JPH08509358A

JPH08509358A - 神経内分泌腫瘍で発現されるδ様遺伝子

Info

Publication number: JPH08509358A
Application number: JP6510414A
Authority: JP
Inventors: ラボルダ，ホルヘ
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1992-12-11
Filing date: 1993-12-10
Publication date: 1996-10-08
Also published as: EP0673390B1; WO1994013701A2; DK0673390T3; CA2151455A1; EP0673390A1; DE69329037D1; AU5746894A; ES2151542T3; PT673390E; EP1013762A2; US5644031A; US5580738A; DE69329037T2; AU677623B2; ATE194653T1; EP1013762A3; WO1994013701A3

Abstract

(57)【要約】ポリヌクレオチド分子ｄｌｋは、小細胞肺癌を含む神経内分泌腫瘍で発現される。ｄｌｋポリヌクレオチド分子によってコードされるＤｌｋポリペプチドを使用して、原発性又は続発性神経内分泌腫瘍の存在を検出することができる。神経内分泌腫瘍の検出や治療で有用なＤｌｋに対するモノクローナル抗体を産生する。

Description

【発明の詳細な説明】神経内分泌腫瘍で発現されるδ様遺伝子発明の背景多能性又は前駆細胞から分化成熟細胞への発達中における遺伝子の発現は、このような前駆細胞に由来する腫瘍形成細胞の研究の手掛かりとなると考えられる。ある種の造血又は上皮腫瘍において、悪性遺伝子発現は腫瘍が由来する組織の正常発達中に観察される発現と実質的に相関する。Ｇｏｒｄｏｎら，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０８：１１８７（１９８９）；Ｇｏｄａｌら，Ａｄｖ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．３６：２１１（１９８２）。実際に、細胞運動及び組織再生を含む前駆細胞の多くの生物活性は、転移及び腫瘍浸潤等の癌細胞の病理活性に類似する。小児期のヒトに罹患する副腎腫瘍の１種である神経芽細胞腫においても、腫瘍生態はその前駆細胞（神経芽細胞）の正常分化及び形態発生の生態と相関する。神経芽細胞腫は未分化及び分化両者の組織病理を示す胚性腫瘍である。神経芽細胞腫の発達は、その起源組織である副腎の組織発達中に認められる段階によく似ている。Ｃｏｏｐｅｒら，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈａｎｄＤｉｆｆ．１：１４９（１９８９）。ヒト副腎髄質神経芽細胞から成熟クロム親和性細胞への発達中には、４種の異なる遺伝子が順次発現される。神経芽細胞が神経内分泌経路に沿って分化するように誘導されると、クロム親和性成熟の進行段階は遺伝子ＴＨ、ＣＧＡ、ｐＧ２及びＢ２Ｍの一時的発現により表される（Ｃｏｏｐｅｒ，前出，１５３頁）。Ｃｏｏｐｅｒは、神経芽細胞腫細胞におけるこれらの４種のマーカーの遺伝子発現のパターンが、異なる３つの発達段階中に阻止される正常な副腎神経芽細胞の遺伝子発現パターンによく似ていることを知見した。これらのマーカー遺伝子の１種であるｐＧ２は、成人副腎の腫瘍である褐色細胞腫で最初に同定された（Ｈｅｌｍａｎら，ＰＮＡＳＵＳＡ８４：２３２６（１９８７））。Ｈｅｌｍａｎは、ｐＧ２が正常なヒト副腎細胞でも高度に発現されることを報告した。Ｈｅｌｍａｎはヒト副腎ｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡを単離し、３０．６キロダルトン（ｋＤａ）の推定分子量を有する２８６アミノ酸を含む対応するｐＧ２タンパク質を同定した（Ｈｅｌｍａｎら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８（３）：６８５（１９９０））。特にｐＧ２発現は副腎では非悪性組織に制限されるので、遺伝的方法により褐色細胞腫又は神経芽細胞腫を検出するためには、ｐＧ２と同様の、発達過程で発現が制御される遺伝子が有用であろう。発明の要約従って、本発明の目的は原発性もしくは続発性褐色細胞腫もしくは神経芽細胞腫の検出方法又はこれらの腫瘍の段階の診断方法を提供するために遺伝子アッセイで使用可能な新規単離ポリヌクレオチド分子ｄｌｋを提供することである。本発明の別の目的は、遺伝子アッセイでｄｌｋポリヌクレオチド分子を使用して、原発性もしくは続発性小細胞肺癌（以下、ＳＣＬＣと呼称する）を検出する方法、又はＳＣＬＣの腫瘍進行段階を診断する方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、対応するＤｌｋポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子ｄｌｋを提供することである。Ｄｌｋポリペプチドは、Ｄｌｋポリペプチドのエピトープに対して特異性を有するモノクローナル又はポリクローナル抗体を生成するために有用である。原発性又は続発性神経内分泌腫瘍の検出には、Ｄｌｋ特異抗体、特に標識モノクローナルＤｌｋ特異抗体が有用である。本発明によると、毒素に結合したＤｌｋ特異的モノクローナル抗体は、原発性又は続発性神経内分泌腫瘍の治療にも有用である。本発明の上記及び他の目的を達成するにあたり、本発明の１態様により、ＤｌｋポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む単離ポリヌクレオチド分子が提供される。本発明の目的は、図１Ｂ又は図１Ａに示すアミノ酸配列から本質的に構成される単離Ｄｌｋポリペプチドを提供することである。