DE60109430T2

DE60109430T2 - An entzündlichen darmerkrankungen beteiligte gene und deren verwendung

Info

Publication number: DE60109430T2
Application number: DE60109430T
Authority: DE
Inventors: Jean-Pierre Hugot; Gilles Thomas; Mohamed Zouali; Suzanne Lesage; Mathias Chamaillard
Original assignee: FOND JEAN DAUSSET CEPH PARIS; Fondation Jean Dausset-CEPH
Current assignee: FOND JEAN DAUSSET CEPH PARIS; Fondation Jean Dausset-CEPH
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2001-03-27
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2021-03-28
Also published as: JP5150997B2; DE60109430D1; FR2806739B1; US7592437B2; CA2404448C; US20130035260A1; FR2806739A1; ZA200207821B; ATE291086T1; NZ522011A; WO2001072822B1; WO2001072822A3; US8137915B2; US20100159453A1; EP1268784B1; AU2001287272B2; WO2001072822A2; AU8727201A; CA2404448A1; US20030190639A1

Description

Die Erfindung betrifft Gene, die an Entzündungskrankheiten und/oder Immunerkrankungen und bestimmten Krebsarten, insbesondere den kryptogenen Entzündungskrankheiten des Darms, beteiligt sind, wie auch die durch diese Gene kodierten Proteine. Verfahren zur Diagnose von Entzündungskrankheiten sind gleichfalls Gegenstände der Erfindung.
Die kryptogenen Entzündungskrankheiten des Darms (MICI) sind Erkrankungen, die durch eine Entzündung des Magendarmkanals, deren Ursache unbekannt ist, gekennzeichnet sind. Gemäß der Lage und den Charakteristiken der Entzündung unterscheidet man zwei unterschiedliche nosologische Entitäten: die hämorrhagische Rektokolitis (RCH) und Morbus Crohn (MC). Die RCH wurde von S. Wilkes in 1865 beschrieben, wohingegen über den ersten Fall von regionaler Ileitis von Crohn in 1932 berichtet worden ist. In Wirklichkeit ist es möglich, dass diese beiden Krankheiten viel älter sind.
Die MICI sind chronische Krankheiten, die sich während des gesamten Lebens entwickeln und die ungefähr 1 bis 2 Personen auf 1000 Einwohner in den westlichen Ländern befallen, was zwischen 60.000 und 100.000 erkrankten Personen in Frankreich entspricht. Es handelt sich um Erkrankungen, die bei dem jungen Individuum (der Peak der Inzidenz liegt im dritten Jahrzehnt) auftreten, die sich durch Ausbrüche, die von Remissionen unterbrochen werden, entwickeln mit häufigen Komplikationen, wie Unterernährung, Wachstumsverzögerung beim Kind, Knochendemineralisierung und am Ende maligner Degeneration in Richtung von Kolonkrebs. Es gibt keine spezifische Behandlung. Die üblichen Therapien ziehen die entzündungshemmenden Mittel, die Immunsuppressiva und die Chirurgie heran. Alle diese therapeutischen Mittel oder Maßnahmen sind ihrerseits die Ursache einer bedeutenden iatrogenen Morbidität. Aus allen diesen Gründen erweisen sich die MICI als ein bedeutendes Problem der öffentlichen Gesundheit.
Die Ätiologie der MICI ist gegenwärtig unbekannt. Umweltfaktoren sind an dem erstmaligen Auftreten der Krankheit beteiligt, wie dies die Erhöhung der Inzidenz der Krankheit im Verlauf der letzten hundert Jahre und die unvollständige Konkordanz bei den eineiigen Zwillingen belegt. Die einzigen Risikofaktoren aus der Umwelt, die gegenwärtig anerkannt sind, sind 1) der Tabak, dessen Rolle bei MC schädlich und bei der RCH vorteilhaft ist, und 2) die Appendektomie, die eine schützende Rolle bei der RCH spielt.
Vor der Existenz von ethnischen und familiären Häufungen dieser Krankheiten ist eine genetische Veranlagung seit langem vermutet worden. Tatsächlich sind die MICI in der kaukasischen Bevölkerung und insbesondere der jüdischen Bevölkerung Mitteleuropas besonders häufig. Die familiären Formen machen 6 bis 20% der MICI-Fälle aus. Sie sind besonders häufig, wenn der Beginn der Erkrankung früh ist. Indessen sind es die Untersuchungen an Zwillingen, die es erlaubt haben, den genetischen Charakter dieser Erkrankungen zu bestätigen. Tatsächlich ist der Konkordanzgrad zwischen Zwillingen hinsichtlich dieser Erkrankungen bedeutender bei den eineiigen Zwillingen als bei den zweieiigen Zwillingen, was stark für eine erbliche Komponente bei den MICI, insbesondere bei MC, spricht. Nach aller Wahrscheinlichkeit sind die MICI komplexe erblich bedingte Erkrankungen, an welchen mehrere unterschiedliche Gene beteiligt sind in Wechselwirkung zwischen einander und mit Umweltfaktoren. Die MICI können folglich in das Spektrum der multifaktoriellen Erkrankungen eingestuft werden.
Es wurden zwei große Strategien entwickelt, um die Suszeptibilitätsgene für die MICI nachzuweisen. Die erste beruht auf der Analyse von Kandidatengenen aus pathophysiologischen Gründen. So wurden zahlreiche Gene als für die MICI potentiell von Bedeutung vorgeschlagen. Es handelt sich oftmals um Gene, die eine Rolle bei der Entzündung und der Immunantwort spielen. Man kann die Gene HLA, TAP, TNF, MICA, den T-Rezeptor des Lymphozyten, ICAM1, Interleukin 1, CCR5 u.s.w. aufführen. Andere Gene sind an diversen Funktionen beteiligt, wie GAI2, Motilin, MRAMP, HMLH1 u.s.w. In Wirklichkeit wurde bei keinem der verschiedenen untersuchten Kandidatengene gegenwärtig definitiv seine Rolle bei dem erstmaligen Auftreten der MICI bewiesen.
Die unlängst erfolgte Entwicklung von Karten des menschlichen Genoms unter Verwendung der hochgradig polymorphen genetischen Marker hat es den Genetikern erlaubt, einen nicht-zielgerichteten Ansatz auf die Gesamtheit des Genoms zu entwickeln. Dieser Ansatz, der auch als inverse Genetik oder Positionsklonierung („positional cloning") bezeichnet wird, stellt keinerlei Hypothese über die an der Krankheit beteiligten Gene auf und versucht, jene über ein systematisches Screening des Genoms zu entdecken. Die für die komplexen genetisch bedingten Erkrankungen am häufigsten eingesetzte Methode beruht auf der Untersuchung der Identität durch die Abstammung der erkrankten Personen aus ein und derselben Familie. Dieser Wert wird für eine große Anzahl (300–400) von auf dem Genom regelmäßig verteilten (alle 10 cM) Polymorphismus-Markern berechnet. Im Falle eines Überschusses von Identität zwischen erkrankten Personen gibt bzw. geben der oder die getestete(n) Marker eine Region an, von der vermutet wird, dass sie ein Suszeptibilitätsgen für die Krankheit enthält. Da in dem Falle der komplexen genetisch bedingten Erkrankungen das der genetischen Prädisposition zugrunde liegende Modell (Anzahl von Genen und jeweilige Bedeutung von jedem von diesen) unbekannt ist, müssen die einzusetzenden statistischen Methoden angepasst werden.
Die Erfindung betrifft den Nachweis der Nukleinsäuresequenz von Genen, die an den MICI und anderen Entzündungskrankheiten beteiligt sind, wie auch die Verwendung dieser Nukleinsäuresequenzen.
Im Rahmen der Erfindung haben einleitende Arbeiten der Erfinder bereits erlaubt, ein Suszeptibilitätsgen für MC zu lokalisieren. Tatsächlich haben die Erfinder (Hugot et al., 1996) gezeigt, dass ein Suszeptibilitätsgen für MC in der perizentromeren Region des Chromosoms 16 lokalisiert war (1). Es handelte sich um das erste Suszeptibilitätsgen für eine komplexe genetisch bedingte Erkrankung, welches durch Positionsklonierung lokalisiert wurde und die strengen Kriterien, die in der Literatur vorgeschlagen worden sind (Lander und Kruglyak, 1995), erfüllte. Dieses Gen ist IBD1 (für „Inflammatory Bowel Disease 1") genannt worden. Seitdem sind andere Lokalisierungen durch andere Autoren insbesondere auf den Chromosomen 12, 1, 3, 6 und 7 vorgeschlagen worden (Satsangi et al., 1996; Cho et al., 1998). Obgleich lokalisiert, konnte gegenwärtig keines dieser Suszeptibilitätsgene für die MICI identifiiziert werden.
Bestimmte Autoren konnten diese Lokalisierung nicht reproduzieren (Rioux et al., 1998). Dies ist indessen im Fall von komplexen genetisch bedingten Erkrankungen, wo eine genetische Heterogenität wahrscheinlich ist, nicht überraschend.
Es ist interessant, festzuhalten, dass gemäß dem gleichen Positionsklonierungsansatz auch Lokalisierungen auf dem Chromosom 16 für mehrere Immun- und Entzündungskrankheiten, wie die ankylosierende Spondylitits, das Blau-Syndrom, Psoriasis u.s.w. vorgeschlagen wurden (Becker et al., 1998; Tromp et al., 1996). An allen diesen Erkrankungen könnte dann ein und dasselbe Gen (oder ein und dieselbe Gruppe von Genen), das bzw. die auf dem Chromosom 16 lokalisiert ist, beteiligt sein.
Das Maximum der genetischen Koppelungstests befindet sich praktisch stets an der gleichen Position, auf der Höhe von D16S409 oder D16S411, welche nur 2 cM voneinander entfernt sind. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu der bedeutenden Größe (gewöhnlich über 20 cM) des Vertrauensbereichs, welcher der genetischen Lokalisierung gemäß einem Ansatz, welcher nicht-parametrische Kopplungsanalysen einsetzt, zugeschrieben werden kann.
Der Vergleich der im Rahmen der Arbeiten der Erfinder verwendeten statistischen Tests zeigt, dass die auf der vollständigen Identität anhand von Abstammung (Tz2) basierenden Tests bes ser sind als die Tests, die auf dem Mittelwert der Identität anhand von Abstammung (Tz) basieren (1). Ein solcher Unterschied kann durch einen rezessiven Effekt von IBD1 erklärt werden.
Mehrere bekannte Gene in der perizentromeren Region des Chromosoms 16, wie der Rezeptor von Interleukin 4, CD19, CD43, CD11, erweisen sich als gute potentielle Kandidaten für MC. Einleitende Ergebnisse sprechen indessen nicht für die Beteiligung dieser Gene an MC.
Insbesondere stellt die Erfindung die Sequenz nicht nur des IBD1-Gens bereit, sondern gleichfalls die partielle Sequenz eines anderen Gens, welches als IBD1prox aufgrund seiner Lage in der Nähe von IBD bezeichnet wird und nachgewiesen wurde, wie in den nachfolgenden Beispielen berichtet. Diese Gene, deren cDNA-Sequenz SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 4 entspricht, sind folglich potentiell an zahlreichen Entzündungs- und/oder Immunkrankheiten wie auch Krebsarten beteiligt.
Die durch die Gene IBD1 und IBD1prox exprimierte Peptidsequenz wird durch SEQ ID Nr. 2 bzw. SEQ ID Nr. 5 angegeben; die genomische Sequenz dieser Gene wird durch SEQ ID Nr. 3 bzw. SEQ ID Nr. 6 angegeben.
So hat die Erfindung eine gereinigten oder isolierte Nukleinsäure zum Gegenstand, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ausgewählt wird aus der Gruppe der folgenden Sequenzen:

a) SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 3;
b) der komplementären Sequenz oder der Sequenz der RNA, welche einer Sequenz wie in a) definiert, entsprechen.

