DE69419748T2

DE69419748T2 - GEN DES VON HIPPEL-LINDAU (VHL) SYNDROMS UND ENTSPRECHENDE cDNS UND METHODEN ZUR DETEKTION VON TRÄGERN DES ENTSPRECHENDEN GENS

Info

Publication number: DE69419748T2
Application number: DE69419748T
Authority: DE
Inventors: Farida Latif; Michael I. Lerman; Marston Linehan; Berton Zbar
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1993-05-14
Filing date: 1994-05-12
Publication date: 1999-12-09
Anticipated expiration: 2014-05-13
Also published as: CA2162928A1; EP0698093B1; US5654138A; JPH08511158A; ES2135581T3; US5759790A; ATE182622T1; DE69419748D1; JP3650397B2; GR3030876T3; DK0698093T3; WO1994026894A1; AU696234B2; EP0698093A1; AU6833794A

Description

Fachgebiet der Erfindung

Die Erfindung fliegt auf dem Gebiet der Tumorsuppressorgene. Insbesondere betrifft die Erfindung das Gen des Von-Hippel-Lindau (VHL)-Syndroms und die entsprechende cDNA sowie Verfahren zum Nachweis von Trägern des VHL-Syndrom- Gens unter Verwendung von Sonden, die von der cDNA hergeleitet sind.