本発明の別の目的は、夫々図１Ｂ又は１Ａに示すアミノ酸配列から本質的に構成されるヒト又はマウスＤｌｋポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド分子を提供することである。本発明の更に別の目的は、ｄｌｋを発現する腫瘍の検出方法を提供することであり、該方法は、ｄｌｋポリヌクレオチド分子とサンプルのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、腫瘍形成の疑いのあるサンプルからのＲＮＡをｄｌｋポリヌクレオチド分子と接触させる段階と、ポリヌクレオチド分子とサンプルのハイブリダイゼーションを検出する段階とを含む。本発明の更に別の目的は、小細胞肺癌の検出方法を提供することであり、該方法は、ｄｌｋポリヌクレオチド分子とサンプルのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、腫瘍形成の疑いのある気管支上皮細胞のサンプルからのＲＮＡをｄｌｋポリヌクレオチド分子と接触させる段階と、ポリヌクレオチド分子とサンプルのハイブリダイゼーションを検出する段階とを含む。図面の簡単な説明図１はマウス（図１Ａ）及びヒト（図１Ｂ）Ｄｌｋアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一アミノ酸には符号（｜）を付した。類似アミノ酸には（＾）を付し、Ａ，Ｓ＆Ｔ；Ｄ＆Ｅ；Ｎ＆Ｑ；Ｒ＆Ｋ；，Ｌ，Ｍ＆Ｖ；及びＦ，Ｙ＆Ｗの群に分類した。データベースＰＲＯＳＩＴＥ（ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓＩｎｃ．（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）の市販品）に見いだされる潜在的な生物学的に有意な部位には次の番号：１＝Ｎ−グリコシル化部位；２＝プロテインキナーゼＣリン酸化部位；３＝Ｎ−ミリスチル化部位；４＝アスパラギン酸及びアスパラギンヒドロキシル化部位を付した。シグナルペプチドにおける潜在的切断部位には（＊）を付した。図２はヒトｄｌｋＤＮＡ配列を示す。図３はマウスｄｌｋＤＮＡ配列を示す。図４はｄｌｋＥＧＦ様反復領域のコンセンサス配列と、数種の無脊椎動物ホメオティック遺伝子に存在するＥＧＦ反復領域とのアラインメントを示す。実施例４に記載するように、ヒト及びマウス両者からのｄｌｋの１２種のＥＧＦ様反復領域のアラインメントにより、ｄｌｋＥＧＦ様反復領域コンセンサス配列を得た。次に、このコンセンサス配列を（同様にして得た）数種の無脊椎動物ホメオティック遺伝子及びマウスＥＧＦのコンセンサス配列と整列させた。好適態様の詳細な説明ヒトポリヌクレオチド分子ｄｌｋ及びｄｌｋによりコードされる対応するヒトポリヌクレオチドＤｌｋが発見され、これを単離及び特徴付けした。ヒトｄｌｋポリヌクレオチド分子は、褐色細胞腫、神経芽細胞腫及びＳＣＬＣ腫瘍で発現されることが判明した。Ｄｌｋタンパク質は約３８３アミノ酸長であり、約４２ｋＤａの分子量を有する。本発明は、ヒトｄｌｋ以外に、マウスｄｌｋ（図３）及び本明細書中に記載するように胎盤から単離したヒト変異体ｄｌｋを含めたｄｌｋファミリーに属する他のポリヌクレオチド分子も提供する。本発明によると、ＳＣＬＣ及び神経内分泌癌の検出にはｄｌｋファミリーに属する単離ポリヌクレオチド分子又はそのフラグメントが有用である。ｄｌｋの発現パターンを利用して、（１）ｄｌｋの存在により原発性又は続発性腫瘍細胞を検出し、（２）ｄｌｋ発現レベルを測定することによりｄｌｋを発現する腫瘍の段階を診断することができる。Ｄｌｋは、副腎に制限される正常非胎児組織内発現パターンを有する膜貫通タンパク質である。従って、ＤｌｋはＳＣＬＣ、褐色細胞腫及び神経芽細胞腫の抗体撮像又は治療用として容易に入手可能なターゲットである。本発明によると、Ｄｌｋタンパク質に対して特異性を有する抗体を製造及び使用して、Ｄｌｋタンパク質を産生する細胞を検出又は治療する。ヒトｄｌｋｃＤＮＡは、ヌクレオチド配列分析により決定した図２に示す配列を有するポリヌクレオチド分子を含む。オープンリーディングフレームであるヌクレオチド１７４（ＡＴＧ）〜１３２２（ＴＡＡ）は１１４９ヌクレオチド長である。マウスｄｌｋポリヌクレオチド分子は、図３に示すように１１５５ヌクレオチドのオープンリーディングフレームであるヌクレオチド１３４（ＡＴＧ）〜１２８８（ＴＡＡ）を有するＤＮＡ配列を含む。マウスＤｌｋタンパク質は約３８５アミノ酸であり、約４２ｋＤａの分子量を有する。本発明は、アミノ酸を欠失するヒトＤｌｋの変異体にも関する。図１（Ｂ）に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号３４７を欠失する「変異体Ｄｌｋ」をコードするｃＤＮＡが完全ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離された。３４７位アミノ酸はタンパク質の細胞内ドメインに存在する。変異体ｄｌｋを含む胎盤ライブラリーは相当量の非変異形、即ち図１Ｂに示すｄｌｋポリヌクレオチド分子も含んでいた。ｄｌｋポリヌクレオチド分子は、リガンドとしてガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）−即ちＧＲＰレセプターであるＧタンパク質結合レセプターとの相互作用を介してガストリンの放出に関与するニューロペプチド− による刺激に応答したヒトＳＣＬＣ（ｈＳＣＬＣ）系のｃＤＮＡ発現産物を試験することにより同定した。ＧＲＰ（ペプチド）は正常肺上皮細胞及びＳＣＬＣ細胞の両者と、マウスＳｗｉｓｓ３Ｔ３繊維芽細胞のマイトジェンである。ＧＲＰ応答性ｈＳＣＬＣ系を、ＧＲＰに対して示差的応答性を示したマウス繊維芽細胞系と比較した。実施例１に詳述するこのアプローチで、応答性繊維芽細胞及び応答性ＳＣＬＣ系の両者で発現される１．６ＫｂｍＲＮＡとハイブリダイズする部分長ｃＤＮＡ分子を生成した。