JP5791506B2 - 造血幹細胞または造血前駆細胞の分化を抑制するペプチド及びその用途 - Google Patents
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Description
2.HoxB4遺伝子を造血幹細胞に導入すると、造血幹細胞は増幅するものの、急性白血病が誘導される。
3.サイトカイン添加により成熟血球の分化が誘導され、造血幹細胞の未分化性を維持することが難しい。
4.脱メチル化剤の添加で造血幹細胞の増幅効率は上がるが、エピジェネティクスに影響を与えるため安全性の確認が必要である。
(I-1)下記(A)または(B)に記載するペプチド:
(A)配列番号1に記載する13のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチド、
(B)配列番号1に記載するアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換または付加してなるペプチドであって、
(1)造血幹細胞または造血前駆細胞の骨髄球系細胞への分化を抑制する作用、
(2)間葉系幹細胞を増幅促進する作用、または
(3)多能性幹細胞から造血幹細胞を誘導する作用
のいずれか少なくとも1つの作用を有するペプチド。
Cys Gln His Lys Ala Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly Ser (配列番号3)
Cys Gln Lys Lys Asp Gly Pro Cys Val Met Asn Gly Ser (配列番号4)
Cys Gln His Lys Ala Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly Ser (配列番号5)
Cys Gln Glu Met Asp Gly Pro Cys Val Val Asn Gly Ser (配列番号6)
Cys His Leu Lys Glu Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly Ser (配列番号7)
Lys Glu Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly Ser (配列番号8)
Cys His Leu Lys Gln Gly Pro Cys Ile Ile Asn Gly Ser (配列番号9)
Gly Pro Cys Ile Ile Asn Gly Ser (配列番号10)。
(II-1)(I-1)乃至(I-3)のいずれかに記載する少なくとも1種のペプチド、またはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を有効成分とする造血幹細胞または造血前駆細胞の分化抑制剤。
(III-1)(I-1)乃至(I-3)のいずれかに記載する少なくとも1種のペプチド、またはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を有効成分とする間葉系幹細胞の増幅促進剤。
(IV-1)(I-1)乃至(I-3)のいずれかに記載する少なくとも1種のペプチド、またはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を有効成分とする造血幹細胞誘導剤。
(V-1)(I-1)乃至(I-3)のいずれかに記載する少なくとも1種のペプチド、またはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、(II-1)に記載する分化抑制剤、または(III-1)に記載する増幅促進剤を含有する培地中で、組織特異的幹細胞または組織特異的前駆体を培養する工程を有する、組織特異的幹細胞または組織特異的前駆細胞の増殖方法。
(VI-1)(IV-4)乃至(IV-6)のいずれかに記載する方法、または(V-1)乃至(V-5)のいずれかに記載する方法によって得られる、造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞集団。
(VII-1)(I-1)乃至(I-3)のいずれかに記載する少なくとも1種のペプチドに対する抗体。
本明細書におけるアミノ酸配列などの略号による表示は、IUPAC−IUBの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」(特許庁編)及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
本発明が対象とするペプチドは、下記に記載する作用のうち、少なくとも1つの作用を有することを特徴とする:
(1)造血幹細胞または造血前駆細胞の分化を抑制する作用、好ましくは、造血幹細胞または造血前駆細胞の骨髄球系細胞への分化を抑制する作用、
(2)間葉系幹細胞を増幅促進する作用、または
