DE69329037T2

DE69329037T2 - Delta ähnliches gen welches in neuroendokrinen tumoren exprimiert wird

Info

Publication number: DE69329037T2
Application number: DE69329037T
Authority: DE
Inventors: Jorge Laborda
Original assignee: National Institutes of Health NIH
Current assignee: National Institutes of Health NIH
Priority date: 1992-12-11
Filing date: 1993-12-10
Publication date: 2001-03-22
Anticipated expiration: 2013-12-11
Also published as: EP0673390B1; EP1013762A2; US5644031A; DE69329037D1; WO1994013701A3; CA2151455A1; JPH08509358A; AU677623B2; PT673390E; WO1994013701A2; DK0673390T3; ES2151542T3; EP1013762A3; ATE194653T1; EP0673390A1; AU5746894A; US5580738A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Expression von Genen während der Entwicklung einer pluripotenten Zelle oder Vorläuferzelle in eine differenzierte reife Zelle kann einen Hintergrund zur Untersuchung tumorerzeugender Zellen bilden, die von solchen Vorläuferzellen abstammen. Bei gewissen Blut- oder Epitheltumoren besteht eine wesentliche Korrelation zwischen der Expression maligner Gene und der Expression, die während der normalen Entwicklung des Gewebes, von dem der Tumor ausgeht, beobachtet wird; Gordon et al., J. Cell Biol. 108 : 1187 (1989); Godal et al., Adv. Cancer Res. 36 : 211 (1982). Tatsächlich gleichen viele biologische Tätigkeiten von Vorläuferzellen, darunter Zeliwanderung und Gewebsumbildung, pathologischen Tätigkeiten von Krebszellen, wie Metastasen und Tumorinvasion.
Beim Neuroblastom, einem Tumor der Nebenniere, der bei Patienten im frühen Kindesalter auftritt, handelt es sich um ein weiteres System, bei dem eine Korrelation zwischen Tumorbiologie und der Biologie der normalen Differenzierung und Morphogenese seiner Vorläuferzellen (Neuroblasten) existiert. Beim Neuroblastom handelt es sich um einen embryonalen Tumor mit undifferenzierter sowie differenzierter Histopathologie. Die Entwicklung von Neuroblastomtumoren läuft zu Stadien parallel, die während der Histogenese ihres Ursprungsgewebes, nämlich der Nebennieren- Medulla, identifiziert werden können; Cooper et al., CelJ. Growth and Diff. 1 : 149 (1989).
Während der Entwicklung der Neuroblasten der menschlichen Nebennieren-Medulla in reife Chromaffinzellen werden vier einzelne Gene der Reihe nach exprimiert. Sobald ein Neuroblast zur Differenzierung in neuroendokriner Richtung induziert ist, sind die fortschreitenden Phasen der Chromaffinreifung durch eine temporäre Expression von Genen mit der Bezeichnung TH, CGA, pG2 und B2M gekennzeichnet (Cooper, oben, Seite 153). Von Cooper wurde gefunden, daß das Muster der Genexpression dieser vier Marker in Neuroblastomzellen parallel zur Genexpression normaler Nebennieren- Neuroblasten läuft, die während drei unterschiedlichen Entwicklungsstadien zum Stillstand gebracht werden.
Eines dieser Markergene, nämlich pG2, wurde zuerst in einem Phäochromozytom, einem Tumor der Nebennieren- Medulla von Erwachsenen, identifiziert (Helman et al., PNAS USA 84 : 2336 (1987)). Helman berichtete, daß pG2 auch in normalen menschlichen Nebennierenzellen stark exprimiert wird.
Helman isolierte eine Vollängen-cDNA aus einer Human-Nebennieren-cDNA-Bibliothek und identifizierte ein entsprechendes pG2-Protein mit 286 Aminosäuren mit einem prognostizierten Molekulargewicht von 30,6 Kilodalton (kDa) (Helman et al., Nucleic Acids Res. 18(3): 685 (1990)).
Ein Gen mit entwicklungsregulierter Expression, die mit der von pG2 parallel läuft, wäre zum Nachweis des Phäochromozytoms oder Neuroblastoms mit genetischen Methoden nützlich, insbesondere da die pG2-Expression in nichtmalignem Gewebe auf die Nebenniere beschränkt ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines neu isolierten Polynukleotidmoleküls dlk, das in Gentests zur Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis eines primären oder sekundären Phäochromozytoms oder Neuroblastoms oder zur Identifizierung eines Stadiums dieser Tumore verwendet werden kann.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis eines primären oder sekundären kleinzelligen Lungenkarzinoms (im folgenden mit SCLC bezeichnet) oder zur Identifizierung des Stadiums der Tumorprogression eines SCLCs bereitzustellen, bei dem d1k- Polynukleotidmoleküle in Gentests verwendet werden.
Ein weiteres Ziel besteht darin, ein Polynukleotidmolekül mit der Bezeichnung dlk bereitzustellen, das für ein entsprechendes Dlk-Polypeptid codiert. Dlk-Polypeptide eignen sich zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern mit einer Spezifität für einen Epitop des Dlk- Polypeptids.
Dlk-spezifische Antikörper, insbesondere markierte monoklonale Dlk-spezifische Antikörper, eignen sich zum Nachweis von primären oder sekundären Neuroendokrintumoren. Gemäß der vorliegenden Erfindung eignen sich mit einem Toxin konjugierte, Dlk-spezifische monoklonale Antikörper auch zur Behandlung von primären oder sekundären Neuroendokrintumoren.
Diese und andere Ziele der Erfindung wurden dadurch erreicht, daß man gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung ein isoliertes Polynukleotidmolekül mit einer für ein Dlk-Polypeptid codierenden DNA-Sequenz bereitgestellt hat.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein isoliertes Dlk-Polypeptid, das im wesentlichen aus der in Fig. 1B oder Fig. 1A gezeigten Aminosäuresequenz besteht, bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein isoliertes Polynukleotidmolekül, das für ein Human- oder Maus-Dlk-Polypeptid, das im wesentlichen aus der in Fig. 1B bzw. 1A gezeigten Aminosäuresequenz besteht, codiert, bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis eines Tumors, der dlk exprimiert, mit den Schritten in-Kontakt-Bringen einer RNA einer Probe, von der vermutet wird, daß sie tumorerzeugend ist, mit einem dlk-Polynukleotidmolekül unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen dem dlk-Polynukleotidmolekül und der Probe gestatten, sowie Nachweisen der erfolgten Hybridisierung zwischen dem Polynukleotidmolekül und der Probe bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis eines kleinzelligen Lungenkarzinoms mit den Schritten In-Kontakt-Bringen einer RNA einer Bronchialepithelzellenprobe, von der vermutet wird, daß sie tumorerzeugend ist, mit d1k-Polynukleotidmolekülen unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen den dlk- Polynukleotidmolekülen und der Probe gestatten, sowie Nachweisen der erfolgten Hybridisierung zwischen den Polynukleotidmolekülen und der Probe bereitzustellen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine Gegenüberstellung von Maus- (Fig. 1A) und Human- (Fig. 1B) Dlk-Aminosäuresequenzen. Identische Aminosäuren sind durch das Zeichen () angegeben. Ähnliche Aminosäuren sind durch (") gekennzeichnet und in die folgenden Gruppen eingeteilt: A, S & T; D & E; N & Q; R & K; I, L, M & V; und F, Y & W. Biologisch möglicherweise signifikante Stellen, die in der Datei PROSITE (kommerziell über Intelligenetics Inc. (Mountain View, CA) erreichbar) aufgefunden wurden, sind zahlenmäßig angegeben: 1. N- Glycosylierungsstelle; 2. Proteinkinase-C- Phosphorylierungsstelle; 3. N-Myristylierungsstelle; 4. Asparaginsäure- und Asparaginhydroxylierungsstelle. Mögliche Spaltstellen im Signalpeptid sind durch (*) angegeben.
Fig. 2 zeigt die Human-dlk-DNA-Sequenz.
Fig. 3 zeigt die Maus-dlk-DNA-Sequenz.
Fig. 4 zeigt eine Gegenüberstellung einer Konsenssequenz von EGF-artigen Sequenzwiederholungen bei dlk mit EGF-Sequenzwiederholungen, die bei verschiedenen homöotischen Genen von Wirbellosen gefunden wurden. Wie bei Beispiel 4 beschrieben wurde eine Konsenssequenz von EGF artigen Sequenzwiederholungen bei d1k dadurch erhalten, daß man 12 EGF-artige Sequenzwiederholungen von Human- als auch Maus-dlk einander gegenüberstellte. Diese Konsenssequenz wurde dann den Konsenssequenzen verschiedener homöotischer Gene von Wirbellosen (die ähnlich erhalten wurden) sowie Maus-EGF gegenübergestellt.

Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausbildungsformen

Es wurden ein Human-Polynukleotidmolekül dlk und ein entsprechendes, von dlk codiertes, Human-Polypeptid Dlk entdeckt, isoliert und charakterisiert. Es wurde gefunden, daß das Human-Polynukleotidmolekül in Phäochromozytomen, Neuroblastomen und SCLC-Tumoren exprimiert wird.
Das Dlk-Protein ist ungefähr 383 Aminosäuren lang und weist ein Molekulargewicht von ungefähr 42 kDa auf. Es werden erfindungsgemäß nicht nur menschliches dlk, sondern auch andere Polynukleotidmoleküle, die zur dlk-Familie zählen, darunter Maus-dlk (Fig. 3) und eine aus der Plazenta wie im folgenden Text beschrieben isolierte Human-dlk- Variante bereitgestellt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung eignen sich isolierte Polynukleotidmoleküle oder deren Fragmente, die zur dlk-Familie zählen, zum Nachweis von SCLC und von Neuroendokrinkarzinomen. Die Expressionsmuster von dlk können sowohl (1) zum Nachweis von primären oder sekundären Tumorzellen aufgrund des Vorliegens von dlk sowie (2) zur Diagnose des Stadiums eines Tumors, der dlk exprimiert, durch Messung des dlk-Expressionsniveaus ausgenutzt werden.
Bei Dlk handelt es sich um ein Transmembranprotein mit einem Expressionsmuster, das bei normalen nichtfötalen Geweben auf die Nebenniere beschränkt ist. Dlk ist daher ein leicht erreichbares Ziel für ein Antikörper-Imaging oder eine Antikörpertherapie von SCLCs, Phäochromozytomen und Neuroblastomtumoren. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Antikörper mit einer Spezifität für das Dlk-Protein hergestellt und zum Nachweis oder zur Behandlung von Zellen, die das Dlk-Protein produzieren, verwendet.
Human-dlk-cDNA umfaßt ein Polynukleotidmolekül mit der in Fig. 2 gezeigten Sequenz, die mittels Nukleotidsequenzanalyse bestimmt wurde. Das offene Leseraster, nämlich die Nukleotide 174 (ATG) - 1322 (TAA), ist 1149 Nukleotide lang. Das Maus-dlk-Polynukleotidmolekül umfaßt eine DNA- Sequenz mit einem offenen Leseraster mit 1155 in Fig. 3 gezeigten Nukleotiden, nämlich den Nukleotiden 134 (ATG) - 1288 (TAA). Das Maus-Dlk-Protein weist ungefähr 385 Aminosäuren auf und hat ein Molekulargewicht von ungefähr 42 kDa.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Human- Dlk-Variante identifiziert, in der eine Aminosäure deletiert ist. Eine für cDNA codierende "Dlk-Variante", in der die Aminosäure Nummer 347 der in Fig. 1 (B) gezeigten Aminosäuresequenz deletiert ist, wurde aus einer vollständigen Human-Plazenta-cDNA-Bibliothek isoliert. Die Aminosäureposition 347 liegt in einer intrazellulären Domäne des Proteins vor, Die Plazentabibliothek, die die dlk-Variante enthielt, enthielt auch beträchtliche Mengen der Nichtvariantenform, d. h. das in Fig. 1B gezeigte dlk-Polynukleotidmolekül.
Das dlk-Polynukleotidmolekül wurde durch Untersuchung von cDNA-Expressionsprodukten von Human-SCLC (hSCLC)- Linien identifiziert, die auf Stimulation mit dem Liganden, "gastrin-releasing peptide" (GRP), einem Neuropeptid, von dem vermutet wird, daß es aufgrund seiner Wechselwirkung mit einem an G-Protein gekoppelten Rezeptor, dem GRP-Rezeptor, an der Freisetzung von Gastrin beteiligt ist, reagierten. Bei dem GRP (Peptid) handelt es sich um ein Mitogen für normale Lungenepithelzellen und SCLC-Zellen sowie auch für Maus-Swiss-3T3-Fibroblasten.
Auf GRP reagierende hSCLC-Linien wurden mit Maus- Fibroblastenzellinien, die unterschiedlich auf GRP reagierten, verglichen. Aufgrund dieses in Beispiel 1 genau beschriebenen Ansatzes gelangte man zu einem Teillängen-cDNA- Molekül, das mit einer 1,6 kB langen mRNA, die sowohl in reagierenden Fibroblasten als auch in reagierenden SCLC- Linien exprimiert wurde, hybridisierte. Eine im Handel erhältliche Swiss-3T3-Fibroblasten-cDNA-Bibliothek wurde mit der Teillängen-cDNA durchmustert, wodurch man zu mehreren Klonen mit 1,6 kB langen Inserts gelangte, die anschließend sequenziert wurden.
Eine Computersuche der von Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12(1): 387 (1984) beschriebenen Dateien "Swissprot" und "NBRF Protein" ergab eine starke Homologie zwischen Dlk und den von verschiedenen homöotischen Genen, die in Beispiel 3 identifiziert wurden, codierten Proteinen. Bei den homöotischen Genen handelt es sich um die Entwicklung kontrollierende Regulatorgene, die Zellgruppen in bezug auf ihren Morphogeneseweg eine räumliche Identität zuordnen. Bei segmentierten Organismen sind zum Beispiel homöotische Gene für die korrekte Morphogenese einer bestimmten Region (wie zum Beispiel eines Beins oder von Antennen) erforderlich, und sie wirken dadurch, daß sie die Aktivitäten anderer Gene während der Entwicklung kontrollieren. Das Dlk- Protein der vorliegenden Erfindung wies die höchste Homologie mit dem Protein Delta, einem neurogenen Locus, der an der normalen Nervendifferenzierung bei Drosophila beteiligt ist, auf. Das vorliegende Protein wurde daher aufgrund der Tatsache, daß es "deltaartig [delta-like]" war, mit der Bezeichnung "Dlk" versehen.
Maus- und Human-Dlk-Proteinsequenzen sind zu 86,2% identisch und es sind ihnen viele Positionen mit einer eventuellen biologischen Wichtigkeit gemeinsam, darunter 6 "epidermal growth factor" (EGF)-artige Sequenzwiederholungen, eine Transmembrandomäne, sowie eine Signalpeptiddomäne am Amino-Terminus. Aufgrund dieser Strukturmerkmale scheint es sich bei dlk um ein neues Mitglied der Familie EGFartiger neurogener Gene von Drosophila zu handeln, die an Entwicklungsentscheidungen des Embryo-Ectoderms bezüglich der Differenzierung in Epidermis- oder Nervenzellen beteiligt sind.