Durch Nukleinsäure, Nuklein- oder Nukleinsäuresequenz, Polynukleotid, Oligonukleotid, Polynukleotidsequenz, Nukleotidsequenz, Begriffe, die unterschiedslos im Rahmen der Beschreibung eingesetzt werden, soll eine präzise Aneinanderreihung von modifizierten oder nicht modifizierten Nukleotiden, welche erlaubt, ein Fragment oder eine Region einer Nukleinsäure, welche natürliche Nukleotide umfassen oder nicht umfassen und ebenso einer doppelsträngigen DNA, einer einzelsträngigen DNA wie auch Transkriptionsprodukten der DNAs entsprechen können, zu definieren, bezeichnet werden. So umfassen die Nukleinsequenzen gemäß der Erfindung gleichfalls die PNA („Peptid Nucleic Acid") oder Analoga.
Es muss sich verstehen, dass die Erfindung nicht die Nukleotidsequenzen in ihrer natürlichen chromosomalen Umgebung, d.h. im natürlichen Zustand, betrifft. Es handelt sich um Sequen zen, die isoliert und/oder gereinigt worden sind, d.h. dass sie direkt oder indirekt entnommen worden sind, beispielsweise durch Kopie, wobei ihre Umgebung wenigstens teilweise modifiziert worden ist. Es sollen so gleichfalls die Nukleinsäuren bezeichnet werden, die durch chemische Synthese erhalten werden.
Mit Nuklein- oder Nukleinsäuresequenzvariante soll gleichfalls eine jegliche RNA oder cDNA bezeichnet werden, welche aus einer Mutation und/oder Variation einer Spleißstelle der genomischen Nukleinsequenz, deren cDNA die Sequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist, resultiert.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise eine gereinigte oder isolierte Nukleinsäure gemäß der Erfindung, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die Sequenz SEQ ID Nr. 1, deren komplementäre Sequenzen oder RNA-Sequenzen, welche SEQ ID Nr. 1 entsprechen, umfasst oder daraus besteht.
Die Primer oder Sonden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung umfassen, bilden gleichfalls einen Teil der Erfindung.
So betrifft die Erfindung gleichfalls die Primer oder die Sonden gemäß der Erfindung, die insbesondere ermöglichen können, die Nukleinsequenzvarianten nachzuweisen oder zu unterscheiden oder die genomische Sequenz der Gene, deren cDNA durch SEQ ID Nr. 1 angegeben wird, zu identifizieren unter Verwendung insbesondere einer Amplifizierungsmethode, wie der PCR-Methode oder einer verwandten Methode.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung als Sonde oder Primer, für den Nachweis, die Identifizierung, die quantitative Bestimmung oder die Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen.
Gemäß der Erfindung können die Polynukleotide als Sonde oder als Primer in Detektions-, Identifizierungs-, quantitativen Bestimmungs- oder Amplifizierungsverfahren von Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden, die eine minimale Größe von 15 Basen, vorzugsweise 20 Basen oder noch besser 25 bis 30 Basen aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Sonden und Primer können direkt oder indirekt durch eine radioaktive oder nicht-radioaktive Verbindung durch Methoden, die den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, markiert werden, um ein detektierbares und/oder quantifizierbares Signal zu erhalten.
Die erfindungsgemäßen Sequenzen von Polynukleotiden, die nicht markiert sind, können direkt als Sonde oder Primer eingesetzt werden.
Die Sequenzen werden im Allgemeinen markiert, um Sequenzen zu erhalten, die für zahlreiche Anwendungen eingesetzt werden können. Die Markierung der Primer oder der Sonden gemäß der Erfindung erfolgt durch radioaktive Elemente oder durch nicht-radioaktive Moleküle.
Unter den eingesetzten radioaktiven Isotopen kann man ³²P, ³³P ³⁵S, ³H oder ¹²⁵I aufführen. Die nicht-radioaktiven Entitäten werden aus den Liganden, wie Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxygenin, den Haptenen, den Färbemitteln, den lumineszierenden Agentien, wie den radiolumineszierenden, chemolumineszierenden, biolumineszierenden, fluoreszierenden, phosphoreszierenden Agentien, ausgewählt.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können so als Primer und/oder Sonde verwendet werden in Verfahren, welche insbesondere die PCR-Technik (Kettenamplifizierung durch eine Polymerase) (Rolfs et al., 1991) einsetzen. Diese Technik erfordert die Wahl von Oligonukleotid-Primerpaaren, welche das Fragment, welches amplifiziert werden muss, einrahmen. Man kann beispielsweise auf die in dem amerikanischen Patent U.S. Nr. 4,683,202 beschriebene Technik verweisen. Die amplifizierten Fragmente können identifiziert werden, beispielsweise nach einer Agarose- oder Polyacrylamidgelelektrophorese oder nach einer chromatographischen Technik, wie der Gelfiltration oder der Ionenaustauschchromatographie, dann sequenziert werden. Die Spezifität der Amplifizierung kann kontrolliert werden, indem als Primer die Nukleotidsequenzen von Polynukleotiden der Erfindung und als Matrices Plasmide, welche diese Sequenzen enthalten, oder ferner die abgeleiteten Amplifizierungsprodukte verwendet werden. Die amplifizierten Nukleotidfragmente können als Reagenzien in Hybridisierungsreaktionen eingesetzt werden, um die Anwesenheit einer Ziel-Nukleinsäure von komplementärer Sequenz zu jener der amplifizierten Nukleotidfragmente in einer biologischen Probe nachzuweisen.
Die Erfindung zielt gleichfalls auf die Nukleinsäuren ab, die durch Amplifizierung mit Hilfe von erfindungsgemäßen Primern erhalten werden können.
Andere Techniken zur Amplifizierung der Ziel-Nukleinsäure können vorteilhafterweise als Alternative zu der PCR („PCR-like") mit Hilfe von Primerpaaren von Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung eingesetzt werden. Mit „PCR-like" sollen alle Methoden bezeichnet werden, die direkte oder indirekte Reproduktionen der Nukleinsäuresequenzen einsetzen, oder ebenso in denen die Markierungssysteme amplifiziert worden sind; diese Techniken sind selbstverständlich bekannt. Im Allgemeinen handelt es sich um die Amplifizierung der DNA durch eine Polymerase; wenn die Ausgangsprobe eine RNA ist, empfiehlt es sich, vorab eine Umkehrtranskription auszuführen. Es existieren gegenwärtig sehr zahlreiche Verfahren, die diese Amplifizierung erlauben, wie beispielsweise die SDA-Technik („Strand Displacement Amplification") oder Strangverdrängungsamplifizierungstechnik (Walker et al., 1992), die TAS-Technik („Transcriptionbased Amplification System"), die von Kwoh et al. (1989) beschrieben worden ist, die 3SR-Technik („Self-Sustained Sequence Replication"), die von Guatelli et al. (1990) beschrieben worden ist, die NASBA-Technik („Nucleic Acid Sequence Based Amplification"), die von Kievitis et al. (1991) beschrieben worden ist, die TMA-Technik („Transcription Mediated Amplification"), die LCR-Technik („Ligase Chain Reaction"), die von Landegren et al. (1988) beschrieben worden ist, die RCR-Technik („Repair Chain Reaction"), die von Segev (1992) beschrieben worden ist, die CPR-Technik („Cycling Probe Reaction"), die von Duck et al. (1990) beschrieben worden ist, die Amplifizierungstechnik mittels der Q-beta-Replikase, die von Miele et al. (1983) beschrieben worden ist. Bestimmte von diesen Techniken sind seitdem perfektioniert worden.
In dem Falle, wo das zu detektierende Zielpolynukleotid eine mRNA ist, setzt man vorteilhafterweise vor der Ausführung einer Amplifizierungsreaktion mit Hilfe der erfindungsgemäßen Primer oder der Ausführung eines Detektionsverfahrens mit Hilfe der Sonden der Erfindung ein Enzym vom Typ reverse Transkriptase ein, um ausgehend von der in der biologischen Probe enthaltenen mRNA eine cDNA zu erhalten. Die erhaltene cDNA wird dann als Ziel für die Primer oder die Sonden, die in dem erfindungsgemäßen Amplifizierungs- oder Detektionsverfahren eingesetzt werden, dienen.
Die Sonden-Hybridisierungstechnik kann auf unterschiedliche Weisen ausgeführt werden (Matthews et al., 1988). Die allgemeinste Methode besteht darin, die aus den Zellen von unterschiedlichen Geweben oder aus in Kultur befindlichen Zellen extrahierte Nukleinsäure auf einem Träger (wie Nitrocellulose, Nylon, Polystyrol) zu immobilisieren und die immobilisierte Zielnukleinsäure unter wohl definierten Bedingungen mit der Sonde zu inkubieren. Nach der Hybridisierung wird der Überschuss an Sonde entfernt und die gebildeten hybriden Moleküle werden durch die geeignete Methode detektiert (Messung der Radioaktivität, der Fluoreszenz oder der enzymatischen Aktivität, die mit der Sonde verbunden sind).
Gemäß einer anderen Einsatzweise der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden können diese Letzteren als Einfang-Sonden („Capture"-Sonden) eingesetzt werden. In diesem Falle wird eine Sonde, die als „Einfang-Sonde" bezeichnet wird, auf einem Träger immobilisiert und dient dazu, durch spezifische Hybridisierung die Zielnukleinsäure, die ausgehend von der zu testenden biologischen Probe erhalten wird, einzufangen und die Zielnukleinsäure wird dann dank einer zwei ten, als „Detektionssonde" bezeichneten Sonde, die mit einem leicht detektierbaren Element markiert ist, detektiert.
Unter den interessanten Fragmenten von Nukleinsäuren muss man beispielsweise insbesondere die Antisinn-Nukleotide aufführen, d.h. deren Struktur durch Hybridisierung mit der Zielsequenz eine Inhibition der Expression des entsprechenden Produkts sicherstellt. Man muss gleichfalls die Sinn-Oligonukleotide aufführen, die durch Wechselwirkung mit an der Regulation der Expression des entsprechenden Produkts beteiligten Proteinen entweder eine Inhibition oder eine Aktivierung dieser Expression induzieren werden.
In den beiden Fällen (Sinn und Antisinn) können die Oligonukleotide der Erfindung in vitro und in vivo eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein isoliertes Polypeptid, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Polypeptid umfasst, welches SEQ ID Nr. 2 entspricht.
Mit „Polypeptid" sollen im Sinne der Erfindung Proteine oder Peptide bezeichnet werden.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren, welche eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung umfassen oder ein Polypeptid gemäß der Erfindung kodieren. Ein solcher Vektor kann gleichfalls die Elemente enthalten, die für die Expression und gegebenenfalls für die Sekretion des Polypeptids in einer Wirtszelle erforderlich sind. Eine solche Wirtszelle ist gleichfalls ein Gegenstand der Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Vektoren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Promotor- und/oder Regulatorsequenz umfassen, bilden gleichfalls einen Teil der Erfindung.
Die Vektoren umfassen vorzugsweise einen Promotor, Translationsstart- und -beendigungssignale wie auch geeignete Transkriptionsregulationsregionen. Sie müssen in der Zelle stabil aufrechterhalten werden können und können gegebenenfalls besondere Signale, die die Sekretion des translatierten Proteins spezifizieren, aufweisen.
Diese verschiedenen Kontrollsignale werden abhängig von dem eingesetzten zellulären Wirt ausgewählt. Zu diesem Zweck können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Vektoren für eine autonome Replikation innerhalb des gewählten Wirts oder in Vektoren, die eine Integration in den gewählten Wirt vornehmen, inseriert werden.
Von den Systemen mit autonomer Replikation setzt man vorzugsweise abhängig von der Wirtszelle Systeme vom Plasmid- oder viralen Typ ein, wobei die viralen Vektoren insbesondere Adenoviren (Perricaudet et al., 1992), Retroviren, Lentiviren, Poxviren oder Herpes-Viren (Epstein et al., 1992) sein können. Der Fachmann auf diesem Gebiet kennt die Techniken, die für jedes dieser Systeme einsetzbar sind.
Wenn man die Integration der Sequenz in die Chromosomen der Wirtszelle wünscht, kann man beispielsweise Systeme vom Plasmid-Typ oder viralen Typ einsetzen; solche Viren sind beispielsweise die Retroviren (Temin, 1986) oder die AAV (Carter, 1993).
Unter den nicht-viralen Vektoren bevorzugt man die nackten Polynukleotide, wie die nackte DNA oder die nackte RNA gemäß der von der Firma VICAL entwickelten Technik, die künstlichen Bakterienchromosomen (BAC, „bacterial artificial chromosome"), die künstlichen Hefechromosomen (YAC, „yeast artificial chromosome") für die Expression in der Hefe, die künstlichen Chromosomen aus der Maus (MAC, „mouse artificial chromosome") für die Expression in Mäusezellen und bevorzugt die künstlichen Chromosomen aus dem Menschen (HAC, „human artificial chromosome) für die Expression in humanen Zellen.
Solche Vektoren werden gemäß den Methoden, die durch den Fachmann auf diesem Gebiet üblicherweise eingesetzt werden, hergestellt und die daraus resultierenden Klone können in einen geeigneten Wirt durch Standardmethoden, wie beispielsweise die Lipofektion, die Elektroporation, den Thermoschock, die Transformation nach chemischer Permeabilisierung der Membran, die Zellfusion, eingeführt werden.
Die Erfindung umfasst außerdem die Wirtszellen, insbesondere die eukaryotischen und prokaryotischen Zellen, welche durch die erfindungsgemäßen Vektoren transformiert sind, wie auch die transgenen Tiere, vorzugsweise die Säugetiere, mit Ausnahme des Menschen, welche eine der genannten erfindungsgemäßen transformierten Zellen umfassen. Diese Tiere können zu gegebener Zeit als Modelle für die Untersuchung der Ätiologie von Entzündungskrankheiten und/oder Immunerkrankungen und insbesondere der Entzündungskrankheiten des Magendarmkanals oder für die Untersuchung von Krebsarten verwendet werden.
Unter den Zellen, die im Sinne der Erfindung verwendet werden können, kann man die Bakterienzellen (Olins und Lee, 1993), aber auch die Hefezellen (Buckholz, 1993) ebenso wie die tierischen Zellen, insbesondere die Kulturen von Säugetierzellen (Edwards und Aruffo, 1993) und insbesondere die Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) aufführen. Man kann gleichfalls die Zellen von Insekten aufführen, in welchen man Verfahren einsetzen kann, die beispielsweise Baculoviren einsetzen (Luckow, 1993). Ein für die Expression der Proteine der Erfindung bevorzugter zellulärer Wirt wird durch die COS-Zellen gebildet.
Unter den erfindungsgemäßen Säugetieren bevorzugt man Tiere, wie die Nagetiere, insbesondere die Mäuse, die Ratten oder die Kaninchen, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimieren.
Unter den erfindungsgemäßen Säugetieren bevorzugt man gleichfalls Tiere, wie die Mäuse, die Ratten oder die Kaninchen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass das das Protein mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 oder das Protein, dessen Sequenz durch das homologe Gen bei diesen Tieren kodiert wird, kodierende Gen nicht funktionsfähig ist, funktionsunfähig gemacht ist oder wenigstens eine Mutation aufweist.
Diese transgenen Tiere werden beispielsweise durch homologe Rekombination mit embryonalen Stammzellen, Transfer von diesen Stammzellen in Embryos, Selektion der betreffenden Chimären auf der Ebene der Fortpflanzungslinien und Vermehrung der Chimären erhalten.
Die transgenen Tiere gemäß der Erfindung können so das das erfindungsgemäße Protein kodierende Gen oder deren homologes Gen überexprimieren oder das Gen exprimieren, in welches eine Mutation eingeführt ist. Diese transgenen Tiere, insbesondere Mäuse, werden beispielsweise durch Transfektion mit einer Kopie dieses Gens unter der Kontrolle eines starken Promotors von ubiquitärer oder für einen Gewebetyp selektiver Natur oder nach viraler Transkription erhalten.
Alternativ können die transgenen Tiere gemäß der Erfindung hinsichtlich des eines der Polypeptide mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 kodierenden Gens oder hinsichtlich dessen homologer Gene defizient gemacht werden durch Inaktivierung mit Hilfe des LOXP/CRE-Rekombinase-Systems (Rohlmann et al., 1996) oder eines jeglichen anderen Systems zur Inaktivierung der Expression dieses Gens.
Die erfindungsgemäßen Zellen und Säugetiere sind in einem Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, wie nachfolgend beschrieben, einsetzbar und können gleichfalls als Analysenmodell dienen.
Die transformierten Zellen oder Säugetiere, wie sie zuvor beschrieben worden sind, können auch als Modelle verwendet werden, um die Wechselwirkungen zwischen den erfindungsgemäßen Polypeptiden und den chemischen oder proteinartigen Verbindungen, die direkt oder indirekt an den Aktivitäten der erfindungsgemäßen Polypeptide beteiligt sind, zu untersuchen und dies, um die verschiedenen Mechanismen und Wechselwirkungen, die daran beteiligt sind, zu untersuchen.
Sie können insbesondere eingesetzt werden für die Selektion von Produkten, die mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden, insbesondere dem Protein mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 oder dessen Varianten gemäß der Erfindung, als Cofaktor oder als Inhibitor, insbesondere kompetitiver Inhibitor, oder ferner mit einer Agonisten- oder Antagonistenaktivität bezüglich der Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide wechselwirken. Man setzt vorzugsweise diese transformierten Zellen oder transgenen Tiere als Modell insbesondere für die Selektion von Produkten, die erlauben, die mit einer abnormalen Expression dieses Gens verbundenen Pathologien zu bekämpfen, ein.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Verwendung einer Zelle, eines Säugetiers oder eines Polypeptids gemäß der Erfindung für das Screening von chemischen oder biochemischen Verbindungen, die direkt oder indirekt mit den Polypeptiden gemäß der Erfindung wechselwirken können und/oder in der Lage sind, die Expression oder die Aktivität dieser Polypeptide zu modulieren.
Ebenso betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zum Screening von Verbindungen, welche in der Lage sind, in vitro oder in vivo mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure wechselzuwirken unter Verwendung einer Nukleinsäure, einer Zelle oder eines Säugetiers gemäß der Erfindung und unter Detektion der Bildung eines Komplexes zwischen den Kandidatenverbindungen und der Nukleinsäure gemäß der Erfindung.
Die so selektierten Verbindungen sind gleichfalls Gegenstände der Erfindung.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung für die Synthese von rekombinanten Polypeptiden.
Das Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Erfindung in rekombinanter Form, das seinerseits in der Erfindung enthalten ist, ist dadurch gekennzeichnet, dass man die transformierten Zellen, insbesondere die Zellen oder Säugetiere der Erfindung, kultiviert unter Bedingungen, welche die Expression eines rekombinanten Polypeptids, welches durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kodiert wird, erlauben, und dass man das rekombinante Polypeptid gewinnt.
Die rekombinanten Polypeptide, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie durch das genannte Herstellungsverfahren erhalten werden können, bilden gleichfalls einen Teil der Erfindung.
Die wie oben angegeben erhaltenen rekombinanten Polypeptide können ebenso in glycosylierter wie nicht-glycosylierter Form vorliegen und können die natürliche Tertiärstruktur aufweisen oder nicht.
Die Sequenzen der rekombinanten Polypeptide können gleichfalls modifiziert werden, um ihre Löslichkeit insbesondere in wässrigen Lösemitteln zu verbessern.
Solche Modifikationen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, wie beispielsweise die Deletion von hydrophoben Domänen oder die Substitution von hydrophoben Aminosäuren durch hydrophile Aminosäuren.
Diese Polypeptide können ausgehend von den Nukleinsäuresequenzen, die oben definiert worden sind, hergestellt werden gemäß den Techniken zur Herstellung von rekombinanten Polypeptiden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. In diesem Falle wird die eingesetzte Nukleinsäuresequenz unter die Kontrolle von Signalen gestellt, welche deren Expression in einem zellulären Wirt erlauben.
Ein wirksames System zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids erfordert, über einen Vektor und eine Wirtszelle gemäß der Erfindung zu verfügen.
Diese Zellen können erhalten werden durch die Einführung einer Nukleotidsequenz, die in einen Vektor, wie oben definiert, inseriert ist, in Wirtszellen, dann das Kultivieren der Zellen unter Bedingungen, die die Replikation und/oder die Expression der durch Transfektion eingeführten Nukleotidsequenz erlauben.
Die für die Reinigung eines rekombinanten Polypeptids eingesetzten Verfahren sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Das rekombinante Polypeptid kann ausgehend von Zelllysaten und -extrakten, dem Überstand des Kulturmediums gereinigt werden durch Verfahren, die individuell oder in Kombination eingesetzt werden, wie die Fraktionierung, die Chromatographieverfahren, die Immunaffinitätstechniken mit Hilfe von spezifischen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern u.s.w.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch erhalten werden durch chemische Synthese unter Verwendung von einer der zahlreichen bekannten Peptidsynthesen, beispielsweise der Techniken, die feste Phasen einsetzen (siehe insbesondere Stewart et al., 1984), oder von Techniken, die partielle feste Phasen einsetzen, durch Kondensation von Fragmenten oder durch eine klassische, in Lösung erfolgende Synthese.
Die Polypeptide, die durch chemische Synthese erhalten worden sind und entsprechende nicht-natürliche Aminosäuren umfassen können, sind gleichfalls in der Erfindung enthalten.
Die mono- oder polyklonalen Antikörper oder deren Fragmente, chimären oder immunkonjugierten Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie in der Lage sind, spezifisch ein erfindungsgemäßes Polypeptid zu erkennen, bilden einen Teil der Erfindung.
Spezifische polyklonale Antikörper können ausgehend von einem Serum eines gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide, die insbesondere durch genetische Rekombination oder durch Peptidsynthese hergestellt worden sind, immunisierten Tiers gemäß den üblichen Verfahrensweisen erhalten werden.
Es wird insbesondere auf den Nutzen von Antikörpern, die auf spezifische Weise bestimmte Polypeptide, Varianten oder deren immunogene Fragmente erkennen, gemäß der Erfindung hingewiesen.
Die mono- oder polyklonalen Antikörper oder deren Fragmente, chimären oder immunkonjugierten Antikörper, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie in der Lage sind, spezifisch die Polypeptide mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 zu erkennen, sind besonders bevorzugt.
Die spezifischen monoklonalen Antikörper können erhalten werden gemäß der klassischen Methode der Kultur von Hybridomen, die von Köhler und Milstein (1975) beschrieben worden ist.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind beispielsweise chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente. Sie können gleichfalls in Form von Immunkonjugaten oder von markierten Antikörpern, um ein detektierbares und/oder quantifizierbares Signal zu erhalten, vorliegen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls Verfahren für die Detektion und/oder die Reinigung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einen erfindungsgemäßen Antikörper einsetzen.
Die Erfindung umfasst außerdem gereinigte Polypeptide, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten werden.
Außerdem können außer ihrer Verwendung für die Reinigung der Polypeptide die Antikörper der Erfindung, insbesondere die monoklonalen Antikörper, gleichfalls für die Detektion dieser Polypeptide in einer biologischen Probe eingesetzt werden.
Sie bilden so ein Mittel zur immunzytochemischen oder immunhistochemischen Analyse der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere der Polypeptide mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 oder von einer von deren Varianten auf spezifischen Gewebeschnitten, beispielsweise durch Immunfluoreszenz, Gold-Markierung, enzymatische Immunkonjugate.
Sie können insbesondere erlauben, eine abnormale Expression dieser Polypeptide in den Geweben oder biologischen Proben nachzuweisen.
Allgemeiner können die Antikörper der Erfindung vorteilhafterweise in einer jeglichen Situation eingesetzt werden, wo die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids, welches normal oder mutiert ist, beobachtet werden muss.
So bildet ein Verfahren zur Detektion eines erfindungsgemäßen Polypeptids in einer biologischen Probe, welches die Schritte umfasst, die biologische Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper in Kontakt zu bringen und den gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex nachzuweisen, gleichfalls einen Gegenstand der Erfindung wie auch ein Kit, welcher erlaubt, ein solches Verfahren auszuführen. Ein solcher Kit enthält insbesondere:

a) einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gemäß der Erfindung;
b) gegebenenfalls Reagenzien für die Konstitution eines für die immunologische Reaktion geeigneten Mediums;
c) die Reagenzien, die die Detektion des während der immunologischen Reaktion erzeugten Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können gleichfalls bei der Behandlung einer Entzündungs- und/oder Immunkrankheit oder einer Krebserkrankung beim Menschen eingesetzt werden, wenn man eine abnormale Expression des IBD1-Gens beobachtet. Eine abnormale Expression bezeichnet eine Überexpression oder die Expression eines mutierten Proteins.
Diese Antikörper können direkt ausgehend von humanem Serum oder ausgehend von mit erfindungsgemäßen Polypeptiden immunisierten Tieren erhalten, dann „humanisiert" werden und können als solche oder bei der Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung der vorerwähnten Krankheiten bestimmt ist, eingesetzt werden.
Gleichfalls einen Teil der Erfindung bilden die Verfahren zur Bestimmung einer Allelvariabilität, einer Mutation, einer Deletion, eines Heterozygotieverlusts oder einer jeglichen genetischen Anomalie des erfindungsgemäßen Gens, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Nukleinsäuresequenz, ein Polypeptid oder einen Antikörper gemäß der Erfindung einsetzen.
Die Erfindung stellt tatsächlich die Sequenz des IBD1-Gens, welches an Entzündungs- und/oder Immunkrankheiten und insbesondere den MICI beteiligt ist, bereit. Eine der Lehren der Erfindung besteht darin, die Mutationen in diesen Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen zu präzisieren, die mit einem Phänotyp, der einer dieser Entzündungs- und/oder Immunkrankheiten entspricht, verbunden sind.
Man kann diese Mutationen direkt durch Analyse der Nukleinsäure und der Sequenzen gemäß der Erfindung (genomische DNA, RNA oder cDNA) detektieren, aber gleichfalls durch das Zwischenglied der erfindungsgemäßen Polypeptide. Insbesondere erlaubt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers, der ein Epitop erkennt, welches eine Mutation enthält, zwischen einem „gesunden" Protein und einem „mit einer Pathologie verbundenen oder assoziierten" Protein zu unterscheiden.
So zeigt die Untersuchung des IBD1-Gens bei verschiedenen Entzündungs- und/oder Immunkrankheiten beim Menschen beispielsweise, dass es Sequenzvarianten dieses Gens bei Morbus Crohn, der hämorrhagischen Rektokolitis und dem Blau-Syndrom gibt, wie durch die Beispiele gezeigt wird. Diese Sequenzvariationen führen zu bedeutenden Variationen der abgeleiteten Proteinsequenz. Tatsächlich sind sie entweder an sehr stark konservierten Stellen des Proteins in wichtigen funktionalen Domänen lokalisiert oder sie führen zu der Synthese eines verkürzten Proteins. Es ist folglich extrem wahrscheinlich, dass diese Veränderungen eine Modifikation der Funktion des Proteins mit sich bringen und folglich eine kausale Wirkung bei dem erstmaligen Auftreten dieser Krankheiten haben.
Die Vielzahl von Erkrankungen, wo diese Mutationen beobachtet werden, legt nahe, dass das IBD1-Gen potentiell bei zahlreichen Entzündungs- und/oder Immunkrankheiten von Bedeutung ist. Dieses Ergebnis ist der Tatsache gegenüberzustellen, dass beschrieben worden ist, dass die perizentromere Region des Chromosoms 16 Suszeptibilitätsgene für verschiedene Krankheiten beim Menschen, wie die ankylosierende Spondylitis oder das Psoriasis-Rheuma, enthält.
Man kann folglich der Auffassung sein, dass IBD1 eine bedeutende Rolle bei einer großen Anzahl von Entzündungs- und/oder Immunerkrankungen spielt.
Insbesondere kann man IBD1 mit den granulomatösen Entzündungskrankheiten in Verbindung bringen. Tatsächlich sind das Blau-Syndrom und MC Erkrankungen, die zu dieser Familie gehören. Man hofft folglich, Variationen in dem IBD1-Gen für die anderen Erkrankungen derselben Familie (Sarkoidose, Behçet-Krankheit...) zu finden.
Außerdem wirft die Beteiligung von IBD1 an den zellulären Wegen, die zur Apoptose führen, die Frage von dessen etwaiger Rolle als Karzinogen auf. Tatsächlich wird erwartet, dass eine Dysregulation von IBD1 zu einer Veranlagung für Krebs führen kann. Diese Hypothese wird gestärkt durch die Tatsache, dass bei den Entzündungskrankheiten des Darms eine Veranlagung für Kolonkrebs existiert. IBD1 könnte diese Anfälligkeit für Krebs teilweise erklären und neue Karzinogenesewege definieren.
Die genaue Beschreibung der in dem IBD1-Gen beobachtbaren Mutationen erlaubt so, die Grundlagen für eine molekulare Diagnostik der Entzündungs- und Immunkrankheiten, wo dessen Rolle gezeigt worden ist, zu legen. Ein solcher Ansatz, der auf der Untersuchung von Mutationen in dem Gen basiert, wird erlauben, einen Beitrag zur Diagnose dieser Krankheiten zu liefern und gegebenenfalls den Umfang von bestimmten ergänzenden invasiven oder kostspieligen Untersuchungen zu verringern. Die Erfindung liefert die Grundlage für eine solche molekulare Diagnostik, welche auf der Untersuchung von Mutationen in IBD1 basiert.
Die molekulare Diagnostik der Entzündungskrankheiten müsste auch erlauben, die nosologische Klassifizierung dieser Krankheiten zu verbessern und Untergruppen von bestimmten erkrankten Personen anhand ihrer klinischen Charakteristiken, des Entwicklungsverlaufs der Krankheit oder dem Ansprechen auf bestimmte Behandlungen besser zu definieren. Als Beispiel könnte die Aufteilung der existierenden Mutationen so erlauben, die gegenwärtig unbestimmten Kolitiden, die mehr als 10% der Entzündungskrankheiten des Darms ausmachen, zu klassifizieren. Ein solcher Ansatz wird erlauben, eine frühe Pflege und Behandlung, welche an jeden Patienten angepasst ist, vorzuschlagen. Allgemein erlaubt ein solcher Ansatz, zu hoffen, binnen einer Frist eine individualisierte Pflege und Behandlung der Erkrankung abhängig von dem genetischen Material von jeder erkrankten Person, einschließlich kurativer und präventiver Maßnahmen, definieren zu können.
Es wird insbesondere ein Verfahren zur Diagnose und/oder zur prognostischen Auswertung einer Entzündungskrankheit oder einer Krebserkrankung bevorzugt, welches dadurch gekenn zeichnet ist, dass man ausgehend von einer biologischen Probe eines Patienten das Vorhandensein von wenigstens einer Mutation und/oder einer Veränderung der Expression des SEQ ID Nr. 1 entsprechenden Gens durch die Analyse der Gesamtheit oder eines Teils einer Nukleinsäuresequenz, welche dem Gen entspricht, bestimmt. Man kann auch das Gen SEQ ID Nr. 3 untersuchen.
Dieses Verfahren zur Diagnose und/oder zur prognostischen Auswertung kann präventiv eingesetzt werden (Untersuchung einer Veranlagung für diese Entzündungskrankheiten oder für die Krebserkrankung) oder um zur Ermittlung und/oder zur Bestätigung eines klinischen Zustands bei einem Patienten zu dienen.
Die Entzündungskrankheit ist vorzugsweise eine Entzündungskrankheit des Magendarmkanals und die Krebserkrankung ist eine Krebserkrankung des Magendarmkanals (Dünndarm oder Kolon).
Die Lehre der Erfindung erlaubt tatsächlich, Kenntnis über die Mutationen zu erlangen, welche ein Kopplungsungleichgewicht bei den Entzündungskrankheiten des Magendarmkanals aufweisen und die folglich mit solchen Krankheiten assoziiert oder verbunden sind.
Die Analyse kann durch Sequenzierung der Gesamtheit oder eines Teils des Gens oder durch andere Methoden, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, erfolgen. Man kann insbesondere auf der PCR basierende Methoden, beispielsweise die PCR-SSCP, die erlaubt, Punktmutationen zu detektieren, einsetzen.
Man kann die Analyse gleichfalls durch Bindung einer erfindungsgemäßen Sonde, welcher einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 oder 3 entspricht, an einen DNA-Chip und die Hybridisierung auf diesen Mikroplatten ausführen. Ein DNA-Chip, welcher eine erfindungsgemäße Sequenz enthält, ist gleichfalls einer der Gegenstände der Erfindung.
Ebenso ist auch ein Chip mit Proteinen, welcher eine Aminosäuresequenz gemäß der Erfindung enthält, ein Gegenstand der Erfindung. Ein solcher Chip mit Proteinen erlaubt die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den erfindungsgemäßen Polypeptiden und anderen Proteinen oder chemischen Verbindungen und kann so für das Screening von Verbindungen, welche mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden wechselwirken, nützlich sein. Man kann gleichfalls die Chips mit Proteinen gemäß der Erfindung einsetzen, um die Anwesenheit von Antikörpern, die gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide gerichtet sind, im Serum von Patienten zu detektie ren. Man kann auch einen Chip mit Proteinen, welcher einen erfindungsgemäßen Antikörper enthält, einsetzen.
Der Fachmann auf diesem Gebiet weiß gleichfalls, Techniken auszuführen, welche die Untersuchung der Veränderung der Expression eines Gens erlauben, beispielsweise durch die Untersuchung der mRNA (insbesondere durch Northern-Blot oder durch RT-PCR-Experimente mit erfindungsgemäßen Sonden oder Primern) oder des exprimierten Proteins, insbesondere durch Western-Blot unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper.
Das Gen, auf welches getestet wird, ist vorzugsweise das Gen mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1, wobei die Entzündungskrankheit, für welche man die Veranlagung vorherzusagen sucht, eine Erkrankung des Magendarmkanals, insbesondere Morbus Crohn oder die hämorrhagische Rektokolitis, ist. Wenn man eine Krebserkrankung zu detektieren sucht, handelt es sich vorzugsweise um Kolonkrebs.
Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf Verfahren zur Gewinnung eines Allels des IBD1-Gens, welches mit einem detektierbaren Phänotyp verbunden ist, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) eine Nukleinsäureprobe von einem Individuum, welches den detektierbaren Phänotyp exprimiert, zu erhalten;
b) die Nukleinsäureprobe mit einem Mittel, welches in der Lage ist, eine das IBD1-Protein kodierende Nukleinsäure spezifisch zu detektieren, in Kontakt zu bringen;
c) die das IBD1-Protein kodierende Nukleinsäure zu isolieren.

