ES2381161B1

ES2381161B1 - Uso de dlk1 como inhibidor de angiogénesis.

Info

Publication number: ES2381161B1
Application number: ES201031547A
Authority: ES
Inventors: Santiago Lamas Peláez; Patricia Rodríguez Pérez; María Ángeles Higueras López; Jorge Laborda Fernández
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Castilla La Mancha
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Castilla La Mancha
Priority date: 2010-10-21
Filing date: 2010-10-21
Publication date: 2013-04-18
Anticipated expiration: 2030-10-21
Also published as: WO2012052594A3; ES2381161A1; WO2012052594A2

Abstract

Uso de Dlk1 como inhibidor de angiogénesis.#La presente invención se refiere al uso de de una construcción génica que comprende una secuencia codificante de Dlk1 o la proteína recombinante que resulta de la expresión de dicha construcción génica para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis, preferentemente la angiogénesis tumoral. También forma parte de la invención el uso de un producto de la expresión de Dlk1 o de cualquiera de sus fragmentos como biomarcador para la determinación de la angiogénesis o de su progresión. Así mismo, también se refiere a un método de determinación de angiogénesis patológica o de su progresión. También se refiere al uso de un kit que comprende la secuencia que codifica para dlk1 o cualquiera de sus productos de expresión para el diagnóstico de angiogénesis patológica.

Description

Uso de Dlk1 como inhibidor de angiogénesis

La presente invención se refiere al uso de una construcción génica que comprende una secuencia codificante de Dlk1 o a la proteína recombinante que resulta de la expresión de dicha construcción génica para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis. Este uso permite tratar y prevenir la formación de nuevos vasos sanguíneos y por lo tanto es útil para el tratamiento y prevención de procesos angiogénicos patológicos tales como la angiogénesis tumoral.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La angiogénesis consiste en la formación de nuevas ramificaciones de vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos existentes. La angiogénesis se produce por la destrucción local de la pared de los vasos sanguíneos preexistentes, la proliferación de las células endoteliales, la migración de las mismas y la organización de éstas en estructuras tubulares alrededor de las cuales se forman las paredes de los vasos sanguíneos. En adultos, la angiogénesis está muy controlada y se activa únicamente en procesos como la reparación de heridas, hipoxia y durante el ciclo reproductivo femenino (Samaranayake et al. 2010. Hum Gene Ther 21:381-396). El aumento descontrolado y/o excesivo de la angiogénesis está asociado a diversas patologías tales como cáncer, aterosclerosis, retinopatía diabética, artritis reumatoide, psoriasis y degeneración macular. Sin la activación de la angiogénesis, se ha descrito que la hipoxia en tumores sólidos no permite crecer al tumor y provoca la muerte de células tumorales (Karamysheva 2008. Biochemistry (Mosc.) 73:751-762; y Folkman et al 1992. J Biol Chem 267:10931-10934). Por todo esto, la inhibición de la angiogénesis es una herramienta de gran utilidad en la terapia antitumoral. La terapia antiangiogénica en tumores se ha centrado hasta la fecha en la inhibición del factor de crecimiento vascular (VEGF) utilizando anticuerpos neutralizantes frente al mismo o frente a sus receptores como herramientas antiangiogénicas. Sin embargo, se hace necesaria una alternativa ya que los anticuerpos neutralizantes frente a VEGF no producen ni una reducción del tumor ni un aumento de la supervivencia significativos, además de presentar un elevado coste de producción (Samaranayake et al. 2010. Hum Gene Ther 21:381-396).

La vía de señalización de Notch juega un importante papel en la formación de vasos sanguíneos. Se ha descrito la inducción de la expresión endotelial del ligando de Notch Delta-like 1 (Dll1) en la arteriogénesis postnatal inducida por isquemia en ratones (Limbourg et al. 2007. Cir Res 100:363-371). Por otra parte, el uso del bloqueo de la función del receptor Notch utilizando una forma soluble del receptor Notch1 se ha demostrado útil para la inhibición de la angiogénesis en estudios in vitro e in vivo en dermis murina tras inducción con VEGF y en xenotransplantes murinos de tumores mamarios y de neuroblastoma (Funahashi et al. 2008. Cancer Res 68:4727-4735). Sin embargo, no se ha descrito hasta la fecha el uso de una proteína relacionada con la familia Notch “Delta-like homolog 1” (dlk1) en la inhibición de la angiogénesis.

El gen Dlk1 codifica para dlk1, una proteína transmembrana que pertenece a la familia que contiene repeticiones de EGF (factor de crecimiento epitelial) a la que también pertenecen proteínas como los receptores Notch y sus ligandos (familia Delta-Notch-Serrate). Dlk1 (también llamado Pref-1, “Fetal antigen-1” o pG2) está muy expresado en el embrión y la placenta durante el desarrollo, sin embargo, en tejidos adultos su expresión se reduce considerablemente llegando incluso a desaparecer, con la excepción de la expresión en las células$ del páncreas, la médula ósea, la pituitaria y la glándula adrenal (Yevtodiyenko et al. 2006. Dev Dynamics 235:1115-1123; Jensen et al. 1993. Hum Reprod 8:635-641; Larsen et al. 1996. Lancet 347:191; y Tornehave et al. 1996. Histochem Cell Biol 106:535-542). Dlk1 participa en el control de diferenciación de diversos procesos, entre los que se incluye diferenciación neuroendocrina, diferenciación de hepatocitos, hematopoyesis, osteogénesis y adipogénesis (WO9413701; Nueda et al 2007. J Mol Biol 367:1281-1293). Dlk1 también se ha relacionado con el proceso de reparación de heridas ya que se ha detectado expresión de Dlk1 en un tejido mesenquimal no diferenciado de la zona de reparación de tejido de la oreja de ratones MRL y C57BL/6 siendo en los primeros donde más se expresa Dlk1 y los que mayor capacidad de reparación tisular presentan (Samulewicz et al. 2002. Wound Repair Regen 10:215-221).

En relación a la implicación de Dlk1 en angiogénesis, se ha descrito que en el embrión, la expresión de Dlk1 se ha relacionado con la formación de vasos sanguíneos embrionarios en ratón ya que se ha visto su expresión en el endotelio en desarrollo de diversos vasos sanguíneos (por ejemplo en las arterias cerebrales) así como en los vasos sanguíneos fetales de la placenta (Yevtodiyenko et al. 2006. Dev Dynamics 235:1115-1123). Sin embrago, no se ha descrito hasta la fecha el uso de la sobreexpresión de Dlk1 en la inhibición de la angiogénesis.

