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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose und Behandlung der polyzystischen
Nierenerkrankung bei Menschen mit Hilfe von DNA-Sequenzen, die aus
dem menschlichen PKD1-Gen abgeleitet sind und durch dieses Gen codierte
Protein oder Proteine.
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Allgemeiner Stand der
Technik
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Die
autosomale dominante polyzystische Nierenerkrankung (APKD), auch
adulte polyzystische Nierenerkrankung genannt, ist eine der am häufigsten
auftretenden Erbkrankheiten bei Menschen, mit etwa einem Betroffenen
je Tausend. In den Vereinigten Staaten liegt die Prävalenz über 500.000,
mit 6.000 bis 7.000 erkannten Neuerkrankungen pro Jahr (Striker
et al., Am. J. Nephrol., 6:161-164, 1986; Iglesias et al., Am. J.
Kid. Dis., 2:630-639, 1983). Die Erkrankung gilt als systemische
Störung,
gekennzeichnet durch Zystenbildung in den duktalen Organen wie Niere,
Leber und Bauchspeicheldrüse,
sowie durch gastrointestinale, kardiovaskuläre und muskuloskeletale Anomalien,
einschließlich
Kolondivertikulitis, Beerenaneurysma, Hernien und Mitralklappenprolaps
(Gabow et al., Adv. Nephrol., 18:19-32, 1989; Gabow, New Eng. J.
Med., 329:332-342, 1993).
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Das
am häufigsten
auftretende und offensichtlichste Symptom der APKD ist jedoch die
Bildung von Nierenzysten, welche in extrem vergrößerten Nieren und einer Verringerung
der Nierenkonzentrationsfähigkeit
resultieren. Häufig
treten bei APKD-Patienten auch Bluthochdruck und endokrine Anomalien
auf, noch vor den Symptomen der Niereninsuffizienz. Bei etwa der
Hälfte
der APKD-Patienten schreitet die Erkrankung bis zur Nierenerkrankung
im Endstadium voran; dementsprechend ist APKD verantwortlich für 4-8 %
der Fälle
von Nierendialyse und -transplantation in den Vereinigten Staaten
und Europa (Proc. European Dialysis and Transplant Assn., Robinson
and Hawkins, Eds., 17:20, 1981). Somit besteht in dem Fachgebiet
ein Bedarf an diagnostischen und therapeutischen Werkzeugen zur
Verringerung der Häufigkeit
und Schwere dieser Erkrankung.
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APKD
zeigt ein Übertragungsmuster,
welches typisch für
autosomale dominante Vererbung ist, d.h. für jeden Nachkommen eines Betroffenen
besteht eine Chance von 50 %, dass auslösende Gen zu erben. Bindungsstudien
haben gezeigt, dass sich ein auslösendes Gen auf dem kurzen Arm
des Chromosoms 16 befindet, nahe dem α-Globin-Cluster; dieser Lokus
wurde als PKD1 bezeichnet (Reeders et al., Nature, 317:542, 1985).
Obwohl es andere mit PKD assoziierte Gene gibt, wie zum Beispiel
PKD2, scheinen in 85-90 der betroffenen Familien PKD1-Defekte APKD
auszulösen
(Parfrey et al., New. Eng. J. Med., 323:1085-1090, 1990; Peters
et al., Contrib. Nephrol., 97:128-139, 1992).
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Das
PKD1-Gen wurde auf der Chromosomenposition 16p13.3 lokalisiert.
Mittels umfangreicher Bindungsanalyse in Verbindung mit der Identifikation
neuer Marker und Restriktionsenzymanalyse wurde das Gen weiters
auf ein Intervall von etwa 600 kb zwischen den Markern ATPL und
CMM65 (D16S84) lokalisiert. Die Region ist reich an CpG-Inseln, von denen
man annimmt, dass sie transkribierte Sequenzen flankieren, und es
wurde geschätzt,
dass dieses Intervall mindestens 20 Gene einschließt. Die genaue
Position des PKD1-Gens wurde durch die Ermittlung einer PKD-Familie festgestellt,
deren betroffene Mitglieder eine Translokation tragen, welche ein 14
kb RNA-Transkript, das mit dieser Region assoziiert ist, unterbricht,
wie im European PKD Consortium, Cell, 77:881, 1994 berichtet ist.
Dieser Artikel beschreibt etwa 5 kb der DNA-Sequenz, welche dem 3'-Ende der mutmaßlichen
PKD1-cDNA-Sequenz entspricht.
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WO
95/18225 und WO 95/34649 betreffen das Gen der polyzystischen Nierenerkrankung
1 und Verwendungen davon und sind unter Artikel 54(3) EPC identifiziert.
Die Veröffentlichungen
offenbaren die teilweise cDNA des ersten Drittels des PKD1-Gens,
jedoch nicht die Genomsequenz. Das European Polycystic Kidney Disease
Consortium berichtete, dass das Gen der polyzystischen Nierenerkrankung
1 ein 14 kb Transkript codiert und innerhalb einer duplizierten
Region auf dem Chromosom 16 liegt (Cell, 77:881, 1994). Ein Kurzüberblick
dieses Berichtes wurde durch Wunderle et al. bereitgestellt (Cell,
77:785, 1994). Germino et al. (Kidney Int., 43, Suppl. 39: S.20-S.25,
1994) berichtete über
einen Positionsklonierungsansatz für das dominante polyzystische
Nierenerkrankungsgen, PKD1.
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Trotz
der Kenntnis über
die teilweise PKD1-3'-cDNA-Sequenz verhindern
mehrere signifikante Hindernisse die Bestimmung der kompletten Sequenz
des PKD1-Gens. Diese Hindernisse entstehen größtenteils aus der komplexen
Organisation des PKD1-Lokus. Ein schwerwiegendes Hindernis ist,
dass Sequenzen in Verbindung mit dem PKD1-Transkript mindestens
drei Mal auf dem Chromosom 16 nahe dem PKD1-Lokus dupliziert sind und so PKD1-Homologa
bilden. Ein weiteres Hindernis ist, dass das PKD1-Genomintervall
auch Wiederholungselemente enthält,
welche auch in anderen Genomregionen vorliegen. Diese beiden Arten
der Sequenzduplikation haben Einfluss auf die „Chromosom-Walking"-Verfahren, welche für die Identifikation von Genom-DNA weitverbreitet
eingesetzt werden. Dies ist weil, diese Verfahren auf Hybridisierung
basieren, um Klone zu identifizieren, welche überlappende Fragmente von Genom-DNA
aufweisen. Somit besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit des „Walkings" in Klone, welche
von PKD1-Homologa abgeleitet sind anstelle von Klonen, die von dem
authentischen PKD1-Gen
abgeleitet sind. In ähnlicher
Art und Weise haben die PKD1-Duplikationen und Chromosom-16-spezifischen
Wiederholungen auch Einfluss auf die eindeutige Bestimmung einer
kompletten cDNA-Sequenz, welche das PKD1-Protein codiert. Somit
besteht ein Bedarf im Fachgebiet an genomischen und cDNA-Sequenzen,
welche dem authentischen PKD1-Gen entsprechen. Dies beinhaltet die Identifikation
von Segmenten dieser Sequenzen, welche einmalig für das exprimierte
PKD1 sind und nicht in duplizierten homologen Sequenzen vorliegen,
welche auch auf dem Chromosom 16 vorhanden sind.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung wird ein isoliertes menschliches PKD1-Gen
bereitgestellt, welches die in 1 dargestellte
DNA-Sequenz aufweist.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der Erfindung wird ein rekombinanter Vektor bereitgestellt,
welcher die DNA-Sequenz des ersten Aspektes aufweist. Der Vektor
kann weiters ein transkriptionales regulierendes Element aufweisen,
welches funktionsfähig
mit der PKD1-DNA-Sequenz verbunden ist, wobei das Element die Fähigkeit
besitzt, die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer
Zellen und ihrer Viren oder Kombinationen davon zu lenken.
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Gemäß einem
dritten Aspekt der Erfindung wird eine Zelle bereitgestellt, welche
den Vektor des zweiten Aspektes aufweist.
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Gemäß einem
vierten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen des
PKD1-Proteins bereitgestellt, welches Folgendes aufweist:
- (a) das Kultvieren der Zelle des dritten Aspektes in
einem Medium und unter Bedingungen, welche für die Expression des Proteins
geeignet sind; und
- (b) das Isolieren des exprimierten Proteins.
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Gemäß einem
fünften
Aspekt der Erfindung wird ein i-soliertes
menschliches PKD1-Gen, wie im ersten Aspekt definiert, bereitgestellt,
welches aus der in 1 dargestellten
DNA-Sequenz besteht.
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Gemäß einem
sechsten Aspekt der Erfindung wird eine isolierte Nukleinsäure bereitgestellt, welche
Folgendes aufweist:
5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3'.
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Geeigneterweise
kann die isolierte Nukleinsäure
dieses Aspektes der Erfindung aus Folgendem bestehen:
5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3'.
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Gemäß einem
siebenten Aspekt der Erfindung wird ein diagnostisches Verfahren
für das Screening
menschlicher Lebewesen zum Identifizieren von PKD1-Trägern bereitgestellt,
welches die Untersuchung auf die Gegenwart von Mutanten-PKD1-Genen
in einer Probe aus biologischem Material einschließt, welches
diesem Lebewesen entnommen wurde. Bei einem solchen Verfahren kann
das biologische Material Nukleinsäure aufweisen und die Untersuchung
kann Folgendes aufweisen:
- (a) das selektive
Amplifizieren der PKD1-Gen-Sequenz
der 1 aus dem biologischen Material; und
- (b) das Ermitteln der Gegenwart von PKD1-Genen mittels eines
analytischen Verfahrens ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus: Restriktionsenzymverdau, direkte DNA-Sequenzierung, Hybridisierung
mit Sequenz-spezifischen Oligonukleotiden, konformative Einzelstrang-Polymorphismusanalyse,
denaturierende Gradientengelelektrophorese (DDGE), zweidimensionale
Gelelektrophorese sowie Kombinationen davon.
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Geeigneterweise
kann die Nukleinsäure RNA
aufweisen, und das Verfahren kann weiters das selektive Transkribieren
der PKD1-RNA vor dem Amplifikationsschritt aufweisen. Es kann auch
bevorzugt sein, dass die Amplifikation in Gegenwart eines Oligonukleotides
durchgeführt
wird, welches Folgendes aufweist:
5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3'.
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Gemäß einem
achten Aspekt der Erfindung wird ein isolierter Antikörper bereitgestellt,
welcher gegen ein Peptid mit der Sequenz LRAKNKVHPSST gerichtet
ist.
