ES2564794T3 - R-espondinas como moduladores de angiogénesis y vasculogénesis - Google Patents

R-espondinas como moduladores de angiogénesis y vasculogénesis Download PDF

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Abstract

Uso de un polipéptido de R-espondina-2 o 3 o de un ácido nucleico de de R-espondina-2 o 3 para elaborar un medicamento destinado al tratamiento de un estado patológico que se beneficia de la promoción de la angiogénesis y/o de la vasculogénesis.

Description

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DESCRIPCION
R-espondinas como moduladores de angiogenesis y vasculogenesis
1. INTRODUCCION
La presente invencion se refiere al uso de polipeptidos de R-espondina, en particular R-espondina-2 (Rspo2) o R- espondina-3 (Rspo3) o acidos nucleicos de R-espondina. La presente invencion esta basada en la demostracion de que Rspo2 y Rspo3 son promotores de la angiogenesis y en la identificacion de Rspo2 y Rspo3 como reguladores positivos del factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV). Estos resultados indican un papel principal de las R- espondinas, en particular de Rspo2 y/o Rspo3 en el sistema de senalizacion durante la angiogenesis. La presente invencion se refiere asimismo al uso de antagonistas de la R-espondina-3 en el tratamiento de enfermedades, incluyendo el cancer, mediante la modulacion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis.
2. ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCION
La familia de protemas R-espondina se conserva en los vertebrados y consta de los cuatro miembros relacionados de R-espondina 1-4 (Rspo1-4) (Chen y otros, 2002, Mol. Biol. Rep. 29, 287-292, que denominaron hPWTSR a la Rspo3; Kamata y otros, 2004, Biochim. Biophys. Acta.1676, 51-62; Kazanskaya y otros, 2004, Dev. Cell 7, 525-534; Kim y otros, 2005, Science 309, 1256-1259; Kim y otros, 2006, Cell Cycle 5, 23-26; Nam y otros, 2006, J. Biol. Chem. 281, 13247-13257). Las Rspo1-4 humanas tambien se han descrito como polipeptidos analogos al factor de crecimiento de celulas madre, que son capaces de promover la proliferacion de celulas madre hematopoyeticas (ver patentes WO 01/77169; WO 01/07611) o se pueden emplear en el tratamiento de varias enfermedades (ver patentes US 2006/0149049, US 2005/0059073) susceptibles de ser aliviadas por un aumento o reduccion de la angiogenesis (vease patente US 2005/054829). Tambien han sido designadas como futrina 1-4 e identificadas como moduladoras de la via senalizadora Wnt (vease patente WO 2005/040418). El contenido de estos documentos se incorpora aqrn como referencia y los aminoacidos y las secuencias nucleicas de las R-espondinas 1-4 aqrn reveladas tambien se incluyen espedficamente.
Los genes Rspo codifican protemas secretadas que pueden activar la senalizacion de Wnt/b-catenina y la Rspo2 promueve la miogenesis a traves de la via senalizadora Wnt/b-catenina en Xenopus (Kazanskaya y otros, 2004, Dev. Cell 7, 525-534). Los genes de R-espondina se coexpresan ampliamente con genes Wnt en muchas regiones durante el desarrollo embrionario y la expresion de R-espondina es regulada positivamente por medio de senales Wnt (Kamata y otros, 2004, Biochim. Biophys. Acta.1676, 51-62; Kazanskaya y otros, 2004, Dev. Cell 7, 525-534). Ademas se ha referido que la Rspo1 humana secretada promueve la proliferacion de epitelio intestinal al estabilizar la b-catenina (Kim y otros, 2005 Science 309, 1256-9). La mutacion de Rspo3 murina produce letalidad embrionaria e induce graves defectos en el desarrollo de la placenta (Aoki y otros, Dev Biol. 2007 301(1):218-26). Sin embargo en este modelo mutante no se describio ningun efecto en el desarrollo de los vasos sangumeos y, contrariamente a los resultados aqrn revelados, los embriones no mostraron ningun signo de hemorragia; por lo tanto antes de la presente invencion no se habfa planteado que la R-espondina, en particular la R-espondina 2 o 3, tuviera un papel importante en la angiogenesis y/o en la vasculogenesis.
La angiogenesis es regulada probablemente por factores de crecimiento polipeptfdicos. Se ha identificado varios polipeptidos con actividad promotora del crecimiento de celulas endoteliales in vitro. Como ejemplo cabe mencionar el factor de crecimiento fibroblastico acido y basico, el FCEV y el factor de crecimiento placentario.
El FCEV es un factor clave en la vasculogenesis y en la angiogenesis, y su via senalizadora es una diana importante para la intervencion farmacologica (Ferrara 2005, Oncology 3:11-6; Rosen 2005, Oncologist 10:382-91).
3. RESUMEN DE LA PRESENTE INVENCION
La presente invencion se refiere al uso de polipeptidos o acidos nucleicos de R-espondina. La presente invencion se basa en la demostracion de que la Rspo3 y la Rspo2 son promotores de la vasculogenesis y de la angiogenesis. Ademas inducen el crecimiento de celulas endoteliales y se han identificado como reguladores positivos del FCEV.
Los resultados indican un papel importante de los polipeptidos de R-espondina, en particular de la Rspo2 y/o Rspo3, en el sistema de senalizacion durante la angiogenesis y/o la vasculogenesis.
Los polipeptidos de R-espondina (p.ej. Rspo2 o Rspo3), los acidos nucleicos de R-espondina y los agonistas de R- espondina son adecuados para el tratamiento de enfermedades que implican la promocion de la angiogenesis y/o la vasculogenesis.
Los antagonistas de los polipeptidos de R-espondina (p.ej. Rspo2 o Rspo3) o los acidos nucleicos de R-espondina sirven para el tratamiento de enfermedades que implican la inhibicion de la angiogenesis y/o la vasculogenesis.
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Aqrn se revela el empleo de polipeptidos de R-espondina, de acidos nucleicos de R-espondina y de reguladores, efectores o moduladores de R-espondina para aplicaciones diagnosticas, en particular para diagnosticar o controlar los procesos, enfermedades y trastornos relacionados con la angiogenesis y/o la vasculogenesis.
Tambien se revelan celulas y animales no humanos transgenicos que presentan una expresion modificada, p.ej. aumentada o reducida, de la R-espondina, en particular de la Rspo2 y/o Rspo3.
Los polipeptidos de R-espondina y los acidos nucleicos de R-espondina y las celulas o animales transgenicos se pueden usar en procedimientos de deteccion, a fin de identificar y/o caracterizar efectores de angiogenesis y/o de vasculogenesis.
4. DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS
FIG. 1: la Rspo3 es necesaria para el desarrollo de las celulas de los vasos sangumeos en Xenopus tropicalis. Se inyectaron del modo indicado embriones de Xenopus tropicalis en la fase de 4 celulas con oligonucleotidos antisentido morfolino (Mo) de control o de Rspo3. Los embriones se fijaron en la fase de brote de cola y se llevo a cabo la hibridacion in situ para los marcadores de sangre (a-globina, SCL, Mead y otros, 1998, Development 125, 2611-2620) o para formar vasos sangumeos (msr, Devic y otros, Mech Dev. 1996; 59,129-40). Observese la expansion de los marcadores de sangre y la inhibicion de msr en los embriones tratados con Mo para Rspo3.
FIG. 2: demostracion de la especificidad de los oligonucleotidos antisentido morfolino para Rspo3. Se inyectaron del modo indicado embriones de Xenopus tropicalis en dos blastomeros ventrales en la fase de 4-8 celulas con oligonucleotidos antisentido morfolino (Mo) para Rspo3, con y sin ARNm de Rspo2 de Xenopus laevis. En la fase de gastrula (fase 10) se escindieron zonas marginales ventrales (ZMV) y se cultivaron hasta que los embriones hermanos alcanzaron la fase 28. Las ZMV se fijaron y se procesaron por hibridacion in situ de embriones enteros para el marcador de sangre a-globina. Observese la recuperacion de la expansion de a-globina inducida por Rspo3 Mo mediante ARNm de Rspo2. Esta recuperacion demuestra la especificidad del fenotipo morfolmico.
FIG. 3: la Rspo3 es necesaria y suficiente para promover el desarrollo celular de vasos sangumeos en Xenopus tropicalis. Se inyectaron del modo indicado embriones de Xenopus tropicalis en la fase de 4 celulas con oligonucleotidos antisentido morfolino (Mo) de control o de Rspo3 o con sin ARNm de Rspo2 de Xenopus laevis. En la fase de gastrula se escindio la zona marginal ventral y se cultivo de forma aislada hasta la 28. Se realizo el analisis RT-PCR para los genes del marcador indicados. H4, histona 4 para la normalizacion. -RT, menos control con transcriptasa inversa. Observese que la inhibicion de la Rspo3 impide la expresion del marcador FCEV de vasos sangumeos y la expresion de msr e induce los marcadores de sangre a-globina y SCL.
FIG. 4: expresion de la Rspo3 en el sistema vascular de embriones murinos. Se muestra la hibridacion in situ de la Rspo3 en un embrion murino de E 10,5. Las puntas de flecha senalan la expresion en los vasos sangumeos embrionarios.
FIG. 5: mutagenesis selectiva de Rspo3 murina. (A) Estructura genomica de la Rspo3 y vector direccional usado para la recombinacion homologa en celulas ES. (B) Alelo diana antes y (C) despues de eliminar el gen marcador seleccionable de neomicina mediante Flp recombinasa.