La sobreexpresión de Dlk1 se ha probado hasta la fecha en adipogénesis pero no en angiogénesis. En adipogénesis se ha visto que la sobreexpresión de Dlk1 activa o inhibe la adipogénesis dependiendo del contexto celular, previniendo la adipogénesis en la línea celular 3T3-L1 pero activando la adipogénesis en la línea celular C3H10T1/2 (Nueda et al. 2007. J Mol Biol 367:1281-1293). Además, se ha sugerido la interacción de Dlk1 con Notch1 in vivo y su participación en la cascada de señalización de Notch1 en la regulación de los procesos de adipogénesis al expresar Dlk1 en una línea celular de ratón (Balb/c 14 que expresa Notch1 pero no Dlk1) y comprobar que la expresión forzada Dlk1 provoca una disminución en la actividad de Notch (Baladrón et al. 2005. Exp Cell Res 303:343-359).

También se ha descrito el uso de la sobreexpresión de Dlk1 en hematopoyesis. El uso de una fracción soluble de Dlk1 humano resulta útil para inhibir la diferenciación de las células madre hematopoyéticas, resultados que se han obtenido mediante transfección estable del cDNA de Dlk1 humano (WO9731647).

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

El problema técnico que resuelve la invención es un medicamento alternativo para la inhibición de la angiogénesis obtenido mediante el uso de una construcción génica que comprende la secuencia que codifica para Dlk1. También forma parte de la presente invención el uso de la proteína recombinante resultante de la expresión de la construcción génica que comprende la secuencia que codifica para Dlk1 para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis. En ambos casos también se contempla el uso para la inhibición de procesos patológicos que cursan con angiogénesis (angiogénesis patológica) tales como cáncer, aterosclerosis, retinopatía diabética, artritis reumatoide, psoriasis y degeneración macular. Dado que en la actualidad no existe ningún tratamiento efectivo para la angiogénesis patológica, entre ella la angiogénesis tumoral, se hace necesaria una alternativa que proporcione un tratamiento efectivo para dicha patología.

La invención describe el uso de una construcción génica que comprende la secuencia que codifica para Dlk1 o un equivalente biológico funcional de la misma para la preparación de un medicamento para el tratamiento de patologías en las que sea necesaria la inhibición de la angiogénesis. Este uso permite prevenir la formación de nuevos vasos sanguíneos y por lo tanto esta nueva aplicación es una alternativa para mejorar la efectividad de los tratamientos antiangiogénicos, incluidos los tratamientos frente a la angiogénesis tumoral.

Con el fin de evaluar el potencial antiangiogénico de la secuencia que codifica para Dlk1 para la elaboración de un medicamento para prevenir la formación de vasos sanguíneos (angiogénesis), se procedió a sobreexpresar Dlk1 en endotelio adulto (por lo tanto células diferenciadas) de modelos animales de angiogénesis mediante construcciones génicas. Las construcciones génicas utilizadas en la invención han sido plásmidos y adenovirus en las que el DNA complementario (cDNA) de Dlk1 se ha fusionado a secuencias marcadoras que permiten la selección de los recombinantes. Se han realizado ensayos in vitro con sistemas de Matrigel, ex vivo con explantes de aorta e in vivo con “plugs” (soportes) de Matrigel en modelos animales. Además, también se ha demostrado el uso de la construcción génica que comprende el cDNA de Dlk1 en la inhibición de la migración celular en procesos de reendotelización (una etapa importante en la angiogénesis, como se ha señalado anteriormente), concretamente en procesos de cicatrización de heridas (“wound healing”) realizados en células endoteliales adultas de aorta in vitro.

Así, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de una construcción génica que comprende la secuencia que codifica para dlk1 para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis.

El término “dlk1” también llamado en la literatura “delta-like homolog (Drosophila) 1”, “delta like homolog”, “secredeltin”, “preadipocyte factor 1”, “fetal antigen 1”, “Brevideltinin”, “DLK”, “FA1”, “pG2”, “SCP-1”, “Pref-1”, “PREF1” y “ZOG”; se refiere a una proteína transmembrana que pertenece a la familia de moléculas de señalización Delta-Notch-Serrate o a sus variantes transcripcionales. La secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica el DNA complementario de Dlk1 en Homo sapiens isoforma a (número de acceso NM_003836.4). La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 se refiere a la secuencia de aminoácidos de dlk1 en Homo sapiens (número de acceso NP_003827.3).

Las proteínas (secuencias de aminoácidos) funcionales originadas a partir de modificaciones postranscripcionales de la secuencia de nucleótidos que codifica para la SEQ ID NO: 1 también forman parte de la presente invención, como por ejemplo, pero sin limitarnos, las variantes producidas por corte y empalme alternativo (“splicing”), entre ellas: “delta-like 1 homolog isoform CRA b” (número de acceso EAW81713.1), “secredeltin” (número de acceso AAY4046.1), “brevideltinin” (número de acceso AAZ38943.1) y “brevideltinin truncated” (número de acceso AAZ66768.1) (ver Tabla 1); así como también forman parte de la invención las construcciones génicas que las codifican.

Tabla 1. Proteínas resultantes de las variantes de “splicing” de Dlk1 humana

Proteína: Nº Acceso Nº aminoácidos

Isoforma CRA a: NP_003827.3 383

Isoforma CRA b: EAW81713.1 310

Secredeltin: AAY40461.1 315

Brevideltinin: AAZ38943.1 212

Brevideltinin truncada: AAZ66768.1 203

Las proteínas con al menos un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 son isoformas o secuencias de aminoácidos homólogas a la SEQ ID NO: 2 en Homo sapiens así como en diferentes animales, también forman parte de esta invención así como las secuencias de nucleótidos que las codifican. El porcentaje de identidad se ha elegido de acuerdo con el programa Blastp del “National Center for Biotechnology Information” (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (ver Tabla 2).