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Gemäß einem
neunten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines menschlichen PKD1-Gens
der 1 bei der Herstellung eines Wirkstoffes
zur Behandlung eines Krankheitszustandes bereitgestellt, welcher
die Charakteristika von APKD aufweist. Bei einer solchen Verwendung
kann das PKD1-Gen die DNA-Sequenz der 1 aufweisen.
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Gemäß einem
zehnten Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Behandlung
eines Krankheitszustandes bereitgestellt, welcher die Charakteristika
von APKD aufweist, wobei die Zusammensetzung ein isoliertes menschliches
PKD1-Gen mit der DNA-Sequenz der 1 und
ein/en pharmazeutisch akzeptablen/s Träger oder Verdünnungsmittel
aufweist. Eine solche Zusammensetzung kann weiters einen Vektor
aufweisen, in welchen das PKD1-Gen eingeschlossen ist.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1A–1EE zeigt die DNA-Sequenz von 53.577 Basen, welche
das normale menschliche PKD1-Gen aufweist.
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2 zeigt
die teilweise DNA-Sequenz von 894 Basen innerhalb der 5'-Region der normalen menschlichen
PKD1-cDNA.
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3A zeigt
einen Vergleich der DNA-Sequenz der 5'-Region von cDNAs, die von dem authentischen
PKD1-Gen und PKD1-Homologa abgeleitet sind. Ein 29-Basenpaar-Spalt
muss in die Sequenz des authentischen Gens eingefügt werden, um
die beiden Sequenzen auszurichten. Zusätzlich unterscheiden sich die
authentische PKD1-cDNA und die PKD1-Homolog-cDNA an Position 418 dieser Figur. 3B zeigt
die DNA-Sequenz eines Oligonukleotides, welches verwendet werden
kann, um zwischen der authentischen PKD1-Sequenz und PKD1-Homologa
zu unterscheiden. Der Stern kennzeichnet eine Polymerisationsblockierungsmodifikation.
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4 zeigt
die Region des Chromosoms 16, welche den PKD1-Lokus enthält. Die
obere Tafel zeigt NotI-Restriktionsstellen
sowie zuvor identifizierte genetische Marker in dieser Region. Die
untere Tafel zeigt P1-Klone, welche diese Region abdecken.
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5 zeigt
eine Restriktionskarte eines P1-Klones mit der Bezeichnung 91.8B,
welcher das authentische PKD1-Gen
enthält.
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6 zeigt
einen Vergleich zwischen einer früher berichteten teilweisen
PKD1-cDNA-Sequenz und der hierin angegebenen Sequenz. Die obere
Sequenz ist die für
die cDNA angegebene, während
die untere Sequenz die Genomsequenz der vorliegenden Erfindung ist.
Abweichungen sind durch Kleinbuchstaben in der cDNA-Sequenz und
durch Kästchen
in der Genomsequenz hervorgehoben.
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7 zeigt
eine Illustration der PKD1-Genomstruktur
wie durch GRAIL2 vorhergesagt. Die vorhergesagten Exons sind als
Kästchen
entlang der Genomsequenz dargestellt. Die berichtete cDNA befindet
sich oben rechts. Die Position der 2,5 kb GC-reichen Region ist
durch ein gestreiftes Kästchen unten
gekennzeichnet.
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8 zeigt
Homologieregionen in dem PKD1-Gen zwischen Sequenzen die durch GRAIL2 vorhergesagte
Exone codiert und Proteinen in SwissProt- und PIR-Datenbanken. Positionen,
an denen die PKD1-Sequenz mit der Konsensussequenz übereinstimmt
sind schattiert.
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9 zeigt
die Ergebnisse des Exon-Trappings innerhalb des PKD1-Lokus.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Definitionen
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- 1. „APKD" bedeutet, wie hierin
verwendet, adulte polyzystische Nierenerkrankung, welche durch die
Entwicklung von Nierenzysten und letztendlich Nierenversagen gekennzeichnet
ist, und sie kann alternativ oder zusätzlich Zysten in anderen Organen,
einschließlich
der Leber und der Milz, sowie gastrointestinale, kardiovaskuläre und muskuloskeletale
Anomalien beinhalten.
- 2. Der Begriff „PKD1-Gen" betrifft eine Genom-DNA-Sequenz, welche die
Chromosomenposition 16p13.3 darstellt und ein Boten-RNA-Molekül erzeugt,
welches das PKD1-Protein
codiert. Das PKD1-Gen umfasst die in 1 gezeigte
Sequenz, welche Introns und mutmaßliche regulierende Sequenzen
beinhaltet. Der Begriff „authentisch" wird hierin verwendet,
um die Genomsequenz an dieser Stelle sowie davon abgeleitete Sequenzen
zu bezeichnen, und er dient der Unterscheidung dieser authentischen
Sequenzen von „PKD1-Homologa" (siehe unten).
- 3. „PKD1-komplementäre-DNA (cDNA)" ist hierin als ein
einzelsträngiges
oder doppelsträngiges, intronloses
DNA- Molekül definiert,
welches von dem authentischen PKD1-Gen abgeleitet ist und dessen
Sequenz, oder Komplement davon, das PKD1-Protein codiert.
- 4. Ein „normales" PKD1-Gen ist hierin
als ein PKD1-Gen
definiert, dessen veränderte,
defekte oder nichtfunktionale Expression zu adulter polyzystischer
Nierenerkrankung führt.
Ein normales PKD1-Gen ist nicht mit der Erkrankung assoziiert und
gilt somit als eine Wildtypversion des Gens. Eingeschlossen in diese
Kategorie sind Allelvarianten im PKD1-Gen, auch als Allelpolymorphismus
bezeichnet, d.h. alternative Versionen des PKD1-Gens, welche nicht
mit der Erkrankung assoziiert sind und welche mit jeder beliebigen
Häufigkeit
in der Population repräsentiert
sein können. Ebenfalls
eingeschlossen sind Veränderungen
in der DNA-Sequenz, ob rekombinant oder natürlich auftretend, welche keine
offensichtliche Auswirkung auf die Expression oder Funktion des PKD1-Genproduktes
haben.
- 5. Ein „mutiertes" PKD1-Gen ist hierin
als ein PKD1-Gen
definiert, dessen Sequenz durch Transitionen, Transversionen, Deletionen,
Insertionen oder andere Modifikationen gegenüber dem normalen PKD1-Gen modifiziert
wurde, wobei die Modifikationen erkennbare Veränderungen in der Expression
oder Funktion des PKD1-Genproduktes verursachen, einschließlich der
Verursachung einer Erkrankung. Die Modifikationen können von einem
bis hin zu mehreren Tausend Nukleotiden reichen, und sie resultieren
in einer oder mehr von einer Vielzahl an Veränderungen in der PKD1-Genexpression, wie
zum Beispiel verringerte oder erhöhte Expressionsraten oder die
Expression eines defekten RNA-Transkriptes
oder Proteinproduktes. Mutierte PKD1-Gene umschließen jene Gene,
deren Gegenwart in einer oder mehreren Kopien im Genom eines menschlichen
Individuums mit APKD assoziiert sind.
- 6. Ein „PKD1-Homolog" ist eine Sequenz,
welche eng mit PKD1 verwandt ist, welche jedoch nicht das authentisch
exprimierte PKD1-Genprodukt codiert. Mehrere Beispiele solcher Homologa, welche
die Chromosomenposition 16p13.1 darstellen, wurden von den vorliegenden
Erfindern identifiziert und sequenziert.
- 7. Ein „PKD1-Träger" ist hierin als ein
Individuum definiert, welches zumindest eine Kopie des krankheitserzeugenden
Mutanten-PKD1-Gens trägt.
Da die Erkrankung im Allgemeinen ein autosomales dominantes Übertragungsmuster
zeigt, besteht für
PKD1-Träger
eine hohe Wahrscheinlichkeit, einige Symptome der PKD zu entwickeln. Somit
ist ein PKD1-Träger
sehr wahrscheinlich ein „PKD-Patient".
- 8. Wie hierin verwendet ist ein „Contig" ein kontinuierlicher DNA-Abschnitt
oder Abschnitt einer DNA-Sequenz, welcher durch multiple, überlappende
Klone oder Sequenzen dargestellt werden kann.
- 9. Wie hierin verwendet, ist ein „Cosmid" ein DNA-Plasmid, welches in Bakterienzellen
replizieren kann und welches große DNA-Einfügungen mit einer Länge von
etwa 30 bis etwa 45 kb aufnimmt.
- 10. Der Begriff „P1-Klone" betriff Genom-DNAs geklont
in Vektoren auf Grundlage des P1-Phagenreplikationsmechanismus.
Diese Vektoren nehmen im Allgemeinen Einfügungen von etwa 70 bis etwa
105 kb auf (Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:2056-2060,
1992).
- 11. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Exon-Trapping" ein Verfahren zum
Isolieren von genomischer DNA-Sequenzen,
welche durch Spender- und Empfänger-Spleißstellen
für die RNA-Verarbeitung
flankiert werden.
- 12. Der Begriff „konformative
Einzelstrang-Polymorphismusanalyse" (SSCP – single-strand
conformatio nal polymorphism) betrifft ein Verfahren zum Ermitteln
von Sequenzunterschieden zwischen zwei DNAs, welches die Hybridisierung
der beiden Spezies mit anschließender
Nichtübereinstimmungsermittlung
durch Gelelektrophorese aufweist. (Ravnik-Glavac et al., Hum. Mol.
Genet., 3:801, 1994).
- 13. „HOT-Spaltung" ist hierin als ein
Verfahren zum Ermitteln von Sequenzunterschieden zwischen zwei DNAs
definiert, welches die Hybridisierung der beiden Spezies mit anschließender Nichtübereinstimmungsermittlung
durch chemische Spaltung aufweist (Cotton et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 85:4397, 1988).
- 14. „Denaturierende
Gradientengelelektrophorese" (DDGE)
betrifft ein Verfahren zum Auflösen von
zwei DNA-Fragmenten
identischer Länge
auf Grundlage von Sequenzunterschieden, welche aus einer einzigen
Basenpaarveränderung
bestehen können,
mittels Elektrophorese durch ein Gel, welches unterschiedliche Konzentrationen
an Denaturierungsmittel enthält
(Guldberg et al., Nuc. Acids Res., 22:880, 1994).
- 15. Wie hierin verwendet, betrifft „sequenzspezifische Oligonukleotide" verwandte Sätze an Oligonukleotiden,
welche verwendet werden können, um
Allelvariationen oder -mutationen im PKD1-Gen zu ermitteln.
- 16. Wie hierin verwendet, betrifft „PKD1-spezifische Oligonukleotide" Oligonukleotide,
welche mit Sequenzen hybridisieren, welche im authentisch exprimierten
PKD1-Gen vorliegen, jedoch nicht mit PKD1-Homologa oder andere Sequenzen.