(3)多能性幹細胞から造血幹細胞を誘導する作用。
Cys Gln Lys Lys Asp Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly Ser (配列番号1)。
上記のようにして得られる本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和はそのまま、あるいは必要に応じて細胞生理学的に許容し得る担体とともに混合して組成物とした後に、造血幹細胞または造血前駆細胞の分化抑制剤として用いることができる。なお、本発明のペプチドは1種単独からなるものであっても、2種以上のものを任意に組み合わせて用いることもできる。好ましくは、ヒト由来のKS-13(配列番号1)、げっ歯類由来のペプチド(配列番号3)、ブタ由来のペプチド(配列番号4)、ニワトリ由来のペプチド(配列番号10)であり、より好ましくはヒト由来のKS-13(配列番号1)、及びげっ歯類由来のペプチド(配列番号3)である。
上記本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和(本発明ペプチド)は、そのまま、あるいは必要に応じて細胞生理学的に許容し得る担体とともに混合して組成物とした後に、間葉系幹細胞の増幅促進剤として用いることができる。なお、本発明ペプチドは1種単独からなるものであっても、2種以上のものを任意に組み合わせて用いることもできる。好ましくは、ヒト由来のKS-13(配列番号1)、げっ歯類由来のペプチド(配列番号3)、ブタ由来のペプチド(配列番号4)、ニワトリ由来のペプチド(配列番号10)であり、より好ましくはヒト由来のKS-13(配列番号1)、及びげっ歯類由来のペプチド(配列番号3)である。
本発明のペプチドまたはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和(本発明ペプチド)は、そのまま、あるいは必要に応じて細胞生理学的に許容し得る担体とともに混合して組成物とした後に、造血幹細胞の誘導剤として用いることができる。なお、本発明ペプチドは1種単独からなるものであっても、2種以上のものを任意に組み合わせて用いることもできる。好ましくは、ヒト由来のKS-13(配列番号1)、げっ歯類由来のペプチド(配列番号3)、ブタ由来のペプチド(配列番号4)、ニワトリ由来のペプチド(配列番号10)であり、より好ましくはヒト由来のKS-13(配列番号1)、及びげっ歯類由来のペプチド(配列番号3)である。
本発明の組織特異的幹細胞または組織特異的前駆細胞の増殖方法には、(1)造血幹細胞または造血前駆細胞を分化抑制する作用、及び(2)間葉系幹細胞を増幅促進する作用のうち、少なくとも1つの作用を有する本発明ペプチドの存在下で、組織特異的幹細胞または組織特異的前駆細胞を培養する工程を含む。
本発明の造血幹細胞の誘導または作製方法には、(3)多能性幹細胞から造血幹細胞を誘導する作用を有する本発明ペプチドの存在下で、多能性幹細胞または多能性幹細胞由来細胞を培養する工程を含む。
前述する本発明の増幅方法(V)または作製方法(VI)により得られた「造血幹細胞または造血前駆細胞を含有する細胞集団」は、従来の骨髄移植や臍帯血移植に代わる血液細胞移植用の組成物(移植片)として用いることができる。
本発明はまた、前述する本発明のペプチドに対する抗体を提供する。
図1に示すように、胎生期肝臓において造血幹細胞(図中、緑に染色)は肝芽細胞(図中、赤に染色)に近接していることから、肝芽細胞は造血幹細胞の増幅に重要な役割を担っていると考えられる。そこでこの肝芽細胞を純化し採取するため、F1ow cytometryに使用可能な抗体の作製を試みた。肝芽細胞の細胞膜に発現する複数のタンパク質から細胞外ドメインに相当し、かつマウスとヒトの両方にホモロジーの高いペプチドを10種類デザイン(以下、ペプチドA−J)し、抗ペプチド抗体の作製を試みた。
Cys Gln Lys Lys Asp Gly Pro Cys Val Ile Asn Gly Ser(配列番号1)
B: yecscapgysgkd
Tyr Glu Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Ser Gly Lys Asp(配列番号13)
C: pcqhggtcvddeg
Pro Cys Gly His Gly Gly Thr Cys Val Asp Asp Glu Gly(配列番号14)
D: canngtcvsldgl
Cys Ala Asn Asn Gly Thr Cys Val Ser Leu Asp Gly Leu(配列番号15)
E: rashasclcppgf
Arg Ala Ser His Ala Ser Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe(配列番号16)
F: lcdrdvracssap
Leu Cys Asp Arg Asp Val Arg Ala Cys Ser Ser Ala Pro(配列番号17)
