DE60027027T2

DE60027027T2 - Pca3 mrna in gutartigen und bösartigen prostatageweben

Info

Publication number: DE60027027T2
Application number: DE60027027T
Authority: DE
Inventors: Ursula Busse; Camille Chypre; Yves Sillery FRADET
Original assignee: Diagnocure Inc
Current assignee: Diagnocure Inc
Priority date: 1999-09-29
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2020-09-30
Also published as: US20180171416A1; ES2260059T3; ATE321857T1; PT1222266E; EP1222266B1; US7368545B1; US20120315634A1; US20100129824A1; US9909189B2; CA2385477C; US20080261228A1; US7927806B2; WO2001023550A2; DK1222266T3; JP2006314328A; JP2003510075A; US7655408B2; WO2001023550A3; DE60027027D1; US8241848B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Prostatakrebs. Im Speziellen betrifft die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren zur Diagnose des Vorliegens von Prostatakrebs oder der Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln, in einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Bestimmen der Menge differentiell exprimierter PCA3-mRNA in einer von dem Patienten entnommenen Probe, und (b) das Diagnostizieren des Vorliegens von Prostatakrebs oder der Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln, in dem Patienten, wobei das Vorliegen einer langen PCA3-mRNA mit einer Sequenz zwischen Exon 3 und Exon 4a, was zu einer PCA3-mRNA mit einer Sequenz, welche länger als die in SEQ ID NO: 2 dargestellte ist, führt, einen nicht bösartigen Zustand der Prostata anzeigt und das Vorliegen einer kurzen PCA3-mRNA mit einer Sequenz, wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt, das Vorliegen von Prostatakrebs oder die Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln, anzeigt.
Des weiteren wird ein Verfahren zur Feststellung des Stadiums von Prostatakrebs zur Verfügung gestellt. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Sonden oder Primern, die an die zusätzliche Sequenz, wie in SEQ ID NO: 1 im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 gezeigt wird, spezifisch hybridisieren, für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zur Diagnose des Vorliegens von Prostatakrebs oder der Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln.
Die vorliegende Offenbarung stellt Nucleinsäuremoleküle (Boten-RNAs), die durch das PCA3-Gen codiert werden; die differenzierte Expression von zwei dieser RNA-Spezies in einem nichtbösartigen und bösartigen Protatastadium; Verfahren zum spezifischen Diagnostizieren von Prostatakrebs, welche auf dem Nachweis der RNA-Spezies beruhen, die mit Prostatakrebs in Zusammenhang stehen; therapeutische Ansätze gegen Prostatakrebs, die diese zwei RNA-Spezies involvieren; Nucleinsäuremoleküle und Antikörper, die eine Bindungsaffinität für die differentiell exprimierten mRNAs besitzen; Kits, welche die Nucleinsäuresonden oder Antikörper enthalten; Bioanalysen, welche die Nucleinsäuresequenzen der differentiell exprimierten mRNAs der vorliegenden Offenbarung verwenden, um eine Diagnose, eine Bewertung oder eine Prognose von einem Säuger zu erstellen, der von Prostatakrebs betroffen ist oder der anfällig ist, einen Prostatakrebs zu entwickeln; und Bioanalysen für das Absuchen von Verbindungen, welche die Expression der mRNAs der vorliegenden Offenbarung modulieren, zur Verfügung.
Über die letzte Dekade wurde der Prostatakrebs zu der am häufigsten diagnostizierten, bösartigen Erkrankung beim Menschen und nach Lungenkrebs die zweithäufigste Ursache für Todesfälle bei Männern mit einer Krebserkrankung in der westlichen Bevölkerung (Landis et al., 1998, CA Cancer J. Clin 48(1):6-29). Von allen Krebsarten steigt die Verbreitung von Prostatakrebs am schnellsten in Korrelation zum Alter. Weil die Langlebigkeit unter der westlichen Bevölkerung steigt, bleibt eine entsprechende Erhöhung der Anzahl von Patienten mit Prostatakrebs bestehen mit einem erwarteten Anstieg von 60% nur in dieser Dekade. Die Mortalität stieg mit einer niedrigeren Rate, hat sich aber in den letzten 50 Jahren verdoppelt. Obwohl diese Erkrankung typischerweise bei Männern mit einem Alter von über 65 Jahren diagnostiziert wird, ist die Auswirkung jedoch insofern bedeutsam, dass die durchschnittliche Lebenserwartung eines Mannes, der an Prostatakrebs stirbt, um 9–10 Jahre vermindert ist. Wenn er entdeckt wird, kann heute ein früher Prostatakrebs durch einen chirurgischen Eingriff in etwa 90% der Fälle geheilt werden. Leider ist die Erkrankung auf eine langsame Weise tödlich, wenn sich der Tumor außerhalb des Drüsengebietes ausgebreitet hat und entfernte Metastasen bildet. Ein früher Nachweis der Erkrankung, während sie noch auf die Prostatadrüse beschränkt ist, und ein genaues Feststellen des Stadiums für die Auswahl einer geeigneten Therapie sollte die Mortalitätsraten verbessern.
Trotz vieler Fortschritte in den letzten Jahren ist die Präzision, mit der das Stadium eines Individuums, das unter Prostatakrebs leidet, festgestellt werden kann, suboptimal. Der Hauptgrund dafür ist, dass der Tumor, der sich außerhalb der Prostata ausgebreitet hat, im Allgemeinen eher mikroskopisch als makroskopisch ist. Eine digitale, rektale Untersuchung der Prostata war die Grundlage für das lokale Feststellen des Stadium von Prostatakrebs für viele Dekaden, aber das Ausmaß der Erkrankung wurde häufig unterschätzt. Ein ausschließlicher transrektaler Ultraschall ist als ein Mittel zur Feststellung des Stadiums des Prostatakrebs nur von begrenztem Wert. Computertomographie und magnetische Resonanzabbildung waren im Allgemeinen enttäuschend für das Feststellen des Stadiums von Prostatakrebs (Kirby, 1997, Prostata Cancer and Prostatic Diseases 1:2-10). Neuere, vielversprechende Ansätze zur Feststellung des Stadiums von Prostatakrebs schließen die Verwendung von biochemischen und molekularen Techniken ein, die sich auf Proteine oder ihre entsprechenden Nucleinsäuren, die vorzugsweise in Prostatazellen exprimiert werden, konzentrieren (Lange, 1997, in "Principles and Practice of Genitourinary Oncology", Hrsg. Lippincott-Raven Publisher, K. 41, S. 417-425). Die bekanntesten Prostatamarker sind PSA (Prostata spezifisches Antigen) und PSM (Prostata spezifische Membran)-Antigen.
PSA ist ein sezerniertes Glycoprotein, das von dem auf dem Chromosom 19 gelegenen PSA-Gen codiert wird. Es wird unter Androgenkontrolle von den glandulären Epithelzellen der Prostata exprimiert und in das Samenplasma sezerniert. Das PSA-Protein ist normalerweise auf die Prostata begrenzt, aber im Fall einer Prostataerkrankung wie z.B. Krebs oder BPH (gutartige Hyperplasie der Prostata) tritt PSA in das Blut aus, wo es in anderen Formen vorliegt, einschließlich einer, die an Proteinkomplexen gebunden ist, und einer, die nicht an Proteinkomplexen gebunden ist (EL-Shirbiny, 1994, Adv Clin Chem 31: 99). Das Messen der Gesamtkonzentrationen von PSA im Serum ist eines der am häufigsten verwendeten und von der FDA genehmigten biochemischen Tests für das Absuchen und die Behandlung von Patienten mit Prostatakrebs. Bisherige Studien deuten darauf hin, dass das Absuchen mit PSA zusammen mit einer digitalen rektalen Untersuchung und einem transrektalen Ultraschall den Nachweis von frühen Prostatakrebsen erhöht, häufig während er noch in der Drüse selbst lokalisiert ist (Brawer et al., 1992, J Urol 147:841). PSA im Serum ist ebenfalls für das Überwachen von Patienten nach der Therapie nützlich, besonders nach der chirurgischen Entfernung der Prostata. Das Messen des gesamten PSA identifiziert jedoch ebenfalls eine große Anzahl von Patienten mit abnormal erhöhten Spiegeln, bei denen anschließend kein Prostatakrebs gefunden wird. Vor kurzem wurde gezeigt, dass das Konzept des Messens des Verhältnisses von freiem/gesamten PSA in Prozent die Spezifität des Absuchens von Prostatakrebs bei Männern mit PSA zwischen 4 und 10 ng/ml erhöht (Letran et al., 1998, J Urol 160:426).
Das PSM-Gen codiert ein transmembranes Glycoprotein, das von den Epithelzellen einer normalen Prostata, einer gutartigen Hyperplasie der Prostata und zu einem größeren Ausmaß von bösartigen Prostatagewebe exprimiert wird. Niedrige Spiegel von PSM werden ebenfalls in einigen anderen Geweben nachgewiesen (Israeli et al., 1994, Cancer Res 54:1807). PSA und PSM waren ebenfalls Ziele für molekulare Ansätze von Prostatakrebs, wobei RT-PCR (reverse Transkriptions-Polymerasekettenreaktion) verwendet wurde. Diese sehr sensitive Technologie zur Amplifikation von Nucleinsäuren wird verwendet, um Zellen basierend auf der Expression spezifischer Boten-RNAs zu identifizieren. Sie beinhaltet die Herstellung von RNA-Proben von Geweben oder Körperflüssigkeiten, ihre reverse Transkription in cDNA und das Amplifizieren der spezifischen cDNAs durch die Verwendung von Primern, die auf das bestimmte Gen des Interesses zielen. RT-PCR-Analysen von Blut, Lymphknoten und Knochenmark von Patienten mit Prostatakrebs unter Verwendung von PSA und PSM haben die außergewöhnliche Sensitivität dieses Ansatzes offenbart. Der klinische Nutzen von molekularen Tests muss jedoch noch bestätigt werden (Verkaik et al., 1997, Urol Res 25:373; Gomella et al., 1997, J Urol 158:326).
Daher bleibt eine Notwendigkeit, einen sensitiveren Test für das Diagnostizieren von Prostatakrebs zur Verfügung zu stellen, bestehen. Es bleibt ebenfalls einen Notwendigkeit, einen besseren Test für das Feststellen des Stadiums von Prostatakrebs bestehen. Ebenfalls bleibt eine Notwendigkeit bestehen, einen Prostatakrebsmarker, der spezifischer und verlässlicher für den Nachweis, das Feststellen des Stadiums und die Behandlungsverfahren von Prostatakrebs ist, zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung versucht, diese und andere Erfordernisse zu erfüllen.
Ein neuer Prostatakrebsmarker, PCA3, wurde vor wenigen Jahren durch die Differential-Display-Analyse entdeckt, die beabsichtigt, Gene, die mit der Entwicklung von Prostatakrebs assoziiert sind, hervorzuheben (PCT-Anmeldungsnummer PCT/CA98/00346). PCA3 ist auf Chromosom 9 lokalisiert und ist aus vier Exons zusammengesetzt. Es codiert mindestens vier unterschiedliche Transkripte, die durch alternatives Spleißen und Polyadenylierung hergestellt werden. Durch die RT-PCR-Analyse wurde herausgefunden, dass die Expression von PCA3 auf die Prostata beschränkt ist und dass sie in allen anderen Geweben einschließlich Hoden, Eierstock, Brust und Blase fehlt. Die Northern-Blot-Analyse zeigt, dass PCA3 in der großen Mehrheit vom untersuchtem Prostatakrebs (47 von 50) hoch exprimiert ist, wohingegen keine oder nur eine sehr geringe Expression in einer gutartigen Hyperplasie der Prostata oder in normalen Prostatazellen der gleichen Patienten gefunden wird. Es besteht mindestens eine 20-fache Überexpression von PCA3 in Prostatakarzinomen im Vergleich zu normalen oder BPH-Geweben. Die PCA3-Expression scheint mit dem Tumorgrad zu steigen und wird in metastatischen Läsionen nachgewiesen.
Zusammengefasst ist das Feststellen des Stadiums von Prostatakrebs, das auf spezifischen Marker wie z.B. PSA und PSM basiert, ein sehr vielversprechender Weg für die Behandlung der Erkrankung. Der Nachteil bei der Verwendung von PSA oder PSM für das Feststellen des Stadiums von Prostatakrebs liegt darin, dass sie sowohl in normalen Zellen als auch in Krebszellen exprimiert werden. Zusätzlich können nur schwach differenzierte Tumore der Diagnose entkommen, da sie dazu tendieren, deutlich weniger PSA-Protein als weniger aggressive Tumore herzustellen. Dies ist der Fall für 10% aller Prostatakrebse. Auf der anderen Seite wird PCA3 in Krebszellen und in normalen Zellen der Prostata differentiell exprimiert und seine Expression sinkt nicht mit einem erhöhten Tumorgrad. PCA3 könnte daher ein nützliches Mittel sein, das die Nachteile von PSA und PSM bei der Diagnose, dem Feststellen des Stadiums und der Behandlung von Patienten mit Prostatakrebs überwindet.