FIG. 6: los ratones con Rspo3 mutada presentan sangrado interno. Fotograffas de embriones murinos de tipo natural (tn) y con Rspo3 (mutantes) en E 10,5. Observense las hemorragias en el raton mutante, indicativas de la falta de formacion de vasos sangumeos.
FIG. 7: los ratones con Rspo3 mutada presentan poca formacion de vasos sangumeos. Se muestran los sacos vitelinos de embriones E 10,5 de tipo natural (tn) y con Rspo3 (mutantes). Observese la palidez del saco vitelino en el mutante.
FIG. 8: los ratones con Rspo3 mutada pierden expresion de FCEV. Se muestra la hibridacion in situ para FCEV de embriones enteros E 9,5 en placentas de tipo natural (tn) y con Rspo3 (mutantes).
FIG. 9: la Rspo2 induce angiogenesis en el ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (MCA).
FIG. 10: la Rspo2 induce la formacion de tubos en las celulas endoteliales. Se aplico un medio de control o un medio acondicionado con Rspo2 de Xenopus laevis a celulas endoteliales humanas (HDMEC) durante 5 dfas. Observese la induccion de morfogenesis indicativa de la formacion de tubos, que es caractenstica durante la angiogenesis.
FIG. 11: la Rspo2 induce el crecimiento de las celulas endoteliales. Se aplico un medio de control o un medio acondicionado con Rspo2 de Xenopus laevis o 0,5 ng/ml de FCEV a celulas endoteliales humanas (HUVEC) durante
2 dfas y se analizo la proliferacion celular mediante un kit comercial (Roche).
5. DESCRIPCION DE LA PRESENTE INVENCION 5.1 1 Definiciones
Tal como se usa aqrn, el termino “polipeptidos de R-espondina” segun la presente invencion se refiere a miembros de la familia de la R-espondina que pueden provenir de mairnferos u otros organismos vertebrados. La familia de protemas R-espondina consta de los cuatro miembros citados, R-espondina 1-4 (Rspo1-4).
El polipeptido de R-espondina es preferiblemente una R-espondina humana, p.ej. R-espondina 1, 2, 3 o 4 humana. Con mayor preferencia el polipeptido de R-espondina es un polipeptido de R-espondina 2 o 3, en particular un polipeptido de R-espondina 2 o 3 humana. Las secuencias de aminoacidos de los polipeptidos de R-espondina 1, 2,
3 o 4 humana se muestran en la patente WO 2005/040418, cuyo contenido se incorpora aqrn como referencia. Otros
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ejemplos de polipeptidos de R-espondina son las R-espondinas de Xenopus, p.ej. de Xenopus tropicalis y Xenopus laevis o de Mus musculus.
Otras secuencias de acidos nucleicos de R-espondinas humanas y secuencias de aminoacidos son las siguientes: secuencia de acidos nucleicos de R-espondina 1 humana (NM_001038633, SEQ ID NO: 16), secuencia de aminoacidos (ABA54597, SEQ ID NO: 17), secuencia de acidos nucleicos de R-espondina 2 humana (NM_178565, SEQ ID NO: 18), secuencia de aminoacidos (NP_848660, SEQ ID NO: 19), secuencia de acidos nucleicos de R- espondina 3 humana (NM_032784, SEQ ID NO: 20), secuencia de aminoacidos (NP_116173, SEQ ID NO: 21), secuencia de acidos nucleicos de R-espondina 4 humana (NM_001029871, SEQ ID NO: 22), secuencia de aminoacidos (NP_001025042, SEQ ID NO: 23).
Los polipeptidos de R-espondina tambien se definen aqrn como polipeptidos que presentan al menos un 40%, preferiblemente al menos un 60%, con mayor preferencia al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad con la secuencia de aminoacidos del respectivo polipeptido de R- espondina humana a lo largo de toda su extension (Kazanskaya y otros, 2004, Dev. Cell 7, 525-534). Ademas los polipeptidos de R-espondina segun la presente invencion se caracterizan preferiblemente por tener al menos una actividad biologica escogida entre
i induccion de angiogenesis en el ensayo MCA,
ii induccion de formacion de tubos en las celulas endoteliales,
iii induccion del crecimiento de las celulas endoteliales, en particular del crecimiento de las celulas endoteliales humanas, y
iv induccion de la expresion de FCEV.
El termino “polipeptido” comprende protemas de longitud completa, moleculas protemicas, fragmentos de protemas, protemas de fusion, peptidos, oligopeptidos, variantes, derivados, analogos o equivalentes funcionales de ellos.
Tal como se usa aqrn, el termino “equivalente funcional de R-espondina” se refiere a una protema inductora de la angiogenesis y/o de la expresion de FCEV. El propio producto genico puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de restos de aminoacidos en la R-espondina, p.ej. en la secuencia de Rspo2 o Rpo3, que producen un cambio silencioso, manteniendo una capacidad importante de transduccion de senales, y por tanto dan lugar a una R-espondina funcionalmente equivalente. Estas sustituciones de aminoacidos son factibles basandose en similitudes de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o en la naturaleza anfipatica de los restos implicados. Por ejemplo, los aminoacidos de carga negativa incluyen el acido aspartico y el acido glutamico; los aminoacidos de carga positiva incluyen la lisina y la arginina; los aminoacidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores similares de hidrofilia incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina; asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, tirosina.
Tal como se usa aqrn, el termino “acido nucleico de R-espondina” se refiere a secuencias de acidos nucleicos que codifican miembros de la familia R-espondina y que pueden provenir de mairnferos u otros organismos vertebrados. El acido nucleico de R-espondina codifica preferiblemente una R-espondina humana, p.ej. R-espondina 1, 2, 3 o 4 humana. Con mayor preferencia el acido nucleico de R-espondina codifica un polipeptido de R-espondina 2 o 3, en particular un polipeptido de R-espondina 2 o 3 humana. Las secuencias de acidos nucleicos de R-espondina 1, 2, 3 y 4 humana se muestran en la patente WO 2005/040418, cuyo contenido se incorpora aqrn como referencia. Otros ejemplos de acidos nucleicos de R-espondina son los que codifican las R-espondinas de Xenopus, p.ej. de Xenopus tropicalis y Xenopus laevis o de Mus musculus.
Ademas los acidos nucleicos de R-espondina se definen aqrn como moleculas escogidas entre
(a) moleculas de acido nucleico que codifican polipeptidos de R-espondina, p.ej. de una R-espondina humana, en particular Rspo2 y/o Rspo3,
(b) moleculas de acido nucleico que se hibridan bajo condiciones rigurosas con una molecula de acido nucleico de
(a) y/o con una molecula de acido nucleico que es complementaria de ellas,
(c) moleculas de acido nucleico que codifican el mismo polipeptido como una molecula de acido nucleico de (a) y/o
(b) , y
(d) moleculas de acido nucleico que codifican un polipeptido identico en al menos un 40%, preferiblemente en al menos un 60%, con mayor preferencia en al menos un 80% y sobre todo en al menos un 90% a un polipeptido codificado por una molecula de acido nucleico de (a) a lo largo de toda su extension.
Las moleculas de acido nucleico pueden ser p.ej. moleculas de ADN o moleculas de ARN.
Tal como se usan aqrn, los terminos “reguladores”, “efectores” o “moduladores” de polipeptidos o acidos nucleicos de R-espondina son intercambiables y cualquiera de ellos se puede emplear para referirse a anticuerpos, peptidos, moleculas inorganicas u organicas de bajo peso molecular y a otras fuentes de materiales activos con potencial biologico capaces de modular polipeptidos de R-espondina, p.ej. Rspo2 y/o Rspo3 para la transduccion de senales, o capaces de modular la actividad de los polipeptidos de R-espondina, o capaces de modular la expresion de R- espondina para promover (agonistas) o inhibir (antagonistas) la angiogenesis y/o de vasculogenesis. Los citados reguladores, efectores o moduladores pueden ser de origen natural o producidos sinteticamente.
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Tal como se usa aqrn, el termino “compuesto capaz de unirse a R-espondina” se refiere a un regulador, efector o modulador de R-espondina, de origen natural o producido sinteticamente, que interactua con un polipeptido de R- espondina. Como ejemplos de tales compuestos cabe mencionar (i) una pareja natural, p.ej. un receptor de una R- espondina; (ii) una molecula de procedencia natural que forma parte del complejo de senalizacion y/o una molecula senalizadora de origen natural producida por otros tipos de celulas; (iii) un anticuerpo de origen natural o producido sinteticamente. El termino “compuesto” se usa aqrn en el contexto de un “compuesto de ensayo” o de un “compuesto propuesto como farmaco”.
Tal como se usa aqrn, el termino “agonista de R-espondina” se refiere a reguladores, efectores o moduladores de R- espondina que activan la respuesta intracelular de la R-espondina y por lo tanto promueven la angiogenesis y/o vasculogenesis.
Tal como se usa aqrn, el termino “antagonista de R-espondina” se refiere a reguladores, efectores o moduladores de polipeptidos de R-espondina o de acidos nucleicos de R-espondina que inhiben, reducen o impiden la respuesta intracelular de los polipeptidos de R-espondina o de los acidos nucleicos de R-espondina y por lo tanto inhiben, reducen o impiden la angiogenesis y/o vasculogenesis.
Como ejemplos de antagonistas adecuados cabe citar las formas mutadas de R-espondina que tienen un efecto negativo dominante, polipeptidos que se unen a la R-espondina, p.ej. anticuerpos anti-R-espondina, incluyendo los anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo que contienen al menos un sito de union a la R-espondina. Ejemplos adicionales de antagonistas de R-espondina son los acidos nucleicos capaces de inhibir la traduccion, transcripcion, expresion y/o actividad de R-espondina, p.ej. aptameros, moleculas antisentido, ribozimas o moleculas de acido nucleico capaces de interferencia por ARN tales como las moleculas de ARNip, incluyendo analogos de acido nucleico como los acidos nucleicos peptfdicos o los acidos nucleicos morfolmicos. Estos acidos nucleicos se pueden unir a los acidos nucleicos de R-espondina o bien interferir con ellos.
