CN112294949A - 包含血细胞的半流体的应用、包含该半流体的疫苗和该疫苗的制备方法 - Google Patents

包含血细胞的半流体的应用、包含该半流体的疫苗和该疫苗的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112294949A
CN112294949A CN201910706686.9A CN201910706686A CN112294949A CN 112294949 A CN112294949 A CN 112294949A CN 201910706686 A CN201910706686 A CN 201910706686A CN 112294949 A CN112294949 A CN 112294949A
Authority
CN
China
Prior art keywords
blood
tumor
cells
blood cells
semi
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910706686.9A
Other languages
English (en)
Inventor
邹方霖
邹礼常
王建霞
王艺羲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Kuachang Aopu Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Chengdu Kuachang Aopu Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Kuachang Aopu Medical Technology Co ltd filed Critical Chengdu Kuachang Aopu Medical Technology Co ltd
Priority to CN201910706686.9A priority Critical patent/CN112294949A/zh
Publication of CN112294949A publication Critical patent/CN112294949A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及一种包含血细胞的半流体的应用、包含它的疫苗、该疫苗的制备方法、以及一种治疗或抑制实体肿瘤的方法。

Description

包含血细胞的半流体的应用、包含该半流体的疫苗和该疫苗 的制备方法
技术领域
本申请涉及一种包含血细胞的半流体的应用、包含它的疫苗、该疫苗的制备方法、以及一种治疗或抑制实体肿瘤的方法。
背景技术
在机体免疫选择压力下，癌细胞往往依靠自身的高突变特性，逐步建立起免疫抑制微环境，以抵抗和抑制机体的免疫识别及反应，最终显示出其瘤体对于机体的免疫耐受。实体肿瘤疫苗开发的核心，是开发其安全、有效的抗原。多种结构层次的物质可以用作疫苗抗原，为疫苗开发提供了广阔空间。
微生物(例如细菌、病毒、寄生虫等)最早被作为抗原应用于开发实体肿瘤疫苗。尽管某些微生物活疫苗或灭活疫苗显示出一定有效性，却被认为有较高的安全性风险。除了卡介苗在膀胱癌治疗中还有所应用外，这类微生物疫苗在临床上己经少有应用。
某些肿瘤细胞随后被作为抗原应用于开发实体肿瘤疫苗。自体或异体同种肿瘤细胞经过消除致瘤性的处理后，其免疫原性显示出一定的抗肿瘤疗效。全细胞疫苗表达较全面，但成分复杂、特异性不强，性(有效性)/价(安全性)比不高。病原体通常携带有多种特异性的抗原决定簇。研究人员于是寄望于在肿瘤细胞中筛选出个别有用无害的抗原部位(例如某些表面蛋白质、DNA、等)制成亚单位疫苗。所谓的肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的发现，曾经让人们欢欣鼓舞。然而，尽管这些亚单位疫苗成分较单一、特异性较强、安全性较高，其免疫原性却较低下，性(有效性)/价(安全性)比仍然不高。亚单位抗原的准确度和微生物减毒活抗原强有力的免疫原性的结合，衍生出载体疫苗。而在体外负载亚单位抗原的自体树突状细胞(DC细胞)，又衍生出DC疫苗。然而，这些亚单位抗原衍生疫苗仍然未显示出针对大多数实体肿瘤的有效性。随着当代基因技术的发展，肿瘤新抗原(Neoantigen)再次让人们为之一振。
肿瘤新抗原是指由癌细胞基因突变所导致的、正常细胞所没有的、且能被免疫细胞所识别的一类蛋白/表位多肽。一个癌细胞所携带的突变基因数目往往巨大(成百上千)，其所产生的异常蛋白数目不小(数十至数千)，肿瘤新抗原只是其中一小部分。新技术(例妣基因测序技术、计算机模拟和蛋白质谱技术)的发展可以鉴定出这些突变基因和异常蛋白，并预测有新抗原潜力的蛋白，以及在体外筛选、合成这些新抗原。然而，多肽序列一般由几个或数十个氨基酸组成，分子量较小，化学结构简单，安全性虽高免疫原性却较弱，仍然难以诱发足够强度的免疫反应，仅有不多的成功案例被报道。
此外，某些异基因淋巴细胞也被作为抗原应用于开发非实体肿瘤疫苗。人们早就发现，在异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后，异体淋巴细胞在受体内迁移、增殖，进而以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，介导移植物抗宿主病(GVHD)。供者和受者HLA配型的不合位点越多，发生严重GVHD的可能性越大。GVHD发生时，异体淋巴细胞往往还介导移植物抗白血病反应(CVL)。在其他非血液系统恶性肿瘤中，也有GVHD和类CVL反应(延伸称之为移植物抗肿瘤反应(GVT))。然而，进一步的研究发现，异基因淋巴细胞抗原的优势抗原性为GVHD，仅显示出较低的GVT反应。于是，其优势适应症主要是一些生长缓慢的血液系统肿瘤(例如慢性髓系白血病)，而非快速进展的血液系统肿瘤(例如急性白血病、转入急变期的慢性白血病)。
也有尝试将包含异基因淋巴细胞的流体作为抗原应用于开发实体肿瘤疫苗。然而，实体肿瘤往往需要强大很多的GVT反应。而其GVT反应的增加，也会增加患者GVHD的发病率和死亡率。这类异基因淋巴细胞疫苗于是将其优势适应症局限于尽可能接近血液系统肿瘤的实体肿瘤，例如应用于尽可能小的瘤体、或在小鼠接种移植瘤后3-5天内即尽快给药。如何才能在增加GVT反应时降低其GVHD，是一个关健的困难。体现在当今临床上，这类异基因淋巴细胞疫苗治疗实体肿瘤的尝试少之又少。
尽管微生物(抗原)疫苗、肿瘤细胞(抗原)疫苗、肿瘤细胞亚单位(抗原)疫苗、肿瘤新(抗原)疫苗、异基因淋巴细胞(抗原)疫苗繁花似锦，而从临床角度看实体肿瘤疫苗的开发，似乎进步不大。大问题还在老地方：要如何才能开发出这样一种实体肿瘤疫苗抗原，其具有临床有效的所需(抗肿瘤)抗原性、同时不需抗原性(例如GVHD)又在临床安全的允许范围内？因而，仍然需要开发新的免疫策略，以满足现有技术尚不能满足的急需临床需求。
发明内容
本发明专利申请的目的，在于提供一种介导针对瘤体组织的有效免疫效应、而不需抗原性(例如GVHD)又最小化的实体肿瘤疫苗抗原，以及包含该抗原的疫苗、该疫苗的制备方法、以及该疫苗抗实体肿瘤方法。
本申请的一个方面提供包含血细胞的半流体作为抗原在制备用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗中的应用。
本申请的另一个方面提供一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗，其包含作为抗原的包含血细胞的半流体。
本申请的又一个方面提供一种治疗或抑制实体肿瘤的方法，其包括向有此需要的个体局部施用、优选为通过局部注射施用包含作为抗原的包含血细胞的半流体的疫苗。
本申请的再一个方面提供一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗的制备方法，所述疫苗包含作为抗原的包含血细胞的半流体，该方法包括以下步骤：
a.提供包含血细胞的流体；
b.对步骤a中的流体进行半流体化处理，其中所述半流体化选自以下之一种或多种：液体的半流体粘稠化、液体的半流体凝固化、非液体或凝固物的破碎。
本申请的再一个方面提供根据上述方法制备的疫苗。
根据本发明的包含血细胞的半流体作为抗原与现有技术的微生物抗原相比具有以下优点：更高的针对实体肿瘤的免疫原性，更低的生物安全性风险。
根据本发明的抗原与现有技术的肿瘤细胞及其亚单位抗原相比具有以下优点：更高的针对实体肿瘤的免疫原性，免疫原性的更宽的实体肿瘤适应症谱。
根据本发明的抗原与现有技术的异基因淋巴细胞抗原相比具有以下优点：更高的针对实体肿瘤的免疫原性，更低的应用量，更低的不需要的免疫活性(例如GVHD)。
根据本发明的包含作为抗原的包含血细胞的半流体的疫苗与现有技术的微生物疫苗相比具有以下优点：更高的抗实体肿瘤有效性，更高的生物安全性，更宽的适应症谱，更多更好的协同作用选择性。
根据本发明的疫苗与现有技术的病原体亚单位疫苗相比具有以下优点：更高的抗实体肿瘤有效性，更宽的适应症谱，更多更好的协同作用选择性。
根据本发明的疫苗与现有技术的异基因淋巴细胞疫苗相比具有以下优点：更高的抗实体肿瘤有效性，更低的移植物风险(例如GVHD)，更宽的适应症谱，更多更好的协同作用选择性。
根据本发明的抗实体肿瘤方案更容易和其它相关治疗方案联合进行。此外，该应用和该疫苗制备可控、成本便宜，而该治疗方案简便易行，特别有助于使难以承受高额费用的广大人群也享受到安全、有效治疗。
具体实施方式
根据本申请公开的一个方面，其提供包含血细胞的半流体作为抗原在用于实体肿瘤疫苗制备中的应用。
根据本申请公开的另一个方面，其提供一种实体肿瘤疫苗抗原，其为包含血细胞的半流体。
根据本申请公开的另一个方面，其提供一种实体肿瘤疫苗，其包含作为抗原的包含血细胞的半流体。
根据本申请公开的又一个方面，其提供一种实体肿瘤疫苗的制备方法，其包括制备作为抗原的包含血细胞的半流体。
根据本申请公开的再一个方面，其提供一种抗实体肿瘤方法，其包括向有此需要的个体局部给药、优选为局部注射包含作为抗原的包含血细胞的半流体的疫苗。
在本申请公开中，术语“疫苗”是指能够诱发机体针对目标疾病(例如实体肿瘤)的安全和有效免疫应答、从而安全和有效地预防或/和治疗该疾病的生物制品。术语“疫苗抗原”(在本申请公开中有时简写为抗原)是指包含在疫苗中、且其优势免疫反应为针对目标疾病(例如实体肿瘤)的所需免疫反应的生物物质。
在本申请公开中，术语“血细胞”是指天然血液中所包含的细胞及其人工衍生物。
在本发明的范围内，所述血细胞包括选自以下细胞及其衍生物之一种或多种：红细胞、白细胞、血小板，其中所述白细胞包括选自以下细胞之一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及其衍生物，其中所述淋巴细胞包括选自以下细胞之一种或多种：T细胞、B细胞、裸细胞及其衍生物。
在本申请公开中，术语“半流体”是指在限时内(例如20秒)无外压则无肉眼可见的流动、而在临床(施用时)可接受的外压(例如可施加在注射器推进装置上的外压)下可以流动并导致不可逆形变的物体，其区别于流体(流体无外压时亦有流动性)、固体(固体在临床可接受的外压下亦不可流动)、半固体(半固体在临床可接受的外压下仅发生可逆形变)。例如，某些动物器官(例如肌肉块、肝、胃、肠、心、肺、胰腺、软骨、关节等)的组织、以及某些压力下不流动的凝胶(例如纤维蛋白胶)是半固体，而不是半流体；而包含血细胞的常规液体(例如常规血液、血细胞比容≤55％的悬浮液)则是流体。
在一个实施方案中，所述半流体所包含的所述血细胞选自以下组之一种或多种：天然血液包含的所述血细胞、天然血液组分包含的所述血细胞、源自所述血细胞的富集组织的天然血细胞制备物和/或工程血细胞、工程血液(例如血浆与天然血细胞制备物和/或工程血细胞的混合物)中的血细胞。
在一个实施方案中，所述包含血细胞的半流体作为抗原优选为包括作为类侵入组织抗原。在本发明的范围内，所述包含血细胞的半流体作为抗原的必要条件(或者基本技术方案)为：使得(例如通过应用条件)它在体内形成在组成(例如包含细胞)、性质(例如柔软性)、形态/结构上类似侵入组织、且在侵入程度上足够严重的类组织结节，以能够引起对它足够的免疫识别，以及激发出针对它也针对与它类似的病变体(例如瘤体)的足够的免疫响应。
在一个实施方案中，所述包含非瘤组织的半流体作为抗原优选为包括作为类瘤侵入组织抗原。在本发明的范围内，所述包含非瘤组织的半流体作为类瘤侵入组织抗原的必要条件(或者基本技术方案)为：使得(例如通过应用条件)它在体内形成在组成(例如包含细胞的量)、性质(例如柔软性)、形态/结构上类似瘤体组织、且在侵入程度上足够严重的类瘤体结节，以能够引起对它足够的免疫识别，以及激发出针对它也针对与它类似的瘤体的足够的免疫响应。在本申请公开中，术语“类瘤入侵组织抗原”是指与肿瘤组织(而不一定是肿瘤细胞)具有在免疫识别上的类似性、且其所诱导的免疫响应可以攻击肿瘤组织的类侵入组织抗原。
在一个实施方案中，包含所述半流体的疫苗是通过瘤区给药的方式施用的。在一个实施方案中，包含所述半流体的疫苗是通过瘤外局部给药的方式施用的。在一个实施方案中，包含所述半流体的疫苗的施用包括在瘤区用药和瘤外局部用药。在一个实施方案中，所述瘤区用药包括瘤内给药。在一个实施方案中，所述瘤外局部用药包括以下之一种或多种：皮下给药、肌肉给药、粘膜给药。
在一个实施方案中，所述包含血细胞的半流体作为抗原为远离天然的状态，优选为处于易被免疫系统辨识为严重损伤状态的类侵入组织抗原。
在一个实施方案中，所述包含血细胞的半流体作为抗原的形态/结构条件包括：所述半流体为高度偏离天然状态、优选为严重损伤的状态，其中所述高度偏离天然状态包括粘稠化；所述严重损伤选自包括以下之一种或多种损伤：凝固化、机械破碎、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤。在该技术方案下，所述包含血细胞的半流体为作为高度偏离天然状态细胞群、优选为作为严重损伤细胞群诱导免疫应答的抗原。
在本发明的范围中，所述粘稠化是指包含血细胞的流体加入血细胞或/和添加剂的量达到如此之高，以至于体系不再是流体而成为非流体粘稠物。从流体变为半流体，明显远离天然血液的状态。
在本申请公开中，术语“严重损伤”是指不仅丧失生理功能且能被机体免疫系统识别和应对作重大创伤加以消除的损伤状态。
在本发明的范围内，所述凝固化损伤、机械破碎、超声损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤可分别通过以下处理来获得：凝固化处理、机械破碎、超声处理、热处理、冻融处理、照射处理、化学处理。众所周知，这些处理可以改变细胞包容物(例如组织)的结构、形态，导致严重损伤。这些处理不仅导致细胞包容物损伤，往往也可以改变细胞结构、形态，从而使得细胞损伤(例如细胞的机械损伤、超声波损伤、热损伤、冻融损伤、照射损伤、化学损伤)。经这些损伤后，细胞包容物(例如组织)甚至细胞均丧失生理功能(例如不能再被用于器官移植或组织移植，以及细胞增殖弱化)，而且更易被机体免疫系统作为重大创伤(例如其优势抗原性不再是异基因抗原性)识别和应对。