Die Offenbarung betrifft die Entdeckung von bestimmten PCA-RNAs, die mit einem nichtbösartigen und/oder einem bösartigen Zustand der Prostata assoziiert sind. Die Offenbarung betrifft ebenfalls die Feststellung, dass ein Gleichgewicht zwischen dem Spiegel dieser PCA3-mRNAs mit dem nichtbösartigen oder dem bösartigen Zustand der Prostata korreliert.
Einer dieser RNAs entspricht einem PCA3-RNA-Molekül, das eine zusätzliche Sequenz von 228 bp (dargestellt in SEQ ID NO: 1) besitzt, die zwischen den Exons 3 und 4a eingefügt ist, wohingegen der anderen die zusätzliche Sequenz (SEQ ID NO: 2) fehlt. Die RNA, der die zusätzliche Sequenz fehlt, ist mit Prostatakrebs assoziiert, wohingegen die RNA, welche diese umfasst, mit einem nichtbösartigen Zustand der Prostata assoziiert ist. Basierend auf der differentiellen Expression dieser zwei PCA3-RNA-Spezies werden Protokolle für die Diagnose einer Erkrankung der Prostata zur Verfügung gestellt. Die vorstehend beschriebenen Ergebnisse können ebenfalls zu einem therapeutischen Ansatz gegen den Prostatakrebs führen.
Die Offenbarung betrifft des weiteren Reagenzien und Verfahren, um das Stadium der Prostata in einem Tier zu bestimmen, die eine quantitative Bestimmung von SEQ ID NO: 1 oder Fragmente oder Varianten davon im Hinblick auf SEQ ID NO: 2 oder Fragmente oder Varianten davon umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Entdeckung und die Charakterisierung einer neuen Sequenz, die in PCA3-mRNA exprimiert ist und die eine Bestimmung des Zustands der Prostata in einem Tier ermöglicht, welche auf einer Bestimmung der relativen Menge von zwei differentiell exprimierten PCA3-mRNAs basiert.
Die Offenbarung stellt im Allgemeinen isolierte Nucleinsäuremoleküle zur Verfügung, welche differentiell exprimierte PCA3-mRNAs codieren, und Varianten oder Anteile davon, die ihre Fähigkeiten behalten, eine Bestimmung des Zustandes der Prostata zu ermöglichen.
Die Erfindung stellt des weiteren gereinigte Polypeptide zur Verfügung, die durch die differentiell exprimierten PCA3-mRNAs der vorliegenden Erfindung codiert werden, oder einen Epitop bindenden Anteil davon.
Die Offenbarung stellt ebenfalls Nucleinsäuren für den spezifischen Nachweis des Vorliegens der differentiell exprimierten PCA3-mRNAs, die mit Prostatakrebs assoziiert sind, oder der Proteine oder Polypeptide, die durch solche mRNAs codiert werden, in einer Probe zur Verfügung.
Die Erfindung stellt ein in-vitro-Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure, welche die differentiell exprimierten PCA3-mRNAs codiert, zur Verfügung.
Es wird ebenfalls ein Kit zum Nachweis des Vorliegens einer Nucleinsäure, welche die differentiell exprimierten PCA3-mRNAs codiert, in einer Probe offenbart.
Die Erfindung stellt des weiteren ein Verfahren zum Nachweis differentiell exprimierter PCA3-mRNAs in einer Probe zur Verfügung. Sie stellt ebenfalls ein Verfahren zum Bestimmen der Menge differentiell exprimierter PCA3-mRNAs in einer Probe zur Verfügung.
Die Offenbarung betrifft des weiteren einen diagnostischen Kit, der einen ersten Behälter umfasst, der Nucleinsäuremoleküle enthält, die für eine differentiell exprimierte PCA3-mRNA spezifisch sind, und einen zweiten Behälter, der eine Sonde enthält, die für differentiell exprimierte PCA3-mRNAs spezifisch ist.
Die Erfindung betrifft des weiteren diagnostische Verfahren für menschliche Erkrankungen, insbesondere Prostatakrebs. Vorzugsweise wird hierin ein Verfahren zum Diagnostizieren des Vorliegens von Prostatakrebs oder der Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln, in einem Patienten zur Verfügung gestellt.
Nachdem die differentielle Expression von mRNAs als ein Marker für den Zustand der Prostata eines Tieres identifiziert wurde und insbesondere nachdem gezeigt wurde, dass das Vorliegen einer zusätzlichen Sequenz, welche die codierende Sequenz des codierten PCA3-Proteins unterbricht, mit einem nicht bösartigen Stadium korreliert, während das Fehlen der zusätzlichen Sequenz und die fehlende Unterbrechung des dadurch codierten Proteins mit einem bösartigen Krebs korreliert, stellt die vorliegende Offenbarung daher die Mittel zur Verfügung, die codierende Sequenz des PCA3-Proteins zu unterbrechen, wobei jedes Mittel der Gentechnik verwendet werden kann, das einem Fachmann bekannt ist, und bewertet, ob eine solche Unterbrechung den bösartigen Phänotyp umkehren kann.
Um ein klares und übereinstimmendes Verstehen der Begriffe, die in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, zur Verfügung zu stellen, wird nachfolgend eine Anzahl von Definitionen zur Verfügung gestellt.
Die Terminologie "nichtbösartige Prostata oder nichtbösartiger Zustand", wie sie hierin verwendet wird, soll einen nicht kanzerösen Zustand der Prostata umfassen. Daher sollen solche Terminologien einen normalen Zustand sowie einen gutartigen Zustand der Prostata (wie zum Beispiel BPH) einschließen.
Weil die differenzierenden Marker zwischen dem bösartigen und dem nicht bösartigen Zustand der Prostata im mRNA-Spiegel und Proteinspiegel liegen (d.h. ein exprimierter Marker), ist einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung, dass eine Bestimmung des Prostatazustandes in einem Tier unter Verwendung einer Anzahl von Mitteln, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, ermöglicht wird. Beispiele von solchen Mitteln, die nicht einschränkend sein sollen, schließen Nucleinsäuresonden, Antikörper, Liganden und PNAs in leicht erhältlichen Zellen, die diese differenzierende Marker exprimieren, ein. Ein Beispiel, das nicht einschränkend sein soll, beinhaltet Lymphocyten, wodurch eine Bestimmung von einer einfachen Blutprobe ermöglicht wird.
Der Ausdruck "Probe" wird hierin weitläufig verwendet, um alle Arten von Proben von einem Tier zu bezeichnen, in der die differentielle Expression der/des kurzen und/oder der langen PCA3-Nucleinsäure oder PCA3-Proteins der vorliegenden Erfindung analysiert werden kann. Beispiele davon, die nicht einschränkend sein sollen, schließen Biopsien, Blut, Feinnadelbiopsien, Urin und Knochenmark ein.
Nucleotidsequenzen sind hierin als Einzelstrang in der 5'- zu 3'-Richtung von links nach rechts dargestellt, wobei die Einbuchstaben-Nucleotidsymbole, die im Allgemeinen in dem Fachgebiet und gemäß den Empfehlungen der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission verwendet werden, verwendet wird.
Wenn sie nicht anders definiert sind, haben die hierin verwendeten wissenschaftlichen und technologischen Begriffe und die hierein verwendete wissenschaftliche und technologische Nomenklatur die gleiche Bedeutung, wie im Allgemeinen von einem Fachmann, auf den sich die Erfindung bezieht, verstanden wird. Im Allgemeinen sind die Verfahren für die Zellkultur, Infektion, Verfahren der Molekularbiologie und dergleichen auf dem Fachgebiet allgemein verwendete Verfahren. Solche Standardtechniken können in Handbüchern, auf die Bezug genommen wird, wie zum Beispiel Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratories) und Ausubel et al. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York) gefunden werden.
Die vorliegende Erfindung bezeichnet eine Anzahl von routinemäßig verwendeten Begriffen der rekombinanten DNA (rDNA)-Technologie. Dennoch werden Definition von ausgewählten Beispielen solcher rDNA-Begriffe für die Klarheit und Übereinstimmung zur Verfügung gestellt.
Der Ausdruck "Nucleinsäuremolekül", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein Polymer von Nucleotiden. Beispiele davon, die nicht einschränkend sein sollen, schließen DNA-Moleküle (d.h. genomische DNA, cDNA) und RNA-Moleküle (d.h. mRNA) ein. Das Nucleinsäuremolekül kann durch Techniken der Klonierung erhalten oder synthetisiert werden. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig (codierender Strang oder nichtcodierender Strang [Antisense]) sein.
Der Ausdruck "rekombinante DNA", wie er auf dem Fachgebiet bekannt ist, bezieht sich auf ein DNA-Molekül, das durch die Verbindung von DNA-Segmenten erhalten wird. Dies wird häufig als Gentechnik bezeichnet.
Der Ausdruck "DNA-Segment", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein DNA-Molekül, das einen linearen Abschnitt oder eine lineare Sequenz von Nucleotiden umfasst. Diese Sequenz kann, wenn sie gemäß des genetischen Codes gelesen wird, einen linearen Abschnitt oder eine lineare Sequenz von Aminosäuren codieren, die als ein Polypeptid, Protein, Proteinfragment oder dergleichen bezeichnet wird.
Der Ausdruck "Amplifikationspaar" bezieht sich hierin auf ein Paar von Oligonucleotiden (Oligos) der vorliegenden Erfindung, die ausgewählt werden, um zusammen bei einer Amplifikation einer ausgewählten Nucleinsäuresequenz durch eine der vielen Arten des Amplifikationsprozesses, vorzugsweise durch eine Polymerasekettenreaktion, verwendet zu werden. Andere Arten des Amplifikationsprozesses schließen die Ligasekettenreaktion, Strangverdrängungsamplifikation oder auf Nucleinsäuresequenz basierende Amplifikation ein, wie nachfolgend detaillierter erklärt wird. Wie auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist, werden die Oligos entworfen, um an eine komplementäre Sequenz unter ausgewählten Bedingungen zu binden.
In einer bestimmten Ausführungsform der Verfahren und der Verwendungen der Erfindung wird die Amplifikation einer Nucleinsäureprobe von einem Patienten unter Bedingungen ausgeführt, welche die Amplifikation einer differentiell exprimierten Nucleinsäure, die in der größten Menge vorliegt, bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Verfahren und der Verwendungen der Erfindung wird die RT-PCR von einer mRNA-Probe eines Patienten unter Bedingungen durchgeführt, welche die Amplifikation der in der größten Menge vorliegenden PCA3-mRNA bevorzugt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Verfahren und der Verwendungen der Erfindung wird die Amplifikation der differentiell exprimierten PCA3-Nucleinsäuren gleichzeitig durchgeführt. Selbstverständlich wird ein Fachmann erkennen, dass solche Verfahren für den Nachweis von differentiell exprimierten Proteinen anstelle von differentiell exprimierten Nucleinsäuresequenzen angepasst werden können.
Die Nucleinsäure (das heißt die DNA oder RNA) für die Durchführung der vorliegenden Erfindung kann gemäß gut bekannter Verfahren erhalten werden.
Oligonucleotidsonden oder -primer, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, können von jeder geeigneten Länge sein, abhängig von dem bestimmten Analyseformat und den bestimmten Erfordernissen und den als Ziel gesetzten Genomen, die verwendet werden. Im Allgemeinen besitzen die Oligonucleotidsonden oder -primer mindestens 12 Nucleotide in der Länge, vorzugsweise zwischen 15 und 24 Molekülen und sie können angepasst werden, so dass sie für ein gewähltes Nucleinsäure-Amplifikationssystem besonders geeignet sind. Wie auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist, können die Oligonucleotidsonden und -primer entworfen werden, indem der Schmelzpunkt der Hybridisierung von ihnen mit ihrer Zielsequenz berücksichtigt wird (vergl. nachfolgend und in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, CSH Laboratories; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., NY).
Der Ausdruck "Oligonucleotid"- oder "DNA"-Molekül oder -Sequenz bezieht sich auf ein Molekül, das aus den Desoxyribonucleotiden Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) und/oder Cytosin (C) besteht. Wenn es in einer doppelsträngigen Form vorliegt, kann es ein "regulatorisches Element", wie der Ausdruck hierin definiert ist, gemäß der Erfindung umfassen oder einschließen. Der Ausdruck "Oligonucleotid" oder "DNA" kann in linearen DNA-Molekülen oder DNA-Fragmenten, Viren, Plasmide, Vektoren, Chromosomen oder synthetisch abgeleiteter DNA gefunden werden. Wie hierin verwendet, können besonders doppelsträngige DNA-Sequenzen gemäß der normalen Konvention, die Sequenz nur in der 5' zu 3'-Richtung anzuzeigen, beschrieben werden. Es wird ebenfalls erkannt werden, dass ein "Oligonucleotid" in einer einzelsträngigen Form vorliegen kann.
