DE69839105T2 - XAF Gene und Polypeptide und deren Verwendung zur Modulation der Apoptose - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Apoptose, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α)-vermittelte Signalgebung, Zellzyklus und Unterdrückung von Tumorwachstum.
  • Apoptose ist eine morphologisch unterscheidbare Form des programmierten Zelltods, die wichtig für die normale Entwicklung und Aufrechterhaltung multizellulärer Organismen ist. Deregulation von Apoptose kann die Form von unangemessener Unterdrückung des Zelltods, wie sie in der Entstehung von Krebs stattfindet, oder von einem Unvermögen annehmen, das Ausmaß des Zelltods zu kontrollieren, wie es bei erworbener Immundefizienz und bestimmten neurodegenerativen Erkrankungen vermutlich auftritt.
  • Einige Baculoviren kodieren Proteine, die als "Inhibitoren von Apoptoseproteinen" (IAPs) bezeichnet werden, da sie die Apoptose inhibieren, die sonst stattfinden würde, wenn Insektenzellen mit dem Virus infiziert werden. Es wird angenommen, dass diese Proteine in einer Weise wirken, die unabhängig von anderen viralen Proteinen ist. Die Baculovirus-IAP-Gene beinhalten Sequenzen, die für ein Ring-Zinkfingerähnliches (RZF) Motiv, das an DNA-Bindung beteiligt sein kann, und zwei N-terminale Domänen, die aus einem als BIR-Domäne (Baculovirus IAP Repeat) bezeichneten 70 Aminosäure-Wiederholungsmotiv bestehen, kodieren.
  • Wir haben kürzlich eine Familie von IAP-Polypeptiden aus Säugern gefunden. Diese Polypeptide umfassen die humanen Proteine HIAP-1, HIAP-2 und XIAP und ihre Homologe in Maus. Ein verwandtes Protein, NAIP, ist auch gefunden worden. Es ist gezeigt worden, dass der Säuger-IAP-Gehalt sowohl in Krebszellen als auch in Zellen, die Ereignisse überleben, von denen bekannt ist, dass sie Apoptose induzieren (z. B. Ischämie), erhöht sind. Es ist auch gezeigt worden, dass IAPs Apoptose blo ckieren, die durch diverse Stimuli ausgelöst wird. Diese Ergebnisse stimmen mit einer Rolle der Säuger-IAPs als Inhibitoren von Apoptose überein.
  • Es ist bekannt, dass die IAP-Familie zusätzlich zu den ursprünglichen vier Säugerhomologen mindestens zwei Drosophila-Proteine umfasst (Hay et al., Cell 83: 1253–1262, 1995). Obwohl wir und andere etabliert haben, dass die IAPs Apoptose in Gewebekulturmodellsystemen unterdrücken können, wird ihr Wirkmechanismus noch immer untersucht.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Wir haben eine Familie an Genen, die XAFs, gefunden. Mitglieder der XAF-Genfamilie kodieren Proteine, die mit IAPs interagieren und mit Apoptose assoziiert sind. Unsere Entdeckung erlaubt die Entwicklung von diagnostischen, prognostischen und therapeutischen Verbindungen und Verfahren zur Erkennung und Behandlung von Krankheiten, in denen Apoptose involviert ist.
  • In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure, die für das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) kodiert, wobei das Polypeptid TRAF6-vermittelte NF-κB-Aktivierung in einer Zelle steigert.
  • In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure, die zu mindestens 10 Nukleotiden einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) kodiert, komplementär ist, wobei die Nukleinsäure bei einer Verabreichung an eine Zelle eine Antisense-Nukleinsäure ist, die ausreicht, um die Apoptose-induzierende Aktivität von XAF-1 zu verringern. In verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspektes ist die Antisense-Nukleinsäure komplementär zu mindestens 15 Nukleotiden, mindestens 30 Nukleotiden oder mindestens 100 Nukleotiden einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 kodiert. In anderen Ausführungsformen wird die Apoptose-induzierende Aktivität um mindestens 20%, 40%, 60% oder 80% verringert. In noch einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung liegt die Antisense-Nukleinsäure in einem Vektor vor, wobei der Vektor fähig ist, eine Expression der Antisense-Nukleinsäure in einer Vektor-enthaltenden Zelle zu steuern.
  • In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung einen Vektor, der eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure umfasst, die für das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) kodiert, wobei der Vektor fähig ist, eine Expression des Polypeptids in einer Vektor-enthaltenden Zelle zu steuern.
  • In einem anderen verwandten Aspekt betrifft die Erfindung eine Zelle, die eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure enthält, die für das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts wird die Nukleinsäure in der Zelle exprimiert. In einer weiteren Ausführungsform ist die Nukleinsäure genomische DNA oder cDNA und ist mit regulatorischen Sequenzen für eine Expression des Polypeptids funktionell verbunden, wobei die regulatorischen Sequenzen einen Promotor (z. B. einen konstitutiven Promotor, einen durch ein oder mehrere externe Mittel induzierbaren Promotor oder einen Zelltyp-spezifischen Promotor) umfassen.
  • In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die Apoptose moduliert. Das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle, die die Nukleinsäure von SEQ ID NO: 1 (XAF-1-Gen) aufweist; (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Kandidatenverbindung; und (c) Überwachen der Expression der Nukleinsäure, wobei eine Veränderung hinsichtlich des Ausmaßes einer Expression der Nukleinsäure die Anwesenheit einer Verbindung, die Apoptose moduliert, anzeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts zeigt die Veränderung, die eine Erhöhung ist, an, dass die Verbindung Apoptose erhöht, und die Veränderung, die eine Verringerung ist, zeigt an, dass die Verbindung Apoptose verringert. In verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspekts ist die Zelle transformiert und die Zelle kann Apoptose nicht durch Expression von p53 induzieren.
  • In einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu hemmen, das umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) oder das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) exprimiert; (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Kandidatenverbindung; und (c) Messen des Ausmaßes an Apoptose in der Zelle, wobei eine Verringerung des Ausmaßes im Verhältnis zu einem Ausmaß in einer Zelle, die nicht mit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wurde, eine Verbindung anzeigt, die fähig ist, Apoptose zu hemmen. In verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspekts ist die Zelle transformiert und die Zelle ist nicht fähig, Apoptose durch Expression von p53 zu induzieren.
  • In einem siebten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu induzieren, das umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) oder das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) exprimiert; (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Kandidatenverbindung; und (c) Messen des Ausmaßes an Apoptose in der Zelle, wobei eine Erhöhung des Ausmaßes im Verhältnis zu einem Ausmaß in einer Zelle, die nicht mit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wurde, eine Verbindung anzeigt, die fähig ist, Apoptose zu induzieren. In verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspekts ist die Zelle transformiert und die Zelle ist nicht fähig, Apoptose durch Expression von p53 zu induzieren.
  • In verwandten Aspekten betrifft die Erfindung andere Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu modulieren.
  • Ein solches Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle, die ein Polypeptid ausgewählt aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) und ein Reportergen exprimiert, das operabel mit DNA verbunden ist, die eine NF-κB-Bindestelle umfasst; (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Kandidatenverbindung; und (c) Messen der Expression des Reportergens, wobei eine Veränderung der Expression in Reaktion auf die Verbindung anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren. In verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspekts ist die Zelle transformiert und die Zelle ist nicht fähig, Apoptose durch Expression von p53 zu induzieren.
  • Ein zweites solches Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle, die ein Polypeptid ausgewählt aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) und ein Reportergen exprimiert, das operabel mit DNA verbunden ist, die eine NF-κB-Bindestelle umfasst; (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Kandidatenverbindung; und (c) Messen der Expression des Reportergens, wobei eine Veränderung der Expression in Reaktion auf die Verbindung anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren. In verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspekts ist die Zelle transformiert und die Zelle ist nicht fähig, Apoptose durch Expression von p53 zu induzieren.
  • Ein drittes solches Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle mit: (i) einem Reportergen, das operabel mit einer DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle verbunden ist; (ii) einem ersten Fusionsgen, das fähig ist, ein erstes Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das erste Fusionsprotein das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) oder das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) in kovalenter Bindung an eine Bindegruppe umfasst, die fähig ist, spezifisch an die DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle zu binden; (iii) einem zweiten Fusionsgen, das fähig ist, ein zweites Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das zweite Fusionsprotein ein Polypeptid, das ausgewählt ist aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1), dem Polypeptid von SEQ ID NO: 4 (XAF-2), TRAF und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C), in kovalenter Bindung an eine Gen-aktivierende Gruppe umfasst; (b) Exponieren der Zelle gegenüber der Verbindung; und (c) Messen von Reportergen-Expression in der Zelle, wobei eine Veränderung in der Reportergen-Expression anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist die Zelle eine Hefezelle.
  • Ein viertes Verfahren zum Nachweis einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu modulieren, umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle mit: (i) einem Reportergen, das operabel mit einer DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle verbunden ist; (ii) einem ersten Fusionsgen, das fähig ist, ein erstes Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das erste Fusionsprotein das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) oder das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) in kovalenter Bindung an eine Bindegruppe umfasst, die fähig ist, spezifisch an die DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle zu binden; (iii) einem zweiten Fusionsgen, das fähig ist, ein zweites Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das zweite Fusionsprotein ein IAP-Polypeptid in kovalenter Bindung an eine Gen-aktivierende Gruppe umfasst; (b) Exponieren der Zelle gegenüber der Verbindung; und (c) Messen von Reportergen-Expression in der Zelle, wobei eine Veränderung in der Reportergen-Expression anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist das IAP XIAP. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine Hefezelle.
  • Ein fünftes solches Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle mit: (i) einem Reportergen, das operabel mit einer DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle verbunden ist; (ii) einem ersten Fusionsgen, das fähig ist, ein erstes Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das erste Fusionsprotein ein IAP-Polypeptid in kovalente Bindung an eine Bindegruppe umfasst, die fähig ist, spezifisch an die DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle zu binden; (iii) einem zweiten Fusionsgen, das fähig ist, ein zweites Fu sionsprotein zu exprimieren, wobei das zweite Fusionsprotein das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) oder das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) in kovalenter Bindung an eine Gen-aktivierende Gruppe umfasst; (b) Exponieren der Zelle gegenüber der Verbindung; und (c) Messen von Reportergen-Expression in der Zelle, wobei eine Veränderung in der Reportergen-Expression anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist IAP XIAP. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine Hefezelle.
  • Ein sechstes solches Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines ersten Polypeptids, das ausgewählt ist aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C), wobei das erste Polypeptid auf einem Festphasensubstrat immobilisiert ist; (b) In-Kontakt-Bringen des ersten Polypeptids mit einem zweiten Polypeptid, das ausgewählt ist aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1), dem Polypeptid von SEQ ID NO: 4 (XAF-2), TRAF und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C); (c) In-Kontakt-Bringen der ersten und zweiten Polypeptide mit einer Verbindung; und (d) Messen der Menge an Bindung des ersten Polypeptids an das zweite Polypeptid, wobei eine Veränderung in der Menge im Verhältnis zu einer Menge, die nicht mit der Verbindung in Kontakt gebracht wurde, anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren.
  • Ein siebtes Verfahren zum Nachweis einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu modulieren, umfasst: (a) Bereitstellen eines ersten Polypeptids, das ausgewählt ist aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C), wobei das erste Polypeptid auf einem Festphasensubstrat immobilisiert ist; (b) In-Kontakt-Bringen des ersten Polypeptids mit einem IAP-Polypeptid; (c) In-Kontakt-Bringen des ersten Polypeptids und des IAP-Polypeptids mit einer Verbindung; und (d) Messen der Menge an Bindung des ersten Polypeptids an das IAP-Polypeptid, wobei eine Veränderung in der Menge im Verhältnis zu einer Menge, die nicht mit der Verbindung in Kontakt gebracht wurde, anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist das IAP XIAP.
  • Ein achtes solches Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines IAP-Polypeptids, das auf einem Festphasensubstrat immobilisiert ist; (b) In-Kontakt-Bringen des IAP-Polypeptids mit einem zweiten Polypeptid, das ausgewählt ist aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C); (c) In-Kontakt-Bringen des IAP-Polypeptids und des zweiten Polypeptids mit einer Verbindung; und (d) Messen der Menge an Bindung des IAP-Polypeptids an das zweite Polypeptid, wobei eine Veränderung der Menge im Verhältnis zu einer Menge, die nicht mit der Verbindung in Kontakt gebracht wurde, anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist das IAP XIAP.
  • In einem sechzehnten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von Apoptose in einer Zelle in vitro durch Verabreichung einer Apoptose-induzierenden Menge eines Polypeptids, das ausgewählt ist aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C), an die Zelle.
  • In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle ein peripherer Blutleukozyt (z. B. ein Lymphozyt), eine Muskelzelle (z. B. eine Myokardzelle), eine Darmzelle, eine Ovarialzelle, eine Plazentazelle oder eine Thymuszelle (z. B. ein Thymozyt).
  • "XAF", "XAF-Protein" oder "XAF-Polypeptid" bedeutet ein Polypeptid oder ein Fragment davon, das mindestens 30%, mehr bevorzugt mindestens 35% und am meisten bevorzugt 40% Aminosäure-Identität mit entweder den 131 aminoterminalen Aminosäuren des humanen XAF-1-Polypeptids (SEQ ID NO: 2) oder den 135 aminoterminalen Aminosäuren des humanen XAF-2L-Polypeptids (SEQ ID NO: 10) aufweist. Es soll verstanden werden, dass Polypeptid-Produkte von Splicevarianten der XAF-Gensequenzen auch von dieser Definition umfasst sind. Vorzugsweise wird das XAF-Protein durch Nukleinsäure mit einer Sequenz kodiert, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die in entweder SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 9 vorhanden ist. Mehr bevorzugt weist das kodierte Polypeptid auch XAF-biologische Aktivität auf. Vorzugsweise hat das XAF-Polypeptid mindestens drei Zinkfinger-Domänen. Mehr bevorzugt hat das XAF-Polypeptid mindestens sechs Zinkfinger-Domänen, wovon mindestens fünf innerhalb von 150 Aminosäuren des N-Terminus vorkommen.
  • "Zinkfinger" bedeutet eine Bindedomäne, die fähig ist, mit Zink zu assoziieren. Eine bevorzugte Zink-bindende Domäne weist die Aminosäuresequenz 5' C-X2-5-C-X11-18-C/H-X2-5-C/H 3' (SEQ ID NO: 6) auf, wobei "X" jegliche Aminosäure sein kann. Eine mehr bevorzugte Zink-bindende Domäne weist die Aminosäuresequenz 5' C-X1-2-C- X11-H-X3-5-C 3' (SEQ ID NO: 7) auf, wobei "X" jegliche Aminosäure sein kann. Noch mehr bevorzugt weist eine Zink-bindende Domäne die Aminosäuresequenz 5' C-X2-H-X11-H-X3-C 3' (SEQ ID NO: 8) auf, wobei "X" jegliche Aminosäure sein kann. Am meisten bevorzugt ist eine Zink-bindende Domäne eine solche, die in einem XAF-Polypeptid gefunden wird.
  • "XAF-biologische Aktivität" bedeutet eine jegliche oder mehrere der biologischen Aktivitäten, die hierin für XAF-1, XAF-2L oder XAF-2S beschrieben sind, die ohne Einschränkung die Fähigkeit, ein IAP- (z. B. ein XIAP) oder ein anderes XAF-Polypeptid zu binden, die Fähigkeit, bei Transfektion in eine Zelle (insbesondere in eine HeLa-Zelle) Apoptose zu verursachen, die Fähigkeit, die NF-κB-induzierende Aktivität eines TRAF zu erhöhen, und die Fähigkeit, spezifisch einen XAF-1-, XAF-2L- oder XAF-2S-spezifischen Antikörper zu binden, umfassen.
  • "Modulation von Apoptose" oder "Veränderung von Apoptose" bedeutet Erhöhung oder Verringerung der Anzahl an Zellen, die Apoptose durchlaufen, (als sonst der Fall wäre) in einer gegebenen Zellpopulation. Vorzugsweise ist die Zellpopulation ausgewählt aus einer Gruppe, die T-Zellen, neuronale Zellen, Fibroblasten, Myokardzellen oder eine jegliche andere Zelllinie umfasst, die dafür bekannt ist, Apoptose in einer Labor-Anordnung zu durchlaufen (z. B. die Baculovirus-infizierten Insektenzellen oder ein in vivo-Assay). Es wird erkannt werden, dass das Ausmaß an Modulation, das durch ein XAF-Polypeptid oder eine modulierende Verbindung in einem bestimmten Assay erreicht wird, variieren wird, aber dass der Fachmann die statistisch signifikante Veränderung oder eine therapeutisch wirksame Veränderung im Ausmaß an Apoptose bestimmen kann, die ein XAF-Polypeptid oder eine Verbindung, die XAF moduliert oder ein XAF-Therapeutikum ist, identifiziert.
  • "Hochstringente Bedingungen" bedeutet Hybridisierung in 2 × SSC bei 40°C mit einer DNA-Sondenlänge von mindestens 40 Nukleotiden. Siehe Ausubel, F. et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 6.3.1–6.3.6 für weitere Definitionen von hochstringenten Bedingungen.
  • "IAP" bedeutet eine Aminosäuresequenz, die Identität mit Inhibitoren von Apoptose aus Baculovirus aufweist. IAPs aus Säugern umfassen ohne Beschränkung NAIP, HIAP1, HIAP2 und XIAP. Vorzugsweise weist ein solches Polypeptid eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens 45%, vorzugsweise 60% und am meisten bevorzugt 85% oder sogar 95% identisch mit mindestens einer der Aminosäuresequenzen eines Baculovirus-IAP ist.
  • "Inhibieren von Apoptose" bedeutet jegliche Verringerung in der Anzahl an Zellen, die Apoptose durchlaufen, im Verhältnis zu einer unbehandelten Kontrolle. Vorzugsweise beträgt die Verringerung mindestens 25%, mehr bevorzugt beträgt die Verringerung 50% und am meisten bevorzugt beträgt die Verringerung mindestens 1-fach.
  • "Polypeptid" bedeutet eine jegliche Kette von mehr als zwei Aminosäuren unabhängig von post-translationalen Modifikationen wie Glykosylierung oder Phosphorylierung.
  • "Pharmazeutisch verträglicher Träger" bedeutet ein Träger, der für den behandelten Säuger physiologisch verträglich ist, während die therapeutischen Eigenschaften der Verbindung, mit der er verabreicht wird, beibehalten werden. Ein beispielhafter pharmazeutisch verträglicher Träger ist physiologische Kochsalzlösung. Andere physiologisch verträgliche Träger und ihre Formulierungen sind dem Fachmann bekannt und zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, (18. Auflage), Hrsg. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA, beschrieben.
  • "Im Wesentlichen identisch" bedeutet, dass ein Polypeptid oder eine Nukleinsäure mindestens 50%, vorzugsweise 85%, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95% Homologie zu einer Referenz-Aminosäure- oder -Nukleinsäuresequenz aufweist. Für Polypeptide ist die Länge der Vergleichssequenzen im Allgemeinen mindestens 16 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 20 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens 25 Aminosäuren und am meisten bevorzugt 35 Aminosäuren. Für Nukleinsäuren ist die Länge der Vergleichssequenzen im Allgemeinen mindestens 50 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 60 Nukleotide, mehr bevorzugt mindestens 75 Nukleotide und am meisten bevorzugt 110 Nukleotide.
  • Sequenzidentität wird üblicherweise unter Verwendung von Sequenzanalysesoftware mit den darin bestimmten Standardparametern gemessen (z. B. Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Dieses Softwareprogramm paart ähnliche Sequenzen durch Zuweisung von Homologiegraden zu verschiedenen Substitutionen, Deletionen und anderen Modifikationen. Konservati ve Substitutionen umfassen üblicherweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin.
  • "Im Wesentlichen reines Polypeptid" bedeutet ein Polypeptid, das von den Komponenten, die es natürlicherweise umgeben, abgetrennt worden ist. Üblicherweise ist das Polypeptid im Wesentlichen rein, wenn es zu mindestens 60 Gew.-% frei von den Proteinen und natürlich vorkommenden organischen Molekülen ist, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist. Vorzugsweise ist das Polypeptid ein XAF-Polypeptid, das zu mindestens 75 Gew.-%, mehr bevorzugt mindestens 90 Gew.-% und am meisten bevorzugt mindestens 99 Gew.-% rein ist. Ein im Wesentlichen reines XAF-Polypeptid kann zum Beispiel durch Extraktion von einer natürlichen Quelle (z. B. einem Fibroblasten, einer neuronalen Zelle oder einem Lymphozyt), durch Expression einer rekombinanten Nukleinsäure, die ein XAF-Polypeptid kodiert, oder durch chemische Synthese des Proteins erhalten werden. Reinheit kann durch ein jegliches geeignetes Verfahren gemessen werden, z. B. durch Säulenchromatographie, Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese oder HPLC-Analyse.
  • Ein Protein ist im Wesentlichen frei von natürlicherweise assoziierten Komponenten, wenn es von den Verunreinigungen, die es in seiner natürlichen Form umgeben, abgetrennt ist. Daher wird ein Protein, das chemisch synthetisiert oder in einem zellulären System, das unterschiedlich von der Zelle ist, von der es natürlicherweise abstammt, hergestellt worden ist, im Wesentlichen frei von seinen natürlicherweise assoziierten Komponenten sein. Dementsprechend umfasst im Wesentlichen reines Polypeptid nicht nur diejenigen, die von eukaryotischen Organismen abgeleitet sind, sondern auch diejenigen, die in E. coli oder anderen Prokaryoten synthetisiert worden sind. "Im Wesentlichen reine DNA" bedeutet DNA, die frei von den Genen ist, die das Gen im natürlicherweise vorkommenden Genom des Organismus, von dem die erfindungsgemäße DNA abgeleitet ist, flankieren. Der Begriff umfasst daher z. B. eine rekombinante DNA, die in einen Vektor, in ein autonom replizierendes Plasmid oder Virus oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten eingebaut ist, oder die als ein separates Molekül (z. B. eine cDNA oder ein genomisches oder cDNA-Fragment, das durch PCR oder Restriktionsendonuklease-Verdau hergestellt worden ist) unabhängig von anderen Sequenzen vorliegt. Er umfasst auch eine rekombinante DNA, die Teil eines Hybridgens ist, das zusätzliche Polypeptid-Sequenzen kodiert.
  • "TRAF" bedeutet ein Mitglied der TRAF-Proteinfamilie. Mitglieder der TRAF-Familie besitzen jeweils einen aminoterminalen RING-Zinkfinger und/oder zusätzliche Zinkfinger, einen Leucin-Zipper und ein einzigartiges konserviertes carboxyterminales Coiled-Coil-Motiv, die TRAF-C-Domäne, die die Familie definiert. TRAF1 und TRAF2 wurden zuerst als Komponenten des TNF-R2-Signalkomplexes identifiziert (Rothe et al., Cell 78: 681–692, 1994). Bevorzugte TRAF-Polypeptide sind TRAF2, TRAF5 und TRAF6.
  • "Transgen" bedeutet ein jegliches Stück DNA, das künstlich in eine Zelle inseriert wurde und Teil des Genoms des Organismus wird, der sich aus der Zelle entwickelt. Solch ein Transgen kann ein Gen umfassen, das teilweise oder gänzlich heterolog (d. h. fremd) zu dem transgenen Organismus ist, oder kann ein Gen darstellen, das homolog zu einem endogenen Gen des Organismus ist.
  • "Transgen" als Adjektiv bedeutet eine jegliche Zelle, die eine DNA-Sequenz umfasst, die künstlich in eine Zelle inseriert wurde und Teil des Genoms des Organismus wird, der sich aus dieser Zelle entwickelt. Wie hierin verwendet, sind die transgenen Organismen im Allgemeinen transgene Säuger (z. B. Nagetiere wie Ratten oder Mäuse) und die DNA (Transgen) ist künstlich in das Kern-Genom inseriert.