G: sgnfceivansct
Ser Gly Asn Phe Cys Glu Ile Val Ala Asn Ser Cys Thr(配列番号18)
H: pgqcictdgwdge
Pro Gly Gly Cys Ile Cys Thr Asp Gly Trp Asp Gly Glu(配列番号19)
I: pnpcendgvctdi
Pro Asn Pro Cys Glu Asn Asp Gly Val Cys Thr Asp Ile(配列番号20)
J: vtspgclhglcge
Val Thr Ser Pro Gly Cys Leu His Gly Leu Cys Gly Glu(配列番号21)。
(1)ラットの免疫及び抗体価の測定
KS-13の抗体(抗KS-13抗体)を作製するために、抗原として認識されやすいペプチドとしてKS-13のN末端のCysを欠失させた12アミノ酸残基からなるペプチド、及びキャリアタンパク質としてKLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)を用いて、定法に従って、ラットを2週間間隔で4回免疫を行い、その後、HRP標識抗ラットIgGを用いてELISAにより抗体価を測定した。その結果、十分な抗体価の上昇が認められた。
3匹(No1, No.2, No.3)のラットを用いて、免疫前と、上記ペプチドとキャリアタンパク質を用いて免疫した後に、それぞれ血清を採取した。以下、免疫前の血清を用いた実験をコントロールという。
Kohler GとMilstein C.の報告(Nature 1975;256:p495-p497) に従ってポリエチレングリコール法を用いて、抗体価上昇が認められ、且つKS-13中和活性が認められたNo.2の免疫ラットの脾臓細胞をミエローマ細胞(p3U1)と融合した。定法に従い、Maleimide Activate Plate(PIERCE)にKS-13を結合させた抗原塗布プレートを用いて培養上清を、その抗体価を指標にスクリーニングし、抗体価陽性株を5つ選抜した。これらの抗体価陽性株をさらに、上記個体スクリーニングと同様の方法でスクリーニングして、KS-13中和活性が確認された3株(51-2、5-2、5-3)を選抜した。
上記で得られた3株を、限界希釈法によりクローニングし、ELISAにより抗体産生を確認した後、最終的に6株(51-2-1、51-2-2、5-2-1、5-2-2、5-3-1、5-3-2)を取得した。RAT MONOCLONAL ISOTYPING KIT(Serotec)を使用して樹立した細胞株のサブクラスを確認したところ、サブクラスは全てIgM(κ鎖)であることが判明した。
細胞刺激因子(50 ng/mL rm SCF, 10 ng/mL rm IL-3, 10 ng/mL rh IL-6, 3 U/mL rh EPO)(rm:組換え型、rh:組換えヒト型を意味する)を含む半固形培地(Methocult M3434;StemCellTechnologies社製)に、KS-13(10μg/mLまたは30μg/mL)を添加して、マウス胎仔肝臓造血幹細胞(CD45(+)c-Kit(+) Sca-1(+))(1000 cells/dish)を培養し、造血コロニー形成細胞アッセイを行い、細胞の造血能力を評価した。また比較のため、KS-13を添加しない液体培地を用いて(None)、同様に造血コロニー形成細胞アッセイを行い、細胞の造血能力を評価した。
(1)実験方法
(1-1)ヒト臍帯血CD34陽性造血幹細胞集団(造血幹細胞及び分化がやや進んだ造血前駆細胞が混在した細胞集団)を、KS-13(1μg/mL、10μg/mL)を添加した液体培地(SCF 50ng/mL, TPO 10ng/mL, Flt3L 20ng/mLを別添したリンパ球用無血清合成培地(X-VIVO 10:Takara))で培養して生体外増幅を試みた。対照試験(コントロール)として、KS-13を添加しない液体培地(SCF 50ng/mL, TPO 10ng/mL, Flt3L 20ng/mLを別添したリンパ球用無血清合成培地(X-VIVO 10:Takara))を用いて、また比較試験(陽性コントロール)として、各種細胞刺激因子の混合物(Full:SCF 50ng/ml、TPO 10ng/mL、FIt3L 20ng/mL、IL-6 20ng/mL、sIL-6R 20ng/mL)を添加した液体培地(X-VIVO 10:Takara)を用いて、それぞれヒト臍帯血CD34陽性造血幹細胞集団を培養し、培養開始時(培養0日目)、並びに培養開始から7日目及び11日目に、総細胞数、CD34陽性細胞数(造血幹細胞及び分化がやや進んだ造血前駆細胞の数)、及びCD34陰性細胞数(分化成熟した血球細胞の数)を測定した。なお、ここで陽性コントロールにおいて使用した細胞刺激因子は、既存のヒトCD34陽性細胞増幅法で使用されている因子であり、これらはヒト造血幹細胞の増殖に作用することが報告されている(Sui X, et al., Proc Natl Acad Sci USA,1995,92,2859-2863; Ebihara Y, et al., Blood 1997, 90, 4363-4368)。