市販のＳｗｉｓｓ３Ｔ３繊維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーをこの部分長ｃＤＮＡでスクリーニングし、１．６Ｋｂインサートを有する数個のクローンを生成した後、その配列を決定した。Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４）に記載されているデータベース“Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ”及び“ＮＢＲＦＰｒｏｔｅｉｎ”のコンピューター検索によると、実施例３に記載する数種のホメオティック遺伝子によりコードされるタンパク質とＤｌｋの間には高い相同度が確認された。ホメオティック遺伝子は、その形態発生的宿命に関して細胞群に空間的位置を割り当てる発生制御調節遺伝子である。例えば体節動物において、ホメオティック遺伝子は別個領域（例えば脚、又は触角）の適正な形態発生に必要であり、発生中に他の遺伝子の活性を制御することにより作用する。本発明のＤｌｋタンパク質は、ショウジョウバエにおける正常な神経分化に関与する神経原性遺伝子座であるδタンパク質との間に最高の相同を示した。従って、本発明のタンパク質は「δ様」という意味で「Ｄｌｋ」と命名した。マウス及びヒトＤｌｋタンパク質配列は８６．２％の相同度を有しており、６個の表皮成長因子（ＥＧＦ）様反復単位、膜貫通ドメイン及びアミノ末端のシグナルペプチドドメインを含む多数の生物学的に重要な潜在部位を共有する。これらの構造特徴によると、ｄｌｋは、表皮又は神経細胞に分化するために外胚葉の発生決定に関与するショウジョウバエのＥＧＦ様神経原性遺伝子のファミリーの新規構成員であると思われる。ｄｌｋの発現パターン及びホメオティックタンパク質とのその配列相同は、ｄｌｋがクロム親和性細胞系の細胞分化経路で機能するという説を裏付けるものである。実施例２に詳述するように、ｄｌｋは原発性及び続発性褐色細胞腫及び神経芽細胞腫細胞と、正常（非組織病理性）ヒト副腎及び胎盤細胞で発現される。本発明によると、ＳＣＬＣ及び神経芽細胞腫は分化に応じてｄｌｋを発現することが知られている唯一の腫瘍である。単離ｄｌｋ、ｄｌｋ変異体、並びにマウスｄｌｋポリヌクレオチド及びタンパク質産物を（以下に詳述するような）診断法で使用し、以下の説明に従って製造する。ｄｌｋポリヌクレオチド分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）及びＤｌｋタンパク質について以下に記載する技術及び適用は、マウスｄｌｋ及び変異体ｄｌｋのＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質にも有用である。本発明のＤｌｋポリペプチドは、Ｍａｎｉａｔｉｓら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載されているような組換えＤＮＡ技術により製造される。ｄｌｋポリヌクレオチド分子のクローニングに特に適用可能な方法については、実施例１に記載する。図１Ｂのｄｌｋポリヌクレオチド分子は、適切な発現ベクターにクローニングし、バキュロウイルス又は大腸菌を含む原核、昆虫又は真核発現系で発現させることができる（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｎ）。従って、Ｄｌｋタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、常法を使用して市販副腎もしくはＳｗｉｓｓ３Ｔ３繊維芽細胞ライブラリー、又はＳＣＬＣ、神経芽細胞腫もしくは褐色細胞腫細胞系からのｍＲＮＡからｃＤＮＡとして得られる。ｍＲＮＡは、ＰＣＲに基づく方法を含む当業者に周知のｃＤＮＡクローニング法を使用して２本鎖ＤＮＡに変換することができる。リンカー又はテールを２本鎖ＤＮＡの末端に加え、適当な制限部位を形成する。制限酵素消化後、十分に適合可能な末端を生成する制限酵素で消化しておいたプラスミド等のクローニングベクターにＤＮＡを導入する。この関連で適切なプラスミドベクターはｐＧＥＸ−λ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。常法により連結後、ＤＮＡを細胞に導入し、その発現により所望のタンパク質を産生させる。あるいは、実施例１に詳述するようにＮＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から市販されているｉｎｖｉｔｒｏ翻訳キットを使用してＤｌｋポリペプチドを製造する。このキットは、ウサギ網状赤血球溶解物に由来する翻訳系（リボソーム、ポリメラーゼ、アミノ酸等を含む）を使用している。ｄｌｋポリヌクレオチド分子に関して記載する「単離」なる用語は、この分子が通常はこれと会合しているヒストン等のタンパク質を含まないことを意味する。ｄｌｋの単離形態は、その発現を制御、促進、強化又は他の方法で調節する機能をもたない他のＤＮＡを実質的に含まない。Ｄｌｋタンパク質に関連して記載する「単離」なる用語は、通常はこれと会合している他のタンパク質を含まないポリペプチドを意味する。原発性ＳＣＬＣ並びにＳＣＬＣ及び他の神経内分泌癌の転移増殖を検出するためには、単離ｄｌｋポリヌクレオチド分子が有用である。より特定的には、本発明は腫瘍を含む疑いのあるサンプルをｄｌｋポリヌクレオチド分子と接触させる段階と、非副腎細胞中のｄｌｋポリヌクレオチド産物（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）の発現を検出する段階とを含む腫瘍検出方法を提供する。ｄｌｋポリヌクレオチド産物が検出されたならば、細胞は神経芽細胞腫、褐色細胞腫もしくはＳＣＬＣの転移細胞（続発性腫瘍）、又はＳＣＬＣの原発性腫瘍であると診断される。ｄｌｋ発現細胞の検出能は腫瘍検出及び腫瘍診断の両者で有用である。ｄｌｋ発現の検出後、腫瘍特異的マーカー、腫瘍特異的形態を検出することにより、又は神経芽細胞腫、褐色細胞腫もしくはＳＣＬＣを含む群から選択される腫瘍のいずれかに明瞭に関連する臨床病理を患者から観察することにより、腫瘍型を決定する。