
21. Verfahren zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur- Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder
Tumorprogression assoziiert sind oder einer Prädisposition für solche Erkrankungen, bei dem man einen Patienten oder eine aus dem Patienten stammende Probe mit einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 in Kontakt bringt und die Nukleotidsequenz und/oder die Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 bestimmt.
22. Verfahren zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit DNA- Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumoφrogression assoziiert sind, bei dem man einem Patienten eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 verabreicht, die die aktive Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält.
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| SAWAS-DIMOPOULOU C ET AL: "Induction of an Experimental Fanconi Syndrome in Mice: Its Effect on the Glomerular Filtration Function Studied by Tc-DTPA", NUCLEAR MEDICINE AND BIOLOGY,US,ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, NEW YORK, NY, vol. 23, no. 6, 1 August 1996 (1996-08-01), pages 807 - 812, XP000922828, ISSN: 0969-8051 * |
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