- 17. „Amplifikation" von DNA bezeichnet,
wie hierin verwendet, eine Reaktion, welche der Erhöhung der
Konzentration einer bestimmten DNA-Sequenz in einer Mischung von
DNA-Sequenzen dient. Amplifikation kann mit Hilfe der Po lymerasekettenreaktion
(PCR; Saiki et al., Science, 239:487, 1988), Ligasekettenreaktion
(LCR), Nukleinsäurespezifisch
basierte Amplifikation (NSBA) oder jedes geeignete in der Technik
bekannte Verfahren erfolgen.
- 18. „RT-PCR" betrifft, wie hierin
verwendet, die gekoppelte Umkehrtranskription und Polymerasekettenreaktion.
Dieses Verfahren der Amplifikation verwendet einen Anfangsschritt,
in welchem ein spezifisches Oligonukleotid, oligo dT, oder eine
Mischung von zufälligen
Primeren verwendet wird, um die Umkehrtranskription der RNA in Einzelstrang-cDNA
einzuleiten; diese cDNA wird dann mit Hilfe von Standardamplifikationsverfahren,
z.B. PCR, amplifiziert.
- 19. Ein PKD1-Gen oder eine PKD1-cDNA, egal ob normal oder mutiert,
welches) einer bestimmten Sequenz entspricht, beinhaltet auch Veränderungen
in der bestimmten Sequenz, welche die inhärenten Eigenschaften der Sequenz
nicht verändern.
Es wird verstanden werden, dass am 5'- und/oder
3'-Terminus des
in 1 gezeigten PKD1-Gens, oder der
in 2 gezeigten PKD1-cDNA als Teil der routinemäßigen rekombinanter
DNA-Manipulationen zusätzliche
Nukleotide hinzugefügt
sein können.
Weiters können
auch konservative DNA-Substituierungen vorgenommen sein, d.h. Veränderungen
in der Sequenz der Protein-codierenden Region, welche die codierte Aminosäuresequenz
nicht verändern.
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Die
vorliegende Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, umschließt das menschliche
Gen für
PKD1. Mutationen dieses Gens sind mit dem Auftreten der adulten
polyzystischen Nierenerkrankung assoziiert. Eine „normale" Version der Genomsequenz,
welche 53.577 Basen des 5'-Endes
des PKD1-Gens entspricht, ist in 1 gezeigt.
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Die
PKD1-Gensequenz wurde mittels der in Beispiel 1 beschriebenen Strategie
bestimmt. Kurz, eine Reihe von Cosmid- und P1-DNA-Klonen wurde zusammengestellt,
welche überlappende
menschliche Genom-DNA-Sequenzen enthielten, welche zusammen ein
750 Kilobasen-Segment des Chromosoms 16 abdecken, von dem bekannt
ist, dass es den PKD1-Lokus enthält.
Zum Identifizieren transkribierter Sequenzen innerhalb dieses 750
kb Segmentes, einschließlich
der Sequenzen, welche PKD1 codieren, wurden sowohl Exon-Trapping- als auch
cDNA-Selektionsverfahren eingesetzt. Gleichzeitig wurde direkte
DNA-Sequenzierung der menschlichen DNA-Sequenzen, welche in den
Genomklonen enthalten sind, durchgeführt, und zwar mit Hilfe von
Verfahren, welche in der Technik gut bekannt sind. Dazu gehört die Isolierung
von Subklonen aus bestimmten Cosmid- oder P1-Klonen. Verschachtelte Deletionen wurden
aus ausgewählten
Subklonen erzeugt, und die verschachtelten Deletionen wurden dann
mit Hilfe des ALFTM automatisierten Sequenzers
(Pharmacia, Uppsala, Schweden) direkter DNA-Sequenzierung unterzogen.
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Eine
Teilsequenz der PKD1-cDNA ist in 2 gezeigt.
Dieses 5'-cDNA-Fragment,
welches 894 Basen aufweist, erstreckt sich über die Nukleotide 4378 bis
5271 der in 1 gezeigten Sequenz.
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Die
vorliegende Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, umschließt isolierte
Oligonukleotide, welche den Sequenzen innerhalb des PKD1-Gens oder
innerhalb der PKD1-cDNA
entsprechen, welche, allein oder zusammen, verwendet werden können, um
zwischen dem authentisch exprimierten PKD1-Gen und PKD1-Homologa
oder anderen wiederholten Sequenzen zu unterscheiden. Diese Oligonukleotide
können
von einer Länge
von etwa 12 bis etwa 60 Nukleotiden reichen, bevorzugt etwa 18 Nukleotide,
sie können
einzelsträngig
oder doppelsträngig
sein und können,
wie unten beschrieben, markiert oder modifiziert sein. Ein Beispiel
eines Oligonukleotides, welches in dieser Art und Weise verwendet
werden kann, ist in 3B gezeigt. Die Unterscheidungsfunktion
dieses Oligonukleotides basiert auf einem Vergleich der Sequenz
des authentischen PKD1-Gens mit drei cDNAs, die aus den PKD1-Homologa
abgeleitet sind, welcher zeigte, das homologe cDNAs eine 29 bp Einfügung in
Bezug auf die authentischen PKD1-Sequenz enthalten (3A).
Das in 3B gezeigte Oligonukleotid ist an
seinem 3'-Terminus modifiziert,
so dass es keine Polymerisationsreaktionen unterstützt, und
es ist so konstruiert, dass es spezifisch zu der homologen Sequenz
hybridisiert und nicht zu der authentischen PKD1-Sequenz. Wenn dieses
Oligonukleotid in Amplifikationsreaktionen eingeschlossen wird,
verhindert es selektiv die Amplifikation der PKD1-homologen Sequenzen.
In dieser Art und Weise werden authentische PKD1-Sequenzen selektiv
amplifiziert und PKD1-Homologa nicht. Diese Oligonukleotide oder ihre
funktionellen Äquivalente
stellen somit eine Grundlage für
das Testen auf die Gegenwart von Mutationen im authentischen PKD1-Gen
in einem menschlichen Patienten (siehe Beispiel 3 unten) bereit.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes menschliches PKD1-Gen,
welches die in 1 gezeigte DNA-Sequenz
aufweist.
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Die
bestimmten Sequenzen können „normale" Allele von PKD1
darstellen, einschließlich
Allelvarianten oder „Mutanten"-Allele, welche mit
Krankheitssymptomen assoziiert sind. Von PKD1 abgeleitete Sequenzen
können
auch mit heterologen Sequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancern,
Reaktionselementen, Signalsequenzen, Polyadenylierungssequenzen
und ähnlichen
assoziiert sein. Weiters können
die Nukleinsäuren
modifiziert sein, um die Stabilität, Löslichkeit, Bindungsaffinität und Spezifität zu verändern.
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Zum
Beispiel können
von PKD1 abgeleitete Sequenzen selektiv methyliert sein.
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Die
DNA kann Antisense-Oligonukleotide aufweisen und kann weiters Nuklease-resistente Phosphorthioat-,
Phosphoramidat- und Methylphosphonat-Derivate einschließen, sowie „Proteinnukleinsäure" (PNA), die durch
das Konjugieren von Basen mit einer Aminosäurenhauptkette gebildet werden, wie
in Nielsen et al., 1991, Science, 254:1497 beschrieben ist. Die
DNA kann durch Bindung des a-Anomer-Nukleotids, oder durch Bildung
einer Methyl- oder Ethylphosphotriester- oder eine Alkylphosphoramidatbindung
derivatisiert werden. Weiters können
die Nukleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindung auch mit einer Markierung modifiziert werden,
welche in der Lage ist, ein erkennbares Signal, entweder direkt
oder indirekt, bereitzustellen. Zu beispielhaften Markierungen zählen Radioisotope, fluoreszierende
Moleküle,
Biotin und ähnliche.
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Im
Allgemeinen werden für
Nukleinsäuremutationen
gemäß der vorliegenden
Erfindung Verfahren verwendet, welche in der Technik gut bekannt sind,
wie zum Beispiel offenbart in Molecular Cloning, A Laboratory Manual
(2. Ausgabe., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor)
oder Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Aufubel, Brent,
Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience,
NY, NY, 1992).
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Die
Erfindung stellt außerdem
Vektoren bereit, welche eine DNA-Sequenz, wie in den Ansprüchen definiert
ist, aufweisen. Eine große
Anzahl an Vektoren, einschließlich
Plasmid- und Pilzvektoren, wurde für die Expression in einer Vielzahl
von eukaryotischen und prokaryotischen Wirten beschrieben und kann
für die
Gentherapie sowie für
einfache Proteinexpression verwendet werden. Vorteilhafterweise können Vektoren
auch einen Promotor einschließen, welcher funktionsfähig mit
dem PKD1-codierenden Abschnitt verbunden ist.
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Das
codierte PKD1 kann mit Hilfe jeglicher geeigneter Vektoren exprimiert
werden, wie z.B. pREP4, pREP8 oder pCEP4 (InVitrogen, San Diego, CA),
und auch mit Hilfe jeglicher geeigneter Wirtszellen, unter Verwendung
von hierin offenbarten oder zitierten Verfahren, oder Verfahren,
welche dem Fachmann anderweitig bekannt sind. Die jeweilige Auswahl
von Vektor/Wirt ist nicht kritisch für die Operation der Erfindung.
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Rekombinante
Klonvektoren beinhalten häufig
eines oder mehrere Replikationssysteme zum Klonen oder Exprimieren,
einen oder mehrere Marker zur Selektion im Wirt, z.B. Antibiotikaresistenz, und
eine oder mehrere Expressionskassetten. Die eingefügten PKD1-Codiersequenzen
können
zum Beispiel synthetisiert, aus natürlichen Quellen isoliert oder
als Hybriden hergestellt sein. Die Ligation der PKD1-Codiersequenzen an
transkriptionale regulierende Elemente und/oder andere Aminosäure-Codiersequenzen
kann mittels bekannter Verfahren erreicht werden. Geeignete Wirtszellen
können
durch jegliches geeignetes Verfahren einschließlich Elektroporation, CaCl2-mediierte DNA-Aufnahme, Pilzinfektion,
Mikroinjektion, Mikroprojektil oder andere etablierte Verfahren
transformiert/transfiziert/infiziert werden.
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Zu
geeigneten Wirtszellen zählen
Bakterien, Archebakterien, Pilze, insbesondere Hefe, und Pflanzen-
und Tierzellen, insbesondere Säugetierzellen. von
besonderem Interesse sind E. coli, B. Subtilis, Saccharomyces cerevisiae,
SF9-Zellen, C129-Zellen, 293-Zellen, Neurospora und CHO-Zellen, COS-Zellen,
HeLa-Zellen und immortalisierte Säugetiermyeloid- und -lymphoidzellen.
Zu bevorzugten Replikationssystemen zählen M13, ColE1, SV40, Baculovirus,
Lambda, Adenovirus, künstliche
Chromosomen und dergleichen.