例えば、神経芽細胞腫、褐色細胞腫又はＳＣＬＣの腫瘍の１種に特異的な細胞マーカー、組織特徴又は症状の確認等の情報を識別する。ｄｌｋ発現が肺から抽出した気管支上皮組織からのサンプルの細胞中で検出されるならば、原発性ＳＣＬＣであると診断される。検出されたｄｌｋ発現腫瘍細胞の起源がＳＣＬＣであると確認する第２段階は、この腫瘍に関連するマーカー、組織特徴又は特徴的症状の出現の検出により実施するのが好ましい。例えば、ＳＣＬＣに通常関連する「燕麦形細胞」の組織を検出し、ＳＣＬＣの存在を観察する。ｄｌｋの発現は、ｄｌｋポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。この方法は、被疑腫瘍サンプルをｄｌｋポリヌクレオチド分子と接触させる段階と、ポリヌクレオチド分子とサンプルのハイブリダイゼーションを検出する段階とを含む。陽性ハイブリダイゼーションシグナルは、サンプルが腫瘍起源であることを示す。ｄｌｋ発現を検出するために使用されるポリヌクレオチド分子又は「ｄｌｋプローブ」は、ｄｌｋの標識フラグメント、又は好ましくは正常副腎及び神経内分泌腫瘍細胞からのｍＲＮＡもしくはＤＮＡとハイブリダイズする完全長ｄｌｋＤＮＡ分子である。常法によりｄｌｋと相補的なプローブを製造し、好ましくは慣用ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用してｍＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしなかったプローブをヌクレアーゼ消化により除去する。当業者に公知のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法では、夫々蛍光顕微鏡測定又はオートラジオグラフィーにより容易に定量可能な蛍光標識及び放射性標識を使用することができる。一般に、蛍光標識が好ましい。別の標識法としては、定量可能な比色又は化学発光シグナルを容易に発生する酵素タッグを使用してもよい。これらの方法の過程で検出されるハイブリダイゼーション強度は、生物サンプル内のｄｌｋの量を表す。本発明のｄｌｋポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（「ノーザン」）ブロット法でプローブとして使用することができる。この方法によると、多数の標準手順のいずれかによりまず最初にＲＮＡを組織から単離する（Ｌｅｈｒａｃｈ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６：４７４３（１９７５））。次にＲＮＡサンプルを変性ゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜又は他の固体支持マトリックスに移す。ｄｌｋｍＲＮＡは、好ましくは当業者に周知の高ストリンジェンシー条件下で放射性又は非放射性標識ｄｌｋ又はｄｌｋフラグメントのハイブリダイゼーションにより検出することができる。ハイブリダイゼーションの量はデンシトメトリーにより定量することができるる本発明の更に別の態様によると、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を使用してサンプル中のｄｌｋＤＮＡ又はｍＲＮＡを検出する。ＰＣＲを実施するためには、二重螺旋上でずれた位置のｄｌｋ遺伝子の対向鎖とハイブリダイズする１対のｄｌｋ配列特異的ポリヌクレオチドプライマーを使用する。本発明に従って提供されるｄｌｋポリヌクレオチド配列から誘導されるこのようなプライマーは、好ましくはｄｌｋに固有のフラグメント、例えばＤｌｋ以外のタンパク質との間に低い相同度を有する配列に相当する。この関連で有用なｄｌｋ特異的プライマー配列の２例は、Ｄｌｋの細胞内領域の一部をコードする下記配列：である。他の類似のプライマー対も同様に選択及び使用することができる。プライマーはＤＮＡ合成の開始点を提供する。いずれも当業者に周知であるＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（「ｄＮＴＰ」）及び他の必要な補因子の存在下で、プライマーとハイブリダイズした鋳型に相補的な新しいＤＮＡ鎖を合成する。各回の間に２本鎖産物を変性させ、合成を数回実施する。好ましくは、熱安定ＤＮＡポリメラーゼを使用すると、各合成回毎に新たに酵素を加える必要がない。ＰＣＲにより、プライマー対配列の末端により規定されるｄｌｋＤＮＡの元の配列と同一配列を有する２本鎖ＤＮＡ増幅産物が生成される。ＰＣＲ産物の量は、サンプル中のｄｌｋＤＮＡ又はｄｌｋｍＲＮＡの量に相当する。産物は、当業者に周知の種々の方法により検出することができる。ＰＣＲ産物をアガロース又はポリアクリルアミド電気泳動により分解し、臭化エチジウム等の蛍光染色により検出することができる。あるいは、ｄＮＴＰの１種を標識し、標識ｄＮＴＰの取り込みを測定することによりＰＣＲ産物を定量することもできる。ＰＣＲ産物を分解、検出及び定量する他の種々の方法が当業者に周知である。ＰＣＲをｄｌｋＤＮＡに特異的にしても、ｄｌｋｍＲＮＡに特異的にしてもよい。例えば、ＲＮＡｓｅ又はＤＮＡｓｅを用いて、試料から一方の鋳型を除去してもよいし、他方の鋳型を除去してもよい。遺伝子とメッセージとを区別するプライマー、例えばプロモーターの非転写領域で配列にハイブリダイズするプライマーは、ｄｌｋｍＲＮＡではなく、ｄｌｋ遺伝子に特異的である。本発明の方法に適した他の技術は当業者には自明であり、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロッティングを包含し得る。抗原と抗体との免疫反応に基づく数種のアッセイ技術も本発明で使用可能である。特に、Ｄｌｋタンパク質に特異的な抗体を用いるアッセイが、Ｄｌｋタンパク質を産生する細胞の検出で有用である。動物をＤｌｋタンパク質で免疫して、Ｄｌｋ発現細胞に特異的な抗体を得る。