Tabla 2. Porcentaje de identidad de la proteína dlk1 en diferentes especies animales

Especie (isoforma): Nº Acceso % Identidad

Sus scrofa (B): NP_001041652.1 73

Sus scrofa (C2): NP_001119573.1 80

Bos Taurus: NP_776462.1 81

Ovis aries (A): ADE59013.1 82

Ovis aries (C2): ADE59014.1 79

Canis lupus familiaris: XP_54798.2 88

Mus musculus: NP_034182.2 85

Mus musculus (3): NP_001177633.1 81

Mus musculus (4): NP_001177634.1 75

Rattus norvegicus: NP_446196.1 85

El término quot;% de identidadquot; entre dos secuencias de aminoácidos, tal como se entiende en la presente invención, se refiere al número de posiciones aminoacídicas sobre la longitud total de la secuencia que se compara, donde todos los aminoácidos en esa posición son idénticos.

Por lo tanto, en la presente invención el término “proteína de la invención” se refiere a proteínas funcionales generadas por corte y empalme alternativo de la secuencia que codifica para la SEQ ID NO: 1 o a proteínas con al menos el 70% de identidad a la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 2, o a cualquiera de sus fragmentos. El término “secuencia de la invención” se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica para la “proteína de la invención”.

En el contexto de la presente invención, Dlk1 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína dlk1, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de (a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 70%, un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2; en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína dlk1.

e) moléculas de ácido nucleico que codifican para las isoformas o secuencias de aminoácidos homólogas a la SEQ ID NO: 2 con al menos un 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Se entiende por “construcción génica” aquellas construcciones genéticas de DNA capaces de transcribirse a un polipéptido o fragmento del mismo, que codifican para la proteína de la invención, en adelante “construcción génica de la invención”. Dicha construcción genética de DNA dirigiría la transcripción in vitro o intracelular de la secuencia de dlk1

o fragmento de la misma, y comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) ácido nucleico preferentemente de doble cadena, que comprende, al menos, la secuencia codificante de dlk1 para su transcripción in vitro, o intracelular, b) un cassette de expresión que comprende el ácido nucleico unido operativamente a elementos de control de la transcripción y opcionalmente de traducción; c) una secuencia de nucleótidos de DNA, preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende la secuencia codificante de la secuencia de dlk1 operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc, donde preferentemente el vector se selecciona de la lista que comprende: plásmido, bácmido, cromosoma artificial de levaduras (YACs), cromosoma artificial de bacterias (BACs), cromosoma artificial derivado del bacteriofago P1 (PACs), cósmido o virus con un origen de replicación heterólogo.

El término quot;medicamentoquot;, tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención se refiere, a una composición capaz de inhibir la angiogénesis.

“Tratamiento” se refiere a tanto el tratamiento terapéutico como el profiláctico o medidas preventivas. Aquellas situaciones susceptibles de tratamiento incluyen las ya asociadas con alteraciones así como en aquellas en las que se previene la alteración. Una “alteración” es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con la composición de la invención, tal y como se describe en el presente documento.

El término “inhibición” como se usa aquí, se refiere principalmente a que el medicamento inhibe (disminuye) la formación de vasos sanguíneos y por tanto la angiogénesis.

La angiogénesis a la que se refiere la presente invención es la que consiste en la formación de nuevas ramificaciones de vasos sanguíneos (angiotubos o microvasos en la presente invención) a partir de vasos sanguíneos existentes que se produce en condiciones patológicas (angiogénesis patológica). Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de una construcción génica que comprende la secuencia que codifica para dlk1 para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis asociada a patologías que se seleccionan de la lista que comprende: cáncer, aterosclerosis, retinopatía diabética, artritis reumatoide, psoriasis y degeneración macular. Preferiblemente la angiogénesis que se inhibe es la angiogénesis tumoral.

Las composiciones de la presente invención permiten la transfección de la construcción génica de la invención al interior de una célula, in vivo o in vitro. La transfección se podría llevar a cabo, pero sin limitarnos a, transfección directa o vectores que faciliten el acceso de la secuencia codificante dlk1 al interior de la célula. Por lo tanto, en una realización preferida del primer aspecto de la invención la construcción génica de la invención comprende un vector que se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse a, plásmido, bácmido, cromosoma artificial de levaduras (YACs), cromosoma artificial de bacterias (BACs), cromosoma artificial derivado del bacteriofago P1 (PACs), cósmido, virus con un origen del replicación heterólogo, adenovirus, retrovirus, lentivirus, virus del Herpes simplex, o cualquiera de sus combinaciones. Así, por ejemplo, las construcciones génicas de la presente invención, pueden conjugarse con péptidos de liberación u otros compuestos para favorecer el transporte al interior de la célula. En una realización aún más preferida, la construcción génica comprende un plásmido como vector. En otra realización aún más preferida, la construcción génica comprende un adenovirus como vector.

La construcción génica que comprende la secuencia que codifica para dlk1 se traduce en el interior de la célula una vez se haya transfectado y codifica para la proteína que va a realizar la función de inhibición en última instancia en el interior de la célula en la presente invención. Por este motivo, la presente invención también se refiere al uso de la proteína recombinante que resulta de la expresión de la construcción génica que comprende la secuencia que codifica para dlk1 para la preparación de un medicamento destinado a la inhibición de la angiogénesis, y preferentemente de la angiogénesis tumoral. En una realización preferida, dicho medicamento es decir, el que comprende la construcción génica de la invención o la proteína de la invención para la inhibición de la angiogénesis, además comprende, al menos, un excipiente y/o al menos, un vehículo farmacológicamente aceptable. Otra realización preferida se refiere a que dicho medicamento además comprende al menos otro principio activo.

El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del medicamento o composición farmacéutica de la invención, estabiliza dicha composición farmacéutica o ayuda a su preparación en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

Un “vehículo farmacológicamente aceptable” se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensoactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación del producto de expresión de la invención así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El término “farmacológicamente aceptable” se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

La invención se lleva a cabo mediante el suministro de una cantidad eficaz de la construcción génica de la invención, la proteína de la invención o un equivalente biológico funcional de las mismas en un tejido de un animal. Por este motivo, la composición proporcionada por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. La cantidad de la construcción génica de la invención o de la proteína de la invención en dichas composiciones se administra a una concentración terapéuticamente efectiva. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión quot;concentración terapéuticamente efectivaquot; se refiere a la concentración de agentes moduladores calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos agentes (y construcciones) y el efecto terapéutico a conseguir. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de al menos un producto de la expresión de Dlk1, o cualquiera de sus fragmentos como biomarcador para la determinación de angiogénesis patológica o para determinar la progresión de angiogénesis patológica, en una muestra biológica aislada de un mamífero, preferiblemente humano.

