JP2007106760A - 造血幹細胞増殖剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明の造血幹細胞増殖剤は、胎盤構成細胞粉砕物を有効成分とするものである。本発明の造血幹細胞増殖剤は、造血幹細胞を誘導・増殖し、末梢血中の造血幹細胞量を増加させることができる。末梢血中の造血幹細胞が確実に増加するため、造血幹細胞の減少が原因で起こる、或いは起こると考えられる様々な疾患(例えば、白血病、悪性リンパ腫、再生不良性貧血、アルツハイマー病、パーキンソン病、拡張型心筋症、心筋梗塞等)の予防及び治療が可能になり、また副作用も極めて低いという特長を有する。
【選択図】 なし
Description
現在のところ造血幹細胞は「細胞表面マーカー/CD-34陽性細胞」と同義と考えられている。造血幹細胞を同定するうえでは蛍光抗体染色法とフローサイトメトリーを併用して、このCD-34陽性細胞を末梢血中から検索している。このCD-34陽性細胞はGVHD (graft-versus-host disease)を起こすことのない安全な移植材料として良く知られている。造血幹細胞は通常、ヒト骨髄中に全単核球の1〜3%程度しか存在せず、末梢血中ではわずか0.1〜0.5%のレベルでしか存在していない。また臍帯血中であってさえ造血幹細胞の存在比率は成人のそれとあまり変わることなく0.4〜0.5%の範囲である。通常では加齢や慢性退行性、慢性消耗性疾患により末梢血中の造血幹細胞は減少する傾向にある。健常な成人における末梢血中の造血幹細胞比率は全単核球の0.4%±0.05(1SD)であり、揺らぎは非常に少ない。一方、本願発明者の研究では、様々な疾患群の末梢血中の平均造血幹細胞比率は0.2%±0.15 (1SD)で、疾患の種類やその重篤度により多少の揺らぎが観察される。とくに中枢神経疾患や心筋疾患、卵巣機能不全による不妊症では末梢血中の造血幹細胞比率が極端に低く0.1%まで低下していた。
係る造血幹細胞移植に使用される造血幹細胞は、ドナーの骨髄から採取する方法、ドナーの末梢血幹細胞を採取する方法、保存臍帯血を利用する方法などにより得られている。
しかし、ドナーの骨髄から採取する方法では、ドナーを全身麻酔するなど侵襲が大きく、また骨髄液採取量も多量になるため、ドナーに大きな負担をかけることになる。
また、ドナーの末梢血幹細胞を採取する方法においては、全身麻酔の必要性はなく、また適量の造血幹細胞を採取できるという利点がある。しかし、末梢血中の造血幹細胞を増加させるために、顆粒球刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF)を投与する必要があり、当該G-CSFは顆粒球を増加させるため、発熱や全身倦怠感といった短期的な副作用に加え、予測が出来ない長期的な副作用の問題がある。
なお、保存臍帯血は補助的に利用されている程度である。
最近、臨床的にはES細胞から造られた造血幹細胞を利用することも検討されているが、造血幹細胞を造るためにES細胞を使用することは倫理的に大きな問題を含み、社会的なコンセンサスを得る必要があるが、未だこのコンセンサスは世界的に得られる方向で進んではいない。
更に、最近、造血幹細胞は文字通り血液中の様々な細胞に分化増殖するだけではなく、造血幹細胞は神経細胞や心筋細胞、肝細胞と細胞融合を起こし、これらの細胞の増殖を起こすことが証明された(非特許文献1)。このように末梢血中を流れる造血幹細胞は、通常知られている機能以外に、細胞融合というプロセスを介して様々な組織や臓器を細胞レベルで修復する機能を有していることが理解され始めている。従って、末梢血中の造血幹細胞を増加させることは、結果的に神経細胞や心筋細胞、肝細胞などの増殖を図ることにつながる。勿論、造血幹細胞は全ての血球の幹細胞であるため、免疫システムの要である白血球を初めとして、様々な血球細胞の機能の回復を図ることができる。