  • "Knockout-Mutation" bedeutet eine Veränderung in der Nukleinsäuresequenz, die die biologische Aktivität des Polypeptids, das normalerweise von dieser kodiert wird, um mindestens 80% im Verhältnis zu dem nicht mutierten Gen reduziert. Die Mutation kann ohne Einschränkung eine Insertion, Deletion, Frameshift-Mutation oder eine Missense-Mutation sein. Vorzugsweise ist die Mutation eine Insertion oder Deletion oder eine Frameshift-Mutation, die ein Stop-Codon erzeugt.
  • "Transformation" bedeutet ein jegliches Verfahren zur Einführung fremder Moleküle in eine Zelle. Lipofektion, Calciumphosphatpräzipitation, retroviraler Transport, Elektroporation und biolistische Transformation sind nur ein paar der Lehren, die verwendet werden können. Zum Beispiel ist biolistische Transformation ein Verfahren zum Einführen fremder Moleküle in eine Zelle unter Verwendung von Geschwindigkeits-getriebenen Mikroprojektilen wie Wolfram- oder Goldpartikel. Solche Geschwindigkeits-getriebenen Verfahren stammen von Druckausbrüchen ab, die in nicht begrenzender Weise Helium-getriebene, Luft-getriebene und Schwarzpulver-getriebene Techniken umfassen. Biolistische Transformation kann für die Transformation oder Transfektion einer großen Auswahl an Zelltypen und intakten Gewe ben, die ohne Begrenzung intrazelluläre Organelle (z. B. Mitochondrien und Chloroplasten), Bakterien, Hefen, Pilze, Algen, Tiergewebe und kultivierte Zellen umfassen, angewandt werden.
  • "Transformierte Zelle" bedeutet eine Zelle, in die (oder in deren Vorgänger) durch rekombinante DNA-Techniken ein DNA-Molekül, das ein XAF-Polypeptid kodiert (wie hierin verwendet), eingebracht wurde.
  • "Für Expression positioniert" bedeutet, dass das DNA-Molekül benachbart zu einer DNA-Sequenz positioniert ist, die Transkription und Translation der Sequenz bestimmt (d. h. die Produktion von z. B. einem XAF-1-Polypeptid, einem rekombinanten Protein oder einem RNA-Molekül fördert).
  • "Reportergen" bedeutet ein jegliches Gen, das ein Produkt kodiert, dessen Expression bestimmbar ist. Ein Reportergen-Produkt kann ohne Begrenzung eine der folgenden Eigenschaften haben: Fluoreszenz (z. B. grün fluoreszierendes Protein), enzymatische Aktivität (z. B. Luciferase oder Chloramphenicol-Acetyl-Transferase), Toxizität (z. B. Rizin) oder eine Fähigkeit, spezifisch durch ein zweites Molekül (z. B. Biotin oder einen nachweisbar markierten Antikörper) gebunden zu werden.
  • "Promotor" bedeutet eine minimale Sequenz, die ausreicht, Transkription zu bestimmen. Auch umfasst sind jene Promotorelemente, die ausreichend sind, um eine Promotor-abhängige Genexpression Zelltyp-spezifisch, Gewebe-spezifisch oder induzierbar durch externe Signale oder Mittel zu machen; solche Elemente können in den 5'- oder 3'- oder Intron-Sequenzregionen des nativen Gens lokalisiert sein.
  • "Operabel verbunden" bedeutet, dass ein Gen und eine oder mehrere regulatorische Sequenzen in einer solchen Weise verbunden sind, dass Genexpression ermöglicht wird, wenn die geeigneten Moleküle (z. B. transkriptionelle Aktivatorproteine) an die regulatorischen Sequenzen gebunden sind.
  • "Konservierte Region" bedeutet einen jeglichen Bereich von sechs oder mehr aufeinander folgenden Aminosäuren, der mindestens 30%, vorzugsweise 50% und am meisten bevorzugt 70% Aminosäuresequenzidentität zwischen zwei oder mehreren Mitgliedern der XAF-Familie (z. B. zwischen humanem XAF-1 und einem anderen humanen XAF) aufweist.
  • "Nachweisbar markiert" bedeutet ein jegliches Mittel zur Markierung und Identifizierung des Vorhandenseins eines Moleküls, z. B. einer Oligonukleotid-Sonde oder eines Oligonukleotid-Primers, eines Gens oder eines Fragments davon oder eines cDNA-Moleküls. Verfahren zur nachweisbaren Markierung eines Moleküls sind bekannt und umfassen ohne Begrenzung radioaktive Markierung (z. B. mit einem Isotop wie 32P oder 35S) und nicht-radioaktive Markierung (z. B. chemilumineszente Markierung, z. B. Fluorescein-Markierung).
  • "Antisense" wie hierin verwendet in Bezug auf Nukleinsäuren bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu dem kodierenden Strang eines Gens, vorzugsweise eines XAF-Gens, ist.
  • "Gereinigter Antikörper" bedeutet ein Antikörper, der zu mindestens 60 Gew.-% frei von Proteinen und natürlich vorkommenden organischen Molekülen ist, mit denen er natürlicherweise assoziiert ist. Vorzugsweise ist die Präparation zu mindestens 75 Gew.-%, mehr bevorzugt 90 Gew.-% und am meisten bevorzugt mindestens 99 Gew.-% Antikörper, z. B. ein XAF-1-, XAF-2-N-Terminus-, XAF-2L- oder XAF-2S-spezifischer Antikörper. Ein gereinigter Antikörper kann z. B. durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von rekombinant hergestelltem Protein oder Peptiden mit konservierten Motiven und Standardtechniken erhalten werden.
  • "Spezifisch binden" bedeutet ein Antikörper, der in einer Probe, z. B. einer biologischen Probe, die natürlicherweise Protein umfasst, ein XAF-Polypeptid erkennt und bindet, der jedoch nicht im Wesentlichen andere Nicht-XAF-Moleküle erkennt und bindet. Ein bevorzugter Antikörper bindet an die XAF-1-Peptidsequenz von 1 (SEQ ID NO: 2). Ein anderer bevorzugter Antikörper bindet an die XAF-2-N-terminale Peptidsequenz von 35 (SEQ ID NO: 4). Noch ein anderer bevorzugter Antikörper bindet an die XAF-2L-Peptidsequenz von 37 (SEQ ID NO: 10). Noch ein anderer bevorzugter Antikörper bindet an die XAF-2S-Peptidsequenz von 38C (SEQ ID NO: 12). Ein mehr bevorzugter Antikörper bindet an zwei oder mehr von XAF-1 (SEQ ID NO: 2), XAF-2-N-Terminus (SEQ ID NO: 4), XAF-2L (SEQ ID NO: 10) und XAF-2S (SEQ ID NO: 12).
  • "Neutralisierende Antikörper" bedeutet Antikörper, die eine jegliche der biologischen Aktivitäten eines XAF-Polypeptids, insbesondere die Fähigkeit eines XAF, bei Apoptose teilzunehmen, beeinträchtigen. Der neutralisierende Antikörper kann die Fähigkeit eines XAF-Polypeptids, an Apoptose teilzunehmen, vorzugsweise um 50%, mehr bevorzugt um 70% und am meisten bevorzugt um 90% oder mehr verringern. Ein jeglicher Standard-Apoptose-Assay, umfassend die hierin beschriebenen, kann verwendet werden, um mögliche neutralisierende Antikörper zu bewerten.
  • Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung sind der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und den Ansprüchen zu entnehmen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine Auflistung der cDNA-(oben; SEQ ID NO: 1) und vorhergesagten Aminosäure-(unten; SEQ ID NO: 2)-Sequenzen des humanen XAF-1.
  • 2 ist ein schematisches Diagramm der sechs vorhergesagten Zn-Finger-Bindedomänen, die den 178 N-terminalen Aminosäuren von XAF-1 (SEQ ID NO: 6) entsprechen.
  • 3 ist eine Northern-Blot-Analyse von XAF-1-mRNA in mehreren humanen Geweben und verschiedenen Zelllinien.
  • 4 ist eine Northern-Dot-Blot-Analyse von XAF-1-mRNA in mehreren adulten und fötalen humanen Geweben.
  • 5 ist eine genomische Southern-Blot-Analyse von XAF-1.
  • 6 ist eine Western-Blot-Analyse des XAF-1-Proteinexpressionsgrads in verschiedenen Zelllinien.
  • 7 sind schematische Diagramme von XAF-1-Konstrukten.
  • 8 ist eine Western-Blot-Analyse von XAF-1-, XAF-1N-(SEQ ID NO: 7) und XAF-1C-(SEQ ID NO: 8)-Proteinexpressionsgraden bei transienter Expression in 293 T-Zellen.
  • 9 ist ein Graph, der den Effekt von p53- und XAF-Überexpression auf das Überleben von HEL-Zellen zeigt.
  • 10 zeigt den Effekt von p53- und XAF-Überexpression auf das Überleben von HeLa-Zellen.
  • 11A, 11B und 11C zeigen Fotografien von HEL-Zellen, die mit Adeno-LacZ, Adeno-p53 bzw. Adeno-XAF-1 infiziert wurden.
  • 12A, 12B und 12C zeigen Fotografien von HeLa-Zellen, die mit Adeno-LacZ, Adeno-p53 bzw. Adeno-XAF-1 infiziert wurden.
  • 13A, 13B, 13C und 13D sind Graphen, die Zellzyklus-Profile von HEL-Zellen zeigen, die mit nichts, Adeno-LacZ, Adeno-p53 bzw. Adeno-XAF-1 transfiziert wurden.
  • 14A, 14B, 14C und 14D sind Graphen, die Zellzyklus-Profile von HeLa-Zellen zeigen, die mit nichts, Adeno-LacZ, Adeno-p53 bzw. Adeno-XAF-1 transfiziert wurden.
  • 15A und 15B zeigen die Lokalisation von humanem XAF-1 durch FISH. 15A zeigt eine Metaphase-Ausbreitung, die mit einer genomischen XAF-1-Sonde hybridisiert wurde. 15B zeigt eine Metaphase-Ausbreitung nach G-Bandenbildung mit Giemsa-Anfärbung. Spezifische Fluoreszenzsignale auf 17p13.3 sind durch Pfeile gekennzeichnet.
  • 16A und 16B zeigen die subzelluläre Lokalisation des XAF-1-Proteins.
  • 17A, 17B und 17C sind Fotografien von CHO-K1-Zellen, die XAF-1 exprimieren, das mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert ist, und die mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wurden.
  • 18A und 18B sind Fotografien von 3Y1-Zellen, die GFP exprimieren und mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wurden.
  • 19A und 19B sind Fotografien von 3Y1-Zellen, die GFP-markiertes XAF-1 exprimieren, und die mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wurden.
  • 20 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch Expression der angegebenen Proteine induziert wurde.
  • 21 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch Co-Expression der angegebenen Proteine induziert wurde.
  • 22 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch TRAF6, das mit den angegebenen Mengen an XAF-1-Protein co-exprimiert wurde, induziert wurde.
  • 23 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch TRAF6, das mit den angegebenen Mengen an XIAP-Protein co-exprimiert wurde, induziert wurde.
  • 24 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch TRAF6, das mit XIAP- und XAF-1-Proteinen co-exprimiert wurde, induziert wurde.
  • 25 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch TRAF2, das mit XIAP- und XAF-1-Proteinen co-exprimiert wurde, induziert wurde.
  • 26 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch TRAF6, das mit entweder Volllängen-XAF-1-Protein, einem Fragment, das den N-Terminus des XAF-1-Proteins darstellt, oder einem Fragment, das den C-Terminus des XAF-1-Proteins darstellt, co-exprimiert wurde, induziert wurde.
  • 27 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch entweder TRAF5 oder TRAF6 bei Co-Expression mit entweder XAF-1-Antisense-DNA oder Bcl-2-Antisense-DNA induziert wurde.
  • 28 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch Interleukin-1β (IL-1β) in Anwesenheit von entweder XAF-1-Antisense-RNA- oder Bcl-2-Antisense-RNA-Expression induziert wurde.
  • 29 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch Interleukin-1β (IL-1β) in Anwesenheit von DNA, die für XAF-1-Protein kodiert, induziert wurde.
  • 30 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch TRAF2, TRAF5 oder TRAF6 co-exprimiert mit A20-Protein induziert wurde.
  • 31 ist ein Graph der relativen Luciferase-Aktivität, die durch NF-κB-Aktivierung durch Erhöhung der Mengen an A20-Protein co-exprimiert mit TRAF6 alleine oder in Kombination mit XAF-1 induziert wurde.
  • 32 ist eine Western-Blot-Analyse von myc-markierten Proteinen von Affinitätsreinigungen mit GST-Kontroll- und GST-XAF-1-Fusionsproteinen.
  • 33 ist ein Autoradiogramm eines in vitro-Bindeassays von in vitro-translatierten HIAP-1- und TRAF2-Proteinen mit GST-Kontroll- und GST-XAF-1-Fusionsproteinen.
  • 34 ist eine Tabelle, die die Interaktionsergebnisse eines Hefe-Zwei-Hybrid-Assays auflistet.
  • 35 ist eine Auflistung der cDNA-(oben; SEQ ID NO: 3) und der vorhergesagten Aminosäure-(unten; SEQ ID NO: 4)-Sequenzen des N-Terminus des humanen XAF-2. Die sieben Zinkfinger-Motive sind durch Kästchen und römische Zahlen markiert.
  • 36 ist eine Auflistung der DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 5) der 3'-nicht-translatierten Region (UTR) des humanen XAF-2, die etwa 250 Basenpaare C-terminal der SEQ ID NO: 3 lokalisiert ist.
  • 37A ist eine Auflistung der Volllängen-5'-Nukleotid-(oben; SEQ ID NO: 9) und -Aminosäure-(unten; SEQ ID NO: 10)-Sequenzen der langen (XAF-2L) Splicevariante von XAF-2. Die kurze Splicevariante von XAF-2 (XAF-2S) ist wie angegeben gesplicet.
  • 37B ist ein Alignment, das die Nukleinsäuresequenz von XAF-2L (oben) mit der gesamten Nukleinsäuresequenz von XAF-2S (unten; SEQ ID NO: 11) vergleicht.
  • 38A, 38B und 38C sind Auflistungen der Aminosäuresequenz von XAF-1, XAF-2L bzw. XAF-2S (SEQ ID NO: 12), wobei die Zinkfinger-Bindedomänen angegeben sind.
  • 39 ist ein Alignment, das die Sequenz der ersten 396 Aminosäuren von XAF-2L (oben) mit der gesamten Aminosäuresequenz von XAF-1 (unten) vergleicht.
  • 40 ist ein Satz von zwei schematischen Zeichnungen, die das Alignment der Zinkfinger-Bindedomänen in XAF-1 (oben) und XAF-2L (unten) anzeigen.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
  • Wir haben eine Familie an Proteinen, die XAFs, gefunden, die mit IAPs interagieren und in den TNFα-Signaltransduktionsweg eingebunden sind, der Apoptose reguliert.
  • Die TNF-Rezeptor-Superfamilie umfasst mindestens 13 Transmembran-Typ I-Glykoproteine, die aus zwei identischen Untereinheiten mit unterschiedlichen Zahlen einer charakteristischen Cystein-reichen extrazellulären Wiederholung bestehen. Von diesen Mitgliedern umfasst sind TNF-Rezeptor 1 (TNF-R1), TNF-Rezeptor 2 (TNF-R2), CD40, Fas und CD30. Die entsprechenden Liganden für diese Rezeptoren sind üblicherweise Typ II-Transmembran-Glykoproteine, die auf der Oberfläche von interagierenden Zellen exprimiert werden. In einigen Fällen, namentlich bei Lymphotoxin-α (auch bekannt als TNFβ) und der Mehrheit von Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα), wird der Ligand von der Zelle sekretiert.
  • Die Signale, die durch ligierte Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie generiert werden, können abhängig von der Art und dem Aktivierungsstatus der Zielzelle stimulierend oder hemmend sein. Jedoch gibt es eine beträchtliche Überlappung bei den Signaltransduktionswegen; z. B. führt eine Ligation von TNF-R1, TNF-R2, CD30 und CD40 (Kitson et al., Nature 384: 372–275, 1996) in allen Fällen zu NF-κB-Aktivierung, ein Transkriptionsfaktor, der latent im Cytoplasma von Zellen im Komplex mit einem Inhibitorprotein, genannt I-κB, gefunden wird. Rezeptorligation induziert die Phosphorylierung von I-κB, was I-κB empfänglich für Ubiquitinierung und nachfolgende Degradation macht. I-κB-Degradation enthüllt das nukleäre Translokationssignal in NF-κB und erlaubt nukleäre Lokalisation und Transkriptionsaktivierung von NF-κB-abhängigen Promotoren (Übersicht in Grilli et al., Int. Rev. Cytol. 143: 1–60, 1993).
  • Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα) vermittelt seine verschiedenen Wirkungen durch sowohl die 55–60 kDa TNF-R1- als auch die 75–80 kDa TNF-R2-Rezeptoren. Die cytoplasmatischen Domänen von TNF-R1 und TNF-R2 sind nicht konserviert, was sich sowohl in den Proteinfaktoren, die mit den cytoplasmatischen Domänen assoziiert sind, als auch in den Konsequenzen einer Rezeptorstimulation widerspiegelt. TNF-α-Signalgebung durch TNF-R2 kann abhängig von dem Zelltyp und Aktivierungsstatus entweder proliferative Antworten (d. h. Thymozyten- und mononukleäre Proliferation; Tartaglia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9292–9296, 1991; Tartaglia et al., J. Immunol. 151: 4637–4641, 1993; Gehr et al., J. Immunol. 149: 911–917, 1992) oder cytolytische Antworten (Heller et al., Cell 70: 47–52, 1992; Grell et al., Lymphokine Cytokine Res. 12: 143–148, 1993) induzieren.
  • Immunpräzipitation von TNF-R2-Komplexen und Peptid-Sequenzanalyse der assoziierten Proteine identifizierten HIAP-1 und HIAP-2 als Komponenten des nicht stimulierten TNF-R2-Signalkomplexes. Eine Protein-Protein-Interaktionsanalyse hat etabliert, dass die BIR-Domänen von HIAP-1 und HIAP-2 untereinander austauschbar an die TRAF-N-Domänen von TRAF1 und TRAF2 binden können (Rothe et al., Cell 83: 1243–1252, 1995). Bis jetzt ist über die Verteilung und Funktion der Proteinkomponenten des TNF-R2-Komplexes nach Rezeptorligation sehr wenig bekannt. Entsprechend sind die funktionellen Konsequenzen von HIAP-1 und HIAP-2 in dem TNF-R2-Rezeptorkomplex nicht bestimmt worden.
  • Die Rolle von HIAP-2 in dem TNF-R1-Rezeptor-Signalkomplex ist im Gegensatz dazu klarer definiert worden.
  • Die intrazelluläre Domäne von TNF-R1 enthält ein Protein-Protein-Interaktionsmotiv von etwa 80 Aminosäuren, das "death domain" genannt wird und das auch im niedrig-affinen Nervenwachstumsfaktor und in Fas-Rezeptoren gefunden wird. Die cytoplasmatische Death-Domäne von TNF-R1 scheint nicht mit Komponenten der Signaltransduktionswege vor einer Ligandenbindung assoziiert zu sein. Die hauptsächlichen Wirkungen von TNF-R1-Aggregation sind die NF-κB-Aktivierung und Apoptose. Diese Wirkungen hängen von einer Interaktion von TNF-R1 mit TRADD (TNF-R1-assoziiertes Death-Domänen-Protein; Hsu et al., Cell 81: 495–504, 1995) durch ihre entsprechenden Death-Domänen ab. TRADD wirkt als ein Adapter-Molekül, das eine Auswahl an Proteinen zu dem Signalkomplex rekrutieren kann. Die Entstehung von alternativen Signalkomplexen bestimmt wahrscheinlich das endgültige Schicksal der Zelle.
  • Unter bestimmten Umstanden ist TRADD fähig, die Bildung eines Proteinkomplexes anzuregen, der DISC (Death Inducing Signaling Complex) genannt wird. DISC-Bildung findet statt, wenn FADD zu dem TNF-R1/TRADD-Komplex wieder durch Interaktion der Death-Domänen rekrutiert wird (Chinnaiyan et al., Cell 81: 505–512, 1995; Chinnaiyan et al., J. Biol. Chem. 271: 4961–4965, 1996). Zusätzlich zu einer carboxyterminalen Death-Domäne besitzt FADD eine aminoterminale "Death-Effektordomäne" (DED), die durch Rekrutierung von FLICE (Caspase-8) Apoptose auslöst. FLICE besitzt eine ungewöhnlich lange aminoterminale Pro-Domäne, die zwei DED-homologe Sequenzen beinhaltet, die an die FADD-DED binden. FLICE-Moleküle in eine nahe Umgebung zu bringen führt zu einer proteolytischen Autoaktivierung. Das Spaltungsereignis, das FLICE aktiviert, setzt auch das Enzym von der DISC frei, an welchem Punkt es andere Caspasen proteolytisch aktiviert und letztendlich zu Apoptose führt (Muzio et al., Cell 85: 817–827, 1996; Boldin et al., 85: 803–815, 1996). Dominant-negative Mutanten von FADD blockieren Apoptose durch entweder Fas oder TNF-R1, was anzeigt, dass die FADD-Komponente verantwortlich für eine Propagierung des Zelltod-Signals ist, das durch einen der beiden Rezeptoren generiert wird (Chinnaiyan et al., J. Biol. Chem. 271: 4961–4965, 1996).
  • Jedoch führt TNFα-Bindung an TNF-R1 nicht unter allen Umständen zu Apoptose. Die Bildung eines alternativen Signalkomplexes trägt zur Formbarkeit der TNFα-Antwort bei. Der "Überlebenskomplex", der der DISC entspricht, besteht aus TRADD gebunden an TRAF2 (TNF-Rezeptor-assoziierter Faktor-2) und HIAP-2 (Hsu et al., Immunity 4: 387–389, 1996; Hsu et al., Cell 84: 299–308, 1996). HIAP-2 wird vor einer TNF-R1-Stimulierung durch TRAF2 komplexiert (Hsu et al., Cell 84: 299–308, 1996). Diese Proteininteraktion kann die Affinität von TRAF2 für die Bindung an TRADD erhöhen, wodurch die Bildung von TRADD/TRAF2-Komplexen anstatt der TRADD/FADD/FLICE-DISC favorisiert wird. Alternativ kann HIAP-2 mit anderen Komponenten des Apoptose-Wegs wie den Caspasen so interagieren, dass die apoptotischen Signale, die ansonsten generiert würden, unterdrückt werden.
  • Wir haben nun gezeigt, dass Mitglieder der XAF-Familie mit IAPs interagieren und deutlich in apoptotischen und NF-κB-induzierenden Signalwegen in Säugerzellen eingebunden sind. Überexpression von XAF-1 bewirkt Zelltod in transformierten Zellen. Interessanterweise führt Überexpression in nicht-transformierten Zellen nur zum Stillstand des Wachstums (Zellzyklus). Die unterschiedlichen Wirkungen in transformierten und nur proliferierenden Zellen sind überraschend und signifikant.
  • Unsere Western- und Northern-Blot-Analysen zeigen, dass XAF-1 in einer Vielzahl an Geweben und Zelltypen exprimiert ist. Da Apoptose ein Ereignis ist, das nicht spezifisch für einen bestimmten Zell- oder Gewebetyp ist, sind diese Ergebnisse im Einklang mit der Beteiligung des XAF-1-Proteins bei Apoptose in einer Vielzahl an Zusammenhängen.
  • Wir haben auch ein zweites Mitglied der XAF-Familie gefunden, XAF-2L. XAF-2L hat wie XAF-1 auch sieben Zinkfinger-Bindedomänen. Eine zweite kürzere XAF-2-Splicevariante, XAF-2S, ist auch gefunden worden.