在本发明的范围中，所述凝固化是使液体转化为固体或半固体的处理，其包括选自本领域公知的任何液体组织的凝固化处理，例如：自凝固化(例如自凝固血液)、热凝固化(例如热凝固血液)、凝固剂凝固化(例如凝固剂凝固血液)。其中，热凝固化可以通过热处理来进行，凝固剂凝固化是通过在液体中加入凝固剂(例如血液中加入凝血酶和氯化钙)来进行。
在本发明的范围中，所述机械破碎包括机械分割(例如组织取样)和剪切破碎。所述剪切破碎是指将待处理物体(例如凝固物)施以转速为≥10转/分、优选10-50000转/分的剪切，其中所述剪切破碎可以通过搅拌机、研磨机或匀漿机来进行。凝固物经机械破碎后可以变为颗粒。
在本发明的范围中，所述超声处理是指将待处理物体(例如血液、细胞沉淀)放入超声装置中进行超声(例如工作频率为2-60kHZ)以使其结构受到破坏。
在本发明范围内，所述热处理选自包括以下之一种或多种：直接热处理、蒸汽热处理、冻干热处理、微波热处理、射频热处理、激光热处理，热处理温度为≥40℃、优选为60℃-115℃。
在本发明范围内，所述冻融处理包括冷冻处理和冷冻物的融化处理，其中所述冷冻处理选自机械制冷或/和液氮制冷，制冷温度为≤-60℃、优选为-60℃-160℃。
在本发明范围内，所述照射处理(例如照射強度为20-100Gy)选自包括以下之一种或多种：X射线照射处理、γ射线照射处理、光敏性药物+紫外线照射处理。
在本发明范围内，所述化学处理是指将待处理物体加入化学破坏剂(例如酸、碱、乙醇等硬化剂)以使其结构受到破坏。
在一个实施方案中，所述血细胞为灭活血细胞。在本发明范围内，所述灭活血细胞为经受严重损伤且失去增殖活性的血细胞。
在一个实施方案中，所述包含血细胞的半流体包括所述血细胞的半流体化产物，其中所述半流体化选自包括以下组之一种或多种：液体的半流体粘稠化、液体的半流体凝固化、非液体或凝固物的破碎化。
在本申请公开中，术语“半流体粘稠化”是指非流体粘稠物为半流体粘稠物的粘稠化。例如：工程组织白细胞/血浆或红细胞/血浆中的细胞比容达70％以上时，体系从流体转变为半流体；术语“半流体凝固化”是指将液体转化为半流体的凝固化，例如血液或血细胞/血漿混合物的自凝固化(例如不加热、不加凝固剂的凝固)、热凝固化(例如中低温加热凝固)等；术语“破碎化”是指将非液体或凝固物进行机械分割或剪切破碎在内的碎块化处理以致于形成半流体、优选可注射半流体，其中所述剪切破碎可以通过搅拌机、研磨机或匀漿机(例如转速为≥10转/分、优选10-50000转/分的剪切)来进行。
在一个实施方案中，所述包含血细胞的半流体作为抗原的形态/结构条件包括：所述半流体选自以下组之一种或多种：包含所述血细胞的半流体粘稠物、包含所述血细胞的半流体凝固物、包含所述血细胞的凝固物的破碎物。在该技术方案下，所述半流体优选为作为体内非正常结节、尤其是严重损伤结节诱导免疫应答的抗原。
在一个实施方案中，所述包含血细胞的半流体优选为选自以下组之一种或多种：包含所述血细胞的半流体凝固物、包含所述血细胞的凝固物的破碎物。
在一个实施方案中，所述凝固物包括包含血细胞的液体体系的自凝固物、凝固剂致凝固物、热凝固物。
在一个实施方案中，所述半流体中所述血细胞的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6×109个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×109-22×109个细胞/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5×109-22×109个细胞/ml)。
在一个实施方案中，所述半流体中细胞比容为55％-86％(或细胞浓度为14.0×109-22×109个细胞/ml)。
在一个实施方案中，所述包含血细胞的半流体作为抗原优选为包括作为尺寸较大的半流体结节抗原。
在一个实施方案中，所述半流体的组成、性质、形态/结构和应用条件使得其在施用处形成体积>100mm3，优选为≥200mm3的半流体结节。
在本申请公开中，术语“尺寸较大的半流体结节抗原”是指由尺寸较大的半流体结节本身的结构(形态)特点致其特异性免疫原的抗原，其区别于分子形态的抗原(例如微生物抗原、肿瘤抗原、异基因免疫细胞抗原等)、以及半流体形态的抗原(例如半流体移植物抗原等)。术语“微生物抗原”、“肿瘤抗原”、“异基因免疫细胞抗原”、“半流体移植物抗原”则是指分别以微生物的种属特异分子、肿瘤细胞的病原特异分子、异基因免疫细胞的异基因特异分子、半流体移植物的种属或异基因特异分子为其特异性免疫原的抗原。当这些抗原被用作疫苗抗原时，相应的疫苗分别被称作“半流体结节抗原疫苗”、“微生物疫苗”、“肿瘤抗原疫苗”、“异基因免疫细胞疫苗”等等。结构越复杂的物质，其携带的抗原决定要素(例如抗原决定基)通常也越多。例如，尽管微生物亚单位抗原更安全、更易制备，临床上应用的很多疫苗仍然主要还是活微生物疫苗。
在一个实施方案中，所述半流体优选为可挤流半流体。在本发明的范围内，所述可挤流半流体是指可在临床接受的压力下流过针管的半流体。
在一个实施方案中，所述半流体为植入剂、优选为注射剂，且其单个动物给药量为>0.1ml，优选为≥0.2ml或0.2-25ml。所述半流体作为抗原的必要条件提供了多重仿瘤体特征，而较大的注射量则使所形成的半流体结节更易被免疫识别作半流体结节抗原。
在本发明的范围内，所述半流体注射剂为可以通过常规注射系统直接用药的半流体。而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如原位凝胶化)结节。
在一个实施方案中，所述半流体的皮下半消失期为≥0.1日，优选为0.1-30日。
在本发明的范围内，所述半流体中包含的血细胞源自哺乳动物。所述哺乳动物选自以下之一种或多种：人、猪、马、羊、牛、兔、鼠。这些动物可以是完全自然进化的动物，也可以是经过生物技术(例如基因编辑技术)改造的动物(例如GAL抗原敲除猪)。
在一个实施方案中，所述半流体包含选自以下组之一种或多种：包含所述血细胞的天然血液、包含所述血细胞的血液组分、源自所述血细胞的富集组织的天然血细胞制备物和/或工程血细胞、包含所述血细胞的工程血液(例如血浆与天然血细胞制备物和/或工程血细胞的混合物)。
在一个实施方案中，所述半流体为选自以下组之一种或多种：包含所述天然血液的半流体凝固物、包含所述血液组分的半流体凝固物、包含所述血细胞制备物和/或工程血细胞的半流体粘稠物、包含所述血细胞的血漿凝固物、包含所述血细胞的凝固物的破碎物。
在一个实施方案中，所述半流体为包含天然血液的半流体凝固物。
在一个实施方案中，所述半流体为包含所述血液组分的半流体凝固物。
在一个实施方案中，所述半流体为包含所述血细胞制备物和/或工程血细胞的半流体粘稠物。
在一个实施方案中，所述半流体粘稠物的细胞比容≥70％。
在一个实施方案中，所述半流体粘稠物包含增粘剂。所述增粘剂选自包括以下之一种或多种：聚乙二醇、淀粉、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、聚乙烯毗咯烷酮。
在一个实施方案中，所述半流体为包含所述血细胞的血漿凝固物。所述血液、血液组分或血漿凝固物包括以下之一种或多种：自凝固物、热凝固物、凝固剂半流体凝固物。
在本申请公开中，术语“自凝固物”是指血液、血液组分或血漿自然凝固形成的凝固物。术语“热凝固物”是指血液、血液组分或血漿经热处理形成的凝固物。术语“凝固剂半流体凝固物”是指血液、血液组分或血漿加入凝固剂所形成的半流体凝固物(而非固体或半固体凝固物)。
在一个实施方案中，所述凝固剂包括血液凝固剂，其中所述血液凝固剂选自包括以下之一种或多种：凝血酶例如牛凝血酶、猪凝血酶、重组人凝血酶、自体凝血酶，其它凝血蛋白例如凝血因子、凝血酶原复合物、及它们的活化形式，钙离子提供剂例如氯化钙、氢氧化钙、碳酸钙。
在一个实施方案中，所述半流体为所述凝固物的破碎物。所述破碎物包括颗粒群。在一个实施方案中，所述颗粒优选为肉眼可辨的宏观颗粒。在一个实施方案中，所述颗粒的最长端的横切面的平均直径为≥100nm，优选为500nm-1mm或1μm-1mm。
在一个实施方案中，所述包含血漿的半流体的半消失期为≥0.1日、优选为0.1-20日。
在一个实施方案中，所述包含血漿的半流体的半消失期为≥1日、优选为2-20日。
在一个实施方案中，所述包含血细胞的半流体作为抗原优选为包括作为其优势抗原性为抗所述实体肿瘤抗原性而非抗宿主抗原性的抗原。
根据本发明的半流体，其作为抗原在上述条件下应用时，优选为其优势抗原性为抗所述实体肿瘤抗原性而非抗宿主抗原性的半流体。
在一个实施方案中，所述半流体优选为抑瘤率为≥抗宿主率、优选为抑瘤率/抗宿主率≥150％的半流体。
物质作为抗原所导致的免疫识别和免疫响应的复杂性，远远超过其作为化疗药物所导致的后果。在免疫系统的多层次、多元化的网络格局中，一个物质有可能导致多种免疫反应，显示多种抗原性。在本申请公开中，术语“优势免疫反应”是指所激活的主要免疫反应。术语“优势抗原性”是指在优势免疫反应中显示的抗原性。例如，异基因淋巴细胞可攻击受者正常细胞(移植物抗宿主反应)和癌细胞(移植物抗肿瘤反应)，也可激活受者淋巴细胞攻击癌细胞(宿主抗肿瘤反应)和异基因细胞(宿主抗移植物反应)。由于其优势免疫反应为移植物抗宿主反应，其次为移植物抗肿瘤反应，宿主抗肿瘤反应则较弱，故异基因淋巴细胞本身是一种抗宿主抗原，可以用作抗肿瘤细胞(例如白血病)抗原，却很难被用作实体肿瘤疫苗抗原。
在一个实施方案中，所述半流体中包含的血细胞可以是异种或异基因抗原性最小化的细胞。
在本申请公开中，术语“异种抗原”是指源自受试者的不同物种且代表其种属特异性的抗原；术语“同种异基因抗原”是指源自受试者的同种异体等位基因差异的抗原，例如主要组织相容性抗原(MHC抗原，例如人类白细胞抗原(HLA))、次要组织相容性抗原(mH抗原)和其它组织相容性抗原(例如人类血型抗原、组织特异性抗原等)。
在一个实施方案中，所述血细胞为选自以下组之一种或多种：源于ABO血型相符或HLA相近的同种异基因组织的血细胞、源于同种同基因组织的血细胞、源于自体组织的血细胞。
在一个实施方案中，所述血细胞包括源于ABO血型相符或HLA相近的同种异基因组织的血细胞。
在一个实施方案中，所述血细胞包括源于自体组织的血细胞。在一个实施方案中，所述血细胞包括源于自体组织和同种异体组织的血细胞。
在一个实施方案中，所述包含作为抗原的包含血细胞的半流体的疫苗还可另外包含抗实体肿瘤的活性成分。在所述疫苗包含抗实体肿瘤的活性成分的情况下，该半流体可以作为免疫增强抗原，其中所述免疫增强是指所述半流体与活性成分的组合物产生出高于组合物之任一单药单用的免疫疗效。所述免疫增强包括所述半流体与活性成分的组合物的协同作用。
在本发明的范围内，所述协同作用包括选自以下抗所述实体肿瘤的协同作用的一个或多个方面：免疫协同作用和/或化疗协同作用。例如，本发明的半流体瘤内用药可作为组织破坏成分参与释放瘤内原位抗原，而与化疗药物的协同作用加强组织破坏以及激活、释放瘤内原位抗原，有利于免疫加强。
在本发明的范围中，术语“原位抗原”是指活体内病变体中包含的有可能诱发机体的特异性免疫应答的物质(例如含有实体肿瘤抗原信息的瘤内实体肿瘤细胞材料、胞外体、多肽及核酸序列等)，其实际上包含大量的有别于正常机体的抗原信息，只是这些信息被某些病理因素(例如肿瘤微环境)所屏蔽，从而不能被常规免疫系统识别并反应。
在一个实施方案中，所述抗实体肿瘤活性成分选自抗实体肿瘤化疗药物或/和生物制品之一种或多种。在一个实施方案中，所述活性成分与所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
在一个实施方案中，所述化疗药物与所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。在一个实施方案中，所述生物制品与所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
在一个实施方案中，所述生物制品选自包括以下组之一种或多种：免疫调节类抗体、细胞因子、病原体或病原体亚单位。
在本发明的范围中，所述免疫调节类抗体药物选自以下组之一种或多种：针对抑制性受体的抗体阻断剂(例如针对CTLA-4分子和PD-1分子的阻断性抗体)、针对抑制性受体的配体的抗体阻断剂、针对免疫反应细胞表面刺激分子(例如OX40、CD137、4-1BB等)的激活性抗体、针对实体肿瘤微环境中免疫抑制性分子如TGF-p1的中和抗体。
在一个实施方案中，所述细胞因子选自以下之一种或多种：肿瘤坏死因子、干扰素、白介素。
在一个实施方案中，所述病原体或病原体亚单位中的所述病原体选自以下组之一种或多种：肿瘤细胞、细菌、病毒。
在本申请公开中，术语“病原体”是指可致病生物体或其他生物媒介，可致病生物体包括例如寄生虫(例如原虫、蠕虫等等)、细菌、真菌、病毒、立克次氐体、衣原体、支原体、螺旋体，其他生物媒介包括例如微生物重组体、病变细胞(例如实体肿瘤细胞)；术语“病原体亚单位”是指病原体的免疫活性成分及其人造类似物，例如寄生物、细菌、病毒、肿瘤细胞、它们的免疫活性成分成分(DNA、蛋白质、多肽片断、等等)(例如肿瘤亚单位抗原、非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸(CpG ODN)、等等)。
在一个实施方案中，所述化疗药物选自细胞毒药物和/或常规无效但局部有效化合物之一种或多种。在一个实施方案中，所述细胞毒药物和半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-15)/100。在一个实施方案中，所述常规无效但局部有效化合物和半流体的量比(w/w或v/v)为(0.5-30)/100。
在本申请公开中，术语“细胞毒药物”是指在安全剂量下可以通过吸收作用有效的药物(例如抗肿瘤化疗药物)，其选自药学上可接受的任何细胞毒药物，优选为选自本领域公知的细胞毒药物，更优选为选自中国、美国或欧洲官方主管行政部门(例如FDA或中国药监局)己批准或将批准、或经中国、美国或欧洲官方药典己载入或将载入的抗肿瘤化疗药物。
在一个实施方案中，所述细胞毒药物可以为选自以下组之一种或多种：尿嘧啶衍生物类、环磷酰胺类、吉西他滨类、表柔比星类、抗肿瘤抗生素类、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉烷类；优选为选自以下药物及其类似衍生物一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗实体肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。
在一个实施方案中，所述抗肿瘤化疗药物在所述疫苗中的浓度大于其饱和浓度的50％、优选为其饱和浓度的50-500％，其中所述饱和浓度是指所述抗实体肿瘤化疗药物在其药用溶媒中的饱和浓度。
在一个实施方案中，所述常规无效但局部有效化合物选自以下组之一种或多种：氨基酸类营养素、无效芳香化合物、非动物生物活性成分。