Einem solchen Verfahren kann ein Schritt einer Sequenzierung der Gesamtheit oder eines Teils der das IBD1-Protein kodierenden Nukleinsäure folgen, was erlaubt, die Veranlagung für eine Entzündungskrankheit oder eine Krebserkrankung vorherzusagen.
Das Mittel, welches in der Lage ist, eine das IBD1-Protein kodierende Nukleinsäure spezifisch zu detektieren, ist vorteilhafterweise eine Sonde von Oligonukleotiden gemäß der Erfindung, die aus DNA, RNA, PNA, die modifiziert sind oder nicht, gebildet wird. Die Modifikationen können eine radioaktive oder fluoreszierende Markierung umfassen oder auf Modifikationen in den Bindungen zwischen den Basen zurückzuführen sein (beispielsweise Phosphorothioate oder Methylphosphonate). Der Fachmann auf diesem Gebiet kennt die Protokolle, welche es erlauben, eine spezielle DNA-Sequenz zu isolieren. Der Schritt b) des oben beschriebenen Verfahrens kann gleichfalls ein Amplifizierungsschritt, wie zuvor beschrieben, sein.
Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf ein Verfahren zur Detektion und/oder quantitativen Bestimmung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer biologischen Probe, welches die folgenden Schritte umfasst, eine erfindungsgemäße Sonde mit einer biologischen Probe in Kontakt zu bringen, und einer Detektion und/oder quantitativen Bestimmung des zwischen dem Polynukleotid und der Nukleinsäure der biologischen Probe gebildeten Hybrids.
Der Fachmann weiß, ein solches Verfahren auszuführen, und kann insbesondere einen Kit von Reagenzien einsetzen, welcher umfasst:

a) ein Polynukleotid gemäß der Erfindung, welches als Sonde eingesetzt wird;
b) die Reagenzien, die für die Ausführung einer Hybridisierungsreaktion zwischen der Sonde und der Nukleinsäure der biologischen Probe erforderlich sind;
c) die Reagenzien, die für die Detektion und/oder die quantitative Bestimmung des zwischen der Sonde und der Nukleinsäure der biologische Probe gebildeten Hybrids erforderlich sind,

Ein solcher Kit kann gleichfalls Positiv- oder Negativkontrollen enthalten, um die Qualität der erhaltenen Ergebnisse sicherzustellen.
Gleichwohl kann der Fachmann auf diesem Gebiet, um eine erfindungsgemäße Nukleinsäure zu detektieren und/oder quantitativ zu bestimmen, gleichfalls einen Schritt einer Amplifizierung mit Hilfe von Primern, die aus den erfindungsgemäßen Sequenzen ausgewählt werden, ausführen.
Schließlich betrifft die Erfindung gleichfalls die Verbindungen, die aus einer Nukleinsäure, einem Polypeptid, einem Vektor, einer Zelle oder einem Antikörper gemäß der Erfindung ausgewählt werden, oder die Verbindungen, die durch die Screeningverfahren gemäß der Erfindung erhalten werden, als Arzneimittel, insbesondere für die Verhütung und/oder die Behandlung einer Entzündungskrankheit und/oder Immunkrankheit und/oder einer Krebserkrankung, welche mit der Anwesenheit von wenigstens einer Mutation des Gens, entsprechend SEQ ID Nr. 1, vorzugsweise einer Entzündungskrankheit des Magendarmkanals, insbesondere Morbus Crohn oder der hämorrhagischen Rektokolitis, verbunden ist.
Die folgenden Beispiele erlauben es, die Vorteile der Erfindung besser zu verstehen, und dürfen nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung verstanden werden.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Nicht-parametrische genetische Kopplungstests für Morbus Crohn in der perizentromeren Region des Chromosoms 16 (nach Hugot et al., 1996). Multipoint-Kopplungsanalyse basierend auf der Identität anhand von Abstammung für die Marken der perizentromeren Region des Chromosoms 16. Die genetischen Abstände zwischen Markern wurden dank des Programms CRIMAP abgeschätzt. Der Iod-Score (MAPMAKER/SIBS) ist in der linken Figur angegeben. Es wurden zwei Pseudo-Wahrscheinlichkeitstests entwickelt und sind in der rechten Figur angegeben. Der Erste (Tz) ist analog zu dem Test der Mittelwerte. Der Zweite (Tz2) ist analog zu dem Test der Proportion der Paare von erkrankten Personen, welche mit zwei Allelen ausgestattet sind.
2: Nicht-parametrische Multipoint-Analyse der genetischen Kopplung. 78 Familien mit mehreren Verwandten, die an Morbus Crohn leiden, wurden für 26 Polymorphismusmarker in der perizentromeren Region des Chromosoms 16 genotypisiert. Die Lage von jedem Marken wird durch einen Pfeil symbolisiert. Die Reihenfolge der Marker und der Abstand, welcher sie trennt, leiten sich aus der Analyse der experimentellen Daten mit der Crimap-Software ab. Die Pfeile unter der Kurve geben die Marker SPN, D16S409 und D16S411 an, welche in der ersten veröffentlichten Untersuchung (Hugot et al., 1996) eingesetzt worden sind. Die oberhalb der Kurve befindlichen Pfeile entsprechen den Markern D16S3136, D16S541, D16S3117, D16S416 und D16S770, die sich beim Maximum des Tests der genetischen Kopplung befinden Die Typisierungsdaten wurden mit Hilfe des nicht-parametrischen Multipoint-Analysenprogramms der Software Genehunter, Version 1,3, analysiert. Das Maximum des NPL-Score beträgt 3,33 (β = 0,0004).
3: Schematische Darstellung des durch IBD1 kodierten Proteins. Das durch IBD1 kodierte Protein ist horizontal angegeben. Die verschiedenen Domänen, die dieses bilden, sind in der Figur mit der Referenznummer der Aminosäuren, die dem Beginn und dem Ende von jeder Domäne entsprechen, angegeben. Das Protein wird aus einer CARD-Domäne, einer Nukleotidbindungsdomäne (NBD) und aus Leucin-reichen Motiven (LRR) gebildet.
4: Schematische Darstellung des IBD1/NOD2-Proteins in drei mit MC assoziierten Varianten

A: Das von der cDNA-Sequenz des Kandidatengens IBD1 abgeleitete Translationsprodukt ist identisch mit jenem von NOD2 (Ogura et al., 2000). Das Polypeptid enthält 2 CARD-Domänen („CAspase Recruitment Domains"), eine Nukleotidbindungsdomäne (NBD) und 10 Wiederholungen von 27 Aminosäuren, Leucin-reiche Motive (LRR). Die Consensus-Sequenz der Stelle des Motivs A (P-Schleife), welche ATP/GTP bindet, der NBD ist durch einen schwarzen Kreis angegeben. Die Sequenzänderungen, die durch die drei hauptsächlichen, mit MC assoziierten Varianten kodiert werden, sind SNP 8 (R675W), SNP 12 (G881R) und SNP 13 (Rasterver schiebung 980). Die Rasterverschiebung verändert ein Leucin-Codon in ein Prolin-Codon an der Position 980, welches unmittelbar von einem Stop-Codon gefolgt wird.
B: Seltene, zu Aminosäureersetzungen führende Varianten („variants faux sens") von NOD2 bei 457 MC-Patienten, 159 RCH-Patienten und 103 nicht verwandten, nicht erkrankten Individuen. Die Positionen der seltenen, zu Aminosäureersetzungen führenden Varianten sind für die drei Gruppen angegeben. Der Maßstab auf der linken Seite gibt die Anzahl von jeder in den Gruppen, die den Gegenstand der Untersuchung bildeten, identifizierten Variante an und jener auf der rechten Seite misst die Häufigkeit der Mutation. Die Allelhäufigkeiten des Polymorphismus V928I waren nicht signifikant verschieden (0,92:0,08) in den drei Gruppen und die entsprechenden Genotypen waren im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht.