本発明者は、係る点を考慮して、副作用を惹起することなく、末梢血中の造血幹細胞を誘導・増殖させることを種々検討したところ、胎盤及び/又は胎盤付属物から単離、精製した胎盤構成細胞粉砕物(即ち、胎盤の細胞膜、細胞内諸器官及び/又は細胞核の粉砕物)の表面抗原及び/又は内部抗原が有するワクチン様作用により患者自身の造血幹細胞を自家誘導、増殖させ得ることを見出した。更に、有効量の胎盤構成細胞粉砕物を投与することにより、造血幹細胞の減少が原因で起こる、或いは起こると考えられる疾患を治療し得ることを見出した。
本発明は係る知見に基づくもので、患者自身の造血幹細胞を自家誘導、増殖させ、末梢血中の造血幹細胞を増加させることのできる造血幹細胞増殖剤及び当該製剤を調製する際に使用される胎盤構成細胞粉砕物の製造方法を提供する。
Nature, Vol.425, 30 Oct. 2003, p 968-972
また、本発明の製造方法は、上記製剤に使用される胎盤構成細胞粉砕物の製造方法であって、下記の工程からなる。
(1)胎盤及び/又は胎盤付属物を洗浄し、脱血する工程;
(2)水性媒体中で粉砕し、次いで遠心分離して固形成分を採取する工程;及び
(3)固形成分を精製水で洗浄する工程。
また、本発明の造血幹細胞増殖剤を生体に注入(好ましくは皮下注射)するだけで効果が得られ、極めて簡便であり、また副作用も極めて低いという特長を有する。
また、本発明の製造方法によれば、上記製剤で使用される胎盤構成細胞粉砕物を簡便に得ることができる。
上記の胎盤材料としては、ヒト胎盤材料を用いるのが好適であるが、他の哺乳動物(例えば、ブタ、ウシ、ウサギ、ヒツジ等)の胎盤材料を使用することもできる。
以下、本発明の胎盤構成細胞粉砕物の製造方法について詳細に説明する。
まず、使用される胎盤材料は正常分娩されたものを使用するのが好ましく、当然ながらHIV/HBV/HCVなどのウイルスを検査し、ウイルス感染しているものは除外する。
上記の胎盤材料は、まず、流水中で洗浄し、脱血した後、用手的に2〜3cm角に細断し水道水を用いて更に洗浄・脱血する。
次いで、細断した胎盤材料は蒸留水などの精製水中で粉砕する。粉砕は慣用の方法にて行うことができ、攪拌機を用いたミキシングなどが挙げられる。ミキシングの回転数は特に限定されないが、8000rpm程度にて行われる。精製水の使用量も適宜設定できるが、通常、細断した胎盤材料1に対して精製水1(重量比)程度とされる。ミキシング終了後、遠心分離(3000rpm、30分間程度)により分離する。分離した胎盤材料は、再度、同様にミキシング・遠心分離し、目視的に脱血が完了し、胎盤材料の粉砕が均一化する程度まで、この操作を繰り返す。
なお、前記の界面活性剤処理はバイアル瓶への分注処理直前に行われてもよい。
本発明の増殖剤は、当業者にとって周知の慣用の徐放性製剤として投与することもできる。徐放性製剤の例としては、微小球体(例えば、ナノ粒子、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ビーズ、リポソーム、複エマルジョンなど)などを挙げることができる。
ヒト胎盤材料を流水中で洗浄し、脱血した。次いで、通常のナイフで当該胎盤材料を用手的に2〜3cm角に細断し水道水を用いて更に洗浄・脱血した。細断した胎盤材料500g(通常の大きさの胎盤1胎分)に蒸留水500mlの割合で加え3分間ミキシングした。ミキシングの回転数は8000rpm程度とした。ミキシングされた胎盤材料と蒸留水の混合物を遠心分離した(3000rpm、30分間)。このミキシングと遠心分離を5回繰り返した。即ち、目視的に、脱血が完了し、胎盤材料の粉砕が均一化する程度まで行った。