Das Expressionsmuster von dlk und seine Sequenzhomologie mit homöotischen Proteinen unterstützen die Vorstellung, daß dlk am Differenzierungsablauf von Zellen der Chromaffin-Linie beteiligt ist. Wie in Beispiel 2 genau beschrieben wird dlk in primären und sekundären Phäochromozytom- und Neuroblastomzellen sowie in normalen (nichthistopathologischen) Human-Nebennieren-Medulla- und -Plazentazellen exprimiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich beim SCLC und beim Neuroblastom um die einzigen Tumore, von denen bekannt ist, daß sie dlk in Abhängigkeit ihrer Differenzierung exprimieren.
Ein isoliertes dlk-, dlk-Varianten- und Maus-dlk- Polynukleotid sowie Proteinprodukte werden in diagnostischen Verfahren verwendet (Beschreibung siehe unten) und werden wie unten angegeben hergestellt. Im Anschluß daran sollen die für das dlk-Polynukleotidmolekül (DNA, RNA) und das Dlk- Protein beschriebenen Techniken und Anwendungen sich auch für DNA, RNA und Protein von Maus-dlk und der dlk-Variante eignen.
Ein erfindungsgemäßes Dlk-Polypeptid wird durch DNA-Rekombinationstechniken wie zum Beispiel den von Maniatis et al., MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschriebenen Techniken hergestellt. Methoden, die sich spezifisch auf die Klonierung des dlk-Polynukleotidmoleküls beziehen sind in Beispiel 1 angegeben.
Das dlk-Polynukleotidmolekül von Fig. 1B läßt sich in geeignete Expressionsvektoren klonieren und in prokaryotischen, Insekten- oder eukariotischen Expressionssystemen, darunter Baculovirus oder E. coli (Boehringer Manhein) exprimieren. Eine für ein Dlk-Protein codierende Polynukleotidsequenz läßt sich daher unter Verwendung traditioneller Techniken als cDNA einer mRNA einer im Handel erhältlichen Nebennieren-Medulla- oder Swiss-3T3-Fibroblastenbibliothek oder von SCLC-, Neuroblastom- oder Phäochromozytom-Zellinien erhalten. Die mRNA läßt sich mit fachbekannten cDNA- Klonierungstechniken, darunter auch Techniken auf PCR-Basis, in eine Doppelstrang-DNA umwandeln. Die Enden der Doppelstrang-DNA können mit Linkem oder Schwänzen versehen werden, um günstige Restriktionsschnittstellen bereitzustellen. Nach Restriktionsenzymverdau kann die DNA in einen Klonierungsvektor wie ein Plasmid, das mit einem Restriktionsenzym, das jeweils geeignete Enden erzeugt, verdaut wurde, eingeführt werden. Ein Plasmidvektor, der sich für diesen Zweck eignet, ist pGEX-X (Pharmacia). Nach dem Ligieren mittels Standardverfahren wird die DNA in eine Zelle eingebracht, wo ihre Expression zu dem gewünschten Protein führt.
Es ist jedoch auch möglich, ein Dlk-Polypeptid mit einem im Handel erhältlichen in vitro Translationskit von NEN (Boston, MA) wie in Beispiel 1 beschrieben herzustellen. Bei diesem Kit wird ein von Kaninchen-Reticulozytenlysaten stammendes Translationssystem (mit Ribosomen, Polymerasen, Aminosäuren usw.) verwendet.
Der Ausdruck "isoliert" bedeutet in bezug auf das dlk-Polynukleotidmolekül, daß solch ein Molekül frei von den Proteinen ist, mit denen es normalerweise assoziiert ist, wie zum Beispiel Histone. Eine isolierte Form des dlk ist im wesentlichen frei von weiterer DNA, die nicht zur Regulation, Promotion, Förderung oder sonstigen Modifizierung seiner Expression dient.
Der Ausdruck "isoliert" bedeutet in bezug auf das Dlk-Protein ein Polypeptid, das frei von den anderen Proteinen, mit denen es normalerweise assoziiert ist, ist.
Ein isoliertes dlk-Polynukleotidmolekül eignet sich zum Nachweis des primären SCLC und der Metastasierung des SCLC und anderen Neuroendokrinkarzinomen. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Tumoren bereit, das die Schritte In-Kontakt-Bringen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie einen Tumor enthält, mit einem dlk-Polynukleotidmolekül, sowie Nachweisen der Expression von dlk-Polynukleotidprodukten (DNA, RNA, mRNA) in Nicht-Nebennierenzellen, umfaßt. Der Nachweis eines dlk-Polynukleotidprodukts weist die Zellen als Metastasenzellen (Sekundärtumor) eines Neuroblastoms, Phäochromozytoms oder SCLC oder als Primärtumor des SCLC aus.
Die Fähigkeit, dlk-exprimierende Zellen nachzuweisen, ist sowohl beim Tumornachweis als auch bei der Tumoridentifizierung von Nutzen. Nach dem Nachweis der dlk- Expression wird ein Tumortyp dadurch bestimmt, daß man entweder einen tumorspezifischen Marker oder eine tumorspezifische Morphologie nachweist oder dadurch, daß der Patient eine klinische Pathologie aufweist, die deutlich mit einem be liebigen Tumor aus der Gruppe Neuroblastom, Phäochromozytom oder SCLC assoziiert ist. Zum Beispiel wird Information wie die Identifizierung eines Zellmarkers, eines histologischen Merkmals oder eines Krankheitssymptoms, der bzw. das für einen Tumor aus der Gruppe Neuroblastom, Phäochromozytom oder SCLC spezifisch ist, erkannt.
Wird eine dlk-Expression in Zellen nachgewiesen, die von einer Probe aus Bronchienepithelgewebe oder aus der Lunge entnommenem Gewebe stammen, so weist diese Beobachtung ein primäres SCLC aus. Bevorzugt ist, daß ein zweiter Schritt, in dem der Ursprung der nachgewiesenen dlkexprimierenden Tumorzellen als SCLC bestätigt wird, dadurch durchgeführt wird, daß man einen Marker, ein histologisches Merkmal oder das Vorliegen eines typischen, mit diesem Tumor assoziierten Symptoms nachweist. Wird zum Beispiel eine üblicherweise mit SCLC assoziierte "Haferzellen"-Histologie nachgewiesen, so bestätigt dies das Vorliegen von SCLC.
Die Expression von dlk wird durch Hybridisierung mit einer dlk-Polynukleotidsonde nachgewiesen. Dieses Verfahren beinhaltet die Schritte des In-Kontakt-Bringens einer Probe, von der vermutet wird, daß sie ein Tumor ist, mit einem dlk-Polynukleotidmolekül, sowie des Nachweisens der Hybridisierung zwischen dem Polynukleotidmolekül und der Probe. Ein positives Hybridisierungssignal zeigt an, daß die Probe von einem Tumor stammt.