Stand der Technik

Das Von-Hippel-Lindau (VHL)-Syndrom ist ein familiäres Krebssyndrom. Diese Erkrankung ist ein autosomal dominantes Leiden, und Patienten, die heterozygot sind für Mutationen im VHL-Syndrom-Gen, sind für die verschiedensten Krebsarten prädisponiert, von denen die häufigsten Hämangioblastome des Zentralnervensystems und der Retina, das Nierenkarzinom ("renal cell carcinoma", RCC) und das Phäochromozytom sind. Der Multisystem-Charakter der Erkrankung in Verbindung mit der Tatsache, daß in jedem Zielorgan multiple Tumoren entstehen können, bewirkt eine beträchtliche Morbidität und Mortalität, was sich in der verminderten Lebenserwartung der betroffenen Individuen, die bei 49 Jahren liegt, zeigt (McKusick, V.A., Mendelian Inheritance in Man (1983), Johns Hopkins University Press, Baltimore und London, S. 534-535). Obwohl die Prävalenz des VHL- Syndroms lediglich 1 von 36 000 beträgt, haben die meisten Individuen aufgrund des späten Ausbruchs der Erkrankung bereits Kinder, bevor sie wissen, daß sie am vererbten VHL-Syndrom leiden. Lange Zeit bestand die einzige Möglichkeit der präsymptomatischen oder pränatalen Diagnose des Syndroms darin, bei allen asymtomatischen Mitgliedern von VHL-Familien die Augen, das Gehirn und das Abdomen in bestimmten Abständen zu untersuchen. Leider ist die Untersuchung aller Zielorgane erforderlich, um den Nachweis der Erkrankung sicherzustellen, die auf ein einzelnes Organ begrenzt sein kann. Zusätzlich zu den offensichtlichen Unannehmlichkeiten und Kosten dieser Untersuchungen haben sie noch den weiteren Nachteil, daß sie möglicherweise keine genaue diagnostische Information liefern. Um also ein Verfahren zu entwickeln, das die eindeutige Diagnose des VHL- Syndroms bei Risikopatienten ermöglicht, haben sich die Forscher in intensiven Untersuchungen darauf konzentriert, das VHL-Syndrom-Gen zu identifizieren und zu isolieren.
Die Ergebnisse dieser Forschung haben gezeigt, daß das VHL-Syndrom- Gen zur Familie der Tumorsuppressorgene zählt (Tory, K. et al., J. Natl. Canc. Inst. 81 (1989), 1097-1101; Maher, E.R. et al., J. Med. Genet. 27 (1990), 311-314) und daß es sich gemäß der Knudson-Theorie der menschlichen Karzinogenese verhält (Knudson, A., Proc. Nail. Acad. Sci. USA 68 (1971), 816-823). Außerdem ermöglichte die Identifizierung von DNA-Markern, die mit dem VHL-Syndrom-Gen fest verbunden sind, die Lokalisierung des VHL-Syndrom-Gens auf dem menschlichen Chromosom 3p25-p26 (Hosoe, S. et al., Genomics 8 (1990), 634-640; Maher, E.R. et al., Genomics 8 (1990), 957-960; Glenn, G.M. et al., Hum. Genet. 87 (1990), 207-210; Latif, F. et al., Am. J. Hum. Genet. 51 (1992), (Suppl.) A63; Tory, K. et al., Genomics 13 (1992), 275-286; Richards, F.M. et al., J. Med. Genet. 30 (1993), 104- 107; Seizinger, B.R. et al., Nature 332 (1988), 268-269; Seizinger, B.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2864-2868 und Vance, J.M. et al., Am. J. Hum. Genet. 51 (1993), 203-209). Kürzlich haben Glenn et al. (Glenn, G.M. et al., JAMA (1992), 1226-1231) DNA-Marker, die das VHL-Syndrom-Gen flankieren, als Sonden zum Nachweis der Kopplung an das VHL-Syndrom-Gen durch Restriktionsfragment-Polymorphismus-Analyse von DNA verwendet, die aus Individuen isoliert wurde, die Mitglieder von Familien mit VHL-Syndrom-Risiko waren. Obwohl anhand dieses DNA-Polymorphismus-Verfahrens die Träger des VHL-Syndrom-Gens mit einer größeren Genauigkeit identifiziert werden können, besteht bei diesem Verfahren doch der Nachteil, daß die DNA-Polymorphismus-Analyse nicht das VHL- Syndrom-Gen selbst nachweist. Vor kurzem wurde ein im VHL-Bereich liegendes Gen cloniert (Latif, F. et al., Cancer Res. 63 (1993), 861-867). Allerdings konnten mit diesem Gen keine Mutationen bei VHL-Patienten nachgewiesen werden, und somit gibt es zur Zeit keine Verfahren, mit denen Träger des VHL-Syndrom-Gens mit 100%iger Genauigkeit identifiziert werden können. Dagegen sollte es durch die kürzliche Identifizierung und Isolierung des VHL-Syndrom-Gens (Latifet al., Science, im Druck, "Idenitification of the von Hippel-Lindau Disease Tumor Suppressor Gene") und durch die entsprechende cDNA möglich werden, diagnostische Verfahren zu entwickeln, die einen eindeutigen Nachweis von Trägern des VHL-Syndrom- Gens bereitstellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gen des Von-Hippel-Lindau (VHL)- Syndroms und die entsprechende cDNA.
Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis von Trägern des VHL- Syndrom-Gens. Das erste Verfahren umfaßt die Analyse von DNA eines Individu ums auf Mutationen des VHL-Syndrom-Gens, die mit dem VHL-Syndrom in Zusammenhang stehen.
Das zweite Verfahren umfaßt die Analyse von RNA eines Individuums auf Mutationen oder Veränderungen in der VHL-spezifischen mRNA, die mit dem VHL- Syndrom in Zusammenhang stehen.
Das dritte Verfahren umfaßt die Analyse von Proteinen eines Individuums auf Veränderungen in der Expression des VHL-Proteins, die mit dem VHL-Syndrom in Zusammenhang stehen.
Außerdem umfaßt die Erfindung rekombinante VHL-Proteine, die von der VHL-cDNA hergeleitet sind, und Antikörper, die gegen die VHL-Proteine oder daraus hergeleitete Peptide gerichtet sind.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung eines Trägers des VHL-Syndrom-Gens, wobei ein Expressionsvektor an den Träger verabreicht wird, der eine das Wildtyp-VHL-Gen darstellende Nucleinsäuresequenz enthält.
Die Erfindung stellt außerdem ein diagnostisches Kit zum Nachweis von Trägern des VHL-Syndrom-Gens bereit. Das Kit umfaßt gereinigte und isolierte Nucleinsäuresequenzen, die als PCR-Primer bei der Analyse von DNA oder RNA auf Mutationen des VHL-Syndroms, die mit dem VHL-Syndrom in Zusammenhang stehen, eingesetzt werden können.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 (Abbildung A) zeigt eine genetische und physikalische Karte des Chromosom-3p-Bereichs, der das VHL-Gen umfaßt. Die genetischen und physikalischen Entfernungen zwischen ausgewählten Markern sind in CentiMorgan bzw. Kilobasen dargestellt. Die Stellen von ausgewählten Crossing-overs sind mit Kreuzen bezeichnet. Fig. 1 (Abbildung B) zeigt die 160 kb Cosmid- und Phagen-Contigs, die den VHL-Bereich überspannen. Eine vergrößerte Restriktionskarte von cos3, cos11 und des Phagen p191 zeigt genauer die Lage der g7-cDNA, die durch Absuchen einer λgt11-Teratokarzinom-cDNA-Genbank mit einem konservierten 7-kb- Fragment aus dem Centromer-Ende von cos11 isoliert wurde. Der Beginn der kleinsten konstitutionellen Deletion ist mit einem Sternchen und einer Linie bezeichnet. Restriktionsstellen: B, BamHI; E, EcoRI; N, NotI; Nr. NruI; M, MluI.
Die Fig. 2A und 2B zeigen eine Northern-Blot-Analyse der Expression des durch die g7-cDNA dargestellten Gens in verschiedenen menschlichen Geweben. Die Fig. 2A zeigt einen Blot mit geringer Auflösung, der 2 ug Poly-A&spplus;-mRNA enthält, die Gewebe sind über den Bahnen angegeben. Die Fig. 2B zeigt einen Blot mit hoher Auflösung, der 1 ug Poly-A&spplus;-mRNA enthält, aus: Bahn 1, fetalem Gehirn; Bahn 2, Gehirn eines Erwachsenen; Bahn 3, fetaler Niere; Bahn 4, Niere eines Erwachsenen; Bahn 5, Cerebellum; Bahn 6, Nebenniere eines Erwachsenen und Bahn 7, Prostata. Die Größen der Transkripte wurden durch die Lage der 28S- und 18S-rRNA-Banden bestimmt.
Die Fig. 3A bis 3E zeigen den Nachweis durch eine Southern-Blotting- Analyse von Rearrangement-Mutationen in konstitutioneller DNA von Patienten mit VHL, wobei die g7-cDNA als Sonde verwendet wurde. (Fig. 3A) Die DNA aus Lymphoblastoid-Zellinien von sieben nicht verwandten VHL-Patienten wurde mit EcoRI gespalten und durch herkömmliche Blotting-Verfahren analysiert. Die normale gleichbleibende Bande liegt bei etwa 20 bis 22 kb, die abnormen Banden, die möglicherweise aus intragenen Deletionen resultieren, liegen bei Größen im Bereich von 4 bis 25 kb. Die Codenummern der Patienten sind über den Bahnen angegeben. (Fig. 3B) Die DNAs aus Lymphoblastoid-Zellinien von Mitgliedern eines Stammbaums einer Familie mit Neumutation (codiert "S") wurden mit DraI, HindIII und PstI gespalten. Der StammbaumI mit der Position der betroffenen (gepunktete Kreise) und der vorausgesagten (schraffierter Kreis) Mitglieder ist dargestellt (Fig. 3C). Männer sind als Quadrate und Frauen als Kreise dargestellt. Die genetische Übertragung des mutierten Allels (die abnorme Bande) in einer regulären VHL- Familie (codiert "P"). Die DNAs wurden mit EcoRI gespalten und durch Southern- Blotting analysiert (Fig. 3D); der Stammbaum ist dargestellt (Fig. 3E).
Fig. 4 zeigt eine Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA von VHL- Patienten (wobei nur die Anfangsbuchstaben jedes Patientennamen angegeben sind). Die DNAs wurden mit EcoRI gespalten und unter Verwendung verschiedener Bereiche der g7-cDNA als Sonde getestet. Abbildung A: Sonde der gesamten g7- cDNA; Abbildung B: Sonde des 5'-Endes, Nucleotide 3 bis 146; Abbildung C: Sonde des 3'-Endes, Nucleotide 1277 bis 1600.
Die Fig. 5A und 5B zeigen die Ergebnisse einer Polymerasekettenreaktion-Einzelstrang-Konformation-Analyse (PCR-SSCP) der genomischen DNA von VHL-Patienten mit der 8 bp-Insertionsmutation (Tabelle 1). Die Teile der DNA- Sequenziergele sind dargestellt, die die normale Sequenz (Fig. 5A) und die Sequenz der 714insTTGTCCGT-Mutation (Fig. 5B) zeigen. Die DNA-Sequenz ist die des Antisense-Strangs; aus diesem Grund sind die eingefügten Basen 5'- ACGGACAA-3'. Neben der Sequenzleiter sind die Positionen der Insertion und die Art der Insertion dargestellt, wie aus der Sequenz vorausgesagt.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse eines Zoo-Blots, in dem die evolutionäre Konservierung des mutmaßlichen VHL-Gens erläutert wird. Die g7-cDNA zeigt unter verschiedenen Arten eine Homologie zu der DNA aus Säugern, Vögeln, Fliegen und Seeigel. Bahnen: 1, Mensch (Homo sapiens); 2, Schimpanse (Pan troglodytes); 3, Makake (Macaca fascicularis); 4, Kuh (Bovis domesticus); 5, Ratte (Rattus norvigicus); 6, Maus (Mus musculus); 7, Huhn (Gallus domesticus); 8, Frosch (Xenopus laevis); 9, Fliege (Drosophila melanogaster); 10, Seeigel (Strongilocetrotus purpuratus) und 11, Hefe (Saccharomyces cerevisiae).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das VHL-Syndrom-Gen und die entsprechende cDNA. Kürzlich wurde der Bereich des menschlichen Chromosoms 3, welcher das VHL-Syndrom-Gen enthält, durch "genomic walking" mit künstlichen Hefechromosomen ("yeast artificial chromosomes", YACs) cloniert und die clonierte DNA mit Cosmiden aus einer Chromosom 3-spezifischen Genbank gewonnen (Latif et al., Science, im Druck). Der Phage 191, der das VHL-Syndrom-Gen enthält, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, am 113. Mai 1993 hinterlegt (Hinterlegungsnummer 69311). Dieses VHL-Syndrom-Gen stellt das Wildtyp-VHL-Gen dar, wobei mit Wildtyp das Gen gemeint ist, das nicht das VHL-Syndrom verursacht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine cDNA, die dem VHL-Syndrom- Gen entspricht. Diese cDNA-Sequenz, die mit g7 bezeichnet wird, ist nachstehend als SEQ ID NO: 1 angegeben und wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 13. Mai 1993 hinterlegt (Hinterlegungsnummer 69312). Diese cDNA hat außerdem die GenBank-Hinterlegungsnummer L15409.
CCTCGCCTCC GTTACAACAG CCTACGGTGC TGGAGGATCC TTCTGCGCAC 50
GCGCACAGCC TCCGCCCGGC TATTTCCGCG AGCGCGTTCC ATCCTCTACC 100
GAGCGCGCGC GAAGACTACG GAGGTCGACT CGGGAGCGCG CACGCGCTC 150
CGCCCCGCGT CCGACCCGCG GATCCCGCGG CGTCCGGCCC GGGTGGTCTG 200
GATCGCGGAG GGAATGCCCC GGAGGGCGGA GAACTGGGAC GAGGCCGAGG 250
TAGGCGCGGA GGAGCCAGGC GTCGAAGAGT ACGGCCCTGA AGAAGACGGC 300
GGGGAGGAGT CGGGCGCCGA GGAGTCCGGC CCGGAAGAGT CCGGCCCGGA 350
GGAACTGGGC GCCGAGGAGG AGATGGAGGC CGGGCGGCCG CGGCCCGTGC 400
TGCGCTCGGT GAACTCGCGC GAGCCCTCCC AGGTCATCTT CTGCAATCGC 450
AGTCCGCGCG TCGTGCTGCC CGTATGGCTC AACTTCGACG GCGAGCCGCA 500
GCCCTACCCA ACGCTGCCGC CTGGCACGGG CCGCCGCATC CACAGCTACC 550
GAGGTCACCT TTGGCTCTTC AGAGATGCAG GGACACACGA TGGGCTTCTG 600
GTTAACCAAA CTGAATTATT TGTGCCATCT CTCAATGTTG ACGGACAGCC 650
TATTTTTGCC AATATCACAC TGCCAGTGTA TACTCTGAAA GAGCGATGCC 700
TCCAGGTTGT CCGGAGCCTA GTCAAGCCTG AGAATTACAG GAGACTGGAC 750
ATCGTCAGGT CGCTCTACGA AGATCTGGAA GACCACCCAA ATGTGCAGAA 800
AGACCTGGAG CGGCTGACAC AGGAGCGCAT TGCACATCAA CGGATGGGAG 850
ATTGAAGATT TCTGTTGAAA CTTACACTGT TTCATCTCAG CTTTTGATGG 900
TACTGATGAG TCTTGATCTA GATACAGGAC TGGTTCCTTC CTTAGTTTCA 950
AAGTGTCTCA TTCTCAGAGT AAAATAGGCA CCATTGCTTA AAAGAAAGTT 1000
AACTGACTTC ACTAGGCATT GTGATGTTTA GGGGCAAACA TCACAAAATG 1050
TAATTTAATG CCTGCCCATT AGAGAAGTAT TTATCAGGAG AAGGTGGTGG 1100
CATTTTTGCT TCCTAGTAAG TCAGGACAGC TTGTATGTAA GGAGGTTTAT 1150
ATAAGTAATT CAGTGGGAAT TGCAGCATAT CGTTTAATTT TAAGAAGGCA 1200
TTGGCATCTG CTTTTAATGG ATGTATAATA CATCCATTCT ACATCCGTAG 1250
CGGTTGGTGA CTTGTCTGCC TCCTGCTTTG GGAAGACTGA GGCATCCGTG 1300
AGGCAGGGAC AAGTCTTTCT CCTCTTTGAG ACCCCAGTGC CTGCACATCA 1350
TGAGCCTTCA GTCAGGGTTT CTCAGAGGAA CAAACCAGGG GACACTTTGT 1400
TAGAAAGTGC TTAGAGGTTC TGCCTCTATT TTTGTTGGGG GGTGGGAGAG 1450
GGGACCTTAA AATGTGTACA GTGAACAAAT GTCTTAAAGG GAATCATTTT 1500