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Eine
große
Anzahl regulierender Transkriptionsinitiierungs- und -terminierungsregionen
wurde isoliert und haben sich als wirksam bei der Transkription
und Translation heterologer Proteine in verschiedenen Wirten erwiesen.
Beispiele dieser Regionen, Verfahren der Isolierung, Art und Weise
der Manipulation und dergleichen sind in der Technik bekannt. Unter
geeigneten Expressionsbedingungen können Wirtszellen als eine Quelle
von rekombinant hergestelltem PKD1 verwendet werden.
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Diese
Erfindung betrachtet auch die Verwendung einzelliger oder mehrzelliger
Organismen, deren Genom durch das Einfügen von PKD1-Codiersequenzen
durch jegliches geeignetes Verfahren transfiziert oder transformiert
wurde, um rekombinant erzeugtes PKD1-Protein oder davon abgeleitete
Peptide zu erhalten.
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Nukleinsäuren, welche
PKD1-Polypeptide codieren, können
auch durch Rekombinationsereignisse in das Genom von Empfängerzellen
eingefügt werden.
Zum Beispiel kann eine solche Sequenz in eine Zelle mikroinjiziert
werden, und hat dadurch Auswirkung auf die homologe Rekombination
an der Stelle eines endogenen Gens, welches PKD1 codiert, eines
Analogons oder Pseudogens davon oder einer Sequenz mit substantieller
Identität
zu einem PKD1-codierenden Gen. Weitere rekombinationsbasierte Verfahren
wie z.B. nichthomologe Rekombinationen oder die Deletion eines endogenen
Gens durch homologe Rekombination, insbesondere in pluripotenten
Zellen, können
auch verwendet werden.
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Das/Die
Polypeptid/e kann/können
durch rekombinante DNA-Verfahren wie zuvor beschrieben in einer
heterologen Zelle hergestellt werden. Standardproteinreinigungsverfahren
können
verwendet werden, um PKD1-verwandte Polypeptide zu isolieren, schließen, ohne
jedoch darauf beschränkt
zu sein, Detergensextraktion und chromatographische Verfahren einschließlich Molekularsieb,
Ionenaustausch und Affinitätschromatographie
unter Verwendung von z.B. PKD1-spezifischen
Antikörpern
oder Liganden ein. Wenn das zu reinigende PKD1-Polypeptid in einem
rekombinanten System hergestellt wird kann der rekombinante Expressionsvektor
zusätzliche
Sequenzen aufweisen, welche zusätzliche aminoterminale
oder carboxyterminale Aminosäuren codieren;
diese zusätzlichen
Aminosäuren
agieren als „Tags" für die Immunaffinitätsreinigung
unter Verwendung immobilisierter Antikörper oder für die Affinitätsreinigung
unter Verwendung immobilisierter Liganden.
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Peptide,
welche PKD1-spezifische Sequenzen aufweisen, können aus zuvor beschriebenen
isolierten größeren PKD1-Polypeptiden abgeleitet
werden, mit Hilfe von proteolytischen Spaltungen durch z.B. Proteasen
wie Trypsin und chemische Behandlungen wie Cyanogenbromid, welche
in der Technik gut bekannt sind.
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Die
Antikörper
der Erfindung können
polyklonal oder monoklonal sein, können als Reaktion auf das native
PKD1-Polypeptid
hergestellt werden oder auf zuvor beschriebene synthetische Peptide.
Solche Antikörper
werden in geeigneter Weise mittels der Verfahren und Zusammensetzungen
offenbart in Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1988, anderen hierin zitierten Referenzen
sowie dem Fachmann bekannten immunologischen und Hybridomtechnologien hergestellt.
Werden natürliche
oder synthetische PKD1-abgeleitete Peptide verwendet, um eine PKD1-spezifische
Immunreaktion zu induzieren, können
die Peptide geeigneterweise mit einem geeigneten Träger wie
KLH gekoppelt und in einem geeigneten Adjuvans wie Freunds verabreicht
werden. Bevorzugt werden ausgewählte
Peptide an einen Lysinkern-Träger
gekoppelt, im Wesentlichen gemäß der Verfahren
von Tam, Proc. Natl. A cad. Sci., USA, 85:5409-5413, 1988. Die entstehenden
Antikörper können in
eine monovalente Form modifiziert werden, wie zum Beispiel Fab,
Fab2, Fab' oder FV. Antiidiotypische Antikörper können ebenfalls
unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden.
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Normale
oder mutierte PKD1-Polypeptide werden verwendet, um Mäuse zu immunisieren,
danach werden ihre Milzen entnommen und die Splenozyten, werden
verwendet, um Zellhybriden mit Myelomzellen zu bilden und Klone
von Antikörpersekretierten
Zellen gemäß standardmäßiger Techniken
zu erhalten. Die entstehenden monoklonalen Antikörper werden auf spezifische
Bindung an PKD1-Proteine oder PKD1-verwandte Peptide untersucht.
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In
einer weiteren Ausführungsform
werden Antikörper
auf selektive Bindung an normale oder mutierte PKD1-Sequenzen untersucht.
Antikörper, welche
zwischen normalen und mutierten Formen von PKD1 unterscheiden, können in
Diagnosetests (siehe unten) unter Einsatz von ELISA, EMIT, CEDIA, SLIFA
und dergleichen verwendet werden. Anti-PKD1-Antikörper können auch verwendet werden, um
subzelluläre
und histochemische Lokalisierungsstudien durchzuführen. Schließlich können Antikörper verwendet
werden, um die Funktion des PKD1-Polypeptides, egal ob normal oder
mutiert zu blockieren, oder um rationelle Arzneimittelentwicklungsstudien
zum Identifizieren und Testen von Funktionsinhibitoren durchzuführen (z.B.
mittels eines antiidiotypischen Antikörperansatzes).
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Identifikation krankheitsverursachender
Mutationen in PKD1
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In
einem Anwendungsmodus der vorliegenden Erfindung wird das isolierte
und sequenzierte PKD1-Gen verwendet, um zuvor unbekannte oder mutierte
Versionen des PKD1-Gens zu identifizieren. Zuerst werden durch klinische
Tests, Stammbaumanalyse und Bindungsanalyse mit Hilfe von Standarddiagnosekriterien
und Interviewverfahren menschliche Lebewesen mit ererbter polyzystischer
Nierenerkrankung identifiziert, und den Lebewesen werden DNA- oder
RNA-Proben entnommen
(siehe unten).
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Eine
Vielzahl von Techniken wird dann eingesetzt, um neue Mutantensequenzen
genau zu bestimmen. Zuerst kann PKD1-DNA direkter DNA-Sequenzierung
unterzogen werden, und zwar mit Hilfe von Verfahren, welche den
Standard der Technik darstellen. Weiters können mittels einer PCR-basierten Untersuchung
Deletionen ermittelt werden, in welchen Oligonukleotidpaare verwendet
werden, um Amplifikationsreaktionen auszulösen, und die Größen der
Amplifikationsprodukte werden mit denen von Kontrollprodukten verglichen.
Zu weiteren geeigneten Techniken zählen die Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse
(SSCP), HOT-Spaltung, denaturierende Gradientengelelektrophorese und
zweidimensionale Gelelektrophorese.
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Ein
verwirrender und verkomplizierender Faktor bei der Ermittlung einer
PKD1-Mutation ist die Gegenwart von PKD1-Homologa an mehreren Stellen
auf dem Chromosom 16 nahe dem transkribierten Gen. Bei der Analyse
von Mutationen in PKD1 ist es kritisch, zwischen Sequenzen abgeleitet
aus dem authentischen PKD1-Gen und Sequenzen abgeleitet aus einem
der Homologa zu unterscheiden. Somit ist ein wichtiges Merkmal der
vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Oligonukleotidprimern,
welche zwischen authentischem PKD1 und den Homologa unterscheiden.
Ein detaillierter Vergleich der Sequenzen des authentischen PKD1
Gens und der Homologa ermöglicht
die Konstruktion von Primern, welche zwischen dem/r authentischen
PKD1-Gen oder -cDNA und den Homologa unterscheiden. Primere, welche
dieses Krite rium erfüllen,
wie jene in 3B offenbarten, können in
Verbindung mit jedem der unten beschriebenen analytischen Verfahren
verwendet werden.
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Für SSCP werden
Primer hergestellt, welche DNA-Produkte
mit einer Länge
von etwa 250-300 bp über
nicht duplizierte Segmente des PKD1-Gens hinweg amplifizieren. Für jedes
Amplifikationsprodukt werden ein Gelsystem und zwei Laufbedingungen verwendet.
Jedes Amplifikationsprodukt wird auf ein 10 % Polyacrylamidgel,
welches 10 % Glycerol enthält,
aufgetragen. Separate Aliquote von jedem Amplimer werden einer Elektrophorese
mit 8 W bei Raumtemperatur für
16 Stunden unterzogen, und mit 30 W bei 4°C für 5,4 Stunden. Diese Bedingungen identifizierten
zuvor nachweislich 98 % der bekannten Mutationen im CFTR-Gen (Ravnik-Glavac
et al., Hum. Mol. Genet., 3:801, 1994).
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Für die „HOT"-Spaltung werden
mit Hilfe von radioaktiv markierten PKD1-spezifischen Primern Amplifikationsreaktionen
durchgeführt.
Jedes radioaktiv markierte Amplifikationsprodukt wird dann mit einem
10-fachen bis 100-fachen
Molüberschuss
an unmarkierten Amplifikationsprodukten gemischt, welche mit Hilfe
der identischen Primer und DNA von APKD-betroffenen oder -unbetroffenen
Lebewesen hergestellt wurden. Heteroduplexbildung, chemische Spaltung
und Gelanalyse werden dann wie beschrieben durchgeführt (Cotton
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85-4397, 1988). Die Banden
auf dem Gel, welche kleiner sind als der Homoduplex, resultieren von
der chemische Spaltung der Heteroduplexe an Basenpaar-Fehlübereinstimmung
mit Cytidin oder Thymidin. Nachdem durch dieses Verfahren eine Mutation
identifiziert worden ist, wird die genaue Position der Nichtübereinstimmung(en)
durch direkte DNA-Sequenzierung bestimmt.
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Mutationen
werden auch durch „Breitband"-DDGE identifiziert
(Guldberg et al., Nuc. Acids Res., 22:880, 1994). Die Verwendung
von GC-geklammerte PCR-Primern und eines sehr breiten Denaturierungsmittelgradienten
ermöglicht
die effiziente Ermittlung von Mutantensequenzen. Dieses Verfahren
kann auch mit nichtdenaturierender Größenfraktionierung in einem
zweidimensionalen System kombiniert werden. Es kommt eine Vorrichtung
zum Einsatz, welche die automatisierte zweidimensionale Elektrophorese
zulässt
und die zweite Dimension erhöht
die Auflösung
der Mutationen erheblich.