Das Polynukleotidmolekül bzw. die "dlk-Sonde", das bzw. die zum Nachweis der dlk-Expression verwendet wird, ist ein markiertes dlk-Fragment oder, vorzugsweise, ein Vollängen-dlk-DNA-Molekül, das mit mRNA oder DNA von normalen Nebennierenzellen und Neuroendokrintumorzellen hybridisiert. Sonden, die zu dlk komplementär sind, werden auf übliche Weise hergestellt und werden vorzugsweise mit mRNA oder DNA unter Verwendung üblicher in-situ-Hybridisierungstechniken hybridisieren gelassen. Nichthybridisiertes Sondenmaterial wird durch Verdauung mit Nukleasen entfernt.
Bei fachbekannten in-situ-Hybridisierungstechniken können Fluoreszenzmarker und radioaktive Marker verwendet werden, die sich leicht mittels Fluoreszenzmikroskopie bzw. Autoradiographie quantifizieren lassen. Im allgemeinen sind Fluoreszenzmarker bevorzugt. Bei einer weiteren Markierungstechnik können Enzym-Marker verwendet werden, die leicht quantifizierbare kolorimetrische Signale oder Chemilumineszenzsignale erzeugen. Die in ihren Verfahren nachgewiesene Hybridisierungsintensität entspricht der dlk-Menge in der biologischen Probe.
Das erfindungsgemäße dlk-Polynukleotid läßt sich als Sonde in RNA ("Northern")-Blotting-Methoden verwenden. Gemäß diesem Verfahren wird zuerst RNA aus Gewebe isoliert, und zwar nach einem der vielen Standardverfahren (Lehrach, H., Biochemistry, 16 : 4743 (1975)). Dann wird die RNA-Probe einer Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen unterzogen und auf eine Nitrocellulosemembran oder eine andere feste Trägermatrix übertragen. Die dlk-mRNA läßt sich durch Hybridisierung radioaktiv oder nichtradioaktiv markierter 62k oder dlk-Fragmente nachweisen, vorzugsweise unter [hochstringenten] Bedingungen, wie sie dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Das Ausmaß der Hybridisierung läßt sich densitometrisch quantifizieren.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird 62k-DNA oder -mRNA in einer Probe mittels der Polymerasekettenreaktion ("PCR") nachgewiesen. Zur Durchführung einer PCR wird ein Paar dlk-sequenzspezifischer Polynukleotid-Primer verwendet, die mit gegenüberliegenden Strängen des d1k-Gens an versetzten Positionen an der Doppelhelix hybridisieren. Derartige Primer, die von den erfindungsgemäß bereitgestellten dlk-Polynukleotidsequenzen stammen, stellen Fragmente dar, die vorzugsweise nur bei d1k vorkommen, d. h. Sequenzen mit wenig Homologie zu Nicht-Dlk-Proteinen. Zwei beispielhafte d1k-spezifische Primer-Sequenzen, die in diesem Zusammenhang nützlich sind, beinhalten die folgenden Sequenzen, die einen Teil der Intrazellulärregion von Dlk codieren:
5'-CAA GCC CGA GTT CAC AGG TC-3'
5'-TCG GGG AAG ATG TTG AC-3'.
Weitere derartige Primer-Paare können ebenfalls ausgewählt und verwendet werden.
Die Primer stellen Startpunkte für die DNA-Synthese dar. Bei Vorhandensein von DNA-Polymerase, der vier Desoxynukleotidtriphosphate ("dNTPs") und anderer erforderlicher Kofaktoren, die allesamt auf diesem Gebiet gutbekannt sind, werden neue DNA-Stränge synthetisiert, die den Matrizen, die mit den Primern hybridisierten, komplementär sind. Es werden mehrere Synthesezyklen durchgeführt, wobei die doppelsträngigen Produkte zwischen den Zyklen denaturieren gelassen werden. Vorzugsweise wird eine hitzestabile DNA- Polymerase verwendet, so daß es sich erübrigt, für jeden Synthesezyklus frisches Enzym zuzugeben.
Mit der PCR wird ein doppelsträngiges DNA- Amplifikationsprodukt hergestellt, das die gleiche Sequenz wie das durch die Enden der Primerpaar-Sequenzen definierte ursprüngliche Stück der 62k-DNA aufweist. Die Menge des PCR- Produkts zeigt die Menge der d1k-DNA oder 62k-mRNA in der Probe an. Das Produkt kann durch verschiedene in der Fachwelt gutbekannte Verfahren nachgewiesen werden. Die PCR- Produkte können durch Agarose- oder Polyacrylamid- Elektrophorese aufgetrennt und mittels Fluoreszenzfärbung, wie z. B. mit Ethidiumbromid, nachgewiesen werden. Es ist jedoch auch möglich, daß eines der dNTPs markiert ist, und die PCR-Produkte können durch Messung des Einbaus des markierten dNTP bestimmt werden. Dem Durchschnittsfachmann sind verschiedene andere Auftrennungs-, Nachweis- und Quantifizierungsverfahren für PCR-Produkte gutbekannt.
Die PCR kann entweder für dlk-DNA oder dlk-mRNA spezifisch geschaltet werden. Zum Beispiel lassen sich RNAse oder DNAse zur Entfernung einer oder der anderen Matrize aus der Probe verwenden, und die Verwendung von Primern, die zwischen dem Gen und der Botschaft unterscheiden, zum Beispiel ein Primer, der mit einer Sequenz in der nichttranskribierten Region des Promoters hybridisiert, ist für das dlk-Gen und nicht für die dlk-mRNA spezifisch.
Weitere Techniken, die sich für die beanspruchten Verfahren eignen, sind für den Fachmann sofort ersichtlich; dazu zählen unter anderem Nukleaseschutz-Assays, ELISA sowie Western-Blotting. Die Erfindung befaßt sich mit verschiedenen Assay-Techniken, die auf Immunreaktion zwischen Antigenen und Antikörpern beruhen. Insbesondere eignen sich Assays, in denen Antikörper mit einer Spezifität für Dlk-Protein verwendet werden, zum Nachweis von Zellen, die Dlk-Protein produzieren.
Antikörper mit einer Spezifität für Dlkexprimierende Zellen werden dadurch erhalten, daß man ein Tier mit Dlk-Protein immunisiert. In diesem Zusammenhang umfaßt "Antikörper" sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper. Ein derartiger Antikörper kann zu einer beliebigen Antikörperklasse zählen (IgG, IgM, IgA, usw.). Gemäß der vorliegenden Erfindung wird einem Tier ein vollständiges Dlk-Polypeptid injiziert, um polyklonale Antikörper zu gewinnen, oder um Lymphozyten oder Milzzellen zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern zu erhalten.
Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers mit Spezifität für Dlk-Protein werden die allgemeinen Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper (MAb) wie die von Kohler und Milstein, Nature 256 : 495(1975) beschriebenen Techniken, verwendet. Diese Vorgehensweise umfaßt die Schritte: Isolierung von Lymphozyten aus einem Tier, das mit Dlk-Polypeptid sensibilisiert bzw. dem Dlk-Polypeptid injiziert wurde, Fusionieren mit einem Myelompartner zur Herstellung von Hybridomen, anschließendes Durchmustern der Hybridome auf die Produktion von "Anti-Dlk-Antikörpern", die eine Bindungsspezifität für ein Dlk-Polypeptid aufweisen.
Der Ausdruck "Antikörper" umfaßt auch Fragmente wie FAb und F(Ab1)2 von Anti-Dlk-Antikörpern, sowie Konjugate solcher Fragmente, sowie sogenannte "Antigenbindungsproteine" (einzelkettige Antikörper), die auf Anti-Dlk-Antikörpern beruhen, zum Beispiel gemäß US- Patent Nr. 4,704,692, dessen Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Es können jedoch MAbs oder deren Fragmente auch durch die Expression von Genen, die variable Regionen solch eines MAb codieren, in Wirtszellen wie E. coli [siehe z. B. Ward et al., Nature 341 : 544-546 (1989)] oder transfizierten Maus-Myelomzellen produziert werden [Siehe Verhoyen et al., BioAssays 8 : 74 (1988); Gillies et al., Biotechnol. 7 : 799-804 (1989); Nakatani et al., Biotechnol. 7 : 805-10 (1989)].
Zu Assays, bei denen die genannten Antikörper verwendet werden, zählen zum Beispiel enzymgebundene Immunsorbtionsassays (ELISAs), Radioimmungssays, die Immunelektrophorese und dergleichen. Immunhistochemische Techniken, bei denen monoklonale Antikörper mit einer bekannten Reaktivität verwendet werden, eignen sich ebenfalls für Diagnosezwecke.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird von einem Probanden, um (1) ein kleinzelliges Lungenkarzinom nachzuweisen, eine Probe dadurch gewonnen, daß man eine Körperflüssigkeit oder ein Gewebe, von der bzw. dem vermutet wird, daß sie bzw. es einen Tumor enthält, entnimmt, z. B. Alveolenzellen, Bronchiolenzellen oder Epithelzellen der Atemwege, die mittels Bronchialspülung, mittels Nasopharyngealaspiraten oder mittels Rachenabstrich oder dergleichen gewonnen wurden, und um (2) einen metastasierten Neuroendokrintumor nachzuweisen, die Probe durch eine Biopsie eines Gewebes, jedoch nicht der Nebenniere (inklusive Cortex und Medulla) gewinnt. An solchen Zellen lassen sich mit einem für Dlk spezifischen monoklonalen Antikörper immunhistochemische Untersuchungen vornehmen.
Diagnostische Anwendungen dieser Antikörper sind gemäß der vorliegenden Erfindung zum Beispiel die Verwendung eines Kits mit einem Anti-Dlk-Antikörper, der mit einer biologischen Probe zwecks Nachweis von Dlk-Protein reagiert. Bei solch einer Reaktion wird unter Bedingungen, die eine Bindung gestatten, der Anti-Dlk-Antikörper an das Dlk- Antigen gebunden. Wird ein Antikörper-Antigen-Komplex in einer biologischen Probe beobachtet, so ist das Ergebnis positiv. Ein derartiges Kit könnte zum Nachweis des Grads der Dlk-Expression in einer bestimmten biologischen Probe einer Person, eines Tiers oder einer Zellinie verwendet werden.
Solch ein immundiagnostisches Kit kann Anti-Dlk- Antikörper sowie ein Behältnis, in dem sich der Antikörper in sterilisierter Form befindet, enthalten. Das Kit kann weiterhin einen Anti-Isotyp-Serum-Antikörper enthalten, der den Anti-Dlk-Antikörper (Fc-Teil) erkennt und der mit einem Marker, wie einem Enzym oder einem fluoreszierenden Molekülteil, konjugiert ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein radioaktiv markierter Anti-Dlk-Antikörper bereitgestellt. Ein derartiger Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, wird einem Tier oder Menschen zwecks Imaging verabreicht. Nach einem geeigneten Zeitabstand, während dessen die verabreichten Antikörper an Dlk-exprimierende Zellen binden, wird ein Gamma-Kameragerät angewandt, um das Vorliegen markierter Antikörper innerhalb des Organismus nachzuweisen. Eine derartige Vorgehensweise liefert Informationen bezüglich der Lokalisierung eines primären oder sekundären Dlk-exprimierenden Neuroendokrintumors im Organismus.
Bei einer therapeutischen Verwendung der monoklonalen Anti-Dlk-Antikörper werden Anti-Dlk-Immuntoxine verabreicht. Eine Konjugation eines monoklonalen Anti-Dlk- Antikörpers mit einem Toxin, wie einem Pseudomonas-Exotoxin oder anderen Toxinen, die üblicherweise mit einem Antikörper mittels üblicher Antikörper-Toxin-Bindung konjugiert sind. Verfahren zur Herstellung einer Antikörper-Toxin-Bindung werden von Hertler et al., J. din. Oncol. 7(12): 1932 (1989) beschrieben, was durch Bezugnahme in dem vorliegenden Text aufgenommen wird. Die beschriebenen Konjugate zwischen Toxin und dem monoklonalen Anti-Dlk-Antikörper werden einem Patienten verabreicht, um die Dlk-exprimierenden Zellen, die in Neuroendokrintumoren vorliegen, gezielt und selektiv abzutöten.
Auf ähnliche Weise wird auch ein Kit bereitgestellt, das Anti-Dlk-Immuntoxine in einem Behältnis enthält. Ein Kit kann die Anti-Dlk-Immuntoxine sowie einen pharmazeutischen Grundstoff in einem Behältnis enthalten.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin in bezug auf die folgenden erläuternden Beispiele beschrieben. Falls nicht anders erwähnt, sind alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe so zu verstehen, wie sie üblicherweise vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Erfindung verstanden werden. Obwohl beliebige Materialien und Verfahren, die den hier beschriebenen ähnlich sind bzw. entsprechen, bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden können, sind die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben worden. Falls nicht anders erwähnt, handelt es sich bei den im vorliegenden Zusammenhang verwendeten oder betroffenen Techniken um fachbekannte Standardvorgangsweisen. Materialien, Methoden und Beispiele dienen nur zu Erläuterungszwecken und sind nicht als Beschränkung aufzufassen.