TGTAGGAAGC ATTTTTTATA ATTTTCTAAG TCGTGCACTT TCTCGGTCCA 1550
CTCTTGTTGA AGTGCTGTTT TATTACTGTT TCTAAACTAG GATTGACATT 1600
CTACAGTTGT GATAATAGCA TTTTTGTAAC TTGCCATCCG CACAGAAAAT 1650
ACGAGAAAAT CTGCATGTTT GATTATAGTA TTAATGGACA AATAAGTTTT 1700
TGCTAAATGT GAGTATTTCT GTTCCTTTTT GTAAATATGT GACATTCCTG 1750
ATTGATTTGG GTTTTTTTGT TGTTGTTGTT TTGTTTTGTT TTGTTTTTTT 1800
GGGATGGAGG GAATTC 1816
Für die Nucleotide wurden die üblicherweise vom Fachmann verwendeten Abkürzungen eingesetzt.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz der g7-cDNA ist als SEQ ID NO: 2 nachstehend dargestellt und beginnt mit Nucleotid 1 von SEQ ID NO: 1 und erstreckt sich über 851 Nucleotide.
In der in SEQ ID NO: 1 dargestellten cDNA-Sequenz sollen auch Variationen enthalten sein, die zu einer DNA-Sequenz führen, die fähig ist, die Produktion von Analoga des in SEQ ID NO: 2 dargestellten VHL-Proteins zu steuern. Es wird darauf hingewiesen, daß die vorstehend angegebene DNA-Sequenz eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es so zu verstehen, daß zahlreiche Nucleotide ausgewählt werden können, die zu einer DNA-Sequenz führen, die fähig sind, die Produktion des vorliegenden VHL-Proteins oder seiner Analoga zu steuern. Somit sollen DNA-Sequenzen in der vorliegenden Erfindung enthalten sein, die zu der vorstehend dargestellten Sequenz funktionell äquivalent sind oder die zu Sequenzen funktionell äquivalent sind, die die Produktion von Analoga des VHL-Proteins, hergestellt gemäß der vorstehend dargestellten Aminosäuresequenz, steuern können.
Der Begriff Analogon umfaßt ein beliebiges Protein oder Polypeptid, das eine Sequenz von Aminosäureresten aufweist, die im wesentlichen identisch ist mit einer hier spezifisch gezeigten Sequenz, bei dem ein oder mehrere Aminosäurereste konservativ substituiert wurden durch einen funktionell ähnlichen Rest und das die funktionellen Aspekte des hier beschriebenen VHL-Proteins zeigt. Beispiele für konservative Substitutionen umfassen z. B. die Substitution eines nicht-polaren (d. h. hydrophoben) Restes, wie z. B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, gegeneinander; die Substitution eines polaren (d. h. hydrophilen) Restes durch einen anderen, z. B. eine Substitution zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutamin und Asparagin oder zwischen Glycin und Serin; die Substitution eines basischen Restes, wie z. B. Lysin, Arginin oder Histidin, gegeneinander; oder die Substitution eines sauren Restes, wie z. B. Asparaginsäure oder Glutaminsäure, gegeneinander.
Der Begriff konservative Substitution kann auch die Verwendung eines chemisch derivatisierten Restes anstelle eines nicht-derivatisierten Restes einschließen, mit der Maßgabe, daß das resultierende Protein oder Polypeptid die erforderliche funktionelle Aktivität besitzt.
Chemisches Derivat bezieht sich auf ein VHL-Protein oder Polypeptid mit einem oder mehreren Resten, die durch Umsetzung einer funktionellen Seitengruppe chemisch derivatisiert wurden. Beispiele solcher derivatisierten Moleküle beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf solche Moleküle, bei denen freie Aminogruppen derivatisiert wurden, wodurch z. B. Amin-Hydrochloride, p-Toluol-Sulfonylgruppen, Carbobenzoxygruppen, t-Butyloxycarbonylgruppen, Chloracetylgruppen oder Formylgruppen erzeugt wurden. Freie Carboxylgruppen können derivatisiert werden, so daß Salze, Methyl- und Ethylester oder andere Estertypen oder Hydrazide entstehen. Freie Hydroxylgruppen können derivatisiert werden, so daß O- Acyl- oder O-Alkylderivate entstehen. Das Imidazol-Stickstoffatom von Histidin kann derivatisiert werden, so daß N-im-Benzylhistidin entsteht. Außerdem sind als chemische Derivate diejenigen Proteine oder Peptide eingeschlossen, die ein oder mehrere in der Natur vorkommende Aminosäurederivate der zwanzig Standardaminosäuren enthalten. Z. B. kann Prolin durch 4-Hydroxyprolin substituiert werden, Lysin durch 5-Hydroxylysin, Histidin durch 3-Methylhistidin, Serin durch Homoserin und Lysin kann durch Ornithin substituiert werden. Ein VHL-Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung schließt auch ein beliebiges Protein oder Polypeptid ein, das eine oder mehrere Additionen und/oder Deletionen von Resten aufweist, bezogen auf die Sequenz eines Proteins oder Polypeptids, dessen Sequenz hier dargestellt ist, solange die erforderliche Aktivität erhalten bleibt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Nachweis von Trägern des VHL-Syndrom-Gens.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, daß die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nachweisverfahren pränatal zum Testen eines Fetus eingesetzt werden können oder daß sie präsymptomatisch verwendet werden können, um ein Individuum zu testen, das aufgrund seiner/ihrer Familiengeschichte ein Risiko aufweist. Außerdem können diese Verfahren verwendet werden, um die Beteiligung des VHL-Syndrom-Gens an anderen malignen Erkrankungen des Menschen, z. B. an Nieren-, Lungen- und Blasenkrebserkrankungen, zu untersuchen.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren zum Nachweis von Trägern des VHL-Syndrom-Gens die Analyse der DNA eines Individuums auf Mutationen des VHL-Syndrom-Gens, die mit dem VHL-Syndrom in Zusammenhang stehen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet Individuum ein Säugetier und Mutation steht für Inversion, Translokation, Insertion, Deletion oder Punktmutation des VHL-Syndrom-Gens.
Für die Analyse der DNA wird eine biologische Probe aus einem Individuum gewonnen. Beispiele von biologischen Proben, die zur Verwendung im vorliegenden Verfahren gewonnen werden können, beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Gewebebiopsien, Vollblut, Urin, Fäzes oder andere Proben, die normalerweise bei der Diagnose von Erkrankungen getestet werden. Bevorzugte biologische Proben sind Vollblut oder Urin.
Obwohl es nicht immer erforderlich ist, ist es doch bevorzugt, die DNA aus der biologischen Probe vor der Analyse zumindest teilweise zu reinigen. Z. B. kann die Nucleinsäure nach dem Aufschluß der Zellen in der Probe aus den als Verunreinigung vorliegenden Zelltrümmern und anderen Proteinsubstanzen extrahiert werden, indem die Probe mit Phenol extrahiert wird. Bei der Phenolextraktion wird die wäßrige Probe mit einem etwa gleich großen Volumen von redestilliertem Phenol gemischt und zur Trennung der zwei Phasen zentrifugiert. Die wäßrige Phase, die die Nucleinsäure enthält, wird entfernt und mit Ethanol gefällt, wodurch Nucleinsäure erhalten wird, die frei von Phenol ist. In einer anderen Ausführungsform kann die DNA aus der biologischen Probe gemäß Sidransky, D., et al. (Science 256 (1992), 102-105; Science 252 (1991), 706) oder durch das Verfahren von Glenn et al. (Glenn, G.M., et al., JAMA 267 (1992), 1226-1231) gereinigt werden. Die DNA, die analysiert wird, kann entweder einzel- oder doppelsträngig sein.
Verfahren zur Analyse der DNA auf Mutationen im VHL-Syndrom-Gen beinhalten das Southern-Blotting nach Spaltung mit den entsprechenden Restriktionsenzymen (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus, RFLP) (Botstein, D., Amer. J. Hum. Genet. 69 (1980), 201-205), die Technik der denaturierenden Gradienten- Elektrophorese (Myers, R.M., Nature 313 (1985), 495-498), die Oligonucleotid- Hybridisierung (Conner, R. et al., EMBO J. 3 (1984), 13321-1326), die RNase- Spaltung eines Doppelstrangs zwischen einer Sonden-RNA und der Ziel-DNA (Winter, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 7575-7579), die Polymerasekettenreaktion ("polymerase chain reaction", PCR) (Saiki, P.K. et al., Science 239 (1988), 487491; US-Patente 4 683 195 und 4 683 202), die Ligasekettenreaktion ("ligase chain reaction", LCR) (Europäische Patentanmeldungen Nr. 0 320 308 und 0 439 182) und die PCR-Einzelstrang-Konformations-Analyse (PCR-SSCP) (Orita, M. et al., Genomics 5 (1989), 874-879; Dean, M. et al., Cell 61 (1990), 863-871). In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA durch die Southern-Analyse untersucht.
Die DNA, die durch die Southern-Analyse untersucht werden soll, wird mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen gespalten. Die Restriktionsenzyme, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Enzyme, bei denen das Vorliegen oder die Abwesenheit ihrer Erkennungsstelle mit dem VHL-Syndrom gekoppelt ist. Bevorzugte Restriktionsenzmye schließen EcoRI, HindIII, PstI, DraI, BamHI, BgIII, BgIII und PvuII ein. Nach der Restriktionsspaltung werden die resultierenden DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese aufgetrennt und die Fragmente durch Hybridisierung mit einer markierten Nucleinsäuresonde nachgewiesen (Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98 (1975), 503-517).
Die Nucleinsäuresequenz, die bei der Southern-Analyse als Sonde eingesetzt wird, kann in einzel- oder in doppelsträngiger Form markiert werden. Die Markierung der Nucleinsäuresequenz kann durch Techniken erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Markierungstechniken können Radiomarkierungen und Enzyme einschließen (Sambrook, J., et al., (1989), in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York). Außerdem gibt es bekannte nicht-radioaktive Techniken für die Signalverstärkung, einschließlich Verfahren zur Anlagerung von chemischen Resten an Pyrimidin- und Purinringe (Dale, R.N.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 70 (1973), 2238-2242; Heck, R.F., S. Am. Chem. Soc. 90 (1968), 5518-5523), Verfahren, die den Nachweis durch Chemilumineszenz erlauben (Barton, S.K. et al., J. Am. Chem. Soc. 114 (1992), 8736- 8740), und Verfahren, bei denen biotinylierte Nucleinsäuresonden eingesetzt werden (Johnson, T.K. et al., Anal. Biochem. 133 (1983), 126-131; Erickson, P.F. et al., J. of Immunology Methods 51 (1982), 241-249; Matthaei, F.S. et al., Anal. Biochem. 157 (1986), 123-128), sowie Verfahren, die den Nachweis durch Fluoreszenz unter Verwendung handelsüblicher Produkte ermöglichen. Die Größe der Sonde kann im Bereich von etwa 200 Nucleotiden bis etwa mehreren Kilobasen liegen. Eine bevorzugte Sondengröße liegt bei etwa 500 bis etwa 2000 Nucleotiden. Jede der bei der Southern-Analyse als Sonde eingesetzten Nucleinsäuresequenzen ist im wesentlichen homolog zu dem entsprechenden Teil der cDNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist. Mit "im wesentlichen homolog" ist ein Niveau der Homologie zwischen der als Sonde eingesetzten Nucleinsäuresequenz und der entsprechenden in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz gemeint. Vorzugsweise beträgt das Homologieniveau mehr als 70%, stärker bevorzugt mehr als 80% und eine besonders bevorzugte Nucleinsäuresequenz ist zu der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz mehr als 90% homolog. Sobald die getrennten DNA- Fragmente mit den markierten Nucleinsäuresonden hybridisiert sind, kann das Muster der Restriktionsspaltung durch Autoradiographie sichtbar gemacht und auf das Vorliegen oder die Abwesenheit eines mit dem VHL-Syndrom assoziierten Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) untersucht werden.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungform wird die DNA auf Mutationen im VHL-Syndrom-Gen durch PCR-SSCP analysiert (Orita et al., (1989), Dean et al., (1990)). In diesem Verfahren werden die jeweiligen Primerpaare für die Venwendung in der PCR so gestaltet, daß sie mit Sequenzen im VHL-Syndrom-Gen hybridisieren, die im Gen eine geeignete Strecke voneinander entfernt sind (mindestens etwa 50 Nucleotide), so daß die Amplifikation und der anschließende Nachweis von Mutationen im Amplifikationsprodukt ermöglicht wird. Primerpaare, die spezifisch mit solchen VHL-Gensequenzen hybridisieren können, können von der VHL- Syndrom-Gensequenz hergeleitet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Primer von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten cDNA-Sequenz hergeleitet. Jeder Primer eines Paars ist ein einzelsträngiges Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 15 bis etwa 50 Basen, das zu einer Sequenz am 3'-Ende von einem der Stränge einer doppelsträngigen Zielsequenz komplementär ist. Jedes Paar umfaßt zwei solche Primer, von denen einer zum 3'-Ende komplementär ist und der andere zum anderen 3'-Ende der Zielsequenz komplementär ist. Die Zielsequenz hat im allgemeinen eine Länge von etwa 100 bis etwa 300 Basenpaaren, sie kann jedoch auch 500 bis 600 Basenpaare lang sein. Die Optimierung der Amplifikationsreaktion, so daß eine ausreichend spezifische Hybridisierung mit dem VHL- Syndrom-Gen erhalten wird, ist dem Fachmann bekannt und wird vorzugsweise erreicht, indem die Anelierungstemperatur eingestellt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch gereinigte und isolierte Paare von Primern bereit, die bei der Analyse von DNA auf Mutationen im VHL-Gen eingesetzt werden können. Die Nucleinsäuresequenzen dieser Primer sind nachstehend als SEQ ID NO: 3 bis 8 dargestellt.