El término “producto de expresión” se refiere a cualquier ARN como por ejemplo, pero sin limitarse, ARN mensajero (ARNm) (secuencia codificada por el cDNA de la SEQ ID NO: 1), o cualquiera de sus fragmentos; así como la de cualquier proteína o cualquiera de sus fragmentos que resulte de la expresión de la SEQ ID NO: 1 de la presente invención o posea una homología con el ARN, proteína o fragmentos de los mismos de al menos un 70%.

El término “biomarcador” en la presente invención se refiere a una molécula que tiene una conexión directa con el riesgo de padecer angiogénesis patológica y sirve para determinar el estado de la enfermedad así como para determinar la progresión de la misma.

La muestra biológica aislada de un organismo, como por ejemplo, pero sin limitarse, un humano u otro animal, puede ser un fluido biológico o cualquier tejido celular de dichos organismos.

Las enfermedades en las que la alteración de la actividad de dlk1 puede ser diagnosticada, y en concreto la angiogénesis patológica, puede ser detectada midiendo la cantidad de ácidos nucleicos (ADN y/o ARN y/o mRNA) que codifican para dlk1, o la cantidad de proteína dlk1 que se expresa, en comparación con células normales. La detección de los oligonucleótidos puede hacerse por métodos bien conocidos en el estado de la técnica (como por ejemplo, pero sin limitarse, sondas con nucleótidos marcados, hibridación ADN-ADN o ADN-ARN, amplificación por PCR empleando nucleótidos marcados, la RT-PCR). Procedimientos para detectar la expresión de la proteína Dlk1 también son bien conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo anticuerpos poli o monoclonales, ELISA, radioinmunoensayo (RIA), y FACS (fluorescence activated cell sorting).

Por tanto, en otro aspecto de la invención se describe un método para la determinación de angiogénesis patológica que comprende, (a) detectar y/o cuantificar en una muestra biológica aislada de un mamífero, al menos un producto de la expresión de Dlk1, o cualquiera de sus fragmentos.

Una realización preferida se refiere a un método de determinación de angiogénesis patológica, donde además comprende el paso (b) la comparación de los datos obtenidos en el paso (a) con datos obtenidos de muestras control para buscar alguna desviación significativa. Otra realización más preferida además comprende el paso (c) atribuir la desviación significativa al desarrollo de angiogénesis patológica en dicho mamífero.

El término “muestras control” tal como se entiende en la presente invención se refiere, por ejemplo, pero sin limitarse, a una muestra obtenida de un individuo que no desarrolla una patología asociada a angiogénesis (individuo sano). Este tipo de muestra control, es un muestra control negativa o control negativo para angiogénesis patológica.

El término “desviación significativa” tal como se entiende en la presente invención se refiere, a la variación de la expresión de los ácidos nucleicos que codifican para dlk1 o la presencia de la proteína dlk1 en la muestra aislada, o una variación en la concentración de la proteína de la invención en la muestra aislada respecto de una muestra aislada procedente de un individuo sano donde la diferencia sea estadísticamente significativa. La selección del individuo sano se lleva a cabo por medio de la medida del nivel de uno o más marcadores comunes de angiogénesis patológica. El marcador común es conocido por el experto en la materia y se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, VE-cadherinas (“vascular endotelial-cadherin”), VEGF, factor de crecimiento de fibroblastos b (FGF-b), la forma soluble del receptor de VEGF (VEGFR-1 o sFlt-1), angiopoyetina (Ang-1) factor de Von Willebrand, PECAM-1 (“platelet endotelial cell adhesión molecule-1”), IL-6, p53, factor VIII, glicoproteína CD105, y los gangliósidos GM y Gtlb.

En la presente invención “diferencia estadísticamente significativa” se refiere a que existen diferencia estadísticas entre los valores comparados, siendo la probabilidad estadística al menos mayor o menor que 0,05 (pgt;0,05 o pgt;0.05) y obteniéndose ésta según el test estadístico aplicable a cada caso.

Otro aspecto de la invención comprende un método para determinar la progresión de angiogénesis patológica que comprende,

(a) determinar una primera concentración de al menos un producto de la expresión de Dlk1, o cualquiera de sus fragmentos en una muestra biológica aislada de un mamífero; (b) determinar una segunda concentración de dicho producto de expresión del paso (a) en una muestra biológica aislada del mismo mamífero tomada posteriormente a la muestra del paso (a), y (c) comparar la segunda concentración obtenida en el paso (b) con la primera concentración obtenida en el paso (a) para buscar una desviación significativa.

También forma parte de la invención el uso de un kit que comprende la construcción génica que comprende la secuencia que codifica para dlk1 para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis así como el uso del kit que comprende la proteína recombinante que resulta de la expresión de la construcción génica que comprende la secuencia que codifica para dlk1 para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis.

Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos.

Los términos “péptido”, “oligopéptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra quot;comprendequot; y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Muestra que la expresión de Dlk1 retrasa la migración celular en ensayos in vitro de cicatrización de heridas (wound healing). Se realizaron ensayos con un plásmido que contenía el cDNA de Dlk1 humana para comprobar el efecto de la sobreexpresión de dlk1 en la migración de células endoteliales. A, se muestra que las células adultas de aorta porcina que fueron transfectadas con un plásmido de Dlk1 (Dlk1) presentan un retraso significativo en el cierre de las heridas comparadas con células en condiciones basales (basal) o con células que expresan un vector control vacío (pCMV6). B, Las células endoteliales aisladas de pulmón de ratones KO para Dlk1 (pérdida de función) presentan una migración significativamente mayor y una mayor capacidad de re-endotelización comparadas con ratones “wild-type” (WT).

Figura 2. Muestra que la sobreexpresión de Dlk1 inhibe la formación de angiotubos en sistemas in vitro de Matrigel. Se realizaron ensayos con un plásmido que contenía el cDNA de Dlk1 humana para comprobar el efecto de la sobreexpresión de dlk1 en la formación de angiotubos en sistemas in vitro de matrigel. A, Las células endoteliales adultas de aorta porcina transfectadas con el cDNA de Dlk1 (Dlk1) se compararon con células sin transfectar (Basal) o, transfectadas con el plásmido pCMV6 vacío (pCMV6) tanto en células a las que se añadió 5 ng/ml de VEGF directamente al medio de cultivo (VEGF) o sin añadir (No VEGF). B, número de estructuras tubulares que se formaron en presencia de VEGF (barras blancas) y en ausencia de VEGF (barras negras).