  • I. Das XAF-1-Gen
  • Ein Hefe-2-Hybrid-Screen einer humanen Plazenta-cDNA-Bibliothek mit XIAP als das "Köder"-Protein identifizierte ein 37 kDa-Zinkfinger-Protein, das XAF-1 (XIAP-assoziierter Faktor 1) genannt wurde. XAF-1 zeigt eine signifikante Homologie zu Mitgliedern der TRAF-Familie, insbesondere TRAF6, umfasst aber nicht die TRAF-C- und TRAF-N-Domänen.
  • II. Synthese von XAF-Proteinen
  • Die Charakteristika der klonierten XAF-Gensequenzen können durch Einbringen der Sequenz in verschiedene Zelltypen oder unter Verwendung von in vitro extrazellulären Systemen analysiert werden. Die Funktion von XAF-Proteinen kann dann unter verschiedenen physiologischen Bedingungen untersucht werden. Zum Beispiel kann die XAF-1-kodierende DNA-Sequenz in Studien manipuliert werden, um die Expression des XAF-1-Gens und das Genprodukt zu verstehen. Alternativ können Zelllinien hergestellt werden, die das XAF-Genprodukt überexprimieren, wodurch Reinigung von XAF für eine biochemische Charakterisierung, Herstellung im großen Maßstab, Antikörperherstellung und Patiententherapie ermöglicht wird.
  • Für eine Proteinexpression können eukaryotische und prokaryotische Expressionssysteme erstellt werden, bei denen XAF-Gensequenzen in ein Plasmid oder einen anderen Vektor eingebracht werden, die dann verwendet werden, um lebende Zellen zu transformieren. Konstrukte, bei denen die XAF-cDNAs, die die gesamten offenen Leserahmen enthalten, in der korrekten Orientierung in ein Expressionsplasmid inseriert sind, können zur Proteinexpression verwendet werden. Alternativ können Teile der XAF-Gensequenzen, einschließlich Wildtyp oder mutierter XAF-Sequenzen, inseriert werden. Prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme erlauben, dass verschiedene wichtige funktionelle Domänen der XAF-Proteine als Fusionsproteine gewonnen werden können und dann für Eindungs-, strukturelle und funktionelle Studien und auch zur Erstellung von geeigneten Antikörpern verwendet werden. Da XAF-1-Proteinexpression Apoptose in immortalisierten Zellen erhöht, kann es erwünscht sein, das Protein unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu exprimieren.
  • Typische Expressionsvektoren enthalten Promotoren, die die Synthese von großen Mengen an mRNA, die der inserierten XAF-Nukleinsäure entspricht, in den das Plasmid tragenden Zellen regeln. Sie können auch eukaryotische oder prokaryotische Replikationsursprung-Sequenzen, die ihre autonome Replikation in dem Wirtsorganismus erlauben, Sequenzen, die genetische Merkmale kodieren, die die Selektion Vektor-enthaltender Zellen in der Anwesenheit von ansonsten toxischen Medikamenten erlauben, und Sequenzen, die die Effizienz, mit der die synthetisierte mRNA translatiert wird, erhöhen, umfassen. Stabile Langzeitvektoren können als frei replizierende Einheiten durch Verwendung von regulatorischen Elementen von beispielsweise Viren (z. B. die OriP-Sequenzen des Epstein-Barr-Virus-Genoms) aufrechterhalten werden. Zelllinien, bei denen der Vektor in die genomische DNA integriert ist, können auch hergestellt werden, und auf diese Weise wird das Genprodukt auf einer kontinuierlichen Basis hergestellt.
  • Eine Expression von fremden Sequenzen in Bakterien wie Escherichia coli benötigt die Insertion der XAF-Nukleinsäuresequenz in einen bakteriellen Expressionsvektor. Dieser Plasmidvektor enthält einige Elemente, die für die Propagierung des Plasmids in Bakterien und Expression der inserierten DNA des Plasmids durch die Plasmid-tragenden Bakterien benötigt werden. Propagierung von nur Plasmid-tragenden Bakterien wird durch Einbringen von selektierbarer Marker-kodierenden Sequenzen, die den Plasmid-tragenden Bakterien erlauben, in der Anwesenheit von ansonsten toxischen Arzneimitteln zu wachsen, in das Plasmid erreicht. Das Plasmid trägt auch einen transkriptionellen Promotor, der fähig ist, große Mengen an mRNA von dem klonierten Gen herzustellen. Solche Promotoren können, müssen aber nicht induzierbare Promotoren sein, die nach Induktion eine Transkription initiieren. Das Plasmid enthält auch vorzugsweise einen Polylinker, um eine Insertion des Gens in der korrekten Orientierung in dem Vektor zu vereinfachen. Bei einem einfachen E. coli-Expressionsvektor, der den lac-Promotor verwendet, enthält das Expressionsvektor-Plasmid ein Fragment des E. coli-Chromosoms, das den lac-Pro motor und das benachbarte lacZ-Gen enthält. In der Anwesenheit des Lactose-Analogs IPTG transkribiert RNA-Polymerase normalerweise das lacZ-Gen, wodurch lacZ-mRNA hergestellt wird, die in das kodierte Protein, β-Galactosidase, translatiert wird. Das lacZ-Gen kann mit Restriktionsendonukleasen aus dem Expressionsvektor ausgeschnitten werden und durch eine XAF-Gensequenz oder ein Fragment, eine Fusion oder eine Mutante davon ersetzt werden. Wenn dieses erhaltene Plasmid in E. coli transfiziert wird, stellt eine Zugabe von IPTG und eine nachfolgende Transkription von dem lac-Promotor XAF-mRNA her, die in ein XAF-Polypeptid translatiert wird.
  • Wenn die geeigneten Expressionsvektoren, die ein XAF-Gen oder ein Fragment, eine Fusion oder eine Mutante davon enthalten, einmal konstruiert sind, werden sie in eine geeignete Wirtszelle durch Transformationstechniken, die Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Protoplasten-Fusion und Liposomen-vermittelte Transfektion umfassen, eingebracht. Die Wirtszelle, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren transfiziert ist, kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilus oder anderen Bacilli, anderen Bakterien, Hefe, Pilzen, Insekten-(unter Verwendung von z. B. baculoviralen Vektoren für eine Expression), Maus- oder anderen Tier- oder humanen Gewebezellen. Säugerzellen können auch zur Expression des XAF-1-Proteins unter Verwendung eines Vacciniavirus-Expressionssystems beschrieben in Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994) verwendet werden.
  • In vitro-Expression von XAF-Proteinen, -Fusionen, -Polypeptidfragmenten oder -Mutanten, die durch klonierte DNA kodiert sind, ist auch unter Verwendung des T7-später Promotor-Expressionssystems möglich. Dieses System hängt von der regulierten Expression von T7-RNA-Polymerase ab, die ein in der DNA von Bakteriophage T7 kodiertes Enzym ist. Die T7-RNA-Polymerase transkribiert DNA beginnend mit einer spezifischen 23 bp-Promotorsequenz, die T7-später Promotor genannt wird. Kopien des T7-späten Promotors sind an verschiedenen Stellen auf dem T7-Genom lokalisiert, aber keine ist in der chromosomalen DNA von E. coli vorhanden. Als ein Ergebnis katalysiert T7-RNA-Polymerase in T7-infizierten Zellen eine Transkription von viralen Genen, aber nicht von E. coli-Genen. Bei diesem Expressionssystem werden rekombinante E. coli-Zellen zuerst so konstruiert, dass sie das Gen, das T7-RNA-Polymerase kodiert, neben dem lac-Promotor tragen. Bei der Anwesenheit von IPTG transkribieren diese Zellen das T7-Polymerase-Gen mit einer hohen Rate und synthetisieren reichliche Mengen an T7-RNA-Polymerase. Diese Zellen werden dann mit Plasmidvektoren transformiert, die eine Kopie des T7-später Promotor-Proteins tragen. Wenn IPTG zu dem Kulturmedium, das diese transformierten E. coli-Zellen enthält, gegeben wird, werden große Mengen an T7-RNA-Polymerase hergestellt. Die Polymerase bindet dann an den T7-späten Promotor auf den Plasmid-Expressionsvektoren und katalysiert eine Transkription der inserierten cDNA mit einer hohen Rate. Da jede E. coli-Zelle viele Kopien des Expressionsvektors enthält, können große Mengen an mRNA, die der klonierten cDNA entspricht, in diesem System hergestellt werden und das erhaltene Protein kann radioaktiv markiert werden. Plasmidvektoren, die späte Promotoren und die entsprechenden RNA-Polymerasen aus verwandten Bakteriophagen wie T3, T5 und SP6 enthalten, können auch für eine in vitro-Produktion von Proteinen von klonierter DNA verwendet werden. E. coli kann auch für eine Expression durch Infektion mit M13-Phage mGPI-2 verwendet werden. E. coli-Vektoren können auch mit regulatorischen Sequenzen aus lambda-Phage durch Fusionsprotein-Vektoren, durch Maltose-bindendes Protein-Fusionen und durch Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteinen verwendet werden.
  • Eukaryotische Expressionssysteme erlauben geeignete post-translationale Modifikationen an exprimierten Proteinen. Transiente Transfektion eines eukaryotischen Expressionsplasmids erlaubt die transiente Herstellung eines XAF-Polypeptids durch eine transfizierte Wirtszelle. XAF-Proteine können auch durch eine stabil transfizierte Säuger-Zelllinie hergestellt werden. Eine Anzahl an Vektoren, die geeignet für stabile Transfektion von Säugerzellen sind (z. B. siehe Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Supp. 1987), sowie Verfahren zum Konstruieren solcher Zelllinien (siehe z. B. Ausubel et al., supra) sind der Öffentlichkeit zugänglich. In einem Beispiel wird cDNA, die ein/eine XAF-1-Protein, -Fusion, -Mutante oder -Polypeptidfragment kodiert, in einen Expressionsvektor kloniert, der das Dihydrofolatreduktase-(DHFR)-Gen beinhaltet. Auf eine Integration des Plasmids und daher eine Integration des XAF-1-kodierenden Gens in das Wirtszellchromosom wird durch Einbringen von 0,01 bis 300 μM Methotrexat in das Zellkulturmedium selektiert (wie beschrieben, Ausubel et al., supra). Diese dominante Selektion kann bei den meisten Zelltypen durchgeführt werden. Rekombinante Proteinexpression kann durch DHFR-vermittelte Amplifikation des transfizierten Gens erhöht werden. Verfahren zur Selektion von Zelllinien, die Genamplifikationen aufweisen, sind in Ausubel et al. (supra) beschrieben. Diese Verfahren umfassen im Allgemeinen eine erweiterte Kultur in Medium, das schrittweise erhöhte Mengen an Methotrexat ent hält. Die am häufigsten verwendeten DHFR-enthaltenden Expressionsvektoren sind pCVSEII-DHFR und pAdD26SV(A) (beschrieben in Ausubel et al., supra). Die vorstehend beschriebenen Wirtszellen oder vorzugsweise eine DHFR-defiziente CHO-Zelllinie (z. B. CHO DHFR-Zellen, ATCC-Zugangsnummer CRL 9096) sind unter den am meisten bevorzugten für eine DHFR-Selektion einer stabil transfizierten Zelllinie oder eine DHFR-vermittelten Genamplifikation.
  • Eukaryotische Zellexpression von XAF-Proteinen erlaubt Studien der XAF-Gene und -Genprodukte, die die Bestimmung von geeigneter Expression und post-translationaler Modifikationen für eine biologische Aktivität beinhalten, wodurch regulatorische Elemente, die in der 5'-Region der XAF-Gene lokalisiert sind, und ihre Rollen in einer Geweberegulation von XAF-Proteinexpression identifiziert werden. Sie erlaubt auch die Herstellung von großen Mengen an normalen und mutierten Proteinen für eine Isolation und Reinigung und die Verwendung von Zellen, die XAF-Proteine exprimieren, als ein funktionelles Assaysystem für Antikörper, die gegen das Protein entwickelt wurden. Eukaryotische Zellen, die XAF-Proteine exprimieren, können auch verwendet werden, um die Effektivität von pharmakologischen Mitteln auf XAF-assoziierter Apoptose zu testen, oder als Mittel zum Studium von XAF-Proteinen als Komponenten eines Signaltransduktionssystems. Eine Expression von XAF-Proteinen, -Fusionen, -Mutanten und -Polypeptidfragmenten in eukaryotischen Zellen ermöglicht auch das Studium der Funktion des normalen kompletten Proteins, spezifischer Teile des Proteins oder natürlich vorkommender Polymorphismen und künstlich hergestellter mutierter Proteine. Die XAF-DNA-Sequenzen können unter Verwendung von bekannten Verfahren wie Restriktionsendonuklease-Verdau, DNA-Polymerase-Auffüllung, Exonuklease-Deletion, terminaler Desoxynukleotidtransferase-Verlängerung, Ligation von synthetischen oder klonierten DNA-Sequenzen und ortsgerichteter Sequenzänderung unter Verwendung von spezifischen Oligonukleotiden zusammen mit PCR verändert werden.
  • Ein anderes bevorzugtes eukaryotisches Expressionssystem ist das Baculovirussystem, das z. B. den Vektor pBacPAK9 verwendet, der von Clontech (Palo Alto, CA) erhältlich ist. Falls erwünscht, kann dieses System zusammen mit anderen Proteinexpressionstechniken, z. B. dem myc-tag-Ansatz beschrieben von Evan et al. (Mol. Cell Biol. 5: 3610–3616, 1985), verwendet werden.
  • Wenn einmal das rekombinante Protein exprimiert ist, kann es von den exprimierenden Zellen durch Zelllyse gefolgt von Protein-Reinigungstechniken wie Affinitäts chromatographie isoliert werden. In diesem Beispiel kann ein Anti-XAF-Antikörper, der durch die hierin beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann, an eine Säule angefügt werden und zur Isolierung der rekombinanten XAF-Proteine verwendet werden. Lyse und Fraktionierung von XAF-Protein-beinhaltenden Zellen vor einer Affinitätschromatographie können mit Standardverfahren durchgeführt werden (siehe z. B. Ausubel et al., supra). Einmal isoliert kann das rekombinante Protein, falls gewünscht, weiter durch z. B. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC; z. B. siehe Fischer, Laboratory Techniques in Biochemistry And Molecular Biology, Work und Burdon, Hrsg., Elsevier, 1980) gereinigt werden.
  • Die vorstehend beschriebenen Polypeptide, insbesondere kurze XAF-1-Fragmente und längere Fragmente des N-Terminus und C-Terminus des XAF-1-Proteins, können auch durch chemische Synthese hergestellt werden (z. B. durch die Verfahren beschrieben in Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe, 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Diese allgemeinen Techniken der Polypeptidexpression und -reinigung können auch verwendet werden, um nützliche XAF-1-Polypeptidfragmente oder -analoga, wie hierin beschrieben, herzustellen und zu isolieren.
  • Der Fachmann der Molekularbiologie wird verstehen, dass eine große Anzahl an Expressionssystemen zur Herstellung der rekombinanten XAF-Proteine verwendet werden kann. Die genaue Wirtszelle, die verwendet wird, ist nicht kritisch für die Erfindung. Die XAF-Proteine können in einem prokaryotischen Wirt (z. B. E. coli) oder in einem eukaryotischen Wirt (z. B. S. cerevisiae, Insektenzellen wie SF9-Zellen oder Säugerzellen wie COS-1-, NIH 3T3- oder HeLa-Zellen) hergestellt werden. Diese Zellen sind kommerziell erhältlich von z. B. der American Type Culture Collection, Rockville, MD (siehe auch Ausubel et al., supra). Das Transformationsverfahren und die Auswahl des Expressionsvehikels (z. B. Expressionsvektor) werden von dem ausgewählten Wirtssystem abhängen. Transformations- und Transfektionsverfahren sind z. B. in Ausubel et al. (supra) beschrieben und Expressionsvehikel können von den z. B. in Pouwels et al., supra, bereitgestellten ausgewählt werden.
  • III. Prüfen auf die Anwesenheit von biologischer Aktivität von XAF
  • Identifizierung von XAF-1 und XAF-2-Splicevarianten erlaubt das Studium von biologischer Aktivität von XAF in Apoptose-assoziierten zellulären Ereignissen. Zum Beispiel kann die Verabreichung eines XAF-1-Proteins oder eines Polypeptidfragments davon eine Fähigkeit aufweisen, Apoptose zu induzieren, die durch bekannte und hierin beschriebene Apoptose-Assays gemessen wird. Eine Apoptose-hemmende Menge eines XAF-Reagenzes (z. B. eine Verbindung, die die biologische Funktion von XAF-1 verringert, wie ein XAF-1-neutralisierender Antikörper oder XAF-1-Antisense-Nukleinsäure) kann in ähnlicher Weise untersucht werden. Solche Assays können in einer Zelle, die entweder endogen XAF-1 exprimiert, oder einer Zelle, in die eine heterologe Menge eines XAF-1-Polypeptids eingebracht wird, durchgeführt werden. Vorzugsweise ist die Zelle fähig, Apoptose zu durchlaufen. Apoptose oder eine Hemmung davon kann in diesen XAF exprimierenden Zellen untersucht werden, wobei solch eine Apoptose-induzierende oder -hemmende Aktivität basierend auf dem Grad an Expression des XAF-Polypeptids ausgewertet wird.
  • Ein anderer Ansatz nutzt die Aktivierung des nukleären Transkriptionsfaktors, NF-κB (Kunkel et al., Crit. Rev. Immunol. 9: 93–117, 1989) in TNF-vermittelter Signaltransduktion aus. In diesem System kann die Rolle eines XAF in NF-κB-Aktivierung in verschiedenen bekannten Assays wie dem I-κB-Degradationsassay leicht aufgeklärt werden. Ein anderes Verfahren zur schnellen Messung von NF-κB-Aktivität ist durch die Verwendung eines Reportergens, dessen Expression durch einen eine NF-κB-Bindestelle enthaltenden Promotor bestimmt wird (Zeichner et al., J. Virol. 65: 2436–2444, 1991). Der Expressionsvektor wird vorzugsweise künstlich in eine Zelle inseriert, die fähig ist, Apoptose zu durchlaufen oder die auf eine TNF-Rezeptorfamilie-vermittelte Signaltransduktion anspricht. Durch Nachweis einer Änderung im Grad der Expression des Reportergens kann eine NF-κB-induzierende Fähigkeit eines XAF leicht bestimmt werden. Dieses Verfahren kann auch zum Nachweis einer NF-κB-hemmenden Fähigkeit eines XAF verwendet werden, wobei NF-κB-Aktivierung durch eine andere Komponente des TNF-Rezeptor-Signalwegs (z. B. TRAF6) stimuliert wird.
  • Es wird verstanden werden, dass diese Analysen mit XAF-1 oder anderen XAF-Proteinen (z. B. XAF-2L) durchgeführt werden können.
  • IV. Zelluläre Verteilung von XAF-1
  • Wir haben die Verteilung von XAF-1-mRNA-Expression unter Verwendung von radiomarkierter XAF-1-Antisense-DNA angesehen und haben herausgefunden, dass XAF-1-mRNA in zumindest den folgenden adulten Geweben exprimiert wird: Herz, Gehirn, Plazenta, Leber, Skelettmuskel, Niere, Pankreas, Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Appendix, Luftröhre, Dünndarm, Submukosaschicht des Dick darms und periphere Blutleukozyten. Es wurde ferner gefunden, dass XAF-1-mRNA in fötalem Gewebe, das fötales Gehirn, fötales Herz, fötale Niere, fötale Leber, fötale Milz, fötalen Thymus und fötale Lunge umfasst, exprimiert wird.
  • V. XAF-Fragmente
  • Polypeptidfragmente, die verschiedene Teile von XAF-Proteinen umfassen, sind zur Identifizierung der Domänen, die für die biologischen Aktivitäten von XAF-Proteinen wichtig sind, geeignet. Verfahren zum Herstellen solcher Fragmente unter Verwendung der hierin bereitgestellten Nukleotidsequenzen sind bekannt (siehe z. B. Ausubel et al., supra). Zum Beispiel kann ein XAF-Proteinfragment durch PCR-Amplifizieren des erwünschten Fragments unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die basierend auf den XAF-1-(SEQ ID NO: 1)-Nukleinsäuresequenzen entworfen wurden, erstellt werden. Vorzugsweise umfassen die Oligonukleotid-Primer eine einmalige Restriktionsenzymstelle, die eine Insertion des Fragments in die Klonierungsstelle eines Säugerexpressionsvektors ermöglicht. Dieser Vektor kann dann künstlich in eine Säugerzelle durch verschiedene bekannte und hierin beschriebene Techniken eingebracht werden, was zur Herstellung eines XAF-Genfragments führt.
  • In einem Ansatz sind XAF-1-Polypeptidfragmente nützlich bei einer Auswertung der Teile des Proteins gewesen, die an NF-κB-Regulation beteiligt sind. Insbesondere wurden Polypeptidfragmente der Amino- und Carboxytermini des XAF-1-Proteins zur Induzierung oder Verhinderung einer Aktivitätsinduzierung durch verschiedene andere Komponenten des TNF-Rezeptor-Signalwegs (z. B. TRAF6) verwendet.
  • Bei einem alternativen Ansatz sind Polypeptidfragmente von verschiedenen Teilen des XAF-1-Proteins für eine Modulierung von XAF-1-vermittelter Apoptose geeignet, wie in verschiedenen bekannten und hierin beschriebenen Apoptoseassays untersucht werden kann. XAF-1-Polypeptidfragmente können verwendet werden, um XAF-1-vermittelte Apoptose durch Inhibieren einer Bindung des Volllängen XAF-1 an z. B. sich selbst zur Bildung von XAF-1:XAF-1-Homodimeren, an ein anderes XAF-Protein (z. B. XAF-2) zur Bildung von XAF-1:XAF-2-Heterodimeren oder an XIAP zur Bildung von XAF-1:XIAP-Heterodimeren zu verändern. Vorzugsweise können solche Fragmente die XAF-1:XAF-1-Bindedomäne, die XAF-1:XAF-2-Bindedomäne oder die XAF-1:XIAP-Bindedomäne umfassen.
  • VI. XAF-Antikörper
  • Um polyklonale Antikörper herzustellen, können XAF-Proteine, Fragmente von XAF-Proteinen oder Fusionsproteine, die bestimmte Teile von XAF-Proteinen enthalten, in Bakterien durch Expression von entsprechenden DNA-Sequenzen in einem geeigneten Klonierungsvehikel synthetisiert werden. Fusionsproteine werden im Allgemeinen als Quelle von Antigenen für eine Antikörperproduktion verwendet. Zwei weithin verwendete Expressionssysteme für E. coli sind lacZ-Fusionen, die die pUR-Serie von Vektoren verwenden, und trpE-Fusionen, die die pATH-Vektoren verwenden. Die Proteine können gereinigt werden, dann an ein Trägerprotein gekoppelt und mit Freund's Adjuvanz vermischt werden (um eine Stimulierung der antigenischen Antwort durch das ausgewählte Tier zu unterstützen) und in Kaninchen oder andere Labortiere injiziert werden. Alternativ können Proteine von XAF-exprimierenden kultivierten Zellen isoliert werden. Nach Auffrischinjektionen in zweiwöchentlichen Intervallen wird den Kaninchen oder anderen Labortieren Blut abgenommen und die Seren isoliert. Die Seren können direkt verwendet werden oder können vor einer Verwendung durch verschiedene Verfahren gereinigt werden, die Affinitätschromatographie unter Verwendung von Reagenzien wie Protein A-Sepharose, Antigen-Sepharose und Anti-Maus-Ig-Sepharose umfassen. Die Seren können dann verwendet werden, um Proteinextrakte von XAF-exprimierenden Geweben, die auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt wurden, zur Identifizierung von XAF-Proteinen zu sondieren. Alternativ können synthetische Peptide hergestellt werden, die den Antigen-Teilen des Proteins entsprechen, und zum Beimpfen der Tiere verwendet werden.
  • Um ein Peptid oder Volllängen-Protein zur Verwendung bei einer Herstellung von z. B. XAF-1-spezifischen Antikörpern zu erstellen, kann eine XAF-1-kodierende Sequenz als eine C-terminale Fusion mit Glutathion-S-Transferase (GST; Smith et al., Gene 67: 31–40, 1988) exprimiert werden. Das Fusionsprotein kann auf Glutathion-Sepharose-Beads gereinigt, mit Glutathion eluiert und mit Thrombin (an der konstruierten Spaltstelle) gespalten und bis zu dem Grad, der für eine erfolgreiche Immunisierung von Kaninchen benötigt wird, gereinigt werden. Primäre Immunisierungen können mit Freund's vollständigem Adjuvanz und nachfolgende Immunisierungen mit Freund's unvollständigem Adjuvanz durchgeführt werden. Antikörpertiter werden durch Western-Blot- und Immunpräzipitationsanalysen unter Verwendung des Thrombin-gespaltenen XAF-1-Fragments des GST-XAF-1-Fusionsproteins beobachtet. Immunseren werden unter Verwendung von CNBr-Sepharose-gekoppel tem XAF-1-Protein affinitätsgereinigt. Antiserum-Spezifität wird unter Verwendung einer Gruppe nicht verwandter GST-Proteine (umfassend GSTp53, Rb, HPV-16 E6 und E6-AP) und GST-Trypsin (das durch PCR unter Verwendung von bekannten Sequenzen erstellt wurde) bestimmt.
  • Es wird auch vom Fachmann verstanden werden, dass monoklonale XAF-Antikörper durch Verwendung eines XAF-Proteins, das von XAF-exprimierenden kultivierten Zellen isoliert wurde, oder eines XAF-Proteins, das von Geweben isoliert wurde, als Antigen hergestellt werden können. Die Zellextrakte oder rekombinanten Proteinextrakte, die XAF-Protein enthalten, können z. B. mit Freund's Adjuvanz in Mäuse injiziert werden. Nachdem sie injiziert wurden, können die Milzen der Mäuse entfernt werden und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufgenommen werden. Die Milzzellen dienen als Quelle von Lymphozyten, von denen manche einen Antikörper der geeigneten Spezifität herstellen. Diese werden dann mit einer permanent wachsenden Myelom-Partnerzelle fusioniert und die Produkte der Fusion werden in eine Reihe von Gewebekulturnäpfchen in Anwesenheit eines Selektionsmittels wie Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) ausplattiert. Die Näpfchen werden dann mittels ELISA zur Identifizierung von denjenigen gescreent, die Zellen enthalten, die einen Antikörper erstellen, der fähig ist, ein XAF-Protein oder ein Polypeptidfragment oder eine Mutante davon zu binden. Diese werden dann neu ausplattiert und nach einer Wachstumsperiode werden diese Schälchen erneut zur Identifizierung von Antikörper-produzierenden Zellen gescreent. Mehrere Klonierungsverfahren werden durchgeführt, bis über 90% der Näpfchen einzelne Klone enthalten, die positiv für eine Antikörperproduktion sind. Aus diesem Verfahren wird eine stabile Linie an Klonen etabliert, die den Antikörper produzieren. Der monoklonale Antikörper kann dann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A-Sepharose, Ionenaustauschchromatographie sowie Variationen und Kombinationen dieser Techniken gereinigt werden. Verkürzte Versionen von monoklonalen Antikörpern können auch durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, in denen Plasmide erstellt werden, die das/die gewünschte(n) monoklonale(n) Antikörperfragment(e) in einem geeigneten Wirt exprimieren.
  • Als ein Ersatz- oder Zusatz-Immunogen zu GST-Fusionsproteinen können Peptide, die relativ einzigartigen hydrophilen Regionen von z. B. XAF-1 entsprechen, erstellt und an Keyhole-Limpet-Hämozyanin (KLH) durch ein eingefügtes C-terminales Lysin gekoppelt werden. Antiserum gegen jedes dieser Peptide wird in ähnlicher Weise an Peptiden, die an BSA konjugiert sind, affinitätsgereinigt und Spezifität wird durch ELISA und Western-Blotting unter Verwendung von Peptidkonjugaten und durch Western-Blotting und Immunpräzipitation unter Verwendung von XAF-1, das als ein GST-Fusionsprotein exprimiert wird, getestet.
  • Alternativ können monoklonale Antikörper unter Verwendung der vorstehend beschriebenen XAF-Proteine und einer Standard-Hybridomtechnologie hergestellt werden (siehe z. B. Kohler et al., Nature 256: 495, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292, 1976; Hammerling et al., in Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, New York, NY, 1981; Ausubel et al., supra). Einmal hergestellt, werden monoklonale Antikörper auch auf eine spezifische Erkennung von XAF-Protein durch Western-Blot- oder Immunpräzipitationsanalyse (durch die in Ausubel et al., supra, beschriebenen Verfahren) getestet.
  • Monoklonale und polyklonale Antikörper, die spezifisch ein XAF-Protein (oder Fragmente davon) erkennen, wie die hierin beschriebenen, die eine XAF-1-C-terminale Domäne enthalten, werden als für die Erfindung geeignet angesehen. Sie können z. B. in einem Reportergen-Assay zur Beobachtung der NF-κB-induzierenden Wirkungen (via TRAF6) eines XAF-Proteins verwendet werden. Antikörper, die hierin beschriebenes XAF-1 hemmen, können insbesondere zur Verhinderung von Apoptose in Zellen, die einen unerwünschten Zelltod oder Wachstumsstopp durchlaufen, nützlich sein. Die vorstehend beschriebenen Antikörper können unter Verwendung von XAF-Aminosäuresequenzen hergestellt werden, die nicht in hochkonservierten Regionen sitzen und bei denen es wahrscheinlich erscheint, dass sie antigenisch sind, was durch Kriterien wie denen analysiert werden kann, die durch das Peptide Structure Program (Genetics Computer Group Sequence Analysis Package, Program Manual für das GCG Package (Version 7, 1991)) unter Verwendung des Algorithmus von Jameson und Wolf (CABIOS 4: 181, 1988) bereitgestellt werden. Diese Fragmente können durch Standardtechniken, z. B. durch die PCR, erstellt und in den pGEX-Expressionsvektor kloniert werden (Ausubel et al., supra). GST-Fusionsproteine werden in E. coli exprimiert und unter Verwendung einer Glutathion-Agarose-Affinitätsmatrix wie in Ausubel et al. (supra) beschrieben gereinigt. Zur Erstellung von polyklonalen Antikörpern aus Kaninchen und zur Minimierung der Möglichkeit Antiseren zu erhalten, die nicht spezifisch sind oder geringe Affinitätsbindung an ein XAF aufweisen, werden zwei oder drei Fusionen für jedes Protein erstellt und jede Fusion wird in mindestens zwei Kaninchen injiziert. Antiseren werden durch Injektionen in Serien, die vorzugsweise mindestens drei Auffrischinjektionen enthalten, erstellt.
  • Zusätzlich können die vorstehend beschriebenen Antikörper unter Verwendung von XAF-Aminosäuresequenzen hergestellt werden, die in hochkonservierten Regionen sitzen. Zum Beispiel können Aminosäuresequenzen von den 150 N-terminalen Aminosäuren von entweder XAF-1 oder XAF-2 als Antigen zum Erstellen von Antikörpern verwendet werden, die spezifisch für sowohl XAF-1 als auch XAF-2 und möglicherweise spezifisch für andere Mitglieder der XAF-Proteinfamilie sind. Diese Antikörper können wie vorstehend beschrieben gescreent werden.
  • Zusätzlich zu intakten monoklonalen und polyklonalen Anti-XAF-1-Antikörpern können verschiedene genetisch manipulierte Antikörper, humanisierte Antikörper und Antikörperfragmente, die F(ab')2-, Fab'-, Fab-, Fv- und sFv-Fragmente umfassen, verwendet werden. Antikörper können durch bekannte Verfahren humanisiert werden, z. B. können monoklonale Antikörper mit einer gewünschten Bindespezifität kommerziell humanisiert werden (Scotgene, Scotland; Oxford Molecular, Palo Alto, CA). Vollständig humane Antikörper wie diejenigen, die in transgenen Tieren exprimiert werden, können auch verwendet werden (Green et al., Nature Genetics 7: 13–21, 1994).
  • Ladner ( US-Patente 4,946,778 und 4,704,692 ) beschreibt Verfahren zur Herstellung von Einzel-Polypeptidketten-Antikörpern. Ward et al. (Nature 341: 544–546, 1989) beschreiben die Herstellung von variablen Domänen der schweren Kette, die sie "Einzeldomänenantikörper" nennen und die hohe Antigen-Bindungsaffinitäten aufweisen. McCafferty et al. (Nature 348: 552–554, 1990) zeigen, dass komplette Antikörper-V-Domänen auf der Oberfläche eines fd-Bakteriophagen präsentiert werden können, dass der Phage spezifisch an ein Antigen bindet und dass ein seltener Phage (einer in einer Million) nach Affinitätschromatographie isoliert werden kann. Boss et al. ( US-Patent 4,816,397 ) beschreiben verschiedene Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinen und immunologisch funktionellen Fragmenten davon, die mindestens die variablen Domänen der schweren und leichten Kette beinhalten, in einer einzelnen Wirtszelle. Cabilly et al. ( US-Patent 4,816,567 ) beschreiben Verfahren zur Herstellung chimärer Antikörper.
  • VII. Verwendung von XAF-Antikörpern
  • Antikörper gegen XAF-Proteine können wie vorstehend beschrieben verwendet werden, um XAF-Proteine nachzuweisen oder die biologischen Aktivitäten von XAF-Pro teinen zu hemmen. Zusätzlich können die Antikörper an Verbindungen für diagnostische und/oder therapeutische Verwendungen wie Radionukleotide für ein Imaging und eine Therapie und Liposomen für die Zielführung von Verbindungen zu einem spezifischen Gewebeort gekoppelt werden.
  • VIII. Nachweis von XAF-Genexpression
  • Wie beschrieben, können die vorstehend beschriebenen Antikörper zum Überwachen einer XAF-Proteinexpression verwendet werden. Zusätzlich ist in situ-Hybridisierung ein Verfahren, das zum Nachweis der Expression von XAF-Genen verwendet werden kann. In situ-Hybridisierungstechniken wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) stützen sich auf die Hybridisierung einer spezifisch markierten Nukleinsäuresonde an die zelluläre RNA in individuellen Zellen oder Geweben. Daher erlaubt sie die Identifizierung von mRNA in intakten Geweben wie dem Herzen. Bei diesem Verfahren werden Oligonukleotide oder klonierte Nukleotid-(RNA oder DNA)-Fragmente, die einmaligen Teilen von XAF-Genen entsprechen, zum Nachweis spezifischer mRNA-Spezies, z. B. im Herzen, verwendet. Zahlreiche andere Nachweistechniken für Genexpression sind dem Fachmann bekannt und können hier verwendet werden.
  • IX. Identifizierung von Verbindungen, die XAF-Proteinexpression modulieren
  • Basierend auf unseren experimentellen Ergebnissen haben wir eine Reihe von Screening-Verfahren zur Identifizierung therapeutischer (z. B. anti-apoptotische oder Apoptose-induzierende) Verbindungen, die in humanen Patienten verwendet werden können, entwickelt. In besonderen Beispielen werden Verbindungen, die eine Expression von XAF-Proteinen herunterregulieren, als nützlich für eine Behandlung von Erkrankungen, die durch eine überhöhte Menge an Apoptose ausgezeichnet sind, wie neurodegenerative Erkrankungen, angesehen. In ähnlicher Weise werden Verbindungen, die XAF-Proteine heraufregulieren oder aktivieren, als nützlich als Arzneimittel für die Behandlung von Erkrankungen, die durch beeinträchtigte Apoptose ausgezeichnet sind, wie Krebs, angesehen. Im Allgemeinen umfassen die erfindungsgemäßen Screeningverfahren ein Screenen einer jeglichen Anzahl an Verbindungen für therapeutisch aktive Mittel durch Verwendung einer jeglichen Anzahl an experimentellen in vitro- oder in vivo-Systemen.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren vereinfachen die Auswertung, Identifizierung und Entwicklung von aktiven Mitteln für die Behandlung und Verhinderung von Zuständen, die eine unangemessene Menge an Apoptose einbeziehen, die abhängig von dem Zustand übermäßig oder ungenügend sein kann. Diese Screeningverfahren stellen ein einfaches Mittel zur Auswahl von natürlichen Produktextrakten oder Verbindungen von Interesse aus einer großen Population bereit, die weiter ausgewertet und auf wenige aktive und selektive Materialien verringert werden. Bestandteile dieser Auswahl werden dann gereinigt und in den erfindungsgemäßen Verfahren ausgewertet, um ihre anti-apoptotischen oder Apoptose-induzierenden Aktivitäten zu bestimmen.
  • Im Allgemeinen werden neue Medikamente für die Behandlung von Zuständen, die einen angemessenen Grad an Apoptose einbeziehen, aus großen Bibliotheken an sowohl natürlichen Produkten oder synthetischen (oder halbsynthetischen) Extrakten oder chemischen Bibliotheken gemäß bekannter Verfahren identifiziert. Der Fachmann auf dem Gebiet des Auffindens und Entwickens von Arzneimitteln wird verstehen, dass die genaue Quelle der Testextrakte oder -verbindungen nicht kritisch für das/die erfindungsgemäße(n) Screeningverfahren ist. Entsprechend kann nahezu jegliche Anzahl an chemischen Extrakten oder Verbindungen unter Verwendung der hierin beschriebenen beispielhaften Verfahren gescreent werden. Beispiele solcher Extrakte oder Verbindungen umfassen in nicht begrenzender Weise Pflanzen-, Pilz-, prokaryotisch- oder Tier-basierte Extrakte, Fermentationsbrühen und synthetische Verbindungen sowie eine Modifikation von bestehenden Verbindungen. Zahlreiche Verfahren zur Durchführung einer zufälligen oder direkten Synthese (z. B. Halbsynthese oder Gesamtsynthese) einer jeglichen Anzahl an chemischen Verbindungen, die in nicht begrenzender Weise Saccharid-, Lipid-, Peptid- und Nukleinsäure-basierte Verbindungen umfassen, sind auch verfügbar. Synthetische Verbindungsbibliotheken sind kommerziell erhältlich von Brandon Associates (Merrimack, NH) und Aldrich Chemical (Milwaukee, WI). Alternativ sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in der Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten kommerziell von einer Anzahl an Quellen erhältlich, die Biotics (Sussex, UK), Xenova (Slough, UK), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, FL) und PharmaMar, U. S. A. (Cambridge, MA) umfassen. Zusätzlich werden natürliche und synthetisch hergestellte Bibliotheken, falls erwünscht, gemäß bekannten Verfahren, z. B. durch Standard-Extraktions- und -Fraktionierungsverfahren, hergestellt. Des Weiteren wird eine jegliche Bibliothek oder Verbindung, falls er wünscht, leicht unter Verwendung von chemischen, physikalischen oder biochemischen Standardverfahren modifiziert.
  • Zusätzlich versteht der Fachmann auf dem Gebiet des Auffindens und Entwickelns von Arzneimitteln leicht, dass Verfahren zur Dereplikation (z. B. taxonomische Dereplikation, biologische Dereplikation und chemische Dereplikation oder eine jegliche Kombination davon) oder zur Eliminierung von Replikaten oder Wiederholungen von Materialien, die bereits für ihre anti-apoptotischen oder Apoptose-induzierenden Aktivitäten bekannt sind, wann immer möglich, eingesetzt werden sollten.
  • Wenn für einen Rohextrakt gefunden wird, dass er anti-apoptotische oder Apoptose-induzierende Aktivitäten oder beides hat, wird eine weitere Fraktionierung des positiven Leitextrakts zur Isolierung chemischer Bestandteile, die für die beobachtete Wirkung verantwortlich sind, notwendig. Daher ist das Ziel des Extraktions-, Fraktionierungs- und Reinigungsverfahrens die sorgfältige Charakterisierung und Identifikation einer chemischen Einheit in dem Rohextrakt mit anti-apoptotischen oder Apoptose-induzierenden Aktivitäten. Die gleichen in vivo- und in vitro-Assays, die hierin für den Nachweis von Aktivitäten in Gemischen von Verbindungen beschrieben sind, können zum Reinigen des aktiven Bestandteils und zum Testen von Derivaten davon verwendet werden. Fraktionierungs- und Reinigungsverfahren für solche heterogenen Extrakte sind bekannt. Falls erwünscht, werden Verbindungen, für die gezeigt wurde, dass sie geeignete Mittel für die Behandlung einer Pathogenität sind, gemäß bekannter Verfahren chemisch modifiziert. Verbindungen, die als therapeutisch wertvoll identifiziert wurden, werden nachfolgend unter Verwendung eines bekannten Standard-Tiermodells einer degenerativen Erkrankung oder von Krebs analysiert.
  • Nachstehend beschreiben wir Screeningverfahren zur Identifizierung und Bewertung der Effektivität einer Verbindung als ein anti-apoptotisches oder Apoptose-induzierendes Mittel. Diese Verfahren sollen den Umfang der beanspruchten Erfindung veranschaulichen, aber nicht begrenzen.
  • a) Screens für Verbindungen, die eine XAF-Proteinexpression beeinflussen
  • XAF-cDNAs können verwendet werden, um die Identifizierung von Verbindungen zu ermöglichen, die eine XAF-Proteinexpression erhöhen oder verringern. In einem Ansatz werden Kandidatenverbindungen in verschiedenen Konzentrationen zum Kul turmedium von Zellen, die XAF-mRNA exprimieren, gegeben. Die XAF-mRNA-Expression wird dann z. B. durch Northern-Blot-Analyse (Ausubel et al., supra) unter Verwendung eines XAF-DNA- oder cDNA- oder RNA-Fragments als eine Hybridisierungssonde gemessen. Der Grad an XAF-mRNA-Expression in Anwesenheit der Kandidatenverbindung wird mit dem Grad an XAF-mRNA-Expression in Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen, wobei alle anderen Faktoren (z. B. Zelltyp und Kulturbedingungen) gleich sind.
  • Die Wirkung von Kandidatenverbindungen auf XAF-vermittelte Apoptose kann stattdessen auf der Ebene von Translation unter Verwendung des vorstehend beschriebenen allgemeinen Ansatzes mit Standard-Protein-Nachweistechniken wie Western-Blot oder Immunpräzipitation mit einem XAF-spezifischen Antikörper (z. B. dem hierin beschriebenen XAF-1-spezifischen Antikörper) gemessen werden.
  • In einem alternativen Ansatz zum Nachweis von Verbindungen, die XAF auf der Ebene der Transkription regulieren, können Kandidatenverbindungen auf eine Fähigkeit getestet werden, ein Reportergen zu regulieren, dessen Expression durch einen XAF-Genpromotor bestimmt wird. Zum Beispiel kann eine Zelle, bei der es unwahrscheinlich ist, dass sie Apoptose durchläuft, mit einem Expressionsplasmid transfiziert werden, das ein Luciferase-Reportergen operativ verbunden mit dem XAF-1-Promotor enthält. Kandidatenverbindungen können dann in verschiedenen Konzentrationen zu dem Kulturmedium der Zellen gegeben werden. Luciferase-Expressionsgrade können dann dadurch gemessen werden, dass die Verbindungsbehandelten transfizierten Zellen bekannten Standard-Luciferase-Assays wie dem hierin verwendeten Luciferase-Assay-Systemkit, das kommerziell von Promega erhältlich ist, unterworfen werden und der Grad an Luciferase-Aktivität auf einem Luminometer schnell ermittelt wird. Der Grad an Luciferase-Expression in Anwesenheit der Kandidatenverbindung wird mit dem Grad an Luciferase-Expression in Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen, wobei alle anderen Faktoren (z. B. Zelltyp und Kulturbedingungen) gleich sind.
  • Verbindungen, die den Grad an XAF-Proteinexpression modulieren, können gereinigt oder im Wesentlichen gereinigt sein oder können ein Bestandteil eines Gemisches an Verbindungen wie eines Extraktes oder Überstandes sein, der von Zellen, von Säugerserum oder von Wachstumsmedium, in dem Säugerzellen kultiviert worden sind, erhalten wird (Ausubel et al., supra). Bei einem Assay eines Gemisches an Verbindungen wird XAF-Proteinexpression gegen fortschreitend kleinere Untergrup pen der Gruppe an Verbindungen (z. B. durch Standard-Reinigungstechniken wie HPLC oder FPLC hergestellt) getestet, bis für eine einzige Verbindung oder eine minimale Anzahl an wirksamen Verbindungen gezeigt wird, dass sie XAF-Proteinexpression moduliert.
  • b) Screens für Verbindungen, die eine biologische Aktivität von XAF beeinflussen
  • Verbindungen können auch auf ihre Fähigkeit gescreent werden, z. B. XAF-1-Apoptose-induzierende Aktivität zu modulieren. In diesem Ansatz wird der Grad an Apoptose in Anwesenheit einer Kandidatenverbindung mit dem Grad an Apoptose in ihrer Abwesenheit unter äquivalenten Bedingungen verglichen. Der Screen kann wieder mit einer Gruppe an Kandidatenverbindungen beginnen, von der eine oder mehrere geeignete Modulatorverbindungen schrittweise isoliert werden. Apoptoseaktivität kann durch einen jeglichen Standard-Assay gemessen werden, z. B. durch die hierin beschriebenen.
  • Ein anderes Verfahren zum Nachweis von Verbindungen, die Apoptose-induzierende Aktivität von XAF modulieren, war das Screenen auf Verbindungen, die physikalisch mit einem gegebenen XAF-Polypeptid, z. B. XAF-1, interagieren. Diese Verbindungen wurden durch Anpassen von bekannten Hefe-2-Hybrid-Expressionssystemen nachgewiesen. Diese Systeme wiesen Proteininteraktionen unter Verwendung eines transkriptionellen Aktivierungsassays nach und sind im Allgemeinen durch Gyuris et al. (Cell 75: 791–803, 1993) und Field et al. (Nature 340: 245–246, 1989) beschrieben und sind kommerziell von Clontech (Palo Alto, CA) erhältlich. Zusätzlich beschreibt die PCT-Veröffentlichung WO 95/28497 einen Hefe-2-Hybridassay, in dem Proteine, die bei Apoptose beteiligt sind, aufgrund ihrer Interaktion mit BCL-2 nachgewiesen wurden. Ein ähnliches Verfahren wurde zur Identifizierung von Proteinen und anderen Verbindungen verwendet, die mit XAF-1 interagieren, und wird zur Identifizierung von XAF-2-Splicevariante-Interaktoren verwendet.
  • Eine Verbindung, die eine Erhöhung der Expression oder biologischen Aktivität des XAF-Proteins, z. B. XAF-1, fördert, wird als besonders geeignet für die Erfindung betrachtet. Solch ein Molekül kann z. B. als ein Therapeutikum zum Erhöhen von zellulären Mengen an XAF-1 und dadurch zum Ausnutzen der Fähigkeit von XAF-1-Polypeptiden, Apoptose zu induzieren, verwendet werden. Dies wäre bei der Be handlung von Erkrankungen vorteilhaft, die mit ungenügender Apoptose verbunden sind (z. B. Krebs).
  • Eine Verbindung, die XAF-1-Aktivität verringert (z. B. durch Verringerung von XAF-1-Genexpression oder biologischer Aktivität von XAF-1), kann auch zur Erhöhung einer zellulären Proliferation verwendet werden. Dies wäre bei der Behandlung von degenerativen Krankheiten wie neurodegenerativen Krankheiten (z. B. Alzheimerkrankheit, Huntingtonkrankheit) oder anderen Gewebe-spezifischen degenerativen Krankheiten (z. B. Leberzirrhose, T-Lymphozyt-Armut bei AIDS, Haarverlust) vorteilhaft.
  • Moleküle, bei denen durch die vorstehend beschriebenen Verfahren gefunden wurde, dass sie wirksam XAF-Genexpression oder Polypeptidaktivität modulieren, können weiter in Tiermodellen getestet werden. Wenn sie weiterhin erfolgreich in einer in vivo-Situation wirken, können sie als Therapeutika entweder zur Hemmung oder zur Erhöhung von Apoptose, wie angemessen, verwendet werden.
  • X. Therapien
  • Therapien können entworfen werden, um einen XAF-Gendefekt oder eine unangemessene XAF-Genexpression zu umgehen oder zu überwinden und dadurch Zustände, die eine unangemessene Menge an Apoptose umfassen, zu modulieren und möglicherweise zu lindern. XAF-1 wird in jedem Gewebe, das bis jetzt betrachtet wurde, exprimiert. Daher wird unter Berücksichtigung verschiedener Therapien verstanden, dass solche Therapien auf jegliche Gewebe zielen können, von denen gezeigt wurde, dass sie XAF-1 exprimieren. Insbesondere sind Therapien zum Erhöhen einer XAF-1-Genexpression bei einer Förderung von Apoptose in Krebszellen nützlich. Apoptose-induzierende XAF-1-Reagenzien können ohne Begrenzung Volllängen- oder Fragment-XAF-1-Polypeptide, XAF-1-mRNA oder eine jegliche Verbindung umfassen, die die Apoptose-induzierende Aktivität von XAF-1 erhöht.
  • a) Proteintherapie
  • Behandlung oder Verhinderung von unangemessener Apoptose kann durch Ersetzen von mutiertem oder zusätzlichem XAF-Protein durch normales Protein, durch Modulieren der Funktion von mutiertem Protein oder durch Transport von normalem XAF-Protein an die geeigneten Zellen erreicht werden. Es ist auch möglich, den pathophysiologischen Weg (z. B. ein Signaltransduktionsweg), an dem das Protein beteiligt ist, zu modifizieren, um den physiologischen Defekt zu berichtigen.
  • Um ein mutiertes Protein durch normales Protein zu ersetzen oder um Protein Zellen zuzufügen, die nicht mehr genug XAF exprimieren, ist es notwendig, große Mengen an reinem XAF-Protein von kultivierten Zellsystemen, die das Protein exprimieren können, zu erhalten. Transport des Proteins zu den betroffenen Geweben (z. B. Krebsgeweben) kann dann unter Verwendung von geeigneten Verpackungs- oder Verabreichungssystemen erreicht werden. Alternativ können kleine Molekülanaloga verwendet und verabreicht werden, um als XAF-Agonisten zu wirken und in dieser Weise eine erwünschte physiologische Wirkung herzustellen. Verfahren zum Auffinden solcher Moleküle werden hierin bereitgestellt.
  • b) Gentherapie
  • Gentherapie ist ein anderer möglicher Therapieansatz, bei dem normale Kopien des XAF-Gens oder Nukleinsäure, die XAF-Antisense-RNA kodiert, in ausgewählte Gewebe eingebracht werden, um erfolgreich normales und reichlich vorhandenes Protein oder XAF-Antisense-RNA in Zellen zu kodieren, die unangemessen entweder Zelltod unterdrücken (z. B. Eierstockkrebszellen) bzw. die Zelltodrate erhöhen (z. B. neuronaler Zelltod, der zu Krankheit führt). Das Gen muss zu diesen Zellen in einer Form transportiert werden, in der es aufgenommen werden kann und für genug Protein kodieren kann, um eine wirksame Funktion bereitzustellen. Alternativ kann es bei manchen Mutanten möglich sein, Apoptose durch Einbringen einer anderen Kopie des homologen Gens, die eine zweite Mutation in dem Gen trägt, zu fördern oder die Mutation zu verändern oder ein anderes Gen zum Blockieren einer jeglichen negativen Wirkung zu verwenden.
  • Transduzieren von retroviralen Vektoren kann insbesondere wegen ihrer hohen Infektionseffizienz und stabilen Integration und Expression für Gentherapie in somatischen Zellen verwendet werden. Die Zielzellen müssen jedoch fähig sein, sich zu teilen, und die Expressionsgrade von normalem Protein sollten hoch sein. Zum Beispiel kann das Volllängen-XAF-1-Gen oder Teile davon in einen retroviralen Vektor kloniert werden und von seinem endogenen Promotor oder von der retroviralen langen terminalen Wiederholung oder von einem für den interessierenden Zielzellentyp (wie Neuronen) spezifischen Promotor angetrieben werden. Andere virale Vektoren, die verwendet werden können, umfassen Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Vakziniavirus, Rinderpapillomvirus oder ein Herpesvirus wie Epstein-Barr-Virus.
  • Gentransfer könnte auch unter Verwendung von nicht-viralen Mitteln, die eine in vitro-Infektion benötigen, erreicht werden. Dieses würde Calciumphosphat, DEAE-Dextran, Elektroporation und Protoplastfusion umfassen. Liposomen können auch möglicherweise günstig für einen Transport von DNA in eine Zelle sein. Obwohl diese Verfahren alle verfügbar sind, haben viele von diesen eine geringe Effizienz.
  • Transplantation von normalen Genen in die betroffenen Zellen eines Patienten kann auch eine geeignete Therapie sein. Bei diesem Verfahren wird ein normales XAF-Gen in einen kultivierbaren Zelltyp transferiert, der entweder exogen oder endogen zu dem Patienten ist. Diese Zellen werden dann serotologisch in das/die Zielgewebe injiziert.
  • Retrovirale Vektoren, adenovirale Vektoren, Adenovirus-assoziierte virale Vektoren oder andere virale Vektoren mit dem geeigneten Tropismus für Zellen, die wahrscheinlich bei Apoptose beteiligt sind (z. B. Epithelzellen), können als ein Gentransfer-Transportsystem für ein therapeutisches XAF-Genkonstrukt verwendet werden. Zahlreiche Vektoren, die für diesen Zweck geeignet sind, sind allgemein bekannt (Miller, Human Gene Therapy 15–14, 1990; Friedman, Science 244: 1275–1281, 1989; Eglitis und Anderson, BioTechniques 6: 608–614, 1988; Tolstoshev und Anderson, Curr. Opin. Biotech. 1: 55–61, 1990; Sharp, The Lancet 337: 1277–1278, 1991; Cornetta et al., Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 36: 311–322, 1987; Anderson, Science 226: 401–409, 1984; Moen, Blood Cells 17: 407–416, 1991; Miller et al., Biotech. 7: 980–990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259: 988–990, 1993; und Johnson, Chest 107: 77S–83S, 1995). Retrovirale Vektoren sind insbesondere gut entwickelt und sind in klinischen Situationen verwendet worden (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323: 370, 1990; Anderson et al., U.S.-Patentnr. 5,399,346 ). Nicht-virale Ansätze können auch für die Einbringung von therapeutischer DNA in Zellen eingesetzt werden, für die ansonsten vorhergesagt wird, dass sie Apoptose durchlaufen. Zum Beispiel kann XAF in ein Neuron oder eine T-Zelle durch Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413, 1987; Ono et al., Neurosci. Lett. 117: 259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298: 278, 1989; Staubinger et al., Meth. Enz. 101: 512, 1983), Asialorosonucoid-Polylysin-Konjugation (Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985, 1989) oder we niger bevorzugt Mikroinjektion unter chirurgischen Bedingungen (Wolff et al., Science 247: 1465, 1990) eingebracht werden.
  • Bei einem anderen Ansatz, der mit all den vorstehenden Verfahren verwendet werden kann, wird ein therapeutisches XAF-DNA-Konstrukt vorzugsweise an die Stelle des erwünschten Apoptose-Ereignisses verabreicht (z. B. durch Injektion). Es kann jedoch auch an Gewebe in der Nähe des erwünschten Apoptose-Ereignisses oder an ein Blutgefäß verabreicht werden, das die Zellen (z. B. Krebszellen) versorgt, von denen es erwünscht ist, dass sie Apoptose durchlaufen.
  • In den beschriebenen Konstrukten kann XAF-cDNA-Expression durch einen jeglichen geeigneten Promotor (z. B. die humanes Cytomegalovirus-(CMV)-, Simianvirus 40-(SV40)- oder Metallothionein-Promotoren) gesteuert und durch ein jegliches geeignetes regulatorisches Element aus Säugern reguliert werden. Zum Beispiel können, falls erwünscht, Enhancer, die dafür bekannt sind, dass sie vorzugsweise Genexpression in neuralen Zellen, Lymphozyten oder Muskelzellen steuern, zur Steuerung der XAF-Expression verwendet werden. Die verwendeten Enhancer könnten ohne Begrenzung diejenigen umfassen, die in ihrer Expression als gewebe- oder zellspezifisch charakterisiert sind. Wenn ein genomischer XAF-Klon als therapeutisches Konstrukt verwendet wird (z. B. nach Isolation durch Hybridisierung mit der vorstehend beschriebenen XAF-cDNA), kann alternativ eine Regulation durch die verwandten regulatorischen Sequenzen oder, falls erwünscht, durch regulatorische Sequenzen, die von einer heterologen Quelle abgeleitet sind und einen jeglichen der vorstehend beschriebenen Promotoren oder regulatorischen Elemente umfassen, vermittelt werden.
  • Antisense-basierte Strategien sind zur Erforschung der XAF-Genfunktion und als eine Basis für therapeutische Medikamentenkonstruktion verwendet worden. Das Prinzip basiert auf der Hypothese, dass Sequenz-spezifische Unterdrückung von Genexpression durch intrazelluläre Hybridisierung zwischen mRNA und einer komplementären Antisense-Spezies erreicht werden kann. Die Bildung eines Hybrid-RNA-Duplexes kann dann in die Prozessierung/den Transport/die Translation und/oder die Stabilität der Ziel-XAF-mRNA eingreifen. Antisense-Strategien können eine Anzahl an Ansätzen verwenden, die die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden und eine Injektion von Antisense-RNA umfassen. Für unsere Analyse einer XAF-1-Genfunktion verwendeten wir das Verfahren einer Transfektion von Antisense-RNA-Expressionsvektoren in Zielzellen. Antisense-Effekte können durch Kon troll-(Sense)-Sequenzen induziert werden, jedoch ist das Ausmaß von phänotypischen Veränderungen stark variabel. Phänotypische Effekte, die durch Antisense-Effekte induziert worden sind, basieren auf Veränderungen in Kriterien wie Proteinmengen, Proteinaktivitätsmessung und Ziel-mRNA-Mengen.
  • Zum Beispiel kann eine XAF-1-Gentherapie auch durch direkte Verabreichung von Antisense-XAF-1-mRNA an eine Zelle, von der erwartet wird, dass sie ungewollte Apoptose durchläuft, erreicht werden. Die Antisense-XAF-1-mRNA kann durch eine jegliche Standardtechnik hergestellt und isoliert werden, wird aber am leichtesten durch in vitro-Transkription unter Verwendung einer Antisense-XAF-1-cDNA unter der Kontrolle eines hocheffizienten Promotors (z. B. dem T7-Promotor) hergestellt. Verabreichung von Antisense-XAF-1-mRNA an Zellen kann durch ein jegliches der vorstehend für direkte Nukleinsäure-Verabreichung beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
  • Ein anderer therapeutischer Ansatz bezieht Verabreichung von rekombinantem XAF-Polypeptid entweder direkt an die Stelle eines erwünschten Apoptose-Ereignisses (z. B. durch Injektion) oder systemisch (z. B. durch eine jegliche herkömmliche Technik zur Verabreichung rekombinanter Proteine) ein. Die Dosis von XAF hängt von einer Anzahl an Faktoren ab, die die Größe und Gesundheit des individuellen Patienten umfassen, aber im Allgemeinen werden zwischen 0,1 mg und 100 mg, einschließlich, pro Tag an einen Erwachsenen in einer jeglichen pharmazeutisch verträglichen Formulierung verabreicht.
  • XI. Verabreichung von XAF-Polypeptiden, XAF-Genen oder Modulatoren von XAF-Synthese oder -Funktion
  • Ein XAF-Protein, -Gen oder -Modulator kann in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Exzipienz in Einheitsdosisformen verabreicht werden. Herkömmliche pharmazeutische Praxis kann verwendet werden, um geeignete Formulierungen oder Zusammensetzungen zur Verabreichung neutralisierender XAF-Antikörper oder XAF-hemmender Verbindungen (z. B. Antisense-XAF-1 oder eine dominant negative XAF-1-Mutante) an Patienten, die unter einer Krankheit (z. B. einer degenerativen Krankheit), die durch übermäßige Apoptose verursacht wird, leiden, bereitzustellen. Eine Verabreichung kann beginnen, bevor der Patient symptomatisch ist. Ein jeglicher geeigneter Verabreichungsweg kann verwendet werden, z. B. kann eine Verabreichung parenteral, intravenös, intra-arteriell, subku tan, intramuskulär, intrakranial, intraorbital, ophthalmisch, intraventrikulär, intrakapsulär, intraspinal, intrazisternisch, intraperitoneal, intranasal, durch Aerosol, durch Zäpfchen erfolgen oder eine orale Verabreichung sein. Therapeutische Formulierungen können in der Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen vorliegen, für eine orale Verabreichung können Formulierungen in der Form von Tabletten oder Kapseln und für intranasale Formulierungen in der Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen vorliegen.
  • Bekannte Verfahren zur Herstellung von Formulierungen werden z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, (18. Ausgabe), Hrsg. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PA, gefunden. Formulierungen für eine parenterale Verabreichung können z. B. Exzipienzien, steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Polyalkylenglykole wie Polyethylenglykol, Öle von pflanzlicher Herkunft oder hydrierte Naphthalene enthalten. Ein biokompatibles, bioabbaubares Lactidpolymer, Lactid/Glykolid-Copolymer oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere können zur Kontrolle der Freisetzung der Verbindungen verwendet werden. Andere möglicherweise geeignete parenterale Transportsysteme für XAF-modulatorische Verbindungen umfassen Ethylenvinylacetat-Copolymerpartikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen. Formulierungen zur Inhalation können Exzipienzien, z. B. Lactose, enthalten oder können wässrige Lösungen sein, die z. B. Polyoxyethylen-9-Laurylether, Glykocholat und Desoxycholat enthalten, oder können ölige Lösungen zur Verabreichung in der Form von Nasentropfen oder als ein Gel sein.
  • Falls erwünscht, kann eine Behandlung mit einem XAF-Protein, -Gen oder einer XAF-modulatorischen Verbindung mit traditionelleren Therapien für die Krankheit, an der übermäßige Apoptose beteiligt ist, verbunden werden, wie Chirurgie, Steroidtherapie oder Chemotherapie für eine Autoimmunkrankheit, antivirale Therapie für AIDS, und Gewebe-Plasminogen-Aktivator (TPA) für eine ischämische Verletzung. In ähnlicher Weise kann eine Behandlung mit einem XAF-Protein, -Gen oder einer XAF-modulatorischen Verbindung mit traditionelleren Therapien für die Erkrankung, bei der ungenügende Apoptose beteiligt ist, verbunden werden, wie Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie für Krebs.
  • XII. Nachweis von Zuständen, bei denen veränderte Apoptose beteiligt ist
  • XAF-Polypeptide und -Nukleinsäuresequenzen finden diagnostische Verwendung bei dem Nachweis oder der Überwachung von Zuständen, bei denen abweichende Mengen an Apoptose beteiligt sind. Zum Beispiel kann eine verringerte Expression von XAF-1 mit verringerter Apoptose in Menschen korreliert sein. Dementsprechend kann eine Verringerung oder Erhöhung im Grad einer XAF-1-Produktion ein Anzeichen für einen schädlichen Zustand bereitstellen. Grade an XAF-Expression können durch eine jegliche Standardtechnik überprüft werden. Zum Beispiel kann eine XAF-Expression in einer biologischen Probe (z. B. einer Biopsie) durch Standard-Northern-Blot-Analyse überwacht werden oder kann durch PCR unterstützt werden (siehe z. B. Ausubel et al., supra; PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Ehrlich, Hrsg., Stockton Press, NY; Yap et al., Nucl. Acids Res. 19: 4294, 1991).
  • Alternativ kann eine biologische Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, auf eine oder mehrere Mutationen in XAF-Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung eines Mismatch-Nachweis-Ansatzes analysiert werden. Im Allgemeinen umfassen diese Techniken eine PCR-Amplifikation von Nukleinsäure von der Patientenprobe gefolgt von einer Identifizierung der Mutation (d. h. des Mismatch) durch entweder veränderte Hybridisierung, abweichende elektrophoretische Gelwanderung, Bindung oder Spaltung, die durch Mismatch-Bindeproteine vermittelt wird, oder direkte Nukleinsäure-Sequenzierung. Eine jede dieser Techniken kann verwendet werden, um einen Nachweis von mutiertem XAF zu ermöglichen, und jede ist gut bekannt. Beispiele von bestimmten Techniken sind ohne Begrenzung in Orita et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766–2770, 1989) und Sheffield et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 232–236, 1989) beschrieben.
  • In einem anderen Ansatz werden Immunassays zum Nachweis oder zur Überwachung von XAF-Proteinexpression in einer biologischen Probe verwendet. XAF-spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper (hergestellt wie vorstehend beschrieben) können in einem jeglichen Standard-Immunassay-Format (z. B. ELISA, Western-Blot oder RIA) zur Messung von XAF-Polypeptidmengen verwendet werden. Diese Mengen werden mit Wildtyp-XAF-Mengen verglichen. Zum Beispiel kann eine Verringerung der XAF-1-Produktion auf einen Zustand hinweisen, bei dem ungenügende Apoptose beteiligt ist. Beispiele von Immunassays sind z. B. in Ausubel et al., supra, beschrieben. Immunhistochemische Techniken können auch für einen XAF- Nachweis verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Gewebeprobe von einem Patienten erhalten, geschnitten und auf die Anwesenheit von XAF unter Verwendung eines Anti-XAF-Antikörpers und eines jeglichen Standard-Nachweissystems (z. B. ein solches, das einen Sekundärantikörper umfasst, der an Meerrettichperoxidase gekoppelt ist) angefärbt werden. Eine allgemeine Anleitung solcher Techniken kann z. B. in Bancroft und Stevens (Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, 1982) und Ausubel et al. (supra) gefunden werden.
  • In einem bevorzugten Beispiel kann ein kombiniertes diagnostisches Verfahren eingesetzt werden, das mit einer Evaluierung von XAF-Proteinproduktion (z. B. durch immunologische Techniken oder den Proteinverkürzungstest (Hogervorst et al., Nature Genetics 10: 208–212, 1995)) beginnt und auch eine Nukleinsäure-basierte Nachweistechnik umfasst, die zur Identifizierung von geringeren XAF-Mutationen (z. B. Punktmutationen) konstruiert ist. Wie vorstehend beschrieben ist eine Reihe an Fehlpaarungsnachweistests für den Fachmann verfügbar und eine jegliche bevorzugte Technik kann verwendet werden. Mutationen in XAF, die entweder zu einem Verlust an XAF-Expression oder zu einem Verlust von normaler biologischer XAF-Aktivität führen, können nachgewiesen werden. In einer Variation dieses kombinierten diagnostischen Verfahrens wird biologische XAF-1-Aktivität als Apoptose-auslösende Aktivität unter Verwendung von einem jeglichen geeigneten Apoptose-Testsystem (z. B. den hierin beschriebenen) gemessen.
  • Fehlpaarung-Nachweistests bieten auch eine Gelegenheit, eine XAF-vermittelte Veranlagung für Krankheiten, die durch unpassende Apoptose ausgelöst werden, zu diagnostizieren. Zum Beispiel kann ein Patient, der heterozygot für eine XAF-1-Mutation ist, die eine XAF-1-Überexpression auslöst, keine klinischen Symptome zeigen und doch eine größere als normale Wahrscheinlichkeit aufweisen, eine oder mehrere Arten von neurodegenerativen oder myelodysplastischen Ereignissen zu entwickeln oder eine schwere Folgeerkrankung zu einem ischämischen Ereignis zu haben. Mit dieser Diagnose können Patienten Vorkehrungen treffen, ihre Belastung mit ungünstigen Umgebungsfaktoren (z. B. UV-Belastung oder chemische Mutagene) zu minimieren und ihren medizinischen Zustand sorgfältig zu überwachen (z. B. durch regelmäßige ärztliche Untersuchungen). Diese Art von diagnostischem XAF-1-Ansatz kann auch verwendet werden, um XAF-1-Mutationen in pränatalen Untersuchungen nachzuweisen. Die vorstehend beschriebenen diagnostischen XAF-1-Tests können unter Verwendung einer jeglichen biologischen Probe (z. B. einer jeglichen Biopsieprobe oder anderem Gewebe), in der XAF-1 normalerweise exprimiert wird, durchgeführt werden. Identifizierung eines mutierten XAF-1-Gens kann auch unter Verwendung dieser Quellen für Testproben untersucht werden.
  • Alternativ kann eine XAF-Mutation, insbesondere als Teil einer Diagnose auf Veranlagung für eine XAF-assoziierte degenerative Krankheit, unter Verwendung einer DNA-Probe aus einer jeglichen Zelle, z. B. durch Fehlpaarung-Nachweistechniken, getestet werden. Vorzugsweise wird die DNA-Probe einer PCR-Amplifikation vor der Analyse unterworfen.
  • XIII. Vorbeugende anti-apoptotische Therapie
  • An einem Patienten, der als Heterozygot für eine XAF-Mutation oder anfällig für XAF-Mutationen oder abweichende XAF-Expression diagnostiziert wurde (selbst wenn diese Mutationen oder Expressionsmuster noch nicht zu einer XAF-Überexpression oder einer erhöhten biologischen XAF-Aktivität führen), oder einem Patienten, bei dem eine degenerative Krankheit diagnostiziert wurde (z. B. degenerative Krankheiten von Motorneuronen wie SMA- oder ALS-Krankheiten) oder der als HIV-positiv diagnostiziert wurde, kann eine jegliche der vorstehenden Therapien vor einem Auftreten des Krankheitsphänotyps verabreicht werden. Zum Beispiel kann ein Patient, der HIV-positiv ist, aber noch keine verminderte T-Zellenzahl oder andere offenkundige Anzeichen für AIDS zeigt, mit den Therapien versorgt werden. Insbesondere können Verbindungen, bei denen gezeigt wurde, dass sie XAF-1-Expression oder biologische XAF-1-Aktivität verringern, an Patienten, bei denen degenerative Krankheiten diagnostiziert wurden, durch eine jegliche Standarddosierung und einen jeglichen Standardverabreichungsweg (siehe vorstehend) verabreicht werden. Alternativ kann eine Gentherapie unter Verwendung eines Antisense-XAF-1-mRNA-Expressionskonstrukts zur Umkehr oder Verhinderung des Zelldefekts vor der Entwicklung der degenerativen Krankheit durchgeführt werden.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren können zur Verringerung oder Diagnose der hierin beschriebenen Erkrankungen in einem jeglichen Säuger, z. B. Menschen, Haustiere oder Vieh, verwendet werden. Wenn ein nicht-menschlicher Säuger behandelt oder diagnostiziert wird, ist das eingesetzte XAF-Polypeptid, die eingesetzte XAF-Nukleinsäure oder der eingesetzte XAF-Antikörper vorzugsweise spezifisch für diese Spezies.
  • XIV. Identifizierung von zusätzlichen XAF-Genen
  • Standardtechniken wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) und DNA-Hybridisierung können zum Klonieren zusätzlicher XAF-Homologen in anderen Spezies verwendet werden. Southern-Blots von genomischer DNA der Maus, die bei geringer Stringenz mit für humanes XAF-spezifischen Sonden hybridisiert wurden, zeigen Banden, die XAF und/oder verwandten Familienmitgliedern entsprechen. Folglich können zusätzliche XAF-Sequenzen leicht unter Verwendung von Hybridisierung unter geringer Stringenz identifiziert werden. Des Weiteren können XAF-spezifsche Primer aus Maus und Mensch zum Klonieren zusätzlicher XAF-verwandter Gene durch RT-PCR verwendet werden.
  • Bisher haben wir multiple ESTs in der Datenbank identifiziert, die signifikante Homologie zu XAF-1 aufweisen. Von den EST-Sequenzen haben wir Oligo-Primer und PCR-kloniertes "XAF-2" hergestellt. Der N-Terminus des XAF-2-Proteins hat fünf der aminoterminalen Zinkfinger von XAF-1 mit einem einzigartigen Carboxyterminus, der zwei zusätzliche RING-Zinkfinger aufweist, so dass das gesamte XAF-2-Protein wie XAF-1 sieben Zinkfinger-Bindedomänen aufweist.
  • XV. Charakterisierung von XAF-Aktivität und intrazelluläre Lokalisationsstudien
  • Die Fähigkeit von XAF-Proteinen, Apoptose zu modulieren, kann in in vitro-Systemen bestimmt werden, in denen Veränderungen von Apoptose nachgewiesen werden können. Säuger-Expressionskonstrukte, die XAF-cDNAs tragen, die entweder die volle Länge aufweisen oder verkürzt sind, können in Zelllinien wie CHO, NIH 3T3, HL60, Rat-1 oder Jurkat-Zellen eingebracht werden. Zusätzlich können SF9-Insektenzellen verwendet werden, in welchem Fall das XAF-Gen vorzugsweise unter Verwendung eines Insekten-Baculovirus-Expressionssystems exprimiert wird. Nach Transfektion kann Apoptose durch Standardverfahren, die Serumentzug umfassen, oder Zugabe von Staurosporin, Menadion (das Apoptose durch Bildung freier Radikale auslöst) oder Anti-Fas- oder Anti-TNF-R1-Antikörper ausgelöst werden. Als eine Kontrolle werden Zellen unter den gleichen Bedingungen wie denen, die zur Durchführung von Apoptose induziert wurden, aber entweder nicht transfiziert oder transfiziert mit einem Vektor, dem ein XAF-Insert fehlt, kultiviert. Die Fähigkeit eines jeden XAF-Konstrukts, bei Expression Apoptose auszulösen oder zu hemmen, kann durch Berechnung des Überlebensindex der Zellen, d. h. dem Verhältnis von überlebenden transfizierten Zellen zu überlebenden Kontrollzellen, quantifiziert werden. Diese Experimente können die Anwesenheit von Apoptose-auslösender Aktivität des Volllängen-XAF-1-Proteins bestätigen und können wie nachstehend diskutiert auch verwendet werden, um die funktionelle(n) Region(en) von XAF-1-Protein zu bestimmen. Diese Tests können auch in Kombination mit der Zugabe von zusätzlichen Verbindungen durchgeführt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die Apoptose durch XAF-Expression modulieren.
  • XVI. Beispiele von zusätzlichen Apoptose-Tests
  • Spezifische Beispiele von Apoptose-Tests werden auch in den folgenden Referenzen bereitgestellt. Tests für Apoptose in Lymphozyten sind offenbart durch: Li et al., "Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein", Science 268: 429–431, 1995; Gibellini et al., "Tat-expressing Jurkat cells show an increased resistance to different apoptotic stimuli, including acute human immunodeficiency virus-type 1 (HIV-1) infection", Br. J. Haematol. 89: 24–33, 1995; Martin et al., "HIV-1 infection of human CD4+ T cells in vitro. Differential induction of Apoptosis in these cells." J. Immunol. 152: 330–342, 1994; Terai et al., "Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T lymphoblasts acutely infected with HIV-1", J. Clin. Invest. 87: 1710–1715, 1991; Dhein et al., "Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1 (Fas/CD95)", Nature 373: 438–441, 1995; Katsikis et al., "Fas antigen stimulation induces marked apoptosis of T lymphocytes in human immunodeficiency virus-infected individuals", J. Exp. Med. 1815: 2029–2036, 1995; Westendorp et al., "Sensitization of T cells to CD95-mediated Apoptosis by HIV-1 Tat and gp12O", Nature 375: 497, 1995; DeRossi et al., Virology 198: 234–244, 1994.
  • Tests für Apoptose in Fibroblasten sind offenbart durch: Vossbeck et al., "Direct transforming activity of TGF-beta on rat fibroblasts", Int. J. Cancer 61: 92–97, 1995; Goruppi et al., "Dissection of c-myc domains involved in S phase induction of NIH3T3 fibroblasts", Oncogene 9: 1537–44, 1994; Fernandez et al., "Differential sensitivity of normal and Ha-ras transformed C3H mouse embryo fibroblasts to tumor necrosis factor: induction of bcl-2, c-myc, and manganese superoxide dismutase in resistant cells", Oncogene 9: 2009–2017, 1994; Harrington et al., "c-Myc-induced apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines", EMBO J. 13: 3286–3295, 1994; Itoh et al., "A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen", J. Biol. Chem. 268: 10932–10937, 1993.
  • Tests für Apoptose in neuronalen Zellen sind offenbart durch: Melino et al., "Tissue Transglutaminase and apoptosis: sense and antisense transfection studies with human neuroblastoma cells", Mol. Cell Biol. 14: 6584–6596, 1994; Rosenbaum et al., "Evidence for hypoxia-induced, programmed cell death of cultured neurons", Ann. Neurol. 36: 864–870, 1994; Sato et al., "Neuronal differentiation of PC12 cells as a result of prevention of cell death by bcl-2", J. Neurobiol. 25: 1227–1234, 1994; Ferrari et al., "N-acetylcysteine D- and L-steroisomers prevents apoptotic death of neuronal cells", J. Neurosci. 1516: 2857–2866, 1995; Talley et al., "Tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis in human neuronal cells: protection by the antioxidant N-acetylcysteine and the genes bcl-2 and crmA", Mol. Cell Biol. 1585: 2359–2366, 1995; Talley et al., "Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Apoptosis in Human Neuronal Cells: Protection by the Antioxidant N Acetylcysteine and the Genes bcl-2 and crmA", Mol. Cell. Biol. 15: 2359–2366, 1995; Walkinshaw et al., "Induction of apoptosis in catecholaminergic PC12 cells by L-DOPA. Implications for the treatment of Parkinson's disease.", J. Clin. Invest. 95: 2458–2464, 1995.
  • Tests für Apoptose in Insektenzellen sind offenbart durch: Clem et al., "Prevention of apoptosis by a baculovirus gene during infection of insect cells", Science 254: 1388–1390, 1991; Crook et al., "An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif", J. Virol. 67: 2168–2174, 1993; Rabizadeh et al., "Expression of the baculovirus p35 gene inhibits mammalian neural cell death", J. Neurochem. 61: 2318–2321, 1993; Birnbaum et al., "An apoptosis inhibiting gene from a nuclear polyhedrosis virus encoding a polypeptide with Cys/His sequence motifs", J. Virol. 68: 2521–2528, 1994; Clem et al., Mol. Cell. Biol. 14: 5212–5222, 1994.
  • XVII. Konstruktion eines transgenen Tiers
  • Charakterisierung von XAF-Genen stellt Information bereit, die notwendig für XAF-Knockout-Tiermodelle ist, die durch homologe Rekombination entwickelt werden sollen. Vorzugsweise ist das Modell ein Säugetier, am meisten bevorzugt eine Maus. In ähnlicher Weise kann ein Tiermodell für XAF-Überexpression durch Integrieren einer oder mehrerer XAF-Sequenzen in das Genom gemäß Standard-Transgentechniken erstellt werden.
  • Ein Zielvektor des Austausch-Typs, der zur Herstellung eines Knockout-Modells verwendet würde, kann unter Verwendung eines isogenen genomischen Klons z. B. von einem Mausstamm wie 129/Sv (Stratagene Inc., LaJolla, CA) konstruiert wer den. Der Zielvektor wird in eine geeigneterweise abgeleitete embryonale Stamm-(ES)-Zelllinie durch Elektroporation eingebracht werden, um ES-Zelllinien herzustellen, die eine hochgradig verkürzte Form eines XAF-Gens tragen. Um chimärische Ursprungsmäuse herzustellen, werden die Zielzelllinien in einen Mäuseembryo der Blastula-Stufe injiziert. Heterozygote Nachkommen werden zur Homozygosität gekreuzt. Knockout-Mäuse würden die Mittel bereitstellen, in vivo auf therapeutische Verbindungen zu screenen, die Apoptose durch einen XAF-abhängigen Weg modulieren. Eine Herstellung solcher Mäuse kann eine Verwendung von loxP-Stellen benötigen, falls multiple Kopien von XAF-Genen (d. h. Genen, die XAF-1 und andere XAF-Polypeptide kodieren) auf dem Chromosom vorhanden sind (siehe Sauer und Henderson, Nucleic Acids Res. 17: 147–61, 1989).
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen. Sie sollen nicht als die Erfindung in irgendeiner Weise begrenzend angesehen werden.
  • BEISPIEL I
  • cDNA- und vorhergesagte Aminosäuresequenzen von kloniertem humanem XAF-1
  • Eine Hefe-2-Hybrid-Analyse (siehe USSN 08/511,485 und verwandte Anmeldungen) mit XIAP als das "Köder"-Protein identifizierte ein 37 kDa RING-Zinkfinger-Protein, das XAF-1 (XIAP-assoziierter Faktor 1) genannt wurde.
  • Methoden
  • Das Plasmid pAS2-XIAP, das die GAL4-DNA-Bindedomäne fusioniert an Volllängen-XIAP kodiert, wurde durch Inserieren der kodierenden Region von Volllängen-XIAP in das pAS2-Plasmid, das kommerziell von Clontech erhältlich ist, konstruiert. pAS2-XIAP wurde dann als Köder (DNA-Bindedomänen-Hybrid) in Hefe-2-Hybridscreens der humanen Plazenta-cDNA-Bibliothek, die kommerziell von Clontech erhältlich ist, verwendet. Der Hefe-2-Hybridtest und Isolierung von positiven Klonen und nachfolgende Interaktionsanalysen wurden wie beschrieben durchgeführt (PCT-Veröffentlichung WO 95/28497 ). DNA-Sequenzierung wurde auf dem automatischen DNA-Sequenzierer Modell 373A von Applied Biosystems durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • In 1 ist die gesamte Nukleotidsequenz von XAF-1-cDNA gezeigt, die für den kodierenden Strang (SEQ ID NO: 1; EMBL-Zugangsnummer X99699) bestimmt wurde, und sie ist mit ihrem kodierenden Protein unterhalb im Ein-Buchstaben-Code (SEQ ID NO: 2) gezeigt. Das Sternchen zeigt das Stopp-Codon an. Es ist vorhergesagt, dass das gesamte XAF-1-Protein sieben Zinkfinger-Bindedomänen aufweist, von denen sechs in den N-terminalen 178 Aminosäuren lokalisiert sind. XAF-1 zeigt eine signifikante Homologie zu Mitgliedern der TRAF-Familie, insbesondere TRAF6, wobei aber die TRAF-C- und TRAF-N-Domänen fehlen.
  • BEISPIEL II
  • Vorhergesagte Zinkfinger des XAF-1-Aminoterminus
  • Ergebnisse
  • In 2 ist ein Schema der sechs vorhergesagten Zinkfinger-Bindedomänen gezeigt, die den N-terminalen 178 Aminosäuren von XAF-1 (SEQ ID NO: 6) entsprechen.
  • Beispiel III
  • Northern-Blot-Analyse von XAF-1-mRNA in mehreren menschlichen Geweben
  • Methoden
  • Unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik beschrieben sind (siehe z. B. Ausubel et al., supra), wurde mRNA aus Geweben von Herz, Hirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, Pankreas, Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Dünndarm, Schleimhaut des Dickdarms und peripheren Blutleukozyten gesammelt. mRNA wurde auch von den folgenden Zelllinien gesammelt:
    • HL-60, eine Promyelozytenleukämie;
    • HeLa/S3, ein Cervix-Epitheloidkarzinom;
    • K-562, eine chronische myeloische Leukämie;
    • MOLT-4, eine lymphoblastische Leukämie;
    • Raji, ein Burkitt's-Lymphom;
    • SW480, ein colorektales Adenokarzinom;
    • A549, ein Lungenkarzinom; und
    • G361, ein Melanom.
  • Die mRNA-Proben wurden elektrophoretisch aufgelöst und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert, die dann einer Northern-Blot-Analyse auf die Anwesenheit und Expressionsgrade von XAF-1-mRNA unter Verwendung von Radioisotop-markierter XAF-1-cDNA als eine Sonde unterworfen wurde (wie beschrieben in Ausubel et al., supra).
  • Zusätzliche mRNA wurde auch von Lunge, Trachea und Plazenta sowie verschiedenen Untereinheiten des Gehirns, des Herzens, der Hoden, der Niere und von fötalem Gewebe gesammelt. RNA von Hefe und E. coli-Bakterien wurde auch gesammelt. Diese RNA sowie DNA, die von Mensch, E. coli-Bakterien und Hefe gesammelt wurde, wurde punktförmig auf eine Dot-Blot-Apparatur aufgetragen, elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit Radioisotop-markierter XAF-1-cDNA auf die Anwesenheit und Expressionsgrade von XAF-1-mRNA sondiert.
  • Ergebnisse
  • XAF-1-kodierende mRNA wird deutlich in normalen Zellen in verschiedenen Geweben exprimiert. 3 zeigt eine Northern-Blot-Analyse, die zeigt, dass XAF-1-mRNA unter den verschiedenen getesteten Geweben mit höchsten Expressionsgraden in dem Herzen, der Plazenta, der Milz, dem Thymus, dem Eierstock, dem Dünndarm, der Schleimhaut des Dickdarms und peripheren Blutleukozyten weit verbreitet ist. XAF-1-mRNA ist auch in K-562- und MOLT-4-Leukämie-Zelllinien vorhanden.
  • Die in 4 gezeigte Dot-Blot-Analyse von verschiedenen Geweben zeigt, dass XAF-1-mRNA unter den verschiedenen angegebenen Regionen des Hirns, des Herzens, der Hoden, der Niere, der Lunge, der Trachea, der Plazenta und von fötalem Gewebe weit verbreitet ist. XAF-1-mRNA wird jedoch nicht in Hefe oder Bakterien des E. coli-Stamms gefunden.
  • BEISPIEL IV
  • Genomische Southern-Blot-Analyse von XAF-1
  • Methoden
  • Genomische DNA wurde aus humanen HEC38-0 endometrialen Adenokarzinomzellen, die von der ATCC (Bethesda, Maryland) erhältlich sind, und Raji-Zellen präpariert, mit den Restriktionsendonukleasen BamH1, EcoR1 und HindIII verdaut, elektrophoretisch aufgelöst und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Membran-gebundene DNA wurde einer Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von Radioisotop-markierter XAF-1-cDNA als eine Sonde unterworfen.
  • Ergebnisse
  • Wie in 5 gezeigt scheint das XAF-1-kodierende Gen hinsichtlich der Kopienzahl im menschlichen Genom beschränkt zu sein und ist in sowohl HEC38-0- als auch Raji-Zellen gleich, was nahe legt, dass sehr wahrscheinlich nur ein XAF-1-kodierendes Gen vorhanden ist und dass dieses Gen in den zwei untersuchten Zelllinien das gleiche ist.
  • Beispiel V
  • Western-Blot-Analyse von XAF-1-Protein in verschiedenen Zelllinien
  • Methoden
  • Eine Reihe an transformierten, immortalisierten Zelllinien und eine primäre Zelllinie wurden durch Western-Blot-Analyse auf das Vorhandensein und Expressionsgrade von XAF-1-Protein unter Verwendung polyklonaler Anti-XAF-1-Antiseren aus Maus, die durch Bereitstellen von GST-Fusionsproteinen aus XAF-1 und XIAP an das MBL Co., Ltd. (Japan) zur Verwendung als Immunogene erhalten wurden, getestet. Zellen wurden lysiert und Lysate mittels SDS-PAGE aufgelöst, elektrophoretisch auf eine Nylon-Membran transferiert und mit polyklonalen Anti-XAF-1-Antiseren immungeblottet. Die Membran-gebundenen Proteine wurden dann mit einem kommerziell erhältlichen Anti-Maus-Sekundärantikörper, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, geblottet und mit einem chemilumineszenten Substrat sichtbar gemacht.
  • Die in der Western-Blot-Analyse verwendeten Zelllinien waren:
    • HeLa: Epitheloidkarzinom, Cervix, human;
    • A431: Epidermoidkarzinom, human;
    • SUDHL6: Hodgekinlymphom, human;
    • P19: Embryonales Karzinom, Maus;
    • cos-7: Nierenfibroblast, SV40-transformiert, afrikanische grüne Meerkatze;
    • 293T: Adenovirus Typ 5-transformierte primäre embryonale Niere, human;
    • CHO: Eierstock aus chinesischem Hamster;
  • Zur Verwendung als eine Positivkontrolle für eine Western-Blot-Analyse wurden 293T-Zellen, die transient ein myc-getaggtes XAF-1-Protein exprimieren, durch das folgende Verfahren hergestellt:
    293T-Zellen (2 × 105) wurden mit 4 μg XAF-1-kodierender Plasmid-DNA durch Standard-Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Trans-IT-Lipofektionsreagenz, das kommerziell von Mirus erhältlich ist, transfiziert.
  • Ergebnisse
  • In 6 ist die Western-Blot-Analyse der verschiedenen Zelllinien auf XAF-1-Expression gezeigt. Bei dieser Art von Analyse scheint XAF-1-Expression ubiquitär zu sein, wobei geringe Grade in einer Reihe an transformierten Zelllinien sichtbar sind.
  • BEISPIEL VI
  • XAF-1-Konstrukte und -Expression
  • Methoden
  • Säuger-Expressionsvektoren, die Volllängen-XAF-1, die N-terminalen 173 Aminosäuren von XAF-1, die sechs potentielle Zinkfinger einschließlich der Region mit signifikanter Homologie zu TRAF4 und TRAF6 enthalten, (XAF-1N; SEQ ID NO: 7), die C-terminalen Aminosäuren 173–317 von XAF-1, die eine einzelne potentielle Zinkfinger-Domäne enthalten, (XAF-1C; SEQ ID NO: 8), kodieren, wurden durch Inserieren von der jeweiligen kodierenden Region in den pcDNA3-myc-Expressionsvektor konstruiert, der eine N-terminale c-myc-Epitopsequenz enthält (ähnliche Vektoren sind kommerziell von Invitrogen erhältlich). Um das XAF-1-Antisensekon strukt herzustellen, wurde ein 720 bp-Fragment von XAF-1, das den Nukleotiden 723-1 (nicht-kodierende Orientierung) entspricht, in den pcDNA3-Expressionsvektor (Invitrogen) kloniert.
  • 293T-Zellen (2 × 105) wurden transient mit 4 μg XAF-1-, XAF-1N- oder XAF-1C-kodierender Plasmid-DNA durch Standard-Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Trans-IT-Lipofektionsreagenz, das kommerziell von Mirus erhältlich ist, transfiziert. Etwa 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und 106 Zelläquivalente wurden durch SDS-PAGE aufgelöst und elektrophoretisch auf eine Nylon-Membran transferiert. Die Membran-gebundenen Proteine wurden dann mit einem monoklonalen Anti-myc-Antikörper (9E10) (kommerziell von Amersham Life Sciences erhältlich), gefolgt von einem kommerziell erhältlichen sekundären Anti-Maus-Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist, immungeblottet. Immunreaktive Proteine wurden durch Chemilumineszenz nach Zugabe von Substrat sichtbar gemacht.
  • Ergebnisse
  • In 7 sind schematische Diagramme der durch die verschiedenen XAF-1-Konstrukte kodierten Polypeptide gezeigt. Obwohl XAF-1-Antisense hier in der "kodierenden" Orientierung gezeigt ist, inserierte und exprimierte es in dem Vektor in der "nicht-kodierenden" Orientierung.
  • In 8 ist die Western-Blot-Analyse von mit XAF-1-, XAF-1N- und XAF-1C-transient transfizierten 293T-Zellen, die mit Anti-C-myc-Antikörper sondiert wurden, gezeigt. Die exprimierten Proteine zeigen eine korrekte elektrophoretische Mobilität, die von den Aminosäure-Sequenzen vorhergesagt wurde.
  • BEISPIEL VII
  • Wirkung von XAF-1-Überexpression auf das Überleben von Zellen
  • Methoden
  • Rekombinante Adenoviren wurden konstruiert, die entweder das LacZ-Protein (Negativkontrolle), p53 (Positivkontrolle für Zellzyklus-Arrest) oder das XAF-1-Protein überexprimieren. HeLa (Cervixkarzinom, erhältlich von der ATCC, Bethesda, MD) und HEL (humane embryonale Lungenepithelzellen, erhältlich von der ATCC, Be thesda, MD) wurden mit rekombinantem Adenovirus bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 infiziert. Dreifache Proben von infizierten Zellen wurden bei t = 0, 24, 48, 72 und 96 Stunden nach Infektion entnommen. Zell-Lebensfähigkeit wurde unter Verwendung von Standard-MTT-Tests untersucht. Zusammengefasst wurde das Medium von dem Näpfchen entfernt und mit 1/10 Volumen MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, erhältlich von Sigma) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung ersetzt und bei 37°C 4 Stunden inkubiert. Umgewandelter Farbstoff wurde dann unter Verwendung von saurem Isopropanol (0,1 N HCl in 100% Isopropanol) extrahiert und die Absorption bei 570 nm in einem Spektrophotometer bestimmt. Umwandlung des Substrats in den bei 570 nm absorbierenden Farbstoff wird durch mitochondriale Enzyme durchgeführt, die in lebenden aber nicht in toten Zellen aktiv sind.
  • Die Verfahren sind ferner beschrieben in: Carmichael, J. et al., (1987) Cancer Res. 47: 936–942 und Miyake, S. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320–1324.
  • Ergebnisse
  • Wie in 9 und 10 zu sehen, hatte Adenovirus-LacZ keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit von Zellen (vergleiche mit der Kontrolle, CON, die nicht infiziert war). Im Gegensatz dazu löste p53 eine starke Verringerung der Anzahl an lebensfähigen Zellen aus, wenn primäre HEL-Zellen verwendet wurden (9), aber nicht in der HeLa-Krebszelllinie (10). Das XAF-1-exprimierende Adenovirus führte zu einer ähnlichen Verringerung der Anzahl an lebensfähigen Zellen in sowohl HEL- als auch HeLa-Zelllinien. Die Verringerung der Lebensfähigkeit in den HeLa-Zelllinien würde daher als unabhängig von p53a erscheinen. Fotografien von Adeno-LacZ-infizierten, Adeno-p53-infizierten und Adeno-XAF-1-infizierten HEL-(11A, 11B, 11C) und HeLa-Zellen (12A, 12B, 12C) sind umfasst. Die Morphologie der XAF-1-überexprimierenden HEL-Zellen stimmt mit Zellzyklus-Arrest überein. Im Gegensatz dazu zeigen die XAF-1-überexprimierenden HeLa-Zellen klassische Merkmale von Apoptose, die pyknotische Zellkerne und umfangreiche Bläschenbildung umfassen. Fotografien wurden vier Tage nach Infektion unter Verwendung eines Standard-Phasenkontrast-Invert-Gewebekultur-Mikroskops aufgenommen.
  • BEISPIEL VIII
  • Zellzyklus-Analyse von XAF-1-überexprimierenden HEL- und HeLa-Zellen
  • Methoden
  • 1 × 105 HeLa- oder HEL-Zellen wurden bei einer MOI von 10 mit rekombinanten Adenoviren infiziert, die entweder LacZ (Negativkontrolle), p53 (Positivkontrolle für Zellzyklus-Arrest) oder XAF-1 exprimieren. Zellen wurden 96 Stunden nach Infektion geerntet, mit PBS gewaschen und mit 100% Ethanol fixiert. Fixierte Zellen wurden 5 Minuten bei 1000 U/Min. zentrifugiert, das Ethanol wurde entfernt und die Zellen wurden in 1 ml PBS resuspendiert. 100 μl 0,1 mg/ml RNase wurden zugegeben und die Zellen wurden bei 37°C 30 Minuten inkubiert. 100 μl 1 mg/ml Propidiumiodid wurden zugegeben, um auf DNA-Gehalt zu färben. Zellen wurden dann auf einer FACS-Maschine analysiert und Zellzyklus-Wirkungen untersucht.
  • Ergebnisse
  • In HEL-Zellen hatte eine Adeno-LacZ-Infektion keine Wirkung auf die Zellzyklus-Profile (vgl. 13A [nicht infiziert] mit 13B [LacZ-infiziert]). Im Gegensatz dazu bewirkten sowohl p53-(13C) als auch XAF-1-(13D)-exprimierende Adenoviren einen nahezu kompletten Stillstand des Zellzyklus und einen Gi-Arrest (beachte die Abwesenheit von S-Phase-Zellen und Akkumulation von G1-arretierten Zellen). Die Wirkungen von p53 und XAF-1 waren identisch. Infektion von HeLa-Zellen mit dem LacZ-Virus hatte keine Wirkung wie in 14A und 14B zu sehen. Im Gegensatz zu den HEL-Zellen arretierten HeLa-Zellen nicht, wenn sie mit dem Adeno-p53-Virus infiziert wurden (14C). Mit dem Adeno-XAF-1-Virus arretierten HeLa-Zellen nicht in G1 sondern durchliefen stattdessen Apoptose (14D). (Beachte: Die sich verändernden Skalen auf den FACS-Ergebnissen ergeben den Anschein eines G2-Arrests [d. h. Zelle mit 2n DNA]. In der Tat veränderte sich die Anzahl an Zellen in S und G2 nicht signifikant). Es gibt einen Verlust an G1-Zellen und eine Erhöhung der Anzahl an Zellen mit weniger als in DNA-Gehalt, was Apoptose anzeigt.
  • BEISPIEL IX
  • Chromosomale Lokalisation des XAF-1-Gens durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH)
  • Methoden
  • FISH wurde mit frisch isolierten Milzlymphozyten aus Maus durchgeführt, die in RPMI 1640-Medium mit 15% fötalem Kälberserum, 3 μg/ml Concanavalin A, 10 μg/ml Lipopolysaccharid und 50 nM Mercaptoethanol kultiviert wurden. Lymphozyten wurden mit 180 μg/ml BrdU 14 Stunden synchronisiert, gefolgt von 4 Stunden Wachstum in α-MEM mit 2,5 μg/ml Thymidin. Chromosomausbreitungen wurden auf Objektträgern unter Verwendung von hypotonischer Lyse präpariert, wonach die Chromosomen fixiert und luftgetrocknet wurden. 1 μg DNA-Sonde, die von einem XAF-1-spezifischen genomischen Phagenklon abgeleitet war, wurde mit biotinyliertem dATP unter Verwendung des BRL BioNick-Markierungskits bei 15°C eine Stunde markiert (Gibco BRL). Objektträger wurden bei 55°C eine Stunde gebacken, mit RNAse A behandelt und die Chromosomen wurden in 70% Formamid in 2 × SSC 2 Minuten bei 70°C denaturiert, gefolgt von Ethanol-Dehydrierung. Sondenhybridisierung an die denaturierten Chromosomen wurde über Nacht in 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 1 μg/ml Maus-cot I-DNA durchgeführt. Objektträger wurden in 2 × SSC/50% Formamid gefolgt von 2 × SSC bei 42°C gewaschen. Biotin-markierte DNA wurde amplifiziert und unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertem Avidin und Anti-Avidin-Antikörpern nachgewiesen (15A). Chromosomen wurden mit Giemsa gegengefärbt und fotografiert (15B).
  • Ergebnisse
  • Es wurde gefunden, dass das XAF-1-Gen am extremen Ende von Chromosom 17, in der p13.3-Region kartiert. Es ist bekannt, dass diese Region (ein) bis jetzt nicht identifizierte(s) Tumor-Suppressor-Gen(e) kodiert. Es wird vermutet, dass dieses Tumor-Suppressor-Gen bei einer großen Anzahl an Tumorarten beteiligt ist, einschließlich Uterus-Cervix-Karzinom (Park et al., Cancer Genet. Cytogenet. 79: 74–78, 1995), Brusttumoren (Cornelis et al., Cancer Res. 54: 4200–4206, 1994; Merlo et al., Cancer Genet. Cytogenet. 76: 106–111, 1994), Magenkarzinom (Kim et al., Lab. Invest. 72: 232–236, 1995), Eierstock-Epithelkrebs (Wertheim et al., Oncogene 12: 2147–2153, 1996), pädiatrischem Medulloblastom (McDonald et al., Genomics 23: 229–232, 1994; Übersicht in Cogan und McDonald, J. of Neuro-Oncology 29: 103–112, 1996) und Lungenkarzinom (White et al., Br. J. Cancer 74: 863–870, 1996). Daher kann XAF-1 ein Tumor-Suppressor sein und Therapien, die für eine Überexpression von XAF-1 in Krebszellen konstruiert sind, können effektiv sein (d. h. Gentherapie, Verbindungen, die endogenes XAF-1 hochregulieren, oder Verbindungen, die den XAF-1-Weg aktivieren). Des Weiteren kann das XAF-1-Gen einen wichtigen Einstufungs-/Prognose-Indikator bei der Krebsdiagnostik durch die Entwicklung eines LOH-Typ-Tests unter Verwendung von einem PCR-basierten Nachweis von Mikrosatelliten im XAF-1-Lokus darstellen.
  • BEISPIEL X
  • Subzelluläre Lokalisation des XAF-1-Proteins
  • Methoden
  • Dreifache Platten von HeLa-Zellen (ATCC, Bethesda, MD) wurden mit einem rekombinanten Adenovirus, der den offenen Leserahmen von XAF-1 unter der Kontrolle des β-Actin-Promotors aus Huhn exprimiert, bei einer Multiplizität der Infektion von 10 infiziert. 48 Stunden nach Infektion wurden die Zellen in 5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung geerntet, durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit pelletiert (5 Minuten, 1000 U/Min. in einem Beckman JA-10-Rotor bei 4°C) und Zellextrakte wurden wie folgt präpariert:
    • – Zellen wurden mit isotonischer Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,0) gewaschen.
    • – Zellen wurden durch fünfmaliges Einfrieren/Auftauen in Zellextraktionspuffer (50 mM PIPES, 50 mM KCl, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT und 20 μM Cytochalasin B) lysiert.
    • – Zellkerne wurden durch Zentrifugation bei 5000 U/Min. in einem JA-17-Rotor 5 Minuten pelletiert. Zellkernpellet wurde in isotonischem Tris pH 7,0 resuspendiert und bei –80°C eingefroren.
    • – Cytoplasmatischer Extrakt wurde weiter durch Zentrifugation bei 60000 U/Min. in einem TA 100.3-Rotor 30 Minuten behandelt. Überstand (cytoplasmatischer Extrakt) wurde bei –80°C eingefroren. Pelletiertes Material (Membranfraktion) wurde in isotonischem Tris pH 7,0 resuspendiert und eingefroren.
    • – Zellkern-, Membran- und cytoplasmatische Fraktionen wurden auf einem 12,5%igem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und auf PVDF-Membranen elektrogeblottet.
    • – Western-Blot wurde zuerst unter Verwendung von polyklonalem Anti-XAF-1-Antikörper aus Kaninchen bei einer Konzentration von 1:1500 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,5% NP-40 und 3% Magermilchpulver durchgeführt. Der Sekundärantikörper war ein Meerrettichperoxidase-gekoppelter Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Amersham), der bei 1:2000-Verdünnung in dem gleichen Puffersystem verwendet wurde. Chemilumineszenter Nachweis von gebundenem Antikörper wurde unter Verwendung des Amersham-ECL-Kits gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die Membran wurde dann mit polyklonalem Anti-XIAP-Antikörper bei einer 1:2000-Verdünnung re-sondiert und wie vorstehend prozessiert.
  • Ergebnisse
  • 16A zeigt, dass die große Mehrheit des Adenovirus-exprimierten XAF-1-Proteins im Zellkern-Kompartiment fraktioniert. Eine sehr kleine Fraktion des Proteins wurde in der Membranfraktion beobachtet, wahrscheinlich als ein Ergebnis einer unvollständigen Trennung der Zellkern- und Membranfraktionen. Das Protein wurde nicht in der cytoplasmatischen Fraktion beobachtet. 16B zeigt, dass Überexpression des XAF-1-Proteins zu einer Umverteilung von > 1/2 des endogenen XIAP-Proteins von der cytoplasmatischen Fraktion in die Zellkern-Fraktion führte. Eine Erklärung dafür ist, dass die Funktion von XAF-1 die Umlagerung des XIAP-Proteins an seine "wahre" Wirkstelle im Zellkern ist. Alternativ kann XIAP die Funktion von XAF-1 im Zellkern stören.
  • BEISPIEL XI
  • XAF-1-Protein wird im Zellkern durch GFP-Färbung gefunden
  • Methoden
  • Ein pGFP-XAF-1 genannter Expressionsvektor, der ein Fusionsprotein zwischen grün fluoreszierendem Protein (GFP) und XAF-1 (Clontech) herstellt, wurde konstruiert. Die kodierende Region von GFP wurde an den Aminoterminus der Volllängen-XAF-1-kodierenden Region fusioniert.
  • CHO-K1-Zellen oder 3Y1-primäre Rattenembryofibroblastenzellen aus Fischer-Rattenfötus (erhältlich von der Riken-Genbank, Tsukuba, Japan) wurden durch Standard-Lipofektionsverfahren unter Verwendung des Trans-IT-Lipofektionsreagenzes, das kommerziell von Mirus erhältlich ist, mit pGFP oder pGFP-XAF-1 transient transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Blaufilter sichtbar gemacht.
  • Alle Zellen wurden mit Evans Blue gegengefärbt.
  • Ergebnisse
  • 17A, 17B und 17C sind Fotografien von transfizierten CHO-K1-Zellen. 17A und 17B zeigen, dass in CHO-K1-Zellen, die mit pGFP-XAF-1 transient transfiziert sind, das GFP-markierte XAF-1-Protein im Zellkern lokalisiert war. Dies ist im Gegensatz zum GFP, das homogen durch das Cytoplasma und den Zellkern in den CHO-K1-Zellen, die mit pGFP transient transfiziert wurden und in 17C gezeigt sind, verteilt ist.
  • 18A und 18B zeigen, dass GFP homogen durch das Cytoplasma und den Zellkern in 3Y1-Zellen, die transient mit pGFP transfiziert sind, verteilt ist.
  • 19A und 19B zeigen, dass GFP-markiertes XAF-1-Protein im Zellkern in 3Y1-Zellen, die transient mit pGFP-XAF-1 transfiziert sind, lokalisiert ist.
  • Wir haben des Weiteren gefunden, dass XAF-1-Expression zu einer Umverteilung von XIAP-Protein aus dem Cytoplasma in den Zellkern führte.
  • BEISPIEL XII
  • Weder die Überexpression von XAF-1 noch von Säuger-IAPs kann NF-κB-Aktivierung in 293T-Zellen auslösen.
  • Jedes der Mitglieder der wachsenden Familie der TRAF-Proteine besitzt einen aminoterminalen RING-Zinkfinger und/oder zusätzliche Zinkfinger, einen Leucin-Zipper und ein einzelnes konserviertes carboxyterminales Coiled-Coil-Motiv, die TRAF-C-Domäne, die die Familie definiert. TRAF1 und TRAF2 wurden zuerst als Komponenten des TNF-R2-Signalkomplexes identifiziert (Rothe et al., Cell 78: 681–692, 1994). Die Interaktionen der TRAF-Proteine sind komplex, was ihre mögliche Rolle als Adaptermoleküle, die selbst keine ersichtliche enzymatische Aktivität besitzen, widerspiegelt.
  • Methoden
  • Säuger-Expressionsvektoren, die XAF-1, HIAP-1, HIAP-2, XIAP, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, RIP und TRADD kodieren, wurden durch Insertion einer jeden kodierenden Region in den pcDNA3-myc-Expressionsvektor, der eine N-terminale C-myc-Epitopsequenz enthält (ähnliche Vektoren sind kommerziell von Invitrogen erhältlich), konstruiert. Das NF-κB-Glühwürmchen-Luciferase-Reporterplasmid pELAM-Lu wurde durch Insertion von PCR-amplifizierten E-Selectin-Promotorsequenzen von Position –730 bis Position 52 in den pGL3-Basisvektor, der kommerziell von Promega erhältlich ist, konstruiert.
  • 293T-Zellen wurden in Collagen-beschichtete Platten mit sechs Näpfchen bei 2 × 105 Zellen pro Näpfchen 24 Stunden vor Transfektion ausgebracht. Zellen wurden dann mit 0,5 μg pELAM-Lu-Reporterplasmid, 0,05 μg pRL-CMV, 1 μg des angegebenen Expressionsplasmids und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 4 μg Gesamt-DNA zu ergeben, durch Standard-Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Trans-IT-Lipofektionsreagenz, das kommerziell von Mirus erhältlich ist, transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden Zellen mit PBS gewaschen und in 400 μl Passive Lysis Buffer, der kommerziell von Promega erhältlich ist, lysiert. Lysat (20 μl) von jeder Probe wurde zur Messung von Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität verwendet. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Luciferase-Aktivität wurde in einem Luminometer des Modells TD20/20 unter Verwendung des Dual-Luciferase-Assaysystems gemäß dem Protokoll des Herstellers (Promega) gemessen. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • XAF-1, HIAP-1, HIAP-2 und XIAP lösen keine NF-κB-Aktivierung in 293T-Zellen aus. Wie in 20 gezeigt, führten die IAPs oder XAF-1 nicht zu messbarer Aktivierung von NF-κB wie durch Luciferase-Aktivität gemessen, wenn sie einzeln in 293T-Zellen exprimiert wurden. TRAF2-, TRAF5-, TRAF6-, RIP- und TRADD-Expressionsplasmide transaktivierten jedoch alle stark das Reportergen. TRAF1, TRAF3 und TRAF4 transaktivierten den Reporter nicht. Wir erhielten auch Daten, die zeigen, dass XIAP NF-κB in HeLa-Zellen aktivieren kann.
  • BEISPIEL XIII
  • Coexpression von XAF-1 und Säuger-IAPs löst keine NF-κB-Aktivierung in 293T-Zellen aus.
  • Methoden
  • 293T-Zellen wurden in Collagen-beschichtete Platten mit sechs Näpfchen bei 2 × 105 Zellen pro Näpfchen 24 Stunden vor Transfektion ausgebracht. Zellen wurden sodann mit 0,5 μg pELAM-Lu-Reporterplasmid, 0,05 μg pRL-CMV, 4 μg des/der angegebenen Plasmids/e und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 5 μg Gesamt-DNA zu ergeben, durch Standard-Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Trans-IT-Lipofektionsreagenz, das kommerziell von Mirus erhältlich ist, transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden Zellen mit PBS gewaschen und in 400 μl Passive Lysis Buffer, der kommerziell von Promega erhältlich ist, lysiert. Lysat (20 μl) von jeder Probe wurde zur Messung von Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität verwendet. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Luciferase-Aktivität wurde in einem Luminometer des Modells TD20/20 unter Verwendung des Dual-Luciferase-Assaysystems gemäß dem Protokoll des Herstellers (Promega) gemessen. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • Wie in 21 gezeigt, führte keins der IAPs, alleine oder in Kombination mit XAF-1, zu einer messbaren Aktivierung von NF-κB, wenn es in 293T-Zellen exprimiert wurde. Expression von TRAF6, die hier als Positivkontrolle gezeigt ist, löste NF-κB-Aktivierung aus.
  • BEISPIEL XIV
  • Dosis-Antwort-Wirkung von XAF-1-Expreession auf TRAF6-vermittelte NF-κB-Aktivierung.
  • Methoden
  • 293T-Zellen wurden in Collagen-beschichtete Platten mit sechs Näpfchen bei 2 × 105 Zellen pro Näpfchen 24 Stunden vor Transfektion ausgebracht. Zellen wurden dann mit 0,5 μg pELAM-Lu-Reporterplasmid, 0,1 μg pRL-CMV, 0,5 μg pCMV-TRAF6, angegebenen Mengen von pCMV-XAF-1 und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 4 μg Gesamt-DNA zu ergeben, durch Standard-Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Trans-IT-Lipofektionsreagenz, das kommerziell von Mirus erhältlich ist, transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden Zellen mit PBS gewaschen und in 400 μl Passive Lysis Buffer, der kommerziell von Promega erhältlich ist, lysiert. Lysat (20 μl) von jeder Probe wurde zur Messung von Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität verwendet. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Luciferase-Aktivität wurde in einem Luminometer des Modells TD20/20 unter Verwendung des Dual-Luciferase-Assaysystems gemäß dem Protokoll des Herstellers (Promega) gemessen. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • Obwohl Expression von TRAF6 selbst fähig war, NF-κB-Aktivität auszulösen, führte eine Coexpression von TRAF6 mit XAF-1 zu einem erhöhten Grad an NF-κB-Aktivierung, die sich erhöhte, wenn die Menge an XAF-1-Expression sich erhöhte, wie in den in 22 gezeigten Ergebnissen gezeigt. Also war XAF-1 fähig, die NF-κB-induzierende Fähigkeit von TRAF6 zu erhöhen.
  • BEISPIEL XV
  • Dosis-Antwort-Wirkung von XIAP-Expression auf TRAF6-vermittelte NF-κB-Aktivierung
  • Methoden
  • 293T-Zellen wurden in Collagen-beschichtete Platten mit sechs Näpfchen bei 2 × 105 Zellen pro Näpfchen 24 Stunden vor Transfektion ausgebracht. Zellen wurden dann mit 0,5 μg pELAM-Lu-Reporterplasmid, 0,1 μg pRL-CMV, 0,5 μg pCMV-TRAF6, angegebenen Mengen von pCMV-XIAP und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 4 μg Gesamt-DNA zu ergeben, durch Standard-Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Trans-IT-Lipofektionsreagenz, das kommerziell von Mirus erhältlich ist, transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden Zellen mit PBS gewaschen und in 400 μl Passive Lysis Buffer, der kommerziell von Promega erhältlich ist, lysiert. Lysat (20 μl) von jeder Probe wurde zur Messung von Glühwürm chen-Luciferase-Aktivität verwendet. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Luciferase-Aktivität wurde in einem Luminometer des Modells TD20/20 unter Verwendung des Dual-Luciferase-Assaysystems gemäß dem Protokoll des Herstellers (Promega) gemessen. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • Die in 23 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass, obwohl eine Expression von TRAF6 selbst fähig war, NF-κB-Aktivität auszulösen, Coexpression von TRAF6 mit XIAP zu einem erhöhten Grad an NF-κB-Aktivierung führte, der sich erhöhte, wenn die Menge an XIAP-Expression sich erhöhte. XIAP war also fähig, die NF-κB-induzierende Fähigkeit von TRAF6 zu erhöhen.
  • BEISPIEL XVI
  • Synergistische Wirkung von XAF-1- und XIAP-Expression auf TRAF6- und TRAF2-vermittelte NF-κB-Aktivierung
  • Methoden
  • 293T-Zellen wurden in Collagen-beschichtete Platten mit sechs Näpfchen bei 2 × 105 Zellen pro Näpfchen 24 Stunden vor Transfektion ausgebracht. Zellen wurden dann mit 0,5 μg pELAM-Lu (pGL3-E-Selectin-Promotor) und 0,05 μg pRL-CMV, 1 μg pCMV-TRAF6 oder 1 μg pCMV-TRAF2, 1 μg pCMV-XAF-1 und/oder pCMV-XIAP und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 4 μg Gesamt-DNA zu ergeben, durch Standard-Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Trans-IT-Lipofektionsreagenz (Mirus) transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden Zellen mit PBS gewaschen und mit 400 μl Passive Lysis Buffer (Promega) lysiert. Lysat (20 μl) von jeder Probe wurde zur Messung von Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität verwendet. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Luciferase-Aktivität wurde in einem Luminometer des Modells TD20/20 (Promega) unter Verwendung des Dual-Luciferase-Assaysystems gemäß dem Protokoll des Herstellers (Promega) gemessen. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • XIAP und XAF-1 waren additiv in ihrer Wirkung auf TRAF6-vermittelte NF-κB-Transaktivierung wie in 24 gezeigt. 25 zeigt, dass XIAP und XAF-1 auch fähig waren, TRAF2-vermittelte NF-κB-Transaktivierung zu unterstützen, jedoch zu einem geringeren Ausmaß als ihre Unterstützung bei TRAF6-vermittelter NF-κB-Transaktivierung. XIAP und XAF-1 arbeiten also synergistisch bei ihren Signaltransduktionsfähigkeiten.
  • BEISPIEL XVII
  • C-Terminus von XAF-1 erhöht TRAF6-vermittelte NF-κB-Aktivierung
  • Methoden
  • Expressionsplasmide, die entweder die aminoterminale Domäne von XAF-1 mit sechs potentiellen Zinkfingern, die die Region mit signifikanter Homologie zu TRAF4 und TRAF6 umfasst, (XAF-1N), oder den Carboxyterminus mit einer einzelnen potentiellen Zinkfinger-Domäne (XAF-1C) exprimieren, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, TRAF6-vermittelte NF-κB-Aktivität zu erhöhen.
  • 293T-Zellen (2 × 105) wurden mit 0,5 μg pELAM-Lu-Reporterplasmid, 0,1 μg pRL-TK, das kommerziell von Promega erhältlich ist, 0,5 μg pCMV-TRAF6, 1 μg des angegebenen Expressionsplasmids und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 4 μg Gesamt-DNA zu ergeben, transfiziert. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde 24 Stunden nach Transfektion bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • Wie 26 zeigt, haben wir gefunden, dass der Carboxyterminus des XAF-1-Proteins die additive Wirkung von XAF-1 auf TRAF6-Induktion von NF-κB vermittelt. XAF-1N-Expression erhöhte die Fähigkeit von TRAF6 nicht, NF-κB zu induzieren, während XAF-1C NF-κB-Induktion durch TRAF6 substanziell erhöhte. Volllängen-XAF-1 erhöhte TRAF6-Induktion von NF-κB deutlich, wie wir vorher in 21 zeigten.
  • BEISPIEL XVIII
  • Hemmende Wirkung von Antisense-XAF-1-Expression auf TRAF5- und TRAF6-vermittelte NF-κB-Aktivierung in 293T-Zellen.
  • Methoden
  • Um das bcl-2-Antisense-Konstrukt herzustellen, wurde ein 1,5 kb-EcoRI-Fragment von bcl-2 in einer nicht-kodierenden Orientierung in das pcDNA3-Plasmid, das kommerziell von Invitrogen erhältlich ist, kloniert.
  • 293T-Zellen (2 × 105) wurden mit 0,5 μg pELAM-Lu-Reporterplasmid, 0,1 μg pRL-TK, das kommerziell von Promega erhältlich ist, 0,5 μg pCMV-TRAF5 oder pCMV-TRAF6, 3 μg des angegebenen Antisense-Plasmids: Antisense XAF-1 (240-1) oder Antisense bcl-2 (450-23), und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 5 μg Gesamt-DNA zu ergeben, transfiziert. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde 24 Stunden nach Transfektion bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • 27 zeigt, dass Expression von Antisense-XAF-1 TRAF6-induzierte Aktivierung von NF-κB signifikant und zu einem geringeren Ausmaß TRAF5-induzierte Aktivierung von NF-κB hemmte. Diese Hemmung war spezifisch für XAF-1, da Antisense-bcl-2 nicht die gleiche Wirkung hatte.