Die "Nucleinsäurehybridisierung" bezieht sich im Allgemeinen auf die Hybridisierung von zwei einzelsträngigen Nucleinsäuremolekülen, die komplementäre Basensequenzen besitzen und die unter geeigneten Bedingungen eine thermodynamisch bevorzugte doppelsträngige Struktur bilden. Beispiele von Hybridisierungsbedingungen können in den zwei Laborhandbüchern gefunden werden, die vorstehend zitiert werden (Sambrook et al., 1989, vorstehend und Ausubel et al., 1989, vorstehend) und sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. In dem Fall einer Hybridisierung auf einem Nitrocellulosefilter wie zum Beispiel in dem gut bekannten Southern-Blot-Verfahren kann ein Nitrocellulosefilter übernacht bei 65°C mit einer markierten Sonde in einer Lösung, die 50% Formamid, einen hohen Salzgehalt (5 × SSC oder 5 × SSPE), 5 × Denhardt-Lösung, 1 % SDS und 100 μg/ml denaturierte Träger-DNA (d.h. Lachssperma-DNA) enthält, inkubiert werden. Die nicht spezifisch bindende Sonde kann anschließend von dem Filter durch mehrfaches Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei einer Temperatur, die im Hinblick auf die gewünschte Strenge ausgewählt wird: Raumtemperatur (niedrige Strenge), 42°C (moderate Strenge) oder 65°C (hohe Strenge) abgewaschen werden. Die ausgewählte Temperatur basiert auf der Schmelztemperatur (Tm) des DNA-Hybrids. RNA-DNA-Hybride können selbstverständlich ebenfalls gebildet und nachgewiesen werden. In solchen Fällen können die Bedingungen der Hybridisierung und des Waschens gemäß gut bekannter Verfahren von einem Fachmann angepasst werden. Vorzugsweise werden stringente Bedingungen verwendet (Sambrook et al., 1989, vorstehend).
Sonden, die in der Erfindung verwendet werden sollen, können mit natürlich vorkommenden Zucker-Phosphat-Rückgraten sowie mit modifizierten Rückgraten einschließlich Phosphorthioaten, Dithionaten, Alkylphosphonaten und α-Nucleotiden und dergleichen verwendet werden. Modifizierte Zucker-Phosphat-Rückgrate werden im Allgemeinen durch Miller,1988, Ann Reports Med Chem 23:295 und Moran et al., 1987, Nucleic acid molecule, Acids Res 14:5019 beschrieben. Sonden, die in der Erfindung verwendet werden sollen, können entweder aus Ribonucleinsäure (RNA) oder Desoxyribonucleinsäure (DNA) aufgebaut sein und vorzugsweise aus DNA.
Die Arten der Nachweisverfahren, in denen Sonden verwendet werden können, schließen Southern-Blots (Nachweis von DNA), Dot- oder Slot-Blots (DNA, RNA) und Northern-Blots (Nachweis von RNA) ein. Obwohl weniger bevorzugt, können ebenfalls markierte Proteine verwendet werden, um eine bestimmte Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, an die sie binden. Vor kurzem wurden PNAs beschrieben (Nielsen et al., 1999, Current Opin Biotechnol 10:71-75). PNAs können ebenfalls verwendet werden, um die mRNAs der vorliegenden Erfindung nachzuweisen. Andere Nachweisverfahren schließen Kits ein, die Sonden auf einer Tauchstab-Anordnung und dergleichen besitzen.
Obwohl die vorliegende Erfindung nicht speziell von der Verwendung einer Markierung für den Nachweis einer bestimmten Nucleinsäuresequenz abhängig ist, kann eine Markierung durch die Erhöhung der Sensitivität des Nachweises vorteilhaft sein. Des weiteren ermöglicht sie die Automatisierung. Sonden können gemäß zahlreicher gut bekannter Verfahren (Sambrook et al., 1989, vorstehend) markiert werden. Beispiele von Markierungen, die nicht einschränkend sein sollen, schließen ³H, ¹⁴C, ³²P und ³⁵S ein. Beispiele von detektierbaren Markern, die nicht einschränkend sein sollen, schließen Liganden, Fluorophore, chemilumineszierende Mittel, Enzyme und Antikörper ein. Andere nachweisbare Marker für die Verwendung mit den Sonden, die eine Erhöhung der Sensitivität des Verfahrens der Erfindung ermöglichen, schließen Biotin und Radionucleotide ein. Es wird dem Fachmann offensichtlich sein, dass die Wahl einer bestimmten Markierung die Art vorschreibt, in der sie an die Sonde gebunden ist.
Wie im Allgemeinen bekannt ist, können radioaktive Nucleotide in Sonden der Erfindung durch verschiedene Verfahren eingebaut werden. Beispiele davon, die nicht einschränkend sein sollen, schließen die Behandlung der 5'-Enden der Sonden mit einer Kinase unter Verwendung von gamma ³²P-ATP und Polynucleotidkinase, die Verwendung des Klenow-Fragments von Pol I von E. coli beim Vorliegen von radioaktivem dNTP (d.h. einheitlich markierte DNA-Sonde unter Verwendung von Zufalls-Oligonucleotidprimern in Gelen mit einem niedrigen Schmelzpunkt), die Verwendung des SP6/T7-Systems zur Transkription eines DNA-Segments beim Vorliegen eines oder von mehreren radioaktiven NTPs und dergleichen ein.
Der Ausdruck "Oligonucleotide" oder "Oligos", wie er hierin verwendet wird, definiert ein Molekül, das zwei oder mehr Nucleotide (Ribo- oder Desoxyribonucleotide) besitzt. Die Größe des Oligos wird von der bestimmten Situation und schließlich von seiner bestimmten Verwendung bestimmt und durch den Fachmann dementsprechend angepasst. Ein Oligonucleotid kann chemisch synthetisiert oder durch Clonierung gemäß gut bekannter Verfahren abgeleitet werden.
Ein "Primer", wie er hierin verwendet wird, definiert ein Oligonucleotid, das in der Lage ist, sich an eine Zielsequenz anzulagern, wobei eine doppelsträngige Region erzeugt wird, die unter geeigneten Bedingungen als Initiationspunkt für eine DNA-Synthese dienen kann.
Die Amplifikation einer ausgewählten Nucleinsäuresequenz oder einer Nucleinsäurezielsequenz kann durch eine Anzahl von geeigneten Verfahren durchgeführt werden. Vergl. im Allgemeinen Kwoh et al., 1990, Am Biotechnol Lab 8:14-25. Zahlreiche Amplifikationstechniken wurden beschrieben und können leicht angepasst werden, um bestimmten Bedürfnissen eines Fachmanns gerecht zu werden. Beispiele von Amplifikationstechniken, die nicht einschränkend sein sollen, schließen die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR), die Strangverdrängungsamplifikation (SDA), die auf Transkription basierende Amplifikation, das Qβ-Replikasesystem und NASBA ein (Kwoh et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA86, 1173-1177, Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6:1197-1202; Malek et al.,1994, Methods Mol Biol, 28:253-260; und Sambrook et al., 1989, vorstehend). Vorzugsweise wird die Amplifikation unter Verwendung von PCR ausgeführt.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wird gemäß bekannter Techniken durchgeführt. Vergl. z.B. US-Pat-Nr.: 4,683,195; 4,683,202: 4,800,159 und 4,965,188 (die Offenbarungen von allen drei US-Patenten werden durch Bezugnahme hierin aufgenommen). Im Allgemeinen schließt die PCR eine Behandlung einer Nucleinsäureprobe (z.B. beim Vorliegen einer hitzestabilen DNA-Polymerase) unter Hybridisierungsbedingungen mit einem Oligonucleotidprimer für jeden Strang der spezifischen Sequenz ein, die nachgewiesen werden soll. Ein Verlängerungsprodukt von jedem Primer, das synthetisiert wird, ist zu jedem der zwei Nucleinsäurestränge komplementär, wobei die Primer ausreichend komplementär zu jedem Strang der spezifischen Sequenz sind, um damit zu hybridisieren. Das Verlängerungsprodukt, das von jedem Primer synthetisiert wird, kann ebenfalls als eine Matrize für die weitere Synthese von Verlängerungsprodukten dienen, wobei die gleichen Primer verwendet werden. Nach einer ausreichenden Anzahl von Syntheserunden der Verlängerungsprodukte wird die Probe analysiert, um zu beurteilen, ob die Sequenz oder die Sequenzen, die nachgewiesen werden sollen, vorliegen. Der Nachweis der amplifizierten Sequenz kann durch Sichtbarmachung nach EtBr-Färbung der DNA nach der Gelelektrophorese oder durch die Verwendung einer nachweisbaren Markierung gemäß bekannter Techniken und dergleichen erfolgen. Für einen Übersichtsartikel über PCR-Techniken (vergl. PCR Protocols, A Guide to Methods and Amplifications, Michael et al., Hrsg., Acad Press, 1990).
Die Ligasekettenreaktion (LCR) wird gemäß bekannter Techniken durchgeführt (Weis, 1991, Science 254:1292). Die Anpassung des Protokolls, um den gewünschten Bedürfnissen gerecht zu werden, kann durch einen Fachmann durchgeführt werden. Die Strangverdrängungsamplifikation (SDA) wird ebenfalls gemäß bekannter Techniken oder durch Anpassungen davon durchgeführt, um den bestimmten Bedürfnissen gerecht zu werden (Walker er al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89: 392-396; und Ibid, 1992, Nucleic Acid Res 20:1691-1696).
Der Ausdruck "Gen", wie er hierin verwendet wird, ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die ein einzelnes Protein oder Polypeptid definiert. Ein "Strukturgen" definiert eine DNA-Sequenz, die in RNA transkribiert wird und in ein Protein, das eine spezifische Aminosäuresequenz besitzt, translatiert wird, wodurch sie ein spezifisches Polypeptid oder Protein erzeugt. Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass die Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung in jedes von zahlreichen etablierten Kit-Formaten, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, aufgenommen werden kann.
Eine "heterologe" Region eines DNA-Moleküls (d.h. ein heterologes Gen) ist ein Untersegment einer DNA innerhalb eines längeren Segments, das in der Natur nicht damit in Assoziation gefunden wird. Der Ausdruck "heterolog" kann auf eine ähnliche Weise verwendet werden, um zwei Polypeptidsegmente zu definieren, die in der Natur nicht verbunden sind. Beispiel von heterogenen Genen, die nicht einschränkend sein sollen, schließen Reportergene wie z.B. Luciferase, Chloramphenicol-Acetyl-Transferase, β-Galactosidase und dergleichen ein, die angrenzend an oder verbunden mit heterologen Kontrollregionen oder heterologen Polypeptiden sein können.
Der Ausdruck "Vektor" ist auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und definiert eine Plasmid-DNA, eine Phagen-DNA, eine Virus-DNA und dergleichen, die als ein DNA-Vehikel dienen können, in das die hierin offenbarte DNA cloniert werden kann. Zahlreiche Arten von Vektoren existieren und sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Der Ausdruck "Expression" definiert den Prozess, durch den ein Gen in mRNA transkribiert wird (Transkription), wobei die mRNA anschließend in ein Polypeptid (oder Protein) oder mehr translatiert wird (Translation).
Der Fachausdruck "Expressionsvektor" definiert einen Vektor oder ein Vehikel, wie vorstehend beschrieben wird, der aber entworfen wird, um die Expression einer eingefügten Sequenz nach der Transformation in einen Wirt zu ermöglichen. Das clonierte Gen (eingefügte Sequenz) wird im Allgemeinen unter der Kontrolle von Kontrollelementsequenzen wie z.B. Promotorsequenzen gestellt. Das Stellen eines clonierten Gens unter solchen Kontrollsequenzen wird häufig als funktionell verbunden mit Kontrollelementen oder -sequenzen bezeichnet.
Funktionell verbundene Sequenzen können ebenfalls zwei Segmente einschließen, die in das gleiche RNA-Transkript transkribiert werden. Daher sind zwei Sequenzen wie z.B. eine Promotorsequenz und eine "Reportersequenz" funktionell verbunden, wenn die Transkription, die mit dem Promotor beginnt, ein RNA-Transkript der Reportersequenz herstellen wird. Um "funktionell verbunden" zu sein, ist es nicht notwendig, dass die zwei Sequenzen direkt aufeinanderfolgend sind.