Figura 3. Muestra que la sobreexpresión de Dlk1 disminuye la angiogénesis en ensayo ex vivo en explantes de aorta de ratón. Se realizaron ensayos con anillos de aorta murina embebidos en colágeno para comprobar el efecto de la sobreexpresión de dlk1 en la formación de angiotubos en sistemas ex vivo de explantes de aorta de ratón. A, esquema de la construcción génica que contiene un adenovirus tipo5 (Ad tipo 5 dE1/dE3). CMV, promotor de citomegalovirus; Dlk1HA, la secuencia de Dlk1 a la que se refiere la SEQ ID NO: 1 con la inserción entre el nucleótido 1302 y 1303 de la secuencia del epítopo de hemaglutinina a la que se refiere la SEQ ID NO: 3; cola poli A (polyA); y “green fluorescente proteinquot; (GFP). B, anillos de aorta de ratón embebidos en colágeno los cuales se infectaron con adenovirus vacío (Ad. Empty), adenovirus con GFP (Ad.GFP), o con adenovirus que contenía el cDNA de Dlk1 humana (Ad.Dlk1). Se muestran dos ensayos por experimento. C, número de microvasos que se formaron en presencia de adenovirus vacío (Ad. Empty), adenovirus con GFP (Ad.GFP), o con adenovirus que contenía el cDNA de Dlk1 humana (Ad.Dlk1).

Figura 4. Muestra que la sobreexpresión de Dlk1 disminuye la angiogénesis en soportes (o matrices) de Matrigel

in vivo. Se realizaron ensayos in vivo mediante la implantación de soportes (o matrices) de matrigel que contenían adenovirus en el tejido subcutáneo de ratones para comprobar el efecto de la sobreexpresión de dlk1 en la inhibición de la angiogéneis en sistemas in vivo. Como control negativo de angiogénesis, se implantaron soportes (matrices) con un inhibidor de la ruta de Notch (DAPT). Los soportes de matrigel contenían VEGF para activar la angiogénesis, como control negativo se implantó un soporte de matrigel con un adenovirus que contenía GFP y que no contenía VEGF. A, soportes de matrigel que se implantaron subcutáneamente en los que se aprecia la angiogénesis producida macroscópicamente por visualización de un color más oscuro que corresponde a la coloración de la sangre localizada en los vasos formados. Ad.GFP, adenovirus con GFP; Ad.DLK, adenovirus que comprende la SEQ. ID. NO: 1; Ad.DLK-GFP, adenovirus que comprende la SEQ. ID. NO: 1 y GFP; DAPT, control con el inhibidor DAPT; y DMSO, control con DMSO. B, contenido total de hemoglobina en los soportes de matrigel implantados.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

EJEMPLO 1. La expresión de Dlk1 retrasa la migración celular en ensayos in vitro de cicatrización de heridas (wound healing).

Se valoró el uso de una construcción génica que comprende el cDNA de Dlk1 humano en la migración celular de reparación de heridas dado que una fase importante de la angiogénesis es la migración del endotelio para formar los nuevos vasos sanguíneos.

Se realizaron ensayos con un plásmido que contenía el cDNA de Dlk1 humana para comprobar el efecto de la sobreexpresión de dlk1 en la migración de células endoteliales adultas de aorta porcina y bovina transfectadas con un plásmido que contenía el cDNA humano y se comparó con células sin transfectar y transfectadas con el plásmido vacío.

El plásmido utilizado en este ensayo fue el pCMV6-XL4 (secuencia de acceso número AF067196 del NCBI) al que se unió mediante clonación en la región de polilinkers MCS entre las dianas de Not I, la SEQ ID NO: 1. Además esta construcción génica lleva un epítopo de hemaglutina (HA) para la localización de la expresión mediante anticuerpos antihemaglutinina. El epítopo de HA (SEQ ID NO: 3) se situó entre los nucleótidos 1302 y 1303 del cDNA de Dlk1 utilizado en la invención la (SEQ ID NO 1).

Se observó que las células endoteliales adultas tanto de aorta porcina como bovina transfectadas con el plásmido que comprendía Dlk1 (Dlk1) presentaron un retraso significativo en el cierre de las heridas comparadas con células en condiciones basales o con las células que expresaban un vector control, por lo que se muestran únicamente los resultados de las células endoteliales de aorta porcina (Fig. 1A).

Además, se procedió a evaluar la implicación de la ausencia de expresión de Dlk1 en la migración de endotelio utilizando ratones en los que la expresión del gen Dlk1 se eliminó por completo (ratones knock-out o KO). Para ello se utilizaron células endoteliales aisladas de pulmón de los ratones KO para Dlk1 (que presentaban ausencia de expresión del gen Dlk1) y se observó que presentaban una migración significativamente mayor y una mayor capacidad de reendotelización comparadas con ratones que expresaban Dlk1 (ratones “wild-type” o WT) (Fig. 1B).

EJEMPLO 2. La sobreexpresión de Dlk1 inhibe la formación de angiotubos en sistemas in vitro de Matrigel.

Para comprobar la inhibición in vitro de la angiogénesis de una construcción génica que comprendía la secuencia que codifica para dlk1, se utilizó un plásmido que contenía el cDNA humano de dlk1 y se comprobó el efecto de la sobreexpresión de dlk1 en la formación de angiotubos en sistemas in vitro de matrigel.

Matrigel es el nombre comercial (Beckton Dickinson and Company, BDTM) para una mezcla gelatinosa de proteínas secretadas por células de tumor de ratón (sarcoma “Engelberth-Holm-Swarm”, EHS) muy rica en proteínas extracelulares de matriz, siendo el mayor componente laminina, seguido de colágeno IV, proteoglicanos y entactina/nidogen, entre otros. Esta mezcla se asemeja al ambiente extracelular complejo encontrado en muchos tejidos y es utilizada en estudios in vitro como substrato de células endoteliales capaces de formar estructuras tubulares de manera similar al proceso de angiogénesis que ocurre in vivo. En la presente invención, las células endoteliales aisladas se embebieron en Matrigel y en presencia de medio de cultivo suplementado o no con VEGF (5ng/ml) se comprobó la formación de redes tubulares.

El plásmido utilizado en este ensayo fue el pCMV6-XL4 (secuencia de acceso número AF067196 del NCBI) al que se unió mediante clonación en la región de polilinkers MCS entre las dianas de Not I, la SEQ ID NO: 1. Además esta construcción génica lleva un epítopo de hemaglutinina (HA) útil para la localización de la expresión mediante anticuerpos anti-HA. El epítopo de HA (SEQ ID NO: 3) se situó entre los nucleótidos 1302 y 1303 del cDNA de Dlk1 utilizado en la invención la (SEQ ID NO 1).

Se comparó la generación de angiotubos en células endoteliales adultas de aorta porcina y bovina transfectadas con el plásmido pCMV6 vacío, con el cDNA de Dlk1o con células sin transfectar, tanto en células a las que se añadió VEGF o sin añadir VEGF al medio de cultivo. El número de angiotubos (estructuras tubulares) que se formaron tras transfectar las células endoteliales con el plásmido que contenía el cDNA humano de Dlk1 fue significativamente menor que el número de angiotubos formados tras transfección con el plásmido vacío o en condiciones basales, tanto en presencia de VEGF y en ausencia de VEGF, tanto en endotelio porcino como bovino por lo que se muestran únicamente los resultados de las células endoteliales de aorta porcina (Figs. 2A y 2B).

EJEMPLO 3. La sobreexpresión de Dlk1 disminuye la angiogénesis en ensayo ex vivo en explantes de aorta de ratón.

Para comprobar la inhibición ex vivo de la angiogénesis de una construcción génica que comprendía la secuencia que codifica para dlk1, se utilizó un adenovirus que contenía el cDNA humano de dlk1 y se comprobó el efecto de la sobreexpresión de dlk1 en la formación de angiotubos en sistemas ex vivo para lo cual se utilizaron anillos de aorta de ratón embebidos en colágeno tipo I.

El adenovirus que contenía bajo el promotor del CMV (citomegalovirus) la secuencia de Dlk1 a la que se refiere la SEQ ID NO: 1, tenía entre el nucleótido 1302 y 1303 insertada la secuencia del epítopo de hemaglutinina a la que se refiere la SEQ ID NO: 3 seguido de una cola poli A y de GFP para su identificación (Fig. 3 A). El adenovirus era de primera generación tipo 5 deficiente en la región E1 (sin capacidad de replicación) y en la región E3 (con capacidad de incorporación de material genético de hasta 8,2 Kb) (dE1/dE3).

La sobreexpresión de Dlk1 en los anillos de aorta mediante adenovirus disminuyó significativamente la formación de angiotubos, comparando con explantes de aorta infectados con adenovirus que expresaban GFP o un vector control (Figs. 3B y 3C).

EJEMPLO 4. La sobreexpresión de Dlk1 disminuye la angiogénesis en soportes de matrigel in vivo.

Para comprobar la inhibición in vivo de la angiogénesis de una construcción génica que comprendía la secuencia que codifica para dlk1, se utilizó el adenovirus explicado previamente (Fig. 3 A) que contenía el cDNA humano de dlk1 y se comprobó el efecto de la sobreexpresión de dlk1 en la formación de angiotubos en sistemas in vivo para lo cual se utilizaron soportes de matrigel implantados subcutáneamente en ratones.

Se observó la angiogénesis producida tanto macroscópicamente por visualización de un color más oscuro que corresponde a la coloración de la sangre localizada en los vasos formados (Fig. 4A) como mediante la valoración del contenido total de hemoglobina en los soportes una vez se retiraron del sitio de implante (Fig. 4B). En el caso de los adenovirus que contenían el cDNA de Dlk1 (SEQ ID NO: 1) (Ad.DLK1-GFP), se observó una presencia significativamente menor de angiogéneis comparado con los adenovirus control y similar a la producida por el inhibidor de la ruta e señalización de Notch DAPT (Figs. 4A y 4B).

MATERIAL Y MÉTODOS EMPLEADOS.

Obtención de células endoteliales de aorta porcina y bovina .

La aorta porcina o bovina aislada y lavada con PBS se sometió a tratamiento con colagenasa (0.03 % peso/volumen) (Sigma) durante 15 minutos a 37º C. Tras la centrifugación, los precipitados se resuspendieron en medio RPMI (Gibco) complementado con 15% de (suero fetal de ternera) FCS (Gibco), 5% penicilina/estreptomicina/fungizona (Gibco) y 5% heparina (Sigma) y cultivados en botellas de cultivo de 25 cm2. La pureza de las preparaciones se analizó por inmunofluorescencia usando el anticuerpo anti-Factor VIII (von Willebrand) (3 μJPO(BDTM).

Obtención de los ratones Knock Out para Dlk1.

La construcción de los ratones knock out (KO) fue realizada conforme a la bibliografía existente (Raghumandan et al. 2008. Stem Cells Dev 17:795-507). Brevemente, el gen de dlk1 fue silenciado al insertar un cassette resistente a Neomicina que sustituyó 3.8 kbp del alelo endógeno, incluyendo el promotor y los tres primeros exones de Dlk1. Dicha construcción fue transfectada por electroporación a células embrionarias de ratones de la cepa SvJ129. Las quimeras fueron generadas y establecidos los cruces pertinentes para conseguir el ratón Dlk1-/- . El análisis del genotipo fue realizado por “Southern blot” o PCR usando los siguientes cebadores de las secuencias recogidas en SEQ ID NO: 4 (cebador sentido para Dlk1), SEQ ID NO: 5 (cebador sentido para Neomicina) y SEQ ID NO: 6 (cebador antisentido que hibrida con la secuencia complementaria en el intrón 3 de Dlk1): El análisis del fenotipo se realizó después de tres cruces con la cepa C57Bl/6, y seguidamente, los cruces entre heterocigotos fueron usados para generar los homocigotos, heterocigotos y wild-type.

Obtención de células endoteliales de pulmón de ratones KO.

Una vez extraídos los pulmones del ratón KO para Dlk-1, estos se lavaron en medio Ham-F12 (Gibco) y se disgregaron mecánicamente antes de someterlos a tratamiento con colagenasa (0.1 % peso/volumen) durante 1hora a 37ºC. El sobrenadante de la centrifugación se eliminó y el precipitado se cultivó durante 24h a 37º C. La preparación celular se sometió primero a una selección negativa usando anticuerpos frente a macrófagos (CD16/CD32) (1,6 μJPO (BDTM) y anti-IgG-recubierto de partículas magnéticas (6,6x105 partículas/ml) (Invitrogen), y después de 48 horas, a una doble selección positiva usando el anticuerpo específico para células endoteliales ICAM-2 (3,3 μJPO(BDTM) y partículas magnéticas. La pureza de la preparación se analizó por citometría de flujo usando el anticuerpo ICAM-2 (3 μJPO#12; (BDTM).

Ensayo de “wound healingquot;.

Las células endoteliales adultas de aorta porcina, bovina, y de pulmón de ratón se cultivaron en monocapa en presencia de 10% FBS (20% en el caso de las células de pulmón). Usando una punta estéril de pipeta, se realizaron incisiones en la monocapa y la velocidad y tiempo de migración de las células al área de la “herida” o re-endotelización se monitorizó de forma continua durante 24 horas usando un microscopio de contraste de fases (10x objetivo) acoplado a una cámara monocromática Hamamatsu CCD C9100-02. En el caso de las células que expresan el vector control pCMV6 o Dlk1, las transfecciones se realizaron 24 horas antes de realizar las incisiones. La cuantificación se realizó midiendo el área que quedaba por cerrar al tiempo del cierre de la primera “herida”.

Transfección de células endoteliales con el plásmido pCMV6.

Todas las transfecciones se realizaron usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen), siguiendo las condiciones recomendadas por la compañía. Las células endoteliales de aorta bovina y/o porcina al 60-80% de confluencia se transfectaron con 0.25 μg de plásmido del vector control pCMV6 o de Dlk1, y se usaron en los distintos ensayos 24 horas post-transfección.

Ensayo de angiogénesis in vitro con sistemas de matrigel.

Las células endoteliales adultas aisladas de aorta porcina y/o bovina (3x104 células por pocillo en placas de 96 pocillos) se embebieron en 40 μl de matriz extracelular de Matrigel (BDTM Bioscience) en presencia de 10% suero y suplementadas o no, según el caso, con 5 ng/ml de VEGF (R&D Systems). Después de 4-6 horas de incubación a 37º C, el número de estructuras tubulares (angiotubos) fue cuantificado usando el programa Angioquant (MATLAB) y confirmado mediante contaje visual.

Infección con adenovirus.

Las infecciones con adenovirus se realizaron a una concentración de 1x109 unidades formadoras de placas (ufp). En el caso de los anillos de aorta, los explantes se incubaron con los adenovirus durante 24 horas antes de embeberlos en la matriz de colágeno tipo I (SERVA). En los ensayos de angiogénesis in vivo, los adenovirus se mezclaron con los soportes de matrigel y demás componentes (VEGF y/o DAPT) (Biomol) antes de inyectarlos a los animales.

Ensayo de angiogénesis ex vivo con explantes de anillos de aorta.

La aorta de ratón se diseccionó y transfirió rápidamente a PBS frío. El tejido fibroadiposo se separó de la pared de la aorta evitando dañarla, y se troceó en segmentos de 1 mm de longitud. Usando puntas de pipetas previamente enfriadas, se añadió a cada pocillo de una placa de 96, 40 μl de la siguiente mezcla de colágeno tipo I (7.5 volúmenes de 2 mg/ml) (SERVA), 1 volumen de medio 10x MEM (Gibco) y 1.5 volúmenes de NaHCO3 (15.6 mg/ml) y 0.1 volúmenes de NaOH 1 M para ajustar el pH a 7.4. Dicha mezcla se dejó solidificar a 37º C durante 10 minutos antes de embeber los anillos de aorta. Tras este tiempo, se procedió a incubar la placa otros 10 minutos a 37º C y se añadieron otros 40 μl de la mezcla de colágeno a cada explante. Tras otra incubación de 10 minutos, se añadieron 100 μl de MCDB131 (Gibco) suplementado con 25 mM NaHCO3, 2.5% de suero de ratón (Source BioScience), 1% de glutamina y 100 U/ml penicilina/estreptomicina. Los cultivos se mantuvieron a 37º C durante 6 días.

En los casos de infecciones con adenovirus, las aortas limpias de tejido adiposo se cortaron por la mitad y se incuban con 1x109 ufp de adenovirus en medio MCDB131 con suero a baja concentración (2%) durante 24 horas. Después de este tiempo, las aortas infectadas se lavaron para eliminar restos de adenovirus, se cortaron en anillos de 1 mm de longitud y se embebieron en la matriz de colágeno tipo I. Los explantes se analizaron después de 6 días de incubación usando un microscopio de fluorescencia. La angiogenesis se evaluó contando el número de microvasos (angiotubos) por anillo.

Ensayo de angiogénesis in vivo con Plugs de matrigel.

Se inyectó Matrigel bajo en factores de crecimiento (500 μl) suplementado con heparina (64 U/ml) y según los casos, adenovirus (1x109 ufp), DAPT (10 mg/Kg peso), vehículo DMSO (dimetilsulfóxido) ó VEGF (250 ng/ml), de forma subcutánea en el abdomen superior del ratón anestesiado. Después de 10 días, la angiogénesis in vivo se determinó analizando el contenido de hemoglobina de los plugs (soportes) mediante método colorimétrico (TMB, Sigma).

Inhibición de la ruta de señalización de Notch con DAPT.

La inhibición de la ruta de Notch in vivo se realizó añadiendo a la mezcla de Matrigel (500 μl) heparina (64 U/ml) y VEGF (250 ng/ml) el compuesto DAPT a una concentración de (10 mg/Kg peso), antes de inyectarla subcutáneamente al ratón.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de una construcción génica que comprende la secuencia que codifica para dlk1 para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis.
2.

Uso según la reivindicación 1, donde la angiogénesis es angiogénesis tumoral.

5 3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde la construcción génica comprende un vector que se selecciona de la lista que comprende: plásmido, bácmido, cromosoma artificial de levaduras (YACs), cromosoma artificial de bacterias (BACs), cromosoma artificial derivado del bacteriófago P1 (PACs), cósmico, virus con un origen de replicación heterólogo, adenovirus, retrovirus, lentivirus virus del Herpes simplex, o cualquiera de sus combinaciones.

10 4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la construcción génica comprende un plásmido como vector.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la construcción génica comprende un adenovirus como vector.
6.

Uso de la proteína recombinante que resulta de la expresión de la construcción génica descrita en cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis.
7.

Uso de la proteína recombinante según la reivindicación 6 donde la angiogénesis es angiogénesis tumoral.
8.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el medicamento además comprende al menos un excipiente y/o al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el medicamento además comprende al menos otro 20 principio activo.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración por vía oral, parenteral o intradérmica.