Tal como se usa aqrn, el termino “anticuerpo” o “anticuerpos” incluye, sin exclusividad, anticuerpos recombinantes policlonales, monoclonales, quimericos o humanizados, o anticuerpos de cadena simple o fragmentos de ellos, incluyendo fragmentos Fab, fragmentos de cadena simple y fragmentos producidos por una biblioteca de expresion Fab. Los anticuerpos neutralizadores, es decir, aquellos que compiten por el sitio de union para FCEV de una R- espondina se prefieren especialmente para fines diagnosticos y terapeuticos.
Tal como se usa aqrn, el termino “vasculogenesis” se refiere a la formacion y difusion de vasos sangumeos.
Tal como se usa aqrn, el termino “angiogenesis” se refiere a un proceso que implica la vascularizacion de un tejido, en particular la proliferacion, migracion e infiltracion de celulas endoteliales vasculares y el crecimiento y desarrollo de nuevos vasos sangumeos capilares.
Tal como se usa aqrn, el termino “tratar” o “tratamiento” se refiere a una intervencion realizada con la intencion de impedir el desarrollo de la patologfa o alterarla y por tanto aliviar un trastorno, enfermedad o afeccion, incluyendo uno o mas smtomas de tal trastorno o enfermedad. Por lo tanto “tratar” se refiere tanto al procedimiento profilactico como a las medidas preventivas. Los necesitados de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno, asf como aquellos en los cuales hay que prevenirlo. Tal como se usa aqrn, el termino afm “tratamiento” se refiere al acto de tratar un trastorno, smtoma, enfermedad o afeccion, del modo arriba definido para el termino “tratar”.
Tal como se emplea aqrn, la frase “enfermedades cuyo tratamiento implica la inhibicion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis” incluye espedficamente (sin limitacion) estados tales como el crecimiento tumoral, p.ej. el crecimiento de tumores solidos y la actividad metastasica, la aterosclerosis, la estenosis, la restenosis, la retinopatfa, la degeneracion macular, la psoriasis y la artritis reumatoide.
Tal como se emplea aqrn, la frase “enfermedades cuyo tratamiento implica la promocion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis” incluye espedficamente (sin limitacion) estados tales como la curacion de heridas, la regeneracion o desarrollo de tejidos y organos, los procesos degenerativos vasculares (p.ej. isquemia cntica de las extremidades o isquemia cerebral, enfermedad cardfaca isquemica), el desarrollo embrionario y los procesos reproductivos, p.ej. procesos de reproduccion femeninos como el desarrollo del folmulo en el cuerpo luteo durante la ovulacion y el crecimiento de la placenta durante el embarazo.
Tal como se usa aqrn, el termino “tumor” se refiere a un crecimiento nuevo maligno que surge del epitelio y se halla en la piel o, mas comunmente, en el revestimiento de organos corporales como por ejemplo la mama, la prostata, el pulmon, el rinon, el pancreas, el estomago o el intestino. Un tumor tambien se puede infiltrar en el tejido adyacente y propagarse a organos distantes (metastasis), por ejemplo a los huesos, al tngado, al pulmon o al cerebro. Tal como se emplea aqrn, el termino tumor comprende tipos de celulas tumorales primarias y metastasicas, incluyendo sin limitacion melanomas, linfomas, leucemias, fibrosarcomas, rabdomiosarcomas y mastocitomas, y tipos de carcinoma tisular tales como - sin limitarse a ellos - el cancer colorrectal, el cancer de prostata, el cancer pulmonar de celulas pequenas y el cancer pulmonar de celulas no pequenas, el cancer de mama, el cancer de pancreas, el cancer de
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vesicular biliar, el cancer renal, el cancer de estomago, el gliobastoma, el cancer de hugado primario y los canceres ovaricos.
5.2 Descripcion detallada de la presente invencion
La presente invencion esta definida por la serie adjunta de reivindicaciones.
La angiogenesis es necesaria para varios procesos fisiologicos tales como la curacion de heridas, la regeneracion de tejidos y organos, el desarrollo embrionario y procesos reproductivos tales como el desarrollo del folmulo en el cuerpo luteo durante la ovulacion y la formacion de la placenta durante el embarazo. La proliferacion anormal de vasos sangumeos es una manifestacion importante de una serie de enfermedades tales como artritis reumatoide, retinopatfas y psoriasis, a las cuales (y a sus estados relacionados) se hace referencia aqrn como “enfermedades cuyo tratamiento implica la inhibicion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis”. La angiogenesis tambien es un factor importante para el crecimiento y la actividad metastasica de los tumores solidos, los cuales dependen de la vascularizacion. Por consiguiente los inhibidores de la angiogenesis se pueden utilizar terapeuticamente para tratar las enfermedades resultantes o acompanadas de un crecimiento anormal de vasos sangumeos y para tratar las formaciones malignas que conllevan el crecimiento y la propagacion de tumores solidos.
La presente invencion se refiere al uso de polipeptidos de R-espondina o de acidos nucleicos de R-espondina.
Un primer aspecto de la presente invencion se refiere a la utilizacion de un polipeptido de R-espondina o de un acido nucleico de R-espondina para elaborar un medicamento promotor de angiogenesis y/o de vasculogenesis.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a la utilizacion de un antagonista de R-espondina para elaborar un medicamento inhibidor de angiogenesis y/o de vasculogenesis.
Aqrn se revelan metodos y reactivos para diagnosticar o controlar procesos, enfermedades o trastornos relacionados con la angiogenesis y/o la vasculogenesis, que consisten en determinar la cantidad, la actividad y/o la expresion de un polipeptido de R-espondina o de un acido nucleico de R-espondina en una muestra. En el metodo aqrn revelado la cantidad, la actividad y/o la expresion de un polipeptido de R-espondina o de un acido nucleico de R-espondina en dicha muestra se compara ademas con la cantidad, la actividad y/o la expresion de un polipeptido de R-espondina o de un acido nucleico de R-espondina en una muestra de control. Tambien se revelan celulas recombinantes y animales no humanos transgenicos que presentan una expresion del polipeptido de R-espondina modificada, es decir aumentada o disminuida.
Se revela el empleo de polipeptidos de R-espondina y de acidos nucleicos de R-espondina para evaluar y examinar la capacidad de los compuestos de modular, p.ej. de estimular o inhibir, los procesos, enfermedades o trastornos relacionados con la angiogenesis y/o la vasculogenesis. Estos reguladores de las R-espondinas se pueden usar con fines terapeuticos. Por ejemplo, los agonistas de las R-espondinas, p.ej. de Rspo2 y/o Rspo3, se pueden emplear en procesos tales como la curacion de heridas; en cabio los antagonistas de Rspo3 se pueden usar en el tratamiento de tumores que dependen de la vascularizacion para crecer.
En parte la presente invencion se basa en resultados de hibridacion in situ que indican que la Rspo3 se expresa en la vasculatura embrionaria. La presente invencion tambien se basa en el hallazgo de que la expresion de la Rspo3 promueve la diferenciacion, proliferacion y morfogenesis de las celulas endoteliales, mientras que la inhibicion por moleculas antisentido en embriones de Xenopus o la mutagenesis selectiva en ratones modificados geneticamente interfiere en la angiogenesis. La presente invencion se basa ademas en el hallazgo de que la Rspo3 es un regulador positivo, lo cual es necesario y suficiente para la expresion del factor angiogenico clave FCEV.
Por consiguiente la inhibicion de las moleculas de R-espondina puede ser util para tratar enfermedades resultantes de la proliferacion anormal de vasos sangumeos mediada por R-espondina, p.ej. por Rspo2 y/o Rspo3, y/o FCEV, en particular para un tratamiento de enfermedades que consiste en inhibir la angiogenesis y/o la vasculogenesis. La presente invencion se refiere a polipeptidos de R-espondina o acidos nucleicos de R-espondina.
Segun la presente invencion, un polipeptido de R-espondina o de un acido nucleico de R-espondina se puede usar para promover la angiogenesis y/o la vasculogenesis, en particular para elaborar un medicamento promotor de la angiogenesis y/o la vasculogenesis.
Esta forma de ejecucion comprende la prevencion o el tratamiento de una enfermedad, consistente en promover la angiogenesis y/o la vasculogenesis.
Los polipeptidos de R-espondina o los acidos nucleicos de R-espondina se pueden usar en medicina humana o veterinaria, bien solos o en combinacion con otro medicamento, p.ej. otro farmaco promotor de angiogenesis y/o vasculogenesis tal como FCF, FCEV, FCDP, FNT o L-lisina.
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Se revela un metodo para promover la angiogenesis en una celula o en un organismo, que consiste en aumentar el nivel, la actividad y/o la expresion de un polipeptido de R-espondina. Este metodo se puede practicar in vitro o in vivo, p.ej. para aplicaciones terapeuticas.
Tambien se revela un metodo para promover la angiogenesis que consiste en administrar a un sujeto que lo necesite una dosis terapeuticamente efectiva de un polipeptido de R-espondina o de un acido nucleico de R-espondina, siendo dicho sujeto preferiblemente humano.
Una forma de ejecucion diferente de la presente invencion se refiere al uso de un antagonista de R-espondina para elaborar un medicamento inhibidor de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis. El antagonista de R-espondina es preferiblemente un antagonista de R-espondina-2 y/o de R-espondina-3.