Die Kontrollsequenzen der Expression werden variieren, abhängig davon, ob der Vektor entworfen wird, um das funktionell verbundene Gen in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt oder in beiden (Shuttle-Vektoren) zu exprimieren, und sie können zusätzlich Transkriptionselemente wie z.B. Enhancerelemente, Terminationssequenzen, gewebsspezifische Elemente und/oder Translationsinitiationsstellen und -terminationsstellen enthalten.
Prokaryontische Expressionen sind für die Herstellung von großen Mengen des Proteins, das durch die DNA-Sequenz des Interesses codiert wird, nützlich. Dieses Protein kann gemäß Standardprotokollen gereinigt werden, die einen Vorteil von in dem Protein vorhandenen Eigenschaften wie z.B. Größe und Ladung (d.h. SDS-Gelelektrophorese, Gelfiltration, Zentrifugation, Ionenaustauschchromatographie ...) ziehen. Zusätzlich kann das Protein des Interesses mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern gereinigt werden. Das gereinigte Protein kann für therapeutische Anwendungen verwendet werden.
Das DNA-Konstrukt kann ein Vektor sein, der einen Promotor umfasst, der funktionell an eine Oligonucleotidsequenz, die hierin offenbart ist, gebunden ist, die ihrerseits funktionell an ein heterologes Gen wie z.B. das Gen für das Luciferase-Reportermolekül gebunden ist. Der "Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Regulatorregion, die in der Lage ist, direkt oder indirekt an RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts gelegenen (3'-Richtung) codierenden Sequenz zu initiieren. Der Promotor kann am 3'-Ende bei der Transkriptionsinitiationsstelle gebunden sein und sich stromaufwärts (5'-Richtung) ausdehnen, um die minimale Anzahl von Basen oder Elementen einzuschließen, die notwendig ist, um die Transkription in Mengen, die über dem Hintergrund detektierbar sind, zu initiieren. Innerhalb des Promotors wird eine Transkriptionsinitiationsstelle (die in geeigneter Weise durch das Kartieren mit der S1-Nuclease definiert ist) sowie Proteinbindungsdomänen (Consensussequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind, gefunden werden. Eukaryontische Promotoren werden häufig, aber nicht immer, "TATA"-Boxen und "CCAT"-Boxen enthalten. Prokaryontische Promotoren enthalten –10- und –35-Consensussequenzen, die dazu dienen, die Transkription zu initiieren, und die Transkriptionsprodukte enthalten eine Shine-Dalgamo-Sequenz, die als eine Ribosomenbindungssequenz während der Initiation der Translation dient.
Die Bezeichnung "funktionelles Derivat", wie sie hierin verwendet wird, kennzeichnet im Kontext eines funktionellen Derivats einer Sequenz, entweder eine Nucleinsäure- oder eine Aminosäuresequenz, ein Molekül, das eine biologische Aktivität (entweder eine Funktion oder eine strukturelle Aktivität) behält, die im Wesentlichen ähnlich zu der Aktivität der ursprünglichen Sequenz ist. Dieses funktionelle Derivat oder Äquivalent kann ein natürliches Derivat sein oder es kann synthetisch hergestellt werden. Solche Derivate schließen Aminosäuresequenzen ein, die Substitutionen, Deletionen oder Additionen von einer oder von mehreren Aminosäuren besitzen, vorausgesetzt, dass die biologische Aktivität des Proteins konserviert ist. Das gleiche gilt für Derivate von Nucleinsäuresequenzen, die Substitutionen, Deletionen oder Additionen von einem oder von mehreren Nucleotiden haben können, vorausgesetzt, dass die biologische Aktivität der Sequenz allgemein erhalten bleibt. Wenn eine Proteinsequenz betroffen ist, besitzt die substituierende Aminosäure chemisch-physikalische Eigenschaften, die ähnlich zu denen der ausgetauschten Aminosäure sind. Die ähnlichen chemischphysikalischen Eigenschaften schließen Ähnlichkeiten in der Ladung, Sperrigkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und dergleichen ein. Der Ausdruck "funktionelle Derivate" soll "Fragmente", "Segmente", "Varianten", "Analoge" oder "chemische Derivate" einschließen.
Der Ausdruck "Variante" bezieht sich daher hierin auf ein Protein oder ein Nucleinsäuremolekül, das im Wesentlichen ähnlich in der Struktur und der biologischen Aktivität zu dem Protein oder zu der Nucleinsäure ist, die hierin offenbart sind.
Die funktionellen Derivate können chemisch synthetisiert oder durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden. Alle diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Der Ausdruck "chemische Derivate", wie er hierin verwendet wird, soll zusätzliche chemische Reste umfassen, die normalerweise nicht Teil des Gegenstandes sind, wie er hierin offenbart wird. Solche Reste können die physikalisch-chemische Eigenschaft der Derivate (d.h. Löslichkeit, Absorption, Halbwertzeit und dergleichen, Verringerung der Toxizität) beeinflussen. Solche Reste werden beispielhaft in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) dargestellt. Verfahren zur Bindung dieser chemisch-physikalischen Reste an ein Polypeptid sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Der Ausdruck "Allel" definiert eine alternative Form eines Gens, das einen bestimmten Locus auf einem Chromosom besetzt.
Wie allgemein bekannt ist, ist eine "Mutation" eine nachweisbare Veränderung im genetischen Material, die an eine Tochterzelle weitergegeben werden kann. Wie ebenfalls bekannt ist, kann eine Mutation zum Beispiel eine nachweisbare Veränderung in einer oder in mehreren Desoxyribonucleotide sein. Zum Beispiel können Nucleotide zugefügt, deletiert, substituiert, invertiert oder an eine neue Position transponiert werden. Es existieren spontane Mutationen und experimentell induzierte Mutationen. Das Ergebnis einer Mutation eines Nucleinsäuremoleküls ist ein mutieres Nucleinsäuremolekül. Ein mutiertes Polypeptid kann von diesem mutierten Nucleinsäuremolekül codiert werden.
Der Ausdruck "gereinigt", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das von einer zellulären Komponente getrennt wird. Ein "gereinigtes" Protein wird daher zum Beispiel in einer Menge gereinigt, die in der Natur nicht gefunden wird. Ein "im Wesentlichen reines" Molekül ist ein Molekül, dem alle anderen zellulären Komponenten fehlen.
Die Ausdrücke "Molekül", "Verbindung" oder "Mittel", wie sie hierin verwendet werden, werden austauschbar und breit verwendet, um natürliche, synthetische oder halbsynthetische Moleküle oder Verbindungen zu bezeichnen. Der Ausdruck "Molekül" kann daher chemische Verbindungen, Makromoleküle, Zell- oder Gewebeextrakte (von Pflanzen oder Tieren) und dergleichen bedeuten. Beispiele von Molekülen schließen Nucleinsäuremoleküle, Peptide, Liganden, einschließlich Antikörper, Kohlenhydrate und pharmazeutische Mittel ein. Die Mittel können durch eine Vielfalt von Mitteln einschließlich der Zufallsdurchmusterung, rationellen Auswahl und durch rationellen Entwurf unter Verwendung von zum Beispiel Protein-oder Liganden-Modellierungsverfahren wie z.B. Computer-Modellierung ausgewählt und abgesucht werden. Die Ausdrücke "rationell ausgewählt" oder "rationell entworfen" sollen Verbindungen definieren, die basierend auf der Konfiguration der Interaktionsdomänen der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden. Wie der Fachmann verstehen wird, sind Makromoleküle, die nicht natürlich vorkommende Modifikationen haben, ebenfalls im Umfang des Ausdruckes "Molekül" eingeschlossen. Zum Beispiel können Peptidomimetika, die in der pharmazeutischen Industrie gut bekannt sind und im Allgemeinen als Peptidanaloge bezeichnet werden, durch Modellierung hergestellt werden, wie vorstehend beschrieben wird. Auf ähnliche Weise können die Polypeptide, die hierin offenbart werden, modifiziert werden, um ihre Stabilität zu erhöhen. Es sollte selbstverständlich sein, dass in den meisten Fällen diese Modifikation nicht die biologische Aktivität des Proteins verändern sollten. Die Moleküle, die gemäß mit den Lehren der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, haben einen diagnostischen Wert für Erkrankungen oder bei Bedingungen, bei denen die Physiologie oder die Homöostase der Zelle und/oder des Gewebes durch einen Fehler in der Expression von PCA3-mRNAs beeinträchtigt ist. In einer anderen Ausführungsform finden die Moleküle, die gemäß den Lehren der vorliegenden Offenbarung identifiziert werden, Verwendung bei der Entwicklung von Verbindungen, welche die Expression einer differentiell exprimierten PCA3-mRNA modulieren oder die Aktivität oder den Spiegel eines davon codierten Proteins modulieren können.
Agonisten und Antagonisten, wie sie hierin verwendet werden, schließen ebenfalls Verstärker von bekannten Verbindungen mit solchen Eigenschaften von Agonisten oder Antagonisten ein.
Modulatoren des Spiegels oder der Aktivität des PCA3-Proteins, welchem die zusätzliche Sequenz fehlt und das hierin offenbart wird, können durch das Inkontaktbringen der Indikatorzelle mit einer Verbindung oder einem Gemisch oder einer Bibliothek von Molekülen für einen festgesetzten Zeitraum identifiziert und ausgewählt werden.
Das PCA3-Protein, das die zusätzliche Sequenz enthält, kann als eine Kontrolle verwendet werden.
Es werden ebenfalls hiermit Antisense-Nucleinsäuremoleküle beschrieben, die zum Beispiel verwendet werden können, um die Expression der PCA3-mRNA, der die zusätzliche Sequenz fehlt und die hierin offenbart wird, zu verringern oder aufzuheben. Ein Antisense-Nucleinsäuremolekül, das hierin zur Verfügung gestellt wird, bezeichnet ein Molekül, das in der Lage ist, ein stabiles Duplex- oder Triplexmolekül mit einem Teil seiner Nucleinsäurezielsequenz (DNA oder RNA) zu bilden. Die Verwendung von Antisense-Nucleinsäuremolekülen und der Entwurf und die Modifikation von solchen Molekülen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, wie zum Beispiel in WO 96/32966, WO 96/11266, WO 94/15646, WO 93/08845 und USP 5,593,974 beschrieben wird. Antisense-Nucleinsäure-Moleküle, die hierin offenbart werden, können von den Nucleinsäuresequenzen abgeleitet und gemäß bekannter Verfahren modifiziert werden. Einige Antisense-Moleküle können zum Beispiel so entworfen werden, dass sie eine höhere Resistenz gegen Degradation aufweisen, um ihre Affinität zu ihrer Zielsequenz zu erhöhen, um ihren Transport zu ausgewählten Zellarten oder Zellkompartimenten zu beeinflussen und/oder um ihre Fettlöslichkeit durch die Verwendung von Nucleotidanalogen und/oder den Austausch von ausgewählten chemischen Fragmenten zu verstärken, wie auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist.
Eine Indikatorzelle kann verwendet werden, um Antagonisten zu identifizieren. Das Testmolekül oder die Testmoleküle werden zum Beispiel mit der Wirtszelle in Verbindung mit einem oder mit mehreren Agonisten inkubiert, die bei einer festgelegten Konzentration gehalten werden. Ein Anzeichen und die relative Stärke der antagonistischen Eigenschaften des Moleküls oder der Moleküle kann durch den Vergleich der Spiegel der Genexpression in der Indikatorzelle bei Vorliegen des Agonisten in der Abwesenheit von Testmolekülen im Vergleich zum Vorliegen davon zur Verfügung gestellt werden. Der antagonistische Effekt eines Moleküls kann selbstverständlich ebenfalls in der Abwesenheit eines Agonisten bestimmt werden, einfach durch das Vergleichen des Expressionsspiegels des Reportergenprodukts bei Vorliegen und in Abwesenheit des Testmoleküls oder der Testmoleküle.
Es sollte selbstverständlich sein, dass experimentelle "in-vivo"-Modelle ebenfalls verwendet werden können, um eine "in-vitro"-Analyse durchzuführen. Zelluläre Extrakte von den Indikatorzellen können zum Beispiel hergestellt werden und in einem der vorstehend beschriebenen "in-vitro"-Tests verwendet werden.
Der Ausdruck "Indikatorzellen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die eine differentiell exprimierte PCA3-mRNA gemäß der vorliegenden Offenbarung exprimieren. Das Protein, das durch die Nucleinsäuresequenz codiert wird, kann an einen identifizierbaren oder selektierbaren Phänotyp oder ein identifizierbares oder selektierbares Kennzeichen gebunden werden. Solche Indikatorzellen können in den Durchmusterungsanalysen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Indikatorzellen können so hergestellt werden, dass sie ein ausgewähltes Derivat, Fragment, Homolog oder eine ausgewählte Mutante der differentiell exprimierten PCA3-mRNA der vorliegenden Erfindung exprimieren. Die Zellen können Hefezellen oder höhere eukaryontische Zellen wie z.B. Säugerzellen sein. Wenn die Bindungspartner für das PCA3-Protein erst einmal identifiziert sind, wird die Interaktion zwischen den beiden Partnern als ein Ziel für die Modulation der Aktivität dieses PCA3 codierten Proteins dienen können.