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Nachdem
durch eine der obengenannten Techniken die Gegenwart einer Mutation
erkannt wurde, wird die spezifische Nukleinsäureänderung, welche die Mutation
aufweist, durch direkte DNA-Sequenzanalyse identifiziert. Auf diese
Art und Weise können
zuvor nicht identifizierte PKD1-Mutationen definiert
werden.
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Nachdem
eine zuvor nicht identifizierte PKD1-Mutation definiert wurde, können Verfahren zur
Ermittlung der bestimmten Mutation bei anderen betroffenen Individuen
angewandt werden, und zwar mittels einer Vielzahl von Verfahren,
welche den Standard der Technik darstellen. Zum Beispiel können Oligonukleotidsonden
hergestellt werden, welche die Ermittlung und Unterscheidung der
bestimmten Mutation erlauben. Es dürfte verständlich sein, dass solche Sonden
entweder die Mutantensequenz selbst aufweisen, oder alternativ dazu,
die Mutantensequenz flankieren können.
Weiters kann die Oligonukleotidsequenz verwendet werden, um ein
Peptidimmunogen herzustellen, welches die Mutantenaminosäuresequenz
aufweist. Diese Peptide werden dann verwendet, um Antikörper zu
erzeugen, welche zwischen normalen und mutierten PKD1-Polypeptiden
unterscheiden.
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Diagnosetests für PKD1-Mutationen
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Mutierte
PKD1-Gene, egal ob durch die zuvor beschriebenen Verfahren oder
durch andere Mittel identifiziert, finden Anwendung in der Entwicklung und
Durchführung
von Diagnosetests. Tests zur Ermittlung der Gegenwart mutierter
PKD1-Gene, einschließlich
der unten und in Beispiel 3 beschriebenen, können wie Folgt angewandt werden:
- (1) Zum Bestimmen der Spendereignung für Nierentransplantate.
Im Allgemeinen ist es wünschenswert,
einen nahen Verwandten des Transplantatempfängers zu verwenden. Ist der
Empfänger
ein an familiärer
APKD leidender Patient, ist es wichtig sicherzustellen, dass der
spendende Verwandte nicht ebenfalls das familiäre mutierte PKD1-Gen trägt.
- (2) Zum Screening nach Risikoindividuen in von APKD betroffenen
Familien. Präsymptomatische Individuen,
bei denen eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, APKD zu entwickeln,
können
identifiziert werden; sie können überwacht
werden und ihnen stehen präventive
Therapien zur Verfügung.
- (3) Auf Hypertoniepatienten für eine Antihypertoniebehandlung
abzielen. Hypertonie ist auch mit APKD verbunden. Das Screening
von Hypertoniepatienten auf die Gegenwart mutierter PKD1-Gene kann
verwendet werden, um Patienten für
eine präventive
Regulierung des Blutdruckes zu identifizieren, um einen späteren Nierenschaden
zu verhindern.
- (4) Zur Durchführung
von pränatalem
Screening. Die meisten mit PKD1 in Verbindung stehenden Fälle von
PKD treten im Erwachsenenalter auf. In einer kleinen Teilmenge der
Familien, welche eine Mutation in den PKD1-Genen tragen, tritt die
Erkrankung jedoch bereits im Jugendalter auf, wobei dies eine schwerere
Form der Erkrankung bedeu tet. Bei diesen Familien kann pränatales Screening
für genetische
Beratungszwecke von Nutzen sein.
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Im
Allgemeinen beinhalten die Diagnosetests gemäß der vorliegenden Erfindung
das Erhalten einer biologischen Probe von einem Lebewesen und das
Screening der Probe mittels des gesamten oder eines Teils des PKD1-Gens
dieser Erfindung auf die Gegenwart einer oder mehrerer Mutantenversionen
des PKD1-Gens oder seines Proteinproduktes. Das Lebewesen kann ein
Fötus in
utero sein, oder ein menschlicher Patient jeden Alters.
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In
einer Ausführungsform
erhält
man eine genomische-DNA
Probe von einem menschlichen Lebewesen und diese wird auf die Gegenwart
von einer oder mehreren mit der Erkrankung assoziierte PKD1-Mutationen
untersucht. Diese DNA kann aus jeder Zellquelle oder Körperflüssigkeit
gewonnen werden. Zu nicht einschränkenden Beispielen von Zellquellen,
welche in der klinischen Praxis zur Verfügung stehen, zählen Blutzellen,
Bukkalzellen, Gebärmutterhals-Scheidenzellen, Epithelzellen
aus Urin, Fetalzellen oder jegliche andere im Gewebe vorkommende
Zellen, die durch Biopsie erhalten wurden. Zu Körperflüssigkeiten zählen Blut,
Urin, Zerebrospinalflüssigkeit,
Fruchtwasser und Gewebsausscheidungen an Infektions- oder Entzündungsstellen.
DNA wird mittels eines beliebigen von einer ganzen Reihe von geeigneten
Verfahren, welche den Standard der Technik darstellen, aus der Zellquelle
oder Körperflüssigkeit
extrahiert. Es dürfte
verständlich
sein, dass das jeweilige zum Extrahieren der DNA verwendete Verfahren
von der Art der Quelle abhängig
ist. Die Mindestmenge an DNA, welche zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung zu extrahieren ist, ist 25 pg (was etwa 5 Zelläquivalenten
einer Genomgröße von 4 × 109 Basenpaaren entspricht).
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In
dieser Ausführungsform
kann die für
die Ermittlung der Gegenwart von Mutationen verwendete Untersuchung
Restriktionsenzymverdau, direkte DNA-Sequenzierung, Hybridisierung
mit Sequenz-spezifischen Oligonukleotiden, Amplifikation durch PCR,
Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse,
denaturierende Gradientengelelektrophorese (DDGE), zweidimensionale
Gelelektrophorese, In situ-Hybridisierung und Kombinationen davon
aufweisen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird RNA aus einer/m PKD1-exprimierenden Zelle oder Gewebe, bevorzugt
Lymphozyten, isoliert, und zwar mit Hilfe von Standardtechniken,
einschließlich
automatisierter Systeme wie dem von Applied Biosystems, Inc. (Foster
City, CA) verkauften. Die RNA wird dann gekoppelter Umkehrtranskription
und PCR-Amplifikation
(RT-PCR) unterzogen. Die resultierende DNA kann dann durch eines
der zuvor erläuterten Verfahren
auf die Gegenwart von Mutantensequenzen durchsucht werden (siehe
Beispiel 3 unten).
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Wie
zuvor diskutiert, muss jedes Nukleinsäurebasierte Screening-Verfahren
für PKD1-Mutationen
in der Lage sein, zwischen dem authentischen PKD1-Gen an Chromosomenposition
16p13.3 und PKD1-Homologa an 16p13.1 und anderen Positionen zu unterscheiden.
Die in 3 gezeigten Oligonukleotide
sind Beispiele von Primer, welche zwischen den authentischen und
homologen Sequenzen unterscheiden, und diese Oligonukleotide oder ihre Äquivalente
bilden einen wichtigen Teil eines jeden solchen Diagnosetests. Weiters
stellen die Nukleotide 43,818 bis 52,882 der PKD1-Sequenz der 1 eine Sequenz dar, welche einzigartig
für das authentische
PKD1-Gen ist und welche in den Homologa nicht vorkommt. Somit können Oligonukleotide die
von dieser Region abgeleitet sind, in einem Screening- Verfahren verwendet
werden, um sicherzustellen, dass das authentische PKD1-Gen, und nicht
die Homologa erkannt wurde.
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In
einer weiteren Ausführungsform
beinhaltet die Untersuchung, die zur Ermittlung der Gegenwart eines
mutierten PKD1-Gens verwendet wird, das Testen auf mutierte Genprodukte
durch eine immunologische Untersuchung mittels eines von vielen
in der Technik bekannten Verfahren, wie zum Beispiel Radioimmunoassay,
ELISA, Immunfluoreszenz und dergleichen. In dieser Ausführungsform
ist die biologische Probe bevorzugt aus einem PKD1-exprimierenden
Gewebe wie der Niere abgeleitet. Das PKD1-Polypeptid kann aus der
Probe extrahiert werden. Alternativ dazu kann die Probe behandelt
werden, um die Ermittlung oder Sichtbarmachung spezifisch gebundener
Antikörper
in situ zu ermöglichen, wie
dies zum Beispiel durch Kryoschneiden gefolgt von Immunfluoreszenzfärbung der
Fall ist.
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Die
Antikörper
können
monoklonal oder polyklonal sein, können gegen intaktes PKD1-Protein oder
aus PKD1 abgeleitete natürliche
oder synthetische Peptide gezüchtet
sein. In einer bevorzugten Ausführungsform
unterscheiden die Antikörper
zwischen „normalen" und „mutierten" PKD1-Sequenzen und besitzen
eine ausreichend hohe Affinität
für PKD1-Polypeptide,
so dass sie für
Routineuntersuchungen eingesetzt werden können.
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Es
dürfte
verständlich
sein, dass das jeweilige Verfahren oder die Kombination von Verfahren von
der jeweiligen Anwendung abhängig
ist. Zum Beispiel beinhalten Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz
bevorzugt die Extraktion von DNA oder RNA aus leicht verfügbarem Gewebe,
gefolgt von Amplifikation bestimmter PKD1-Sequenzen und Hybridisierung
der Amplifikationsprodukte mit einem Panel spezifischer Oligonukleotide.
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Therapeutische Anwendungen
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Die
vorliegende Erfindung umschließt
die Verwendung eines menschlichen PKD1-Gens der 1 bei
der Behandlung von PKD mittels der hierin offenbarten Verfahren
und Zusammensetzungen. Das gesamte oder ein Teil des zuvor offenbarten
normalen PKD1-Gens kann an Nierenzellen oder andere betroffene Zellen
abgegeben werden, und zwar mit Hilfe einer Vielzahl bekannter Verfahren,
einschließlich
z.B. Liposome, virale Vektoren, rekombinante Viren und dergleichen.
Das Gen kann in DNA-Vektoren eingeschlossen sein, welche zusätzlich gewebsspezifische
regulierende Elemente aufweisen, welche die PKD1-Expression in einer
gewebsspezifischen Art und Weise erlauben. Dieser Ansatz ist durchführbar, wenn
ein bestimmtes mutiertes PKD1-Allel, wenn es in einer Einzelkopie
vorliegt, gerade verursacht, dass sich die Konzentration des PKD1-Proteins
unter ein Schwellwertlevel verringert, welches für die normale Funktion notwendig
ist; in diesem Fall sollte eine Erhöhung der Gendosierung durch
Ergänzung
mit zusätzlichen
normalen Kopien des PKD1-Gens den Funktionsdefekt korrigieren.