この場合“抗体”という用語は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方を包含し、前述の抗体はどの抗体クラスであってもよい（ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ等）。本発明によれば、ポリクローナル抗体を得るため又はモノクローナル抗体産生用のリンパ球又は脾臓細胞を得るために、完全Ｄｌｋポリペプチドを動物に注射する。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎがＮａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）に記載しているようなモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の一般的な産生技術を適用して、Ｄｌｋタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を産生する。この手順は、Ｄｌｋポリペプチドで感作した又はこれを注射した動物のリンパ球を単離し、これを骨髄腫パートナーと融合してハイブリドーマを産生し、次いでＤｌｋポリペプチドに対して結合特異性を示す“抗Ｄｌｋ抗体”の産生についてハイブリドーマをスクリーニングする段階からなる。 “抗体”という用語は更に、抗Ｄｌｋ抗体の断片（例えばＦＡｂやＦ（Ａｂ¹）₂）、このような断片の結合体、及び例えば米国特許第４，７０４，６９２号に記載の抗Ｄｌｋ抗体に基づくいわゆる“抗原結合タンパク質”（一本鎖抗体）を包含する。前記特許は参考として本明細書に組み入れる。あるいは、大腸菌のような宿主細胞（例えばＷａｒｄ等，Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６（１９８９）を参照）又はトランスフェクトしたマウス骨髄腫細胞中でのこのようなＭａｂの可変領域をコードする遺伝子の発現によりＭａｂ又はその断片を産生することができる。Ｖｅｒｈｏｙｅｎ等，ＢｉｏＡｓｓａｙｓ８：７４（１９８８）；Ｇｉｌｌｉｅｓ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：７９９−８０４（１９８９）：Ｎａｋａｔａｎｉ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：８０５−１０（１９８９）を参照。前記抗体が使用されるアッセイには、エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動等が含まれ得る。反応性が知られているモノクローナル抗体を用いる免疫組織化学技術も診断では有用である。本発明のこの態様によれば、ヒトから試料を入手して、（１）腫瘍を有すると思われる体液又は組織（例えば気管支洗浄液、鼻咽頭吸引液、咽喉スワブ等から得た肺胞、細気管支又は呼吸性上皮細胞）を取出して小細胞肺ガンを検出し、また（２）（皮質や骨髄を含む）副腎以外の組織から生検により採取した転移神経内分泌腫瘍を検出する。Ｄｌｋに特異的なモノクローナル抗体を用いて、前述の細胞で免疫組織化学研究を実施することができる。本発明によれば、これらの抗体の診断への適用の例としては、生物試料と反応させる抗Ｄｌｋ抗体を含むキットを用いたＤｌｋタンパク質の検出が挙げられる。このような反応は、結合を許容する条件下で抗Ｄｌｋ抗体とＤｌｋ抗原とを結合させることからなる。生物試料での抗体抗原複合体の観察は、陽性結果を示している。この種のキットを使用して、個体、動物又は細胞系に由来する特定生物試料でＤｌｋの発現の程度を検出することができる。このような免疫診断キットは、抗Ｄｌｋ抗体と、抗体を滅菌形態で収納するための容器とを含んでなり得る。キットは更に、抗Ｄｌｋ抗体（Ｆｃ部分）を認識し、酵素又は蛍光部分のようなラベルに結合する抗アイソタイプ血清抗体を含み得る。好ましい実施態様では、放射性標識した抗Ｄｌｋ抗体を提供する。このような抗体、好ましくはモノクローナル抗体を撮像のため動物又はヒトに投与する。投与した抗体がＤｌｋ発現細胞と結合するのに適した時間が経過した後、γカメラを用いて、生体内での標識抗体の存在を検出する。このような手順で、原発性又は続発性Ｄｌｋ発現神経内分泌腫瘍の生体内での位置に関する情報が得られる。抗Ｄｌｋモノクローナル抗体の治療への適用は、抗Ｄｌｋ免疫毒素を投与することからなる。抗Ｄｌｋモノクローナル抗体を毒素（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素又は通常は従来の抗体−毒素結合により抗体に結合されている他の毒素）と結合する。Ｈｅｒｔｌｅｒ等（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．７（１２）：１９３２（１９８９））は、抗体−毒素結合の生成方法を記載しており、参考として本明細書に組み入れる。従って、前述の抗Ｄｌｋモノクローナル抗体−毒素結合体を個体の標的に投与し、神経内分泌腫瘍に存在するＤｌｋ発現細胞を選択的に死滅させる。同様に、容器に抗Ｄｌｋ免疫毒素を含むキットを提供する。キットは、抗Ｄｌｋ免疫毒素や医薬賦形剤を容器に含んでいてもよい。以下の実施例を参照して本発明を更に詳しく説明する。特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術／科学用語の意味は、通常当業者に理解されている通りとする。本発明の実施に当たっては、本明細書に記載するのと同様の方法や材料を使用することができるが、好ましい方法や材料は前述した通りである。特に明記しない限り、本明細書で使用する又は予測される技術は当業界では公知の標準的な手法である。材料、方法及び実施例は一例にすぎず、限定的なものではない。実施例１．