在本申请公开中，术语“常规无效但局部有效化合物”是指在安全剂量下通过吸收作用临床无效的药物(例如抗肿瘤化疗药物)，其选自例如中国、美国或欧洲官方药典己载入的抗肿瘤化疗药物之外的药物。
在本发明的范围内，作为所述氨基酸类营养素的氨基酸、氨基酸盐、寡肽优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸(GABA)、茶氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸；更优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。
在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素在该疫苗中的浓度(w/w)为大于≥5％、优选为10-35％或18-35％，更优选为15％-35％或20％-35％。
在本申请公开中，术语“无效芳香化合物”是指在安全剂量下通过吸收作用不能有效抑制肿瘤的芳香化合物。所述无效芳香化合物包括药学上可接受的任何无效芳香化合物。在本发明的范围内，所述无效芳香化合物为选自以下组之一种或多种：色素芳香化合物、水杨酸类化合物、喹啉类化合物。
在一个实施方案中，所述无效芳香化合物在疫苗中的浓度(w/v)≥0.35％、优选为0.35-20％。
在本申请公开中，术语“色素芳香化合物”是指药学上可以接受的能够使靶区有选择性的将特定波长的光吸收或反射的芳香化合物，其可以例如包括活体染料、光敏剂和有色化疗药物。
在一个实施方案中，所述色素芳香化合物可以为选自以下化合物及其衍生物之一种或多种：亚甲蓝(包括其水合物)、专利蓝、异硫蓝、孟加拉红、混合卟啉类光敏剂、卟啉类化合物(例如卟啉、卟吩、红紫素、内源性卟啉)、硝基酚化合物。在一个实施方案中，所述色素芳香化合物在该疫苗中的浓度(w/v)≥0.35％、优选为0.5-10％。
在一个实施方案中，所述水杨酸类化合物为选自水杨酸和以下化合物及其衍生物之一种或多种：乙酰水杨酸、二氟苯水杨酸、双水杨酸酯、双香豆素、赖氨匹林。在一个实施方案中，所述水杨酸类化合物在该疫苗中的浓度(w/v)≥0.5％、优选为0.5-2.0％。
在一个实施方案中，所述喹啉类化合物选自水溶性喹啉类化合物，优选为选自以下之一种或多种：奎宁、盐酸奎宁、二盐酸奎宁、氯喹。在一个实施方案中，所述喹啉类化合物在该疫苗中的浓度(w/v)≥3％、优选为3-6％。
在本申请公开中，术语“非动物生物活性成分”是指具有药学活性的生物提取物及其类似物。术语“生物提取物”是指以植物、微生物等生物材料为原料、通过分离过程及其它加工过程获取的特定组分(例如基于特定结构的纯化物)。术语“类似物”是指虽不相同、但结构或/和性质上相似的天然产物、衍生物、半合成物、或合成物。
在本发明的范围内，所述非动物生物活性成分选自具有以下之一种或多种结构的生物提取物及其类似物：苷、多酚、多糖、萜类、黄酮。
在一个实施方案中，所述组织破坏剂选自以下组之一种或多种：抗实体肿瘤化疗药物例如5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇，氨基酸类营养素例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽，无效芳香化合物例如亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁，非动物生物活性成分例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖、青蒿素。
在一个实施方案中，所述疫苗还任选地包含选自常规佐剂的佐剂。在本申请公开中，术语“佐剂”是指与疫苗抗原混合后能增强机体针对疫苗抗原的免疫应答能力、或改变免疫反应类型的本发明公开的添加剂。根据这一定义，疫苗佐剂与通常意义上的免疫增强剂有所不同，后者起作用往往不必与疫苗抗原混合。
在本申请公开中，术语“常规佐剂”是指本领域技术人员已知的任意合适佐剂，例如可以是油/乳佐剂。在本申请公开中，术语“油/乳佐剂”是指基于油或/和乳化物的佐剂(例如弗式佐剂、MF59)。
根据本申请公开的半流体中的所述添加剂还可进一步任选地包括赋形剂。所述赋形剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可包括例如以下之一种或多种：分散介质、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂等。所述防腐剂例如抗氧化剂例(如抗坏血酸)。
在本申请公开中，所述疫苗是用于治疗或者抑制实体肿瘤。在一个实施方案中，所述实体肿瘤为瘤体体积>85mm3、优选为≥200mm3、更优选为≥300mm3的实体肿瘤，尤其是瘤体体积≥400mm3、优选为≥600mm3的恶性肿瘤。
在本申请公开中，所用术语“实体肿瘤”是指有瘤体的任何恶性肿瘤。例如白血病、恶性淋巴瘤、等则是非实体肿瘤。
在一个实施方案中，所述实体肿瘤包括：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
本发明中的所述疫苗是一种局部用药疫苗，当其用于预防和治疗疾病时，还可与其它疗法，例如介入疗法、全身化疗、其它免疫疗法(例如去免疫耐受的免疫疗法)、光动力疗法、声动力疗法、手术干预或此类疗法的组合相组合施用，以进一步提高疗效。
根据本申请公开的又一个方面，其提供一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗的制备方法，所述疫苗包含作为抗原的包含血细胞的半流体，该方法包括以下步骤：
a.提供包含血细胞的流体；
b.对步骤a中的流体进行半流体化处理，其中所述半流体化选自以下之一种或多种：液体的半流体粘稠化、液体的半流体凝固化、非液体或凝固物的破碎。
如有涉及，本申请公开之前述方面中各相关术语的定义和描述也适用于此方面。
在一个实施方案中，所述步骤a可包括以下步骤：由天然血液或浓缩血液提供所述包含血细胞的流体。
在一个实施方案中，所述步骤a可包括以下步骤：自富集血细胞的器官和/或组织得到血细胞制备物和/或工程血细胞，并任选地将所述混入天然血浆、人造血浆或合适的载体中。
在本发明的范围中，所述血细胞制备物和/或工程血细胞包括从天然血液中分离获得的细胞成分(例如沉淀)、白细胞成分(例如沉淀)、红细胞成分(例如沉淀)、血小板成分(例如沉淀)，从骨髓等组织提取和制备的造血干细胞等，由肾脏等组织提取和制备的淋巴细胞，通过体外诱导、激活、扩增的自体或异体的血细胞，例如DC细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞、DC-CIK、CTL细胞，TCR-T细胞、CAR-T细胞、NK细胞，γδ干细胞等。
在一个实施方案中，在所述半流体化处理之前或之后还加入抗实体肿瘤活性成分进行混合，得到包含所述血细胞和活性成分的半流体。
在根据本发明之制备所述疫苗的方法中，在进行步骤b期间还可进行本申请公开中所述的其它严重损伤处理，例如，机械破碎、凝固化处理、热处理、冻融处理、照射处理、化学处理。在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括机械破碎。在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括热处理。在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括冻融处理。在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括照射处理。在一个实施方案中，所述严重损伤处理包括化学处理。
在根据本申请公开的制备疫苗的方法中，如上制备的半流体状的疫苗可进一步进行分装，该分装物可作为制剂(优选为植入剂、更优选为注射剂)备临床使用，或进一步经过冷冻干燥处理制备为冻干制剂(例如注射用粉针剂)备临床使用。
在本申请公开中，术语“注射剂”是指合乎药政当局注射剂标准的可通过针管给药的药物。注射剂包括全身用药注射剂(例如静脉注射剂)和局部用药注射剂(例如皮下给药注射剂、肌内给药注射剂、血液内给药注射剂等)。
所述冷冻干燥处理的工艺条件例如包括：预冻条件为在预冻温度-45℃保持4小时；升华干燥条件为升温速率为0.1℃/分钟、且升至-15℃时至少保持10小时；解吸附干燥条件为30℃保持6小时。该冻干制备物可与液体介质(例如水或含增粘剂的水溶液)混合后直接局部给药。
基于在下文中更详细描述的研究，尽管具体机理尚待进一步研究，本发明的疫苗显示出快速治疗和后续治疗、短效与长效的有机统一，且对患者正常血液几无损害，从而达到安全、有效治疗疾病的药学效果。
实施例
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。在以下实施例中，所有的试验动物均依照相关法规及行业自律进行。如无特殊说明，所有试验均按常规方法进行。
以下具体实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所用的部分添加剂列于表1中。
表1
Figure BDA0002152345830000131
在本发明中，L-氨基酸均简写为氨基酸(例如L-精氨酸均简写为精氨酸)。
以下实施例中所用的实验动物均为通过专业实验动物公司购入，均为SPF(Specific Pathogen Free，无特定病原体)级动物。以小鼠为例，共有5种：BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠、CB6F1小鼠、CC3HF1小鼠、裸小鼠，其中：CB6F1小鼠为BALB/c×C57BL/6杂交F1代雌性小鼠(表型为H-2b/d)，CC3HF1小鼠为BALB/c×C3H杂交F1代雌性小鼠(表型为H-2d/k)、裸小鼠为裸基因(nu)导入BALB/c小鼠获得的突变系(BALB/c–nu)小鼠。小鼠均为6-8周龄健康雌性、体重17.5-20.5g。除非另有说明，在以下实施例中，BALB/c小鼠被简写为B鼠，C57BL/6小鼠被简写为C鼠。实验动物器官、组织和细胞均为通过实验动物公司购入或用实验动物依规作常规制备，包括：血液、血漿等。人血液、人白细胞沉淀、人血漿从法规规定的处置机构合法获得。
在以下实施例中，除非另有说明，皮下移植瘤动物试验均依据药管当局颁发的试验指南、按常规的实体瘤细胞皮下接种方法进行。除非另有说明，实体瘤长至所需体积(例如小鼠荷瘤30-500mm3)则为建模成功，然后采用PEMS 3.2软件(四川大学华西公共卫生学院编制)随机分为若干个实验组，每组6只动物。试验观察、测量和分析的项目，包括一般状态、体重、摄食量、动物移植物抗宿主病、实体瘤体积、瘤重、生存时间等。
实体瘤体积计算公式如下：
实体瘤体积(V)＝l/2×a×b2，其中a表示实体瘤长，b表示实体瘤宽。
实体瘤生长抑制率(本发明中简记为抑瘤率)计算公式如下：
抑瘤率Y(％)＝(CW-TW)/CW×100％，其中TW为研究组的平均瘤重；CW为阴性对照组的平均瘤重。
动物移植物抗宿主病的观察项目及评分如下表2所示。
表2 移植物抗宿主病评分
观察指标 0分 1分 2分
体质量减轻 <10％ 10％～25％ >25％
活动能力 正常 减弱 静止不动
皮毛 正常 轻度混乱 色度差，混乱
皮肤完整度 正常 脚趾、尾部轻度蜕皮 严重脱毛
姿势 正常 轻度弓背 严重弓背向上
每只动物评分为5项得分之和，最高10分，最低0分。
移植物抗宿主率计算公式如下：
抗宿主率Z(％)＝(研究组移植物抗宿主病评分的平均值-阴性对照组移植物抗宿主病评分的平均值)/(每只动物移植物抗宿主病评分的可能最高值)×100％
在以下实施例中，实验结果(例如瘤重)采用均数±标准差(x±s)表示，两个实验动物组与组均数之间的差别采用统计学软件SPSS 19.0软件进行显著性检验来比较，检验选用统计量t来进行，检验水准α＝0.05，P<0.05表示差异有统计学意义，否则无统计学意义。
在本发明的范围內，A药和B药的组合物记为B/A。以下实施例中，除非另有说明，A药和B药分别为包含血细胞的半流体和活性组分。除非另有说明，A、B、A/B的药效均为抑瘤率。改善抗肿瘤药物的药效一直是世界最大的医药难题。哪怕百分之几的药效提高也难之又难，以致于联合用药的理论预期通常不高，而一旦实现就意义重大。药物联合使用产生的药效，理论上可依据于q判断进行：
q＝实际合用效应/理论单纯相加预期效应。
当q＝1时，实际合用效应符合理论预期，显示为相加作用；当q<1时，实际合用效应弱于理论预期，显示为拮抗作用；当q>1时，实际合用效应超理论预期，显示为协同作用。
本申请公开中使用的q计算基于Burgi法(Burgi Y.Pharmacology；Drug actionsand reactions.Cancer res.1978，38(2)，284-285)的金正均改进法(金正均，合并用药中的相加，中国药理学报1980；1(2)，70-76)：
q＝EA+B/(EA+EB-EA·EB)，
其中EA+B为A药和B药实际合用效应，EA为A药单用效应，EB为B药单用效应，(EA+EB-EA·EB)为A药和B药理论单纯相加预期效应。为了更符合动物实验中的实际误差范围，他进一步用q＝1±15％代替q＝1作为相加作用的判定式。
文献中常见的另一种抗肿瘤联合用药药效判断方法，基于显著性检验(例如p判断)。在以下抗肿瘤动物实验中，将既合乎q判断又合乎p判断的组合物的药学效应(抑瘤率)判断为实际合用效应与理论预期之间的明显关系：
1).当0.85≤q≤1.15、以及EA+B与EA之间或EA+B与EB之间的差异无统计学意义(p≥0.05)，则判断为相加作用或未超预期的作用；
2).当q<0.85、以及EA+B与EA之间和EA+B与EB之间的差异有统计学意义(p<0.05)，则判断为明显拮抗作用；
3).当q>1.15、以及EA+B与EA之间和EA+B与EB之间的差异有统计学意义(p<0.05)，则判断为明显协同作用。
实施例1：疫苗的制备
以下实施例中，所用血细胞选自以下组之一种或多种：
1)血液中的血细胞。例如，使用包含所需血细胞的血液；
2)血液组分中富集的所需血细胞。例如，使用富含血细胞的血细胞浓缩血液；
3)源自富集血细胞的器官和/或组织的天然血细胞制备物和/或工程血细胞。天然细胞制备物包括纯化的天然细胞及其衍生物。例如，按照现有技术从天然血液分离获得的细胞沉淀、白细胞沉淀、红细胞沉淀、血小板沉淀。又例如，按照现有技术从骨髓等组织提取和制备的造血干细胞等。又例如，通过体外诱导、激活、扩增自体或异体的血细胞，例如DC细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞、DC-CIK、CTL细胞，TCR-T细胞、CAR-T细胞、NK细胞，γδ干细胞等。又例如，按照现有技术从动物脾经红细胞裂解去除处理后获得的淋巴细胞，其制备例如：将动物处死后取脾并温和破碎，再分别加入无血清DMEM培养液、红细胞裂解液(0.0075％氯化铵/0.0026％Tris加入除菌水溶液溶解并稀释至500mL)，温和搅拌后静止5钟，进行离心洗涤3次(离心条件为1 000rpm/min，沉淀重悬液为无血清DMEM)，最后获得淋巴细胞沉淀。