BEISPIELE
Beispiel 1: Genaue Lokalisierung von IBD1
Der erste Schritt in Richtung der Identifizierung des IBD1-Gens ist gewesen, die Größe der genetischen Region von Interesse, die sich anfänglich um den Marken D16S411, welcher zwischen D16S409 und D16S419 (Hugot et al., 1996, und 1) gelegen ist, zentriert erstreckte, zu verringern. Eine Gruppe von nahe gelegenen Markern (Genkarte mit hoher Auflösung) war eingesetzt worden, um die genetische Region besser zu präzisieren, und hat erlaubt, die genetischen Kopplungsanalysen zu vervollständigen und ein genetisches Kopplungsungleichgewicht in Verbindung mit der Krankheit zu untersuchen.
Die Untersuchung ist an 78 Familien, welche wenigstens 2 an MC leidende verwandte Personen umfassten, welche 119 Paaren von erkrankten Personen entsprachen, ausgeführt worden. Die Familien, die an RCH leidende erkrankte Personen umfassten, wurden aus der Untersuchung ausgeschlossen.
Es wurden sechsundzwanzig genetische Polymorphismus-Marker vom Mikrosatelliten-Typ untersucht. Diese Marker bildeten zusammen eine Karte von hoher Auflösung mit einem mittleren Abstand zwischen den Markern in der Größenordnung von 1 cM in der genetischen Region von Interesse. Die Merkmale der untersuchten Marker sind in der Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1: Polymorphe Marker vom Mikrosatelliten-Typ, die für die genaue Lokalisierung von IBD1 eingesetzt wurden
Jeder Marken ist gemäß der internationalen Nomenklatur und häufiger durch den von dem Herkunftslabor vorgeschlagenen Namen aufgenommen. Die Marker erscheinen gemäß ihrer Reihenfolge auf dem Chromosom (von 16p in Richtung von 16q). Der genetische Abstand zwischen den Markern (in centiMorgan Kosambi, berechnet durch das Programm Crimap ausgehend von den experimentellen Daten) ist in der zweiten Spalte angegeben. Der erste polymorphe Marker wird willkürlich als Referenzpunkt angenommen. Die Oligonukleotide, die für die Polymerasekettenreaktion (PCR) gedient haben, sind in der dritten Spalte angegeben.
Die Genotypisierung dieser Mikrosatelliten-Marker beruhte auf der Technik der automatischen Sequenziergeräte unter Verwendung von fluoreszierenden Primern. Kurz zusammengefasst, wurden die fluoreszierenden Polymerasekettenreaktions (PCR)-Produkte nach der Amplifizierung auf einem Polyacrylamidgel auf einem automatischen Sequenziergerät gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Perkin Elmer) abgeschieden. Für jedes Individuum wurde die Größe der Allele dank der Software Genescan^® und Genotyper^® abgeleitet. Die Daten wurden dann in einer integrierten Datenbank, welche die genealogischen, phänotypischen und genetischen Daten enthielt, gespeichert. Sie wurden dann für die genetischen Kopplungsanalysen verwendet.
Während des gesamten Genotypisierungsverfahrens wurden mehrere Qualitätskontrollen ausgeführt:

– doppeltes unabhängiges Lesen der Genotypisierungsdaten,
– Verwendung eines DNA-Standards, welcher als interne Kontrolle dient, für jede elektrophoretische Wanderung,
– Kontrolle des Größenbereichs von jedem beobachteten Allel,
– Untersuchung von Mendelschen Transmissionsfehlern,
– Berechnung des genetischen Abstands zwischen Markern (Programm CRIMAP) und Vergleich von jenem mit den Daten aus der Literatur,
– neue Typisierung der Marker, für welche eine Rekombination zwischen nahe liegenden Markern beobachtet worden war.

Die Genotypisierungsdaten wurden durch nicht-parametrische Multipoint-Analysenmethoden der genetischen Kopplung (Programm GENEHUNTER, Version 1.3) analysiert. Die Informativität des Markersystems lag für die untersuchte Region über 80%. Das Maximum des Tests (NPL = 3,33; P = 0,0004) wurde für die Marker D16S541, D16S3117, D16S770 und D16S416 erhalten (2).
Die Typisierungsdaten für diese 26 Polymorphismusmarker wurden auch bei der Untersuchung eines Transmissionsungleichgewichts analysiert. Es wurden zwei Gruppen von 108 und 76 Familien mit einer oder mehreren erkrankten Personen, die an MC litten, untersucht. Der statistische Transmissionsungleichgewichtstest ist von Spielman et al. (1993) beschrieben worden. In dieser Arbeit ist lediglich eine einzige erkrankte Person pro Familie berücksichtigt worden und der p-Wert ist durch die Anzahl von für jeden untersuchten Marker getesteten Allelen korrigiert worden.
Es ist ein Transmissionsungleichgewicht für die Allele 4 und 5 (Größe 205 bzw. 207 Basenpaare) des Markers D16S3136 (p = 0,05 bzw. p = 0,01) beobachtet worden.
Diese eine Assoziation zwischen dem Marker D16S3136 und MC nahelegenden Ergebnisse haben dazu geführt, eine physische Genomkarte der um D16S3136 zentrierten genetischen Region zu konstruieren und die Sequenz eines Abschnitts von genomischer DNA von großer Größe (BAC), welcher diese polymorphe Stelle enthält, zu ermitteln. Es wurde dann möglich, eine größere Anzahl von Polymorphismus-Markern in der Nachbarschaft von D16S3136 zu identifizieren und zu analysieren wie auch die in der Region vorhandenen transkribierten Sequenzen zu definieren und zu untersuchen.
Beispiel 2: Physische Kartierung der IBD1-Region
Es wurde ein Contig von genomischen DNA-Fragmenten, welches um die Marker D16S3136, D16S3117, D16S770 und D16S416 zentriert war, ausgehend von humanen genomischen DNA-Banken der Fondation Jean Dausset/CEPH erzeugt. Die chromosomalen DNA-Abschnitte wurden ausgehend von bestimmten Polymorphismusmarkern, die bei der genetischen Feinkartierung eingesetzt wurden (D16S411, D16S416, D16S541, D16S770, D16S2623, D16S3035, D16S3117 und D16S3136), identifiziert. Für jeden Marker wurde eine Bank von künstlichen Bakterienchromosomen (BAC) durch PCR auf der Suche nach Klonen, die die Sequenz des Markers enthielten, gescreent. Abhängig davon, ob die getesteten Sequenzen auf den BAC-Klonen vorhanden waren oder nicht, war es dann möglich, die Klone untereinander mit Hilfe der Software Segmap, Version 3.35, zu organisieren.
Man konnte für die BACs eine kontinuierliche Organisation (Contig), welche die genetische Region von Interesse überspannte, gemäß einer Methode, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist (Rouquier et al., 1994; Kim et al., 1996; Asakawa et al., 1997) etablieren. Um dies zu tun, wurden die Enden der identifizierten BACs sequenziert, und diese neuen Sequenzdaten haben dann dazu gedient, die Banken von BACs wiederholt zu screenen. Bei jedem Screening ist das BAC-Contig um einen Schritt vorwärtsgekommen bis zur Erzielung eines Kontinuums von überlappenden Klonen. Die Größe von jedem BAC, welches an dem Contig beteiligt ist, wurde aus dessen Wanderungsprofil auf einem Agarosegel im gepulsten Feld abgeleitet.
Es wurde so ein BAC-Contig konstruiert, welches 101 BACs enthielt und sich über eine globale Distanz von mehr als 2,5 Mb mit einer mittleren Redundanz von 5,5 BAC an jedem Punkt des Contigs erstreckte. Die mittlere Größe der BACs beträgt 136 kb.
Beispiel 3: Sequenzierung des BAC hb87b10
Das BAC dieses Contigs, welches den Polymorphismusmarker D16S3136 enthält (bezeichnet als hb87b10), dessen Größe 163761 bp war, ist gemäß der sogenannten „Shotgun" ("coup de fusil")-Methode sequenziert worden. Kurz zusammengefasst, wird die DNA des BAC durch Beschallen fragmentiert. Die so erzeugten DNA-Fragmente wurden einer Agarosegelelektrophorese unterworfen und jene, deren Größe über 1,5 kb war, wurden eluiert, um analysiert zu werden. Diese Fragmente wurden dann in den Phagen m13 kloniert, welcher seinerseits in Bakterien, die durch Elektroporation kompetent gemacht worden waren, eingeführt wurde. Nach der Kultivierung wurde die DNA der Klone gewonnen und durch automatische Sequenzierungsmethoden mit Hilfe von fluoreszierenden Primern des Vektors m13 an einem automatischen Sequenziergerät sequenziert.
Es wurden 1526 unterschiedliche Sequenzen mit einer mittleren Größe von 600 bp erzeugt, die untereinander dank der Software Polyphredphrap^® organisiert wurden, was zu einem Sequenzcontig führte, welches die Gesamtheit des BAC abdeckte. Die so erzeugte Sequenz wies eine mittlere Redundanz von 5,5 Genomäquivalenten auf. Die seltenen (n = 5) Sequenzintervalle, die in der Bank von m13-Klonen nicht repräsentiert sind, wurden aufgefüllt unter Erzeugung von spezifischen PCR-Primern auf beiden Seiten dieser Intervalle und unter Analysieren des von der genomischen DNA eines gesunden Individuums abgeleiteten PCR-Produkts.
Es wurden Sequenzhomologien mit in den öffentlichen Gendatenbanken (Genbank) verfügbaren Sequenzen untersucht. In diesem Intervall von 163 kb konnte keinerlei bekanntes Gen identifiziert werden. Es befanden sich darin mehrere EST, was nahe legt, dass unbekannte Gene in dieser Sequenz enthalten sind. Diese aus den öffentlichen Gendatenbanken (Genbank, GDB, Unigene, dbEST) stammenden EST tragen die folgenden Bezeichnungen: AI167910, AI011720, Rn24957, Mm30219, hs132289, AA236306, hs87296, AA055131, hs151708, AA417809, AA417810, hs61309, hs116424, HUMGS01037, AA835524, hs105242, SHGC17274, hs146128, hs122983, hs87280 und hs135201. Die Untersuchung von mutmaßlichen Exons mit Hilfe des Computerprogramms GRAIL hat erlaubt, mehrere potentielle Exons, Polyadenylierungsstellen und Promotorsequenzen zu identifizieren.
Beispiel 4: Untersuchung des Transmissionsungleichgewichts
Es wurden in einer Region, welche sich über ungefähr 250 kb erstreckte und um das BAC hb87b10 zentriert war, 12 biallelische Polymorphismusmarker (SNP) identifiziert. Diese Polymorphismen wurden durch Analyse der Sequenz von ca. 10 voneinander unabhängigen erkrankten Personen, die an MC litten, erzeugt. Die Sequenzierung wurde zumeist auf der Ebene von ESTs, die bekannt waren und sich auf dem BAC oder in dessen Nachbarschaft befanden, ausgeführt. Es wurden auch mutmaßliche Exons, die durch das Computerprogramm GRAIL vorausgesagt worden sind, analysiert. Die Merkmale der so identifizierten polymorphen Marken sind in der Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Merkmale von in der Region von IBD1 untersuchten biallelischen Polymorphismusmarkern

PCR-AS: PCR-Allel-spezifisch; LO: Ligierung von Oligonukleotiden

In dieser Tabelle sind die im Rahmen dieser Arbeit neu beschriebenen 12 biallelischen Polymorphismusmarker aufgenommen. Für jeden von diesen werden angegeben:

– der Locus (Genort) (Spalte I),
– der Name (Spalte II),
– die eingesetzte Genotypisierungstechnik (Spalte III),
– das gegebenenfalls eingesetzte Restriktionsenzym (Spalte IV),
– die für die Polymerasekettenreaktion oder für die Ligierung verwendeten Oligonukleotid-Primer (Spalte V),
– die Größe der während der Typisierung erwarteten Produkte (Spalte VI).

199 Familien, welche 1 oder mehrere erkrankte Personen, die an MC litten, umfassten, wurden hinsichtlich dieser 12 Polymorphismusmarker wie auch hinsichtlich der Marker D16S3035 und D16S3136, die auf dem BAC hb87b10 lokalisiert waren, typisiert. Die Familien, die an RCH leidende erkrankte Personen umfassten, wurden nicht berücksichtigt. Die Verfahren zur Typisierung der untersuchten Polymorphismen waren abhängig von der Art des Polymorphismus variabel, wobei herangezogen wurden:

– die Technik der PCR-RFLP (Amplifizierung, gefolgt von einem enzymatischen Verdau des PCR-Produkts), wenn sich der Polymorphismus an einer Restriktionsenzymstelle befand.
– PCR mit für die polymorphe Stelle spezifischen Primern: differenzielle Amplifizierung der beiden Allele unter Verwendung der für jedes Allel spezifischen Primer.
– Ligationstest von Oligonukleotiden: differenzielle Ligation unter Verwendung der für jedes Allel spezifischen Oligonukleotide, gefolgt von einer Polyacrylamidgelelektrophorese.