Beispiel 1. IDENTIFIKATION VON dlk-POLYNUKLEOTID- UND -POLY- PEPTIDMOLEKÜLEN

Identifikation von dlk

Bei der Untersuchung von Molekülen, die mit dem auf das gastrinfreisetzende Peptid (GRP) reagierenden Phänotyp assoziiert sind, wurden Gene identifiziert, die sowohl (1) zwischen reagierenden Maus-Swiss- und nichtreagierenden Maus-Balb/c-3T3-Fibroblasten differenziell exprimiert wurden sowie (2) in auf GRP reagierenden Human-SCLC-Zellinien exprimiert wurden. Hinter diesem Ansatz steht, daß Genprodukte, die mit einem auf GRP reagierenden Phänotyp korreliert sind, in Balb/c- und nichtreagierenden SCLC-Zellinien nicht vorhanden sein würden, jedoch in Swiss-3T3-Fibroblasten und reagierenden SCLC-Zellinien schon.
Es wurde eine Differential-cDNA-Bibliothek konstruiert, die mit Klonen, die in Swiss-3T3-Fibroblasten exprimiert wurden, in Balb/c-3T3-Fibroblasten jedoch nicht, angereichert war. Die Differentialbibliothek von Swiss-3T3- Fibroblasten im Vergleich zu Balb/c-3T3-Fibroblasten wurde wie genau bei Timblin et al., Nucleic Acids Res. 18 : 1587 (1990) angegeben konstruiert. RNA-Isolierung, Elektrophorese, Northern-Blots sowie Hybridisierungstechniken wurden wie bei Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier, New York (1986) beschrieben durchgeführt. Die Nukleinsäuresonden wurden mit 32P-dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) mittels Random-Priming wie bei Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, New York 3.5.9.-3.5.10 (1991) beschrieben markiert.
Ein (150 Nukleotide langer) Teillängenklon, der aus dieser Differentialbibliothek isoliert wurde, hybridisierte mit einer 1,6 Kilobasen langen mRNA, die ein Expressionsmuster aufwies, das den beiden Durchmusterungsbedingungen entsprach. Mit diesem Teillängenklon wurde dann eine im Handel erhältliche Oligo-dT-primed cDNA-Bibliothek von Swiss-3T3- Fibroblasten im Vektor λZAPII (Stratagene (La Jolla, CA)) durchmustert, wodurch man zu einem Vollängenklon gelangte.
Durchmusterung und "Plasmid Rescue" positiver XZAPII-Klone wurden gemäß der Vorschrift des Herstellers (Stratagene) wie bei Short et al., Nuc. Acids Res. 16 : 7583 (1988) durchgeführt. Das Ergebnis dieser Durchmusterung waren mehrere Klone mit ungefähr 1,6 Kilobasenpaaren langen Inserts.