.

FIG. 1 A

FIG. 1 B

12

FIG. 2 A

FIG. 2 B

13

FIG 3 A

Ad Tipo 5

(dE1/dE3)

FIG 3 B

FIG 3 C

14

FIG. 4 A

FIG. 4 B

15

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 201031547

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 21.10.2010

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A

US 5644031 A (LABORDA J.) 01.07.1997, 1-10

columna 3, líneas 5-31; columna 4, línea 31 – columna 5, línea 62; SEQ ID NO: 2.

A

US 20090326205 A1 (NAKAMURA K. et al.) 31.12.2009, 1-10

página 2, párrafos 29-36; página 3, párrafos 51-79; página 12, párrafos 209-213; página 13,

párrafos 219-221; página 14, párrafo 224; página 26, párrafos 358-360.

A

YIN D. et al. DLK1: increased expression in gliomas and associated with oncogenic Activities. 1-10

Oncogene. 2006. Vol. 25, páginas: 1852-1861, todo el documento.

A

YEVTODIYENKO A. & SCHMIDT JV. Dlk1 Expression Marks Developing Endothelium and Sites of 1-10

Branching Morphogenesis in the Mouse Embryo and Placenta. Developmental Dynamics. 2006.

Vol. 235, páginas: 1115-1123, todo el documento.

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 31.10.2011

Examinador M. D. García Grávalos Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201031547

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

A61K48/00 (2006.01) A61K38/18 (2006.01) C12Q1/68 (2006.01) A61P35/04 (2006.01)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

A61K, C12Q, A61P

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, USPTO PATENT DATABASE, GOOGLE ACADEMICO, EBI.

Informe del Estado de la Técnica Página 2/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201031547

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 31.10.2011

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-10 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-10 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201031547

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

US 5644031 A 01.07.1997

D02

US 20090326205 A1 31.12.2009

D03

YIN D. et al. Oncogene. 2006. Vol. 25, páginas: 1852-1861. 2006

D04

YEVTODIYENKO A. & SCHMIDT JV. Developmental Dynamics. 2006. Vol. 235, páginas: 1115-1123. 2006
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La presente solicitud divulga el uso de una construcción génica, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína Dlk1, o la proteína recombinante que resulta de la expresión de dicha construcción génica, para preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis, preferentemente tumoral, que puede ser administrado por vía oral, parenteral o intradérmica (reivindicaciones 1-10).

El documento D01 divulga la molécula correspondiente al polinucleótido dlk, que codifica para la proteína humana Dlk, de 383 aminoácidos, que se expresa en varios tipos de tumores, como feocromocitomas, neuroblastomas y tumores de pulmón de célula pequeña; así como su utilidad para diagnóstico y terapia de estos tumores (ver columna 3, líneas 5-31; columna 4, línea 31 -columna 5, línea 62; SEQ ID NO: 2).

El documento D02 divulga un anticuerpo, específico frente a la proteína humana Dlk, policlonal, o preferentemente un anticuerpo monoclonal y el hibridoma que lo produce; así como una composición farmacéutica que lo contiene y un kit y método para detección y pronóstico de un tumor. Este anticuerpo presenta actividad antitumoral in vivo, produciendo la muerte celular o inhibiendo el proceso de angiogénesis (ver página 2, párrafos 29-36; página 3, párrafos 51-79; página 12, párrafos 209-213; página 13, párrafos 219-221; página 14, párrafo224; página 26, párrafos 358-360).

El documento D03 divulga la función de la proteína Dlk1 en la formación y progresión de gliomas. Esta proteína se expresa en tejido embrionario, limitando posteriormente su expresión a tejidos tumorales; por ejemplo, se expresa ampliamente en tumores de origen endocrino. La expresión de la proteína Dlk1 en células de glioblastoma es mayor que la encontrada en tejidos procedentes de cerebros sanos. Dlk1 no solo se sobreexpresa en gliomas, si no que estimula la proliferación y migración celular (ver todo el documento).

El documento D04 divulga la función de la proteína Dlk1 durante el desarrollo embrionario en ratones. En estudios de hibridación in situ, realizados con embriones de ratón de 12,5 días, el patrón de expresión génica tejido-específica para Dlk1, muestra que esta proteína se sobreexpresa durante el desarrollo de la glándula pituitaria y de los tejidos pancreático, pulmonar, adrenal y mesodérmico. También Dlk1 caracteriza la diferenciación y desarrollo de los tejidos durante la organogénesis y morfogénesis. En la placenta se expresa en los vasos sanguíneos fetales (ver todo el documento).

1. NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986)

La presente solicitud divulga el uso de una construcción génica, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína Dlk1, o la proteína recombinante que resulta de la expresión de dicha construcción génica, para preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis, preferentemente tumoral, que puede ser administrado por vía oral, parenteral o intradérmica.

1.1. REIVINDICACIONES 1-10

La expresión de la proteína humana Dlk1 en ciertos tipos de tumores se encuentra divulgada en el estado de la técnica. Los documentos D01 y D02 anticipan las secuencias correspondientes al polinucleótido dlk (SEQ ID NO: 1) y a la proteína que codifica Dlk (SEQ ID NO: 2) y también el uso de esta proteína para diagnóstico y terapia de ciertos tipos de tumores, produciendo la muerte celular o inhibiendo el proceso de angiogénesis.

La diferencia entre estos documentos y el objeto técnico de las reivindicaciones 1-10 de la presente solicitud, estriba en las secuencias seleccionadas para elaborar un medicamento para inhibir la angiogénesis. La presente invención reivindica el uso de la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína Dlk1, o la proteína resultante de su expresión; sin embargo, los documentos D01 y D02 se refieren al uso de un anticuerpo específico frente a la proteína humana Dlk para elaborar un inhibidor de la angiogénesis.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201031547

Ambos concepto son distintos y opuestos, por lo que se considera que esta diferencia aporta, de acuerdo con los datos de la descripción, una composición diferente a la divulgada, que constituye un medicamento para inhibición de la angiogénesis alternativo a lo divulgado en el estado de la técnica.

En consecuencia, según lo expuesto en los documentos D01 y D02, las reivindicaciones 1-10 cumplen los requisitos de novedad y actividad inventiva (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986).

Los documentos D03 y D04 se refieren al estado de la técnica y no se consideran relevantes en relación con el objeto de la invención.

Informe del Estado de la Técnica Página 5/5