Die Typisierungsdaten wurden dann gemäß einem Transmissionsungleichgewichtstest analysiert (Computerprogramm TDT der Software GENEHUNTER, Version 2). Bei den Familien, die mehrere erkrankte Verwandte umfassten, wurde nur eine einzige erkrankte Person für die Analyse berücksichtigt. Tatsächlich wirft die Berücksichtigung von mehreren verwandten erkrankten Personen das Problem der fehlenden Unabhängigkeit der Daten in den statistischen Berechnungen auf und kann eine Aufblähung des Werts des Tests induzieren. Die erkrankte Person, die für die Analyse dient, wurde innerhalb von jeder Familie durch eine automatische Randomisierungsprozedur ausgelost. Unter Berücksichtigung dieser Randomisierung repräsentiert der erhaltene Wert des statistischen Tests lediglich eine einzige mögliche, aus der Gruppe von untersuchten Familien stammende Probe. Um die Analyse nicht auf diese einzige mögliche Probe zu beschränken und um die Robustheit der erhaltenen Ergebnisse besser zu erfassen, wurden so für jeden Test ca. einhundert zufallsgesteuerte Proben erzeugt und analysiert.
Die Marken wurden getrennt, dann gruppiert gemäß ihrer Reihenfolge auf dem Chromosomenabschnitt untersucht (KIAA0849ex9 (Locus 1), hb27G11F (Locus 2), Ctg22Ex1 (Locus 3), SNP1 (Locus 4), ctg2931-3ac/ola (Locus 5), ctg2931-5ag/ola (Locus 6), SNP3-2931 (Locus 7), Ctg25Ex1 (Locus 8), CTG35ExA (Locus 9), ctg35ExC (Locus 10), d16s3136 (Locus 11), hb133D1f (Locus 12), D16S3035 (Locus 13), ADCY7int7 (Locus 14)) (Tabelle 2). Die 2, 3 und 4 aufeinanderfolgende Marker umfassenden Haplotypen wurden so unter Verwendung stets der gleichen Strategie analysiert (100 zufällige Proben unter Hinzuziehung von einem einzigen erkrankten Individuum für jede Familie).
Für jede getestete Probe wurden lediglich die Genotypen (oder Haplotypen), welche wenigstens 10 Elternchromosomen enthielten, berücksichtigt. Im Mittel wurden so 250 unterschiedliche Tests für jede Probe ausgeführt. Es ist dann möglich gewesen, die Anzahl von erwarteten positiven Tests für jedes Signifikanzniveau abzuleiten und diese Verteilung mit der beobachteten Verteilung zu vergleichen. Bei den gesunden Individuen unterscheidet sich die Verteilung der Tests nicht von jener, die gemäß dem Zufall erwartet wird (χ² = 2,85, ddl = 4, p = 0,58). Bei den kranken Individuen existiert im Gegensatz dazu ein Überschuss an positiven Tests, welcher die Existenz eines Transmissionsungleichgewichts in der untersuchten Region belegt.
Zieht man die Ergebnisse der Transmissionsungleichgewichtstests für jeden Polymorphismusmarker einzeln und für die Haplotypen, die die stärksten Transmissionsungleichgewichte zeigen, heran, haben diese gezeigt, dass die folgenden Marker im Kopplungsungleichgewicht bezüglich dieser Krankheit stehen: Ctg22Ex1 (Locus 3), SNP1 (Locus 4), ctg2931-5ag/ola (Locus 6), SNP3-2931 (Locus 7), Ctg25Ex1 (Locus 8) und ctg35ExC (Locus 10). Diese Marker erstrecken sich über eine Region von ungefähr 50 kb (Positionen 74736 bis 124285 auf der Sequenz von hb87b10).
Die am stärksten mit Morbus Crohn assoziierten Haplotypen erstrecken sich ihrerseits auch in dieser Region. So war für die Mehrzahl der zufällig ausgewählten Proben der Transmissionstest positiv (p < 0,01) für Haplotypen, die die folgenden Marker kombinieren:

– Locus 5-6, Locus 6-7, Locus 7-8, Locus 8-9, Locus 9-10, Locus 10-11,
– Locus 5-6-7, Locus 6-7-8, Locus 7-8-9, Locus 8-9-10, Locus 9-10-11,
– Locus 5-6-7-8; Locus 6-7-8-9, Locus 7-8-9-10.

Der Suszeptibilitätshaplotyp mit dem höchsten Risiko wird durch die Loci 7 bis 10 definiert. Es handelt sich um den Haplotyp 1-2-1-2- (Tabelle 2).
Die getesteten Marker sind, wie erwartet, am häufigsten untereinander im Kopplungsungleichgewicht.
Vor kürzerer Zeit ist ein neuer Test, der im Juli 2000 veröffentlichte „Pedigree Disequilibrium Test" (PDT) (Martin et al., 2000) verwendet worden, um die Signifikanz der mit dem TDT-Computerprogramm erhaltenen Ergebnisse besser zu erfassen. Diese neue Statistik erlaubt es tatsächlich, die Gesamtheit der in einer Familie verfügbaren Informationen sowohl ausgehend von den erkrankten Individuen als auch ausgehend von den gesunden Individuen zu verwenden und die Bedeutung von jedem Verwandten in einer globalen Statistik für jede Familie zu gewichten. Die Werte von p, die den PDT-Tests entsprechen und für eine auf 235 Familien mit einem oder mehreren, an Morbus Crohn leidenden Verwandten, ausgedehnte Gruppe erhalten worden sind, sind in der Tabelle 3 angegeben. Diese neue Analyse bestätigt, dass die Region des BAC hb87b10 gut mit Morbus Crohn assoziiert ist.
Tabelle 3. Ergebnis der PDT-Tests, ausgeführt an 235 an Morbus Crohn erkrankten Familien (NS: nicht signifikant)
Beispiel 5: Identifizierung des IBD-Gens
Die veröffentlichten und auf dem BAC hb87b10 vorhandenen Gruppierungen von ESTs (Referenzen Unigene: Hs 135201, Hs87280, Hs122983, Hs146128, Hs105242, Hs116424, HS61309, Hs151708, Hs 87296 und Hs 132289) wurden bei der Suche nach einer vollständigeren Sequenz von komplementärer DNA (cDNA) untersucht. Für IBD1prox wurden die in den öffentlichen Banken verfügbaren Klone sequenziert und die Sequenzen untereinander organisiert. Für IBD1 wurde eine cDNA-Bank aus peripherem Blut („Stratagene human blood cDNA lambda zapexpress" Ref. 938202) durch die ausgehend von den bekannten EST erzeugten PCR-Produkte gemäß den vom Hersteller vorgeschlagenen Modalitäten gescreent. Die Sequenz der so identifizierten cDNAs diente dann für ein neues Screening der cDNA-Bank und so fort bis zur Gewinnung der vorgestellten cDNA.
Das EST hs135201 (UniGene) hat erlaubt, eine cDNA zu identifizieren, die nicht in den verfügbaren Gendatenbanken (Genbank) auftaucht. Sie entspricht folglich einem neuen humanen Gen. Der Vergleich der Sequenz der cDNA und der genomischen DNA hat gezeigt, dass dieses Gen aus 11 Exons und 10 Introns gebildet wird. Ein ergänzendes Exon an einer Position 5' bezogen auf die identifizierte cDNA wird durch die Analyse der Sequenz mit der Grail-Software vorhergesagt. Diese Exons sind sehr homolog mit den ersten Exons des Gens CARD4/NOD1. Unter Berücksichtigung der Gesamtheit der identifizierten Exons und des mutmaßlichen ergänzenden Exons scheint dieses neue Gen eine genomische Struktur zu haben, die jener von CARD4/NOD1 sehr nahe kommt. Außerdem taucht strangaufwärts von dem ersten mutmaßlichen Exon eine Transkriptionsstartstelle auf. Aus der Gesamtheit dieser Gründe wurde davon ausgegangen, dass das mutmaßliche Exon an diesem neuen Gen beteiligt ist. Die im Anhang (SEQ ID Nr. 1) angegebene cDNA umfasst folglich die Gesamtheit der identifizierten Sequenz plus die durch die Computermodellierung vorhergesagte Sequenz, wobei die cDNA willkürlich bei dem ersten ATG-Codon der vorerwähnten kodierenden Sequenz beginnt. Auf dieser Grundlage würde das Gen 12 Exons und 11 Introns umfassen. Die Intron-Exon-Struktur des Gens ist in der SEQ ID Nr. 3 angegeben.
Die aus der Nukleotidsequenz abgeleitete Proteinsequenz umfasst 1041 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 2). Diese Sequenz wurde in den biologischen Datenbanken (Genpept, pri, swissprot) nicht mehr gefunden.
Indessen konnte vor kürzerer Zeit das oben beschriebene mutmaßliche Exon nicht bestätigt werden. Das IBD1-Gen umfasst folglich lediglich 11 Exons und 10 Introns und kodiert ein Protein von 1013 Aminosäuren (d.h. 28 Aminosäuren weniger als anfänglich bestimmt).
Die Untersuchung der abgeleiteten Proteinsequenz zeigt, dass dieses Gen drei unterschiedliche funktionale Domänen enthält (3):

– eine CARD-Domäne („Caspase Recruitment Domain"), welche dafür bekannt ist, an der Wechselwirkung zwischen die Apoptose und die Aktivierung des NFkappa B-Wegs regulierenden Proteinen beteiligt zu sein. Die CARD-Domäne erlaubt, dieses neue Protein in die Familie der CARD-Proteine einzustufen, deren ältere Mitglieder CED 4, APAF1 und RICK sind.
– Eine NBD-Domäne („Nucleotide Binding Domaine"), welche eine ATP-Erkennungsstelle und eine Magnesium-Bindungsstelle umfasst. Das Protein muss folglich eine sehr wahrscheinliche Kinaseaktivität aufweisen.
– eine LRR-Domäne („Leucin Rich Domain"), von welcher angenommen wird, dass sie an der Wechselwirkung zwischen Proteinen durch Analogie mit anderen beschriebenen Proteindomänen teilnimmt.

Außerdem erlaubt die LRR-Domäne des Proteins, das Protein in eine Familie von Proteinen einzugliedern, welche an der intrazellulären Signalisierung beteiligt und sowohl bei den Pflanzen als auch bei den Tieren vorhanden ist.
Der Vergleich dieses neuen Gens mit den zuvor identifizierten und in den öffentlichen Datenbanken verfügbaren Genen zeigt, dass jenes sehr homolog mit CARD4/NOD1 (Bertin et al., 1999; Inohara et al., 1999) ist. Diese Homologie bezieht sich auf die Sequenz der cDNA, die Intron-Exon-Struktur des Gens und die Proteinsequenz. Die Sequenzidentität der 2 cDNAs beträgt 58%. Eine Ähnlichkeit wird gleichfalls auf der Ebene der Intron-Exon-Struktur beobachtet. Die Sequenzhomologie auf Proteinebene liegt in der Größenordnung von 40%.
Die Ähnlichkeit zwischen diesem neuen Gen und CARD4/NOD1 legt nahe, dass das Protein IBD1 wie CARD4/NOD1 an der Regulation der Apoptose und der Aktivierung von NF-kappa B beteiligt ist (Bertin et al., 1999; Inohara et al., 1999). Die Regulation der zellulären Apoptose und die Aktivierung von NF-kappa B sind intrazelluläre Signalisierungswege, die bei den Immunreaktionen essentiell sind. Tatsächlich sind diese Signaltransduktionswege Effektorwege der Proteine aus der Familie des TNF („Tumor Necrosis Factor")-Rezeptors, welche an den Zell-Zell-Wechselwirkungen und der zellulären Reaktion auf die verschiedenen Vermittler von Entzündungen (Zytokine) beteiligt sind. Das neue Gen erscheint folglich allgemein als potentiell für die Entzündungsreaktion von Bedeutung.
Mehrere Beweisstränge kommen der Deregulation von NF-kB, welche durch Bakterien bei Morbus Crohn induziert wird, zu Hilfe. Zu allererst ist die Anfälligkeit für spontane IBD bei der Maus mit Mutationen in TIr4, einem Molekül, das dafür bekannt ist, an die LPS durch das Zwischenglied von dessen LRR-Domäne zu binden (Poltorak et al., 1998, und Sundberg et al., 1994) und ein Mitglied der Aktivatoren aus der Familie der NF-kB zu sein, in Verbindung gebracht worden. Zweitens bewirkt die Antibiotikatherapie eine vorübergehende Besserung bei den an MC leidenden Patienten, was die Hypothese glaubwürdig erscheinen lässt, dass die enterischen Bakterien eine ätiologische Rolle bei Morbus Crohn spielen können (McKay, 1999). Drittens spielt NF-kB eine fundamentale Rolle bei den Entzündungskrankheiten des Darms und wird in den mononukleären Zellen der Lamina propria bei Morbus Crohn aktiviert (Schreiber et al., 1998). Viertens basiert die Behandlung von Morbus Crohn auf der Verwendung von Sulfasalazin und Glucocorticoiden, welche alle beide dafür bekannt sind, Inhibitoren von NF-kB zu sein (Auphan et al., 1995, und Wahl et al., 1998).
Vor noch kürzerer Zeit ist gezeigt worden, dass das Kandidatengen IBD1 ein Protein kodiert, das sehr ähnlich zu NOD2, einem Mitglied der CED4/APAF1-Superfamilie, ist (Ogura et al., 2000). Die Nukleotid- und Proteinsequenzen von IBD1 und NOD2 unterscheiden sich in der Realität lediglich hinsichtlich eines kurzen Abschnitts ganz am Anfang der 2 berichteten Sequenzen. Die Gewebeexpression von Nod2 und IBD1 sind überdies deckungsgleich. Diese beiden Gene (Proteine) können folglich als identisch angesehen werden. Es ist gezeigt worden, dass die LRR-Domäne von Nod2 eine Bindungsaktivität für die bakteriellen Lipopolysaccharide (LPS) hat (Inohara et al., 2000) und dass ihre Deletion den NFkB-Weg stimuliert. Dieses Ergebnis bestätigt die Daten der Erfindung.
Die Gewebeexpression von IBD1 wurde dann durch die Northern-Blot-Technik untersucht. In den meisten der humanen Gewebe ist ein Transkript von 4,5 kb sichtbar. Die Größe des Transkripts stimmt mit der aus der cDNA vorhergesagten Größe überein. Das Transkript von 4,5 kb scheint im Dünndarm und im Kolon in einer sehr geringen Menge vorhanden zu sein. Es wird im Gegensatz dazu in den Leukozyten sehr stark exprimiert. Dies stimmt mit klinischen Daten bei Transplantationen überein, die nahe legen, dass Morbus Crohn potentiell eine Krankheit ist, die mit den zirkulierenden Immunzellen verbunden ist. Tatsächlich verhindern bei Morbus Crohn intestinale Transplantationen nicht das Rezidiv hinsichtlich des Transplantats, wohingegen die Transplantation von Knochenmark eine vorteilhafte Wirkung auf die Entwicklung der Krankheit zu haben scheint.
Bestimmte Daten lassen gleichfalls an ein alternatives Spleißen denken, was sich als ein bedeutendes Element bei der Möglichkeit, Mutanten zu erzeugen, die eine Rolle bei der Entwicklung von Entzündungskrankheiten spielen könnten, erweisen könnte.
Der Promotor des IBD1-Gens ist gegenwärtig nicht mit Genauigkeit identifiziert. Es ist indessen vernünftig, anhand von Analogie mit einer sehr großen Anzahl von Genen anzunehmen, dass dieser sich wenigstens zum Teil unmittelbar strangaufwärts von dem Gen in dem 5'-Abschnitt von jenem befindet. Diese genetische Region enthält transkribierte Sequenzen, wie dies die Anwesenheit von EST (HUMGS01037, AA835524, hs.105242, SHGC17274, hs.146128, hs.122983, hs.87280) belegt. Die ATCC-Klone, die diese Sequenzen enthalten, wurden im Labor sequenziert und analysiert, was erlaubte, eine Organisation von Exons und Introns mit etwaigen alternativen Spleißungen nachzuweisen. Diese Daten legen die Existenz eines anderen Gens (welches aufgrund seiner Nähe zu IBD1 als IBD1 prox bezeichnet wird) nahe. Es wird über die partielle Sequenz der cDNA von IBD1prox (SEQ ID Nr. 4) ebenso wie über dessen Intron-Exon-Struktur in SEQ ID Nr. 6 berichtet.
Die Translation der IBD1prox entsprechenden cDNAs führt zu einem Protein, welches eine Homöobox enthält. Die Analyse von mehreren cDNAs des Gens legt indessen die Existenz von alternativen Spleißungen nahe. IBD1prox entspricht gemäß einer der möglichen alternativen Spleißungen dem anonymen EST HUMGS01037, dessen RNA auf bedeutendere Weise in den differenzierten leukozytären Linien als in den nicht-differenzierten Linien exprimiert wird.
So ist es möglich, dass dieses Gen eine Rolle bei der Entzündung und der zellulären Differenzierung spielen könnte. Es kann folglich seinerseits auch als ein guter Kandidat für die Anfälligkeit für die MICI angesehen werden. Die Verbindung zwischen MC und dem Polymorphismus ctg35 ExC, welcher auf der IBD1prox kodierenden Sequenz lokalisiert ist, bestärkt diese Hypothese, auch wenn dieser Polymorphismus keinerlei Sequenzvariation auf Proteinebene mit sich bringt.
Schließlich legt vor noch kürzerer Zeit die Existenz einer genetischen Kopplung in den an Morbus Crohn leidenden Familien und solchen, die keine Mutation des IBD1-Gens aufweisen, auch ihrerseits nahe, dass IBD1 prox eine zusätzliche Rolle zu IBD1 bei der genetischen Veranlagung für die Krankheit spielt.
Die funktionale Beziehung zwischen IBD1 und IBD1prox ist gegenwärtig nicht geklärt. Gleichwohl könnte die große Nähe zwischen den beiden Genen eine Wechselwirkung zwischen diesen reflektieren. In diesem Falle legt die entgegengesetzte Lokalisation dieser Gene nahe, dass sie gemeinsame oder wechselseitig abhängige Regulationsweisen haben könnten.
Beispiel 6: Identifizierungen von Mutationen des IBD1-Gens bei Entzündungskrankheiten
Um die Rolle von IBD1 bei den Entzündungskrankheiten zu bestätigen, wurden die kodierende Sequenz und die Intron-Exon-Verbindungsstellen des Gens vom Exon 2 bis zum Exon 12 einschließlich bei 70 unabhängigen Individuen sequenziert, nämlich: 50 an MC leidenden erkrankten Personen, 10 an RCH leidenden erkrankten Personen, 1 am Blau-Syndrom leidenden erkrankten Person und 9 gesunden Vergleichspersonen. Die untersuchten erkrankten Personen waren zumeist familiäre Formen der Krankheit und waren häufig Träger des Suszeptibilitäts haplotyps, der durch die Untersuchung des Transmissionsungleichgewichts definiert wird. Die gesunden Vergleichspersonen waren von kaukasischer Herkunft.
24 Sequenzvarianten konnten so bei dieser Gruppe von 70 nicht verwandten Personen identifiziert werden (Tabelle 3).
Die Nomenklatur der angegebenen Mutationen nimmt Bezug auf die anfängliche Sequenz des Proteins, welche 1041 Aminosäuren umfasst. Die Nomenklatur, die vor kürzerer Zeit vorgeschlagen worden ist, wird leicht abgeleitet, indem von der anfänglichen Sequenz 28 Aminosäuren abgezogen werden, und entspricht folglich einem Protein, welches 1013 Aminosäuren umfasst (siehe Beispiel 5).
Tabelle 4. In dem IBD1-Gen beobachtete Mutationen
Es sind die anderen Mutationen als die Stummen, die in jedem Exon beobachtet werden, angegeben. Sie werden angegeben durch die Variation der Peptidkette. Für jede Mutation und für jeden untersuchten Phänotyp ist die Anzahl von Malen, wo die Mutation beobachtet wird, bezogen auf die Anzahl von getesteten Chromosomen angegeben.
In den Exons 1 bis 3 (welche der CARD-Domäne des Proteins entsprechen) wurde keinerlei funktionale Sequenzvariante identifiziert. Die Exons 7 und 12 haben ebenfalls keine Sequenzvariation gezeigt. Bestimmte Varianten entsprachen bereits identifizierten und für die Untersuchungen des Transmissionsungleichgewichts typisierten Polymorphismen, nämlich:

– Snp3-2931: Nukleotidvariante T806C, Proteinvariante S269P
– ctg2931-5ag/ola: Nukleotidvariante T1380C (stumm)
– ctg2931-3ac/ola: Nukleotidvariante T1764G (stumm)
– SNP1: Nukleotidvariante C2107T, Proteinvariante R703W.

Mehrere Sequenzvariationen waren stumm (G417A, C537G, C1284A, C1287T, T1380C, T1764G, C2928T) und brachten keine Modifikation der Proteinsequenz mit sich. Sie wurden hier nicht weiter untersucht.
Bei den 16 nicht-stummen Sequenzvariationen wurden Proteinsequenzvarianten bei 43/50 MC-Patienten gegenüber 5/9 gesunden Vergleichspersonen und 6/10 RCH-Patienten beobachtet. Die Existenz von einer oder mehreren Sequenzvariation(en) schien mit dem MC-Phänotyp verbunden zu sein. Es existierten häufig mehrere Sequenzvariationen bei ein und demselben Individuum, das an MC litt, was eine manchmal rezessive Wirkung des Gens für die MC nahe legt. Im Gegensatz dazu wurde keinerlei Homozygotie oder zusammengesetzte Heterozygotie unter den an RCH leidenden Patienten oder unter den gesunden Vergleichspersonen beobachtet.
Bestimmte nicht-stumme Varianten waren gleichermaßen bei den an RCH oder MC leidenden erkrankten Personen und bei den gesunden Individuen vorhanden. Es handelte sich um die Varianten S269P, N290S, R703W und V956I, welche sich in den Exons 2, 4 und 9 befinden. Es erscheinen folglich ergänzende Informationen erforderlich, bevor eine etwaige funktionale Rolle diesen Sequenzvarianten zugeschrieben werden kann.
V956I ist eine konservative Sequenzvariation (aliphatische Aminosäuren).
Die Sequenzvariante S269P entspricht einer Variation der Aminosäureklasse (hydroxyliert zu Immunosäure) am Beginn der Domäne, welche die Nukleotide bindet. Diese steht im Transmissionsungleichgewicht mit MC. Es handelt sich tatsächlich um den Polymorphismus Snp3 (siehe oben).
R703W führt zu einer Modifikation der Aminosäureklasse (aromatisch anstelle von basisch). Diese Modifikation tritt in der intermediären Region zwischen den Domänen NBR und LRR, einer zwischen IBD1 und CARD4/NOD1 konservierten Region, ein. Für diesen Polymorphismus kann folglich eine funktionale Rolle vermutet werden. Diese Sequenzvariation (welche der polymorphen Snp1-Stelle entspricht) wird häufiger bei den an MC leidenden erkrankten Personen übertragen, als dies der Zufall erfordert (siehe oben), was bestätigt, dass dieser Polymorphismus mit MC verbunden ist. Es ist möglich, dass das Vorhandensein dieser Mutante bei den gesunden Personen eine unvollständige Penetranz der Mutation bezeugt, wie dies für die komplexen genetisch-bedingten Erkrankungen, wie die chronischen Entzündungskrankheiten des Darms, erwartet wird.
Die Variante R704C, die sich unmittelbar neben R703W befindet, konnte zugleich bei MC und bei der RCH identifiziert werden. Sie entspricht ihrerseits auch einer nicht-konservativen Variation des Proteins (schwefelhaltige Aminosäure anstelle einer basischen) in der gleichen Proteinregion, was eine ebenso bedeutende funktionale Auswirkung für R704C wie für R703W nahe legt.
Andere Sequenzvariationen sind spezifisch für MC, für die RCH oder das Blau-Syndrom.
Bestimmte Sequenzvariationen sind im Gegensatz dazu selten, nur bei einem oder einigen wenigen Erkrankten vorhanden (A613T, R704C, E844K, N853S, M864V, A919D). Es handelt sich stets um Variationen, die nicht-konservative Modifikationen des Proteins in Leucin-reichen Domänen, an wichtigen Positionen innerhalb dieser Domänen mit sich bringen. Diese verschiedenen Elemente legen nahe, dass diese Varianten eine funktionale Rolle spielen.
Bei einer ziemlich großen Anzahl von Morbus Crohn-Fällen (7/50 und 16/50) werden zwei Sequenzvariationen gefunden (G909R, L1008P*), wohingegen diese bei den Vergleichspersonen oder bei den an RCH leidenden erkrankten Personen nicht detektiert werden.
Die Deletion/Insertion eines Guanosins auf der Höhe des Codons 1008 führt zu einer Umwandlung des dritten Leucins der alpha-Helix der letzten LRR zu Prolin, gefolgt von einem STOP-Codon (L1008P*). Diese Sequenzvariation bringt folglich eine bedeutende Modifikation des Proteins mit sich: Verringerung der Größe des Proteins (Protein, welches eine verkürzte LRR-Domäne aufweist) und Veränderung einer sehr stark konservierten Aminosäure (Leucin). Diese Sequenzmodifikation ist mit MC verbunden, wie dies eine Untersuchung des Transmissionsungleichgewichts bei 16 Familien, die die Mutation tragen (P = 0,008), belegt.
Die Mutation G909R tritt bei der letzten Aminosäure des sechsten LRR-Motivs auf. Sie ersetzt eine aliphatische Aminosäure durch eine basische Aminosäure. Diese Variation ist potentiell von Bedeutung, berücksichtigt man den gewöhnlich neutralen oder polaren Charakter der Aminosäuren an terminaler Position der Leucin-reichen Motive (ebenso für IBD1 wie für NOD1/CARD4) und den konservierten Charakter dieser Aminosäure bei den Proteinen IBD1 und NOD1/CARD4.
Bei dem Blau-Syndrom waren die erkrankten Personen (n = 2) der untersuchten Familie Träger einer speziellen Sequenzvariation (L470F), welche im Exon 4 lokalisiert ist und der NBD-Domäne des Proteins entspricht. In dieser Reihe war diese Sequenzvariante spezifisch für das Blau-Syndrom.
Bei der RCH wurden ebenfalls mehrere Sequenzvarianten, die bei den gesunden Individuen nicht gefunden werden, identifiziert. Der Anteil von erkrankten Personen, die eine Mutation tragen, war geringer als bei MC, wie erwartet wurde, berücksichtigt man die weniger stark etablierte Kopplung zwischen IBD1 und der RCH und den vermuteten weniger genetisch-bedingten Charakter dieser letztgenannten Krankheit. Bei MC und bei der RCH treten gemeinsame Sequenzvariationen auf (R703W, R704C). Andere erweisen sich im Gegensatz dazu als spezifisch für die RCH (V794M). Diese Beobachtung erlaubt, zu bestätigen, dass MC und RCH Krankheiten sind, die wenigstens teilweise die gleiche genetische Prädisposition teilen. Sie legt die Grundlagen für eine nosologische Klassifizierung der MICI.
Die Untersuchung der Sequenzvarianten des IBD1-Gens hat folglich erlaubt, mehrere Varianten, die eine sehr wahrscheinliche funktionale Wirkung haben (Bsp. verkürztes Protein) und die mit Morbus Crohn, der RCH und dem Blau-Syndrom verbunden/assoziiert sind zu identifizieren.
Der Promotor des Gens ist gegenwärtig nicht bestimmt. Indessen befindet sich jener aller Wahrscheinlichkeit nach wahrscheinlich in der 5'-Region strangaufwärts des Gens. Nach dieser Hypothese können die in dieser Region beobachteten Sequenzvarianten eine funktionale Wirkung haben. Dies könnte die sehr starke Verbindung zwischen MC und bestimmten polymorphen Loci, wie ctg35 Exc oder Ctg25Ex1 erklären.
Die Erfindung liefert auch die erste Beschreibung von Mutationen in der Familie der Gene, welche eine CARD-Domäne enthalten, beim Menschen. Die Häufigkeit dieser Mutationen bei verschiedenartigen Entzündungskrankheiten zeigt, dass das IBD1-Gen eine essentielle Rolle bei dem normalen und pathologischen Entzündungsprozess spielt. Diese Erfindung liefert neue Wege zum Verständnis und für die Forschung auf dem Gebiet der Pathophysiologie der normalen und pathologischen Entzündungsprozesse. Sie erlaubt aus diesem Grunde, die Entwicklung von neuen pharmazeutischen Molekülen, die die durch IBD1 kontrollierten Effektor- oder Wir kungswege regulieren und bei der Behandlung der Entzündungskrankheiten und der Regulation des Entzündungsprozesses im Allgemeinen nützlich sind, ins Auge zu fassen.
Beispiel 7: Grundlagen für eine biologische Diagnostik der Anfälligkeit für Morbus Crohn
Vor kürzerer Zeit wurden 457 unabhängige Patienten, die an Morbus Crohn litten, 159 unabhängige Patienten, die an hämorrhagischer Rektokolitis litten und 103 gesunde Vergleichspersonen auf der Suche nach Mutationen untersucht. Diese Arbeit hat erlaubt, die Mutationen, über die zuvor berichtet worden ist, zu bestätigen und ergänzende Mutationen, die in der 4 angegeben sind, zu identifizieren. Die hauptsächlichen Mutationen wurden dann bei 235 an Morbus Crohn leidenden Familien genotypisiert. Diese jüngere Arbeit wird erläutert unter Verwendung der kürzeren Proteinsequenz (1013 Aminosäuren, siehe Beispiel 5) als Referenz, aber die frühere Nomenklatur der Mutationen wird leicht ausgehend von dieser Letzteren unter Hinzufügung von 28 zu der Zahl, welche die Position der Aminosäuren angibt, abgeleitet.
Unter den 5 häufigsten Mutationen ist die konservative Mutation V928I (früher V956I) nicht signifikant mit der einen oder der anderen der Entzündungskrankheiten des Darms verbunden und scheint folglich keine bedeutende Rolle bei der Krankheit zu spielen.
Die Mutation S241P (früher S269P) steht im Kopplungsungleichgewicht mit den anderen hauptsächlichen Mutationen und scheint ihrerseits keine bedeutende Rolle bei der Anfälligkeit für die Entzündungskrankheiten des Darms zu haben (Daten nicht gezeigt).
Im Gegensatz dazu sind die 3 anderen Mutationen R675W (früher R703W), G881R (früher G909R) und 980fs (früher L1008P*) signifikant mit Morbus Crohn verbunden, nicht aber mit der hämorrhagischen Rektokolitis (siehe unten). Die Lokalisierung der 3 häufigen Mutationen in der LLR oder deren unmittelbarer Nähe spricht sehr stark für einen funktionalen Mechanismus, welcher diese Proteindomäne mit einbezieht, wahrscheinlich durch einen Mangel an negativer Regulation von NFkB durch das mutierte Protein. Die anderen Mutationen sind seltener (4). Diese kumulierten Mutationen sind bei 17% der an Morbus Crohn leidenden Individuen vorhanden gegenüber 4% bzw. 5% der gesunden Individuen oder jenen, die an hämorrhagischer Rektokolitis leiden. Eine große Anzahl der seltenen Mutationen ist ebenfalls in der LLR lokalisiert.
Die intrafamiliären Untersuchungen der drei häufigsten Polymorphismen bei Morbus Crohn zeigen, dass sie alle drei mit der Krankheit verbunden sind (Tabelle 5). Wie für eine als sehr schädlich angenommene Mutation erwartet, ist der am stärksten verbundene Polymorphismus die zur Verkürzung führende Mutation. Diese drei Polymorphismen sind auf unabhängige Weise mit Morbus Crohn verbunden, denn es ist nicht möglich gewesen, bei 235 Familien Chromosomen zu identifizieren, die mehr als eine dieser drei Mutationen enthielten. Der unabhängige Charakter dieser Assoziationen oder Verbindungen stärkt die Hypothese beträchtlich, dass das IBD1-Gen sehr wohl an der genetischen Veranlagung für Morbus Crohn beteiligt ist.
Tabelle 5: Untersuchung der 3 häufigen Polymorphismen von IBD1 bei 235 Familien, die von Morbus Crohn betroffen sind
Die Untersuchungen von Vergleichsfällen bestätigen diese Verbindung (Tabelle 6). Sie zeigen, dass die häufigsten Mutationen bei Morbus Crohn bei der hämorrhagischen Rektokolitis nicht häufig sind.
Tabelle 6: Untersuchung der 3 bei den Entzündungskrankheiten des Darms häufigen Polymorphismen von IBD1 bei Vergleichsfällen
Die Untersuchung der Dosis-Wirkung dieser Mutationen zeigt, dass die Individuen, die eine Mutation in homozygotem oder zusammengesetztem heterozygotem Zustand tragen, ein deutlich größeres Risiko, die Krankheit zu entwickeln, aufweisen als die Individuen, die keine Träger oder hinsichtlich dieser Mutationen heterozygot sind (Tabelle 7).
Tabelle 7: Relatives und absolutes Risiko von Morbus Crohn, welches abhängig vom IBD1 Genotyp zuschreibbar ist
In der allgemeinen Bevölkerung wurde ein Risiko für Morbus Crohn von 0,001 als Referenz genommen und die Mutationen wurden als im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht angenommen.
Die vorstehend aufgeführten Arbeiten bestätigen die früheren, einleitend erhaltenen Daten und liefern die detaillierten Grundlagen für eine biologische Diagnostik von Morbus Crohn durch die Untersuchung von Varianten von IBD1. In der Tat, diese Arbeit:

1) definiert die Mutationen, deren Häufigkeit in einer gemischten kaukasischen Population über 0,001 liegt,
2) definiert die Häufigkeit der beobachteten Mutationen und erlaubt, 3 Hauptmutationen zu definieren, die mit Morbus Crohn verbunden/assoziiert sind. So ist es möglich, dank dieser Arbeit eine Strategie zur Untersuchung des Gens für die Suche nach morbiden Varianten zu definieren, nämlich: erstens Typisierung der 3 Hauptmutationen, zweitens Suche nach Mutationen in den 7 letzten Exons, drittens Suche nach anderen Sequenzvarianten.
3) definiert die praktischen Modalitäten zur Untersuchung dieser Mutationen unter Angabe von deren Position und deren Natur. Tatsächlich wird es dann dem Fachmann auf diesem Gebiet vereinfacht, Verfahren zur Typisierung und zur Sequenzierung gemäß seiner persönlichen Expertise zu entwickeln. Man kann insbesondere die Möglichkeit aufführen, die Genotypisierungen der 3 Hauptmutationen durch PCR, gefolgt von einem enzymatischen Verdau und Elektrophorese, Untersuchung der Wanderungsprofile durch dHPLC, DGGE oder SSCP, Oligoligation, Mikrosequenzierung u.s.w., vorzunehmen.
4) zeigt die Unabhängigkeit der häufigsten Mutationen, die in dieser breiten und variierten Population nicht auf dem gleichen Chromosom beobachtet werden. Diese Information erlaubt, die als zusammengesetzte heterozygote (welche zwei Mutationen aufweisen) auftretenden Individuen zuverlässig als Träger einer doppelten Dosis von intragenischen Variationen zu klassifizieren.
5) zeigt, dass der größte Anteil der Mutationen lediglich eine Wirkung von null oder eine minimale Wirkung hinsichtlich des Risikos von hämorrhagischer Rektokolitis mit sich bringt. Dieses Ergebnis erlaubt, ins Auge zu fassen, den Kliniker bei der unterscheidenden Diagnostik zwischen diesen beiden Krankheiten zu unterstützen. Tatsächlich bleiben in ungefähr 10% der Fälle die Entzündungskrankheiten des Darms trotz der biologischen, radiologischen und endoskopischen Untersuchungen unklassifiziert.
6) definiert ein relatives und absolutes Risiko der Krankheit für die häufigsten Genotypen. Dieses Ergebnis liefert die Grundlagen für eine vorhersagende Diagnostik, die in einem Ansatz der Weiterbeobachtung oder der präventiven Intervention bei den Risikopopulationen, insbesondere den Verwandten von erkrankten Personen, potentiell nützlich ist.
7) zeigt die Existenz einer Dosis-Wirkung für das IBD1-Gen und bestätigt den teilweise rezessiven Charakter der genetischen Veranlagung für Morbus Crohn. Sie erlaubt folglich, die Grundlagen für eine genetische Beratung und eine intrafamiliäre vorklinische Diagnostik zu liefern.

Es ist schließlich anzumerken, dass eine ergänzende Mutation der NBD-Domäne in einer zweiten Familie, in welcher ein Blau-Syndrom auftrat, isoliert worden ist. Die Seltenheit der zwei Ereignisse bei 2 unterschiedlichen Familien reicht aus, die Beteiligung dieses Gens an dem Blau-Syndrom und an den granulomatösen Erkrankungen im Allgemeinen zu bestätigen.
Die Gesamtheit dieser Daten liefert ein diagnostisches Werkzeug oder Tool, welches für den Praktiker in seiner täglichen Praxis direkt anwendbar und nützlich ist.
Das Gen IBD1prox, welches sich in der Promotorregion von IBD1 befindet und dessen partielle Sequenz in der Erfindung offenbart wird, kann seinerseits eine bedeutende Rolle bei der Regulation der zellulären Apoptose und des Entzündungsprozesses spielen, wie durch seine differenzielle Expression in den reifen Zellen des Immunsystems nahegelegt wird. Die starke Verbindung zwischen dem Polymorphismusmarker ctg35ExC (gelegen in der transkribierten Region des Gens) und Morbus Crohn, über die in dieser Arbeit berichtet wird, spricht ebenfalls sehr stark für diese Hypothese.
Die Entzündungskrankheiten des Darms sind komplexe genetisch-bedingte Krankheiten, für welche bis zum heutigen Tag keinerlei Suszeptibilitätsgen mit Sicherheit identifiziert worden war. Die Erfindung hat die Identifizierung des ersten Suszeptibilitätsgens für Morbus Crohn durch einen Positionsklonierungs-Ansatz (oder einen Ansatz reverser Genetik) erlaubt. Es handelt sich hier um die erste genetische Lokalisierung, die durch einen solchen Ansatz für eine komplexe genetisch-bedingte Krankheit erhalten worden ist, was deren Nützlichkeit und ihre Durchführbarkeit zeigt, wenigstens in bestimmten Fällen bei den komplexen genetisch-bedingten Krankheiten.
Die Erfindung betrifft auch eine gereinigte oder isolierte Nukleinsäure, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ein Polypeptid kodiert, welches ein kontinuierliches Fragment von wenigstens 200 Aminosäuren eines Proteins, ausgewählt unter SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 5, aufweist.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigte oder isolierte Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ausgewählt wird aus der Gruppe von folgenden Sequenzen: a) SEQ ID NO.1 und SEQ ID NO.3; b) der komplementären Sequenz oder der RNA-Sequenz, welche einer Sequenz, wie in a) definiert, entspricht.
Gereinigte oder isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie SEQ ID NO.1, die komplementäre Sequenz oder die dieser Sequenz entsprechende RNA-Sequenz umfasst oder aus dieser besteht.
Isoliertes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polypeptid, welches SEQ ID NO.2 entspricht, umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es aus SEQ ID NO.2 besteht.
Klonierungs- und/oder Expressionsvektor, welcher eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 und 2 oder eine, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 3 und 4 kodiert, umfasst.
Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch einen Vektor nach Anspruch 5 transformiert ist.
Tier, mit Ausnahme des Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Zelle nach Anspruch 6 umfasst.
In vitro-Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 und 2 als Sinn- oder Antisinn-Nukleotid.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 und 2 für die Herstellung eines rekombinanten Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Zelle nach Anspruch 6 unter Bedingungen, welche die Expression des Polypeptids erlauben, kultiviert und dass man das rekombinante Polypeptid gewinnt.
Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er selektiv ein Polypeptid nach Anspruch 4 bindet.
Verfahren zum Nachweis eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit einem Antikörper nach Anspruch 11; b) Nachweisen des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.
Reagenzienkit für das Ausführen eines Verfahrens nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst: a) einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper nach Anspruch 11; b) gegebenenfalls Reagenzien für die Bildung eines Mediums, welches für die immunologische Reaktion günstig ist; c) die Reagenzien, die den Nachweis des während der immunologischen Reaktion erzeugten Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben.
Diagnose- und/oder prognostisches Bewertungsverfahren einer entzündlichen und/oder das Immunsystem betreffenden Erkrankung oder einer Krebserkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass man ausgehend von einer biologischen Probe eines Patienten das Vorhandensein von wenigstens einer Mutation und/oder eine Veränderung der Expression des SEQ ID NO.1 oder SEQ ID NO.3 entsprechenden Gens durch die Analyse der Gesamtheit oder eines Teils einer Nukleinsäuresequenz, welche dem Gen entspricht, bestimmt.
DNA-Chip, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 und 2 enthält.
Chip mit Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 3 und 4 oder einen Antikörper nach Anspruch 11 enthält.
Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 und 2 in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Inkontaktbringen eines markierten Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 und 2; b) Nachweis und/oder quantitative Bestimmung des zwischen dem Polynukleotid und der Nukleinsäure der biologischen Probe gebildeten Hybrids.
Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 und 2 in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Amplifizierungsschritt der Nukleinsäuren der biologischen Probe mit Hilfe von Primern, die Fragmenten von wenigstens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden von SEQ ID NO.1 oder SEQ ID NO.3 entsprechen, umfasst.
Verfahren zum Screenen auf Verbindungen, die in der Lage sind, an ein Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID NO.2 zu binden, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 3 und 4, eine Zelle nach Anspruch 6 oder ein Säugetier nach Anspruch 7 mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt zu bringen und die Bildung eines Komplexes zwischen der Kandidatenverbindung und dem Polypeptid nachzuweisen.
Verfahren zum Screenen auf Verbindungen, die zur Wechselwirkung in vitro oder in vivo mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 und 2 in der Lage sind, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 und 2, eine Zelle nach Anspruch 6 oder ein Säugetier nach Anspruch 7 mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt zu bringen und die Bildung eines Komplexes zwischen der Kandidatenverbindung und der Nukleinsäure nachzuweisen.
Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt wird aus a) einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 und 2; b) einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 3 und 4; c) einem Vektor nach Anspruch 5; d) einer Zelle nach Anspruch 6; und e) einem Antikörper nach Anspruch 11; als Arzneimittel.
Verbindung nach Anspruch 21 für die Verhütung und/oder die Behandlung einer entzündlichen und/oder das Immunsystem betreffenden Erkrankung oder einer Krebserkrankung, welche mit dem Vorhandensein von wenigstens einer Mutation des SEQ ID NO.1 entsprechenden Gens verbunden ist.