Die Indikatorzelle kann eine Hefezelle sein, die Vektoren enthält, welche die Verwendung der Zwei-Hybrid-System-Technologie, die auf dem Fachgebiet gut bekannt ist (Ausubel et al., 1994, vorstehend) ermöglicht und sie kann verwendet werden, um eine Verbindung oder eine Bibliothek davon zu testen. Ein Reportergen, das einen selektierbaren Marker oder ein Protein, das in einer Analyse nachgewiesen werden kann, codiert, kann funktionell an ein Kontrollelement gebunden werden, sodass die Expression des selektierbaren Markers oder des Proteins, das durch eine Analyse nachgewiesen werden kann, von der Interaktion des PCA3 codierten Proteins und seines Bindungspartners abhängig ist. Eine solche Indikatorzelle kann verwendet werden, um mit hohem Durchsatz eine sehr große Menge von Testmolekülen schnell abzusuchen.
Das Reportergen kann Luciferase oder β-Gal sein.
Es kann vorteilhaft sein, ein Protein, das hierin offenbart wird, als ein Fusionsprotein zu exprimieren. Der Entwurf von Konstrukten dafür und die Expression und die Herstellung von Fusionsproteinen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (Sambrook et al., 1989, vorstehend, Ausubel et al., 1994, vorstehend).
Beispiele von solchen Fusionsproteinen, die nicht einschränkend sein sollen, schließen Hämaglutinin-Fusionen und Gluthion-S-Transferase-Fusionen (GST) und Maltose-Bindungsprotein-Fusionen (MBP) ein. In bestimmten Ausführungsformen kann es vorteilhaft sein, eine Protease-Spaltungsstelle zwischen den zwei Polypeptidsequenzen, die fusioniert worden sind, einzuführen. Solche Protease-Spaltungsstellen zwischen zwei heterolog fusionierten Polypeptiden sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Es kann ebenfalls vorteilhaft sein, das Protein, das hierin offenbart wird, an Signalpeptidsequenzen zu fusionieren, die eine Sekretion des Fusionsproteins von der Wirtszelle ermöglichen. Signalpeptide von verschiedenen Organismen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Bakterielles OmpA und Suc2 der Hefe sind zwei Beispiele, die nicht einschränkend sein sollen, von Proteinen, die Signalsequenzen besitzen.
Es kann ebenfalls vorteilhaft sein, einen Linker (allgemein bekannt) zwischen der Interaktionsdomäne und dem Anteil des heterologen Polpeptids einzuführen. Ein solches Fusionsprotein ist sowohl für die Analysen der vorliegenden Erfindung als auch für Reinigungen, Nachweise und dergleichen nützlich.
Mit Sicherheit schließen die Sequenzen und Polypeptide, die für die Durchführung der Erfindung nützlich sind, Mutanten, Homologe, Unterarten, Allele und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Es sollte selbstverständlich sein, dass im Allgemeinen die Sequenzen der vorliegenden Erfindung ein funktionelles (wenn auch fehlerhaftes) PCA3-Protein codieren. Es wird dem Fachmann selbstverständlich sein, dass durch die Lehren und durch die Analysen, die hierin offenbart werden, und durch die allgemeinen Lehren des Fachgebiets bestimmt werden kann, ob das PCA3, das hierin offenbart wird, eine Variante, ein Derivat oder ein Fragment davon seine Funktion behält.
Wie nachfolgend beispielhaft dargestellt wird, kann das PCA3-Protein, das hierin offenbart wird, zum Beispiel durch Mutagenese in vitro modifiziert werden, um die Beziehung von Struktur und Funktion davon zu analysieren und einen besseren Entwurf und eine bessere Identifizierung von modulierenden Verbindungen zu ermöglichen. Einige Derivate oder Analoge, die ihre biologische Funktion verloren haben, können jedoch weiterhin nützlich sein, zum Beispiel für die Erzeugung von Antikörpern. Diese Antikörper können zum Nachweis oder für Reinigungen verwendet werden. Zusätzlich können diese Antikörper als ein kompetitiver oder nichtkompetitiver Hemmstoff wirken und als Modulatoren der Aktivität des PCA3-Proteins, das hierin offenbart wird, identifiziert werden.
Eine Wirtszelle oder eine Indikatorzelle ist durch exogene oder heterologe DNA (z.B. ein DNA-Konstrukt) "transfiziert" worden, wenn eine solche DNA in die Zelle eingeführt worden ist. Die transfizierende DNA kann in die chromosomale DNA, welche das Genom der Zelle aufbaut, integriert (kovalent gebunden) werden oder nicht. Die transfizierende DNA kann zum Beispiel in Prokaryonten, Hefe- und Säugerzellen auf einem episomalen Element wie z.B. einem Plasmid erhalten werden. Mit Bezug auf eukaryontische Zellen ist eine stabil transfizierte Zelle eine Zelle, in der die transfizierende DNA in ein Chromosom integriert worden ist, sodass sie durch Chromosomenreplikation von Tochterzellen ererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryontischen Zellen demonstriert, Zelllinien oder Clone zu etablieren, die aus einer Population von Tochterzellen bestehen, welche die transfizierende DNA enthalten. Transfektionsverfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (Sambrook et al., 1989, vorstehend; Ausubel et al., 1994, vorstehend). Die Verwendung einer Säugerzelle als ein Indikator kann den Vorteil bieten, einen Zwischenfaktor bereitzustellen, der zum Beispiel die Interaktion von zwei Polypeptiden erlaubt, die getestet werden und der in niedrigeren Eukaryonten oder in Prokaryonten nicht vorhanden sein könnte. Es wird selbstverständlich sein, dass Extrakte von Säugerzellen zum Beispiel verwendet werden können, um das Fehlen von bestimmten Faktoren zu kompensieren.
Im Allgemeinen sind Techniken zur Herstellung von Antikörpern (einschließlich monoclonalen Antikörpern und Hybridomen) und zum Nachweis von Antigenen unter Verwendung von Antikörpern auf den Fachgebiet gut bekannt (Campbell, 1984, in "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molekular Biology", Elsevier Science Publisher, Amsterdam, Die Niederlande und in Harlow et al., 1988 (in "Antibody – A Laboratory Manual", CSH Laboratories)).
Die vorliegende Offenbarung betrifft ebenfalls polyclonale, monoclonale Antikörper oder humanisierte Versionen davon, chimäre Antikörper und dergleichen, die ihre jeweiligen Interaktionsdomänen hemmen oder Neutralisieren und/oder spezifisch dazu sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro-Verfahren zur Diagnose des Vorliegens von Prostatakrebs oder der Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln, und ein in-vitro-Verfahren zur Feststellung des Stadiums von Prostatakrebs.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls einen Kit zur Diagnose und/oder zum Feststellen des Stadiums von Prostatakrebs oder einer Prädisposition, dasselbe zu entwickeln, zur Verfügung, umfassend eine Nucleinsäure, ein Protein oder einen Ligand.
Ein in Kompartimente aufgeteilter Kit kann zum Beispiel jeden Kit einschließen, in dem Reagenzien in getrennten Behälter enthalten sind. Solche Behälter schließen kleine Glasbehälter, Plastikbehälter oder Streifen von Plastik oder Papier ein. Solche Behälter ermöglichen den effizienten Transfer eines Reagenzes von einem Kompartiment in ein anderes Kompartiment, sodass die Proben und Reagenzien nicht kreuzkontaminiert werden und die Mittel oder Lösungen von jedem Behälter in einer quantitativen Weise von einem Kompartiment in ein anderes zugegeben werden können. Solche Behälter werden einen Behälter einschließen, der die Testprobe (DNA, Protein oder Zellen) aufnehmen wird, einen Behälter, der die Primer, die in der Analyse verwendet werden, enthält, Behälter, die Enzyme enthalten, Behälter, die Waschreagenzien enthalten, und Behälter, welche die Reagenzien enthalten, die zum Nachweis des Extensionsprodukts verwendet werden.
Die Offenbarung stellt ebenfalls einen Kit zur Verfügung, der die Oligonucleotid-Primer enthält, die hierin offenbart werden, und die entweder für die PCA3-mRNA, der die zusätzliche Sequenz der vorliegenden Erfindung fehlt, oder für die PCA3-mRNA, welche die zusätzliche Sequenz der vorliegenden Erfindung enthält, spezifisch sind.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden von der nachfolgenden Beschreibung verständlich sein.
Die Figuren zeigen:
1 zeigt die Genomstruktur von PCA3 und den Ort der Oligonucleotide, die für die PCR verwendet werden;
2 zeigt ein Gel, das die PCA3-RT-PCR-Produkte trennt, die von Gewebebiopsien von Prostatakrebs und gutartiger Hyperplasie der Prostata unter Verwendung der Primer von Beispiel 1 amplifiziert wurden;
3 stellt die Nucleinsäuresequenzen der durch RT-PCR amplifizierten PCA3-Fragmente mit und ohne der zusätzlichen Sequenz der vorliegenden Erfindung dar. Die Sequenzen wurden unter Verwendung von PCR-Primern, die in Exon 3 und Exon 4a lokalisiert sind, amplifiziert. Die Primersequenzen werden in fettgedruckten Buchstaben gezeigt. Großbuchstaben repräsentieren Nucleinsäuren, die in beiden Sequenzen gleich sind;
4 zeigt die Aminosäuresequenz, die von den PCA3-mRNAs vorhergesagt wurden, welche die zusätzliche Sequenz der vorliegenden Erfindung enthalten. Diese Sequenz entspricht den Aminosäuren 1–23 des ursprünglichen PCA3-Polypeptids; und
5 zeigt Beispiele von antigenen, Epitop tragenden PCA3-Peptiden, die 8 Aminosäuren umfassen (kalkuliert gemäß H.G. Rammensee bei http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/EpPredict.htm).
Die vorliegende Offenbarung stellt ein isoliertes und/oder gereinigtes, differentiell exprimiertes PCA3-mRNA-Molekül zur Verfügung. Vorzugsweise umfasst die PCA3-mRNA oder das PCA3-Nucleinsäuremolekül eine Polynucleotidsequenz, die mindestens 90% identisch (stärker bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch) zu einer Sequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt wurde, bestehend aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die ein differentiell exprimiertes PCA3-Polypeptid codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 umfasst;
(b) einer Nucleotidsequenz, die komplementär zu jeder der Nucleotidsequenzen in (a) oder (b) ist.

Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann eine differentiell exprimierte PCA3-mRNA-Nucleotidsequenz mit einer größeren Identität oder Ähnlichkeit zu der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 vorliegt, als 90% umfassen (vorzugsweise größer als 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100%). Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann die differentiell exprimierte PCA3-mRNA-Sequenz umfassen, der die zusätzliche Sequenz fehlt, die in SEQ ID NO: 1 vorliegt. In einer anderen Ausführungsform der Verfahren und der Verwendungen der Erfindung codiert das isolierte Nucleinsäuremolekül der differentiell exprimierten mRNA-Sequenz, der die zusätzliche Sequenz fehlt, die differentiell exprimierte PCA3-Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 3 vorliegt.
Obwohl die PCT-Anmeldung CA 98/00346 eine Anzahl von alternativ gespleißten mRNAs beschreibt, wurde vor der vorliegenden Erfindung eine PCA3-mRNA, die eine zusätzliche Sequenz zwischen Exon 3 und Exon 4a umfasst, nicht identifiziert. Des weiteren wurde die Identifizierung dieser zusätzlichen Sequenz als ein unterscheidbarer Marker des Zustands der Prostata nicht gemacht. Zusätzlich wurde die Korrelation zwischen der PCA3-mRNA, der die zusätzliche Sequenz fehlt, und Prostatakrebs (im Gegensatz zu der PCA3-mRNA, welche die zusätzliche Sequenz enthält, in Nicht-Prostatakrebs [z.B. normal oder BPH]) nicht durchgeführt. Die zusätzliche Sequenz in der PCA3-mRNA ermöglicht somit eine Prognose und Diagnose von Prostataerkrankungen in einem Patienten. Vorzugsweise umfasst das PCA3-Nucleinsäuremolekül eine Polynucleotidsequenz, die mindestens 90% identisch (stärker bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch) zu einer der vorstehend beschriebenen differentiell exprimierten mRNAs ist.