総細胞数、CD34陽性細胞数、及びCD34陰性細胞数の経時的変化を、それぞれ図3、図4、及び図5に示す。
図3に示すように、KS-13(1μg/mL、10μg/mL)の存在下でヒト臍帯血CD34陽性造血幹細胞集団を11日間培養した場合に得られる総細胞数は、培養開始時(0日目)よりも増加しているものの(KS-13 1μg/mL:27.50倍の増加、KS-13 10μg/mL:29.38倍の増加)、その増加率は、陽性コントロール(Full:細胞刺激因子存在下での培養)よりも、またコントロール(Basal)よりも低かった。各培養系(コントロール、陽性コントロール、KS-13[1μg/mL]添加、KS-13[10μg/mL]添加)で11日間培養して得られる総細胞数の増加率は、コントロールでの増加率を1とすると以下のようになる。
総細胞数の増加率
コントロール:陽性コントロール:KS-13[1μg/mL]:KS-13[10μg/mL]
=1:2.2:0.72:0.77 。
図4に示すように、KS-13(1μg/mL、10μg/mL)の存在下でヒト臍帯血CD34陽性造血幹細胞集団を11日間培養することで、陽性コントール(図中「Full」と示す)条件下と比べるとかなり劣るものの、CD34陽性細胞(造血幹細胞及び分化がやや進んだ造血前駆細胞)の数は、培養開始時(0日目)よりも約8倍増加していた(KS-13 1μg/ml:7.96倍、KS-13 10μg/ml:8.38倍)。
CD34陽性細胞数の増加率
コントロール:陽性コントロール:KS-13[1μg/mL]:KS-13[10μg/m]
=1:2.69:0.84:0.89 。
図5に示すように、CD34陰性細胞(分化成熟した血球細胞)は、いずれの実験系(コントロール、陽性コントロール、KS-13[1μg/mL]、KS-13[10μg/mL])でも細胞播種時には存在しなかったが、ヒト臍帯血CD34陽性造血幹細胞集団を11日間培養すると、すべての実験系でCD34陰性細胞の生成とその細胞数の増加が認められた。
CD34陰性細胞数の増加率
コントロール:陽性コントロール:KS-13[1μg/mL]:KS-13[10μg/m]
=1:2.04:0.68:0.73 。
各実験系(コントロール、陽性コントロール、KS-13[1μg/mL]、KS-13[10μg/mL])について11日間液体培養した細胞を対象として生細胞率{(生細胞数/(生細胞数+死細胞数)}を算出した結果を下記に示す。
陽性コントロール(細胞刺激因子存在):98.1%
KS-13[1μg/mL]:97.5%
KS-13[10μg/mL]:97.6%
これから、KS-13は細胞死を誘導しないことが判明した。
各実験系(コントロール、陽性コントロール、KS-13[1μg/mL]、KS-13[10μg/mL])について11日間液体培養した細胞を対象として、各種の造血前駆細胞のコロニー〔CFU-GEMM(colony forming unit-granulocyte/erythrocyte/macrophage/ megakaryocyte)、BFU-E(burst forming unit-erythrocyte)、CFU-GM(colony forming unit-granulocyte/macrophage)、CFU-M(colony forming unit- macrophage)、CFU-G(colony forming unit-granulocyte)〕の数を計測した結果を図6に示す。
(1)Flow cytometry解析
マウス骨髄細胞をビオチン標識したKS-13で処理し、次いで造血幹細胞のマーカーであるCD45抗体(CD45 conjugated with PE-Cy7:Biolegend)、c-Kit抗体(c-Kit conjugated with APC:Biolegend)、及びSca-1抗体(Sca-1 conjugated with PE:Biolegend)、並びに蛍光色素で標識したStreptavidin(Streptavidin conjugated with FITC:Biolegend)を用いて染色し、Flow cytometryを用いて解析した。
造血幹細胞増幅器官である胎齢12.5日目マウス胎仔肝臓の凍結切片を作製し、ビオチン標識したKS-13を用いて染色を行った。具体的には、凍結切片をPBS(-)で洗浄後、1%BSA PBS(-)溶液で30分間ブロッキング(非特異的反応を抑える操作)を行い、抗マウスc-Kit抗体(R&D systems, AF1356 )とビオチン標識したKS-13で4℃、一晩反応した。反応後PBS(-)で洗浄し、Anti-goat IgG conjugated with Alexa 488 (Invitrogen)及びStreptavidin conjugated with Alexa 546 (Invitrogen)、TOTO-3 (Invitrogen)で室温30分反応し、PBS(-)で洗浄後、マウンティングメディウム(DAKO)でマウントし、共焦点レーザー顕微鏡(オリンパスFV-1000)で観察した。