1、包含血细胞的半流体以及疫苗的制备
通过本发明公开的方法(半流体粘稠化、液体的半流体凝固化、凝固物的破碎化)，可以制备本发明的半流体以及包含该半流体的疫苗。下表列举了本实施例的部分制备物(制备物编号)、用以制备它的血液、主要制备步骤、以及制备所达到的作用和其结节性。
表3
Figure BDA0002152345830000161
比容：血细胞比容按血常规测定方法测定(例如使用全自动血液细胞分析仪BC5000)。例如，43％细胞比容的小鼠血液中的细胞浓度为11×109个/ml。比容：血细胞比容由相关动物实验公司的兽医提供；
作用：A表示半流体化的有无(+为有)，B表示严重损伤的有无(+为有)。
结节：表示能否在注射处形成半流体结节(+为能)，具体如下：将100μl上表中的制备物注射至BALB/c小鼠左腋皮下形成结节，且该结节在食指和拇指掐压下可产生不可逆形变。除半流体粘稠物(X8、X9、X10、X13)为0.1-0.5日外，其它半流体结节的皮下半消失期为1-30日。小鼠：表中的小鼠均为BALB/c小鼠。当细胞悬浮液的细胞比容≥70％时，其转化为半流体粘稠物。
混合搅拌：在本实施例中，除非另有说明，混合搅拌为机械搅拌(转速10-100转/分、总时间1-3分钟)，其可造成机械损伤。
以下列出本发明的半流体的制备试验的几个实施例。
实施例1a：杀死一只新西兰免并取15ml免血，在室温下静置30分钟，便获得自凝固血液(表2中X1)。
实施例1b：杀死一只新西兰免并取15ml免血于预置抗凝剂枸橼酸钠的杯中，慢搅拌均匀后将杯加盖，再放在蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得热凝固血液(表2中X2)。
使用与X2制备相同的方法，可分别进行表2中制备物X3、X4和X14的制备。
实施例1c：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)，混合在杯中获得约6ml血液，杯放入超声仪(温度5-25℃、工作频率10-30kHZ)中处理5-50分钟，再将杯加盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸5分钟，便获得表2中制备物X5。
实施例1d：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)，加入预置凝血剂(例如终浓度10-100U/1ml的凝血酶和5-25mmol/L的氯化钙)的杯中混合均匀，静置30分钟后获得半流体凝固物，再经搅拌破碎(转速3000-10000转/分、总时间1-3分钟)便获得上表中制备物X6。
实施例1e：从多只小鼠眼眶分别取血(无抗凝剂)3ml至杯，静置后抽除1ml上清液(主要含血清)，再将杯加盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸5分钟，便获得表2中制备物X7。使用马血液通过相同制备便获得上表中制备物X14。
实施例1f：从多只小鼠眼眶分别取血，离心去除血清后便获得上表中制备物X8。
实施例1g：从20只小鼠眼眶分别取血，经常规的白细胞富集血液制备方法(血液离心+白细胞分选富集)，便获得上表中制备物X9。
实施例1h：从生产人除白红细胞(血液离心+白细胞分选富集)时所获含血被滤除的人白细胞含血液沉淀，便获得上表中制备物X10。
实施例1i：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合、离心后获得血漿，将3ml该血浆与2ml淋巴细胞沉淀(细胞比容72％)在杯中搅拌均匀，再加盖可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得制备物X11。
实施例1j：将6g人血液与4g取自脱白细胞滤器中的人白细胞沉淀(细胞比容77％)混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸10分钟，便获得上表中制备物X12。
实施例1k：将4g人血浆与6g取自脱白细胞滤器中的人白细胞沉淀(细胞比容77％)混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸10分钟，便获得上表中制备物X13。
实施例1l：从人血液离心去除40％体积上清液(血清)后的浓缩血液放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得上表中制备物X15。
上述制备物均为可注射半流体，分装至注射器后即可作为疫苗使用。
2、包含血细胞的半流体和活性成分的组合物以及疫苗的制备
本发明的包含血液的半流体作为抗原可以作为抗原和活性成分的协同成分用于药物制备。通过本发明公开的制备方法，在血细胞半流体化或/和严重损伤处理前、中、后加入添加药物(生物制品和/或组织破坏剂)并适当混合，便制备出本发明的包含血细胞和活性成分的半流体。其中所述活性成分包括生物制品和/或组织破坏剂。
组织破坏剂和绝大多数生物制品通过商业途径获得(例如表1)。本实施例所用肿瘤抗原按如下方法制备：将肿瘤细胞液(108-109个细胞/ml)进行常规的冻融灭活处理(放入低于-80℃液氮中30分钟，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化进行3次)后，经常规的肿瘤细胞移植瘤实验验证为不致瘤，即可用作肿瘤抗原，自各自肿瘤细胞液获得的肿瘤抗原包括包括自各自肿瘤细胞液获得的以下肿瘤抗原：肉瘤抗原(S180细胞)、肝癌抗原(H22细胞)、结肠癌抗原(CT26细胞)、乳腺癌抗原(4T1细胞)、黑色素瘤抗原(B16细胞)、肺癌抗原(LLC细胞)。
下表列举了本实施例制备的部分组合物半流体(制备物编号)、用以制备它的优选血液和优选活性成分、主要制备步骤、以及制备所达到的作用和其结节性。
表4
Figure BDA0002152345830000191
作用：A表示半流体化的有无(+为有)，B表示严重损伤的有无(+为有)。
结节：表示能否在注射处形成半流体结节(+为能)，具体如下：将100μl上表中的制备物注射至BALB/c小鼠左腋皮下形成结节，且该结节在食指和拇指掐压下可产生不可逆形变。除半流体粘稠物(Y12)为0.1-0.5日外，其它半流体结节的皮下半消失期为1-30日。
小鼠：表中的小鼠均为BALB/c小鼠。
混合搅拌：在本实施例中，除非另有说明，混合搅拌为机械搅拌(转速10-1000转/分、总时间1-3分钟)。
以下列出本发明的包含血液和添加药物的半流体的制备试验的几个例子。
实施例1m：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将4.9g该血液与0.1g5-Fu在杯中搅拌均匀，再对杯加盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得表3中制备物Y1。使用与Y1制备相同的方法，可分别进行表4中制备物Y2、Y3、Y4的制备。
实施例1n：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将5g该血液与500万单位α干扰素在杯中搅拌均匀，再对杯加盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得500万单位α干扰素/5g小鼠血液半流体组合物(制备物Y5)。当使用其它动物的血液、或使用其它细胞因子时使用相同的方法，可分别制备细胞因子/血液半流体组合物(例如Y6)。
实施例1o：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将4.95g该血液与0.05g抗PD-1抗体在杯中搅拌均匀，再对杯加盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-15分钟，便获得1％抗PD-1抗体/99％小鼠血液半流体组合物(制备物Y7)。Y7为可注射半流体，分装至注射器后即可作为疫苗使用。当使用其它动物的血液、或使用其它免疫调节类抗体时使用相同的方法，可分别制备免疫调节类抗体/血液半流体组合物。
实施例1p：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml肝癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再对杯加可透气盖，放入蒸汽(约100℃)中蒸5-50分钟，便获得上表中制备物Y8。
实施例1q：从多只小鼠眼眶分别取血(有或无抗凝剂)并混合，将1.5ml该血液与1ml肺癌细胞液(109个细胞/ml)在杯中搅拌均匀，再置于塑料袋中密封好，放入液氮(低于-80℃)中30分钟冷冻，然后在37℃解冻融化，此冷冻-融化可进行一次或多次，便获得上表中制备物Y9。
实施例1r：使用表3中X10的“含血细胞物质”(人白细胞富集血液)4.95g和活性成分(抗PD-1抗体)0.05g混合，便获得1％抗PD-1抗体/99％人白细胞富集血液半流体组合物(制备物Y10)。
实施例1s：将0.2ml小鼠淋巴细胞液(109个细胞/ml)、0.2ml肝癌细胞液(109个细胞/ml)、0.4ml小鼠血浆加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物Y11。
实施例1t：将0.6ml小鼠淋巴细胞液(109个细胞/ml)、10mg亚甲蓝肝、0.39ml小鼠血浆加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物Y12。
实施例1u：将0.3g人白细胞沉淀、0.2ml肝癌细胞液(109个细胞/ml)、0.5ml人血浆加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物Y13。
实施例1v：将0.6g人白细胞沉淀、10mg亚甲蓝、0.39ml人血浆加入杯中温和混合，再将杯加可透气盖，放在蒸汽(约100℃)中蒸20分钟，便获得上表中制备物Y14。
这些制备物均为可注射半流体，分装至注射器后即可作为疫苗使用。
实施例2：包含血细胞的半流体作为实体肿瘤抗原应用的必要条件研究
免疫系统是一个多层次网络系统。细胞内生化网络、细胞间传输网络和器官内细胞传输网络相互作用、关系复杂。外源性物质在什么样的条件下才能足够地激活至少某一个层次并诱发整个免疫系统反应，使得肿瘤特异性免疫活性成分增殖，并通过全身循环足量迁移到肿瘤局部并能发挥其效应功能，可能是其能否被应用为疫苗抗原的关健问题。为此，以下实验研究了本发明的技术方案之中的必要条件。
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积206mm3)随机分为6个试验组(如下表所示)。试验组分为1个阴性对照组(0组)和5个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
人白细胞沉淀、人血浆为按照现有技术抽取并获得正常血液后通过离心分离获得。人白细胞液为人白细胞沉淀(血细胞比容70.5％)加入等体积生理盐水获得的血细胞比容为35％的稀释液体。50％人血浆为人血浆和等体积生理盐水的混合物。人白细胞/人血漿为人白细胞沉淀加入等体积血浆的混合物(血细胞比容为35％)。血细胞比容按常规方法测定。人白细胞/人血漿半流体为以人白细胞/人血漿经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物Y9的制备方法制备)。人白细胞/人血漿半固体为上述人白细胞/人血漿中加入猪凝血酶(终浓度100U/1ml)和氯化钙(终浓度20mmol/L)形成的凝胶(半固体)，将其切割为体积约400mm3的小块使用。
各实验组均在左腋皮下用药一次，每次用药200μl/只。研究组5通过手术将半固体移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表5。
表5
组号 研究药物 形态 结节 瘤重(x±s) 抑瘤率
0 生理盐水 液体 - 0.92±0.18g -
1 50％人血漿 液体 - 0.89±0.11g 3％
2 人白细胞液/人血漿 液体 - 0.84±0.19g 8％
3 人白细胞液 液体 - 0.87±0.10g 5％
4 人白细胞/人血漿半流体 半流体 + 0.61±0.10g 43％
5 人白细胞/人血漿半固体 半固体 + 0.75±0.26g 19％
注：+为形成结节，-为不形成结节；x为瘤重平均值(g,以下表皆相同)。
在上表中，研究组1、2、3的抑瘤率均低。在研究组1、2、3之间，研究组2的q判断(q＝1.13)显示出相加作用，然而研究组2与1之间、和2与3之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.0931>0.05、P＝0.3762>0.05)，于是组2显示的相加作用并不明显。该结果说明，白细胞(甚至超高浓度异种白细胞)液体、人血浆液体、以及白细胞/人血浆组合物液体均未显示出明显的肿瘤负荷减小效应。
然而，研究组2、4、5的抑瘤率相差较大。研究组4的药效不仅超过研究组2和研究组5的药效，甚于显示出超过这两组加和作用的药效(q＝1.69>1.15)，且研究组4与2之间、4与5之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0271<0.05、P＝0.0472<0.05)。该结果说明，既使组成相同、浓度相同、用药方式相同，只须形态结构不同(液体、半流体、半固体)，包含血细胞的物质便有可能显示出明显不同的肿瘤负荷减小效应。半流体显示出明显超过同组成液体、半固体、甚至液体和半固体效应之和的理论预期药效。这显示出半流体可能与液体和半固体具有完全不同的免疫作用机理，可以被用作实体肿瘤疫苗抗原。以下试验对此进行了进一步研究。
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为肉瘤S180细胞，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积342mm3)随机分为12个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，尾静脉注射系列有1个阴性对照组(01组)和2个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和9个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