Hierin sind ebenfalls die funktionellen Äquivalente der hierin beschriebenen, isolierten Nucleinsäuremoleküle und Derivate davon offenbart. Die Nucleinsäuresequenzen, die in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dargestellt werden, können zum Beispiel durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen verändert werden, die ein funktionell äquivalentes Molekül zur Verfügung stellen. Aufgrund der Degeneration der codierenden Nucleotidsequenzen können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO.: 3 dargestellt wird, codieren, bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Zusätzlich kann die Nucleinsäuresequenz eine Nucleotidsequenz umfassen, die auf die Addition, Deletion oder Substitution von mindestens einem Nucleotid am 5'-Ende und/oder dem 3'-Ende der Nucleinsäureformel, die in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigt wird, oder einem Derivat davon zurückzuführen ist. In dieser Hinsicht kann jedes Nucleotid oder Polynucleotid unter der Vorraussetzung verwendet werden, dass seine Addition, Deletion oder Substitution die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 nicht im Wesentlichen ändert, die durch die die zusätzliche Sequenz enthaltende Nucleotidsequenz codiert wird. Des weiteren kann das Nucleinsäuremolekül, das hierin offenbart wird, gegebenenfalls Erkennungsstellen für Restriktionsendonucleasen haben, die an sein 5'-Ende und/oder 3'-Ende angefügt werden. Alle Variationen der Nucleotidsequenz von der codierenden Nucleotidsequenz von PCA3 und Fragmente davon, die durch den genetischen Code erlaubt sind, sind daher in dieser Offenbarung eingeschlossen.
Des weiteren ist es möglich, Codons zu deletieren oder ein oder mehr Codons durch andere Codons als degenerierte Codons zu substituieren, um ein strukturell modifiziertes Polypeptid herzustellen, das aber im Wesentlichen die gleiche Nützlichkeit oder Aktivität des Polypeptids besitzt, das durch das nicht modifizierte Nucleinsäuremolekül hergestellt wird. Wie auf dem Fachgebiet erkannt wurde, sind die zwei Polypeptide funktionell äquivalent, ebenso wie die zwei Nucleinsäuremoleküle, die zu ihrer Herstellung führen, auch wenn die Unterschiede zwischen den Nucleinsäuremolekülen nicht auf die Degeneration des genetischen Codes zurückzuführen sind.
Ein Fachmann wird erkennen, dass die Genome zwischen Individuen häufig leichte Variationen in den Allelen enthalten. Daher wird ebenfalls beabsichtigt, dass das isolierte Nucleinsäuremolekül Variationen in den Allelen einschließt, solange die Sequenz ein funktionelles Derivat der codierenden Sequenz der differentiell exprimierten PCA3-mRNA ist. Wenn ein PCA3-Allel nicht die identische Sequenz zu der, die in SEC ID NO:1 oder 2 gefunden wird, codiert, kann es isoliert und als PCA3 identifiziert werden, wobei die gleichen Techniken, die hierin verwendet werden, und besonders PCR-Techniken verwendet werden, um das geeignete Gen mit auf den hierin offenbarten Sequenzen basierenden Primern zu amplifizieren.
Ein Fachmann wird erkennen, das auch andere Organismen als Menschen die differentiell exprimierten PCA3-mRNAs enthalten können (zum Beispiel Eukaryonten, genauer Säuger, Vögel, Fische und Pflanzen, noch genauer Gorillas, Rhesusaffen und Schimpansen). Die Offenbarung soll die differentiell exprimierten PCA3-mRNAs, die von den vorstehend beschriebenen Organismen isoliert werden, einschließen, ist aber nicht auf sie begrenzt.
Isolierte Nucleinsäuremoleküle sollen ebenfalls solche einschließen, die chemisch synthetisiert werden. Ein Nucleinsäuremolekül mit der Nucleotidsequenz, die hierin beschrieben ist oder welche die hierin beschriebenen, differentiell exprimierten Produkte des PCA3-Gens codiert, kann entworfen werden und gegebenenfalls in geeignete kleinere Fragmente geteilt werden. Anschließend kann ein Oligomer, das dem Nucleinsäuremolekül entspricht oder das jedem der geteilten Fragmente entspricht, synthetisiert werden. Solche synthetischen Oligonucleotide können zum Beispiel durch das Triester-Verfahren von Matteucci et al., J Am Chem Soc 103:3185-3191 (1981) oder durch die Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesegeräts hergestellt werden.
Die vorliegende Offenbarung stellt ebenfalls gereinigte differentiell exprimierte Polypeptide (vorzugsweise im Wesentlichen rein), die eine Aminosäuresequenz besitzen, die der hierin beschriebenen PCA3 entspricht, oder ein funktionelles Derivat davon, zur Verfügung. Vorzugsweise besitzt das Polypeptid die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 3 dargestellt ist, oder eine Mutante oder eine Artvariation davon oder eine Sequenz mit mindestens 80% Identität oder mindestens 90% Ähnlichkeit dazu (vorzugsweise mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Identität oder mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Ähnlichkeit dazu) oder mindestens 6 zusammenhängende Aminosäuren davon (vorzugsweise mindestens 10, 15, 20, 25 oder 50 zusammenhängende Aminosäuren davon).
Die Proben der vorliegenden Erfindung schließen Zellen, Proteinextrakte oder Membranextrakte von Zellen oder biologische Flüssigkeiten ein. Die Probe wird basierend auf dem Analyseformat, dem Nachweisverfahren und der Art des Gewebes, der Zellen oder der Extrakte, die als eine Probe verwendet werden, variieren.
Jeder Organismus kann als eine Quelle für das Peptid, das hierin offenbart wird, verwendet werden, solange der Ursprungsorganismus natürlicherweise ein solches Peptid enthält. Der Ausdruck "Ursprungsorganismus", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf den ursprünglichen Organismus, von dem die Aminosäuresequenz der Untereinheit abgeleitet ist, unabhängig von dem Organismus, in dem die Untereinheit exprimiert und von dem es letztendlich isoliert wird.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nucleinsäure für den spezifischen Nachweis des Vorliegens der PCA3-Nucleinsäure in einer Probe, welche die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle oder mindestens ein Fragment davon umfasst, das unter stringenten Bedingungen an die PCA3-Nucleinsäure bindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Offenbarung Nucleinsäuresonden zur Verfügung, die komplementär zu einer Nucleotidsequenz sind, die aus mindestens 10 zusammenhängenden Nucleotiden (vorzugsweise 15, 18, 20, 25 oder 30) von dem Nucleinsäuremolekül besteht, das eine Polynucleotidsequenz umfasst, die mindestens 90% identisch zu einer Sequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die das PCA3-Polypeptid codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 umfasst;
(b) einer Nucleotidsequenz, die das PCA3-Gen codiert, das die Nucleotidsequenz in SEQ ID NO: 1 oder 2 umfasst;
(c) einer Nucleotidsequenz, die komplementär zu jeder der Nucleotidsequenzen in (a) oder (b) ist; und
(d) einer Nucleotidsequenz, wie sie zuvor vorstehend beschrieben wird.

In einer Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens wird eine Nucleinsäureprobe an einen Feststoffträger immobilisiert. Beispiele solcher Feststoffträger schließen Plastik wie z.B. Polycarbonat, Komplexkohlenhydrate wie z.B. Agarose und Sepharose und Acrylharze wie z.B. Polyacrylamid- und Latexkügelchen ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Techniken zur Bindung von Nucleinsäuresonden an solche Feststoffträger sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die Testproben, die für die Nucleinsäuresondierungs-Verfahren der vorüegenden Erfindung geeignet sind, schließen zum Beispiel Zellen oder Nucleinsäureextrakte von Zellen oder biologische Flüssigkeiten ein. Die Probe, die in den vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet wird, wird basierend auf dem Analyseformat, dem Nachweisverfahren und der Art des Gewebes, der Zellen oder der Extrakte, die untersucht werden sollen, variieren. Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäureextrakten von Zellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können leicht adaptiert werden, um eine Probe zu erhalten, die mit den verwendeten Verfahren kompatibel ist.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens einer differentiell exprimierten PCA3-mRNA in einer Probe, umfassend: a) das Inkontaktbringen der Probe mit der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuresonde unter spezifischen Hybridisierungsbedingungen, sodass eine Hybridisierung erfolgt und b) den Nachweis des Vorliegens der Sonde, die an das Nucleinsäuremolekül gebunden ist. Ein Fachmann würde die Nucleinsäuresonde gemäß den Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie vorstehend beschrieben wird, auswählen. Die Proben, die gestestet werden sollen, schließen RNA-Proben aus menschlichem Gewebe ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Nachdem identifiziert wurde, dass die zusätzliche PCA3-Sequenz, die hierin offenbart wird, als ein Marker zur Unterscheidung zwischen bösartigen und nichtbösartigen Prostatastadien verwendet werden kann, können Sonden, die spezifisch zu dieser zusätzlichen Sequenz (oder Varianten oder Fragmente davon) sind, ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Da selbstverständlich in bestimmten Ausführungsformen solche Sonden genomische DNA nachweisen könnten, müsste ein positives Signal, das von der genomischen DNA stammt, eliminiert werden, um die differentiell exprimierte PCA3-mRNA spezifisch zu detektieren.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Verwendung von Primern, die an Exon 3- und Exon 4a-Sequenzen hybridisieren, dargestellt wird, sollte es für den Fachmann selbstverständlich sein, dass Primer, die von anderen Regionen von PCA3 abgeleitet sind, verwendet werden können. Primer können zum Beispiel von Sequenzen von Exon2, Exon 4b, Exon 4c oder von der zusätzlichen Sequenz davon abgeleitet werden. Verfahren, um spezifische Primer von bekannten Sequenzen abzuleiten, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die vorliegende Offenbarung betrifft ebenfalls einen Kit zum Nachweis des Vorliegens einer differentiell exprimierten PCA3-mRNA in einer Probe, die mindestens einen Behälter umfasst, in dem die vorstehend beschriebene Nucleinsäuresonde enthalten ist. Der Kit kann des weiteren andere Behälter umfassen, die eines oder mehrere der nachfolgenden Reagenzien umfassen: Waschreagenzien und Reagenzien, die in der Lage sind, das Vorliegen der gebundenen Nucleinsäuresonde nachzuweisen. Beispiele von Nachweisreagenzien schließen radiomarkierte Sonden, enzymatisch markierte Sonden (Merrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase) und affinitätsmarkierte Sonden (Biotin, Avidin oder Straptavidin) ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Detaillierter beschrieben, schließt ein in Kompartimente aufgeteilter Kit jeden Kit ein, in dem Reagenzien in getrennten Behältern enthalten sind. Solche Behälter schließen kleine Glasbehälter, Plastikbehälter oder Streifen von Plastik oder Papier ein. Solche Behälter ermöglichen den effizienten Transfer von Reagenzien von einem Kompartiment in ein anderes Kompartiment, sodass die Proben und Reagenzien nicht kreuzkontaminiert werden und die Mittel oder Lösungen von jedem Behälter in einer quantitativen Weise von einem Kompartiment in ein anderes zugegeben werden können. Solche Behälter werden einen Behälter einschließen, der die Testprobe aufnehmen wird, einen Behälter, der die Sonde oder die Primer, die in der Analyse verwendet werden, enthält, Behälter, die Waschreagenzien enthalten (wie z.B. Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, Tris-Puffer und dergleichen), und Behälter, welche die Reagenzien enthalten, die zum Nachweis der hybridisierten Sonde, des gebundenen Antikörpers, des amplifizierten Produkts oder dergleichen verwendet werden.
Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass die Nucleinsäuresonden, die hierin beschrieben werden, leicht in einem der etablierten Kitformate, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, aufgenommen werden können.
Sonden und Antikörper, die hierin offenbart werden, können an einen Feststoffträger immobilisiert werden. Beispiele solcher Feststoffträger schließen Plastik wie z.B. Polycarbonat, Komplexkohlenhydrate wie z.B. Agarose und Sepharose und Acrylharze wie z.B. Polyacrylamid- und Latexkügelchen ein. Techniken zur Bindung von Antikörpern an solche Feststoffträger sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die immobilisierten Antikörper können für in-vitro-, in-vivo- und in-situ-Analysen sowie in der Immunchromatographie verwendet werden.
Ein Verfahren zum Nachweis eines differentiell exprimierten PCA3-Polypeptids in einer Probe ist hierin offenbart, umfassend: a) das Inkontaktbringen der Probe mit einem vorstehend beschriebenen Antikörper (oder Protein) unter Bedingungen, sodass sich Immunkomplexe bilden, und b) den Nachweis des Vorliegens des Antikörpers, der an das Polypeptid gebunden ist. Im Einzelnen umfassen die Verfahren das Inkubieren einer Testprobe mit einem oder mit mehreren der Antikörper, die hierin offenbart werden, und das Durchführen der Analyse, ob der Antikörper an die Testprobe bindet. Die relativen Spiegel der differentiell exprimierten PCA3 in einer Probe ermöglichen eine Unterscheidung zwischen einem bösartigen und einem nichtbösartigem Prostatastadium.