ビオチン標識したKS-13を胎齢12.5日目マウス胎仔肝臓細胞と氷上で1時間反応し、PBS(-)洗浄後Streptavidin-Microbeads (Milteny 130-048-102)と反応した。この操作で、KS-13を取り込む細胞には、Microbeadsが結合したと考えられた。次に、このサンプルをMACSカラム(Milteny LS column)に通し、KS-13を取り込んだ細胞をカラムにトラップした。1% Triton(Wako chemical)をカラムに流して細胞膜を破砕し、続けて6-8M Urea溶液あるいは2.5M Glycin溶液をカラムに流してKS-13に結合する一連のタンパク群を抽出した。この抽出溶液をMudPIT(Multidimensional Protein Identification Technology)法を用いてKS-13に結合するタンパク質を解析した。
KS-13がどのようなシグナル伝達経路を活性化するか検討するため、まず、ヒト臍帯血CD34陽性細胞をKS-13添加培地(X-VIVO 10)で2日間培養した。次にQproteome Mammalian Protein Prep Kit (QIAGEN, Cat No.37901)を用いてタンパクを抽出し、Phospho-Kinase Array Kit, Human, Proteome Profiler (R&D CatNo.ARY003)を用いて、様々なシグナル伝達経路のリン酸化を検討した。図11の結果より、Aktのリン酸化サイトT308、p53のリン酸化サイトS15のリン酸化が認められた。このことから、KS-13はAktとp53のシグナル伝達経路を制御することが明らかになった。
マウス骨髄細胞(2x107 cells)を、KS-13を50μg/mLの割合で添加した液体培地(Mesencult:Stem Cell Technologies社)またはKS-13を添加しない同液体培地で培養して、コロニー形成線維芽細胞(CFU-F)アッセイを行い、間葉系幹細胞数の指標であるCFU-Fの形成数を測定した。
多能性幹細胞より造血幹細胞及び造血幹細胞に類似する造血前駆細胞を誘導するため、マウス胚性幹細胞より胚様体誘導後中胚葉系細胞をFlow cytometryで採取し、SCFとKS-13存在下で培養後、遺伝子発現解析及び造血能力の解析を行った(図13)。
15% FBS (Fetal Bovine Serum), 2mM L-glutamine(SIGMA-ALDRICH)0.0026% (vol/vol) monothioglycerol(MTG, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan), 50 mg/ml L-ascorbic acid (Wako Pure Chemical Industries), 10 U/ml penicillin, 10 mg/ml streptomycin (SIGMA-ALDRICH)。
胎齢12.5日目マウス胎仔肝臓より、Flow cytometry法を用いて造血幹細胞(CD45(+)c-Kit(+) Sca-1(+))を純化・採取し、KS-13(30μg/mL)を添加した液体培地(SCF 50ng/mL, TPO 50ng/mLを別添したリンパ球用無血清合成培地(X-VIVO 10:Takara))で培養して生体外増幅を試みた。対照試験(コントロール)として、KS-13を添加しない液体培地(SCF 50ng/mL, TPO 50ng/mLを別添したリンパ球用無血清合成培地(X-VIVO 10:Takara))を用いた。4日間培養後、放射線照射したレシピエントLy-5.1マウスへ、体外増幅した細胞(約10000細胞)とレスキュー用1x105個のLy-5.1マウス骨髄細胞を混在し、骨髄及び尾静脈より細胞を移植した(体外増幅群:3匹、コントロール:2匹)。移植5ヶ月後にFlow cytometryを用いて造血幹細胞活性を意味する骨髄再構築能を評価した。
細胞刺激因子(50 ng/mL rm SCF, 10 ng/mL rm IL-3, 10 ng/mL rh IL-6, 3 U/mL rh EPO)(rm:組換え型、rh:組換えヒト型を意味する)を含む半固形培地(Methocult M3434;StemCellTechnologies社製)に、KS-13(配列番号1)のN末端をミリストイル化したMyristoylated KS-13(30μg/mL)、コントロールペプチド(NQVSIGCPCDGKK:配列番号22)(30μg/mL)を添加して、マウス胎仔肝臓造血幹細胞(CD45(+)c-Kit(+) Sca-1(+))(1000 cells/dish)を培養し、造血コロニー形成細胞アッセイを行い、細胞の造血能力を評価した。