DNA-Seayenzierung

Die "Rescued-Plasmide" wurden mit Sequenase (USB, Cleveland, OH) nach der Didesoxy-Kettenabbruchsmethode gemäß der von Tabor et al., J. Biol. Chem. 214 : 6447 (1989) beschriebenen Vorschrift des Herstellers sequenziert. Bei der Nukleotidsequenzanalyse wurde ein offenes Leseraster mit 1155 Nukleotiden definiert, das ein vermutliches Protein (Dlk) von 385 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 41.320 Dalton codiert. Dieses offene Leseraster wurde sowohl nach der Methode von Fickett als auch nach der von Shepherd als codierend klassifiziert. Fickett et al., Nucleic Acids Res. 10 : 5303 (1982); Shepherd et al., Meth. Enzymol. 188: 180 (1990). Die offenen Leseraster wurden mit Hilfe von Software-Programmen, die diese Methoden durchführen, identifiziert (PC/Gene Software-Programmpaket, Intelligenetics Inc. (Mountain View, CA); A. Bairoch, Doktorarbeit, Universität Genf (1990))

In vitro-Translation des Dlk-Polypentids

In vitro-Translationsassays mit Maus-dlk-mRNA wurden gemäß der Vorschrift des Herstellers wie von Lockhard et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 37 : 204 (1969) beschrieben mit einem Kaninchen-Retikulozytenlysatsystem von NEN (Boston, MA) durchgeführt.
Die dlk-mRNA wurde durch Hybridisierung von poly A+ RNA aus Swiss-3T3-Fibroblasten mit auf Nitrocellulosefiltern immobilisiertem denaturiertem Vollängen-dlk selektiert (die dlk-mRNA wurde dadurch selektiert, daß man 2 ug poly A+ Swiss-3T3-RNA mit 5 ug an Nitrocellulose immobilisiertem denaturiertem dlk hybridisierte). Die gebundene RNA wurde durch Kochen eluiert. Maus-dlk-mRNA wurde auch dadurch in vitro hergestellt, daß man zwei unterschiedliche Vollängendlk-cDNAs, die in pGEM4Z (Promega) kloniert waren, verwendete. Diese drei mRNAs dienten als Matrizen für die in vitro- Translation.
Die markierten Proteine wurden in einem 12%igen Polyacrylamidgel und anschließend fluorographisch analysiert. Bei allen drei Proben fand man in Übereinstimmung mit dem prognostizierten Molekulargewicht des Dlk-Polypeptids eine Proteinbande mit ungefähr 42 Kilodalton.

Vergleich zwischen Maus und Mensch

Die Maus- und Human-dlk-Polynukleotidsequenzen weisen bezüglich ihrer Aminosäuresequenz eine Identität von 86,2% und eine Ähnlichkeit von 90,1% auf. Es sind ihnen viele mögliche Stellen biologischer Wirksamkeit, darunter 6 EGF-artige Sequenzwiederholungen (die zu denjenigen von neurogenen Proteinen von Wirbellosen stark homolog sind), eine integrale Transmembrandomäne und eine Signalpeptiddomäne, gemeinsam.
Die Strukturcharakteristiken von dlk wurden mit dem Programm PC/Gene (Intelligenetics Inc. (Mountain View, CA), A. Bairoch, Doktorarbeit, Universität Genf (1990)) analysiert. Die Transmembrandomäne wurde mit dem Programm RAOARGOS, das die Methode von Rao und Argos, Biochem. Biophy. Acta 869 : 197 (1986) durchführt, identifiziert. Das Signalpeptid wurde mit dem Programm PSIGNAL nach der Methode von Von Heijne, Nucleic Acids Res. 14 : 4683 (1986) analysiert.

Beispiel 2. VERGLEICH ZWISCHEN DER pPG2- und dlk- GENEXPRESSION IN DER MAUS UND DER dlk-GENEXPRESSION BEIM MENSCHEN

In normalem Gewebe des Menschen, der Maus und des Hamsters wurde dlk-Expression gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen, und zwar nur in Nebennieren- und Plazentagewebe. Ähnlich war bekannt, daß sich die pG2-Expression in normalem menschlichem Gewebe auf die Nebennieren beschränkt.
dlk-mRNA wurde mittels Northern-Analyse in Human- und Ratten-Phäochromozytom- (PC12)-Zellinien nachgewiesen. pG2 wurde von Helman et al., PNAS USA 84 : 2336 (1987) in Phäochromozytom-Zellinien identifiziert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde dlk in Neuroblastom- (SK-N-SH)-Zellen nachgewiesen. Eine pG2-Expression in Neuroblastom-Zellinien wurde in differenzierten Zellen nachgewiesen, fehlte jedoch in nicht differenzierten Neuroblastom-Zellinien. Cooper et al., Cell Growth and Diff. 1 : 149 (1989).
Zu weiteren Zellen, die dlk exprimieren, was durch die vorliegende Erfindung identifiziert wurde, zählen außerdem gewisse SCLC-Zellinien. Mit einer Human-dlk-Sonde wurde außerdem unter hochstringenten Bedingungen gefunden, daß auch Maus-Swiss-3T3-Fibroblasten dlk exprimieren. Mit einer Human-dlk-Sonde wurde unter hochstringenten Bedingungen gefunden, daß Balb/c-3T3-Fibroblasten dlk exprimieren. Unter diesen Bedingungen war Balb/c-3T3-Fibroblasten-RNA bezüglich der dlJc-Expression negativ.
Zur Untersuchung der Beziehung zwischen Maus-dlk und Human-pG2 wurden cDNA-Klone aus einer λgt10-Humannebennnierenbibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) mit Maus-d1k als Hybridisierungssonde isoliert. Nicht einmal unter wenig stringenten Bedingungen wurden Klone isoliert, die Proteine mit Struktureigenschaften, die den für pG2 beschriebenen Struktureigenschaften ähnlich waren, codierten.
Die cDNA-Inserte aus positiven λ-Klonen wurden in pGEM4Z (Promega, Madison WI) subkloniert und gemäß dem Verfahren nach Beispiel 1 sequenziert. Aus den Polynukleotidsequenzdaten aus mehreren Vollängenklonen ging hervor, daß diese cDNAs 82,1% Sequenzidentität mit Maus-dlk aufwiesen und das Human-Homolog des Maus-dlk-Proteins codierten (Fig. 1).
Die Strukturcharakterisierung von Dlk unterscheidet sich stark von derjenigen, die für das pG2-Protein prognostiziert wurde (Helman et al., supra. (1987). Das erstgenannte Protein besteht aus einer 286 Aminosäuren langen Sequenz (ungefähr 30 kDa), enthält keine EGF-artigen Sequenzwiederholungen und keine Signalpeptid- oder Transmembrandomänen. Dies war der Fall, obwohl der Befund einer Nukleotidsequenzidentität zwischen dlk und pG2 von 81,2% korrekt als das in Fig. 1 dargestellte dlk-Polynukleotidmolekül identifiziert wird.