Esta forma de ejecucion de la presente invencion incluye la prevencion o el tratamiento de una enfermedad, que consiste en inhibir la angiogenesis y/o la vasculogenesis.
En una forma de ejecucion preferida el antagonista de R-espondina puede usarse en medicina humana o veterinaria, solo o en combinacion con otro medicamento. Por ejemplo, el tratamiento de los tumores puede consistir en el uso combinado de un antagonista de R-espondina y un agente antitumoral, como p.ej. un agente quimioterapeutico o un anticuerpo antitumoral, p.ej. Bevacizumab, Endostatina, Talidomida, Combrestatina A4, un anticuerpo anti-FCEV, SU 5416 o SU 6668.
Las moleculas de acido nucleico son preferiblemente moleculas de ADN recombinante que dirigen la expresion recombinante de los polipeptidos de R-espondina en celulas huesped apropiadas. Alternativamente tambien pueden usarse secuencias de nucleotidos que se hibriden con porciones de una secuencia codificadora de R-espondina en ensayos de amplificacion y/o hibridacion de acidos nucleicos, p.ej. PCR, analisis Southern y Northern blot, etc.
Debido a la degeneracion inherente del codigo genetico, en la practica de la presente invencion se pueden usar moleculas de acido nucleico que codifican sustancialmente el mismo polipeptido o un polipeptido funcionalmente equivalente para la clonacion y expresion de una protema de R-espondina, p.ej. de Rspo2 o 3. Estas secuencias de aDn incluyen aquellas que son capaces de hibridarse con las secuencias de R-espondina de Xenopus, murina y/o humana en condiciones estrictas. Hibridacion en condiciones estrictas significa preferiblemente que se observa una senal de hibridacion positiva despues de lavar durante 1 h con 1 x tampon SSC y SDS al 0,1%, preferiblemente a 55°C, con mayor preferencia a 62°C y sobre todo a 68°C, en particular durante 1 h en 0,2 x tampon SSC y SDS al 0,1%, a 50°C, preferiblemente a 55°C, con mayor preferencia a 62°C y sobre todo a 68°C.
Las moleculas de acido nucleico segun la presente invencion se pueden disenar con el fin de alterar la secuencia codificadora de R-espondina para varios fines, incluyendo, sin limitarse a ellas, las alteraciones que modifican el procesamiento y/o la expresion del producto genico. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones mediante el uso de tecnicas bien conocidas del estado tecnico, como p.ej. mutagenesis sitio-dirigida, para insertar nuevos sitios de restriccion, alterar patrones de glicosilacion, fosforilacion, etc. Por ejemplo, en ciertos sistemas de expresion como en las levaduras las celulas huesped pueden sobreglicosilar el producto genetico. Cuando se usan estos sistemas de expresion puede ser preferible alterar la secuencia codificadora de Rspo2 o 3 para eliminar cualquier sitio de glicosilacion unido a N.
En otro aspecto, la secuencia de acido nucleico de R-espondina se puede ligar a una secuencia heterologa para codificar una protema de fusion. Por ejemplo, para cribar bibliotecas de peptidos puede ser util codificar una protema quimerica de R-espondina que exprese un epftopo heterologo capaz de ser reconocido por un anticuerpo disponible comercialmente. Tambien se puede disenar una protema de fusion que contenga un sitio de corte situado entre la secuencia de R-espondina y la secuencia de protema heterologa, a fin de que la porcion de R-espondina se pueda separar de la porcion heterologa.
Segun un aspecto alternativo, la secuencia codificadora de acido nucleico se puede sintetizar total o parcialmente empleando metodos qmmicos bien conocidos del estado tecnico. Vease por ejemplo Caruthers, y otros, 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7: 215-233; Crea and Horn, 180, Nuc. Acids Res. 9(10): 2331; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21: 719; y Chow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12): 2807-2817. Como alternativa, la propia protema se puede producir empleando metodos qmmicos para sintetizar total o parcialmente la secuencia de aminoacidos de la R-espondina. Por ejemplo, los peptidos se pueden sintetizar mediante tecnicas de fase solida, separarlos de la resina y purificarlos por cromatograffa lfquida preparativa de alta resolucion (p.ej. vease Creighton, 1983, Proteins Structures And Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N.Y. pp. 50-60). La composicion de los peptidos sinteticos se puede confirmar por analisis o secuenciacion de aminoacidos (p.ej. segun el procedimiento de degradacion de Edman; vease Creighton, 1983, Proteins, Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., N.Y., pp. 34-49).
Para expresar un polipeptido de R-espondina biologicamente activo, la secuencia nucleotida que codifica dicho polipeptido se inserta en un vector de expresion adecuado, es decir un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripcion y traduccion de la secuencia codificadora insertada. Los productos genicos de Rspo, asf como
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las celulas huesped o las lmeas celulares transfectadas o transformadas con vectores de expresion recombinante se pueden usar para varios fines, incluyendo, sin limitarse a ellos, la generacion de anticuerpos (es decir monoclonales o policlonales) que se unen a la R-espondina, como los que “neutralizan” la actividad de la R-espondina.
Se pueden usar metodos bien conocidos de los especialistas en la materia para construir vectores de expresion que contengan la secuencia codificadora de R-espondina y senales de control de transcripcion/traduccion apropiadas. Estos metodos incluyen tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y de recombinacion in vivo / recombinacion genetica. Veanse por ejemplo las tecnicas descritas en Maniatis y otros, 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel y otros, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
Para expresar la secuencia codificadora de R-espondina se pueden usar varios sistemas de vectores de expresion en huesped, incluyendo, sin limitarse a ellos, microorganismos como bacterias transformadas con ADN bacteriofago recombinante, con vectores de expresion de ADN plasmido o ADN cosmido que llevan la secuencia codificadora de R-espondina; celulas de levadura transformadas con vectores de expresion de levadura recombinante que llevan la secuencia codificadora de R-espondina; sistemas de celulas de insectos infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes (p.ej. baculovirus) que contienen la secuencia de codificacion de Rspo2 o 3; sistemas de celulas vegetales infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes (p.ej. virus del mosaico de la coliflor, VMCF; virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformadas con vectores de expresion plasmidos recombinantes (p.ej. plasmido Ti) que contienen la secuencia de codificacion de R-espondina; o sistemas de celulas animales infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes (p.ej. adenovirus, virus vacuna), incluyendo lmeas celulares creadas por ingeniena genetica para contener copias multiples del ADN de R-espondina amplificadas de forma estable (CHO/dhfr) o inestable en cromosomas doble minuto (p.ej. lmeas celulares murinas).
En otro aspecto, los polipeptidos de R-espondina, p.ej. Rspo2 y/o Rspo3, y los acidos nucleicos de R-espondina que expresan una R-espondina se pueden usar para cribar reguladores, efectores o moduladores de R-espondina que actuan como agonistas o antagonistas la angiogenesis o de la vasculogenesis. Por ejemplo, los anticuerpos capaces de neutralizar la actividad de R-espondina, p.ej. de Rspo3, en un ensayo de proliferacion endotelial, en un ensayo MCA de pollo y/o en un ensayo de diferenciacion de zMv de Xenopus se pueden utilizar para inhibir la funcion de la R-espondina. Asimismo, los anticuerpos anti-Rspo3 que imitan la actividad del FCEV se pueden seleccionar para aplicaciones proangiogenicas, p.ej. en la curacion de heridas. Como alternativa, el cribado de bibliotecas de peptidos o compuestos organicos con polipeptidos solubles de R-espondina expresados de forma recombinante, o con imeas celulares o animales transgenicos no humanos que expresan un polipeptido de R-espondina, puede ser util para identificar moleculas terapeuticas que funcionan modulando, p.ej. inhibiendo, la actividad biologica de R-espondina y que por lo tanto sirven como reguladores, efectores o moduladores de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis o como reguladores, efectores o moduladores de R-espondina, p.ej. como antagonistas de R-espondina.
En otro aspecto, las lmeas celulares creadas por ingeniena genetica y/o los animales transgenicos no humanos que muestran una expresion modificada de R-espondina, p.ej. una expresion de R-espondina aumentada o disminuida en comparacion con las lmeas celulares o los animales de tipo natural, se pueden usar para cribar e identificar tanto antagonistas como agonistas. Los compuestos sinteticos, productos naturales y otras fuentes de materiales activos con potencial biologico se pueden cribar de varias maneras para identificar reguladores, efectores o moduladores de R-espondina. La capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir la actividad de un polipeptido de R-espondina se puede medir por medio de un ensayo de proliferacion endotelial, un ensayo MCA de pollo y/o un ensayo de diferenciacion de ZMV de Xenopus como los descritos en los ejemplos.
Las moleculas capaces de unirse a un polipeptido de R-espondina se pueden identificar detectando un compuesto, p.ej. una biblioteca de peptidos con un polipeptido soluble recombinante de R-espondina. Para identificar y aislar un compuesto que interactua y forma un complejo con R-espondina es preferible marcar o “etiquetar” el polipeptido de R-espondina. El polipeptido de R-espondina se puede conjugar con grupos marcadores, p.ej. enzimas tales como la fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante o con otros reactivos tales como los marcadores fluorescentes, incluyendo el isotiocianato de fluorescema (ITCF), la ficoeritrina (FE) o la rodamina. La conjugacion de cualquier marcador determinado con R-espondina se puede realizar empleando tecnicas rutinarias del estado tecnico. Existe un polipeptido que contiene un epftopo para el cual hay un anticuerpo comercialmente disponible. El anticuerpo espedfico del epftopo se puede marcar mediante metodos bien conocidos del estado tecnico, incluyendo el marcaje con enzimas, colorantes fluorescentes o perlas magneticas.