SEQ. ID. NO. 3

ATAGTGCAAA TACAGTAACG AGTTGGCCTA GCCTCGC

SEQ. ID. NO. 4

CCCAGCTGGG TCGGGCCTAA GCGCCGGGCC CGT

SEQ. ID. NO. 5

GTGGCTCTTT AACAACCTTT GCTTGTCCCG ATA

SEQ. ID. NO. 6

CAAGTGGTCT ATCCTGTACT TACCAGAACA CCT

SEQ. ID. NO. 7

TGTATACTCT GAAAGAGCGA TGCCTCCAGG T

SEQ. ID. NO. 8

TACCATCAAA AGCTGAGATG AAACAGTGTA AGT
wobei SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 ein Primerpaar darstellen; SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 ein zweites Primerpaar und SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 ein drittes Primerpaar darstellen.
Die Primer der vorliegenden Erfindung können synthetisiert werden, indem ein beliebiges bekanntes Verfahren der Oligonucleotidsynthese verwendet wird (z. B. das Phosphodiesterverfahren von Agarwal et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 11 (1972), 451, das Phosphotriester-Verfahren von Hsiung et al., Nucleic Acids Res. 6 (1979), 1371, oder das automatisierte Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beuacage et al., Tearahedron Letters 22 (1981), 1859-1862), oder sie können isolierte Fragmente von natürlich vorkommender oder clonierter DNA sein. Außerdem ist es für den Fachmann ersichtlich, daß Oligonucleotide durch automatisierte Apparaturen synthetisiert werden können, die von verschiedenen Herstellern vertrieben werden, oder daß sie kundenspezifisch bestellt und hergestellt werden können. In einer Ausführungsform können die Primer so derivatisiert werden, daß sie eine nachweisbare Markierung enthalten, die für den Nachweis und/oder die Identifizierung der Primerverlängerungsprodukte geeignet ist (z. B. Biotin, Avidin oder radioaktiv-markierte dNTPs) oder mit einer Substanz, die die Isolierung der Amplifikationsprodukte unterstützt (z. B. Biotin oder Avidin). In einer bevorzugten Ausführungsform sind die SEQ ID NO: 3 bis SEQ ID NO: 8 synthetische Oligonucleotide.
In einer anderen Ausführungsform können die Primerpaare so ausgewählt werden, daß sie mit Mutantenformen des VHL-Syndrom-Gens hybridisieren. Die ausgewählten Primerpaare sollten mit den mutierten Gensequenzen ausreichend spezifisch hybridisieren, so daß die Identifizierung des Amplifikationsproduktes der mutierten Gensequenz nicht durch eine unspezifische Hybridisierung mit den Wildtyp-VHL-Gensequenzen verhindert werden kann. Primerpaare, die mit Mutationen in der VHL-Gensequenz hybridisieren, können zur Amplifikation spezifischer mutierter Gensequenzen verwendet werden, die in der DNA einer biologischen Probe vorliegen.
Die Amplifikationsprodukte der PCR können entweder direkt oder indirekt nachgewiesen werden. Bei dem PCR-SSCP-Verfahren erfolgt der direkte Nachweis der Amplifikationsprodukte über die Markierung von Primerpaaren. Die Markierungen, die für die Markierung von Primern der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind dem Fachmann bekannt und beinhalten radioaktive Markierungen, Biotin, Avidin, Enzyme und fluoreszierende Moleküle. Die abgeleiteten Markierungen können in die Primer eingetaut werden, bevor die Amplifikationsreaktion durchgeführt wird. Bei einem bevorzugten Markierungsverfahren wird radioaktives ATP und T4-Polynucleotidkinase eingesetzt (Sambrook, J., et al., (1989), in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY). In einer anderen Ausführungsform kann die gewünschte Markierung während der Amplifikationsreaktion in Form von einem oder mehreren markierten dNTPs in die Primerverlängerungsprodukte eingebaut werden. In der vorliegenden Erfindung können die markierten amplifizierten PCR-Produkte auf Mutationen des VHL-Gens, die mit dem VHL-Syndrom-Gen in Zusammenhang stehen, analysiert werden, indem die PCR- Produkte durch denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt werden oder indem die PCR-Produkte direkt sequenziert werden.
In einer anderen Ausführungsform können unmarkierte Amplifikationsprodukte auf Mutationen im VHL-Syndrom-Gen analysiert werden, indem eine Hybridisierung mit Nucleinsäuresonden, die radioaktiv markiert sind oder die mit Biotin markiert sind, in Southern-Blots oder Dot-Blots durchgeführt wird. Nucleinsäuresonden, die in der Ausführungsform verwendet werden können, sind diejenigen, die bereits früher für die Southern-Analyse beschrieben wurden.
In einer zweiten Ausführungsform umfaßt das Verfahren zum Nachweis von Trägern des VHL-Syridrom-Gens die Analyse der RNA eines Individuums auf Mutationen oder Veränderungen in der VHL-spezifischen mRNA, die mit dem VHL- Syndrom in Zusammenhang stehen.
Für die Analyse von RNA durch dieses Verfahren wird die aus Blut oder einer Tumorbiopsieprobe stammende RNA aus dem Individuum gewonnen, wobei die Tumoren Tumoren des Ophthalmenzephalons, der Leber, der Niere, des Pankreas und Phäochromozytome umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind.
Die zu analysierende RNA kann aus Blut oder Tumorbiopsieproben als gesamte Zell-RNA oder als Poly(A)&spplus;-RNA isoliert werden. Die gesamte Zell-RNA kann durch Verfahren isoliert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Verfahren schließen die Extraktion von RNA durch differenzierende Fällung (Birnboim, H. C., Nucleic Acids Res. 16 (1988), 1487-1497), die Extraktion von RNA durch organische Lösungsmittel (Chomczynski, P., et al., Anal. Biochem. 162 (1987), 156- 159) und die Extraktion von RNA mit starken Denaturierungsmitteln (Chirgwin, J. M., et al., Biochemistry 18 (1979), 5294-5299) ein. Poly(A)&spplus;-RNA kann aus der gesamten Zell-RNA durch Affinitätschromatographie auf Oligo-d(T)-Säulen selektiert werden (Aviv, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69 (1972), 1408-1412). Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung von RNA ist die Extraktion der gesamten Zell-RNA durch saures Phenol (Chomczynski et al., 1987).
Die Verfahren zur Analyse der RNA auf Veränderungen im Muster oder in der Stärke der VHL-spezifischen mRNA-Expression, die mit dem VHL-Syndrom in Zusammenhang stehen, schließen das Northern-Blotting (Alwine, J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), 5350-5354), die Dot- und Slot-Hybridisierung (Kafatos, F.C., et al., Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1541-1522), die Filterhybridisierung (Hol lander, M.C., et al., Biotechniques 9 (1990), 174-179), den RNase-Schutz (Sambrook, J., et al., (1969), in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY) und die Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) (Watson, J.D., et al., (1992), in "Recombinant DNA", 2. Aufl., W.H. Freeman and Company, New York) ein. Ein bevorzugtes Verfahren ist das Northern-Blotting.
Die Nucleinsäuresequenz, die als Sonde zum Nachweis der VHL- spezifischen m-RNA-Expression verwendet wird, ist im wesentlichen homolog zu SEQ ID NO: 1. Mit "im wesentlichen homolog" ist ein Niveau der Homologie zwischen der Nucleinsäuresequenz und der cDNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 gemeint. Vorzugsweise beträgt das Homologieniveau mehr als 70%, stärker bevorzugt mehr als 80%, und eine besonders bevorzugte Nucleinsäuresequenz ist zu der in SEQ ID NO: 1 dargestellten cDNA-Sequenz mehr als 90% homolog.
Ein am stärksten bevorzugtes Verfahren ist die Reverse Transkription- Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), bei der die zur Amplifikation der durch reverse Transkription von IRNA erzeugten cDNA verwendeten Primer von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten cDNA-Sequenz hergeleitet sind. Diese Primer können markiert werden, wie vorstehend beschrieben, und die RT-PCR-Produkte können auf Mutationen des VHL-Gens, die mit dem VHL-Syndrom in Zusammenhang stehen, untersucht werden, indem eine denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese der RT- PCR-Produkte oder eine direkte Sequenzierung der RT-PCR-Produkte erfolgt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch rekombinante Proteine, die von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten cDNA hergeleitet sind, und Antikörper, die gegen diese Proteine (genannt VHL-Proteine) gerichtet sind. Rekombinante VHL-Proteine können durch Verfahren der DNA-Rekombinationstechnik hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Z. B. kann eine Nucleinsäuresequenz, die zur Codierung eines Proteins fähig ist, das die gesamte oder einen Teil der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz umfaßt, in einen Vektor cloniert werden, der in einen Wirtsorganismus übertragen und darin repliziert werden kann. Eine geeignete Nucleinsäuresequenz für den Zweck der vorliegenden Erfindung ist die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz. Geeignete Expressionsvektoren beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf Vacciniavirus-Vektoren, Baculovirus-Vektoren und E. coli-pTRCHIS (Invitrogen Co., San Diego). Der rekombinante Expressionsvektor, der durch Insertion einer Nucleinsäuresequenz, die fähig ist, die Synthese von VHL- Protein zu steuern, in einen geeigneten Expressionsvektor hergestellt wird, kann in E. coli oder in geeignete eukaryotische Zellsysteme durch Verfahren transfiziert werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Zellen, die das exprimierte rekombinante VHL-Protein enthalten, Zell-Lysate von mit einem rekombinanten Expressionsvektor transfizierten Zellen oder ein Kulturüberstand, der das exprimierte VHL-Protein enthält, können als Immunogen eingesetzt werden, um die Produktion von Anti-VHL-Antikörpern in einem Säugetier zu induzieren. In einer anderen Ausführungsform kann man aus der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz synthetische Peptide erzeugen, die als Immunogene verwendet werden können. Bevorzugte synthetische Peptidsequenzen für die Verwendung als Immunogen sind nachstehend dargestellt:

SEQ ID NO. 9:

Glu Glu Tyr Gly Pro Glu Glu Asp Gly Gly Glu Glu Ser Gly

SEQ ID NO. 10:

Gly Thr Gly Arg Arg Ile His Ser Tyr Arg Gly His Leu
Zwar kann das Immunogen an das Säugetier in einer reinen oder einer im wesentlichen reinen Form verabreicht werden, jedoch ist bevorzugt, es als eine pharmazeutische Zusammensetzung, Formulierung oder Präparat anzubieten. Für die Immunisierung geeignete Säugetiere schließen Mäuse, Kaninchen und dergleichen ein. Der Anti-VHL-Antikörper der vorliegenden Erfindung wird typischerweise durch Immunisierung eines Säugetiers mit einer immunologisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen synthetischen Peptids erzeugt. Die Herstellung von polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern gegen ein solches Peptid ist dem Fachmann bekannt (Standt et al., J. Exp. Med. 157 (1988), 687-704). Die gegen das VHL-Peptid gerichteten Antikörpermoleküle, die durch Immunisierung eines Säugetiers mit dem rekombinanten VHL-Protein induziert wurden, werden sodann aus dem Säugetier gewonnen und diejenigen, die für das VHL-Protein immunspezifisch sind, werden bis zu dem gewünschten Ausmaß durch bekannte Techniken isoliert, z. B. durch Immunchromatographie.
In einer dritten Ausführungsform umfaßt das Verfahren zum Nachweis von Trägern des VHL-Syndrom-Gens die Analyse des Proteins von einem Individuum auf Veränderungen in der VHL-Protein-Expression, die mit dem VHL-Syndrom in Zusammenhang stehen.
Zur Analyse des Proteins durch dieses Verfahren wird das Protein aus biologischen Proben, z. B. Tumorbiopsieproben, Urin und dergleichen, gewonnen. Das Protein kann als ein rohes Lysat gewonnen oder durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, weiter gereinigt werden (Sambrook, J., et al., (1989), in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY).
Das rohe Proteinlysat kann durch Immuntests unter Verwendung von Anti- VHL-Antikörpern auf das VHL-Protein untersucht werden.
Immuntests der vorliegenden Erfindung können ein Radioimmuntest, Wester- Blot-Test, Immunfluoreszenztest, Enzymimmuntest, Chemilumineszenztest, immunhistochemischer Test und dergleichen sein. Herkömmliche Techniken für ELISA, die dem Fachmann bekannt sind, werden beschrieben in Method in Immunodiagnosis, 2. Aufl., Rose und Bigazzi, Hrsg., John Wiley and Sons (1980), und Campbell et al., Methods of Immunology, W.A. Benjamin, Inc. (1964), die beide durch Bezugnahme hier eingeschlossen sind. Solche Tests können ein direkter, indirekter, kompetitiver oder nicht-kompetitiver Immuntest sein, wie in der Fachliteratur beschrieben (Oellerich, M., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22 (1984), 895-904).
Der Nachweis des gebildeten Komplexes aus VHL-Protein und Anti-VHL- Antikörper kann durch Umsetzung des Komplexes mit einem sekundären Antikörper erfolgen, z. B. mit einem markierten Anti-Kaninchen-Antikörper. Die Markierung kann ein Enzym sein, das durch Inkubation des Komplexes in Gegenwart eines geeigneten fluorimetrischen oder colorimetrischen Reagens nachgewiesen wird. Auch andere nachweisbare Markierungen können eingesetzt werden, z. B. Radiomarkirungen oder kolloidales Gold und dergleichen. Anschließend wird der markierte Komplex aus VHL-Protein und Anti-VHL-Antikörper durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung eines Trägers des VHL-Syndrom-Gens, wobei an den Träger ein Expressionsvektor verabreicht wird, der eine Nucleinsäuresequenz enthält, die das Wildtyp-VHL-Gen darstellt. Eine Nucleinsäuresequenz, die das Wildtyp-VHL-Gen darstellt, ist die in SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz. Eine solche Nucleinsäuresequenz kann in einen geeigneten Expressionsvektor durch Verfahren eingefügt werden, die dem Fachmann bekannt sind (Beispiel 5). Expressionsvektoren, die geeignet sind, in vivo einen Gentransfer mit einem hohen Wirkungsgrad zu erreichen, schließen Retrovirus-, Adenovirus- und Vacciniavirus-Vektoren ein.
Expressionsvektoren, die eine das Wildtyp-VHL-Gen darstellende Nucleinsäuresequenz enthalten, können intravenös, intramuskulär, subkutan, intraperitoneal oder oral verabreicht werden. Bevorzugt ist die intravenöse Applikation.
Die Erfindung stellt auch ein diagnostisches Kit für den Nachweis von Trägern des VHL-Syndrom-Gens bereit. Dieses diagnostische Kit umfaßt gereinigte und isolierte Nucleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 3 bis SEQ ID NO: 8, wobei die Sequenzen als PCR-Primer bei der Analyse von DNA auf Mutationen des VHL-Syndrom-Gens, die mit dem VHL-Syndrom in Zusammenhang stehen, nützlich sind.
Die Artikel und Patente, auf die hier Bezug genommen wird, sind durch Bezugnahme eingeschlossen. Die folgenden Beispiele erläutern verschiedene Aspekte der Erfindung, sie sollen jedoch in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken.

Materialien

Die in den folgenden Beispielen untersuchten Personen waren Verwandte, die durch Augenärzte, Urologen, medizinische Genetiker und Neurochirurgen in den Vereinigten Staaten, Europa und Kanada identifiziert wurden. Die Mitglieder der Familien wohnten in Louisiana, Tennessee, Mississippi, Virginia, Pennsylvania, New York, Michigan, Quebec, Nova Scotia, im Vereinigten Königreich und in den Niederlanden. Die ärztlichen Befunde von jedem Familienmitglied, von dem man wußte, daß es betroffen ist, wurden überprüft. Asymptomatische Familienmitglieder und Familienmitglieder, bei denen über die Diagnose Ungewissheit bestand, wurden nach ihrer Einwilligung an den klinischen Zentren der National Institutes of Health auf ein okkultes Vorliegen der Erkrankung untersucht. Die Untersuchung bestand aus der Anamnese und der körperlichen Untersuchung des Skrotums. Ein asymtomatisches Mitglied einer VHL-Familie wurde als betroffen eingestuft, wenn eines oder mehrere der folgenden Manifestationen der Erkrankung nachgewiesen wurden: Angiom(e) der Retina, spinale(s) oder zerebrale(s) Hämangioblastom(e), Phäochromozytom(e), multiple Pankreaszysten und multiple bilaterale Nierenzysten, begleitet von Nierenkarzinom. Die Diagnose der Erkrankung wurde gestellt, ohne daß der Status des Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) bekannt war.
Die Restriktionsenzyme stammten von Bethesda Research Laboratory (BRL) (Bethesda, MD), New England Biolabs (Beverly, MA) und Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) und wurden gemäß den Empfehlungen der Hersteller eingesetzt. δ-³²PdCTP (~3000 IU/mmol) wurde von Amersham (Arlington Heights, IL) bezogen. Die beim Northern-Blotting eingesetzten polyadenylierten RNAs aus verschiedenen menschlichen Geweben wurden von Clonstech (Palo Alto, CA) bezogen, wie auch die doppelsträngige komplementäre DNA-Probe aus einer erwachsenen Niere. PCR- und RT-PCR-Material stammte von Perkin-Elmer/Cetus (Norwalk, CT); Desoxynucleotidtriphosphate und Fluoreszens-markierte Didesoxynucleotide wurden von Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA), bezogen. Die Nylonmembranen wurden von MSI, Inc. (Westlore, MA), geliefert.

Methoden

Die Southern- und Northern-Blottings, die Filterhybridisierung und die Sondenmarkierung durch zufälligen Synthesestart ("random priming") erfolgten nach Standardprotokollen (Sambrook, J., et al., (1989)). Die DNA-Insertionen wurden nach dem GeneClean Verfahren (Bio 101) (BioRad, Richmond, CA) gereinigt und für die Subclonierung oder Markierung eingesetzt. Die Oligonucleotide, die als Pri mer in der PCR oder RT-PCR oder für die Sequenzierung verwendet wurden, wurden auf dem DNA/RNA-Synthesizer von Applied Biosystems, Inc., Modell 392, gemäß den Empfehlungen der Hersteller synthetisiert. Die Pulsfeld-Ziel-Elektrophorese wurde unter Verwendung der Systeme CHEF-DRII oder CHEF-Mapper-XA wie vom Hersteller (BioRad) beschrieben unter für die gewünschte Auflösung optimalen Bedingungen durchgeführt.
Die PCR erfolgte in einem Reaktionsvolumen von 50 ul in einem Gemisch, das 1 uMol von jedem Primer, 250 uMol von jedem Desoxynucleotidtriphosphat, 5 ul von 10 · PCR-Puffer (500 mMol KCl, 120 mMol Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 mMol MgCl&sub2; und 0,1% Gelatine) und 1,25 Einheiten AmpTaq (Cetus) DNA-Polymerase enthielt, in einem automatisierten Thermocycler der ersten Generation (Perkin-Elmer/Cetus). Die PCR-Bedingungen bestanden aus 40 Cyclen aus Denaturierung für eine Minute bei 94ºC, Aneinanderlagern (Anelierung) für eine Minute bei spezifischen Temperaturen (55 bis 65ºC) und Strangverlängerung für vier Minuten bei 72ºC, gefolgt von sieben Minuten endgültiger Strangverlängerung bei 72ºC.
RNA-Herstellung und Northern-Blotting - Die gesamte zelluläre RNA wurde durch Extraktion von Lymphoblastoid-Zellinien von betroffenen VHL-Patienten oder von Nierengeweben in Guanidinthiocyanat und anschließende Zentrifugation durch ein 5,7 M CsCI-Kissen gemäß Standardverfahren isoliert (Sambrook, J. et al., (1989)). Die RNA-Proben wurden durch Elektrophorese in 2,2 M Formaldehyd enthaltenden 1% Agarosegelen aufgetrennt, auf Nylonmembranen übertragen und mit einer g7-cDNA-Sonde hybridisiert (Sambrook, J., et al., (1989)).
RT-PCR - Etwa 5 ug der gesamten zellulären RNA wurden durch Extraktion von Lymphoblastoid-Zellinien oder von Nierengewebe von VHL-Patienten isoliert, oder 2,5 ng doppelsträngige komplementäre DNA-Proben von normalen erwachsenen Nieren wurden unter Verwendung des RT-PCR-Kits von Perkin-Elmer/Cetus auf die Expression untersucht. Die Primer wurden von der in SEQ ID NO: 1 gezeigten g7-cDNA-Sequenz hergeleitet und die Reaktionen unter Einsatz verschiedener Anelierungstemperaturen durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Gelelektrophorese und Southern-Blotting analysiert (Sambrook, J., et al. (1989)).