Beispiel 3. dlk/Dlk-HOMOLOGIE ZU ANDEREN GENEN UND PROTEINEN

Die dlk-Nukleinsäuresequenz weist einen hohen Homologiegrad zu den EGF-artigen neurogenen Genen von Drosophila auf, die an den Entscheidungen beteiligt sind, die die Zellen des embryonalen Ectoderms bezüglich der Differenzierung in Epidermis- oder Nervenzellen treffen. Zu den Genen, von denen gefunden wurde, daß sie die höchste Homologie zu Dlk aufweisen, zählen: Delta, Notch und Serrate von D. melanogaster, lin-12 und glpl von C. elegans, sowie uEGF1 des Seeigels. Obwohl der Homologiegrad zwischen den einzelnen Proteinen und Dlk schwankte, wiesen Regionen maximaler Homologie eine Aminosäureidentität von bis zu 33% auf, die unter Einbeziehung konservativer Aminosäuresubstitutionen bis auf ungefähr 75% anstieg.
In Fig. 4 ist eine Gegenüberstellung von Maus- bzw. human-dlk-EGF-artigen Sequenzwiederholungen mit mehrere Proteinen langen Konsenssequenzen von EGF- Sequenzwiederholungen dargestellt. Die Gegenüberstellung der EGF-artigen Sequenzwiederholungen wurde mit dem von Higgins et al., Gene 73 : 237 (1988) beschriebenen Progamm CLUSTAL durchgeführt. Die Stellen mit möglicher biologischer Wichtigkeit wurden mit Hilfe des Programms PROSITE analysiert. Reste, die bei homöotischen Genen stark konserviert sind, sind bei dlk ebenfalls konserviert. Dieses Ergebnis bestätigt, daß es sich bei dlk um ein Mitglied der Familie EGFartiger homöotischer Gene handelt. Die Aminosäuresequenz und Struktur der EGF-artigen Sequenzwiederholungen ist wie auch die Gesamtstruktur von dlk stärker mit den homöotischen Genen von Wirbellosen als mit nichthomöotischen EGF-artigen Proteinen anderer Wirbeltiere, wie zum Beispiel EGF- Vorstufe, TGFa, die α-, β1- und β2-Ketten von Laminin, Koagulationsfaktoren oder Komplement-Proteinen verwandt, von denen früher angenommen wurde, daß es sich bei ihnen um die Säugetier-Gegenstücke der homöotischen Gene von Wirbellosen handelt.
Das dlk-Gen wurde in Spezies nachgewiesen, die von Vögeln bis zum Menschen reichen, darunter Hefe, Drosophilia, Xenopus, Maus, Ratte, Kaninchen, Huhn, Hund, Rind, Affe sowie der Mensch. Trotz der Strukturhomologie mit Wirbellosen- Proteinen fehlt das dlk-Gen bei den Wirbellosen und bei niederen Wirbeltieren.
Zur Analyse der Homologie wurde das von Needleman et al., Mol. Biol. 48 : 443 (1970) beschriebene Programm PCOMPARE, das Bestandteil von PC/Gene ist, verwendet. Bei dieser Methode wurde das optimale Ergebnis der Gegenüberstellung zweier Proteine mit der statistischen Verteilung von 100 zufallsmäßigen Gegenüberstellungen verglichen. Ein Gegenüberstellungsergebnis von mehr als 5 positiven Standardabweichungen von der mittleren Zufallsgegenüberstellungsverteilung wurde als signifikant angesehen, insbesondere wenn keine funktionelle oder strukturmäßige Beziehung zwischen den verglichenen Proteinen bekannt ist. Es wurden die folgenden repräsentativen Gegenüberstellungsergebnisse bestimmt: Delta 20,2; Serrate, 19,7; TAN-1, 16,2; Notch, 14,6; Xotch, 13,6; Drosophila-Laminin ß2, 6,3; Maus-Laminin ß2, 4,1; Human-Koagulationsfaktor XII, 2,8; sowie Human-EGF- Vorstufe, 0,6.

Beispiel 4. dlk-EXPRESSION: mRNA-ANALYSE MIT NORTHERN-BLOT Die dlk-Expression wurde in den SCLC-Linien

NCI-H510, NCI-H69 und NCI-N592, in der Human- Neuroblastomlinie SK-N-SH sowie in der Ratten- Phäochromozytomzellinie PC-12 mittels Northern-Analyse nachgewiesen. Zwanzig ug Gesamt-RNA oder 2 ug Poly A+ wurden in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und dann auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (Beschreibung siehe Beispiel 1).
Eine 1,6 kB-Bande, die 11k entsprach, wurde nur in den RNA-Proben der SCLC-Zellinien NCI-N592, NCI-H69 und NCI- H510 sowie in Swiss-3T3-Fibroblasten beobachtet. Bei der Maus-Swiss-3T3-Fibroblasten-RNA fand man ebenfalls starke dlk-Expression, auch dann, wenn die Hybridisierung unter hochstrengen Bedingungen mit human-dlk als Sonde durchgeführt wurde. Ähnliche Ergebnisse erzielte man mit Maus-dlk als Sonde. Balb/c-3T3-Fibroblasten-RNA war bezüglich d1k- Expression unter diesen Bedingungen negativ. Ewing's Sarkomzellinien SK-Es-1, A4573 und TC106 exprimierten kein dlk.
In normalem Gewebe der Maus, des Hamsters sowie des Menschen wurde eine Expression von dlk nur in der Nebenniere nachgewiesen.

Claims

1. Isoliertes Dlk-Polypeptid, das im wesentlichen aus der in Fig. 1B gezeigten Aminosäuresequenz besteht.

2. Isoliertes Polynukleotidmolekül, das für ein Human- Dlk-Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.

3. Isoliertes Polynukleotidmolekül, das im wesentlichen aus der in Fig. 2 gezeigten Polynukleotidsequenz besteht.

4. Isoliertes Polynukleotidmolekül, das für ein Maus- Dlk-Polypeptid codiert, wobei dieses Dlk-Polypeptid die in Fig. 1A gezeigte Aminosäuresequenz enthält.

5. Verfahren zum Nachweis eines Tumors, der dlk exprimiert, mit den folgenden Schritten:

(a) In-Kontakt-Bringen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie tumorerzeugend ist, mit dem dlk-Polynukleotidmolekül unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen dem dlk-Polynukleotidmolekül und der Probe gestatten, sowie

(b) Nachweisen der erfolgten Hybridisierung zwischen dem Polynukleotidmolekül und der Probe.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem dlk-Polynukleotidmolekül um ein isoliertes Polynukleotidmolekül nach Anspruch 3 handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 zum Nachweis eines Tumors, der als kleinzelliges Lungenkarzinom diagnostiziert wurde, wobei die Probe in Schritt (a) Bronchialepithelzellen enthält.