El conjugado del polipeptido de R-espondina “etiquetado” se puede incubar con una biblioteca de compuestos inmovilizados en condiciones adecuadas, p.ej. durante 30 minutos hasta una hora a 22°C, para permitir la formacion de un complejo entre el polipeptido de R-espondina y un compuesto individual de la biblioteca. Despues se lava la biblioteca para eliminar cualquier polipeptido de R-espondina no fijado. Si la R-espondina ha sido conjugada con fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante, la biblioteca completa se puede verter en una placa de petri que contenga un substrato adecuado, tanto para la fosfatasa alcalina como para la peroxidasa, por ejemplo 5-bromo-4- cloro-3-indoM fosfato (BCIF) o 3,3',4,4”-diaminobencidina (DAB), respectivamente. Tras incubar varios minutos, el complejo compuesto/fase solida-R-espondina cambia de color y se puede identificar con facilidad y aislar ffsicamente con un micromanipulador bajo un microscopio de diseccion. Si se ha utilizado una molecula de R-espondina con
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marcaje fluorescente, los complejos se pueden aislar mediante clasificacion activada por fluorescencia. Si se ha utilizado un polipeptido quimerico de R-espondina que exprese un epftopo heterologo, el complejo compuesto/R- espondina se puede detectar con un anticuerpo marcado espedfico del epftopo. Una vez aislado, la identidad del compuesto unido al soporte de fase solida se puede determinar p.ej. mediante secuenciacion peptidica.
Las lrneas celulares o los animales transgenicos no humanos que expresan R-espondina, p.ej. R-espondina-3, se pueden emplear para cribar reguladores, efectores o moduladores de R-espondina de varias maneras.
La capacidad de un regulador, efector o modulador de R-espondina para interferir en la actividad de la R-espondina y/o en la senal de transduccion de R-espondina se puede medir mediante un ensayo de proliferacion endotelial, un ensayo MCA de pollo y/o un ensayo de diferenciacion de ZMV de Xenopus. Otras respuestas, como la activacion o supresion de la actividad catalftica, la fosforilacion o desfosforilacion de otras proternas, la activacion o modulacion de la produccion de segundos mensajeros, los cambios en los niveles celulares de iones, la asociacion, disociacion o translocacion de moleculas senalizadoras, o la transcripcion o traduccion de genes espedficos, tambien se puede controlar. Estos ensayos se pueden realizar empleando tecnicas convencionales desarrolladas para dichos fines, en el curso del cribado.
La union del ligando a su receptor celular a traves de las vfas de transduccion de senales puede afectar a varios procesos celulares. Los procesos celulares bajo el control de la via senalizadora de R-espondina pueden incluir, sin limitarse a ellos, las funciones celulares normales, la proliferacion y la diferenciacion celular, la conservacion de la forma y adhesion celular, ademas de procesos anormales o potencialmente deletereos, tales como la proliferacion celular incontrolada, la perdida de la inhibicion por contacto, el bloqueo de la diferenciacion o la muerte celular. La observacion cualitativa o cuantitativa y la medicion de cualquiera de los procesos celulares descritos por tecnicas conocidas de la especialidad se pueden utilizar ventajosamente como medio de valoracion de la transduccion de senales en el curso del cribado.
Se describen varias formas de ejecucion para el cribado, identificacion y evaluacion de compuestos que interaction con R-espondina, los cuales pueden afectar a varios procesos celulares bajo el control de la via senalizadora de R- espondina.
Se revela un metodo para identificar un regulador, efector o modulador de R-espondina, que consiste en:
(a) poner en contacto el supuesto regulador, efector o modulador de R-espondina con un polipeptido de R- espondina, en forma pura o semipura, o en una celula totalmente viva o fijada o en un animal transgenico no humano;
(b) medir el efecto del supuesto regulador, efector o modulador de R-espondina en el polipeptido de R-espondina, en la actividad de la R-espondina y/o en una propiedad fenotfpica de la celula o del organismo mediado por la R- espondina;
(c) comparar el efecto medido con el obtenido sin el supuesto regulador, efector o modulador de R-espondina, determinando si el supuesto regulador, efector o modulador de R-espondina estimula o inhibe la respuesta celular de la R-espondina.
Las R-espondinas, como p.ej. Rspo3, que sirven para identificar un regulador, efector o modulador de R-espondina pueden ser equivalentes funcionalmente a la R-espondina. Un equivalente funcional de R-espondina se puede preparar partiendo de una R-espondina, de procedencia natural o expresada por recombinacion, mediante division proteolftica seguida de procedimientos convencionales de purificacion conocidos de los especialistas en la materia. Alternativamente, el derivado funcional se puede producir por tecnologfa de ADN recombinante, expresando las partes de R-espondina que incluyen el dominio funcional en celulas adecuadas. Los derivados funcionales tambien se pueden sintetizar qmmicamente. Las celulas que expresan Rspo3 se pueden usar como fuentes de R-espondina, cruda o purificada, para analizarlas en estos ensayos. Como alternativa, en estos ensayos se pueden emplear directamente celulas totalmente vivas o fijadas.
La actividad transductora de senales de R-espondina se puede medir llevando a cabo un ensayo de proliferacion endotelial, un ensayo MCA de pollo y/o un ensayo de diferenciacion de ZMV de Xenopus y/o siguiendo los procesos celulares controlados por la senal.
Tambien se revela un metodo que permite identificar una molecula capaz de unirse a un polipeptido de R-espondina, el cual consiste en:
(a) inmovilizar un polipeptido de R-espondina o un equivalente funcional de la misma en una matriz de fase solida;
(b) poner en contacto la molecula con la matriz de fase solida producida en la etapa (a), durante un tiempo suficiente para permitir la union de la molecula;
(c) eliminar de la matriz de fase solida por lavado cualquier material no unido a ella;
(d) detectar la presencia de la molecula unida a la fase solida.
El metodo anterior puede incluir la etapa adicional de:
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(e) eluir la molecula unida de la matriz de fase solida, para aislarla.
El metodo anterior puede incluir la etapa adicional de:
(f) identificar la molecula eluida.
Para producir anticuerpos destinados a los epftopos de un polipeptido de R-espondina, como p.ej. Rpo2 o Rspo3, se pueden usar varios procedimientos conocidos del estado tecnico.
Los anticuerpos monoclonales que se unen a un polipeptido de R-espondina se pueden marcar radiactivamente para poder seguir su localizacion y distribucion en el cuerpo despues de la inyeccion. Los anticuerpos marcados con radiactividad se pueden utilizar como herramienta de diagnostico no invasiva para obtener imagenes de la nueva vascularizacion relacionada con enfermedades cuyo tratamiento implica la inhibicion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis.
Asimismo se pueden disenar inmunotoxinas que dirijan agentes citotoxicos a sitios espedficos del cuerpo. Por ejemplo, se pueden complejar covalentemente anticuerpos monoclonales muy afines, espedficos de R-espondina, a toxinas bacterianas o vegetales tales como la toxina difterica, la abrina o la ricina. Un metodo general de preparacion de moleculas Idbridas de anticuerpos puede implicar el uso de reactivos reticulantes de tiol tales como el SPDP, que atacan los grupos amino primarios del anticuerpo y por intercambio de disulfuro unen la toxina al anticuerpo. Los anticuerpos hfbridos se pueden emplear para eliminar espedficamente las celulas endoteliales que expresan de R- espondina.
Para producir los se pueden inmunizar por inyeccion del polipeptido de R-espondina varios animales huesped, incluyendo, sin limitarse a ellos, conejos, ratones, ratas, etc. Para aumentar la respuesta inmunologica se pueden usar varios adyuvantes en funcion de la especie huesped, incluyendo, sin limitarse a ellos, el adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales como el hidroxido de aluminio, sustancias surfactantes tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente utiles como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Los anticuerpos monoclonales para R-espondina se pueden preparar usando cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo por cultivo continuo de lmeas celulares, incluyendo, sin limitarse a ellas, la tecnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein, (Nature, 1975, 256: 495-497), la tecnica del hibridoma de celulas B humanas (Kosbor y otros, 1983, Immunology Today, 4: 72; Cote y otros, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 2026-2030) y la tecnica del hibridoma de EBV (Cole y otros, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Ademas se pueden utilizar tecnicas desarrolladas para producir “anticuerpos quimericos” (Morrison y otros, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberger y otros, 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda y otros, 1985, Nature, 314: 452-454) cortando y empalmando genes de una molecula de anticuerpo de raton, adecuadamente espedfico del antfgeno, con genes de una molecula de anticuerpo humano de actividad biologica apropiada. Como alternativa, las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos de cadena simple (vease la patente U.S. n°. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena simple espedficos de R-espondina.
Los fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de union espedficos para Rspo3 se pueden generar mediante tecnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, sin limitarse a ellos: los fragmentos F(ab')2 que pueden producirse por digestion de la molecula de anticuerpo con pepsina y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Como alternativa se pueden construir bibliotecas de expresion Fab (Huse y otros, 1989, Science, 246: 1275-1281) para permitir la identificacion rapida y facil de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para la R-espondina.
Los anticuerpos de los polipeptidos de R-espondina pueden ser antagonistas de la actividad de la R-espondina al evitar que esta se una a su pareja usual en la cascada de senalizacion de Wnt. Por tanto los anticuerpos que se unen espedficamente a la R-espondina, en particular a Rspo2 o Rspo3, pueden ser antagonistas de R-espondina utiles para inhibir la angiogenesis y/o de la vasculogenesis.