BEISPIELE

Beispiel 1

Isolierung des VHL-Syndrom-Gens

Die Isolierung des VHL-Syndrom-Gens kam durch den Einsatz von Verfahren der Positionsclonierung zustande (Latifet al., Cancer Res. 63 (1993), 861-867; Trofatter et al., Cell 72 (1993), 791-800 und The Huntington's Disease Collaborative Research Group, Cell 72 (1993), 971-983), die früher schon für die Isolierung von Krankheitsgenen verwendet wurden, sie werden in Latifet al. beschrieben (Science, im Druck, "Identification of the von Hippel-Lindau Disease Tumor Suppressor Gene"). Die genetische und physikalische Karte des Chromosom-3p-Bereichs, der das VHL-Gen umfaßt, ist in Fig. 1 dargestellt. Die Position des VHL-Locus wurde auf der Karte (Fig. 1, Abbildung A) durch Multipunkt-Kopplungsanalyse und meiotische Kartierung bestimmt (Tory et al., 1989); die Stellen von ausgewählten Crossing-overs sind durch Kreuze gekennzeichnet.
Absuchen von YAC-Genbanken und Analyse von YACs - Die Kopien der WU- und CEPH YAC-Genbanken wurden von Dr. Craig Chinault (Baylor Institute of Human Genetics, Houston, Texas) bzw. Dr. Daniel Cohen (Centre d'Etude du Polymorphisme Humain, Paris) erhalten. Die WU- und CEPH-Genbanken sind im PYAC4-Vektor konstruierte menschliche Gesamt-Genom-DNA-Genbanken (Burke, D.T., et al., Science 236 (1987), 806-812; Anand, R., et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 1951-1956). Diese Genbanken wurden durch "Sippen"-Selektion unter Verwendung von auf PCR basierenden Techniken (Greene, E.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (1990), 1213-1217) mit Primem auf die D3S601, D3S587 und D3S18- Loci im VHL-Bereich abgesucht (Fig. 1). Die Sequenzen der Primer, die für die positive Identifizierung der YACs Y52A10, YA101D4, Y132F2 und Y70D2 verwendet wurden, sind nachstehend als SEQ ID NO: 11 bis SEQ ID NO: 16 dargestellt:
Absuchen der Chromosom-3-Cosmid-Genbank und Zusammenbau von Cosmid-Contigs - Die Chromosom-3-Cosmid-Genbank wurde konstruiert, wie in Lerman et al. beschrieben (Lerman, M.I., et al., Hum. Genet. 86 (1991), 567-577). Diese Genbank wurde durch Koloniehybridisierung abgesucht (Sambrook, J., et al., (1989)), wobei die YAC-DNA-Insertionen als Sonden verwendet wurden, wie in Baxendale et al. beschrieben (Baxendale, S., et al., Nucl. Acids Res. 19 (1991), 6651). Nach der Markierung mit ³²P-dCTP wurden die Sonden zuerst mit einem 1000fachen Überschuß an gescherter menschlicher DNA zusammengebracht. Die Cosmid-Contigs wurden konstruiert, indem auf Southern-Blots von EcoRI-gespaltenen Cosmiden überlappende Banden gefunden wurden, wobei ganze Cosmide als Sonden eingesetzt wurden. Lücken in den Cosmid-Contigs wurden durch "chromosome walking" unter Verwendung von "insert end fragment"-Sonden geschlossen, die durch Restriktionskartierung und Hybridisierung mit gespaltener genomischer DNA identifiziert wurden. Diese "insert end fragment"-Sonden wurden für jeden "walking"-Schritt eingesetzt. Fig. 1 zeigt den 160 kb Cosmid- und Phagen-Contig, der den VHL-Bereich überdeckt. Der Phage T42 wurde durch Absuchen einer gesamten genomischen Phagen-Genbank mit YAC-DNA-Insertionen isoliert, wie vorstehend beschrieben. Der Phage p191, der das VHL-Syndrom-Gen enthält, wurde durch Absuchen einer Drei-"hit"-P1-Phagen-Genom-Genbank (Genome System, Inc., St. Louis, MO) mit Primern isoliert, die aus dem Bereich innerhalb eines Exons der in SEQ ID NO: 1 dargestellten g7-cDNA-Sequenz ausgewählt wurden. Der Phage p191 wurde bei der ATCC am 13. Mai 1993 hinterlegt.

Beispiel 2

Isolierung einer dem VHL-Svndrom-Gen entsprechenden cDNA

Absuchen von cDNA-Genbanken - Eine λgt11-Teratokarzinom-Genbank (Geschenk von Dr. Maxine Singer, National Cancer Institute) wurde durch Plaque- Hybridisierung (Sambrook, J., et al. (1989)) mit 10º-Filter-immobilisierten cDNA- Phagenclonen bei einer Dichte von 4 · 10&sup4; pfu/150-mm-Filter abgesucht. Fig. 1 (Abbildung B) zeigt die Position der g7-cDNA, die durch Absuchen der λgt11- Teratokarzinom-cDNA-Genbank isoliert wurde, wobei ein konserviertes 7-kb-Fragment am Centromer-Ende von cos11 beim Absuchen als Sonde verwendet wurde. Die Orientierung der g7-cDNA wurde durch Sequenzierung und Restriktionskartierung des Contigs festgestellt. Der Beginn der kleinsten konstitutionellen Deletion ist mit einem Sternchen und einer Linie gekennzeichnet. Restriktionsstellen: B, Bam-HI; E, EcoRI; N, NotI; Nr, NruI; M, MluI.
cDNA-Sequenz und Sequenzanalyse - Der g7-cDNA-Clon wurde in das Bluescript KS (+)-Plasmid (Stratagene, La Jolla, CA) subcloniert. Doppelsträngige Plasmid-DNA wurde in den Sequenzierreaktionen eingesetzt, die mit "Tag Dye Deoxy terminator cychle sequencing kits" (Applied Biosystems, Ind.) durchgeführt wurden. Alle Sequenzen wurden erhalten, indem die Reaktionen in einem automatischen Sequenziersystem ABI 373A (Applied Biosystems, Inc.) durchgeführt wurden. Die Sequenzierung wurde anfangs mit T3- und T7-Primern durchgeführt, dann wurden zur Fortsetzung der Sequenzierung "walking"-Primer konstruiert. Der cDNA- Clon wurde mehrere Male in einer Orientierung oder in beiden Orientierungen se quenziert. Die Datenbanksuche, Sequenzeditierung, Zusammenbau der Sequenz und Sequenzanalyse erfolgten mit dem Sequenzanalyse-Softwarepaket der University of Wisconsin Genetics Computer Group, Version 7.0 (Devereaux, J., et al., Nucl. Acids Rev. 12 (1984), 387-395). Die Sequenz der g7-cDNA ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Diese cDNA wurde bei der ATCC am 13. Mai 1993 hinterlegt. Die cDNA-Sequenz zeigte ein offenes Leseraster ("open reading frame", ORF) von 284 Aminosäuren, dies macht deutlich, daß der Rest einen Teil des 3'-untranslatierten Bereichs der mRNA darstellt. Dieses ORF zeigte einen hohen Wahrscheinlichkeitswert (> 95%) für eine Protein-codierende Sequenz (Fickett, J.W., Nucl. Acids Rev. 10 (1982), 5303). Weder das Nucleotid noch die vorausgesagten Aminosäuresequenzen zeigten eine signifikante Homologie zu Genen oder Proteinen in den Datenbanken.

Beispiel 3

Nachweis einer g7-spezifischen mRNA-Expression in Zielgeweben

RNA-Herstellung und Northern-Blotting-Analyse - Zur Identifizierung des VHL-Gens wurden die g7-Loci getestet, indem die Expression in Zielgeweben untersucht wurde.
Das Expressionsmuster des g7-Gens wurde durch Northern (RNA)-Blotting untersucht. Fig. 2A zeigt einen Blot mit geringer Auflösung, wobei jede Bahn Poly- A&spplus;-mRNA (2 ug) enthält aus: Bahn 1, fetalem Gehirn; Bahn 2, Gehirn eines Erwachsenen; Bahn 3, fetaler Niere; Bahn 4, Niere eines Erwachsenen; Bahn 5, Cerebellum eines Erwachsenen; Bahn 6, Nebenniere eines Erwachsenen und Bahn 7, Prostata eines Erwachsenen, während die Fig. 2B einen Blot mit hoher Auflösung von 1 ug Poly-A&spplus;-mRNA aus den in Fig. 2 A angegebenen Geweben zeigt. Die Größen der Transkripte wurden aus der Position der 285- und 18S-rRNA- Banden des Gesamt-RNA-Laufs auf dem gleichen Gel bestimmt. Transkripte wurden in allen getesteten menschlichen Geweben festgestellt, einschließlich Gehirn und Niere, Gewebe, die beim VHL-Syndrom häufig betroffen sind. Die Transkripte bestanden aus zwei unterschiedlichen Größen, 6 und 6,5 kb, und wurden in einer Gewebe-spezifischen und Entwicklungs-selektiven Art und Weise exprimiert, d. h. im fetalen Gehirn und in der fetalen Niere wurde nur der 6 kb- oder der 6,5 kb-Typ exprimiert, während in Geweben von Erwachsenen beide exprimiert wurden. Die zwei Transkripte stellen möglicherweise verschieden gespleißte Formen der g7- mRNA dar.

Beispiel 4

Nachweis von Mutationen des VHL-Syndrom-Gens, die mit dem VHL-Syndrom in Zusammenhang stehen

RT-PCR-Studien der Genexpression - Um Mutationen in der konstitutionellen DNA von betroffenen Patienten in Stammbäumen und bei Patienten mit Neumutation nachzuweisen, wurde eine intensive Suche nach Mutationen (d. h. nach kleinen intragenen und nicht-überlappenden Deletionen oder Insertionen), die aus dem Funktionsverlust-Typ bestanden, bei konstitutioneller DNA durchgeführt, die von 221 nicht verwandten VHL-Patienten stammte. Die Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA, die aus dem Blut von sieben Patienten isoliert (Sambrook, J., et al. (1989)) und anschließend mit EcoRI gespalten wurde, ist in Fig. 3A dargestellt. Dieser Blot wurde getestet, indem die g7-cDNA als Sonde verwendet wurde, von der gezeigt wurde, daß sie ein einzelnes gleichbleibendes 20 bis 22 kb-großes EcoRI-Fragment in normaler DNA nachweist, dies wurde durch frühere Tests an mehr als 100 nicht verwandten DNA-Proben bestimmt, die vom Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) bereitgestellt wurden. Eine hohe Inzidenz (≥12%) von abnormen Banden wurde bei den Banden mit einer Größe im Bereich von 4 bis 25 kb festgestellt (Fig. 3A), deshalb wurden diese VHL-Patienten als Neumutationen eingestuft.
Um festzustellen, ob die einzelnen abnormen Banden, die aus dem 20 bis 22 kb-großen gleichbleibenden Fragment stammten, Deletionen oder Insertionen innerhalb dieses Fragments oder Deletionen waren, die die flankierenden EcoRI- Stellen entfernten, wurde eine Southern-Blot-Analyse durchgeführt, wobei abgesehen von EcoRI mehrere andere Restriktionsenzym-Spaltungen erfolgten (BamHI, BgII, BgIII, DraI, EcoRV, HindIII, PstI und PvuII). Die Ergebnisse der Southern- Analyse mit einigen wenigen dieser Enzyme ist in Fig. 3B dargestellt. Diese Ergebnisse machten deutlich, daß die Mutationen mit der Erkrankung weitergegeben wurden (Fig. 3C). Fig. 3D zeigt die Ergebnisse der Southern-Blotting-Analyse von DNA, die aus einer regulären VHL-Familie (codiert "P") isoliert und mit EcoRI gespalten wurde. Die Ergebnisse machen deutlich, daß das mutierte Allel (die abnorme Bande) in dieser VHL-Familie weitergegeben wurde (Fig. 3D und 3E).