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Alternativ
kann es wünschenswert
sein, die Expression eines mutierten PKD1-Gens unter Verwendung
von zum Beispiel Antisensesequenzen zu beschränken. In dieser Ausführungsform
können
Antisense-Oligonukleotide an die Niere oder andere Zellen abgegeben
werden.
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Für therapeutische
Anwendungen kann PKD1-verwandte DNA in jeder geeigneten Art und Weise
verabreicht werden, zum Beispiel parenteral in einem physiologisch
akzeptablen Träger
wie phosphatgepufferter Salzlösung,
Salzlösung,
deionisiertem Wasser oder dergleichen. Normalerweise werden die
Zusammensetzungen zu einer zurückgehaltenen
physiologischen Flüssigkeit
wie Blut oder Synovialflüssigkeit zugegeben.
Die verabreichte Menge wird empirisch mit Hilfe von Routineexperimenten
bestimmt. weitere Zusatzstoffe wie Stabilisatoren, Bakterizide und
dergleichen können
in üblichen
Mengen beigefügt
werden.
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Die
Verwendungen eines menschlichen PKD1-Gens der 1 können auch
die Verwendung bei der Behandlung von APKD durch Proteinaustausch
umfassen. In einer Ausführungsform
wird Protein, das durch Wirtszellen, die mit DNA, welche das PKD1-Polypeptid
der vorliegenden Erfindung codiert, transformiert oder transfiziert
sind, erzeugt wurde in die Zellen eines Individuums, welches an
einer veränderten,
defekten oder nichtfunktionalen Expression des PKD1-Gens leidet
eingefügt.
Dieser Ansatz erhöht
die Abwesenheit des PKD1-Proteins oder die Gegenwart eines defekten
PKD1-Proteins durch Zugabe funktionalen PKD1-Proteins. Das für die Erhöhung verwendete PKD1-Protein
kann ein/e subzelluläre/s
Fragment oder Fraktion aufweisen oder kannteilweise oder im Wesentlichen
gereinigt sein. In jedem Fall wird das PKD1-Protein in einem geeigneten Vehikel
formuliert, wie zum Beispiel Liposome, welche zusätzlich herkömmliche
Träger,
Excipienten, Stabilisatoren und dergleichen beinhalten können.
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Es
dürfte
verständlich
sein, dass die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
nicht an sich eine wirksame Menge darstellen müssen, da solche wirksamen Mengen
durch die Verabreichung mehrerer solcher therapeutischer Zusammensetzungen
erreicht werden können.
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Die
folgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung ohne Einschränkung ihres
Umfangs.
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Beispiel 1: Klonen und
Sequenzieren des menschlichen PKD1-Gens
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A. Verfahren:
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Geordnete
Restriktionsfragmente wurden entweder in pBLUEscript (Stratagene,
La Jolla, CA) oder pGEM (Promega, Madison, WI) subkloniert. Plasmide
wurden durch CsCl-Dichtezentrifugierung in
Gegenwart von Ethidiumbromid gereinigt. Geschachtelte Deletionen
wurden mittels ExoIII (Henikoff, S., Methods Enzymol., 155:156-165,
1987) und zusätzlichen
enzymatischen Reagenzien bereitgestellt durch das Erase-A-Base-Kit (Promega,
Madison, WI) aus jedem Plasmid erzeugt. Die so entstehenden verschachtelten
Klone wurden nach angemessenem Restriktionsenzymverdau elektrophoretisch
analysiert und für
die Sequenzierung in einen verschachtelten Satz von Matrizen geordnet.
Eine minimale Überlappungsreihe
von Plasmiden, wobei sich jedes um etwa 250 by von den flankierenden Klonen
unterschied, wurde identifiziert und für die Sequenzierung verwendet.
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Plasmid-DNAs
wurden für
die Sequenzierung in einer von zwei Möglichkeiten zubereitet. Zuerst
wurden alle Klone von Interesse in 2 ml Super Broth (Tartof et al.,
BRL Focus, 9:12, 1987) für
20 Stunden bei 37°C
kultiviert. Sätze
von 12-24 wurden gleichzeitig
mit Hilfe eines modifizierten alkalischen SDS-Verfahrens gefolgt
von Ionenaustauschchromatographie wie durch den Hersteller (Easy-Prep,
Pharmacia, Piscataway, NJ) beschrieben verarbeitet. Die Plasmid-DNA-Ausbeuten reichten
von 2,5 bis 25 μg. Schlecht
wachsende Klone, oder die, deren Plasmide eine Sequenz mit inakzeptabler
Qualität
erzeugten, wurden in 100 ml Luria's Broth rekultiviert und die Plasmid-DNA
mit Hilfe von Qiagen-Säulen
(Qiagen, San Diego, CA) isoliert.
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Dideoxy-Sequenzierungsreaktionen
wurden bei Deletionsklonen mittels des Auto-Read Sequencing Kit
(Pharmacia, Piscataway, NJ) und Fluorescein-markierten Vektorprimer
(M13 universal, M13 umgekehrt, T3, T7 und SP6) durchgeführt. Die
Reaktionsprodukte wurden mit Hilfe des ALF DNA Sequencers (Pharmacia,
Piscataway, NJ) auf 6 % denaturierenden Acrylamidgelen getrennt.
Die Sequenzierung des zweiten Stranges erfolgte entweder mittels eines
gegenüberliegenden
Satzes verschachtelter Deletionen oder Primer-Walking. Für das Primer-Walking wurden kundenspezifische
17mere, alle 250 bp versetzt, von einem kommerzieller Lieferanten
erworben (Protogene, Palo Alto, CA). Matrizen-DNAs hergestellt durch
Qiagen oder CsCl-Dichtegradienten wurden mittels der unmarkierten 17mere
durch Inklusion einer Fluor-dATP-Markierungsmischung in die Sequenzierungsreaktionen
wie durch den Hersteller (Pharmacia, Piscataway, NJ) beschrieben
sequenziert. In allen Fällen,
außer
der 2,5 kb GC-reichen Region, wurde mit Hilfe des Helferphagen VCSM13
(Stratagene) im Wesentlichen wie durch den Hersteller beschrieben
Einzelstrang-DNA aus Deletionsklonen gewonnen. Einzelstrang-Matrizen
aus der 2,5 kb GC-reichen
Region wurden mittels Fluorescein-markiertem universellem Primer
und dem Sequitherm-Long-Read-Cycle-sequencing-Kit (Epicentre Technologies, Madison,
WI) (Zimmerman et al., Biotechniques, 17:303-307, 1994) sequenziert.
Sämtliche
verarbeiteten Sequenzierungsdaten wurden auf einen Quadra 700 Macintosh
Computer übertragen
und mit Hilfe des SEQUENCHER (Gene Codes, Ann Arbor, MI) Sequenzierungszusammensetzungsprogramms
zusammengesetzt. Bei Unterschieden, welche sich nicht durch Überprüfung der
Chromatogramme lösen ließen, wurden
die Matrizen entweder erneut sequenziert oder es wurden Primere
nahe der unklaren Stelle hergestellt und für die Lösung des Sequenzunterschiedes
verwendet. Zyklussequenzierung erfolgte mit Hilfe des Sequitherm-cycle-sequencing-Kits wie
durch den Hersteller (Epicentre Technologies, Madison, WI) beschrieben.
Die Reaktionsprodukte wurden auf denaturierenden Acrylamidgelen
getrennt und anschließend
durch Autoradiographie ermittelt.
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B. Sequenzierungsstrategie:
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Eine
700 kbp Region des Chromosoms 16, welche den PKD1-Lokus enthält, ist
in 4 (obere Feld) gezeigt. Eine Contig, welche diese
Region abdeckt, wurde aus überlappenden
P1-Klonen zusammengesetzt
(in der mittleren Tafel gezeigt). Die Contig wurde durch unidirektionales
Chromosomen-Walking von den Enden des Intervalls (ATPL und D16S84)
und bidirektionales Walking von mehreren internen Loki (D16S139
und KG8) zusammengesetzt. Einer der Klone, 91.8B, scheint sich über das gesamte
PKD1-Intervall zu erstrecken und beinhaltet die Cosmide cDEB11,
cGGG10.2 und wesentliche Anteile der Cosmide 2H2 und 325A11 (Stallings,
R.L. et al., Genomics, 13:1031, 1992). Dieser P1-Klon (in 5 schematisch
gezeigt) wurde als eine zweite genomische Matrize verwendet, um
Unstimmigkeiten zwischen der veröffentlichten
cDNA-Sequenz und der vom Cosmid abgeleiteten genomischen Sequenz zu
bestätigen.
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Vorläufige Experimente
haben die Gegenwart mehrerer sich wiederholender Elemente im cGGG10.2
Cosmid gezeigt. Daher wurde ein geordneter Ansatz basierend auf
verschachtelten Deletionen anstelle einer zufälligen Shotgun-Subklonierung verwendet,
um das PKD1-Gen zu sequenzieren. Restriktionsfragmente abgeleitet
von den Einfügungen von
sowohl cGGG10.2 als auch cDEB11 wurden als ein vorläufiger Schritt
zur Erzeugung verschachtelter Deletionen in Plasmide mit einer hohen
Kopienanzahl subkloniert. Unidirektionale Deletionen wurden hergestellt
und sequenziert, und zwar mit Hilfe des automatisierten ALFTM Sequenzierungssystems (Pharmacia, Uppsala,
Schweden).
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Die
Leselängen
lagen im Durchschnitt bei 350 Nukleotiden, wobei Durchläufe über 500
Nukleotide nicht selten waren. Diese Strategie erlaubte die schnelle
und akkurate Sequenzierung von 53.577 Nukleotiden in linearer Gensequenz
unter Verwendung von 1.200 Sequenzierungsreaktionen. Basierend auf
dieser Analyse liegt die kumulative Vielfach-Redundanz bei etwa
7-Fach. Intervalle von Mindestredundanz (3-Fach) zeigten eine perfekte
Sequenzidentität
zwischen überlappenden
Matrizen. Die einzige Ausnahme zur kompletten Doppelstrangsequenzierung
war die 2,5 kb GC-reiche Region im 4 kb BamH1-SacI-Fragment und eine
angrenzende 150 bp GC-reiche Region im benachbarten Sacl-BamH1-Fragment.
Diese Segmente wurden nur auf dem nichtcodierenden Strang sequenziert,
und zwar aufgrund von Komplikationen, welche sich aus der sich wiederholenden
Natur der Sequenzen in dieser Region ergeben.
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In
dieser Art und Weise erhielt man die Sequenz der in 1 gezeigten
PKD1-genomischen-DNA.
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C. Primärstruktur
des PKD1-Lokus:
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Die
Primärsequenz
des Intervalls, welches das PKD1-Gen umschließt besitzt eine Länge von 53.577
bp. Der Lokus ist GC-reich (62,4 %) mit einem CpG/GpC-Dinukleotidverhältnis von
0,485. Der Vergleich dieser Sequenz mit der zuvor berichteten teilweisen
cDNA-Sequenz zeigte Unterschiede an drei Stellen (6).