Des weiteren wird ein Verfahren zum Nachweis eines PCA3-Antikörpers in einer Probe, umfassend: a) das Inkontaktbringen der Probe mit einem vorstehend beschriebenen differentiell exprimierten PCA3-Proteins unter Bedingungen, sodass sich Immunkomplexe bilden, und b) dem Nachweis des Vorliegens des Proteins, das an dem Antikörper gebunden ist, oder des Antikörpers, der an das Protein gebunden ist. Im Einzelnen umfassen die Verfahren das Inkubieren einer Testprobe mit einem oder mit mehreren der Proteine der vorliegenden Erfindung und das Durchführen der Analyse, ob der Antikörper an die Testprobe bindet.
Des weiteren wird ebenfalls ein Kit offenbart, der alle notwendigen Reagenzien enthält, um die vorstehend beschriebenen Nachweisverfahren durchzuführen.
Der Kit kann umfassen: i) einen ersten Behälter, der einen vorstehend beschriebenen Antikörper enthält, und ii) einen zweiten Behälter, der ein Konjugat enthält, das einen Bindungspartner des Antikörpers und eine Markierung umfasst.
Der Kit kann umfassen: i) einen ersten Behälter, der ein vorstehend beschriebenes Protein enthält, und vorzugsweise ii) einen zweiten Behälter, der ein Konjugat enthält, das einen Bindungspartner für das Protein und eine Markierung umfasst. Insbesondere umfasst ein diagnostischer Kit ein differentiell exprimiertes PCA3-Protein, wie vorstehend beschrieben wird, um Antikörper in dem Serum eines möglicherweise infizierten Tiers oder Menschen nachzuweisen.
Der Kit, der hierin offenbart wird, kann des weiteren einen oder mehrere Behälter umfassen, die ein oder mehrere der nachfolgenden Reagenzien umfassen: Waschreagenzien und Reagenzien, die in der Lage sind, das Vorliegen von gebundenen Antikörpern nachzuweisen. Beispiele von Nachweisreagenzien schließen markierte sekundäre Antikörper oder in einer anderen Ausführungsform, falls der primäre Antikörper markiert ist, die chromophoren, enzymatischen Reagenzien oder Antikörperbindungsreagenzien, die mit dem markierten Antikörper reagieren können, ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Der in Kompartimente aufgeteilte Kit kann, wie vorstehend beschrieben wird, ein Kit für Nucleinsäuresonden sein.
Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass die Antikörper, die hierin offenbart werden, leicht in einem der etablierten Kitformate, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, aufgenommen werden können.
Es sollte selbstverständlich sein, dass die Lehren ebenfalls auf jedes Tier anwendbar sind, das differentiell PCA3-mRNAs exprimiert, obwohl die nachfolgende Diskussion spezifisch auf menschliche Patienten zielt.
Die diagnostischen Verfahren und die Durchmusterungsverfahren der Erfindung sind besonders nützlich für einen Patienten, von dem vermutet wird, dass bei ihm aufgrund der Familiengeschichte ein Risiko zur Entwicklung einer Erkrankung besteht, die mit einem veränderten Expressionsspiegel von PCA3 assoziiert ist, oder für einen Patienten, bei dem es erwünscht ist, eine PCA3-verwandte Erkrankung (z.B. Prostatakrebs) zu diagnostizieren.
Gemäß der Erfindung ist das präsymptomatische Durchmustern eines Individuums, das eine solche Durchmusterung benötigt, nun möglich, wobei DNA, die das PCA3-Protein codiert, oder das PCA3-Gen der Erfindung oder Fragmente davon verwendet werden. Das Durchmusterungsverfahren der Erfindung erlaubt eine präsymptomatische Diagnose des Vorliegens der differentiell exprimierten PCA3-mRNA ohne die zusätzliche PCA3-Sequenz und damit eine Meinung mit Bezug auf die Wahrscheinlichkeit, dass solche Individuen eine PCA3 assoziierte Erkrankung entwickeln würden oder entwickelt haben oder dass sie einen normalen Prostatazustand besitzen. Dies ist besonders wertvoll für die Identifizierung von Trägern eines veränderten PCA3-Gens, zum Beispiel von Individuen mit einer Familiengeschichte einer PCA3 assoziierten Erkrankung. Die frühe Diagnose wird ebenfalls erwünscht, um eine zeitlich geeignete Intervention zu maximieren.
In einem offenbarten Durchmusterungsverfahren würde eine Gewebeprobe von einem solchen Individuum genommen werden und nach (1) dem Vorliegen der PCA3-mRNA, der die zusätzliche Sequenz der vorliegenden Erfindung fehlt; (2) dem Vorliegen der PCA3-mRNA, welche die zusätzliche Sequenz enthält, und/oder (3) dem Vorliegen eines differentiell exprimierten PCA3-Proteins abgesucht werden. Die PCA3-mRNA kann charakterisiert und verglichen werden, um (a) die Spiegel und/oder (b) die Größe der differentiell exprimierten PCA3-mRNA zu bestimmen. Zuletzt kann das differentiell exprimierte PCA3-Protein (a) nachgewiesen und/oder (b) quantifiziert werden, wobei eine biologische Analyse für die PCA3-Aktivität verwendet wird oder eine immunologische Analyse und PCA3-Antikörper verwendet werden. Ein Vorliegen einer PCA3-mRNA, der die zusätzliche Sequenz fehlt (oder einer mRNA, bei der die PCA3-codierende Sequenz nicht modifiziert und/oder nicht unterbrochen ist) und/oder des Proteins, das dadurch codiert wird, würde anzeigen, dass für den Patienten ein Risiko besteht, Prostatakrebs zu entwickeln, oder dass der Patient Prostatakrebs entwickelt hat. Ein Vorliegen einer PCA3-mRNA, welche die zusätzliche Sequenz der Erfindung enthält, und/oder des Proteins, das dadurch codiert wird, bei Abwesenheit der PCA3-mRNA, der die zusätzliche Sequenz fehlt, und/oder des Proteins, das dadurch codiert wird, oder das Vorliegen in einer Menge, die größer als die der mRNA ist, der die zusätzliche Sequenz fehlt, und/oder des Proteins, das dadurch codiert wird, würde anzeigen, dass der Patient noch keinen Prostatakrebs entwickelt hat und/oder dass ein geringeres Risiko besteht, Prostatakrebs zu entwickeln.
Die therapeutischen Wirkungen der therapeutischen Nucleinsäuren können das Ausschalten oder das Modifizieren der Prozessierung der differentiell exprimierten PCA3-mRNA, der die zusätzliche Sequenz fehlt, einschließen, wie hierin offenbart wird, sind aber nicht darauf beschränkt. Zusätzlich kann eine Expression einer differentiell exprimierten PCA3-mRNA, welche die zusätzliche Sequenz umfasst, wie hierin offenbart wird, in einer größeren Menge als die PCA3-mRNA, der die zusätzliche Sequenz fehlt, Wirkungen auf Zellen haben, die dazu führen, dass sich der Krebs zurückentwickelt.
Es werden hierin ebenfalls Arzneimittel, die eine wirksame Menge von mindestens einem Antisense-Oligonucleotid gegen eine PCA3-mRNA, der die zusätzliche Sequenz fehlt, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, offenbart. Solche Antisense-Oligos schließen mindestens eine Nucleotidsequenz von 12–500 Basen in der Länge ein, die komplementär zu mindestens einem Anteil von SEQ ID NO: 2 ist, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Offenbarung stellt daher allgemein Mittel zur Verfügung, um das Gleichgewicht zwischen der Menge der differentiell exprimierten PCA3-mRNAs so zu verändern, dass der bösartige Zustand einer Zelle moduliert werden kann.
Die Spezifität für die Genexpression in Prostatakrebszellen kann durch die Verwendung von geeigneten zellspezifischen Regulatorsequenzen wie z.B. zellspezifischen Enhancern und Promotoren verliehen werden. Daher kann Gentherapie verwendet werden, um die mit PCA3 im Zusammenhang stehende Pathologie durch die Hemmung der ungeeigneten Expression einer bestimmten Form von PCA3 zu lindern. Des weiteren kann die Gentherapie verwendet werden, um solche Pathologien zu lindern, indem der geeignete Expressionsspiegel einer bestimmten Form von PCA3 zur Verfügung gestellt wird. In diesem Fall können bestimmte PCA3-Nucleinsäuresequenzen durch DNA- oder RNA-Konstrukte, die in der Form von Viren verabreicht werden, codiert werden, wie vorstehend beschrieben wird.
Die vorstehend beschriebenen PCA3-Antikörper (vorzugsweise murine PCA3-Antikörper und chimäre murin-menschliche PCA3-Antikörper und Fragmente und Regionen davon), welche die biologische Aktivität von PCA3 in vivo hemmen oder neutralisieren und die spezifisch für PCA3 sind, werden offenbart. Diese Antikörper können für therapeutische Zwecke in Patienten verwendet werden, die Pathologien oder Bedingungen haben, die mit dem Vorliegen einer abweichenden PCA3-Expression assoziiert sind. Antikörper und Fragmente, Regionen und Derivate davon enthalten vorzugsweise mindestens eine Region, die ein Epitop von PCA3 erkennt, was zu einer hemmenden und/oder neutralisierenden biologischen Aktivität in vivo führt.
Die Behandlung umfasst die parenterale Verabreichung einer einzelnen oder von mehreren Dosen des Antikörpers, Fragments oder Derivats. Bevorzugt für die pharmazeutische Verwendung im Menschen werden hochaffine, potente, PCA3 hemmende und/oder neutralisierende murine oder chimäre Antikörper, Fragmente und Regionen.
Monoclonale Antikörper können durch jedes Mittel verabreicht werden, das dem aktiven Mittel ermöglicht, die Wirkungsstelle des Mittels in dem Körper eines Säugers zu erreichen. Weil Proteine verdaut werden, wenn sie oral verabreicht werden, wird im Allgemeinen eine parenterale Verabreichung, d.h. intravenös, subkutan, intramuskulär, verwendet, um die Absorption zu optimieren.
Monoclonale Antikörper können entweder als individuelle therapeutische Mittel oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln verabreicht werden. Sie können allein verabreicht werden, werden aber im Allgemeinen mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht, der auf der Basis der gewählten Route der Verabreichung und der pharmazeutischen Standardanwendung ausgewählt wird.
Die verabreichte Dosis wird selbstverständlich variieren, abhängig von bekannten Faktoren wie z.B. die pharmakodynamischen Kennzeichen des bestimmten Mittels und die Art und Route der Verabreichung; Alter, Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers; Natur und Ausmaß der Symptome, Art einer gleichzeitigen Behandlung, Häufigkeit der Behandlung und erwünschte Wirkung. Im Allgemeinen kann eine tägliche Dosis des wirksamen Bestandteils etwa 0,1 bis 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht betragen. Gewöhnlich sind 0,5 bis 50 und vorzugsweise 1 bis 10 Milligramm pro Kilogramm pro Tag, die in getrennten Dosen ein- bis sechsmal am Tag oder in einer anhaltenden Freisetzung gegeben werden, wirksam, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten.
Dosisformen (Zusammensetzungen), die für eine innere Verabreichung geeignet sind, enthalten im Allgemeinen von etwa 1 Milligramm bis etwa 500 Milligramm des wirksamen Bestandteils pro Einheit. In diesen Arzneimitteln wird der aktive Bestandteil gewöhnlich in einem Gewichtsanteil von etwa 0,5–95%, basierend auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung, enthalten sein.
Zellschädigende Arzneistoffe, die an Antikörper gebunden werden können und anschließend für eine Therapie in vivo verwendet werden können, schließen Daunorubicin, Doxorubicin, Methotrexat und Mitomycin C ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die nichtmenschlichen Tiere umfassen jedes Tier, das eine tansgene Unterbrechung oder Veränderung des endogenen Gens/der endogenen Gene (Knock-out-Tiere) besitzt und/oder in dem ein oder mehrere Transgene in das Genom eingeführt wurden, welche die Expression von differentiell exprimierten menschlichen PCA3-mRNAs steuern. Es werden ebenfalls die Einführung von PCA3-Antisense-Nucleinsäuren bevorzugt.
Solche nichtmenschlichen Tiere schließen Vertebraten wie z.B. Nagetiere, nichtmenschliche Primaten, Schaf, Hund, Kuh, Amphibien, Reptilien etc. ein. Bevorzugte nichtmenschliche Tiere werden von nichtmenschlichen Arten von Säugern ausgewählt, am meisten werden Tiere der Familie der Nagetiere einschließlich Ratten und Mäuse bevorzugt, am stärksten werden Mäuse bevorzugt.