Beispiel 5

Nachweis und Kartierung von Deletionen des VHL-Syndrom-Gens

Um das Vorliegen von Deletionen nachzuweisen und sie genau zu kartieren, wurden einen Bereich der g7-cDNA darstellende Subfagmente, erzeugt durch PCR, als Sonden bei der Southern-Blotting-Analyse von genomischer DNA eingesetzt, die aus dem Blut von VHL-Patienten isoliert und mit EcoRI gespalten wurde (Fig. 4, wobei die folgenden Sonden in den jeweiligen Bahnen verwendet wurden: Fig. 4A, gesamte g7-cDNA; Fig. 4B, Nucleotide 3 bis 146 der g7-cDNA; und Fig. 4C, Nucleotide 1277 bis 1600 der g7-cDNA). Diese Ergebnisse zeigten eindeutig, daß 18 der Umlagerungen Deletionen waren, denn bei jedem Patienten war lediglich ein Teil der cDNA nicht in der Lage, die neue Bande nachzuweisen (Fig. 4).
Diese Deletionen konnten sodann in drei Gruppen eingeteilt werden, wie in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1 Deletions-Analyse von VHL-Patienten mit abnormen Banden am VHL-Locus (nachgewiesen durch g7-cDNA)
ND = Nicht deletiert
D = Deletiert
Das Auffinden von drei überlappenden Deletionen innerhalb der gleichen cDNA ist ein starker Beweis für die Identifizierung der g7-cDNA als das VHL-Gen.

Beispiel 6

Nachweis von intragenen Deletionen oder Insertionen durch PCR-SSCP und RT- PCR

Um intragene Deletionen oder Insertionen zu finden, wurde genomische DNA, die aus Lymphoblastoid-Zellinien von VHL-Patienten isoliert wurde (Lymphoblastoid-Zellen wurden durch Transformation mit dem Epstein Barr-Virus gemäß herkömmlichen Verfahren unsterblich gemacht, Nilison, K., et al., Adv. Cancer Res. 37 (1982), 319-380), durch Analyse mittels PCR-Einzelstrang-Konformation- Polymorphismus (PCR-SSCP) auf Veränderungen untersucht, wobei die in SEQ ID NO: 3 bis SEC ID NO: 8 dargestellten Primer eingesetzt wurden, und RNA, die aus sporadischem Nierenkarzinom (RCC)-Zellinien isoliert wurde (Anglard, P., et al., Cancer Res. 52 (1992), 348-356), wurde durch Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) analysiert. Die für die RT-PCR der RCC-Zellinien verwendeten Primer sind als SEQ ID NO: 17 bis SEQ ID NO: 20 dargestellt.

SEQ ID NO. 17

CATCTTCTGC AATCGCAGTC CGCGCGT

SEQ ID NO. 18

CAAAAGCTGA GATGAAACAG TGTAAGT

SEQ ID NO. 19

GTTTGGTTAA CCAGAAGCCC ATCGT

SEQ ID NO. 20

GATGGGCTTC TGGTTAACCA AACT
wobei die SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18 ein Primerpaar und die SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 20 ein zweites Paar darstellen. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 2 zu sehen. TABELLE 2 Keimbahn- (VHL) und somatische (sporadische RCC) Mutationen in dem Kandidaten für das VHL-Gen
* NT = Nucleotid(e)
RCC wurde ausgewählt, weil nach der Theorie von Knudson (Knudson (1971)) sporadische Krebserkrankungen mit Mutationen in genau den Loci in Zusammenhang stehen sollten, die bei der vererbten Form der gleichen Krebserkrankung betroffen sind. Bisher wurden in fünf RCC-Zellinien abnorme Muster identifiziert und bei vier davon nachgewiesen, daß es sich um kleine (1 bis 10 bp) Deletionen handelt, die Leserastermutationen und verkürzte Proteine erzeugen (TABELLE 2). Die Zellinien UMRC5 und RCC "UOK118" haben die gleiche 1 bp-Deletion an Nucleotid 737, Aminosäure 246, wodurch 28 neue Aminosäuren, gefolgt von einem Stop-Codon, erzeugt werden. Außerdem bewirkt diese Deletion eine neue EcoRI- Stelle, die bei Southern-Blots zu zwei abnormen Banden führt (nicht gezeigt). Die Linie UMRC6 hat eine 10 bp-Deletion (Nucleotide 715 bis 724), die eine Verschiebung des Leserasters bewirkt, so daß 32 neue Aminosäuren, gefolgt von einem neuen Stop-Codon, vorliegen. Schließlich weist die Linie A498 eine 5 bp-Deletion auf (Nucleotide 638 bis 642), die zu einem vorzeitigen Stop nach 62 neuen Aminosäuren führt. In der fünften RCC-Zellinie, UOK151, ist die Veränderung eine Nonsense-Mutation (Stop-Codon), die durch eine Transversion von C zu A am Nucleotid 761 zustande kommt (TCG → TAG), wodurch ein verkürztes Protein erzeugt wird. Diese Ergebnisse legen nahe, daß das VHL-Syndrom-Gen beim sporadischen Nierenkrebs eine wichtige Rolle spielt. Dabei können RT-PCR oder PCR- SSCP, die in dieser Anmeldung beschrieben werden, als diagnostische Verfahren eingesetzt werden, um primäre Nierentumoren von Tumoren zu unterscheiden, die sich von anderen Geweben oder Organen aus auf die Niere ausgebreitet haben, und um unterschiedliche histologische Typen von Nierentumoren zu unterscheiden.
In der DNA der VHL-Lymphoblastoid-Zellinien, die von VHL-Patienten stammten, wurden auch mit der Erkrankung abweichende abnorme SSCP-Muster nachgewiesen, wobei die in SEQ ID NO: 3 bis SEQ ID NO: 8 gezeigten Primer verwendet wurden. Bei einem Patienten ("VA") wurde gefunden, daß es sich um eine 8 bp (TTGTCCGT)-Insertion hinter Nucleotid 714 handelte. Diese Insertion erzeugte eine Verschiebung im Leseraster und ein verkürztes Protein. Der zweite Patient ("CS") hatte eine Im-Raster-Deletion von 3 bp, die zur Entfernung von Aminosäure 146 (Isoleucin) führte. Schließlich hatte der Patient "E" eine Im-Raster-Deletion von 9 bp (Nucleotide 456-464), die die Entfernung von drei Aminosäuren (Arg Val Val) an den Positionen 153 bis 155 zur Folge hatte. Diese Ergebnisse zusammen stützen die Schlußfolgerung, daß das g7-Gen das Tumorsuppressorgen des VHL und des sporadischen RCC darstellt.

Beispiel 7

Konservierung der g7-cDNA unter verschiedenen Arten

Um festzustellen, ob die g7-cDNA unter verschiedenen Arten stark konserviert ist, die von Säugetieren bis zu Drosophila und Seeigel reichen, wurde ein Zoo- Blotting unter Verwendung von g7-cDNA als Sonde mit DNA durchgeführt, die isoliert worden war aus Mensch (Homo sapiens), Schimpanse (Pan troglodytes), Makake (Macaca fascicularis), Kuh (Bovis domesticus), Ratte (Rattus norvigicus), Maus (Mus musculus), Huhn (Gallus domesticus), Frosch (Xenopus laevis), Fliege (Drosophila melanogaster), Seeigel (Strongilocetrotus purpuratus) und Hefe (Saccharomyces cerevisiae), die alle von BIOS Laboratories (New Haven, CT, USA) bezogen wurden. Die Prä-Hybridisierung erfolgte in Church-Puffer (G.M. Church und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 1991) 18 Stunden bei 65ºC. Die Blots wurden in 0,1 · Church-Puffer 60 Minuten bei 60ºC gewaschen. Die Ergebnisse des Zoo-Blots sind in Fig. 6 dargestellt. Die Ergebnisse machen eine starke Konservierung im Laufe der Evolution deutlich, die darauf hinweist, daß g7 eine grundlegende Lebensfunktion betrifft und außerdem, daß g7 eine Rolle als Tumorsuppressor spielt.
Die Inhalte aller Zitate, d. h. die Zeitschriftenartikel, Patente und dergleichen, sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Es ist so zu verstehen, daß die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen der Erläuterung dienen und daß verschiedene Modifikationen und Veränderungen davon, die für den Fachmann ersichtlich sind, im Wesen und im Bereich dieser Anmeldung und im Umfang der beigefügten Patentansprüche eingeschlossen sind.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, VERTRETEN DURCH THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Gen des Von-Hippel-Lindau (VHS)-Syndroms und die entsprechende cDNA sowie Verfahren zum Nachweis von Trägern des VHL-Syndrom-Gens
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 20
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) NAME: Morgan & Finnegan
(B) STRASSE: 345 Park Avenue
(C) STADT: New York
(D) STAAT: New York
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 10154
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Wordperfect 5.1
(vi) DERZEITIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: PCT/US94/
(B) TAG DER ANMELDUNG: 12. Mai 1994
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: 08/061,889
(B) TAG DER ANMELDUNG: 14. Mai 1993
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANWALT/VERTRETER INFORMATION:
(A) NAME: Richard W. Bork
(B) REGRISTIERUNGSNUMMER: 36,459
(C) REFERENZ/DOCKET-NUMMER: 2026-4078PCT
(ix) TELEKOMMUNIKATION INFORMATION:
(A) TELEFON: (212) 758-4800
(B) TELEFAX: (212) 751-6849
(C) TELEX: 421792

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 1816 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 1:

CCTCGCCTCC GTTACAACAG CCTACGGTGC TGGAGGATCC 40
TTCTGCGCAC GCGCACAGCC TCCGGCCGGC TATTTCCGCG 80
AGCGCGTTCC ATCCTCTACC GAGCGCGCGC GAAGACTACG 120
GAGGTCGACT CGGGAGCGCG CACGCAGCTC CGCCCCGCGT 160
CCGACCCGCG GATCCCGCGG CGTCCGGCCC GGGTGGTCTG 200
GATCGCGGAG GGAATGCCCC GGAGGGCGGA GAACTGGGAC 240
GAGGCCGAGG TAGGCGCGGA GGAGGCAGGC GTCGAAGAGT 280
ACGGCCCTGA AGAAGACGGC GGGGAGGAGT CGGGCGCCGA 320
GGAGTCCGGC CCGGAAGAGT CCGGCCCGGA GGAACTGGGC 360
GCCGAGGAGG AGATGGAGGC CGGGCGGCCG CGGCCCGTGC 400
TGCGCTCGGT GAACTCGCGC GAGCCCTCCC AGGTCATCTT 440
CTGCAATCGC AGTCCGCGCG TCGTGCTGCC CGTATGGCTC 480
AACTTCGACG GCGAGCCGCA GCCCTACCCA ACGCTGCCGC 520
CTGGCACGGG CCGCCGCATC CACAGCTACC GAGGTCACCT 560
TTGGCTCTTC AGAGATGCAG GGACACACGA TGGGCTTCTG 600
GTTAACCAAA CTGAATTATT TGTGCCATCT CTCAATGTTG 640
ACGGACAGCC TATTTITGCC AATATCACAC TGCCAGTGTA 680
TACTCTGAAA GAGCGATGCC TCCAGGTTGT CCGGAGCCTA 720
GTCAAGCCTG AGAATTACAG GAGACTGGAC ATCGTCAGGT 760
CGCTCTACGA AGATCTSCAA GACCACCCAA ATGTGCAGAA 800
AGACCTGGAG CGGCTGACAC AGGAGCGCAT TGCACATCAA 840
CGGATGCGAG ATTGAAGATT TCTGTTGAAA CTTACACTGT 880
TTCATCTCAG CTTTTGATGG TACTGATGAG TCTTGATCTA 920
GATACAGGAC TGGTTCCTTC CTTAGTTTCA AAGTGTCTCA 960
TTCTCAGAGT AAAATAGGCA CCATTGCTTA AAAGAAAGTT 1000
AACTGACTTC ACTAGGCATT GTGATGTTTA GGGGCAAACA 1040
TCACAAAATG TAATTTAATG CCTGCCCATT AGAGAAGTAT 1080
TTATCAGGAG AAGGTGGTGG CATTTTTGCT TCCTAGTAAG 112 0
TCAGGACAGC TTGTATGTAA GGAGGTTTAT ATAAGTAATT 1160
CAGTGGGAAT TGCAGCATAT CGTTTAATTT TAAGAAGGCA 1200
TTGGCATCTG CTTTTAATGG ATGTATAATA CATCCATTCT 1240
ACATCCGTAG CGGTTGGTGA CTTGTCTGCC TCCTGCTTTG 1280
GGAAGACTGA GGCATCCGTG AGGCAGGGAC AAGTCTTTCT 1320
CCTCTTTGAG ACCCCAGTGC CTGCACATCA TGAGCCTTCA 1360
GTCAGGGTTT CTCAGAGGAA CAAACCAGGG GACACTTTGT 1400
TAGAAAGTGC TTAGAGGTTC TGCCTCTATT TTTGTTGGGG 1440
GGTGGGAGAG GGGACCTTAA AATGTGTACA GTGAACAAAT 1480
GTCTTAAAGG GAATCATTTT TGTAGGAAGC ATTTTTTATA 1520
ATTTTCTAAG TCGTGCACTT TCTCGGTCCA CTCTTGTTGA 1560
AGTGCTGTTT TATTACTGTT TCTAAACTAG GATTGACATT 1600
CTACAGTTGT GATAATAGCA TTTTTGTAAC TTGCCATCCG 1640
CACAGAAAAT ACGAGAAAAT CTGCATGTTT GATTATAGTA 1680
TTAATGGACA AATAAGTTTT TGCTAAATGT GAGTATTTCT 1720
GTTCCTTTTT GTAAATATGT GACATTCCTG ATTGATTTGG 1760
GTTTTTTTGT TGTTGTTGTT TTGTTTTGTT TTGTTTTTTT 1800
GGGATGGAGG GAATTC 1816

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 284 Aminosäurereste
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: unbekannt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(1) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 37 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 3:

ATAGTGGAAA TACAGTAACG AGTTGGCCTA GCCTCGC 37

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 4:

CCCAGCTGGG TCGGGCCTAA GCGCCGGGCC CGT 33

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 5:

GTGGCTCTTT AAGACCTTT GCTTGTCCCG ATA 33

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 6:

CAAGTGGTCT ATCCTGTACT TACCACAACA CCT 33

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 7:

TGTATACTCT GAAAGAGCGA TGCCTCCAGG T 31

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 8:

TACCATCAAA AGCTGAGATG AAACAGTGTA AGT 33

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LANGE: 14 Aminosäurereste
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: unbekannt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEC ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(1) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäurereste
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: unbekannt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEC ID NO: 10:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 11:

CACAAGTGAT GCCTTGTAGC TG 22

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 12:

CAGTAGTGTC CTGTATTTAG TG 22

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 13:

GTTGGCTATG GGTAGAATTG G 21

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 14:

CAGGGTAGCC TTGACTAAG T 21

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(8) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 15:

GGAGGTCCTG AGAATATGTG TCC 23

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 16:

TGTTCAGGCA CACAGTAGAT G 21

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 17:

CATCTTCTGC AATCGCAGTC CGCGCGT 27

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 18:

CAAAAGCTGA GATGAAACAG TGTAAGT 27

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 19:

GTTTGGTTAA CCAGAAGCCC ATCGT 25

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(i) EIGENSCHAFTEN DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 20:

GATGGGCTTC TGGTTAACCA AACT 24

Claims

1. Phage, enthaltend ein VHL-Syndrom-Gen, mit den identifizierenden Merkmalen der ATCC-Hinterlegungsnummer 69311.

2. VHL-Syndrom-Gensequenz, die ein funktionelles VHL-Protein codiert, wobei die Gensequenz

(a) die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,

(b) eine Sequenz, die aufgrund des genetischen Codes zu der DNA von SEQ ID NO: 1 degeneriert ist, oder

(c) eine Sequenz, die unter hochstringenten Bedingungen mit der Sequenz von (a) oder (b) hybridisiert,

besitzt.

3. VHL-Syndrom-Gen, das ein Protein oder Analoge davon codiert, welches die in SEQ ID NO: 2 enthaltene Sequenz besitzt.

4. Verfahren zur Identifizierung eines Allels des VHL-Syndrom-Gens in einer biologischen Probe, umfassend die Analyse der Probe auf ein Allel des VHL- Syndrom-Gens Lind den Vergleich des Allels mit der Gensequenz nach Anspruch 2, wobei das Allel identifiziert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Analyseschritt Southern-Blot-Analyse umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei für die Southern-Blot-Analyse eine Sonde verwendet wird, die aus der VHL-Syndrom-Gensequenz nach Anspruch 2 hergeleitet ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Sequenz cDNA ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei cDNA eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 besitzt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Sonde aus den folgenden Fragmenten von SEQ ID NO: 1 ausgewählt ist: 3-146, 169-391, 291-506, 585-940, 921- 1231 und 1277 bis 1600.

10. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Analyseschritt mit einer PCR-SSCP durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Primer, die in der PCR-SSCP verwendet werden, aus der VHL-Syndrom-Gensequenz nach Anspruch 2 hergeleitet sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Sequenz eine Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 besitzt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Primer Nucleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 3 bis SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 17 bis 20 besitzen.

14. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Analyseschritt PCR umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die in der PCR verwendeten Primer aus der VHL-Syndrom-Gensequenz nach Anspruch 2 hergeleitet sind.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Sequenz eine Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 besitzt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Primer Nucleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 3 bis SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 17 bis 20 besitzen.

18. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Analyseschritt Northern-Blotting umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die in dem Northern-Blot verwendete Sonde aus der VHL-Syndrom-Gensequenz nach Anspruch 2 hergeleitet ist.

20. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Analyseschritt die Durchführung einer RT-PCR-Reaktion mit einer Proben-mRNA zur Herstellung von RT-PCR- Produkten umfaßt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die für die RT-PCR verwendeten Primer aus der VHL-Syndrom-Gensequenz nach Anspruch 2 hergeleitet sind.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Sequenz eine Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 besitzt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Primer eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 bis SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 17 bis SEQ ID NO: 20 besitzen.

24. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Analyseschritt ferner die Hybridisierung der RT-PCR-Produkte mit einer Sonde umfaßt, die aus der VHL-Syndrom-Gensequenz nach Anspruch 2 hergeleitet ist.

25. Primer, die aus der VHL-Syndrom-Gensequenz nach Anspruch 2 hergeleitet sind.

26. Primer nach Anspruch 25, wobei die Sequenz cDNA ist.

27. Primer nach Anspruch 26, wobei die cDNA eine Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 besitzt.

28. Primer nach Anspruch 27, wobei die Primer Nucleinsäuresequenzen besitzen, ausgewählt aus SEQ ID NO: 3 bis SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 17 bis SEQ ID NO: 20.

29. Diagnosekit zur Verwendung bei der Identifizierung eines Allels des VHL- Syndrom-Gens, wobei der Kit die Primer nach Anspruch 25 umfaßt.

30. Verfahren zur Identifizierung eines Allels des VHL-Syndrom-Gens in einer biologischen Probe, umfassend die Analyse des Proteins der Probe auf VHL- Protein-Expression mit einem Immuntest, in dem der anti-VHL-Antikörper nach Anspruch 40 verwendet wird.

31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Analyseschritt Western-Blotting umfaßt.

32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Analyseschritt Immunohistochemie umfaßt.

33. Expressionsvektor, der die VHL-Syndrom-Gensequenz nach Anspruch 2 oder einen Teil davon enthält, der ein immunogenes Polypeptid codiert.

34. Wirtsorganismus, der den Vektor nach Anspruch 33 enthält.

35. VHL-Protein, das von der Gensequenz nach Anspruch 2 codiert wird.

36. Verfahren zur Produktion des VHL-Proteins nach Anspruch 35 oder eines Teils davon, der immunogen ist, umfassend die Schritte der Züchtung des Wirtsorganismus nach Anspruch 34 in einem geeigneten Medium und der Isolation des Proteins.

37. VHL-Protein oder ein Teil davon, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 36, zur Verwendung als Immunogen.

38. VHL-Protein oder ein Teil davon nach Anspruch 37 mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10.

39. Arzneimittel, umfassend das VHL-Protein oder einen Teil davon nach Anspruch 37 oder 38.

40. Antikörper gegen das VHL-Protein oder einen Teil davon nach einem der Ansprüche 35, 37 oder 38.

41. Antikörper nach Anspruch 40, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus polyclonalen und monoclonalen Antikörpern.

42. Arzneimittel, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 33.

43. Verfahren nach Anspruch 4 oder 30, wobei das identifizierte Allel ein mutiertes Allel ist.

44. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die Nucleinsäuresequenz des mutierten Allels eine Deletion, Insertion oder Punktmutation im Vergleich zum die SEQ ID NO: 1 umfassenden VHL-Syndrom-Gen besitzt.

45. Verfahren nach Anspruch 43, wobei das mutierte Allel im Zusammenhang steht mit dem VHL-Syndrom oder mit VHL-verwandten Krankheiten, ausgewählt aus Nieren-, Lungen- und Blasenkrebs.