ビオチン標識したKS-13をヒト臍帯血CD34陽性細胞と氷上で1時間反応し、PBS(-)洗浄後Streptavidin-Microbeads (Milteny 130-048-102)と反応した。この操作で、KS-13を取り込む細胞には、Microbeadsが結合したと考えられた。次に、このサンプルをMACSカラム(Milteny LS column)に通し、KS-13を取り込んだ細胞をカラムにトラップした。1% Triton(Wako chemical)をカラムに流して細胞膜を破砕し、続けて6-8M Urea溶液あるいは2.5M Glycin溶液をカラムに流してKS-13に結合する一連のタンパク群を抽出した。この抽出溶液をMudPIT(Multidimensional Protein Identification Technology)法を用いてKS-13に結合するタンパク質を解析した。
0.58:Uncharacterized protein C20orf54。0.47:Ig lambda chain V-I region HA。0.47:Protein CGI-301。0.47:Protein transport protein Sec61 subunit beta。0.27:DNA-binding protein A。
0.58:Small nuclear ribonucleoprotein G-like protein。0.39:Host cell factor C1 regulator 1。0.39:Keratin, type I cytoskeletal 16。0.28:Keratin, type I cytoskeletal 14。0.28:Tropomyosin beta chain。
Claims (14)
- 配列番号1及び配列番号3〜10のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 請求項1に記載する少なくとも1種のペプチド、またはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を有効成分とする造血幹細胞または造血前駆細胞の分化抑制剤。
- 請求項1に記載する少なくとも1種のペプチド、またはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を有効成分とする間葉系幹細胞の増幅促進剤。
- 請求項1に記載する少なくとも1種のペプチド、またはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を有効成分とする造血幹細胞誘導剤。
- 請求項1に記載する少なくとも1種のペプチドまたはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、請求項2に記載する分化抑制剤、または請求項3に記載する増幅促進剤を含有する培地中で、組織特異的幹細胞または組織特異的前駆細胞を培養する工程を有する、組織特異的幹細胞または組織特異的前駆細胞の増殖方法。
- 組織特異的幹細胞または組織特異的前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞であり、造血幹細胞を増幅することを含む、請求項5に記載する増殖方法。
- 組織特異的幹細胞が間葉系幹細胞であり、間葉系幹細胞を増幅することを含む、請求項5に記載する増殖方法。
- 請求項1に記載する少なくとも1種のペプチドまたはその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、または請求項4に記載する造血幹細胞誘導剤を含有する培地中で、多能性幹細胞または多能性幹細胞由来細胞を培養する工程を有する、造血幹細胞の誘導または作製方法。
- 上記多能性幹細胞が、患者由来の人工多能性幹細胞であり、遺伝子導入により正常化されてなるものである、請求項8に記載する方法。
- 上記培地がさらに、細胞刺激因子、脱メチル化剤、及び細胞外マトリックスタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種を含有するものである、請求項5〜7のいずれかに記載する方法。
- 上記培地がさらに、細胞刺激因子、脱メチル化剤、及び細胞外マトリックスタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種を含有するものである、請求項8または9に記載する方法。
- 請求項6に記載する方法、または請求項8、9又は11に記載する方法によって得られる造血幹細胞または造血前駆細胞を含む細胞集団。
- 請求項12に記載する細胞集団を含有する医薬組成物。
- 請求項1に記載する少なくとも1種のペプチドに対する抗体。
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