ｄｌｋポリヌクレオチド及びポリペプチド分子の同定ｄｌｋの同定ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）反応性表現型と関連する分子の研究で、（１）反応性マウスＳｗｉｓｓ及び非反応性マウスＢａｌｂ／ｃの３Ｔ３線維芽細胞間で特異的に発現されると共に、（２）ＧＲＰ反応性ヒトＳＣＬＣ細胞系で発現される遺伝子を同定した。このアプローチの論拠は、ＧＲＰ反応性表現型と相関関係にある遺伝子産物がＢａｌｂ／ｃや非反応性ＳＣＬＣ細胞系には存在しないが、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３線維芽細胞や反応性ＳＣＬＣ細胞系には存在することであった。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞ではなく、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３線維芽細胞で発現されるクローンに富むディファレンシャルｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｔｉｍｂｌｉｎ等が詳しく説明しているように（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：１５８７（１９９０））、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞と比較したＳｗｉｓｓ３Ｔ３のディファレンシャルライブラリーを構築した。Ｄａｖｉｓ等が記載しているように（ＢＡＳＩＣＭＥＴＨＯＤＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８６））、ＲＮＡの単離、電気泳動、ノーザンブロット及びハイブリダイゼーション技術を実施した。Ａｕｓｕｂｅｌ等が記載しているように（ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ３．５．９．−３．５．１０（１９９１））ランダムプライミングにより、核酸プローブを³²ＰｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で標識した。発現パターンを示す１．６ｋｂｍＲＮＡとハイブリダイズしたこのディファレンシャルライブラリーから単離した部分長クローン（１５０ヌクレオチド長）は、２つのスクリーニング要件との一貫性を示している。次いで、この部分長クローンを使用して、λＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ））でＳｗｉｓｓ３Ｔ３線維芽細胞の市販オリゴｄＴ−プライムドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、全長クローンを得た。Ｓｈｏｒｔ等が記載しているように（Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：７５８３（１９８８））製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のプロトコルに従って陽性λＺＡＰＩＩクローンのスクリーニング手順及びプラスミドレスキューを実施した。このスクリーニング手順で、長さが約１．６ｋｂ対のインサートを含む数個のクローンを得た。ＤＮＡ配列決定救済したプラスミドを、Ｔａｂｏｒ等が記載した製造業者のプロトコル（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１４：６４４７（１９８９））に従い、ジデオキシチェインターミネーション法によりＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）で配列決定した。ヌクレオチド配列分析は、分子量４１，３２０ドルトンの３８５アミノ酸の推定上のタンパク質（Ｄｌｋ）をコードする１１５５ヌクレオチドの読み取り枠を明示した。この読み取り枠は、Ｆｉｃｋｅｔｔ法及びＳｈｅｐｈｅｒｄ法によりコード化として分類されている。Ｆｉｃｋｅｔｔ等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：５３０３（１９８２）；Ｓｈｅｐｈｅｒｄ等，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ１８８：１８０（１９９０）。これらの方法を実行するソフトウエアプログラム（ＰＣ／Ｇｅｎｅソフトウエアパッケージ、ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓＩｎｃ．（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）；Ａ．Ｂａｉｒｏｃｈ，Ｐｈ．Ｄｔｈｅｓｉｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｅｎｅｖａ，（１９９０））によりこの読み取り枠を同定した。Ｄｌｋポリペプチドのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳Ｌｏｃｋｈａｒｄ等が記載するように（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３７：２０４（１９６９））、製造業者のプロトコルに従って、ＮＥＮ由来のウサギ網状赤血球溶解物系（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いてマウスｄｌｋｍＲＮＡからのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイを実施した。Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３線維芽細胞由来のポリＡ⁺ＲＮＡを、ニトロセルロースフィルター上に固定化した変性全長ｄｌｋとハイブリダイズしてｄｌｋｍＲＮＡを選択した。（２μｇのポリＡ⁺Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３ＲＮＡを、ニトロセルロースに固定化した５μｇの変性ｄｌｋとハイブリダイズしてｄｌｋｍＲＮＡを選択した。）