脱血が完了し、均一的に粉砕された胎盤材料に、甘草抽出物を界面活性剤として加え、再度ホモジネートした(8000rpm、3分間)。ホモジネートした胎盤材料を遠心分離した(3300rpm、30分間)。
上記で採取された固形成分は、蒸留水を用いたミキシングと遠心分離により洗浄してグリセリンを除去した。次いで、蒸留水と適量の甘草抽出物を界面活性剤として添加し、ミキシングした後、5mlのガラス製バイアルに充填した。1バイアル当り、固形成分含量が100mg程度となるように調整した。
上記のバイアルを凍結乾燥に付し、乳白色の胎盤細胞膜粉砕物粉末を得た。当該バイアルをアルミシールで密封した。密封後、電子線滅菌(照射線量25kG)した。
ヒト胎盤材料を流水中で洗浄し、脱血した。次いで、通常のナイフで当該胎盤材料を用手的に2〜3cm角に細断し水道水を用いて更に洗浄・脱血した。細断した胎盤材料500g(通常の大きさの胎盤1胎分)に蒸留水500mlの割合で加え3分間ミキシングした。ミキシングの回転数は8000rpm程度とした。ミキシングされた胎盤材料と蒸留水の混合物を遠心分離した(3000rpm、30分間)。このミキシングと遠心分離を5回繰り返した。即ち、目視的に、脱血が完了し、胎盤材料の粉砕が均一化する程度まで行った。
上記で採取された固形成分は、蒸留水を用いたミキシングと遠心分離により洗浄し、次いで、採取された固形成分は凍結乾燥により乾燥した。乾燥した固形成分は、粉砕機で粉砕して、粒子径を200μm以下にした後、蒸留水と適量の甘草抽出物を界面活性剤として添加し、ミキシングした後、5mlのガラス製バイアルに充填した。1バイアル当り、固形成分含量が100mg程度となるように調整した。
上記のバイアルを凍結乾燥に付し、乳白色の胎盤構成細胞粉砕物粉末を得た。当該バイアルをアルミシールで密封した。密封後、電子線滅菌(照射線量25kG)した。
患者6名の了解を得て、実施例1で調製した胎盤構成細胞粉砕物製剤を、局所麻酔剤1%のリドカイン溶液で再分散させた後、各患者の臀部に皮下注射した(投与量:100mg/患者)。
投与後、経時的に採血し、末梢血中の単核球細胞において造血幹細胞が占める割合(%)を測定した。その結果を表1に示す。
表1に示されるように、患者番号1〜4においては、投与14日後には、造血幹細胞の割合は1.2〜1.6%に上昇し、その後徐々に減少し、造血幹細胞が誘導されていることが判明した。
一方、患者番号5及び6においては、急激な造血幹細胞の増加は認められなかったが、経時的に造血幹細胞量が増加していく傾向が認められた。
患者番号1〜4と患者番号5〜6との挙動の相違は、前者においては、病態に応じて、患者の体内が造血幹細胞を要求していた結果、造血幹細胞の誘導と増殖が顕著に発現されたものと推察される。
また、実施例2で調製した製剤を投与しても、同様な結果が認められた。
Claims (5)
- 胎盤構成細胞粉砕物を有効成分として含有する造血幹細胞増殖剤。
- 胎盤構成細胞粉砕物が、胎盤細胞膜の粉砕物である請求項1記載の造血幹細胞増殖剤。
- 粉砕物の粒子径が1〜200μmである請求項1又は2記載の造血幹細胞増殖剤。
- 剤形が凍結乾燥製剤である請求項1〜3のいずれかに記載の造血幹細胞増殖剤。
- 下記の工程からなる胎盤構成細胞粉砕物の製造方法。
(1)胎盤及び/又は胎盤付属物を洗浄し、脱血する工程;
(2)水性媒体中で粉砕し、次いで遠心分離して固形成分を採取する工程;及び
(3)固形成分を精製水で洗浄する工程。
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