Ademas, las formas mutadas de R-espondina que tienen un efecto negativo dominante se pueden expresar en poblaciones de celulas diana para inhibir la actividad de la Rspo3 de tipo natural expresada endogenamente.
En el ambito de la presente invencion se incluyen acidos nucleicos antagonistas de R-espondina. Las moleculas de ARN y ADN antisentido actuan para bloquear directamente la traduccion de ARNm uniendose al ARNm diana y evitando la traduccion proteica. En cuanto al ADN antisentido se prefieren los oligodesoxirribonucleotidos derivados del sitio de inicio de la traduccion, p.ej. entre las regiones -10 y +10 de la secuencia nucleotida de R-espondina.
Los ribozimas son moleculas enzimaticas de ARN capaces de catalizar la division espedfica del ARN. El mecanismo de accion de los ribozimas implica la hibridacion espedfica de secuencia de la molecula de ribozima con el ARN diana complementario, seguida de una escision endonucleolftica. En el ambito de la presente invencion se disenan
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moleculas de ribozima con motivo de cabeza de martillo, que catalizan espedfica y eficientemente la division de secuencias de ARN de Rspo3.
En cualquier ARN diana potencial los sitios espedficos de division mediante ribozimas se identifican inicialmente escaneando la molecula diana para ver sitios de escision por ribozima que incluyan las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, en las secuencias cortas de ARN de 15 y 20 ribonucleotidos correspondientes a la region del gen diana que lleva el sitio de escision se pueden evaluar caractensticas estructurales pronosticadas, tales como la estructura secundaria, que pueden hacer inadecuada la secuencia oligonucleotida. La idoneidad de las posibles dianas tambien se puede evaluar experimentando su accesibilidad a la hibridacion con oligonucleotidos complementarios en ensayos de proteccion de ribonucleasa.
Las moleculas de ARNi son moleculas de ARN monocatenario o analogas de las mismas capaces de mediar en la interferencia por ARN de una molecula diana de ARNm, p.ej. moleculas de ARNip que son moleculas cortas de ARN bicatenario con una longitud preferible de 19-25 nucleotidos y opcionalmente al menos un extremo 3' protuberante, o precursores de las mismas o moleculas de ADN que las codifican. Las moleculas de ARN y ADN antisentido, los ribozimas y las moleculas de ARNi de la presente invencion se pueden preparar por cualquier metodo conocido del estado tecnico para sintetizar moleculas de ARN, incluyendo tecnicas bien conocidas del sector para sintetizar oligo- desoxirribonucleotidos como por ejemplo la smtesis qrnmica por el metodo de la fosforamidita en fase solida. Como alternativa las moleculas de ARN se pueden generar por transcripcion in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican la molecula de ARN antisentido. Estas secuencias de aDn se pueden incorporar a una amplia variedad de vectores que llevan promotores adecuados de ARN polimerasa tales como los promotores de T7 o SP6 polimerasa. Como alternativa se pueden introducir de forma estable en lmeas celulares constructos de ADNc antisentido que sintetizan ARN antisentido de manera constitutiva o inducible, dependiendo del promotor empleado.
En las moleculas de ADN se pueden introducir varias modificaciones como medio de incrementar la estabilidad intracelular y la vida media. Las posibles modificaciones incluyen, sin limitarse a ellas, la adicion de secuencias flanqueantes de derivados de morfolino, asf como ribo- o desoxi-nucleotidos, a los extremos 5' y/o 3' de la molecula o el uso de enlaces fosforotioato o 2' O-metilo en vez de enlaces fosfodiesterasa en el esqueleto del oligodesoxi- ribonucleotido.
La expresion y la actividad funcional de la Rspo3 estan relacionadas con el desarrollo del sistema vascular y la proliferacion celular, lo cual indica que la Rspo3 interviene en el proceso de vascularizacion. Las R-espondinas como Rspo2 o 3 inducen el FCEV y se ha demostrado que el FCEV es un factor de crecimiento mitogeno que actua exclusivamente en las celulas endoteliales (Ferrara, N. and Henzel, W. J., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 851-858).
En un aspecto, los polipeptidos de R-espondina como Rspo2 o 3 se pueden administrar in vivo para modular la angiogenesis y/o la vasculogenesis. Por ejemplo, la administracion de Rspo2 o 3 se puede usar en el tratamiento de enfermedades que requieren la promocion de la angiogenesis y/o la vasculogenesis, mientras que los antagonistas de Rspo2 o 3 se pueden emplear para tratar enfermedades que requieren la inhibicion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis.
En concreto se pueden usar agonistas de R-espondina para tratar enfermedades que requieren la promocion de la angiogenesis y/o la vasculogenesis. Mas concretamente, dichas enfermedades estan seleccionadas del grupo formado por curacion de heridas, regeneracion o desarrollo de tejidos y organos, procesos degenerativos vasculares (p.ej. isquemia cntica de extremidades o isquemia cerebral, enfermedad cardfaca isquemica), desarrollo embrionario y procesos reproductivos tales como el desarrollo del folfculo en el cuerpo luteo durante la ovulacion y el crecimiento de la placenta durante el embarazo. De manera espedfica dicha enfermedad esta seleccionada entre curacion de heridas, regeneracion o desarrollo de tejidos y organos, procesos degenerativos vasculares (p.ej. isquemia cntica de extremidades o isquemia cerebral, enfermedad cardfaca isquemica).
En un aspecto particular el agonista de R-espondina es un agonista de Rspo2 o de Rspo3.
En un aspecto particular, el agonista de R-espondina se elige entre un polipeptido de R-espondina, un acido nucleico de R-espondina o una molecula pequena. En concreto se puede usar un polipeptido de R-espondina para tratar enfermedades que requieren la promocion de la angiogenesis y/o la vasculogenesis. En un aspecto mas particular se puede emplear un acido nucleico de R-espondina para tratar enfermedades que requieren la promocion de la angiogenesis y/o la vasculogenesis.
En una forma de ejecucion particular de la presente invencion se pueden usar antagonistas de R-espondina para tratar enfermedades que requieren la inhibicion de la angiogenesis, como p.ej. el crecimiento tumoral y la actividad metastasica, la aterosclerosis, la estenosis, la restenosis, la retinopatfa, la degeneracion macular, la psoriasis y la artritis reumatoide. En una forma de ejecucion particular dicha enfermedad es el crecimiento de un tumor solido. En otra forma de ejecucion particular dicha enfermedad es degeneracion macular. En otra forma de ejecucion particular dicha enfermedad es artritis reumatoide.
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En una forma de ejecucion particular de la presente invencion el antagonista de R-espondina es un antagonista de Rspo2 o de Rspo3.
En una forma de ejecucion particular de la presente invencion el antagonista de R-espondina se selecciona entre un anticuerpo de R-espondina o un acido nucleico capaz de inhibir la traduccion, la transcripcion, la expresion y/o la actividad de la R-espondina. En una forma de ejecucion mas particular de la presente invencion se puede utilizar un anticuerpo de R-espondina para tratar las enfermedades que requieren la inhibicion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis. En una forma de ejecucion mas particular de la presente invencion se puede usar un acido nucleico capaz de inhibir la traduccion, la transcripcion, la expresion y/o la actividad de la R-espondina para tratar aquellas enfermedades que requieren la promocion de la angiogenesis y/o la vasculogenesis. En una forma de ejecucion mas particular de la presente invencion se puede usar un ARNip o acido nucleico antisentido contra R-espondina para tratar las enfermedades que requieren la inhibicion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis.
Los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina farmaceuticamente activos se pueden administrar tal cual a un paciente o en composiciones farmaceuticas en las que van mezclados con vetnculos o excipientes adecuados.
Dependiendo de las enfermedades concretas que se esten tratando, estos agentes se pueden formular y administrar sistemica o localmente. En la ultima edicion de “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pa., se pueden encontrar tecnicas de formulacion y administracion. Las modos de administracion adecuados pueden incluir, por ejemplo, la via oral, rectal, transmucosal o intestinal; la administracion parenteral, incluyendo la inyeccion intramuscular, subcutanea, intramedular, asf como la inyeccion intratecal, intraventricular directa, intraperitoneal, intranasal o intraocular, o, en el caso de tumores solidos, la inyeccion directa en un tumor solido. Para inyectarlos, los agentes de la presente invencion se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiologicamente compatibles tales como la solucion de Hanks, la solucion de Ringer o en tampon salino fisiologico. Para la administracion transmucosal se usan en la formulacion agentes de penetracion apropiados para permeabilizar la barrera. Estos agentes penetrantes son generalmente conocidos en la especialidad.
Los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina se pueden formular facilmente empleando vetnculos farmaceuticamente aceptables bien conocidos del estado tecnico, en dosis adecuadas para la administracion oral. Estos vetnculos permiten formular los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina conforme a la presente invencion en forma de tabletas, pfldoras, capsulas, lfquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para ingestion oral del paciente tratado.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para usar segun la presente invencion incluyen aquellas que llevan los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina en una cantidad efectiva para lograr el fin pretendido. Los expertos en la materia tienen la capacidad suficiente para determinar las cantidades efectivas, sobre todo a la luz de la exposicion detallada que aqrn se ofrece.
Ademas de los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina, estas composiciones farmaceuticas pueden contener vetnculos farmaceuticamente aceptables, incluyendo excipientes y sustancia auxiliares que facilitan la elaboracion de los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina en preparados de uso farmaceutico. Los preparados formulados para administracion oral pueden estar en forma de tabletas, grageas, capsulas o soluciones.
Las formulaciones farmaceuticas arriba reveladas se pueden producir mediante procedimientos ya conocidos, p.ej. por procesos convencionales de mezclado, disolucion, granulacion, grageado, levigacion, emulsion, encapsulacion, atrapamiento o liofilizacion.