結合ＲＮＡを沸騰させて溶出した。ｐＧＥＭ４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした２つの異なる全長ｄｌｋｃＤＮＡを用いて、マウスｄｌｋｍＲＮＡもｉｎｖｉｔｒｏ調製した。これら３個のｍＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ翻訳の鋳型として使用した。標識したタンパク質を１２％ポリアクリルアミドゲル中で分析し、次いでフルオログラフィーにかけた。Ｄｌｋポリペプチドの予想分子量と一致して、３個全ての試料に約４２ｋＤａのタンパク質バンドが存在していた。マウスとヒトとの比較マウスとヒトのｄｌｋポリヌクレオチド配列のアミノ酸配列は８６．２％が同一で、９０．１％の類似性がある。前記ポリヌクレオチド配列は、（無脊椎動物神経原性タンパク質で確認される反復領域との相同性が高い）６ＥＧＦ様反復領域、細胞膜内トランスメンブランドメイン及びシグナルペプチドドメインを含む多数の潜在的な生物活性部位を保有している。ｄｌｋの構造特性をＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム（ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓＩｎｃ．（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ），Ａ．Ｂａｉｒｏｃｈ，Ｐｈ．Ｄｔｈｅｓｉｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｅｎｅｖａ（１９９０））で分析した。Ｒａｏ及びＡｒｇｏｓ法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ８６９：１９７（１９８６））を実行するＲＡＯＡＲＧＯＳプログラムを用いて、トランスメンブランドメインを同定した。ＶｏｎＨｅｉｊｎｅ法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１４：４６８３（１９８６））に従って、シグナルペプチドをＰＳＩＧＮＡＬプログラムで分析した。実施例２．マウスでのｐＰＧ２及びｄｌｋ遺伝子発現と、ヒトでのｄｌｋ遺伝子発現との比較ヒト、マウス及びハムスター由来の正常組織では、本発明に従って、副腎及び胎盤組織でのみｄｌｋ発現が検出された。同様に、正常ヒト組織では、ｐＧ２発現が副腎に限定されることが知られている。ｄｌｋｍＲＮＡをノーザン分析によりヒト及びラットクロム親和性細胞腫（ＰＣ１２）細胞系で検出した。ｐＧ２はＨｅｌｍａｎ等により褐色細胞腫細胞系で同定されている（ＰＮＡＳＵＳＡ８４：２３３６（１９８７））。本発明では、ｄｌｋを神経芽腫（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）細胞で検出した。神経芽腫細胞系でのｐＧ２発現は分化した細胞では検出されたが、未分化神経芽腫細胞系には存在しなかった。Ｃｏｏｐｅｒ等，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈａｎｄＤｉｆｆ．１：１４９（１９８９）。更には、本発明で同定したｄｌｋを発現する他の細胞には、特定のＳＣＬＣ細胞系が含まれる。厳密度の高い条件下でヒトｄｌｋプローブを用いて、マウスＳｗｉｓｓ３Ｔ３線維芽細胞がｄｌｋを発現することも知見された。厳密度の高い条件下でヒトｄｌｋプローブを用いて、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞がｄｌｋを発現することが知見された。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞ＲＮＡは、このような条件下ではｄｌｋ発現に対して陰性であった。マウスｄｌｋとヒトｐＧ２との関係を探求するため、マウスｄｌｋをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、λｇｔ１０ヒト副腎ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）からｃＤＮＡクローンを単離した。厳密度の低い条件下でも、ｐＧ２について報告されているのと同様の構造特性を有するタンパク質をコードするクローンは単離されなかった。陽性λクローン由来のｃＤＮＡインサートをｐＧＥＭ４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）内にサブクローニングし、実施例１の方法に従って配列決定した。数個の全長クローンのポリヌクレオチド配列データは、これらのｃＤＮＡがマウスｄｌｋの配列と８２．１％同一であり、マウスｄｌｋタンパク質のヒト相同体をコードすることを示していた（図１）。Ｄｌｋの構造特性は、ｐＧ２タンパク質で予想される構造特性とは非常に異なる（Ｈｅｌｍａｎ等，上掲（１９８７））。前者のタンパク質は、２８６個のアミノ酸配列（約３０ｋＤａ）からなり、ＥＧＦ様反復領域もシグナルペプチドもトランスメンブランドメインも含まない。ｄｌｋとｐＧ２のヌクレオチド配列が８１．２％同一であるという知見が図１に示すｄｌｋポリヌクレオチド分子のように正確に同定されているにもかかわらず前述の結果が得られた。実施例３．他の遺伝子やタンパク質とのｄｌｋ／Ｄｌｋ相同性ｄｌｋ核酸配列は、表皮細胞又は神経細胞への分化のために外胚葉細胞により取られる決定に関与するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＥＧＦ様神経原性遺伝子との相同性が高い。Ｄｌｋと最も高い相同性を有することが知見されている遺伝子には、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＤｅｌｔａ，Ｎｏｔｃｈ及びＳｅｒｒａｔｅ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｌｉｎ−１２及びｇｌｐｌ、並びにウニのｕＥＧＦ１が含まれる。