Der erste und signifikanteste Unterschied ist die Gegenwart von
zwei zusätzlichen
Cytosinresten auf dem Plusstrang an Position 4566 der berichteten
Sequenz. Dieser Sequenzunterschied wurde mittels einer von einer
cDNA, welche von einem anderen Individuum stammt abgeleiteter Sequenz,
bestätigt.
Zusätzlich
wurden Allel-spezifische Oligonukleotide (ASOs), welche entweder
zu der berichteten Sequenz oder der vorliegenden Sequenz homolog
sind, mit den genomischen und cDNA-Klonen hybridisiert. In allen
Fällen
zeigte die Dot-Blot-Analyse
mit Einzelbasen-Unterscheidungsbedingungen, dass nur das ASO mit
den zusätzlichen
Cytosinresten mit allen geklonten DNAs hybridisierte. Die Gegenwart
dieser beiden Cytosinreste resultiert in einer Rahmenverschiebung
in der vorhergesagten Proteincodiersequenz, was zur Ersetzung von
92 Carboxyterminus-Aminosäuren
mit einem neuartigen 12 Aminosäuren-Carboxyterminus
führt. Sieben
der zwölf
Aminosäuren
des neuen Carboxyterminus sind geladen oder polar. Weitere Sequenzunterschiede
sind an den Positionen 3639-3640 und 3708-3709 der veröffentlichten Sequenz (6)
zu finden. Ein GC-Dinukleotid-Paar befindet sich an jeder dieser
Positionen in der vorliegenden Sequenz, während in der berichteten Sequenz
ein CG-Paar gefunden wird. In jedem Fall würden Histidin- und Valin-Reste
die zuvor vorhergesagten Glutamin- bzw. Leucin-Reste ersetzen. Es
ist derzeit unklar, ob diese letztgenannten Unterschiede Allelvariationen
oder Fehler in der berichteten Sequenz darstellen.
-
Es
ist klar, dass die zuvor berichtete cDNA-Sequenz eine inakkurate
Sequenz mit einem inkorrekten Leserahmen bereitstellt. Sämtliche
durch die vorherige Teilsequenz codierten Proteine wären somit
defekt und würden
in keiner Weise auf Proteine, welche durch die Sequenz der vorliegenden
Erfindung codiert sind, oder sogar die Sequenz selbst schließen lassen.
Daraus folgt, dass der Einsatz der vorherigen Sequenz, oder von
durch sie codierten Proteinen, in therapeutischen oder diagnostischen Anwendungen
erfolglos wären.
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Die
gesamte Sequenz wurde mittels GRAIL2 (Uberbacher, E.C. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 88:11261, 1991) und den XGrail Client-Server
(Shah et al., User's
Guide to GRAIL and GENQUEST, Client-Server Systems, erhältlich durch
anonymes FTP an arthur.epm.omi.gov (128.219.9.76) von Verzeichnis
pub/xgrail oder pub/xgenquest, als Datei manual.grailgenquest, 1994)
auf Transkriptionselemente und CpG-Inseln analysiert. Es wurden
zehn CpG-Inseln identifiziert (7). Durch
das GRAIL-Programm wurden achtundvierzig Exons auf dem Codierstrang
vorhergesagt. Die Qualität
von 39 der 48 Exons war „ausgezeichnet", sechs wurden als „gut" betrachtet und drei
als „unbedeutend" erachtet. Diese
Daten wurden mittels des Genmodell-Merkmals von GRAIL2 analysiert.
Das endgültige
Genmodell enthielt 46 Exons. Als durch Vergleich mit der ver öffentlichten
cDNA die Genauigkeit des Genmodells untersucht wurde, wurden 22
von 23 Exons in der veröffentlichten
cDNA in dem Modell vorhergesagt. Von den 22 im Genmodell vorkommenden
Exons waren 16 korrekt gespleißt,
vier waren komplett im Modell enthalten, verwendeten jedoch entweder
eine inkorrekte 5'-
oder 3'-Spleißstelle,
und in einem Fall waren zwei Exons in dem Modell in ein einzelnes Exon
kombiniert (wobei das Programm ein kleines Intron nicht entfernen
konnte). Lediglich eines der hergeleiteten Exons in der veröffentlichten
cDNA fehlte in dem Genmodell.
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D. Identifikation von
Proteincodierregionen:
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Die
durch das GRAIL2-Programm vorhergesagten Exons mit „ausgezeichneter" Bewertung wurden
verwendet, um die SwissProt- und PIR-Datenbanken mit dem BLASTP-Programm
zu durchsuchen. Exon 3 und 4 des Genmodells wurden vorhergesagt,
die Peptide mit Homologie zu einer Reihe von Leucin-reiche Wiederholungen
(LRR) enthaltende Proteine zu codieren, welche an Protein-Protein-Interaktionen
(8) beteiligt sind. Zusätzlich zum LRR selbst können auch
Amino- oder Carboxyflankierende Sequenzen zum LRR in Proteinen der
Leucinreichen Glycoprotein (LRG)-Familie, entweder einzeln oder
zusammen, konserviert sein. Exon 3 codiert Reste homolog zum LRR
vom Leucin-reichen α2-Glycoprotein,
Mitglieder des GP1b.IX-Komplexes, welche den von-Willebrand-Faktor-Rezeptor umfassen,
sowie die Drosophila-Proteine Chaoptin, toll und slit. Letztgenannte
sind an der Adhäsion,
Dorsal-Ventral-Polarität bzw. Morphogenese
beteiligt. Mit GRAIL2 vorhergesagten Sequenzen, die durch Exon 4
codiert sind, besaßen
nachweislich Homologie mit dem Carboxyterminus der konservierten
Region zum LRR bei allen zuvor genannten Proteinen, außer Chaoptin,
welchem diese konservierte Region fehlt. Homologie wurde ebenfalls
zwischen den durch Exon 4 codierten Sequenzen und dem trk Proto-Onkogen
beobachtet, welches einen Rezeptor für den Nervenwachstumsfaktor
codiert. Die weitere Überprüfung des
vorhergesagten PKD1-Peptides ergab zusätzliche Regionen mit schwächerer Homologie
zu konservierten Regionen der trk Tyrosin-Kinase-Domäne. Keines
der näheren
Exons im Genmodell scheint ein Peptid mit Homologie zu der konservierten
Amino-flankierenden Region zu codieren, wie sie in einer Teilmenge
der LRR-enthaltenden Proteine gefunden wurden.
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Exon-Trapping,
RT-PCR und Northern-Blot-Analyse zeigten, dass die von GRAIL2 vorhergesagte
Exon 3 und 4 in der exprimierten Sequenz vorhanden sind. Während anfänglicher Exon-Trapping-Experimente
mit Genom-P1- und Cosmid-Klonen vom PKD1-Lokus wurde eine Exon-Trap
identifiziert, welche beide Exons enthielt. In separaten Experimenten
wurde die Gegenwart des LRR-Carboxy-flankierenden Motivs in transkribierten
Sequenzen durch RT-PCR mit RNA aus fötaler Niere und aus Erwachsenengehirn
als Matrize bestätigt.
Auf dem Northern-Blot detektierte ein RT-PCR-Fragment, welches dieses
Motiv enthielt, das 14 kb PKD1-Transkript und mehrere andere Transkripte
mit 21 kb, 17 kb und 8,5 kb.
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Eine
Homologieregion wurde ebenfalls zwischen dem von GRAIL2 vorhergesagten
Peptid und den menschlichen gp100/Pmel17-Genprodukten, sowie mit
dem bovinen RPE1 entdeckt. Das gp100/Pmel17-Gen codiert zwei abwechselnd
gespleißte
Produkte (9p10 und Pmel17), welche sich nur durch 7 Aminosäuren unterscheiden.
Eine genauere Überprüfung zeigte,
dass diese Homologieregion in Sequenzen vorhanden war, welche durch
drei getrennte, von GRAIL vorhergesagte Exons codiert wurden; jedoch
ist nur das Exon welches die erste Kopie des Motivs enthält vollständig innerhalb
des abschließenden
Genmodells enthalten.
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Die
von GRAIL2 vorhergesagten Exons 9, 22 und 28, stromaufwärts der
3'-cDNA, zeigten
eine starke Homologie zu EST T03080 (85 %, 255 bp), EST T04943 (98
%, 189 bp) und EST T05931 (94 %, 233 bp). Zusätzlich zeigten die Nukleotide 10378-10625
des von GRAIL vorhergesagten Introns 1 eine starke Homologie zu
einer Region des Apo CII-Gens (81 %, 263 bp).
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E. Wiederholte Sequenzen:
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Der
PKD1-Lokus wurde durch den FASTR-Vergleich mit der Wiederholungsdatenbank von
Jurkat et al. (J. Mol. Evol., 35:286-291, 1992) auf bekannte Klassen
von repetitiver DNA durchsucht. Diese Suche identifizierte 23 Alu-Wiederholungen, jedoch
keine anderen repetitiven Elemente. Die Alu-Wiederholungen sind in drei Cluster
von vier oder mehr Alu-Wiederholungen,
drei Cluster mit zwei Alu-Wiederholungen und zwei einzelne Alu-Wiederholungen
organisiert (7). Die durchschnittliche Dichte
der Alu-Wiederholungen pro kb ist 0,4. Die drei Cluster mit vier
oder mehr Alu-Wiederholungen befinden sich innerhalb der ersten
20.000 Nukleotide (0,85 Alu pro kb) und liegen vorrangig auf dem
Umkehrstrang (15 von 17). Die Intervalle 20.000-40.000 und 47.000-54.000
sind frei von Alu-Wiederholungen.
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Das
Sequenzintervall enthielt zwei Dinukleotid-Wiederholungen (>(TG)8) und eine einzelne Tetranukleotid-Wiederholung ((TTTA)6).
Die TG-Dinukleotid-Wiederholungen befinden sich an den Positionen
209-224 und 52.693-52.708. Die Tetranukleotid-Wiederholung befindet
sich an Position 7795-7810.
Es wurden keine Trinukleotid-Wiederholungen > 5 identifiziert. Nur die TG8-Wiederholung
ist nachweislich polymorph.
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Zusätzlich zu
den üblicheren,
Wiederholungselementen enthält
das PKD1-Gen verschiedene Arten von repetitiven Sequenzen, welche
entweder in bestehenden Datenbanken nicht erscheinen, oder dort
nicht in der extremen Form erscheinen, wie sie an diesem Lokus auftreten.
Die auffallendste Wiederholung ist ein 2,5 kb Segment innerhalb
des 4 kb BamH1-Sac1-Fragmentes.