Las formulaciones farmaceuticas para la administracion parenteral incluyen soluciones acuosas de los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina en forma soluble en agua. Ademas se pueden preparar suspensiones en aceite de los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina aptas para inyectar. Los disolventes o vetnculos lipofilos adecuados incluyen aceites grasos tales como el aceite de sesamo, o esteres sinteticos de acidos grasos tales como el oleato de etilo, o trigliceridos o liposomas. Las suspensiones acuosas inyectables pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, tales como la carboximetilcelulosa sodica, el sorbitol o el dextrano. Opcionalmente la suspension tambien puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina, con el fin de permitir la preparacion de soluciones altamente concentradas.
Los preparados farmaceuticos de uso oral se pueden obtener combinando los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina con un excipiente solido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante y procesando dicha mezcla de granulos despues de anadir sustancias auxiliares adecuadas, si se desea, a fin de obtener tabletas o nucleos de grageas. Como excipientes son particularmente adecuados rellenos tales como los azucares, incluyendo lactosa, sacarosa, manita o sorbita; los almidones de mafz, trigo, arroz, patata; gelatina y goma tragacanto; preparaciones celulosicas tales como, por ejemplo, metil-celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetil-celulosa sodica; y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea pueden anadirse agentes desintegrantes como polivinilpirrolidona reticulada, agar o acido algmico o una sal del mismo, tal como el alginato sodico.
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Los nucleos de grageas se recubren adecuadamente. Para ello se puede usar soluciones concentradas de azucar que opcionalmente pueden contener goma arabiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dioxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes organicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden anadir colorantes o pigmentos a los recubrimientos de las tabletas o grageas para identificar o caracterizar las distintas combinaciones de dosis de reguladores, efectores o moduladores de R-espondina.
Los preparados farmaceuticos de uso oral incluyen capsulas duras de gelatina, asf como capsulas blandas selladas de gelatina con un plastificante tal como glicerina o sorbita. Las capsulas duras pueden contener los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina mezclados con una sustancia de relleno como la lactosa, con aglutinantes como los almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato magnesico y, opcionalmente, estabilizantes. En las capsulas blandas, los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina pueden estar disueltos o suspendidos en lfquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina lfquida o polietilenglicoles lfquidos. Ademas se pueden agregar estabilizantes.
Las composiciones que llevan los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina formulados en un vetnculo farmaceuticamente compatible se pueden preparar, introducir en un recipiente idoneo y etiquetar para el tratamiento de una enfermedad indicada. Las enfermedades procedentes para indicar en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de un tumor tal como un glioma o glioblastoma, y otras cuyo tratamiento implique la inhibicion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis.
Las composiciones que llevan los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina de la presente invencion formulados en un vetnculo farmaceuticamente compatible se pueden preparar, introducir en un recipiente idoneo y etiquetar para el tratamiento de una enfermedad indicada. Las enfermedades procedentes para indicar en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de enfermedades que requieran la promocion de la angiogenesis y/o vasculogenesis, en particular la curacion de heridas.
Las composiciones farmaceuticas tambien pueden llevar vehnculos o excipientes adecuados, solidos o en fase gel. Los ejemplos de dichos vehnculos o excipientes incluyen, sin limitarse a ellos, carbonato calcico, fosfato calcico, varios azucares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polfmeros como los polietilenglicoles.
Muchos de los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina se pueden preparar como sales con contra- iones farmaceuticamente compatibles. Las sales farmaceuticamente compatibles se pueden formar con muchos acidos, incluyendo, sin limitarse a ellos, los acidos clorhndrico, sulfurico, acetico, lactico, tartarico, malico, succmico, etc. Las sales tienden a ser mas solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protonicos que las respectivas formas basicas libres.
La dosis terapeuticamente efectiva de cualquier regulador, efector o modulador de R-espondina usada en el metodo arriba expuesto puede estimarse inicialmente partiendo de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo se puede formular una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentracion circulante que incluya el valor IC50 determinado en el cultivo celular (es decir, la concentracion del compuesto ensayado que produce la inhibicion semimaxima de la actividad de la PTP). Esta informacion se puede usar para determinar con mayor exactitud las dosis utiles en humanos.
Una dosis terapeuticamente efectiva se refiere a la cantidad de regulador, efector o modulador de R-espondina que mejora los smtomas o prolonga la supervivencia del paciente. La toxicidad y la eficacia terapeutica de los citados reguladores, efectores o moduladores de R-espondina se puede determinar mediante procedimiento farmaceuticos estandar en cultivos celulares o en animales de experimentacion, p.ej. para determinar el valor LD50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion) y el valor ED50 (la dosis terapeuticamente efectiva en el 50% de la poblacion). El cociente de dosificacion entre efectos toxicos y terapeuticos es el mdice terapeutico y se puede expresar como la relacion ED50/LD50. Se prefieren los reguladores, efectores o moduladores de R-espondina que dan los mayores indices terapeuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y de los estudios con animales pueden utilizarse para fijar un intervalo de dosificacion destinado al uso en humanos. La dosificacion de tales reguladores, efectores o moduladores de R-espondina esta comprendida preferiblemente en un intervalo de concentraciones circulantes que incluye el valor eD50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo en funcion de la forma de dosificacion y de la via de administracion utilizadas. La formulacion exacta, la via de administracion y la dosificacion se pueden elegir por cada medico a la vista del estado del paciente (vease p.ej. Fingl y otros, 1975, en “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p1).
La cantidad y el intervalo de dosificacion se pueden ajustar individualmente para aportar al plasma unos niveles de reguladores, efectores o moduladores de R-espondina que sean suficientes para mantener los efectos de inhibicion o promocion de la Rspo3. Las dosis usuales para la administracion sistemica a un paciente estan comprendidas en un intervalo de 1-2000 mg/dfa, normalmente de 1-250 mg/dfa y tfpicamente de 10-150 mg/dfa. Referidas al peso corporal del paciente las dosis usuales vanan entre 0,02-25 mg/kg/dfa, normalmente 0,02-3 mg/kg/dfa, tfpicamente 0,2-1,5 mg/kg/dfa. Referidas a zonas superficiales del paciente las dosis usuales vanan entre 0,5-1200 mg/m2Ma, normalmente 0,5-150 mg/m2/dfa, tfpicamente 5-100 mg/m2/dfa.
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La cantidad y el intervalo de dosificacion se pueden ajustar individualmente para aportar al plasma unos niveles del regulador, efector o modulador de R-espondina que sean suficientes para mantener los efectos de inhibicion o promocion de la R-espondina. Los niveles medios habituales en plasma debenan mantenerse entre 50-5000 pg/ml, normalmente 50-1000 pg/ml y tipicamente 100-500 pg/ml.
Como alternativa, el regulador, efector o modulador de R-espondina se puede administrar localmente en lugar de sistemicamente, por ejemplo inyectando el regulador, efector o modulador de R-espondina directamente a un tumor, a menudo mediante una formulacion para absorcion gradual o liberacion prolongada.
La composicion farmaceutica tambien se puede administrar mediante un sistema de liberacion dirigida del farmaco, por ejemplo en un liposoma recubierto con anticuerpo espedfico del tumor. Los liposomas son dirigidos y absorbidos selectivamente por el tumor.
En los casos de administracion local o absorcion selectiva puede ser que la concentracion localmente efectiva de la composicion farmaceutica no tenga relacion con la concentracion en el plasma.
Los acidos nucleicos de R-espondina o los compuestos capaces de unirse a la R-espondina, como los anticuerpos, se pueden usar con fines diagnosticos para detectar la expresion de R-espondina en los procesos, enfermedades o trastornos relacionados con la angiogenesis y/o la vasculogenesis.
Los reactivos adecuados para detectar R-espondinas, como los acidos nucleicos de R-espondina o los compuestos capaces de unirse a la R-espondina, pueden tener varios usos para el diagnostico de procesos, enfermedades o trastornos resultantes de la expresion aberrante de R-espondina, relacionados con la misma y/o acompanados de ella. Los metodos de diagnostico se llevan a cabo preferiblemente en muestras obtenidas de un sujeto, p.ej. de un paciente humano, p.ej. muestras de fluidos corporales como sangre entera, plasma, suero u orina, o de muestras de tejidos como las obtenidas por biopsia o autopsia. Por ejemplo, la secuencia de R-espondina se puede utilizar en amplificacion, p.ej. en ensayos de hibridacion, para diagnosticar anormalidades en la expresion de R-espondina; p.ej. en analisis Southern o Northern blot, incluyendo los ensayos de hibridacion in situ.
El ADNc de R-espondina se puede usar como sonda para detectar la expresion del correspondiente ARNm. En un ejemplo espedfico aqrn descrito se analizo la expresion del ARNm de Rspo3 en embriones de raton (FIG. 4). El ARNm de Rspo3 se encontro enriquecido en los vasos embrionarios, lo cual indica que la Rspo3 interviene en la proliferacion de celulas endoteliales.
La presente invencion se explica tambien con mayor detalle mediante el siguiente ejemplo.