相同性の程度は個々のタンパク質とＤｌｋとの間で異なるが、最大相同性領域は、３３％までのアミノ酸同一性を示し、保存性（conservative）アミノ酸置換を考慮すれば、約７５％に達した。図４は、マウス又はヒトｄｌｋＥＧＦ様反復配列と、数個のタンパク質のＥＧＦ配列反復領域のコンセンサス配列とのアラインメント（alignment）を示す。ＥＧＦ様反復領域のアラインメントを、Ｈｉｇｇｉｎｓ等が記載する（Ｇｅｎｅ７３：２３７（１９８８））ＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて実施した。ＰＲＯＳＩＴＥプログラムで潜在的な生物学的重要性を示す部位を分析した。ホメオチック（homeotic）遺伝子の間で高度に保存されている残基はｄｌｋでも保存されている。この知見により、ｄｌｋがＥＧＦ様ホメオチック遺伝子ファミリーの一構成員であることが確定された。ＥＧＦ様反復領域のアミノ酸配列や構造、及びｄｌｋの全構造は、以前は哺乳動物の無脊椎動物ホメオチック遺伝子に対応するものと考えられていた他の脊椎動物非ホメオチックＥＧＦ様タンパク質（例えばＥＧＦ前駆体、ＴＧＦα、ラミニンのα、β１、β２鎖、凝集因子又は補体タンパク質）よりも、無脊椎動物ホメオチック遺伝子に関係する。酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、イヌ、ウシ、サル及びヒトを含むトリからヒトに至る種でｄｌｋ遺伝子が検出された。しかしながら、ｄｌｋ遺伝子は、無脊椎動物タンパク質と構造的な相同性があるにもかかわらず、無脊椎動物や下級脊椎動物には存在しない。ＰＣ／Ｇｅｎｅに含まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎ等の記載するＰＣＯＭＰＡＲＥプログラム（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））を相同性分析のために使用した。この方法では、２種のタンパク質間の最適アラインメントスコアを、１００ランダムアラインメントの統計分布と比較した。特に比較したタンパク質の間で機能的関係も構造的関係も認められないときに、平均ランダムアラインメント分布からの標準偏差が＋５以上のアラインメントスコアを有意とみなした。代表的なアラインメントスコアを決定した：Ｄｅｌｔａ，２０．２；Ｓｅｒｒａｔｃ，１９．７；ＴＡＮ−１，１６．２；Ｎｏｔｃｈ，１４．６；Ｘｏｔｃｈ，１３．６；ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＬａｍｉｎｉｎ β２，６．３；マウスＬａｍｉｎｉｎ β２，４．１；ヒト凝集因子XII ，２．８；及びヒトＥＧＦ前駆体，０．６。実施例４．ｄｌｋ発現：ノーザンブロットｍＲＮＡ分析ノーザン分析により、ＳＣＬＣ系ＮＣＩ−Ｈ５１０，ＮＣＩＨ６９及びＮＣＩ−Ｎ５９２、ヒト神経芽腫系ＳＫ−Ｎ−ＳＨ並びにラット褐色細胞腫ＰＣ−１２細胞系でｄｌｋの発現を検出した。２０μｇの全ＲＮＡ又は２μｇのポリＡ⁺ を１％アガロースゲル中で分離し、次いでニトロセルロースフィルターにブロットした（実施例１に記載）。ｄｌｋに相当する１．６ｋｂバンドは、ＳＣＬＣ細胞系ＮＣＩ−Ｎ５９２、ＮＣＩ−Ｈ６９及びＮＣＩ−Ｈ５１０に由来するＲＮＡ試料や、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３線維芽細胞でのみ観察された。マウスＳｗｉｓｓ３Ｔ３線維芽細胞ＲＮＡは更に、ヒトｄｌｋをプローブとして用いて厳密度の高い条件下でハイブリダイズしたときでも高度のｄｌｋ発現を示した。マウスｄｌｋをプローブとして用いて同様の結果が得られた。このような条件下で、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞ＲＮＡはｄｌｋの発現に対して陰性であった。Ｅｗｉｎｇの肉腫細胞系ＳＫ−ＥＳ−１、Ａ４５７３及びＴＣ１０６はｄｌｋを発現しなかった。マウス、ハムスター及びヒトに由来する正常組織では、ｄｌｋ発現は副腎でのみ検出された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/574 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/574 Ｚ // Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 9452−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】１．本質的に図１Ｂに示すアミノ酸配列からなる単離Ｄｌｋポリペプチド。２．請求項１に記載のヒトＤｌｋポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド分子。３．本質的に図２に示すポリヌクレオチド配列からなる単離ポリヌクレオチド分子。４．前記Ｄｌｋポリペプチドが図１Ａに示すアミノ酸配列を含んでいる、マウスＤｌｋポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド分子。５．（ａ）腫瘍形成性であると思われる試料を、ｄｌｋポリヌクレオチド分子と前記試料とのハイブリダイゼーションを許容する条件下でｄｌｋポリヌクレオチド分子と接触させ、（ｂ）前記ポリヌクレオチド分子と前記試料とのハイブリダイゼーションの存在を検出する段階を包含するｄｌｋを発現する腫瘍の検出方法。６．前記ｄｌｋポリヌクレオチド分子が、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド分子である請求項５に記載の方法。７．段階（ａ）で前記試料が気管支上皮細胞を含んでいる、小細胞肺癌と同定された腫瘍を検出するための請求項５に記載の方法。