Eine wesentlich kürzere C-T-reiche
Region befindet sich auch im benachbarten 1,8 kb Sacl-BamH1-Fragment.
Es stellte sich heraus, dass diese Regionen aufgrund des hohen GC-Gehalts
(65 %), der Purinasymmetrie hinsichtlich jeden Stranges und der
Länge der
Wiederholung sehr schwierig eindeutig zu sequenzieren waren. Der Codierstrang
in dieser Region weist einen extremen Pyrimidin-Hang auf, mit 96
% C-T, und konnte nicht mit T7 DNA-Polymerase oder Sequenase sequenziert
werden. Dies war der Fall ungeachtet der Matrizenart (Plasmid, Einzelstrangphage
oder stranggetrennte Einzelstrang-DNA). In beiden Fällen wurde der
nichtcodierende Strang, welcher G-A-reich ist, sowohl mit T7 DNA-Polymerase
als auch mit Sequenase erfolgreich sequenziert, obwohl die Lauflängen im
Vergleich zu allen anderen sequenzierten Regionen merklich verkürzt waren.
Kompressionen auf dem nichtcodierenden Strang wurden durch herkömmliche
und Zyklussequenzierung mit Einzelstrang-Matrize aufgelöst. Die
extreme Purin-Asymmetrie der Stränge
in diesem Segment kann unter den entsprechenden Bedingungen (pH,
bivalente Kationen, Superknäuelung)
die lokalisierte Dreifachstrang-Konformation unterstützen und
kann der Hauptgrund für
die Schwierigkeiten beim Sequenzieren dieses Segments sein.
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Die
andere ungewöhnliche
Wiederholung befand sich im 7,6 kb Xho1-Fragment. Diese Wiederholung
weist eine Länge
von 459 bp auf und besteht aus 17 Tandemkopien einer perfekten 27
bp Wiederholung.
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Beispiel 2: PKD1-cDNA-Sequenzen
erhalten durch Exon-Trapping
und cDNA-Selektionstechniken
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Das
700 kbp Intervall des Chromosoms 16, welches das PKD1-Gen beinhaltet,
scheint besonders reich an CpG-Inseln zu sein und ist, durch Assoziation,
sehr wahrscheinlich auch reich an exprimierten Sequenzen. Zum Reinigen
und Sequenzieren exprimierter PKD1-Sequenzen wurde ein Exon-Rescue-Vektor,
pSPL3, verwendet, um Sequenzen aus Cosmiden zu gewinnen, welche
sowohl ein Spleißempfänger- als
auch ein Spleißspenderelement
enthalten; dieses Verfahren wird als „Exon-Trapping" bezeichnet. Die
Anwendung dieses Verfahrens erlaubte in Verbindung mit Standardsubklonierungs-,
Amplifikations- und DNA-Sequenzierungsverfahren
die Bestimmung der PKD1-cDNA-Sequenz wie in 2 gezeigt.
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Exon-Trapping
ist ein hochwirksames Verfahren zum Isolieren exprimierter Sequenzen
von genomischer DNA. Das Verfahren verwendet das pSPL3-Plasmid,
welches Hasen-β-Globin-Codiersequenzen getrennt
durch einen Anteil des HIV-tat-Gens enthält, oder verbesserte Derivate
von SPL3, denen kryptische (störende)
Spleißstellen
fehlen. Fragmente geklonter PKD1-genomischer
DNA wurden in das Intron des tat-Gens geklont und die daraus resultierenden
Subklone wurden in COS-7-Zellen transfiziert. SV40-Sequenzen im
Vektor erlauben sowohl eine entspannte episomale Replikation des
transfizierten Vektors als auch die Transkription der geklonten
genomischen DNAs. Exons innerhalb der subklonierten genomischen
DNAs gespleißt
in das Globin/tat-Transkript wurden mittels RT-PCR gewonnen, unter
Verwendung von Primern, welche tat-Spleißspender- und -empfängersequenzen
enthalten. Ein Hauptvorteil des Exon-Trappings ist, dass die Expression der
geklonten DNA durch einen Virenpromotor gelenkt wird; somit ist
die Entwicklungs- oder
gewebsspezifische Expression von Genprodukten kein Problem.
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PKD1-enthaltende
Genomklone, entweder in der Form eines Cosmids oder P1-DNA, wurden
entweder doppelt mit BamHI und BglII verdaut oder teilweise mit
Sau3A, und es folgte eine Shotgun-Klonierung in BamHI-verdauten
und dephosphorylierten pSPL3 (GIBCO BRL, Bethesda, MD) oder seine
Derivate. Plasmid-Minipräparationen
wurden in COS-7-Zellen elektroporiert, und „eingeschlossene" Exons wurden durch
RT-PCR gewonnen, gefolgt von einer Subklonierung mittels Standardverfahren.
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Eingeschlossene
Exons vom PKD1-Lokus sind in 9 (unten)
dargestellt. Die eingeschlossenen Exons wurden wie zuvor automatisierter DNA-Sequenzierung
unterzogen, wobei ihre Ausrichtung mit der genomischen PKD1-DNA
zugelassen wurde.
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Beispiel 3: Diagnosetest
für PKD1-Mutationen
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Vollblutproben,
gesammelt in hochglukosehaltigen ACD-Vacutainern
TM (gelber
Deckel), wurden zentrifugiert und der Leukozytenfilm wurde entnommen.
Die weißen
Blutkörperchen
wurden mit zwei Waschungen einer 10:1 (Vol.-Vol%) Mischung aus 14 mM
NH
4Cl und 1 mM NaHCO
3 lysiert,
ihre Kerne wurden in Kern-Lyse-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,4 M NaCl,
2 mM EDTA, 0,5 % SDS, 500 ug/ml Proteinase K) resuspendiert und über Nacht
bei 37°C
inkubiert. Proben wurden dann mit einem Viertelvolumen gesättigtem
NaCl extrahiert und die DNA wurde in Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde dann
mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl,
pH 7,5, 1 mM EDTA) aufgelöst.
0,2-1 μg DNA
(in 1-2 μl)
wurden dann zu einer PCR-Reaktionsmischung zugegeben, welche folgende
Komponenten enthielt:
| 10X
Taq-Puffer | 8 μl |
| dNTPS
(je 2 mM) | 7 μl |
| Vorwärtsprimer
(100 μM) | 1,5 μl |
| Rückwärtsprimer
(100 μM) | 1,5 μl |
| Blockier-Oligo
(2 mM) | 1,5 μl |
| Taq
DNA-Polymerase | 1 μl |
| Wasser
auf | 80 μl |
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Dreißig Amplifikationszyklen
wurden dann durchgeführt,
mittels eines standardmäßigen DNA-Thermo-Cyclers
und dem fol genden Protokoll für
jeden Zyklus: 94°C,
30 Sekunden; 55°C,
30 Sekunden und 72°C,
30 Sekunden. Es dürfte
verständlich
sein, dass die bei den zuvor genannten Reaktionen verwendeten Enzyme
und Nukleotide von einem beliebigen Hersteller bezogen werden können, wie GIBCO-BRL,
Promega, New England Biolabs und dergleichen.
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Das
zuvor beschriebene in der Reaktion verwendete Vorwärtsprimer
weist ein Oligonukleotid auf, welches sowohl mit authentischen PKD1-
als auch mit PKD1-Homolog-Sequenzen hybridisiert. Ein Beispiel eines
solchen Primers ist: 5'-CAGGACCTGTCCCAGGCAT-3'. Das Rückwärtsprimer
weist eine Sequenz auf, die von einer 3'-Region des Authentischen PKD1-Gens abgeleitet ist,
welche in den PKD1-Homologa vorliegen kann oder nicht. Beispiele
geeigneter Rückwärtsprimer
sind: 5'-CTGGCGGGCGAGGAGAT-3', 5'-CTTTGACAAGCACATCT-3' und 5'-CAACTGGCTGGACAACA-3'.
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Das
blockierende Oligonukleotid weist: 5'-AGGACCTGTCCAGGCATC-3' auf. Wichtig ist, dass
dieses Oligonukleotid nicht in der Lage sein darf, die Polymerisation
zu unterstützen.
Ein Beispiel ist ein Oligonukleotid in welchem das 3'-Terminusnukleotid
ein Dideoxynukleotid aufweist. Es dürfte verständlich sein, dass jede Modifikation,
welche diese Wirkung erzielt in der praktischen Anwendung dieser Erfindung
zum Einsatz kommen kann. Unter entsprechenden Bedingungen hybridisiert
das Blockier-Oligonukleotid effektiv mit den PKD1-Homologa, jedoch ineffektiv
mit der authentischen PKD1-Sequenz.
Somit sind die Amplifikationsprodukte in diesem Diagnosetest nur
von dem authentischen PKD1-Gen abgeleitet.
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Die
zuvor erhaltenen RT-PCR-Produkte wurden wie Folgt auf die Gegenwart
spezifischer PKD1-Mutationen analysiert: 8 μl des wie zuvor beschrieben
hergestellten Amplifizierten wurden zu 50 μl einer denaturierenden Lösung (0,5
mM NaOH, 2,0 M NaCl, 25 mM EDTA) zugegeben und auf Nylonmembran filter
(INC Biotrans) getupft. Die DNA wurde dann durch Backen der Filter
bei 80°C
für 15
Minuten unter Vakuum auf den Membranen fixiert.
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Oligonukleotide,
welche PKD1-Mutationen erkennen, wurden mit Hilfe eines automatisierten Synthesizers
chemisch synthetisiert und mit 32P mit Polynukleotidkinase
radioaktiv markiert, und zwar mit Verfahren, welche den Standard
in der Technik darstellen.
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Die
Hybridisierungen erfolgten in Kunststoffbeuteln, welche die wie
in Beispiel 1D oben hergestellten Filter enthielten, zu welchen
ein oder mehrere markierte Oligonukleotide in einem Hybridisierungspuffer
(3,0 M Tetramethylammoniumchlorid (TMAC), 0,6 % SDS, 1 mM EDTA,
10 mM Natriumphosphat pH 6,8, 5 × Denhardt's Lösung
und 40 μg/ml
Hefe-RNA) zugegeben wurden. Die Oligonukleotidkonzentrationen in
den Pools reichten von 0,03 bis 0,15 pmol/ml Hybridisierungslösung.
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Die
Hybridisierungen erfolgten über
Nacht bei 52°C,
unter Rühren.
Die Membranen wurden dann aus den Beuteln entfernt und für 20 Minuten
bei Raumtemperatur mit Waschpuffer (3,0 M TMAC, 0,6 % SDS, 1 mM
EDTA, 10 mM Natriumphosphat pH 6,8) gewaschen, gefolgt von einer
zweiten Waschung in dem gleichen Puffer für 20 Minuten bei 52°C. Die Membranen
wurden dann getrocknet und einem Kodak X-OMAT-Film ausgesetzt.