6 EJEMPLO
6.1 MATERIALES Y METODOS Secuencias codificadoras de Rspo
La secuencia codificadora de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos deducidos de los genes de R-espondina de raton y de Xenopus depositadas en el banco genetico aqrn utilizado son
X. laevis R-espondina-2 [gi:54145367] (SEQ ID NO: 1)
X. tropicalis R-espondina-3 [gi:114149217] (SEQ ID NO: 2)
M. musculus R-espondina-3 [NM_028351] (SeQ ID NO: 3)
Embriones de raton y de Xenopus
Se aparearon ratones BALB/c durante la noche y la manana en que se detecto el tapon vaginal se definio como 1/2 dfa de gestacion. Para los analisis histologicos rutinarios, los tejidos se fijaron en paraformaldeddo al 4% durante la noche y se incluyeron en cera de parafina para poder cortarlos. Se cortaron respectivamente secciones de 4 mm y se tineron con hemalum y eosina. Para la hibridacion in situ de los embriones enteros, estos se fijaron y procesaron del modo descrito (del Barco y otros, 2003, Genes Dev. 17, 2239-2244). Los embriones de Xenopus se obtuvieron mediante fertilizacion in vitro y se cultivaron del modo descrito (Gawantka y otros, 1995 EMBO J. 14, 6268-79). Los embriones de Xenopus se fijaron y procesaron del modo descrito para la hibridacion in situ de los embriones enteros (Bradley y otros, 1996 Development 122, 2739-2750). La zona marginal ventral se escindio y se cultivo del modo descrito (Gawantka y otros, 1995 EMBO J. 14, 6268-79). Para generar ribosondas antisentido se usaron ADNc de Rspo3 de longitud completa.
Siguiendo procedimientos estandar se obtuvieron ratones KO de Rspo3 por mutagenesis dirigida de Rspo3 murina (gi:94388197) en celulas madre embrionarias de raton, utilizando un vector direccional mostrado en la FIG. 5. Los ratones transgenicos se generaron sobre un fondo de C57BL/6 por inyeccion de diploides estandar. Los embriones mutantes homocigotos fueron generados por entrecruzamientos heterocigoticos. Luego los C57BL heterocigotos se
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retrocruzaron con hembras CD1 durante al menos 6 generaciones. No se detecto ninguna diferencia importante entre los embriones homocigotos en el fondo genetico de C57BL/6 y CD1. Para determinar el genotipo por PCR se usaron puntas de cola, sacos vitelinos o embriones de raton. El genotipado se realizo rutinariamente por analisis de PCR con 3 cebadores: 5'-ATGCTTTGAGGCTTGTGACC-3' (SEQ ID NO: 4), 5'-TGCACCGACTCCAGTACTGG-3' (SEQ ID NO: 5) y 5'-TACATTCTGGTTTCTCATCTGG-3' (SEQ ID NO: 6).
RT-PCR
Los ensayos de RT-PCR se llevaron a cabo del modo descrito (Gawantka y otros, 1995 EMBO J. 14,6268-79); los cebadores adicionales fueron: (directo, actcaccctccagacaagaa (SEQ ID NO: 7); inverso, atttaatcaccgctgcccac (SEQ ID NO: 8)); a-globina (directo, tccctcagaccaaaacctac (SEQ ID NO: 9); inverso, cccctcaattttatgctggac (SEQ ID NO: 10)); Xmsr (directo, aacttcgctctcgctcctccatac (SEQ ID NO: 11); inverso, gccagcagatagcaaacaccac (SEQ ID NO: 12)), FCEV (directo, aggcgagggagaccataaac (SEQ ID NO: 13); inverso, tctgctgcattcacactgac (SEQ ID NO: 14)).
Preparacion de un medio acondicionado con Rspo2 de Xenopus laevis
Del modo descrito (Kazanskaya y otros, 2004, Dev. Cell 7, 525-534) se transfectaron celulas HEK293T con Rspo2 de Xenopus laevis (gi:54145367) y se extrajeron del medio acondicionado.
Ensayo de proliferacion endotelial
Se cultivaron celulas endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (PromoCell) en medio de cultivo de celulas endoteliales (Promocell) suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%. Para los estudios de proliferacion las celulas se cultivaron en placas de 96 pocillos hasta el 50% de confluencia, al dfa siguiente se suplementaron con las protemas FCEV y Rspo2 de Xenopus laevis durante 48 h, tras lo cual se anadio BrdU (10 pM) a cada pocillo durante 4 h. El analisis de proliferacion celular con BrdU se realizo mediante el uso del kit “Cell Proliferation ELISA, BrdU” quimioluminescente de Roche Applied Science.
Ensayo de membrana corioalantoidea (MCA)
Para el ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (MCA) se incubaron huevos de pollo a 37°C en una camara humidificada. Al tercer dfa de desarrollo se practico una ventana en la cascara externa y al sexto dfa de desarrollo se pusieron en la superficie de la MCA 20 pl de Rspo2 o perlas de control o un disco filtrante (Whatman 3MM de 8 mm de diametro) que llevaba FCEV recombinante (Sigma-Aldrich, 100 ng/filtro). Las perlas (ANTI-FLAG M2-Agarosa, Sigma) se incubaron por la noche con medio acondicionado con Rspo2 de Xenopus laevis o con medio de control procedente de celulas HEK 293T no transfectadas y se lavaron 3 veces en SBF. Despues de 5 dfas de incubacion los discos filtrantes y la MCA adherida se escindieron, se lavaron con SBF y se prepararon para analisis histologico, tinendolos con hematoxilina-eosina.
Oligonucleotido antisentido morfolino
Basandose en la secuencia del ADNc de Rspo3 de Xenopus tropicalis (gi:114149217) se designo un oligonucleotido antisentido morfolino (secuencia: 5': atgcaattgcgactgctttctctgt (sEq ID NO: 15)).
6.2 RESULTADOS
La FIG.1 demuestra que un oligonucleotido antisentido morfolino dirigido contra la Rspo3 de Xenopus tropicalis inhibio el desarrollo de la formacion de vasos sangumeos en renacuajos de Xenopus. Un marcador de la formacion de vasos sangumeos es el gen msr, que fue regulado a la baja. La inhibicion del desarrollo de los vasos sangumeos - en otras palabras, de la angiogenesis embrionaria - va acompanada de la expansion del desarrollo de celulas sangumeas, ya que los marcadores de las celulas sangumeas a-globina y SCL han aumentado. Los resultados indican que la Rspo3 es un regulador que cambia el destino celular entre desarrollo de celulas de la sangre y vasos sangumeos. La especificidad del fenotipo inducido por morfolino para la inhibicion de Rspo3 esta demostrada en el ensayo de recuperacion de la FIG. 2. En este experimento la molecula relacionada Rspo2 fue capaz de revertir la expansion del marcador sangumeo a-globina.
La capacidad de la Rspo2 para promover la angiogenesis en embriones de Xenopus se demuestra en un ensayo de zonas marginales ventrales (ZMV) en la FIG. 3. La sobreexpresion del ARNm de Rspo2 inhibe los marcadores de las celulas sangumeas e induce el marcador endotelial msr, asf como el factor angiogenico FCEV. Inversamente, la necesidad de Rspo3 endogena para la angiogenesis embrionaria se demuestra mediante la inhibicion del msr y del FCEV por un oligonucleotido antisentido morfolino.
Mediante los ejemplos de las FIGs. 1-3 se demuestra que la inhibicion de Rspo3 en un vertebrado inhibe el FCEV, la vasculogenesis y la angiogenesis. Por lo tanto los antagonistas de Rspo3 seran utiles para inhibir deliberadamente el FCEV, la vasculogenesis y la angiogenesis allf donde sea necesario, p.ej. en estados cuyo tratamiento implica la inhibicion de la vasculogenesis y/o de la angiogenesis.

Claims (9)

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    REIVINDICACIONES
    1. Uso de un polipeptido de R-espondina-2 o 3 o de un acido nucleico de de R-espondina-2 o 3 para elaborar un medicamento destinado al tratamiento de un estado patologico que se beneficia de la promocion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis.
  2. 2. Uso segun la reivindicacion 1 para promover la curacion de heridas, la regeneracion o el desarrollo de tejidos y organos, el desarrollo embrionario y/o los procesos reproductivos, o para inhibir los procesos degenerativos, en particular los procesos degenerativos vasculares de tipo isquemico como la isquemia crftica de las extremidades, la isquemia cerebral o la enfermedad ca^aca isquemica.
  3. 3. Uso de un antagonista de R-espondina-2 o 3 para elaborar un medicamento destinado al tratamiento de un estado patologico que se beneficia de la inhibicion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis, de manera que el antagonista de la R-espondina-2 o 3 es un anticuerpo anti-R-espondina-2 o anti-R-espondina-3, o una molecula antisentido o una molecula de ARNip.
  4. 4. Uso segun la reivindicacion 3, en que el antagonista de la R-espondina-2 o 3 es un anticuerpo anti-R- espondina-2.
  5. 5. Uso segun la reivindicacion 3, en que el antagonista de la R-espondina-2 o 3 es un anticuerpo anti-R- espondina-3.
  6. 6. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en que el anticuerpo es un anticuerpo recombinante policlonal, monoclonal, quimerico o humanizado, o un anticuerpo de cadena simple o un fragmento del mismo.
  7. 7. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  8. 8. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
  9. 9. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 3-8 para la prevencion o el tratamiento de enfermedades cuyo tratamiento implica la inhibicion de la angiogenesis y/o de la vasculogenesis, en particular para el tratamiento del crecimiento tumoral, sobre todo de tumores solidos, de la artritis reumatoide, aterosclerosis, estenosis, restenosis, retinopatfa, degeneracion macular o psoriasis.
    imagen1
    a-globina
    Control
    Mo
    Rspo3
    Mo
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    Control Mo Rspo3 Mo ARNm de Rspo2
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    CO
    O)
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    No inyectado
    Control Mo Rspo3 Mo xRspo2
    imagen5
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    Q)
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    00
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    imagen10
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    ATG hi Ejanl
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    . alelo convencional
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