WO2001040461A2 - cDNA-SEQUENZEN VON ZWEI INTERAKTOREN FANCIP4 UND FANCIP5 DER FANCONI-ANÄMIE-PROTEINE DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPEN A UND C - Google Patents

cDNA-SEQUENZEN VON ZWEI INTERAKTOREN FANCIP4 UND FANCIP5 DER FANCONI-ANÄMIE-PROTEINE DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPEN A UND C Download PDF

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WO2001040461A2
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Tanja Reuter
Helmut Hanenberg
Sabine Herterich
Matthias Wagner
Holger Hoehn
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to the cDNAs of two interactors (FANCIP4 and FANCIP5) of the Fanconi anemia proteins of complementation groups A and C (FANCA and FANCC) as well as the polypeptides and proteins encoded thereby.
  • Other subjects include the corresponding genes, antibodies directed against the polypeptides or proteins, FANCIP4 or FANCIP ⁇ transgenic organisms and cells, and the use of FANCIP4 or FANCIP5 for effector screening and the pharmaceutical use of nucleic acids, polypeptides, proteins and the antibody.
  • Fanconi anemia (hereinafter referred to as "FA") is an autosomal recessive hereditary disease that manifests itself clinically with symptoms such as progressive pancytopenia, congenital malformations and an increased risk of cancer (Glanz and Fraser, 1982). At least 15% of FA patients develop myeloid leukemia (Auerbach and Allen, 1991).
  • FA cells are cytogenetic due to a hypersensitivity towards DNA cross-linking agents, e.g. Mitomycin C (MMC) and Diepoxybutan (DEB), characterized, which manifests itself in chromosome breaks and aberrations (Auerbach, 1993).
  • MMC Mitomycin C
  • DEB Diepoxybutan
  • FA lymphocytes and fibroblasts show a delay or an arrest in the G2 phase of the cell cycle after treatment with MMC (Kubbies et al., 1985; Seyschab et al., 1995).
  • MMC Mitomycin C
  • DEB Diepoxybutan
  • FA lymphocytes and fibroblasts show a delay or an arrest in the G2 phase of the cell cycle after treatment with MMC (Kubbies et al., 1985; Seyschab et al., 1995).
  • increased sensitivity to oxygen can be observed in FA cells (Joenje et al. 1981; Schindler and Hoehn, 1988; Poo
  • the object of the present invention was to provide interactors of the fanconi
  • the present invention describes the identification of two cDNAs which code for proteins and were designated FANCIP4 and FANCIP5.
  • the cDNA sequences were found using an interaction trap version of the yeast two hybrid system (Fields and Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996), with the proteins of complementation groups A and C (FANCA and FANCC) served as bait.
  • the proteins encoded by the FANCIP4 or FANCIP5 cDNA interact with both FANCA and FANCC and can thus be part of the complex or the signal transduction cascade, which leads to FA pathogenesis in the event of a defect.
  • the FANCIP4 or FANCIP5 cDNA and the proteins encoded thereby, but also the corresponding genes and antibodies directed against the proteins are therefore suitable as diagnostic, therapeutic or preventive agents for diseases which are associated with DNA repair defects, cell cycle disorders, Cytopenias, tumorigenesis and / or tumor progression are associated. They can continue to serve as targets for effector screening procedures for new ones
  • the present invention relates to nucleic acids which
  • Nucleotide sequences or a protein-coding section thereof b) one of the sequences from a) nucleotide sequences corresponding to the degeneracy of the genetic code, c) one with the sequences from a) and / or b) under stringent
  • the nucleotide sequence (FANCIP4) shown in FIG. 1 contains an open one
  • Reading frame that corresponds to a protein with a length of 492 amino acids.
  • the amino acid sequence of this protein is shown in Fig. 2.
  • the protein has a peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase domain, an RNA recognition domain and a C-terminal core localization sequence.
  • the nucleotide sequence shown in FIG. 3 (FANCIP5) contains an open reading frame which corresponds to a protein with a length of 549 amino acids.
  • the amino acid sequence of this protein is shown in Fig. 4.
  • the protein has an N-terminal nuclear localization sequence and an internal ATP / GTP binding motif.
  • FANCIP4 belongs to a new group in the area of this protein family, but excludes full identity to a known human protein.
  • FANCIP5 FANCIP5
  • FIG. 4 For the derived protein FANCIP5 (FIG. 4) can be found in the protein database of the NCBI proteins with up to 36% partial homologies. The following entries are examples: Access numbers Z49068, AL031743, S40612, P53742, U69600, Q13823, Z98981, P40010, AL021571, AL021571, AP000003, AJ248287, AF003143, G64482, Q10190, AC00000000, AF1166, AE124737, AF126637. Most of these proteins are referred to as hypothetical GTP-binding proteins or as homologues to GTP-binding proteins. Due to the low degree of homology to the protein sequences given, the derived FANCIP5 sequence can be regarded as novel within the group of GTP-binding proteins.
  • the present invention also includes nucleotide sequences which hybridize with one of the aforementioned sequences.
  • hybridization according to the present invention is used as in Sambrook et al. (1989) used.
  • the invention further relates to nucleic acids which comprise a protein-coding section of the nucleotide sequence shown in FIG. 1 or FIG. 3 or a sequence which has a homology of more than 65%, preferably more than 80% or preferably at least 15, in particular at least 30 nucleotides long section thereof.
  • nucleotide sequences according to the invention can also include RNAs, modified nucleic acids and nucleic acid analogs, e.g. Peptide nucleic acids.
  • Nucleic acids according to the invention can be isolated from mammals according to known techniques using short sections of the nucleotide sequence shown in FIG. 1 or FIG. 3 as hybridization probes and / or primers according to known methods. Furthermore, nucleic acids according to the invention can also be produced by chemical synthesis, instead of the usual
  • Modified nucleotide building blocks eg methylated or 2'-O-alkylated nucleotides or phosphorothioates
  • Nucleic acids that are partially or completely made from modified nucleotide building blocks exist, can be used, for example, as therapeutic agents, for example as antisense nucleic acids or as ribozymes.
  • the present invention further relates to a vector which contains at least one copy of one of the nucleic acids according to the invention or a section thereof.
  • This recombinant vector can be any prokaryotic or eukaryotic vector on which a DNA sequence according to the invention is located and / or which enables the expression of a nucleic acid according to the invention in a suitable host cell.
  • prokaryotic vectors are chromosomal vectors, such as bacteriophages, and extrachromosomal vectors, such as circular plasmid vectors.
  • eukaryotic vectors are yeast vectors or vectors suitable for higher cells, such as plasmid vectors or viral vectors.
  • the invention also relates to a vector which preferably contains at least a 15 nucleotide long section of the sequences shown in FIG. 1 or FIG. 3.
  • This section preferably has a nucleotide sequence which comes from the protein-coding region of the sequences shown in FIG. 1 or FIG. 3 or from a region which is essential for the expression of the protein.
  • These nucleic acids are particularly suitable for the production of therapeutically usable antisense nucleic acids.
  • the present invention further relates to a cell which is transformed with one of the nucleic acids according to the invention or a vector according to the invention.
  • the cell can be both a eukaryotic and a prokaryotic cell.
  • eukaryotic cells are in particular mammalian cells.
  • FANCIP4 and FANCIP ⁇ transgenic organisms such as e.g. knock in or knock out animal models.
  • Animal models that stably express the product of the nucleic acid are known as knock-in animal models, and those whose corresponding natural gene has been deliberately destroyed are known as knock-out animal models.
  • the present invention includes polypeptides and proteins encoded by the above nucleic acids. These polypeptides and proteins have the properties shown in Fig. 2 or Fig. 4 amino acid sequence shown or a homology of more than 60%, preferably more than 70% to the amino acid sequence shown in Fig. 2 or Fig. 4.
  • the invention also relates to variants and fragments of the polypeptide or protein shown in FIG. 2 or FIG. 4. Variants are understood to mean sequences which differ from the amino acid sequence shown in FIG. 2 or FIG. 4 by substitution, deletion and / or insertion of individual amino acids or short amino acid segments.
  • This term also includes chemically modified polypeptides. These include polypeptides that are modified on the termini and / or on reactive amino acid side groups by acylation or amidation.
  • the invention also relates to methods which lead to the production of the polypeptides and proteins according to the invention and which comprise both the cultivation of appropriately transformed cells and the isolation of the proteins according to the invention.
  • the invention further relates to the use of polypeptides and proteins according to the invention or their fragments immunogens for the production of antibodies.
  • Antibodies can be produced in a customary manner by immunizing experimental animals with the complete polypeptide, protein or fragments thereof and then obtaining the resulting polyclonal antisera.
  • Monoclonal antibodies can be produced by known methods.
  • the present invention thus also includes antibodies against FANCIP4 or FANCIP5 or a variant thereof.
  • the FANCIP4 or FANCIP5 encoded by the nucleic acids according to the invention can be used as a target for a targeted search for effectors. Substances which have an inhibitory or activating effect on proteins according to the invention are able to selectively influence the cell functions controlled by these proteins. Therefore, they can be used in the therapy of corresponding clinical pictures, such as cytopenias or tumors.
  • the invention thus also relates to a method for identifying FANCIP4 and FANCIP5 effectors, in which cells which express the protein are brought into contact with various potential effector substances and the cells are subjected to changes, for example cell-activating, cell-inhibiting, cell-proliferative and / or cell genetic changes. In addition, binding domains of FANCIP4 or FANCIP5 can be identified in this way.
  • the invention relates to pharmaceutically active effector substances determined in the above-mentioned manner.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition which as an active component comprises nucleic acids, vectors, cells, polypeptides, proteins,
  • the pharmaceutical composition can be used in particular for the diagnosis, therapy or prevention of diseases which are associated with DNA repair defects, cell cycle disorders, cytopenias, tumorigenesis and / or tumor progression. This also applies to the diagnosis of a predisposition to such diseases in individuals, in particular in the diagnosis of a risk for cytopenias and / or tumor diseases. Furthermore, a targeted diagnosis of diseases is made possible which are directly or indirectly linked to changes in the activity of FANCIP4 or FANCIP5. These tests can be carried out with the help of specific nucleic acid probes for detection at the nucleic acid level, e.g. at the gene or transcript level, or with the help of antibodies against FANCIP4 or FANCIP5 for detection at the protein level.
  • gene therapy treatment can be carried out which involves the transmission of a nucleic acid coding for the FANCIP4 or FANCIP5
  • Vectors for example viral vectors
  • gene therapy treatment can take place, which leads to a blocking of this expression.
  • the present invention also relates to a method for the diagnosis of the above-mentioned diseases, whereby a patient or a patient-derived sample, e.g. a sample of a body fluid or a tissue, in contact with a pharmaceutical composition according to the invention and the nucleotide sequence and / or the expression of the invention
  • nucleic acid Qualitative or quantitative determination of nucleic acid. These determination methods can be carried out, for example, at the nucleic acid level by using nucleic acid hybridization probes or via reverse transcription / PCR or at the protein level by antibodies using cyto- or histochemical methods.
  • the pharmaceutical composition can be used as a marker for the occurrence of
  • Cytopenias, tumors or other diseases associated with proliferation or a predisposition to the pathophysiological changes mentioned can be used.
  • the present invention also relates to a method for the therapy or prevention of one of the aforementioned diseases, wherein the patient is administered a pharmaceutical composition according to the invention which contains the active component in an amount effective against the disease.
  • a pharmaceutical composition according to the invention which contains the active component in an amount effective against the disease.
  • pharmaceutical compositions which are suitable for therapeutic purposes are, for example, bispecific antibodies and antibody toxins or antibody-enzyme conjugates.
  • Further preferred pharmaceutical compositions for therapeutic purposes are antisense nucleic acids, gene therapeutic vectors or effector substances, for example in the form of low molecular weight activators or inhibitors.
  • the complete coding sequence of the proteins was cloned into the vector pEG202 via the EcoRI interface in the reading frame with the region coding for the LexA DNA-binding domain.
  • the vector pJG4-5 was used for the expression of the prey protein, which allows the construction of fusion proteins with the B42-transactivating domain.
  • a HeLa cDNA library cloned into this vector as a fusion gene library was screened in each case with the FANCA and FANCC bait protein.
  • the yeast strain EGY48 served as the host organism. A positive interaction was demonstrated by transcription activation of the LEU2 gene, resulting in growth of the yeasts on leucine-free medium.
  • EGY48 cotransformed with pEG202FANCA or pEG202FANCC and the B42 fusion library were pre-selected on leucine-containing medium to obtain both vectors and recorded.
  • To search for interacting yeast clones aliquots were plated on leucine-free medium and incubated for 3 to 5 days at 30 ° C. A total of 1 ⁇ 10 6 transfectant aliquots were screened.
  • the dependence of the transcription activation of positive clones on the expression of the prey protein was determined to be leucine-free Checked glucose medium.
  • the interactor plasmids were isolated after growing the yeast in glucose medium without tryptophan, electroporation of the nucleic acid isolate in the E.
  • coli strain XLIblue (Stratagene) and plasmid preparation from the bacterial cells.
  • retransformations of the isolated prey interactor were carried out in combination with different bait constructs. The previously observed interaction was confirmed in combination with pEG202FANCA or pEG202FANCC.
  • possible interactions with the LexA fusion partner were excluded by co-retransforming on the one hand with the pEG202 empty vector and on the other hand with a LexA-DNA ligase or LexA-bicoid bait fusion construct as a negative control.
  • the length of the Genbank cDNAs of the isolated interactor clones was determined by EcoRI / Xhol restriction hydrolysis.
  • the cDNAs were sequenced by an automated "cycle sequencing" method (Applied Biosystems) using the nucleic acid primer Bco I (5'-ACC AGC CTC TTG CTG AGT GGA GAT G-3 ').
  • the vector-inserted FANCIP4 or FANCIP5 cDNA fragments were completely sequenced with the nucleic acid primers Bco I and Bco II (5'-GAC AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA G-3 ") and additional internal FANCIP4 or FANCIP ⁇ -specific primers.
  • FANCIP4 there was a 2017 nucleotide-long cDNA area with a possible open reading frame of 1476 nucleotides or 492 codons.
  • the ⁇ '/ 3' RACE kit (Röche Diagnostics) was used to determine the 5 'region partial sequence of the found FANCIP ⁇ nucleotide sequence.
  • the sequence-specific primers FANCIP ⁇ -SP1 ⁇ '-CTCTGTTTCCTTAGCTCAGC-S '
  • FANCIP ⁇ -SP2 ⁇ '-TAGGCTTCTTGTGACCCTGC-3'
  • the PCR product obtained was purified electrophoretically (JETquick Gel Extraction Kit, GENOMED) and directly sequenced using the above-mentioned primer FANCIP ⁇ -SP2.
  • the affiliation of the nucleotide fragments obtained to the plasmid-inserted interactor fragments was confirmed in each case by overlapping sequence regions.
  • FANCIP4-P ⁇ '-AGG AGC GGG CGC CAT GGC G-3 '
  • FANCIP4-M ⁇ '-TGT TAG CCT CTC AAT TCT GCC-3'
  • FANCIP ⁇ -P ⁇ '-ACA GCC AAT ATG AAA AGG CC-3 '
  • FANCIP ⁇ -M ⁇ '-AAA GCC ATT GTT CTG TTA CAC-3'
  • the PCR products were cloned via the Smal interface into the vector pUC19.
  • the inserted PCR products for FANCIP4 and FANCIP ⁇ were completely sequenced after plasmid preparation from transformed E. coli cells, using additional internal FANCIP4- or FANCIP ⁇ -specific and external pUC19-specific primers. ⁇
  • NCBI National Center of Biotechnology Information
  • SEQ ID NO. 1 shows (SEQ ID NO. 1) a nucleotide sequence which contains an open reading frame coding for FANCIP4,
  • Fig. 2 (SEQ ID NO. 2) the amino acid sequence of an open reading frame of the nucleotide sequence shown in Fig. 1, 0
  • SEQ ID NO. 3 a nucleotide sequence which contains an open reading frame coding for FANCIP ⁇ , 4 (SEQ ID NO. 4) the amino acid sequence of an open reading frame of the nucleotide sequence shown in FIG. 3,
  • Figure 8 shows the nucleic acid primers used for PCR amplification of the FANCIP ⁇ open reading frame.
  • the Fanconi anemia group G gene is identical to the human XRCC9. Nat. Genet. 20, 281-283
  • the Fanconi anemia gene FANCF encodes a novel protein with homology to ROM. Nat. Genet. 24, 15-16

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNAs von zwei Interaktoren (FANCIP4 UND FANCIP5) des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppen A und C (FANCA und FANCC) sowie die davon codierten Polypeptide und Proteine. Weitere Gegenstände sind die entsprechenden Gene, gegen die Proteine gerichtete Antikörper, FANCIP4- bzw. FANCIP5-transgene Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP4 bzw. FANCIP5 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäuren, der Polypeptide, der Proteine und der Antikörper.

Description

cDNA-Sequenzen von zwei Interaktoren FANCIP4 und FANCIP5 der Fanconi- Anämie-Proteine der Komplementationsgruppen A und C
Beschreibung
Umfang der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNAs von zwei Interaktoren (FANCIP4 und FANCIP5) der Fanconi-Anämie-Proteine der Komplementationsgruppen A und C (FANCA und FANCC) sowie die davon codierten Polypeptide und Proteine. Weitere Gegenstände sind die entsprechenden Gene, gegen die Polypeptide oder Proteine gerichtete Antikörper, FANCIP4- bzw. FANCIPδ-transgene Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP4 bzw. FANCIP5 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäuren, der Polypeptide, der Proteine und der Antikörper.
Hintergrund der Erfindung
Fanconi-Anämie (im folgenden als "FA" bezeichnet) ist eine autosomal rezessiv erbliche Erkrankung, die sich klinisch mit Symptomen wie progressive Pancytopenie, angeborenen Mißbildungen und erhöhtem Risiko für Krebserkrankungen manifestiert (Glanz und Fräser, 1982). Mindestens 15% der FA-Patienten entwickeln myeloische Leukämien (Auerbach und Allen, 1991).
Cytogenetisch sind FA-Zellen durch eine Hypersensitivität gegenüber DNA- quervernetzenden Agenzien, wie z.B. Mitomycin C (MMC) und Diepoxybutan (DEB), charakterisiert, die sich in Chromosomenbrüchen und -aberrationen manifestiert (Auerbach, 1993). FA-Lymphozyten und -Fibroblasten weisen nach Behandlung mit MMC eine Verzögerung bzw. einen Arrest in der G2-Phase des Zellzyklus auf (Kubbies et al., 1985; Seyschab et al., 1995). Zudem ist bei FA-Zellen eine erhöhte Sauerstoffempfindlichkeit zu beobachten (Joenje et al. 1981 ; Schindler und Hoehn, 1988; Poot et al., 1996).
Anhand somatischer Zellfusionsstudien konnten für FA mindestens acht verschiedene Komplementationsgruppen (A bis H) unterschieden werden (Joenje et al., 1997). Bisher wurden die Gene für drei Komplementationsgruppen identifiziert: FANCC (Strathdee et al., 1&92; WO93/22435), FANCA (Lo Ten Foe et al., 1996; The Fanconi anaemia/Breast cancer consortium, 1996; WO98/14462), FANCG (Saar et al., 1998; de Winter et al., 1998), FANCF (de Winter et al., 2000) und FANCE (de Winter et al., 2000) Obwohl die molekulare Wirkungsweise der FA-Proteine immer noch unbekannt ist, deutet der zelluläre Phänotyp und das erhöhte Krebsrisiko bei einem Gendefekt auf eine Beteiligung bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklus- Regulation und/oder der Hämatopoiese hin. Die Ähnlichkeit des klinischen und zellulären Phänotyps der verschiedenen Komplementationsgruppen und die Erkenntnis, daß das FANCA- und das FANCC-Protein unter FANCA-
Phosphorylierung interagieren und als Komplex in den Zellkern transportiert werden (Kupfer et al., 1997a; Yamashita et al., 1998), lassen auf eine Protein-Kaskade oder ein funktionelles Zusammenwirken der FA-Proteine in einem Komplex schließen. Für FANCG konnte die Beteiligung an diesem Komplex ebenfalls gezeigt werden (Garcia-Higuera et al., 1999; Waisfisz et al., 1999; Reuter et al., 2000).
Entscheidende Fortschritte bei der Entschlüsselung der molekularen Ursachen der FA-Pathogenese können über die Identifikation der beteiligten Gene bzw. Proteine erzielt werden. Als FANCC-Interaktoren sind bislang die Cyclin-abhängige Kinase cdc2 (Kupfer et al., 1997b), das Chaperon GRP94 (Hoshino et al., 1998) und die NADPH.Cytochrom c-Reduktase (Kruyt et al., 1998) veröffentlicht, als potentiell Pathogenese-relevant wurden die Fanconi-Gene 1 und 2 eingestuft (Planitzer et al., 1998; WO98/16637 und WO98/45428).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Interaktoren der Fanconi-
Anämie-Proteine FANCA und FANCC zu finden. Auf Grundlage der FA-Pathogenese als Modellsystem für Mechanismen zur Aufrechterhaltung genetischer Stabilität war das Ziel, Bestandteile eines Proteinkomplexes bzw. einer Proteinkaskade zu identifizieren, die eine Rolle bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklusregulation und/oder der Onkogenese spielen. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung von zwei cDNAs, die für Proteine codieren und mit FANCIP4 bzw. FANCIP5 bezeichnet wurden. Die cDNA- Sequenzen wurden unter Verwendung einer Interaction Trap-Version des Hefe-Two Hybrid-Systems (Fields und Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996) gefunden, wobei die Proteine der Komplementationsgruppen A und C (FANCA und FANCC) als Köder dienten. Die durch die FANCIP4- bzw. FANCIP5-cDNA codierten Proteine interagieren sowohl mit FANCA als auch mit FANCC und können somit Teil des Komplexes bzw. der Signaltransduktionskaskade sein, die bei Defekt zur FA- Pathogenese führt. Die FANCIP4- bzw. FANCIP5-cDNA und die davon codierten Proteine, aber auch die entsprechenden Gene und gegen die Proteine gerichtete Antikörper sind daher als diagnostische, therapeutische oder präventive Mittel für Erkrankungen geeignet, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Sie können weiterhin als Targets für Verfahren zum Effektor-Screening dienen, um neue
Medikamente zur Behandlung der zuvor genannten Erkrankungen zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, welche
a) die in Fig. 1 (FANCIP4) bzw. Fig. 3 (FANCIP5) dargestellten
Nukleotidsequenzen oder einen Protein-codierenden Abschnitt davon, b) eine der Sequenzen aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenzen, c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten
Bedingungen hybridisierenden Nukleotidsequenzen oder d) zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre
Sequenzen umfaßt.
Die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz (FANCIP4) enthält einen offenen
Leserahmen, der einem Protein mit einer Länge von 492 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins ist in Fig. 2 dargestellt. Das Protein besitzt eine Peptidyl-Prolyl-cis-trans-lsomerase-Domäne, eine RNA-Erkennungsdomäne sowie eine C-terminale Kernlokalisierungssequenz. Die in Fig. 3 dargestellte Nukleotidsequenz (FANCIP5) enthält einen offenen Leserahmen, der einem Protein mit einer Länge von 549 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins ist in Fig. 4 dargestellt. Das Protein besitzt eine N-terminale Kernlokalisierungssequenz sowie ein internes ATP/GTP-Bindungsmotiv.
Für FANCIP4 fanden sich zum Zeitpunkt der prioritätsbegründenden Erstanmeldung DE 199 58 680.2 in der EST-Sequenzdatenbank am "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) als Beispiele folgende humane cDNA-Klone, die Teilbereiche der in Fig. 1 angegebenen Nukleotidsequenz enthalten:
Zugangsnummern AI880208, AA425562, AA346646 und N22655. Zudem existiert ein homologer genomischer Klon mit der Zugangsnummer AC006042. Für das abgeleitete Protein FANCIP4 (Fig. 2) finden sich in der Proteindatenbank des NCBI bekannte Proteine mit bis zu 42% Teilhomologien. Als Beispiele seien folgende Einträge genannt: Zugangsnummern Z97628, AF132148, AL109846, P52017, AC007135, U58755, AF151882, AJ000917, P87051 , AJ000916, AL023828, AF000668, AL023704, U37220, U37221 , S64705, D38552, AF043642, AJ004826 und AF154878. Bei diesen Proteinen handelt es sich um Peptidyl-Prolyl-cis-trans- Isomerasen bzw. Cyclophiline aus diversen Organismen. Diese Enzym-Gruppe erfüllt Funktionen vor allem im Bereich der Proteinfaltung, zudem bei der
Signaltransduktion und Zellzyklusregulation (Übersichtsartikel: Göthel und Marahiel, 1999). Der Homologiegrad weist auf die Zusammengehörigkeit von FANCIP4 zu einer neuen Gruppe im Bereich dieser Proteinfamilie hin, schließt aber die vollständige Identität zu einem bekannten humanen Protein aus.
Für FANCIP5 fanden sich zum Zeitpunkt der prioritätsbegründenden Erstanmeldung DE 199 58 680.2 in der EST-Sequenzdatenbank des NCBI cDNA-Klone die Teilbereiche der in Fig. 3 angegebenen Nukleotidsequenz enthalten. Als Beispiele seien folgende Einträge genannt: Zugangsnummern AL040968, AL040878, AA876119, AI810630, AA662674, AI624158, AA436573, AI139291 , AI610191 , AI628041 , AI223312, H53723, AA223723, AA101504, AI393334, AA125853, AA166669, AA609710, AI620201 und AA428869. Unter diesen Zugangsnummern finden sich jedoch keine Angaben über einen vollständigen offenen Leserahmen. Für das abgeleitete Protein FANCIP5 (Fig. 4) finden sich in der Proteindatenbank des NCBI Proteine mit bis zu 36% Teilhomologien. Als Beispiele seien folgende Einträge genannt: Zugangsnummern Z49068, AL031743, S40612, P53742, U69600, Q13823, Z98981 , P40010, AL021571 , AL021571 , AP000003, AJ248287, AF003143, G64482, Q10190, AC004044, AF124737, AE001166, AC007290 und AE001746. Die meisten dieser Proteine werden als hypothetische GTP-bindende Proteine bzw. als Homologe zu GTP-bindenden Proteinen bezeichnet. Aufgrund des niedrigen Homologiegrads zu den angegebenen Proteinsequenzen kann die abgeleitete FANCIP5-Sequenz als neuartig innerhalb der Gruppe GTP-bindender Proteine angesehen werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt neben der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 gezeigten Nukleotidsequenz und einer dieser Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen auch noch Nukleotidsequenzen, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisiert. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (1989) verwendet.
Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die einen Protein-codierenden Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz oder eine Sequenz, die eine Homologie von mehr als 65%, vorzugsweise mehr als 80% oder einen vorzugsweise mindestens 15, insbesondere mindestens 30 Nukleotide langen Abschnitt davon aufweist. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen auch RNAs, modifizierte Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga, z.B. Peptid-Nukleinsäuren, umfassen.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können aus Säugern nach bekannten Techniken unter Verwendung kurzer Abschnitte der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 gezeigten Nukleotidsequenz als Hybridisierungssonden und/oder Primer nach bekannten Methoden isoliert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei anstelle der üblichen
Nukleotidbausteine auch modifizierte Nukleotidbausteine (z.B. methylierte oder 2'-O- alkylierte Nukleotide oder Phosphorthioate) eingesetzt werden können. Nukleinsäuren, die teilweise oder vollständig aus modifizierten Nukleotidbausteinen bestehen, können beispielsweise als therapeutische Mittel, z.B. als Antisense- Nukleinsäuren oder als Ribozyme, eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, der mindestens eine Kopie einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder einen Abschnitt davon enthält. Dieser rekombinante Vektor kann ein beliebiger prokaryotischer oder eukaryotischer Vektor sein, auf dem sich eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz befindet und/oder der die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht. Beispiele für prokaryotische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie Bakteriophagen, und extrachromosomale Vektoren, wie zirkuläre Plasmid vektoren. Beispiele für eukaryotische Vektoren sind Hefevektoren oder für höhere Zellen geeignete Vektoren, wie Plasmidvektoren oder virale Vektoren.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der vorzugsweise mindestens einen 15 Nukleotide langen Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Sequenzen enthält. Vorzugsweise besitzt dieser Abschnitt eine Nukleotidsequenz, die aus dem Protein-codierenden Bereich der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Sequenzen oder einem für die Expression des Proteins wesentlichen Bereich stammt. Diese Nukleinsäuren eignen sich besonders zur Herstellung von therapeutisch einsetzbaren Antisense-Nukleinsäuren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine Zelle, die mit einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryotische als auch eine prokaryotische Zelle sein. Beispiele eukaryotischer Zellen sind insbesondere Säugerzellen. Ebenfalls Gegenstand sind FANCIP4- bzw. FANCIPδ-transgene Organismen, wie z.B. knock in- oder knock out-Tiermodelle. Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure stabil exprimieren, werden als knock in-Tiermodelle, jene, deren entsprechendes natürliches Gen gezielt zerstört wurde, als knock out- Tiermodelle bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt von den oben angegebenen Nukleinsäuren codierte Polypeptide und Proteine. Diese Polypeptide und Proteine weisen die in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Homologie von mehr als 60%, vorzugsweise mehr als 70% zu der in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Aminosäuresequenz auf. Die Erfindung betrifft auch Varianten und Fragmente des in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Polypeptids oder Proteins. Unter Varianten sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von der in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Aminosäuresequenz unterscheiden. Hierunter fallen sowohl natürlich vorkommende allelische Variationen oder Spleißvariationen von FANCIP4 bzw. FANCIP5 als auch durch rekombinante DNA-Technologie, insbesondere durch in vitro-Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden erzeugte Polypeptide und Proteine, die hinsichtlich ihrer biologischen und/oder immunologischen Aktivität den in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Polypeptid oder Protein im wesentlichen entsprechen. Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch modifizierte Polypeptide. Hierzu gehören Polypeptide, die an den Termini und/oder an reaktiven Aminosäureseitengruppen durch Acylierung oder Amidierung modifiziert sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide und Proteine führen und sowohl die Kultivierung entsprechend transformierter Zellen als auch die Isolierung der erfindungsgemäßen Proteine umfassen.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide und Proteine oder deren Fragmente Immunogene zur Herstellung von Antikörpern. Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem vollständigen Polypeptid, Protein oder Fragmenten davon und anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach bekannten Methoden können monoklonale Antikörper hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt somit auch Antikörper gegen FANCIP4 bzw. FANCIP5 oder eine Variante davon.
Das von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codierte FANCIP4 bzw. FANCIP5 kann als Target für eine gezielte Suche nach Effektoren eingesetzt werden. Substanzen, die auf erfindungsgemäße Proteine inhibitorisch oder aktivierend wirken, sind in der Lage, die durch diese Proteine gesteuerten Zellfunktionen selektiv zu beeinflussen. Daher können sie bei der Therapie entsprechender Krankheitsbilder, wie z.B. Cytopenien oder Tumoren, eingesetzt werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des FANCIP4 bzw. FANCIP5, wobei man Zellen, die das Protein exprimieren, mit verschiedenen potentiellen Effektorsubstanzen, in Kontakt bringt und die Zellen auf Veränderungen, z.B. zeilaktivierende, zellinhibierende, zellproliferative und/oder zellgenetische Veränderungen, analysiert. Zudem können auf diese Weise Bindedomänen des FANCIP4 bzw. FANCIP5 identifiziert werden. Gegenstand der Erfindung sind auf obengenannte Weise ermittelte pharmazeutisch wirksame Effektor-Substanzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente Nukleinsäuren, Vektoren, Zellen, Polypeptide, Proteine,
Antikörper und/oder Effektor-Substanzen wie zuvor angegeben enthält und weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe sowie gegebenenfalls weitere aktive Komponenten enthalten kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann insbesondere zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Erkrankungen eingesetzt werden, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus- Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Dies gilt auch für die Diagnostik einer Prädisposition für solche Erkrankungen bei Individuen, insbesondere bei der Diagnostik eines Risikos für Cytopenien und/oder Tumorerkrankungen. Weiterhin wird eine gezielte Diagnostik von Krankheiten ermöglicht, die mit Veränderungen der Aktivität des FANCIP4 bzw. FANCIP5 direkt oder indirekt verbunden sind. Diese Untersuchungen können mit Hilfe spezifischer Nukleinsäuresonden zum Nachweis auf Nukleinsäureebene, z.B. auf Gen- oder Transkriptebene, oder mit Hilfe von Antikörpern gegen FANCIP4 bzw. FANCIP5 zum Nachweis auf Proteinebene durchgeführt werden.
Bei Krankheitsbildern, die auf einen Ausfall des FANCIP4 bzw. FANCIP5 zurückzuführen sind, kann eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche die Übertragung einer für das FANCIP4 bzw. FANCIP5 codierenden Nukleinsäure mittels Vektoren, z.B. viralen Vektoren, in das entsprechende Zielgewebe umfaßt. Andererseits kann bei Krankheitsbildern, die auf eine unkontrollierte Expression des FANCIP4 bzw. FANCIP5 zurückzuführen sind, eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche zu einer Blockierung dieser Expression führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnostik der oben genannten Erkrankungen, wobei man einen Patienten oder eine aus einem Patienten stammende Probe, z.B. eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes, mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in Kontakt bringt und die Nukleotidsequenz und/oder die Expression der erfindungsgemäßen
Nukleinsäure qualitativ oder quantitativ bestimmt. Diese Bestimmungsmethoden können beispielsweise auf Nukleinsäureebene durch Verwendung von Nukleinsäure- Hybridisierungssonden oder über Reverse Transkription/PCR bzw. auf Proteinebene durch Antikörper nach cyto- oder histochemischen Methoden erfolgen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann als Marker für das Auftreten von
Cytopenien, Tumoren oder anderer proliferationsassoziierter Erkrankungen oder einer Prädisposition für die genannten pathophysiologischen Veränderungen verwendet werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Therapie oder Prävention einer der zuvor genannten Erkrankungen, wobei man dem Patienten eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die die aktive Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält. Spezifische Beispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen, welche für therapeutische Zwecke geeignet sind, sind beispielsweise bispezifische Antikörper und Antikörper- Toxine bzw. Antikörper-Enzymkonjugate. Weitere bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen für therapeutische Zwecke sind Antisense-Nukleinsäuren, gentherapeutische Vektoren oder Effektor-Substanzen, z.B. in Form niedermolekularer Aktivatoren oder Inhibitoren. Detaillierte Beschreibung dt.r Erfindung
Interaction Trap
Zur Klonierung von cDNAs, deren Genprodukte mit den Fanconi-Anämie-Proteinen FANCA und/oder FANCC interagieren und damit eine Rolle bei der FA-Pathogenese spielen können, wurde eine Interaction Trap-Version des Hefe-Two Hybrid-Systems (Fields und Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996) eingesetzt.
Für die Konstruktion der FANCA- und FANCC-Köderproteine wurde jeweils die komplette codierende Sequenz der Proteine in den Vektor pEG202 über die EcoRI- Schnittstelle im Leserahmen mit der für die LexA-DNA-bindende Domäne codierenden Region kloniert. Für die Expression des Beuteproteins wurde der Vektor pJG4-5 verwendet, der die Konstruktion von Fusionsproteinen mit der B42- transaktivierenden Domäne erlaubt. Mit dem FANCA- und FANCC-Köderprotein wurde jeweils eine in diesen Vektor als Fusionsgenbank klonierte HeLa-cDNA- Bibliothek durchmustert.
Als Wirtsorganismus diente der Hefestamm EGY48. Der Nachweis einer positiven Interaktion erfolgte durch Trankriptionsaktivierung des LEU2-Gens, woraus Wachstum der Hefen auf Leucin-freiem Medium resultiert.
Vor Durchführung des Interaction Traps wurde durch Ausplattieren pEG202FANCA- bzw. pEG202FANCC-transformierter EGY48-Hefen auf Glucose-Medium ohne Histidin und Leucin sichergestellt, daß keine intrinsische transaktivierende Eigenschaft des FANCA- bzw. FANCC-Köder-Fusionskonstruktes vorliegt.
Mit pEG202FANCA bzw. pEG202FANCC und der B42-Fusionsgenbank cotransformierte EGY48 wurden auf Leucin-haltigem Medium auf Erhalt beider Vektoren vorselektiert und aufgenommen. Für die Suche nach interagierenden Hefeklonen wurden Aliquots auf Leucin-freiem Medium ausplattiert und 3 bis 5 Tage bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden Aliquots entsprechend einer Menge von 1 x 106 Transfektanten durchmustert. Die Abhängigkeit der Transkriptionsaktivierung positiver Klone von der Expression des Beuteproteins wurde auf Leucin-freiem Glucose-Medium überprüft. Die Isolierung der Interaktor-Plasmide erfolgte nach Aufzucht der Hefen in Glucose-Medium ohne Tryptophan, Elektroporation des Nukleinsäure-Isolats im E. coli-Stamm XLIblue (Stratagene) und Plasmidpräparation aus den Bakterienzellen. Zur Bestätigung der Interaktionen wurden Retransformationen des isolierten Beute-Interaktors in Kombinationen mit unterschiedlichen Köderkonstrukten durchgeführt. In Kombination mit pEG202FANCA bzw. pEG202FANCC wurde die zuvor beobachtete Interaktion bestätigt. Außerdem wurden mögliche Interaktionen mit dem LexA-Fusionspartner ausgeschlossen, indem einerseits mit dem pEG202-Leervektor co-retransformiert wurde und andererseits mit einem LexA-DNA-Ligase- bzw. LexA-bicoid- Köderfusionskonstrukt als Negativkontrolle.
Sequenzanalyse der FANCIP4- bzw. FANCIP5-cDNA
Die Länge der Genbank-cDNAs der isolierten Interaktorklone wurde durch EcoRI/Xhol-Restriktionshydrolyse bestimmt. Die Ansequenzierung der cDNAs erfolgte durch eine automatisierte "Cycle Sequencing"-Methode (Applied Biosystems) unter Verwendung des Nukleinsäureprimers Bco I (5'-ACC AGC CTC TTG CTG AGT GGA GAT G-3'). Die vollständige Sequenzierung der Vektor-inserierten FANCIP4- bzw. FANCIP5-cDNA-Fragmente erfolgte mit den Nukleinsäureprimem Bco I und Bco II (5'-GAC AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA G-3") sowie zusätzlichen internen FANCIP4- bzw. FANCIPδ-spezifischen Primern.
Für FANCIP4 ergab sich ein 2017 Nukleotide langer cDNA-Bereich mit einem möglichen offenen Leserahmen von 1476 Nukleotiden bzw. 492 Codons. Zur Ermittlung der 5'-Bereich-Teilsequenz der gefundenen FANCIPδ-Nukleotidsequenz wurde der δ'/3' RACE Kit (Röche Diagnostics) verwendet. Hierbei kamen die sequenzspezifischen Primer FANCIPδ-SP1 (δ'-CTCTGTTTCCTTAGCTCAGC-S') sowie FANCIPδ-SP2 (δ'-TAGGCTTCTTGTGACCCTGC-3') zum Einsatz. Das erhaltene PCR-Produkt wurde elektrophoretisch gereinigt (JETquick Gel Extraction Kit, GENOMED) und unter Verwendung des oben genannten Primers FANCIPδ-SP2 direkt sequenziert. Die Zugehörigkeit der erhaltenen Nukleotidfragmente zu den Plasmid-inserierten Interaktor-Fragmenten wurde jeweils durch überlappende Sequenzbereiche bestätigt. Die zusammengesetzte Nukleotidsequenz ergab für FANCIPδ einen 1929 Nukleotide langen cDNA-Bereich mit einem möglichen offenen Leserahmen von 1647 Nukleotiden bzw. δ49 Codons.
Zur Überprüfung und Klonierung der kompletten offenen Leserahmen der FANCIP4- δ und FANCIPδ-cDNA-Sequenzen wurden diese mittels PCR und sequenzspezifischer δ'- und 3'-Primer aus Gesamt-cDNA amplifϊziert. Bei den Primern handelte es sich um FANCIP4-P (δ'-AGG AGC GGG CGC CAT GGC G-3') und FANCIP4-M (δ'-TGT TAG CCT CTC AAT TCT GCC-3') bzw. FANCIPδ-P (δ'-ACA GCC AAT ATG AAA AGG CC-3') und FANCIPδ-M (δ'-AAA GCC ATT GTT CTG TTA CAC-3'). Die 0 Klonierung der PCR-Produkte erfolgte über die Smal-Schnittstelle in den Vektor pUC19. Die inserierten PCR-Produkte für FANCIP4 und FANCIPδ wurden nach Plasmidpräparation aus transformierten E. coli-Zellen komplett sequenziert, wobei zusätzliche interne FANCIP4- bzw. FANCIPδ-spezifische sowie externe pUC19- spezifische Primer verwendet wurden. δ
Um ähnliche Nukleotid- und Proteinsequenzen in den Sequenzdatenbanken des "National Center of Biotechnology Information" (NCBI) zu finden, wurden die cDNA- Sequenzen von FANCIP4 bzw. FANCIPδ sowie die aus den offenen Leserahmen abgeleiteten Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Blast-Programms am 0 NCBI (http://www.ncbi. nlm. nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast? Jform=1) analysiert.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Es zeigen: δ Fig. 1 (SEQ ID NO. 1) eine Nukleotidsequenz, die einen für FANCIP4 codierenden offenen Leserahmen enthält,
Fig. 2 (SEQ ID NO. 2) die Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz, 0
Fig. 3 (SEQ ID NO. 3) eine Nukleotidsequenz, die einen für FANCIPδ codierenden offenen Leserahmen enthält, Fig. 4 (SEQ ID NO. 4) die Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens der in Fig. 3 gezeigten Nukleotidsequenz,
Fig. δ (SEQ ID NOs. δ und 6) die Nukleinsäureprimer, die zur Sequenzierung der Plasmid-inserierten FANCIP4- bzw. FANCIPδ-Nukleotidsequenzen verwendet wurden,
Fig. 6 (SEQ ID NOs. 7 und 8) die Nukleinsäureprimer, die zur δ'-RACE-Analyse von FANCIPδ verwendet wurden,
Fig. 7 (SEQ ID NOs. 9 und 10) die Nukleinsäureprimer, die zur PCR-Amplifikation des offenen Leserahmens von FANCIP4 verwendet wurden,
Fig. 8 (SEQ IDs NOs. 11 und 12) die Nukleinsäureprimer, die zur PCR-Amplifikation des offenen Leserahmens von FANCIPδ verwendet wurden.
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Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäure, die a) die in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Proteincodierenden Abschnitt davon, b) eine den Sequenzen aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz, c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder d) eine zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre Sequenz umfaßt.
2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 , die einen vorzugsweise mindestens 30 Nukleotide umfassenden Protein-codierenden Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz umfaßt.
3. Nukleinsäure, die eine Homologie von mehr als 6δ% zu der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder einem Abschnitt davon aufweist.
4. Modifizierte Nukleinsäure oder Nukleinsäureanalogon, die eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassen.
δ. Rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Abschnitt davon enthält.
6. Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch δ, der die Expression der Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht.
7. Mit einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Vektor gemäß Anspruch δ oder 6 transformierte Zelle, ein entsprechender transgener Organismus oder Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 stabil exprimieren (knock-in) oder deren entsprechendes natürliches Gen gezielt zerstört wurde (knock-out).
8. Polypeptid oder Protein, oder dessen Salz, das von einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.
9. Peptid gemäß Anspruch 8, das a) die in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder b) eine Homologie von mehr als 60% zu der in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, oder dessen Salz.
10. Fragment des Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9 mit mindestens 100 Aminosäuren oder dessen Salz.
11. Modifiziertes Polypeptid oder Protein, das eine Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 8 oder 9 umfaßt.
12. Verfahren zur Herstellung des Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9, das die Kultivierung von Zellen gemäß Anspruch 7 umfaßt sowie die Isolierung des Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9.
13. Verwendung eines Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9 oder von Fragmenten dieses Peptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern.
14. Antikörper gegen ein Peptid gemäß Anspruch 8 oder 9.
1δ. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren eines Polypeptids oder Proteins gemäß Anspruch 8 oder 9, mit dessen Hilfe verschiedene potentielle Effektorsubstanzen an Zellen getestet werden können, die das Polypeptid oder Protein exprimieren.
16. Substanz, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß Anspruch 1δ erhalten wurde und die mit mindestens einem Bereich des Peptid gemäß Anspruch 8 oder 9 reagiert und/oder dieses verändert.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente a) eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, b) einen Vektor gemäß Anspruch δ oder 6, c) eine Zelle gemäß Anspruch 7, d) ein Peptid gemäß Anspruch 8, 9, 10 oder 11 , e) einen Antikörper gemäß Anspruch 14 umfaßt oder f) eine Substanz gemäß Anspruch 16 und pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthält.
18. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind, oder einer Prädisposition solcher Erkrankungen.
19. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus- Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind.
20. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Gentherapie von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind.
21. Verfahren zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind oder einer Prädisposition für solche Erkrankungen, bei dem man einen Patienten oder eine aus dem Patienten stammende Probe mit einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 in Kontakt bringt und die Nukleotidsequenz und/oder die Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 bestimmt.
22. Verfahren zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit DNA- Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind, bei dem man einem Patienten eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 verabreicht, die die aktive Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält.
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