Die transgenen Tiere sind Tiere, in denen durch künstliche Mittel (d.h. durch menschliche Manipulation) ein oder mehrere Gene, die normalerweise nicht in dem Tier vorkommen, z.B. fremde Gene, gentechnisch hergestellte endogene Gene etc. eingeführt wurden. Die künstlich eingeführten Gene, bekannt als Transgene, können von der gleichen oder von einer anderen Art als das Tier sein, werden aber normalerweise nicht in dem Tier in der Konfiguration und/oder an dem Chromosomenort gefunden, wie sie/er durch das Transgen vermittelt wird. Transgene können fremde DNA-Sequenzen, d.h. Sequenzen, die normalerweise nicht in dem Genom des Wirtstiers gefunden werden, umfassen. In einer anderen oder einer zusätzlichen Ausführungsform können die Transgene endogene DNA-Sequenzen umfassen, die darin abnormal sind, dass sie in vitro neu angeordnet oder mutiert worden sind, um das normale Muster der Expression des Gens in vivo zu verändern oder um die biologische Aktivität eines endogenen Genprodukts, das durch das Gen codiert wird, zu verändern oder zu eliminieren.
Die transgenen nichtmenschlichen Tiere werden durch das Einführen der Transgene in die Keimbahn der nichtmenschlichen Tiere hergestellt. Embryonale Zielzellen in verschiedenen Entwicklungsstadien werden verwendet, um die Transgene der Erfindung einzuführen. Verschiedene Verfahren werden in Abhängigkeit von dem Enwicklungsstadium der embryonalen Zielzelle(n) verwendet. Diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die Transgene können in nichtmenschliche Tiere eingeführt werden, um Tiermodelle für menschliche Erkrankungen zur Verfügung zu stellen. Die Transgene, die zu solchen Tiermodellen führen schließen z.B. Transgene ein, welche die differentiell exprimierte PCA3-mRNAs codieren, die mit einem bösartigen Prostatazustand (d.h. Prostatakrebs) oder mit einem nichtbösartigen Prostatazustand assoziiert sind.
Durch die Identifizierung einer Markersequenz in der differentiell exprimierten PCA3-mRNA und einer Korrelation zwischen dem Gleichgewicht des Expressionsspiegels der differentiell exprimierten PCA3-mRNAs (oder des dadurch codierten Proteins) und der bösartigen oder nichtbösartigen Prostatazustand öffnet die vorliegende Erfindung den Weg zu zahlreichen Verfahren, Analysen und Reagenzien für die Prognose, Diagnose, dem Feststellen des Stadiums, der Prädisposition und der Therapie von Prostatakrebs. Die vorliegende Offenbarung stellt die Mittel zur Verfügung, um Prostatakrebs durch die Identifizierung der PCA3-mRNA, der die zusätzliche Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung fehlt (oder eines dadurch codierten Proteins) zu bestimmen. Zahlreiche Verfahren, Primer, Sonden, Antikörper und Reagenzien können verwendet werden, um ein solches Nucleinsäuremolekül (oder ein solches Protein) zu identifizieren, wie dem Fachmann, den die vorliegende Erfindung angeht, selbstverständlich sein wird.
Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher durch die nachfolgenden Beispiele, die nicht einschränkend sein sollen, dargestellt.
BEISPIEL 1
Identifizierung von differentiell exprimierten PCA3-mRNAs und Korrelation ihrer Expression mit Prostataerkrankungen
PCA3-spezifische Primer wurden entwickelt, um die PCA3-Expression in verschiedenen Proben zu analysieren. Um in der Lage zu sein, zwischen amplifizierten Sequenzen von mRNA (Boten-RNA) und genomischer DNA zu unterscheiden, wurden diese Primer so entworfen, dass sie ein Intron, in diesem Fall Intron 3, umspannen. Wie in 1 dargestellt wird, liegt der PCA3-Sense-Primer innerhalb Exon3 und der PCA3-Antisense-Primer innerhalb Exon 4a. Die auf PCA3-Expression zu analysierenden Proben bestanden aus gefrorenen Gewebestücken, die durch eine transurethrale Resektion der Prostata entfernt wurden (BPH, 4 Patienten) oder aus gefrorenen Prostatas, die durch eine vollständige Prostataentfernung erhalten wurden (Prostatakrebs, 6 Patienten). Die Proben der vollständigen Prostataentfernung wurden in gefrorene Schnitte verarbeitet, um spezifisch Regionen auszuwählen, welche die Prostatakrebszellen enthielten. Die RNA wurde von den gefrorenen Proben unter Verwendung eines Flüssigphasen-RNA-Extraktionsverfahren (Trizol^®) extrahiert. Die extrahierten Nucleinsäuren wurden anschließend mit DNase behandelt, um die genomische DNA zu spalten. Die DNase behandelte RNA wurde in cDNA revers transkribiert, wobei reverse Transkriptase verwendet wurde, und anschließend einer PCR-Analyse unter Verwendung der PCA3-Primer unterzogen. Die PCR wurde für 35 Zyklen mit Taq-DNA-Polymerase durchgeführt, das amplifizierte Material wurde auf Agarosegelen getrennt und durch Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht. Wie in 2 gezeigt wird, werden durch die PCR-Amplifikation von PCA3 zwei Produkte hergestellt, die anhand der Größe aufgetrennt werden können und die sich in der relativen Menge unterscheiden. Das kleinere Amplicon (277 bp) wird hauptsächlich oder ausschließlich gefunden in den Proben von Patienten mit Prostatakrebs (2, obere Reihe), wohingegen das größere Amplicon (505 bp) vorherrschender in Proben von Patienten mit einem nichtbösartigen Prostatastadium ist (BPH [2, untere Reihe]]. Die pathologische Untersuchung der Biopsien der Patienten bestätigten die erste Diagnose für jeden Patienten mit Ausnahme von Patient BPH 1, bei dem Prostatakrebs gefunden wurde.
Um den Ursprung der amplifizierten Fragmente zu bestätigen, wurden sie von dem Gel isoliert und sequenziert. Die Sequenzen werden in 3 gezeigt. Wie erwartet wurde, wurde bestätigt, dass das kleinere 277 bp große Fragment den Regionen von Exon 3 und 4a entspricht, die durch die PCA3-PCR-Primer umspannt wurden. Das größere 505 bp große Fragment ist mit dem kleineren Fragment identisch, ausgenommen der hierin identifizierten Sequenz, die zwischen Exon 3 und Exon 4a liegt. Man sollte beachten, dass eine direkte PCR-Analyse von allen Proben ohne die reverse Transkription kein amplifiziertes Material ergab, wodurch die Hypothese widerlegt wurde, dass das größere Amplifikationsprodukt von der genomischen DNA stammt.
Die PCA3-mRNA liegt daher mindestens in zwei unterschiedlichen Formen in der Zelle vor, einer kurzen Form, der die hierin identifizierte zusätzliche Sequenz (nachfolgend als Sequenz 2 bezeichnet, SEQ ID NO: 2) fehlt, sowie eine lange Form, welche diese zusätzliche Sequenz (nachfolgend als Sequenz 1 bezeichnet, SEQ ID Nr.; 1) besitzt. Das Vorliegen der zusätzlichen Sequenz in Sequenz 1 unterbricht den vorhergesagten offenen Leserahmen, der für das PCA3-Protein codiert. Die vorhergesagte Sequenz des Proteins, das durch diese lange PCA3-mRNA codiert wird, ist in 4 gezeigt. Wie in 2 dargestellt wird, variieren die relativen Expressionsspiegel der zwei PCA3-mRNA-Sequenzen in Abhängigkeit von der Zellart. Prostatakrebszellen exprimieren vorwiegend Sequenz 2, wohingegen BPH-Zellen hauptsächlich Sequenz 1 exprimieren.
Diese Beobachtungen zeigen, dass es möglich ist, zwischen einem bösartigen und nichtbösartigen Zustand einer Prostata zu unterscheiden. Es ist außerdem attraktiv vorherzusagen, dass die relativen Spiegel der zwei Arten der PCA3-mRNAs es ermöglichen, den gutartigen Zustand von dem bösartigen Zustand zu unterscheiden.
BEISPIEL 2
Beurteilung des Zustandes der Prostata von einem Patienten unter Verwendung von RT-PCR
Patientenproben wurden erhalten und die RNA wurde davon hergestellt, wie allgemein bekannt ist. Gemische für die reverse Transkription wurden wie nachfolgend als RT hergestellt: 0,2 μg Gesamt-RNA + 0,6 μg pdN6 (Zufalls-Hexamer-Primer) + 1,25 mM dNTPs + 200 E M-MLV-reverse Transkriptase in 50 mM Tris-HCI, pH-Wert 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 40°C inkubiert.
4 μl der vorstehenden RT-Reaktion wurden in 50 μL von 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 0,5 mM dNTPs, 0,5 μM jedes Primers und 2,5 E Taq-DNA-Polymerase gemischt. Für die PCR-Analyse wurde die Amplifikation für 35 Zyklen Qe 1 min bei 94°C, 60°C, 72°C) durchgeführt, gefolgt von einer 10 minütigen Extension bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden durch konventionelle Agarosegel-Elektrophorese analysiert.
REFERENZEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In vitro-Verfahren zur Diagnose des Vorliegens von Prostatakrebs oder der Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln, in einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bestimmen der Menge differentiell exprimierter PCA3-mRNA in einer von dem Patienten entnommenen Probe; und (b) Diagnostizieren des Vorliegens von Prostatakrebs oder der Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln, in dem Patienten; wobei das Vorliegen einer langen PCA3-mRNA mit einer Sequenz zwischen Exon 3 und Exon 4a, was zu einer PCA3-mRNA mit einer Sequenz, welche länger ist als die in SEQ ID NO: 2 dargestellte, führt, einen nicht-malignen Zustand der Prostata anzeigt, und das Vorliegen einer kurzen PCA3-mRNA mit einer Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt das Vorliegen von Prostatakrebs oder die Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln, anzeigt.
In vitro-Verfahren zur Feststellung des Stadiums von Prostatakrebs in einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bestimmen der Menge differentiell exprimierter PCA3-mRNA in einer von dem Patienten entnommenen Probe; und (b) Feststellen des Stadiums von Prostatakrebs in dem Patienten; wobei ein Anstieg in der Menge einer kurzen PCA3-mRNA mit einer Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt verglichen mit der Menge einer langen PCA3-mRNA mit einer Sequenz zwischen Exon 3 und Exon 4a, was zu einer PCA3-mRNA mit einer Sequenz, welche länger ist als die in SEQ ID NO: 2 dargestellte, führt, mit einem Anstieg der Malignität von Prostatakrebs korreliert.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Menge der kurzen PCA3- mRNA, welche die der langen PCA3-mRNA übersteigt, das Vorliegen von Prostatakrebs oder die Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln, anzeigt.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Diagnostizieren des Vorliegens von Prostatakrebs oder der Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln, eine quantitative Bestimmung umfasst von: (a) einer kurzen PCA3-mRNA mit der Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt, die mit einem malignen Zustand der Prostata assoziiert ist; und (b) einer langen PCA3-mRNA mit einer Sequenz zwischen Exon 3 und Exon 4a, was zu einer PCA3-mRNA mit einer Sequenz, welche länger ist als die in SEQ ID NO: 2 dargestellte, führt, die mit einem nichtmalignen Zustand der Prostata assoziiert ist, wobei eine Menge der kurzen PCA3-mRNA mit der Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt verglichen mit einer Menge der langen PCA3-mRNA mit einer Sequenz zwischen Exon 3 und Exon 4a mit dem Prostatazustand des Patienten korreliert sein kann.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Quantifizieren der kurzen PCA3-mRNA und der langen PCA3-mRNA gleichzeitig erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die lange PCA3-mRNA mit einer Sequenz zwischen Exon 3 und Exon 4a die Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Sequenz zwischen Exon 3 und Exon 4a die zwischen den Nucleotiden 27 bis 254 von SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Verwendung von Sonden oder Primern, die an die zusätzliche Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 im Vergleich zu SEQ ID NO: 2 gezeigt spezifisch hybridisieren, für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zur Diagnose des Vorliegens von Prostatakrebs oder der Prädisposition, Prostatakrebs zu entwickeln.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die zusätzliche Sequenz zwischen Exon 3 und Exon 4a lokalisiert ist und die zwischen den Nucleotiden 27 bis 254 von SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Sonde oder der Primer eine Nucleotidsequenz ist, die komplementär zu einer Nucleotidsequenz ist, die aus mindestens 10 aufeinander folgenden Nucleotiden der Nucleotidsequenz zwischen Exon 3 und Exon 4a besteht, wie dargestellt zwischen den Nucleotiden 27 bis 254 von SEQ ID NO: 1.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Nucleotidsequenz das PCA3-Polypeptid wie in SEQ ID NO: 3 dargestellt codiert.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Nucleotidsequenz die Nucleotidsequenz ist, die in den Nucleotiden 27 bis 254 von SEQ ID NO: 1 gezeigt ist.