C小鼠为C57BL/6小鼠，B小鼠为BALB/c小鼠。血细胞包含在血液中。4种小鼠血液制备如下：天然血液(血细胞比容42％、43％41％)为取自小鼠的加有抗凝剂(枸橼酸钠)的新鲜血液。分出6ml天然血液离心，取出3ml血清，把离心管中剩下部分混匀为小鼠浓缩血液(血细胞比容68％)。将2ml血清与2ml天然血液混匀为小鼠稀释血液(1)(血细胞比容22％)。再将剩下的1ml血清与2ml天然小鼠血液混匀为小鼠稀释血液(2)(血细胞比容33％)。各血液的血细胞比容按常规方法测定。各小鼠血液半流体为相应的小鼠血液经加热凝固形成的半流体(分别按实施例1中的制备物X16、X19的制备方法制备)。小鼠血液半固体为小鼠血液中加入猪凝血酶(终浓度100U/1ml)和氯化钙(终浓度20mmol/L)形成的凝胶(半固体)，将其切割为体积约400mm3的小块使用。
各实验组均如下表所示用药方式(皮下注射为在左腋皮下注射)用药1次，每次用药400μl/只。研究组10通过手术将半固体移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射。在该实验中，对研究组1、3、5和7-10的给药可被视作同种异基因给药模型(可以代表99％以上的同种异体给药)，对其它研究组的给药可被视作全相合给药模型和自体给药模型。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表6。
表6
Figure BDA0002152345830000231
*：+为形成结节，-为不形成结节
在上表中，研究组1、2、3、4的抑瘤率抑率率均低，它们与各自的阴性对照组之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.9332>0.05、P＝0.5340>0.05、P＝0.3788>0.05、P＝0.5458>0.05)。该结果进一步说明，无论是同基因血液还是异基因血液、是静脉给药还是皮下给药，液态血液均未显示出明显的肿瘤负荷减小效应。更一般地，包含血细胞的液体可能难以优选作为能够明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原。
实际上，通常认为对肿瘤患者行同种异基因输血会引起白细胞介素-2、白细胞介素-10和白细胞介素-24分泌增加，抑制辅助T淋巴细胞分泌白细胞介素-2，使B淋巴细胞的刺激应答和抗体生成减少，产生细胞免疫的负向调节。于是，异基因血液被看作是免疫效应细胞的潜在抑制剂，也是免疫抑制细胞的刺激剂，这些免疫抑制作用可使有益的抑瘤免疫功能下调。可是，在上表中，研究组5和6均显示出较高的抑瘤率。它们各自与阴性对照组之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0004<0.05、P＝0.0002<0.05)。更进一步，研究组5和3之间(P＝0.0005)、5和1之间(P＝0.0004)、6和4之间(P＝0.0001)、6和2之间(P＝0.0002)的瘤重差异也都有统计学意义(P<0.05)。而研究组5和6之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.1375>0.05)。以上结果说明，血细胞包容物能否作为明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原与其状态(是液体还是半流体)的相关性明显高于其基因异同。
在上表中，研究组10的抑瘤率小于研究组9，而研究组10和9之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0147<0.05)。该结果说明，血细胞作为明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原的优选状态为半流体，而非半固体。此外，半流体相较半固体还具有临床应用的较高操作便利性和较高患者顺应性。
此外，在C小鼠血液半流体研究组中，抑瘤率自大而小的排列次序为：研究组5、研究组9、研究组8、研究组7。其中，研究组7和3之间(P＝0.2139)的瘤重差异无统计学意义(P>0.05)，而研究组8、9、5分别和7的瘤重差异有统计学意义(分别为P＝0.0107<0.05、P＝0.0227<0.05、P＝0.0008<0.05)。该结果说明，血液半流体(更一般地，包含血细胞的半流体)能否作为明显减小瘤体的实体瘤疫苗抗原与其所含细胞的比容(>22％、优选为≥33％)相关。
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的实体肿瘤疫苗抗原的必要条件为：其所述包含血细胞的半流体的组成和形态使得其在用药处形成激活有效免疫应答的半流体结节。该必要条件似乎就是要在体内局部形成在生理组成和形态上类似于瘤体组织、又能够被机体有效识别(例如高度偏离天然状态或高度损伤的半流体)并激发针对它以及与它类似瘤体的有效特异性免疫响应。于是，本发明的实体瘤疫苗抗原的基本技术方案为：
包含血细胞的半流体作为实体瘤疫苗抗原应用；
上述半流体中所含血细胞远离其天然环境、优选为处于易被免疫系统辨识为严重损伤组织的环境。此外，本发明的半流体所含血细胞优选为严重损伤细胞(例如失去增殖活性的细胞)。严重损伤细胞通常可暴露细胞内容物(例如细胞膜破坏释放出的细胞内容物)；
上述包含血细胞的半流体优选为选自以下组之一种或多种：包含血细胞的半流体粘稠物、包含血细胞的半流体凝固物、包含血细胞凝固物的破碎物，更优选为选自以下组之一种或多种：包含血细胞的半流体凝固物、包含血细胞凝固物的破碎物。与包含血细胞的天然组织相比较，这些包含血细胞的半流体显现出高度偏离天然状态、优选为严重损伤的状态；
上述包含血细胞的半流体包含在所述疫苗的瘤区用药和/或瘤外局部用药中；
上述包含血细胞的半流体为半流体植入剂、优选为半流体注射剂。其中所述半流体注射剂为可以以半流体方式通过常规注射系统直接用药的注射剂，而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如凝胶化)结节。
此外，所述半流体所包含的血细胞的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6×109个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×109-22×109个细胞/ml)、45％-86％(或细胞浓度为11.5×109-22×109个细胞/ml)、或55％-86％(或细胞浓度为14.0×109-22×109个细胞/ml)。在其中所述半流体粘稠物组合物中，所述细胞和组合物的量比(v/v)为≥70％(或细胞浓度为≥17.9×109个细胞/ml)、优选为70％-86％(或细胞浓度为17.9×109-22×109个细胞/ml)。
以下实验在基本技术方案基础上对技术方案进一步优选。
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为肉瘤S180细胞，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积313mm3)随机分为5个试验组(如下表所示，包括包括1个阴性对照组(0组)和4个研究组)。阴性对照物为生理盐水，研究药物为实施例1的制备物X16X4。血细胞包含在血液中。各实验组均在左腋皮下用药1次，用药量如下表所示。用药后24小时测定用药处形成的凸出结节大小，并按上述瘤体计算方式计算结节体积。用药后10天对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表7。
表7
Figure BDA0002152345830000251
在类似试验中，常规疫苗的量效关系敏感区通常≤100μl。然而在上表中，研究组1和0之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.2262>0.05)。研究组2和1之间用药量的成倍提高也未出现抑瘤率明显提高，它们之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.8565>0.05)。在这种情况下，通常就可能因为缺少量效关系而放弃进一步的研究了。出人意料的是，当用药量达到200μl后，抑瘤率突然升高。研究组3和2的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0140<0.05)，研究组4和2的瘤重差异也有统计学意义(P＝0.0048<0.05)，显示出200μl是一个阈值、而非偶然值。根据该结果及一些其它结果，本发明的疫苗显示出与常规疫苗大不相同的量效关系敏感区，很可能具有大不相同的免疫作用机理。
使用实施例1中的其它制备物(例如X1、X3、X20、X21、X22等)，也可获得类似结果。
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的所述包含血细胞的半流体的组成和形态使得其在用药处形成的半流体结节的总体积为>100mm3，优选为≥200mm3、更优选为≥400mm3。为满足该条件，本发明的半流体的单次施用总量为>0.1ml，优选为≥0.2ml或0.2-25ml，更优选为≥400mm3或0.4-25ml本发明的半流体的单次施用总量为≥0.2ml、优选为0.4-25ml。
在上述优选条件下，本发明的半流体所包含的血细胞选自以下一种或多种：红细胞、白细胞、血小板，其中所述白细胞选自以下一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，其中所述淋巴细胞选自以下一种或多种：T细胞、B细胞、裸细胞。
以下实施例对技术方案进行了进一步优选。
实施例3：本发明半流体抗原的特异性免疫原研究及血细胞优选
在一个试验中，试验动物为CB6F1小鼠，建模细胞为肝肿瘤H22细胞，以2×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物中，一部分用于制备瘤体颗粒半流体，另一部分(瘤体平均体积213mm3)随机分为6个试验组(如下表所示，包括1个阴性对照组(0组)和5个研究组)。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
血细胞包含在血液中。CB6F1小鼠浓缩血液和CB6F1小鼠浓缩血液半流体的制备与实施例2中的制备相同。CB6F1小鼠肌肉块为一体积约400mm3的块状小鼠肉。CB6F1小鼠瘤组织颗粒半流体的制备如下：剥取荷肝癌CB6F1小鼠的瘤体，再将它置于搅拌机中破碎(转速1000-10000转/分、总时间1-3分钟)，获得横截面平均尺寸小于1mm×1mm的、肉眼可辨的组织颗粒。马血液半流体为实施例1中的制备物X14。
各实验组均在左腋皮下用药1次，用药400μl/只。研究组3通过手术将小鼠肌肉块移植入小鼠左肋皮下。其它各实验组的药物均通过注射器注射至CB6F1小鼠左肋皮下。在该实验中，对研究组1-4和8的给药可被视作全相合给药移植模型或自体给药模型，对研究组5的给药可被视作同种半相合给药模型，对研究组6的给药可被视作同种异基因给药模型，对研究组7的给药可被视作异种给药模型。给药后第14日对动物进行移植物抗宿主病评分测量，然后处以安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表8。
表8
Figure BDA0002152345830000261
通常认为，分子形态的抗原(例如全肿瘤细胞抗原、异源糖蛋白抗原、异基因细胞抗原、亚单位抗原)有着与正常机体明显不同的独特结构成分(例如病原体相关分子模式，Pathogen-associated molecμlar patterns，PAMPs)，而机体内的天然免疫系统细胞上存在可识别这些结构成分(例如PAMP)的模式识别受体(Pattern-recognition receptors，PRRs)，PRRs被刺激并启动适应性免疫应答去攻击相同或类似的结构成分(例如肿瘤细胞中的交叉抗原成分)。于是，异源或异基因移植物通过其抗原分子(例如异源糖蛋白、异基因细胞、等等)介导的较高的移植物抗宿主反应可以导致较高的移植物抗肿瘤反应性。
在上表中，研究组2和1之间比较，其抗宿主病评分无统计学意义(P＝0.3016>0.05)，说明其移植排斥免疫原性(针对宿主正常细胞和肿瘤细胞)相当，然而其瘤重差异(针对宿主瘤体)却有统计学意义(P＝0.0023<0.05)。研究组2和3之间比较，其抗宿主病评分有统计学意义(P＝0.0002<0.05)，说明其移植排斥的免疫原性(针对宿主细胞)明显不同，然而瘤重差异(针对宿主瘤体)却无统计学意义(P＝0.5417>0.05)。此外，尽管研究组5(含马血液)和2(含鼠血液)之间的移植物抗宿主病评分的差异确有统计学意义(P＝0.0005<0.05)，但它们之间的瘤重差异却无统计学意义(P＝0.7295>0.05)。根椐这些结果，包含血细胞的半流体作为实体瘤疫苗抗原的表现与其抗宿主反应没有明显的正相关性。于是，在本发明公开的必要条件下，本发明的包含血细胞的半流体的抗原性显示出明显不同于现有技术中的移植物(通常为半固体或液体)，后者的抗肿瘤免疫原性往往与其移植排斥免疫原性正相关。
此外，研究组4(含瘤细胞)和研究组2(含血细胞)的瘤重差异无统计学意义(P＝0.7295>0.05)。
使用实施例1中的其它制备物，也可获得类似结果。
本实施例的以上结果，进一步证实本发明的包含血细胞的半流体具有不同于常规移植物(通常为流体、半固体或固体)的抗实体肿瘤免疫原性，后者的抗原性通常与其异分子(例如异基因抗原分子、异源抗原分子、等等)的抗宿主抗原性相关。而本发明的包含组织的半流体似乎具有与高度损伤的肿瘤组织相当的抗实体肿瘤免疫原性。
根据上述研究及更多的类似研究，对本发明的半流体抗原的技术方案进一步优选如下：本发明的半流体优选为其优势抗原性为抗所述实体肿瘤抗原性而非抗宿主抗原性的半流体，例如抑瘤率为≥抗宿主率、优选为≥150％抗宿主率的半流体。于是：
本发明的半流体的必要组成不包含移植物抗宿主反应强烈的血细胞(例如异种血细胞)，优选为选自移植物抗宿主反应不大的血细胞，例如以下组之一种或多种：ABO血型相符或HLA相近的同种异基因血细胞、同种同基因血细胞、自体血细胞。
根据以上结果以及对导致这些结果的免疫策略的初步分析，在本发明公开的基本技术方案(必要条件)下，本发明的优选技术方案中的半流体(形态的)抗原可以有别于现有技术中的分子形态的抗原(例如病原体抗原、常规移植物抗原、和异基因单一细胞抗原)，显示出具有与高度损伤的肿瘤组织相似的针对瘤体组织的特异性免疫原。众所周知，化疗药物的主要特征在其组成，而疫苗抗原的主要特征在其特异性免疫原。该免疫原很可能是因为其形成了一种类瘤体组织结节，但其半流体性和高损伤性(半流体中的血细胞远离其在天然组织或器官中的状态)却又比瘤体组织更易被免疫系统识别，从而激发出针对其所仿生的瘤体的有效免疫应答。以下实验将对此进行进一步的研究。
实施例4：本发明半流体抗原的靶向研究及适应症优选
以上实施例的结果说明，本发明的半流体抗原靶向荷瘤小鼠的瘤体。以下实验对荷瘤兔进行了研究。