  • BEISPIEL XIX
  • Hemmende Wirkung von Antisense-XAF-1-Expression auf IL-1β-induzierte NF-κB-Aktivierung
  • Methoden
  • 293T-Zellen (2 × 105) wurden mit 0,5 μg pELAM-Lu-Reporterplasmid, 0,1 μg pRL-TK, das kommerziell von Promega erhältlich ist, den angegebenen Mengen an Antisense-Plasmid: Antisense-XAF-1 (240-1) oder Antisense-bcl-2 (1486-23), und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 5 μg Gesamt-DNA zu ergeben, transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden Zellen 6 Stunden mit 20 ng/ml Interleukin-1β (IL-1β) behandelt. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde nach IL-1β-Behandlung bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • Wie in 28 gezeigt, hemmte Expression von Antisense-XAF-1 Interleukin-1β-induzierte Aktivierung von NF-κB. Diese Hemmung war spezifisch für XAF-1, da Antisense-bcl-2 nicht die gleiche Wirkung hatte.
  • BEISPIEL XX
  • Dosis-Antwort-Wirkung von XAF-1-Expression auf IL-1β-induzierte NF-κB-Aktivierung
  • Methoden
  • 293T-Zellen (2 × 105) wurden mit 0,5 μg pELAM-Lu-Reporterplasmid, 0,1 μg pRL-TK, das kommerziell von Promega erhältlich ist, angegebenen Mengen an pCMV-XAF-1 und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 5 μg Gesamt-DNA zu ergeben, transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion wurden Zellen 6 Stunden mit 20 ng/ml Interleukin-1β (IL-1β) behandelt. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde nach IL-1β-Behandlung bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • Expression von Volllängen-XAF-1 erhöhte Interleukin-1β-vermittelte Induktion von NF-κB in einer Dosis-abhängigen Weise, wie in 29 gezeigt ist.
  • BEISPIEL XXI
  • Hemmende Wirkung von A20-Expression auf TRAF2-, TRAF5- und TRAF6-vermittelte NF-κB-Aktivierung
  • Das A20-Protein wird durch NF-κB induziert und bindet, wieder über die TRAF-C-Domäne, sowohl TRAF1 als auch TRAF2. Bindung von A20 an TRAF2 stört NF-κB- Aktivierung in einer negative Rückkopplungsschleife (Song et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6721–6725, 1996). Es ist vorher festgestellt worden, dass Überexpression von A20 Zellen resistent gegen die apoptotischen Wirkungen von TNFα machen kann (Opipari et al., J. Biol. Chem. 267: 12424–12427, 1992) und auch dazu beitragen kann, B-Zellen resistent gegen Apoptose nach einem CD40-Signal zu machen (Sarma et al., 270: 12353–12346, 1995).
  • Methoden
  • 293T-Zellen (2 × 105) wurden mit 0,5 μg pELAM-Lu-Reporterplasmid, 0,1 μg pRL-TK, das kommerziell von Promega erhältlich ist, 0,5 μg pCMV-TRAF2, pCMV-TRAF5 oder pCMV-TRAF6, 0,3 μg pCMV-A20 und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 4 μg Gesamt-DNA zu ergeben, transfiziert. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde 24 Stunden nach Transfektion bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • Bei den in 30 gezeigten Experimenten führte eine Co-Transfektion eines A20-Expressionsvektors mit entweder TRAF2, TRAF5 oder TRAF6 zu einer nahezu kompletten Hemmung von NF-κB-Transaktivierung.
  • BEISPIEL XXII
  • XAF-1 wirkt der Wirkung von A20-Expression auf TRAF6-vermittelte Induktion von NF-κB entgegen
  • Methoden
  • 293T-Zellen (2 × 105) wurden mit 0,5 μg pELAM-Lu-Reporterplasmid, 0,1 μg pRL-TK, das kommerziell von Promega erhältlich ist, 0,5 μg pCMV-TRAF6, 2 μg pCMV-XAF-1, angegebenen Mengen von pCMV-A20 und genug pCMV-myc-Kontrollplasmid, um 5 μg Gesamt-DNA zu ergeben, transfiziert. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde 24 Stunden nach Transfektion bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Gezeigte Werte sind Durchschnittswerte eines Experiments, in dem jede Transfektion doppelt durchgeführt wurde.
  • Ergebnisse
  • Wie in 31 gezeigt, hatte XAF-1-Expression eine teilweise neutralisierende Wirkung auf die A20-vermittelte hemmende Funktion von TRAF6-vermittelter NF-κB-Aktivierung.
  • BEISPIEL XXIII
  • Interaktion von XAF-1 mit den verschiedenen TRAFs und Säuger-IAPs
  • Methoden
  • XIAP- und XAF-1-kodierende Regionen wurden im korrekten Leseraster in den pGEX-4T-1-Expressionsvektor, der kommerziell von Pharmacia erhältlich ist, kloniert. Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen wurden im Wesentlichen gemäß dem Protokoll des Herstellers (Pharmacia) durchgeführt.
  • 293T-Zellen wurden transient mit Expressionsvektoren für myc-Epitop-getaggte TRAFs und Säuger-IAPs (5 μg) transfiziert. Nach 36 Stunden wurden Zellen lysiert und Zelllysate wurden mit GST-XAF-1-Fusionsprotein oder GST-Kontrollprotein (Glutathion-S-Transferase von Schistosoma Japonicum), das auf 10 μl Glutathion-Beads immobilisiert war, inkubiert. An die Beads adsorbiertes Protein wurde durch SDS-PAGE gefolgt von Western-Blot unter Verwendung von monoklonalem Anti-c-myc-Antikörper (9E10) analysiert. Spuren wurden wie folgt beladen:
    • Spur 1: HIAP-2,
    • Spur 2: TRAF1,
    • Spur 3: TRAF2,
    • Spur 4: TRAF3,
    • Spur 5: A20.
  • Proteine in a-Spuren waren mit dem GST-XAF-1-Fusionsprotein affinitätsgereinigt. Proteine in den b-Spuren waren mit dem GST-Kontrollprotein affinitätsgereinigt.
  • Ergebnisse
  • GST-Interaktionsanalyse zeigte, dass XAF-1 Komplexe mit einer Vielzahl von zellulären Proteinen, die HIAP-2, TRAF1, TRAF2 und A20 umfassen, bilden kann, wie in 32 gezeigt ist. Bei dieser Art von Analyse können indirekte Interaktionen nicht von direktem Binden unterschieden werden. Zum Beispiel kann XAF-1 TRAF2 direkt binden (wie durch Zwei-Hybrid-Analyse gezeigt), das wiederum mit entweder TRAF1 oder A20 interagieren kann.
  • BEISPIEL XXIV
  • In vitro-translatiertes TRAF2 und HIAP-1 binden XAF-1
  • Methoden
  • 35S-markierte in vitro-translatierte Proteine wurden durch eine Verwendung der verschiedenen TRAF2- und HIAP-1-Expressionskonstrukte in pCDNA3-myc mit dem TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System gemäß den Beschreibungen des Herstellers (Promega) und 35S-markiertem Methionin, das kommerziell von DuPont/NEN erhältlich ist, hergestellt.
  • 35S-markierte in vitro-translatierte Proteine wurden mit GST-XAF-1-Fusionsprotein oder GST-Kontrollprotein, das auf 10 μl Glutathion-Beads immobilisiert war, inkubiert. Auf den Beads adsorbiertes Protein wurde durch SDS-PAGE analysiert. Das Protein-tragende Gel wurde dann getrocknet und adsorbierte Proteine wurden durch Autoradiographie des Gels nachgewiesen. Die Spuren wurden wie folgt beladen:
    • Spur 1: HIAP1,
    • Spur 2: TRAF2.
  • Proteine in den a-Spuren waren mit dem GST-XAF-1-Fusionsprotein affinitätsgereinigt. Proteine in den b-Spuren waren mit dem GST-Kontrollprotein affinitätsgereinigt.
  • Ergebnisse
  • Wie in 33 gezeigt, banden sowohl in vitro-translatiertes HIAP-1 als auch TRAF2 an GST-XAF-1-Fusionsprotein, aber sie binden nicht an das GST-Kontrollprotein. Da dieses Experiment in einem zellfreien System durchgeführt wurde, haben wir gezeigt, dass die HIAP-1:XAF-1- und TRAF2:XAF-1-Interaktionen direkt sind.
  • BEISPIEL XXV
  • XAF-1 interagiert direkt mit XIAP, HIAP-1, HIAP-2 und TRAF2
  • Methoden
  • Die Plasmide pAS2-XIAP, pAS2-HIAP-1, pAS2-HIAP-2, pAS2-TRAF2, pAS2-TRAF4, pAS2-XAF-1 und pAS2 (nur Vektor), die die GAL4-DNA-Bindungsdomänen in Fusion an die angegebenen Volllängen-Proteine kodieren, wurden als Köder (DNA-Bindungsdomänen-Hybride) in Zwei-Hybrid-Screens von pGAD-GH-Plasmiden (kommerziell von Clontech erhältlich), die XIAP, HIAP-1, HIAP-2, TRAF2, TRAF4 und XAF-1 als Beute kodieren (Aktivierungsdomänen-Hybride), verwendet. Der Hefe-Zwei-Hybrid-Assay und Isolierung von positiven Klonen und nachfolgende Interaktionsanalysen wurden wie woanders beschrieben durchgeführt (PCT-Veröffentlichung WO 95/28497 ). DNA-Sequenzierung wurde auf einem automatischen DNA-Sequenzierer des Modells 373A von Applied Biosystems durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • In 34 ist eine Liste der XAF-1-Interaktionen mit Säuger-IAPs und TRAFs gezeigt, die in dem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay gefunden wurden. Unsere Ergebnisse zeigten, dass XAF-1 direkt mit XIAP, HIAP-1, HIAP-2 und TRAF2 (aber nicht TRAF4) interagiert. Wie in der Literatur etabliert ist, kann TRAF2 mit TRAF1 oder A20 interagieren. Da wir hier in einer Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse gezeigt haben, dass XAF-1 direkt an TRAF2 bindet, könnte XAF-1 durch diese Interaktion fähig sein, einen Komplex mit TRAF1 und A20 zu bilden, wie wir in 32 zeigten.
  • BEISPIEL XXVI
  • Identifizierung und Klonierung von humanem XAF-2
  • Methoden
  • Wir screenten die Datenbank auf ESTs, die signifikante Homologie zu XAF-1 besitzen. Eine Reihe an solchen ESTs wurde identifiziert. Von den EST-Sequenzen haben wir Oligonukleotid-Primer hergestellt und eine cDNA, die ein Protein kodiert, das wir "XAF-2" genannt haben, PCR-kloniert.
  • Ergebnisse
  • 35 zeigt die teilweisen 5'-Nukleinsäure-(SEQ ID NO: 3) und N-terminalen Aminosäure-(SEQ ID NO: 4)-Sequenzen der langen Splicevariante von XAF-2. Der N-Terminus des XAF-2-Proteins hat fünf Zinkfinger in den 150 N-terminalen Aminosäuren, die 38% Aminosäure-Identität zu XAF-1 (SEQ ID NO: 2) zeigen. XAF-2 hat auch einen einzigartigen C-Terminus, der zwei RING-Zinkfinger hat, so dass das gesamte XAF-2-Protein, wie XAF-1, sieben Zinkfinger-Bindedomänen aufweist. 36 zeigt die Sequenz der 3'-nicht-translatierten Region (UTR), die etwa 250 Nukleinsäurereste C-terminal zu der Nukleinsäure-Sequenz von 35 liegt. Es gibt mindestens zwei Splicevarianten von XAF-2. 37A zeigt die Volllängen-5'-Nukleotid-(oben; SEQ ID NO: 9) und -Aminosäure-(unten; SEQ ID NO: 10)-Sequenzen der langen (XAF-2L) Splicevariante von XAF-2. Die kürzere Spliceform von XAF-2 (XAF-2S) ist wie in 37A angegeben gesplicet, wobei die Nukleinsäure, die XAF-2S kodiert, in 37B, untere Sequenz (SEQ ID NO: 11) angegeben ist. 38A, 38B und 38C zeigen die angegeben Zinkfinger-Bindedomänen in den Aminosäure-Sequenzprotokollen von XAF-1, XAF-2L bzw. XAF-2S. XAF-2L und XAF-1 zeigen eine Gesamtidentität der Aminosäuresequenz von 27%, obwohl die ersten 135 Aminosäuren von XAF-2L und die ersten 131 Aminosäuren von XAF-1 eine 40%ige Aminosäuresequenz-Identität teilen (39). Wie in 40 angegeben, ist das Alignment der Zinkfinger-Bindedomänen in XAF-1 und XAF-2L nicht äquivalent: die sechste Zink-Domäne von XAF-2L ordnet sich mit der siebten Zink-Domäne von XAF-1 an. Jedoch haben beide XAF-Moleküle insgesamt sieben Zinkfinger-Bindedomänen.
  • BEISPIEL XXVII
  • Ein Screen auf Kandidatenverbindungen, die XAF-1-Expression modulieren
  • Verbindungen werden auf eine Fähigkeit, XAF-1-Expression zu modulieren, durch Beobachten der Fähigkeit der Verbindungen gescreent, die Expression eines Luciferase-Reportergens, das operabel an den XAF-1-Promotor gekoppelt ist, zu modulieren.
  • Methoden
  • Das XAF-1-Promotor-Glühwürmchen-Luciferase-Reporterplasmid pXAF-1prom-Lu wird durch Inserieren von PCR-amplifizierten XAF-1-Promotorsequenzen in einen Vektor wie den pGL3-Basic-Vektor, der kommerziell von Promega erhältlich ist, konstruiert.
  • COS-Zellen werden in Platten mit sechs Näpfchen bei 2 × 105 Zellen pro Näpfchen 24 Stunden vor Transfektion ausgebracht. Zellen werden dann mit 1,0 μg pXAF-1prom-Lu-Reporterplasmid und 3,0 μg pCMV-myc-Kontrollplasmid durch Standard-Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Trans-IT-Lipofektionsreagenz, das kommerziell von Mirus erhältlich ist, transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion werden verschiedene Konzentrationen von unterschiedlichen Verbindungen zu dem Kulturüberstand von transfizierten Zellen gegeben, so dass eine Verbindung oder eine Kombination davon pro Näpfchen vorhanden ist. 12 Stunden nach Behandlung mit der Verbindung werden die Zellen mit PBS gewaschen und in 400 μl Passive Lysis Buffer, der kommerziell von Promega erhältlich ist, lysiert. Lysat (20 μl) von jeder Probe wird zur Messung von Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität verwendet. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wird bestimmt und auf der Basis eines Renilla-Luciferase-Expressionsgrads normalisiert. Luciferase-Aktivität wird in einem Luminometer des Modells TD20/20 unter Verwendung des Dual-Luciferase-Assay-Systems gemäß dem Protokoll des Herstellers (Promega) gemessen.
  • Ergebnisse
  • Verbindungs-behandelte Zellen, die verglichen mit unbehandelten Kontrollzellen eine erhöhte Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität zeigen, zeigen eine Verbindung mit einer Fähigkeit an, XAF-1-Aktivität zu erhöhen. Verbindungs-behandelte Zellen, die verglichen mit unbehandelten Kontrollzellen eine niedrigere Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität zeigen, zeigen eine Verbindung mit einer Fähigkeit an, XAF-1-Aktivität zu verringern. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (20)

  1. Im Wesentlichen reine Nukleinsäure, die für das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) kodiert, wobei das Polypeptid TRAF6-vermittelte NF-κB-Aktivierung in einer Zelle steigert.
  2. Im Wesentlichen reine Nukleinsäure, die zu mindestens zehn Nukleotiden einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) kodiert, komplementär ist, wobei die Nukleinsäure bei einer Verabreichung an eine Zelle eine Antisense-Nukleinsäure ist, die ausreicht, um die Apoptose-induzierende Aktivität von XAF-1 zu verringern.
  3. Antisense-Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die Antisense-Nukleinsäure zu mindestens 15 Nukleotiden einer Nukleinsäure, die für das in Anspruch 1 spezifizierte Polypeptid kodiert, komplementär ist.
  4. Antisense-Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die Apoptose-induzierende Aktivität um mindestens 20% verringert wird.
  5. Antisense-Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die Antisense-Nukleinsäure durch einen Vektor kodiert wird, der fähig ist, eine Expression der Antisense-Nukleinsäure in einer Vektor-enthaltenden Zelle zu steuern.
  6. Vektor, der eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure, die für das in Anspruch 1 spezifizierte Polypeptid kodiert, umfasst, wobei der Vektor fähig ist, eine Expression des Polypeptids in einer Vektor-enthaltenden Zelle zu steuern.
  7. Zelle, die eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure, die für das in Anspruch 1 spezifizierte Polypeptid kodiert, enthält.
  8. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure genomische DNA oder cDNA ist.
  9. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure mit regulatorischen Sequenzen für eine Expression des Polypeptids operabel verbunden ist und wobei die regulatorischen Sequenzen einen Promotor umfassen.
  10. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die Apoptose moduliert, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle, die die Nukleinsäure von SEQ ID NO: 1 (XAF-1-Gen) umfasst, (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Kandidatenverbindung und (c) Überwachen der Expression der Nukleinsäure, wobei eine Veränderung hinsichtlich des Ausmaßes einer Expression der Nukleinsäure eine Verbindung, die Apoptose moduliert, anzeigt.
  11. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu hemmen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) oder das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) exprimiert, (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Kandidatenverbindung und (c) Messen des Ausmaßes an Apoptose in der Zelle, wobei eine Verringerung des Ausmaßes im Verhältnis zu einem Ausmaß in einer Zelle, die nicht mit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wurde, eine Verbindung anzeigt, die fähig ist, Apoptose zu hemmen.
  12. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu induzieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle, die das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) oder das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) exprimiert, (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Kandidatenverbindung und (c) Messen des Ausmaßes an Apoptose in der Zelle, wobei eine Erhöhung des Ausmaßes im Verhältnis zu einem Ausmaß in einer Zelle, die nicht mit der Kandidatenverbindung in Kontakt gebracht wurde, eine Verbindung anzeigt, die fähig ist, Apoptose zu induzieren.
  13. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die Apoptose moduliert, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle, die ein Polypeptid, das aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) ausgewählt ist, und ein Reportergen, das operabel mit DNA verbunden ist, die eine NF-κB-Bindestelle umfasst, exprimiert, (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einer Kandidatenverbindung und (c) Messen der Expression des Reportergens, wobei eine Veränderung der Expression in Reaktion auf die Verbindung anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren.
  14. Verfahren zum Nachweis einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu modulieren, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle mit: (i) einem Reportergen, das operabel mit einer DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle verbunden ist, (ii) einem ersten Fusionsgen, das fähig ist, ein erstes Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das erste Fusionsprotein das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) oder das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) in kovalenter Bindung an eine Bindegruppe umfasst, wobei die Bindegruppe fähig ist, spezifisch an die DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle zu binden, (iii) einem zweiten Fusionsgen, das fähig ist, ein zweites Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das zweite Fusionsprotein ein Polypeptid, das ausgewählt ist aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1), dem Polypeptid von SEQ ID NO: 4 (XAF-2), TRAF und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C), in kovalenter Bindung an eine Gen-aktivierende Gruppe umfasst, (b) Exponieren der Zelle gegenüber der Verbindung und (c) Messen von Reportergen-Expression in der Zelle, wobei eine Veränderung in der Reportergen-Expression anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren.
  15. Verfahren zum Nachweis einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu modulieren, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle mit: (i) einem Reportergen, das operabel mit einer DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle verbunden ist, (ii) einem ersten Fusionsgen, das fähig ist, ein erstes Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das erste Fusionsprotein das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) oder das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) in kovalenter Bindung an eine Bindegruppe umfasst, wobei die Bindegruppe fähig ist, spezifisch an die DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle zu binden, (iii) einem zweiten Fusionsgen, das fähig ist, ein zweites Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das zweite Fusionsprotein ein IAP-Polypeptid in kovalenter Bindung an eine Gen-aktivierende Gruppe umfasst, (b) Exponieren der Zelle gegenüber der Verbindung und (c) Messen von Reportergen-Expression in der Zelle, wobei eine Veränderung in der Reportergen-Expression anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren.
  16. Verfahren zum Nachweis einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu modulieren, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle mit: (i) einem Reportergen, das operabel mit einer DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle verbunden ist, (ii) einem ersten Fusionsgen, das fähig ist, ein erstes Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das erste Fusionsprotein ein IAP-Polypeptid in kovalenter Bindung an eine Bindegruppe umfasst, wobei die Bindegruppe fähig ist, spezifisch an die DNA-Bindeprotein-Erkennungsstelle zu binden, (iii) einem zweiten Fusionsgen, das fähig ist, ein zweites Fusionsprotein zu exprimieren, wobei das zweite Fusionsprotein das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) oder das Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) in kovalenter Bindung an eine Gen-aktivierende Gruppe umfasst, (b) Exponieren der Zelle gegenüber der Verbindung und (c) Messen von Reportergen-Expression in der Zelle, wobei eine Veränderung in der Reportergen-Expression anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren.
  17. Verfahren zum Nachweis einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu modulieren, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines ersten Polypeptids, das aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) ausgewählt ist, wobei das erste Polypeptid auf einem Festphasensubstrat immobilisiert ist, (b) In-Kontakt-Bringen des ersten Polypeptids mit einem zweiten Polypeptid, das aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1), dem Polypeptid von SEQ ID NO: 4 (XAF-2), TRAF und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) ausgewählt ist, (c) In-Kontakt-Bringen der ersten und zweiten Polypeptide mit einer Verbindung und (d) Messen der Menge an Bindung des ersten Polypeptids an das zweite Polypeptid, wobei eine Veränderung in der Menge im Verhältnis zu einer Menge, die nicht mit der Verbindung in Kontakt gebracht wurde, anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren.
  18. Verfahren zum Nachweis einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu modulieren, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines ersten Polypeptids, das aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) ausgewählt ist, wobei das erste Polypeptid auf einem Festphasensubstrat immobilisiert ist, (b) In-Kontakt-Bringen des ersten Polypeptids mit einem IAP-Polypeptid, (c) In-Kontakt-Bringen des ersten Polypeptids und des IAP-Polypeptids mit einer Verbindung und (d) Messen der Menge an Bindung des ersten Polypeptids an das IAP-Polypeptid, wobei eine Veränderung in der Menge im Verhältnis zu einer Menge, die nicht mit der Verbindung in Kontakt gebracht wurde, anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren.
  19. Verfahren zum Nachweis einer Verbindung, die fähig ist, Apoptose zu modulieren, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines IAP-Polypeptids, wobei das IAP-Polypeptid auf einem Festphasensubstrat immobilisiert ist, (b) In-Kontakt-Bringen des IAP-Polypeptids mit einem zweiten Polypeptid, das aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C) ausgewählt ist, (c) In-Kontakt-Bringen des IAP-Polypeptids und des zweiten Polypeptids mit einer Verbindung und (d) Messen der Menge an Bindung des IAP-Polypeptids an das zweite Polypeptid, wobei eine Veränderung in der Menge im Verhältnis zu einer Menge, die nicht mit der Verbindung in Kontakt gebracht wurde, anzeigt, dass die Verbindung fähig ist, Apoptose zu modulieren.
  20. Verfahren zur Steigerung von Apoptose in einer Zelle in vitro, wobei das Verfahren ein Verabreichen an die Zelle einer Apoptose-induzierenden Menge eines Polypeptids umfasst, das ausgewählt ist aus dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 (XAF-1) und dem Polypeptid der Aminosäuren 173–317 von SEQ ID NO: 2 (XAF-1C).
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