在一个试验中，试验动物为新西兰白兔(体重2.0～2.5kg，雌雄不限)，建模组织为经2次传代接种的兔ⅤX2瘤体组织。通过手术向动物右肺部植入瘤体组织细块(约1mm3/块、总量约500mm3/只)。建模成功的荷肺癌兔(接种后14天行CT检查，肿瘤直径6～13mm者)随机分为2个试验组(1个阴性对照组和1个研究组)，每组6只。阴性对照物为生理盐水，研究药物为取自加利福尼亚兔的血液按实施例1中的制备物X7方法制备的同种异基因浓缩血液半流体。各实验组均在左腋皮下用药3次，每7天1次，用药2ml/只。用药后第7日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，从阴性对照组计算出研究组的抑瘤率。
在文献中，几乎所有的实体肿瘤疫苗研究均在瘤体平均体积<100mm3的动物模型上进行研究。实际上，现有技术中的肿瘤疫苗抗原几乎都靶向肿瘤细胞及其中的结构成分(例如移植物的交叉抗原)，而非瘤体、尤其是较大瘤体。以异基因造血干细胞移植物(allo-HSCT，通常为液体)为例，其作为抗原介导的免疫响应的靶向无特异性，针对宿主健康细胞(移植物抗宿主病(GVHD))的同时亦可针对肿瘤细胞(例如抗白血病反应(CVL))。因而，它们尽管可以显示出对非实体肿瘤(例如白血病)的最好疗效，以及对较小实体肿瘤的较好疗效，对于较大瘤体的实体瘤则往往无能为力。
在以上实验中，抑瘤率为27％。此外，研究组5只兔子在治疗后出现皮下可触硬结节。众所周知，这种结节通常是机体内局部急性炎症的并发症状。该结果进一步显示，本发明的半流体抗原似乎是作为半流体结节抗原通过诱发瘤体急性炎症而靶向瘤体，而且对平均体积远大于100mm3的瘤体也显示出瘤体负荷降低的药效。
根据上述研究及更多类似研究的结果，本发明的半流体抗原不同于现有技术的其它抗原(尤其是能在血液中自由分布的分子形态的抗原)，还在于其靶向性、从而适应症不同。肿瘤抗原靶向肿瘤细胞，从而其应用的适应症与具体肿瘤种类相关。常规移植物(通常为半固体)或allo-HSCT(通常为液体)靶向细胞(正常细胞和肿瘤细胞)，从而其应用的适应症与肿瘤细胞的暴露难易(液体癌易，实体瘤难，瘤体越大越难)相关。
这些结果进一步加强了上述关于本发明半流体的特异性免疫抗原是一种瘤体仿生抗原的分析。一个可能的解释为：本发明的免疫策略，其必要条件模拟出瘤体而非肿瘤细胞的成分、形状、电荷、尺寸等三维特性，以及瘤体的四维动态重构现象(粘弹性的软物质)。于是，本发明的半流体抗原在本质上是一种类瘤体侵入组织，却又比瘤体更易被免疫系统识别从而激发出靶向其也靶向其所仿生的瘤体的有效免疫应答的新式抗原。当然，瘤体的有效破坏又可能次生地释放出肿瘤抗原并导致自体肿瘤疫苗。因而，本发明的半流体抗原的适应症，与瘤体体积相关，尤其是优选为较大而不是较小的瘤体体积，而对于瘤内具体是什么肿瘤细胞、其是否以分子形态与免疫系统作用(暴露性)的依赖性不强。
按照这些结果，本发明的组合物中的包含组织血细胞的半流体作为抗原应用，其适用症优选为瘤体体积>85mm3、优选为≥200mm3、更优选为瘤体总体积≥400mm3的实体瘤。根据其适应症，本发明的半流体抗原的单动物给药量为≥0.2ml、优选为0.2-25ml或0.43-25ml。
本发明的半流体抗原的应用范围，于是具有较大的瘤细胞种类广谱性。除了上述实验中的肝癌、乳腺癌、肉瘤以外，以下实验进行了进一步证实。
在以下一个包括3个实验的实验系列中，试验动物和建模细胞分别如下所示。建模细胞分别在动物右侧腋部皮下进行常规的移植瘤建模。每个系列实验中成功建模的试验动物随机分为4个试验组，其中1个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。阴性对照物为生理盐水，A、B、C组研究药物分别为实施例1中的制备物X8、X7和X10。各实验组均在左腋皮下注射用药1次，每次用药250μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各系列的阴性对照组计算抑瘤率，实验结果示于以下。
1)、在结肠癌治疗中的应用
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为结肠癌CT26细胞(1×106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积203mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为36％、31％、29％。
2)、在黑色素瘤治疗中的应用
在一个试验中，试验动物为C57BL/6小鼠，建模细胞为黑色素瘤B16细胞(1×106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积403mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为41％、35％、33％。
3)、在肺癌治疗中的应用
在一个试验中，试验动物为C57BL/6小鼠，建模细胞为路易斯肺癌(LLC)(1×106个细胞/只)，在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的荷瘤动物(瘤体平均体积532mm3)随机分为4个试验组(1个阴性对照组和3个研究组)。A、B、C组的抑瘤率均值分别为32％、31％、28％。
使用实施例1中的其它制备物，也可获得以上类似结果。
根据上述研究及更多的类似研究，本发明的半流体作为抗原、优选为作为半流体结节抗原或瘤体仿生抗原可以应用于广谱的实体瘤的治疗或/和预防疫苗制备。所述实体瘤包括例如乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌等。
实施例5：包含血细胞的半流体组合物的协同作用研究
本发明的半流体还可以是包含血细胞和抗实体肿瘤的活性成分的半流体组合物。本发明的包含血细胞的半流体作为抗原还包括作为抗实体肿瘤的活性成分的免疫增强抗原，其中所述免疫增强是指所述半流体与活性成分的组合物产生出高于组合物之任一单药单用的免疫疗效。该免疫疗效可以通过单一的免疫效应进行观察，也可以通过免疫-化疗综合的免疫效应进行观察(尤其是考虑到原位抗原的释放)。免疫协同效应以荷瘤小鼠为试验动物模型进行研究，化疗协同效应以荷瘤裸鼠为试验动物模型进行研究。
1、包含血细胞和生物制品的半流体组合物协同作用方案
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积236mm3)随机分为16个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，尾静脉注射系列有1个阴性对照组(01组)和3个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和11个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
所用乳腺癌抗原为从按上述相同建模方法获得的荷乳腺癌小鼠的瘤体再经实施例1所述方法制备获得的乳腺癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)。所用血细胞包含在血液中。4种小鼠血液制备如下：天然血液(血细胞比容41％)为取自小鼠的加有抗凝剂(枸橼酸钠)的新鲜血液。分出6ml天然血液离心，取出3ml血清，把离心管中剩下部分混匀为小鼠浓缩血液(血细胞比容68％)。将2ml血清与2ml天然血液混匀为小鼠稀释血液(1)(血细胞比容22％)。再将剩下的1ml血清与2ml天然小鼠血液混匀为小鼠稀释血液(2)(血细胞比容33％)。各血液的血细胞比容按常规方法测定。各乳腺癌抗原/小鼠血液为40％乳腺癌细胞冻融灭活液(109个细胞/ml)和60％各小鼠血液的混合物。各乳腺癌抗原/小鼠血浆半流体为各乳腺癌抗原/小鼠血液经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物Y8的制备方法制备)。小鼠天然血液半流体为小鼠血液经加热凝固形成的半流体(按实施例1中的制备物X4的制备方法制备)。
在该实验中，对研究组的给药可被视作同种异基因给药模型(可以代表99％以上的同种异体给药)。各实验组均如下表所示用药方式(皮下注射均在左腋皮下注射)用药一次，每次用药400μl/只。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表9。
表9
Figure BDA0002152345830000301
Figure BDA0002152345830000311
结节：+为形成结节，-为不形成结节
*：小鼠血液半流体抑瘤率：根据相关实验，稀释小鼠血液的半流体的抑瘤效应小于100％小鼠血液的半流体
在上表中，在行静脉注射的研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝0.83<0.85)显示出拮抗作用，然而研究组3与1之间、3与2之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.7662>0.05、P＝0.9317>0.05)，于是组合物组未显示出明显拮抗作用。在行皮下注射的研究组6、5、4之间，组合物组的q判断(q＝0.79<0.85)显示出拮抗作用，然而研究组6与4之间、6与5之间的瘤重差异均无统计学意义(分别为P＝0.3274>0.05、P＝0.7771>0.05)，于是组合物组未显示出明显拮抗作用。该结果说明，液体组合物无论行静脉注射还是皮下注射，均未显示出协同作用、甚至未显示出明显加和作用。
然而，在行皮下注射的研究组8、7、5之间，组合物组的q判断(q>1.77>1.15)显示出协同作用，且研究组8与5之间、8与7之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0006<0.05、P＝0.0327<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。该结果说明，包含血细胞的液体和半流体与活性组分之间具有完全不同的相互作用。
在上表中，行皮下注射的组合物研究组中，抑瘤率自大而小的排列次序为：研究组14、研究组8、研究组12、研究组10。在研究组10、9、5之间，组合物组的q判断(q＝0.95)显示出相加作用，但研究组10与5之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0288<0.05)、10与9之间的瘤重差异却无统计学意义(P＝0.2850>0.05)，于是组合物组未显示出明显相加作用、更无协同作用。随着血细胞比容增加，在研究组12、11、5之间，组合物组的q判断(q＝1.29>1.15)显示出协同作用，且研究组12与5之间、12与11之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0012<0.05、P＝0.0274<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。更进一步，在研究组14、13、5之间，组合物组的q判断(q＝1.25>1.15)显示出协同作用，且研究组14与5之间、14与13之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0001<0.05、P＝0.0283<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。该结果说明，包含细胞的半流体对生物制品的协同作用依赖于细胞比容。细胞比容也许参与决定了半流体在体内形成的结节的诸多性质(例如柔软度)，从而参与决定了其协同效应。
使用实施例1中的其它制备物(例如Y14-Y18、等)，也可获得类似结果。
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为乳腺癌4T1细胞，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(瘤体平均体积215mm3)随机分为8个试验组，包括1个阴性对照组和7个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
所用PD-(L)1抗体为商业渠道获得，所用细胞包含在血液中。PD-(L)1抗体药物均为所示浓度的水溶液，小鼠血液均取自BALB/c小鼠的加有抗凝剂(枸橼酸钠)的新鲜血液，小鼠血液半流体为实施例1中的制备物X16，不同重量比的PD-(L)1抗体/小鼠血液半流体按实施例1中的制备物Y16的制备方法制备。
在该实验中，对研究组的给药可被视作同基因给药模型(可以代表异体同基因给药和自体给药)。各实验组均在左腋皮下注射用药均如下表所示用药方式(皮下注射为均在左腋皮下注射)用药一次，每次用药250μl/只。给药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表10。
表10
Figure BDA0002152345830000321
在上表中，在PD-(L)1抗体/血液半流体组合物研究组中，抑瘤率自大而小的排列次序为：研究组7、研究组6、研究组5。在研究组5、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.11)显示出相加作用，但研究组5与2之间的瘤重差异有统计学意义(P＝0.0019<0.05)而研究组5与1之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.2980>0.05)，于是组合物组显示出不明显的相加作用。然而，在研究组6、3、1之间，组合物组的q判断(q＝1.30>1.15)显示出协同作用，且研究组6与3之间、6与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0003<0.05、P＝0.0060<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。进一步，在研究组7、4、1之间，组合物组的q判断(q＝1.54>1.15)显示出协同作用，且研究组7与4之间、7与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0003<0.05、P＝0.0038<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。根据该结果及更多结果，PD-(L)1抗体与半流体组合物(更一般地，与它们同类的免疫调节类抗体与半流体组合物)的协同量比(w：w)为>0.05/100，优选为≥0.1/100。
以下更多的实验证实了上述协同量比的范围。
在一个试验中，试验动物为BALB/c小鼠，建模细胞为肉瘤S180，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(荷肉瘤小鼠，瘤体平均体积251mm3)随机分为8个试验组(1个阴性对照组和7个研究组)，并在动物瘤内给药。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
0.1％卡介苗、人重组干扰素50万IU/ml分别为以注射用水配制的液体。所用细胞包含在血液中。小鼠血液半流体为实施例1的X16，0.1％卡介苗/99.9小鼠血液半流体、人重组干扰素/小鼠血液(50万IU/ml)半流体分别为所示量的生物制品与小鼠血液的混合物的热凝固物(按实施例1的Y14或Y18的制备方法制备。
各实验组均瘤内用药一次，每次用药250μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表11。
表11
Figure BDA0002152345830000331
在上表中，在研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.20>1.15)显示出协同作用，且研究组3与2之间、3与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0022<0.05、P＝0.0166<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组5、4、1之间，组合物组的q判断(q＝1.33>1.15)显示出协同作用，且研究组5与4之间、5与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.004<0.05、P＝0.0379<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。
上述结果及更多类似研究说明，包含本发明的血细胞和抗病原体疾病生物制品的半流体组合物对病原体致病变组织有协同破坏作用。该协同作用的形成，有可能是因为本发明的包含血细胞的半流体作为免疫成分(抗原)协同、或/和作为缓释载体协同。病原体致病变组织的加大破坏有利于內源疫苗的生成。
2、包含血细胞和化疗药物的半流体组合物协同作用方案研究
包含血细胞的半流体的组织破坏性或/和缓释性是其作为组织破坏或/和缓释协同组分的基础。以下实验对此进行了研究。
在一个试验中，试验动物为裸小鼠，建模细胞为肉瘤S180，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(荷肉瘤小鼠，瘤体平均体积218mm3)随机分为6个试验组(如下表所示)。试验组分为2个系列，瘤内注射系列有1个阴性对照组(01组)和3个研究组，皮下注射系列有1个阴性对照组(02组)和1个研究组。阴性对照物均为生理盐水，研究药物如下表所示，分别为：BALB/c小鼠新鲜血液、无水乙醇(消融剂阳性对照物)、小鼠血液半流体(实施例1的X4)，半流体中分别含血细胞。各实验组均用药一次，用药200μl/只，用药方式(皮下注射为在左腋皮下注射)如下表所示。
裸小鼠为先天性无胸腺的nude小鼠的位于第11对染色体上的隐性突变基因“nu”导入BALB/c小鼠所获小鼠。裸小鼠胸腺仅有残迹或异常上皮，不能使T细胞正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制和杀伤功能，细胞免疫力低下。荷肉瘤裸小鼠用药后第7日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表12。
表12
组号 研究药物 给药方式 瘤重(x±s) 抑瘤率
01 生理盐水 瘤内注射 1.91±0.34g -
1 小鼠血液半流体 瘤内注射 1.30±0.15g 32％
2 小鼠血液 瘤内注射 1.70±0.22g 11％
3 无水乙醇 瘤内注射 1.13±0.27g 41％
02 生理盐水 皮下注射 1.99±0.21g -
4 小鼠血液半流体 皮下注射 1.87±0.15g 5％
在上表中，研究组4与02之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.437>0.05)。该结果及更多类似研究说明，本发明组合物中的包含细胞的半流体主要是作为胸腺依赖抗原在先前的荷瘤小鼠皮下注射中显示出免疫抑瘤效应。
然而在上表中，研究组1与2之间、研究组1与01之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0043<0.05和P＝0.0014<0.05)。而研究组1与3之间的瘤重差异无统计学意义(P＝0.2096>0.05)。该结果及更多类似研究说明，本发明的半流体除了可以作为胸腺依赖抗原应用于免疫协同，还可以作为非胸腺依赖的组织破坏成分应用于化疗协同。众所周知，瘤体组织的破坏可能次生地释放出肿瘤抗原(原位)并产生疫苗效应。
在一个试验中，试验动物为裸小鼠，建模细胞为肉瘤S180，以1×106个细胞/只在动物右侧腋部皮下进行移植瘤建模。成功建模的试验动物(荷肉瘤小鼠，瘤体平均体积209mm3)随机分为10个试验组(1个阴性对照组和9个研究组)，并在动物瘤内给药。阴性对照物为生理盐水，研究药物如下表所示。研究药物的制备如下：
血细胞包含在血液中。血液半流体为取自其它裸小鼠的血液按实施例1中X16的制备方法制备，0.5％5-Fu、0.5％亚甲蓝、10％精氨酸/10％甘氨酸分别为组织破坏剂的水溶液，其它药物为取自其它裸小鼠的血液分别按实施例1中Y6、Y8、Y9的制备方法制备的组织破坏剂/自体血液半流体组合物。各实验组均瘤内用药一次，每次用药200μl/只。用药后第14日对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表13。
表13
组号 研究药物 瘤重(x±s) 抑瘤率
0 生理盐水 1.87±0.17g -
1 裸小鼠血液半流体* 1.35±0.21g 28％
2 0.5％5-Fu 1.27±0.18g 32％
3 0.5％5-Fu/99.5％裸小鼠血液半流体 0.71±0.25g 62％
4 1％5-Fu/99％裸小鼠血液半流体 0.49±0.08g 74％
5 0.5％亚甲蓝 1.63±0.28g 13％
6 0.5％亚甲蓝/99.5％裸小鼠血液半流体 0.92±0.21g 51％
7 1％亚甲蓝/99％裸小鼠血液半流体 0.65±0.07g 65％
8 10％精氨酸/10％甘氨酸 1.40±0.29g 25％
9 10％精氨酸/10％甘氨酸/80％裸小鼠血液半流体 0.92±0.12g 51％
小鼠血液半流体抑瘤率：根据相关实验，稀释小鼠血液的半流体的抑瘤效应小于100％小鼠血液的半流体
在上表中，研究组4的抑瘤率高于研究组3，研究组7的抑瘤率高于研究组6。在研究组3、2、1之间，组合物组的q判断(q＝1.22>1.15)显示出协同作用，且研究组3与2之间、3与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0012<0.05、P＝0.0007<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组6、5、1之间，组合物组的q判断(q＝1.38>1.15)显示出协同作用，且研究组6与5之间、6与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0006<0.05、P＝0.0054<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。在研究组9、8、1之间，组合物组的q判断(q>1.17>1.15)显示出协同作用，且研究组9与8之间、9与1之间的瘤重差异均有统计学意义(分别为P＝0.0041<0.05、P＝0.0015<0.05)，于是组合物组显示出明显协同作用。
上述结果及更多类似研究说明，包含本发明的血细胞和抗病原体疾病化疗药物的半流体组合物对病原体致病变组织有协同破坏作用。该协同作用的形成，有可能是因为本发明的包含血细胞的半流体作为免疫成分(抗原)协同、组织破坏协同、或/和作为缓释载体协同。病原体致病变组织的加大破坏有利于內源疫苗的生成。
根据上述研究及更多的类似研究，包含血细胞的半流体可以作为抗原与其它抗实体肿瘤的免疫药物(例如免疫生物制品)形成组合物以提高免疫效应，也可以在作为抗原的同时作为组织破坏成分或/和载体与化疗药物形成组合物以提高免疫-化疗复合效应。
本发明的组合物的必要条件为：其组成和形态使得其可激发比半流体抗原单用更有效的免疫应答和/或更有效的化疗效果。于是，本发明的组合物的基本技术方案为：
包含血细胞的半流体作为抗原和抗病原体疾病活性成分的协同组分应用；
上述包含血细胞和活性成分的半流体优选为选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和血细胞的半流体粘稠物、包含所述活性成分和血细胞的凝固物、包含所述活性成分和血细胞的凝固物的破碎物，更优选为选自以下组之一种或多种：包含所述活性成分和血细胞的凝固物、包含所述活性成分和血细胞的凝固物的破碎物；
上述包含血细胞和活性成分的半流体包含在所述疫苗的瘤区用药和/或瘤外局部用药中；
上述包含血细胞和活性成分的半流体为半流体植入剂、优选为半流体注射剂。其中所述半流体注射剂为可以以半流体方式通过常规注射系统直接用药的注射剂，而半固体移植物则往往通过手术植入、或以流体(液体)方式通过常规注射系统用药后在用药处形成半固体(例如凝胶化)结节。
在更优选的条件下，本发明的包含血细胞和抗实体肿瘤活性成分的半流体组合物显示出免疫协同作用、化疗协同作用和/或载体协同作用。该半流体组合物的协同条件为：所述活性成分和组合物的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100，所述细胞和组合物的量比(v/v)为>22％(或细胞浓度为>5.6×109个/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×109个/ml-22×109个/ml)或45％-86％(或细胞浓度为11.5×109个/ml-22×109个/ml)。在其中所述半流体粘稠物组合物中，所述细胞和组合物的量比(v/v)为≥70％(或细胞浓度为≥17.9×109个/ml)、优选为70％-86％(或细胞浓度为17.9×109个/ml-22×109个/ml)。
更优选地，所述活性成分的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，其中：
所述生物制品的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，例如：所述肿瘤抗原的含量为大于105个/ml、优选为105～109个/ml个肿瘤细胞所包含的肿瘤抗原，所述微生物抗原的浓度为>0.1％，所述免疫调节类抗体药物的含量为≥0.1％、优选为0.25-5％，等等；或/和
所述化疗药物的浓度为大于或等于其在单独局部给药时产生作用的浓度，例如：所述细胞毒药物的浓度大于其饱和浓度的50％、优选为其饱和浓度的50％-500％；所述常规无效化合物的浓度为>0.25％、优选为0.35-30％(例如：所述氨基酸营养素的局部给药浓度为大于5％，优选为5％-30％；所述无效芳香化合物的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.35％-10％；所述植物或菌类活性成分的局部给药浓度为大于0.25％、优选为0.75％-15％)。
本申请公开包括以下项目：
项目1、包含血细胞的半流体作为抗原在制备用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗中的应用。
项目2、一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗，其包含作为抗原的包含血细胞的半流体。
项目3、一种治疗或抑制实体肿瘤的方法，其包括向有此需要的个体局部施用、优选为通过局部注射施用包含作为抗原的包含血细胞的半流体的疫苗。
项目4、根据项目1-3之一的应用、疫苗或方法，其中所述血细胞为选自以下细胞及其衍生物之一种或多种：红细胞、白细胞、血小板，其中所述白细胞为选自以下细胞及其衍生物之一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，其中所述淋巴细胞为选自以下细胞及其衍生物之一种或多种：T细胞、B细胞、裸细胞。
项目5、根据项目1-4之一的应用、疫苗或方法，其中所述半流体所包含的所述血细胞选自以下组之一种或多种：天然血液包含的所述血细胞、天然血液组分包含的所述血细胞、工程血液中的血细胞、源自所述血细胞的富集组织的天然血细胞制备物和/或工程血细胞，且其中所述半流体的组成和形态使得其在用药处形成半流体结节。
项目6、根据项目1-5之一的应用、疫苗或方法，其中所述半流体为选自以下组之一种或多种：包含所述血细胞的半流体粘稠物、包含所述血细胞的半流体凝固物、包含所述血细胞的凝固物的破碎物，优选为选自以下组之一种或多种：包含所述血细胞的半流体凝固物、包含所述血细胞的凝固物的破碎物。
项目7、根据项目1-6之一的应用、疫苗或方法，其中所述血细胞在所述半流体中的细胞比容为>22％(或细胞浓度为>5.6×109个细胞/ml)、优选为33％-86％(或细胞浓度为8.4×109-22×109个细胞/ml)或55％-86％(或细胞浓度为14.1×109-22×109个细胞/ml)。
项目8、根据项目1-7之一的应用、疫苗或方法，其中所述半流体为植入剂、优选为注射剂，且其单次施用量为>0.1ml，优选为≥0.2ml或0.2-25ml。
项目9、根据项目1-8之一的应用、疫苗或方法，其中所述血细胞为选自以下组之一种或多种：源于ABO血型相符或HLA相近的同种异基因组织的血细胞、源于同种同基因组织的血细胞、源于自体组织的血细胞。
项目10、根据项目1-9之一的应用、疫苗或方法，其中所述血细胞包括源于ABO血型相符或HLA相近的同种异基因组织的血细胞。
项目11、根据项目1-9之一的应用、疫苗或方法，其中所述血细胞包括源于自体组织的血细胞。
项目12、根据项目1-9之一的应用、疫苗或方法，其中所述血细胞包括源于自体组织和同种异体组织的血细胞。
项目13、根据项目1-12之一的应用、疫苗或方法，其中所述疫苗还包含抗实体肿瘤的活性成分。
项目14、根据项目13的应用、疫苗或方法，其中所述活性成分和所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-85)/100，以及其中所述活性成分选自组织破坏剂或/和生物制品之一种或多种。
项目15、根据项目14的应用、疫苗或方法，其中所述生物制品选自以下组之一种或多种：免疫调节类抗体、细胞因子、病原体抗原，且所述生物制品与所述半流体的量比(w/w)为(0.1-30)/100。
项目16、根据项目14的应用、疫苗或方法，其中所述免疫调节类抗体选自以下组之一种或多种：针对抑制性受体的抗体阻断剂，例如针对CTLA-4分子和PD-1分子的阻断性抗；针对抑制性受体的配体的抗体阻断剂、针对免疫反应细胞表面刺激分子的激活性抗体，例如抗OX40抗体、抗CD137抗体、抗4-1BB抗体；针对实体肿瘤微环境中免疫抑制性分子的中和抗体，例如抗TGF-p1抗体。
项目17、根据项目14的应用、疫苗或方法，其中所述细胞因子选自以下之一种或多种：肿瘤坏死因子、干扰素、白介素。
项目18、根据项目14的应用、疫苗或方法，其中所述病原体或病原体亚单位中的所述病原体选自以下组之一种或多种：肿瘤细胞、细菌、病毒。
项目19、根据项目14的应用、疫苗或方法，其中所述组织破坏剂选自细胞毒药物和/或常规无效但局部有效化合物之一种或多种，且其中所述组织破坏剂和所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
项目20、根据项目19的应用、疫苗或方法，其中所述细胞毒药物包括选自以下之一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗实体肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。
项目21、根据项目19的应用、药物或方法，其中所述常规无效但局部有效化合物包括选自以下组之一种或多种：氨基酸类营养素、无效芳香化合物、非动物生物活性成分。
项目22、根据项目21的应用、疫苗或方法，其中所述常规无效但局部有效化合物包括选自以下组之一种或多种：氨基酸类营养素，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽；无效芳香化合物，例如亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁；非动物生物活性成分，例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖、青蒿素。
项目23、根据项目1-22之一的应用、疫苗或方法，其中所述实体肿瘤为选自瘤体体积>85mm3、优选为≥200mm3、更优选为≥300mm3的实体肿瘤。
项目24、根据项目1-23之一的应用、疫苗或方法，其中所述实体肿瘤选自以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
项目25、根据项目3-24之一的方法，其中所述方法还包括与以下之一种或多种治疗合用：介入疗法、化疗、其它免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法、手术干预。
项目26、一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗的制备方法，所述疫苗包含作为抗原的包含血细胞的半流体，该方法包括以下步骤：
a.提供包含血细胞的流体；
b.对步骤a中的流体进行半流体化处理，其中所述半流体化选自以下之一种或多种：液体的半流体粘稠化、液体的半流体凝固化、非液体或凝固物的破碎。
项目27、根据项目26的方法，其中所述步骤a包括：由天然血液或浓缩血液提供所述包含血细胞的流体。
项目28、根据项目26的方法，其中所述步骤a包括：自富集血细胞的器官和/或组织得到血细胞制备物和/或工程血细胞，并任选地将其混入天然血浆、人造血浆或合适的载体中。
项目29、根据项目28的方法，其中所述血细胞制备物和/或工程血细胞包括从天然血液中分离获得的细胞组分、白细胞组分、红细胞组分、血小板组分，从骨髓等组织提取和制备的造血干细胞等，由肾脏等组织提取和制备的淋巴细胞，通过体外诱导、激活、扩增的自体或异体的血细胞，例如DC细胞、LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞、DC-CIK、CTL细胞，TCR-T细胞、CAR-T细胞、NK细胞，γδ干细胞等。
项目30、根据项目26-29之一的方法，其中在所述半流体化处理之前或之后还加入抗实体肿瘤活性成分进行混合，得到包含所述血细胞和活性成分的半流体。
项目31、根据项目30的方法，其中所述活性成分和所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-85)/100，以及其中所述活性成分选自组织破坏剂或/和生物制品之一种或多种。
项目32、根据项目31的方法，其中所述生物制品选自以下组之一种或多种：免疫调节类抗体、细胞因子、病原体抗原，且所述生物制品与所述半流体的量比(w/w)为(0.1-30)/100。
项目33、根据项目32的方法，其中所述免疫调节类抗体选自以下组之一种或多种：针对抑制性受体的抗体阻断剂，例如针对CTLA-4分子和PD-1分子的阻断性抗；针对抑制性受体的配体的抗体阻断剂、针对免疫反应细胞表面刺激分子的激活性抗体，例如抗OX40抗体、抗CD137抗体、抗4-1BB抗体；针对实体肿瘤微环境中免疫抑制性分子的中和抗体，例如抗TGF-p1抗体。
项目34、根据项目32的方法，其中所述细胞因子选自以下之一种或多种：肿瘤坏死因子、干扰素、白介素。
项目35、根据项目32的方法，其中所述病原体或病原体亚单位中的所述病原体选自以下组之一种或多种：肿瘤细胞、细菌、病毒。
项目36、根据项目31的方法，其中所述组织破坏剂选自细胞毒药物和/或常规无效但局部有效化合物之一种或多种，且其中所述组织破坏剂和所述半流体的量比(w/w或v/v)为(0.1-30)/100。
项目37、根据项目36的方法，其中所述细胞毒药物包括选自以下之一种或多种：5-氟尿嘧啶、吉西他滨、表柔比星、抗实体肿瘤抗生素、替尼泊苷、金属铂络合物、紫杉醇。
项目38、根据项目36的方法，其中所述常规无效但局部有效化合物包括选自以下组之一种或多种：氨基酸类营养素、无效芳香化合物、非动物生物活性成分。
项目39、根据项目38的方法，其中所述常规无效但局部有效化合物包括选自以下组之一种或多种：氨基酸类营养素，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、或它们的盐、或包含它们的寡肽；无效芳香化合物，例如亚甲蓝、乙酰水扬酸、奎宁、一盐酸奎宁、二盐酸奎宁；非动物生物活性成分，例如藻类多糖、药用植物多糖、真菌多糖、青蒿素。
项目40、根据项目26-39之一的方法制备的疫苗。
除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的多种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。

Claims (10)

1.包含血细胞的半流体作为抗原在制备用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗中的应用。
2.一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗，其包含作为抗原的包含血细胞的半流体。
3.根据权利要求1或2的应用和疫苗，其中所述血细胞为选自以下细胞及其衍生物之一种或多种：红细胞、白细胞、血小板，其中所述白细胞为选自以下细胞及其衍生物之一种或多种：粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，其中所述淋巴细胞为选自以下细胞及其衍生物之一种或多种：T细胞、B细胞、裸细胞。
4.根据权利要求1-3之一的应用和疫苗，其中所述半流体所包含的所述血细胞选自以下组之一种或多种：天然血液包含的所述血细胞、天然血液组分包含的所述血细胞、工程血液中的血细胞、源自所述血细胞的富集组织的天然血细胞制备物和/或工程血细胞，且其中所述半流体的组成和形态使得其在用药处形成半流体结节。
5.根据权利要求1-3之一的应用和疫苗，其中所述半流体为选自以下组之一种或多种：包含所述血细胞的半流体粘稠物、包含所述血细胞的半流体凝固物、包含所述血细胞的凝固物的破碎物，优选为选自以下组之一种或多种：包含所述血细胞的半流体凝固物、包含所述血细胞的凝固物的破碎物。
6.根据权利要求1-5之一的应用和疫苗，其中所述实体肿瘤为选自瘤体体积>85mm3、优选为≥200mm3、更优选为≥300mm3的实体肿瘤。
7.根据权利要求6的应用和疫苗，其中所述实体肿瘤选自以下组之一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、胃癌、结直肠癌、支气管癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、脑瘤、肾细胞癌、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤。
8.一种用于治疗或抑制实体肿瘤的疫苗的制备方法，所述疫苗包含作为抗原的包含血细胞的半流体，该方法包括以下步骤：
a.提供包含血细胞的流体；
b.对步骤a中的流体进行半流体化处理，其中所述半流体化选自以下之一种或多种：液体的半流体粘稠化、液体的半流体凝固化、非液体或凝固物的破碎。
9.根据权利要求8的方法，其中在所述半流体化处理之前或之后还加入抗实体肿瘤活性成分进行混合，得到包含所述血细胞和活性成分的半流体。
10.根据权利要求8或9的方法制备的疫苗。
CN201910706686.9A 2019-08-01 2019-08-01 包含血细胞的半流体的应用、包含该半流体的疫苗和该疫苗的制备方法 Pending CN112294949A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910706686.9A CN112294949A (zh) 2019-08-01 2019-08-01 包含血细胞的半流体的应用、包含该半流体的疫苗和该疫苗的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910706686.9A CN112294949A (zh) 2019-08-01 2019-08-01 包含血细胞的半流体的应用、包含该半流体的疫苗和该疫苗的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112294949A true CN112294949A (zh) 2021-02-02

Family

ID=74485842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910706686.9A Pending CN112294949A (zh) 2019-08-01 2019-08-01 包含血细胞的半流体的应用、包含该半流体的疫苗和该疫苗的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112294949A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114432261A (zh) * 2022-02-24 2022-05-06 深圳市众循精准医学研究院 一种靶向递送疫苗的制备方法及红细胞疫苗

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114432261A (zh) * 2022-02-24 2022-05-06 深圳市众循精准医学研究院 一种靶向递送疫苗的制备方法及红细胞疫苗
CN114432261B (zh) * 2022-02-24 2023-11-28 初源汇企业管理(深圳)合伙企业(有限合伙) 一种靶向递送疫苗的制备方法及红细胞疫苗

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6553219B2 (ja) 腫瘍の一掃のための方法および組成物
CN107847534B (zh) Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用
KR20180042284A (ko) 암 치료에 사용하기 위한 천연두 백신
WO2014161887A1 (en) Targeted cancer immune therapy
KR102367009B1 (ko) 면역원성 용해물의 제조방법, 이로부터 얻어진 면역원성 용해물, 상기 용해물이 로딩된 수지상 세포 및 상기 용해물 또는 상기 수지상 세포를 포함하는 약학 조성물
Toyoda et al. Oncolytic poliovirus therapy and immunization with poliovirus-infected cell lysate induces potent antitumor immunity against neuroblastoma in vivo
CN107488235A (zh) 一种新的增强型抗原联合多肽诱导肝癌特异性ctl细胞的制备及应用
JP2018111695A (ja) がんの治療のためのワクチン及びワクチン有効性を増強するための組成物
CN112294949A (zh) 包含血细胞的半流体的应用、包含该半流体的疫苗和该疫苗的制备方法
CN112294950A (zh) 包含非瘤组织的半流体的应用、及包含该半流体的疫苗和制备方法
CN112316147A (zh) 包含组织细胞的半流体和活性成分的药物组合物以及该组合物的制备方法
CN117838845A (zh) 用于治疗癌症的药物组合物
CN112294964A (zh) 一种用于治疗或抑制实体肿瘤的药物组合、及包含该组合物的药盒
JP2003533203A (ja) 毒性物質が充填された樹状細胞
CN112294948A (zh) 包含血液的半流体的应用、包含该半流体的疫苗和该疫苗的制备方法
US20040022813A1 (en) Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant
CA3208059A1 (en) Therapeutic composition and method combining multiplex immunotherapy with cancer vaccine for the treatment of cancer
CN1994463A (zh) 一种免疫制剂的制备和用途
CN112316148A (zh) 包含血浆的半流体的应用、包含该半流体和活性成分的药物组合物及其制备方法
RU2694761C2 (ru) Терапевтическая вакцина против рака на основе стрессовых белков в качестве иммуногенов
AU2003277641B2 (en) Remedy for cancer
CN114306612A (zh) 非致病性细胞相关组分的应用以及包含非致病性细胞相关组分的药物组合物
EP2564867B1 (en) Autologous biological cancer vaccine
WO2007032566A1 (ja) 造血幹細胞増殖剤
WO2023201787A1 (zh) 一种基于癌症特异性t细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210202

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication