KR102367009B1 - 면역원성 용해물의 제조방법, 이로부터 얻어진 면역원성 용해물, 상기 용해물이 로딩된 수지상 세포 및 상기 용해물 또는 상기 수지상 세포를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents
면역원성 용해물의 제조방법, 이로부터 얻어진 면역원성 용해물, 상기 용해물이 로딩된 수지상 세포 및 상기 용해물 또는 상기 수지상 세포를 포함하는 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 중피종 종양 세포로부터 면역원성 용해물을 제조하는 방법, 이러한 용해물 및 상기 용해물이 로딩된 수지상 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 용해물 또는 수지상 세포를 포함하는 약학 조성물, 상기 용해물의 용도, 및 상기 로딩된 수지상 세포 또는 중피종의 예방 또는 치료시 사용되는 상기 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 중피종 종양 세포로부터 면역원성 용해물(immunogenic lysate)의 제조방법, 이러한 용해물 및 상기 용해물이 로딩된 수지상 세포(dendritic cells)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 용해물 또는 수지상 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 또한, 상기 용해물, 상기 수지상 세포 또는 상기 약학 조성물의 중피종의 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
흉강의 악성 중피종은 상당히 치명적인 신생물이다. 증상의 시작으로부터 9-15개월의 평균 생존 기간으로, 진단은 저조하다. 현재까지, 악성 흉강 중피종(이하: 중피종)에 대한 표준 치유 요법은 없다. 흉막 절제술 및 흉막외 절제술과 같은 수술적 접근방법은 높은 국소 재발률 및 미심쩍은 생존 효과를 초래한다. 미국 식품 의약국(FDA)에 의해 승인된 치료는 단지 페메트렉시드(Alimta)/시스플라틴이며, 3개월의 평균 생존 효과를 갖는다. 현 치료의 제한된 성공 때문에, 새로운 치료 요법이 시급히 요구된다. 면역 시스템의 효력 및 특이성을 활용하기 위한 잠재력은 암 면역치료에서 관심의 증가가 기저를 이루고 있다. 환자의 면역 시스템을 활성화하는 한 접근방법은 수지상 세포를 사용하여 종양-관련 항원을 제시하고, 이에 따라 항종양 특이 반응을 생성하는 것이다.
수지상 세포는 그 바디가 이의 환경과 접촉하게 되는 전략적인 장소에 위치한 고 이동성의 매우 강력한 항원 제시 세포이다. 이러한 위치에서, 이들은 항원을 픽업하고 이들을 2차 림프 기관으로 수송하며, 이곳에서 내추럴 킬러 세포, B 및 T-림프구의 활성화를 지시 및 조절하고, 항원에 대하여 이들을 효율적으로 활성화한다[1]. 이 특성은 암에 대한 치료 전략에 사용하는 데 있어 이들을 매력적인 후보로 만든다[2-3]. 수지상 세포는 시험관에서, 면역 억제 종양 환경에 의해 유발되는 항원 제시 결핍들을 우회함으로써 다수 생성될 수 있으며[4-7], 후속적으로 성숙 상태로 주입되어 항종양 반응을 유도할 수 있다[8-11].
수지상 세포 베이즈드 면역치료는, 실험 동물 및 예를 들어, 신장 세포 암종, 흑색종, 신경교종 및 폐암과 같은, 일부 인간의 암에서 보호성 및 항종양 면역성을 유도하는 것으로 발견되었다. 이는 또한 중피종에 대해서 입증되었다. 특히, 수지상 세포 베이즈드 면역치료는, 악성 중피종에 대한 마우스 모델에서 생존 및 종양 성장 감소에 유익한 효과를 갖는 것으로 발견되었다[13].
실험실 동물에서 이러한 전임상적 발견에 기초하여, 펄스 수지상 세포의 안전성 및 실행가능성을 해소하여 중피종 환자에서 종양-특이적 세포독성 T-세포 반응을 유도하기 위한 임상 시도가 착수되었다[14]. 환자들은 화학 치료(페메트렉시드/시스플라틴)로 치료받은 다음, 자가 종양 용해물-로딩된 모노사이트-유래 수지상 세포를 3회 예방접종 받았다. 화학 치료는 종양 로드를 감소시키기 위해 수지상 세포 예방접종 전에 주어졌으며, 이에 따라 마우스에서 초기에 발견된 것과 같이, 예방접종의 효능을 강력히 증가시켰다. 이러한 연구로부터, 화학 치료 후, 중피종 환자에서 자가 종양 용해물-펄스 수지상 세포의 주입은 안전하고 잘 용인된다는 것이 명확해졌다.
그러나, 수지상 세포를 로딩하기 위해 자가 종양 세포 용해물을 이용하는 것은 어떠한 이론적 및 실제적으로 약점을 갖는다. 자가 접근방법과 연관된 중요 문제점은, 흉부 악성 종양, 특히, 중피종(흉수 또는 생검)의 절제된 종양 물질로부터 얻어지는 종양 세포의 수가 매우 제한된다는 것이다. 예를 들어, 중피종에서 수지상 세포 베이즈드 면역치료를 이용한 첫번째 인간 임상 시험에서, 대부분의 환자들은 참여에서 제외되었다[14]. 총 57명의 중피종 환자로부터, CT/MRI 스캔 상에서는 모든 환자들이 높은 종양 존재량을 가졌음에도 불구하고, 단지 10명의 환자만이 충분한 종양 물질을 제공할 수 있었다.
더욱이, 중피종으로 고통받는 환자들로부터 얻어진 자가 종양 물질은 총 종양 량이 매우 다양하고, 다른 세포들로 "오염(contamination)"되어 있다. 이는 매우 가변적인 종양 세포 용해물을 형성하여 표준화를 상당히 어렵게 만든다. 이러한 종양 물질이 자가 수지상 세포 상에 로딩되는 경우에, 다른 결과의 표현형 및 자극 성능이 기다려진다. 게다가, 각 개별 환자에 대한 자가 종양 물질을 준비하는 것은 시간 소비적이며 고된 일이다. 또한, 각 환자의 용해물 배치(batch)에 대해 품질 시험이 요구되며, 이는 자가 종양 용해물을 이용한 수지상 세포 베이즈드 면역치료 방법을 매우 고비용적인 것으로 만든다.
자가 중피종 종양 세포의 사용과 관련된 또 다른 제한은, 종양 유래 세포의 시험관 내 조작의 어려움이다. 종양 세포 유도체(아포토시스성 또는 괴사성 프래그먼트)를 최적으로 제조하기 위한 다른 접근방법들, 면역원성 증가 또는 단백질 분별에 의한 농축, 및 효능을 증가시키기 위한 다른 중요한 단계들은 자가 종양 물질 상에서 직접 수행될 수 없다. 중피종 세포의 단기 배양일지라도 대부분 세포주를 생성하는 것에 실패하기 때문에, 세포의 수가 조작하기에 적절해질 때까지의 생체 외 자가 세포 배양은 선택사항이 아니다. 자가 종양 세포를 이용하는 것이 실현 가능하지 못한 또 다른 이유는, 환자의 질병이 더욱 진행되는 동안에 상대적으로 긴 배양 기간이 요구된다는 사실이다.
종래 기술에서, 자가 수지상 세포를 로딩하기 위해 아포토시스성 동종 이계(allogeneic) 중피종 종양 세포를 사용하는 것이 제안된바 있다. 이와 관련된 참고문헌은 Ebstein 등(2003), American Journal of Respiration and Critical Care Medicine이다. 이 문헌에서, 하나의 세포주로부터 유래된 온전한 아포토시스 동종 이계 중피종 종양 세포가 시험관 내 연구에 사용되며, 여기서 자가 수지상 세포가 상기 온전한 아포토시스 종양 세포와 함께 로딩된다.
이 연구에서, 아포토시스 열 충격 단백질 과발현 중피종 종양 세포와 함께 공급된 수지상 세포가 세포독성 T 세포 반응을 유도한 것으로 나타났음에도 불구하고, Ebstein에 의해 사용된 방법 및 세포들은 임상적으로 사용할 수 없다. Ebstein에 의해 사용된 세포들은 하나의 세포주로부터 기원한 것이며, 결과적으로 수지상 세포에 제공된 항원은 상대적으로 제한될 것이며, 이에 따라 이의 임상적 사용을 상당히 감소시킬 수 있다. 또한, 이는 종양 세포가 사전 열 충격 처리를 받은 경우에만, 사용된 세포주가 긍정적인 결과를 보인다는 사실로 예시된다. 보다 중요하게도, Ebstein은 아포토시스를 유도하기 위해 UV-B로 처리된 온전한 종양 세포만을 사용한다. 다수의 세포들이 이러한 UV-B 처리에 생존할 수 있기 때문에, 이들은 환자에게 투여하기에 부적절하다. 이와 관련된 참고문헌은 Chalmers A.H. 등(1976), Cancer Research 및 Salucci S. 등(2013), International Journal of Molecular Sciences이다.
따라서, 중피종으로 고통받는 환자들을 치료하기 위해 안전하고 신뢰성있는 방법의 제공이 요구되며, 또한 중피종의 예방 또는 치료에 사용되는 약제 및 약학 조성물의 제공이 요구된다.
본 발명의 제1견지는
i) 적어도 2개의 다른 세포주로부터 동종 이계(allogeneic) 중피종 종양 세포를 제공하는 단계;
ii) 상기 종양 세포에서 괴사 또는 아포토시스를 유도하는 단계;
iii) 괴사성 또는 아포토시스성 종양 세포를 용해(lysing)하여 용해물을 얻는 단계
를 포함하는 면역원성 용해물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법으로, 최초로, 적어도 2개의 다른 세포주로부터 기원한 동종 이계 종양 세포가, 중피종으로 고통받는 환자, 또는 중피종이 발달할 위험이 증가된 자의 면역치료에 사용될 수 있는 용해물을 제조하는데 사용된다.
환자들에서 발견되는 다양한 중피종 종양 세포주들에서 차별적인 항원 발현이 일어나기 때문에, 단지 하나의 세포주로부터 유래된 항원이 로딩된 수지상 세포를 일 그룹의 환자들에게 제공하는 것은 충분하지 못하다. 대신, 세포독성 T-세포 반응이 매우 다양한 중피종 종양에 대해 유도되도록, 수지상 세포에 충분한 종양 항원 공급원들로 로딩하는 것이 중요하다.
본 발명에 따르면, 이는 수지상 세포에 적어도 2개의 다른 세포주로부터 얻어진 동종 이계 종양 세포의 용해물을 로딩함으로써 달성된다. 다양한 세포주를 사용함으로써 이에 따라 다중 항원들이 용해물에 존재하며, 이러한 용해물이 수지상 세포에 로딩하는데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 특정 항원을 하향 조절함으로써 환자에서 중피종 종양이 빠져나가는 것이 감소된다.
또한, 상기 종양 세포의 용해물을 수지상 세포에 로딩하는데 사용하는 것이 본 발명에 필수적이다. 종양 세포의 용해물의 사용에 기인하여, 다양한 종양 세포주들로부터 다양한 항원들의 보다 우수한 혼합이 달성될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 용해물이 로딩된 수지상 세포는 다양한 종양 세포주들로부터 모든 항원들을 제시할 수 있다. 이는 온전한 세포(동종 이계 종양 세포)로는 불가능하다. 용해물을 이용하는 또 다른 이점은, 다량으로 생성하기에 더 용이하며, 취급 및 포장이 더 용이하며, 그리고 이의 품질이 상대적으로 용이하게 모니터될 수 있다는 것이다.
본 발명의 맥락으로, 용어 "중피종 종양 세포(mesothelioma tumor cells)"는 악성 중피종으로부터 유래된 세포를 칭한다.
본 발명의 맥락으로, 용어 "동종 이계(allogeneic)"는 이의 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본 발명에 따른 방법으로부터 형성된 용해물이 나중에 투여될 개체와 다른 개체로부터 유래된 종양 세포를 칭한다. 동종 이계 중피종 종양 세포로부터 얻어진 종양 세포 용해물의 사용은, 개별적으로 제조된 자가 종양 용해물에 대한 필요성을 우회함으로써, 보다 표준화되고, 보다 용이한 접근방법을 제공한다. 또한, 이는 최적의 공급원(아포토시스성 또는 괴사성)을 선택하고, 수지상 세포 상에 투여 및 운반하거나 또는 수지상 세포의 면역원성을 증가시키기 위한 조작을 수행할 기회를 생성한다. 강건하고 유효한 대규모 제조 공정의 이용은, 동일성, 순도, 양 및 멸균성/안전성 시험과 같은 품질 제어 시험을 위해 보다 적은 제품 배치(product batch)를 필요로 한다. 자가 접근방법에 비해 동종 이계 접근방법의 주된 이점은, 종양 세포가 대량으로 최적화되고, 저장될 수 있으며, 그리고 공급이 이미 존재함에 따라 제조/품질 제어 적시성이 환자의 즉각적인 질병 진행에 영향을 주지 않는다는 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "괴사(necrosis)"는 이의 일반적인 과학적 의미를 가지며, 세포의 형태학적 변화를 의미한다. 괴사는, 그 중에서도, 예를 들어 세포막의 "누설성(leakiness)", 즉, 증가된 투과성으로 특성화되며, 이는 또한 세포의 내용물의 유출 및 세포의 항상성 및 이온 평형을 교란시키는 물질들의 유입, DNA 단편화, 그리고 최종적으로 붕괴된 세포들, 즉, 세포 데브리스(cellular debris)로부터 기원한 그래뉼 구조물의 생성을 일으킨다. 전형적으로, 괴사는 그 주변으로 단백질들의 분비를 일으키며, 이것이 생체 내에서 일어나는 경우에 전염증 반응을 일으킨다.
세포가 괴사성인지 여부를 검출하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 다양한 방법이 알려져 있기 때문에 당해 기술분야의 통상의 기술자가 어떤 방법을 선택하는지는 중요하지 않다.
본 발명에 따르면, 괴사성 세포는, 예를 들어, 트리판 블루를 이용한 고전적 염색을 이용하여 이에 의해 괴사성 세포는 염색 시약을 흡수하여 파랗게 염색되거나, 또는 막 무결성의 손실, 세포기관의 분해 및/또는 염색질의 응집을 포함하는 형태학적 변화를 통해 괴사성 세포를 구별하는 광-, 형광 또는 전자 현미경 기술에 의해 검출될 수 있다. 다른 방법은 예를 들어, 프로피듐 요오드(propidium iodide)를 이용한 괴사성 세포 염색에 의한 유동 세포 분석법(flow cytometry)을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "아포토시스(apotosis)"는 이의 일반적인 과학적 의미를 가지며, 프로그램화된 세포 사멸을 의미한다. 세포들이 아포토시스성인 경우에, 세포 수축, 핵 단편화, 염색질 농축 및 염색체 DNA 단편화와 같이, 세포에서 다양한 변화들이 발생한다.
아포토시스성 세포는, 예를 들어, Annexin V-FITC를 이용하여, 형광 색소: Flura-red, Quin-2를 이용하여, 7-아미노-악티노마이신 D(7-AAD)를 이용한 유동 세포 분석법, 로다민 123의 축적의 감소, 엔도뉴클레아제: TUNEL-방법(말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제에 의해 기인한 X-UTP 닉 라벨링)에 의한 DNA 단편화의 검출을 통해, Hoechst 33258 염료를 이용한 염색에 의한 광 현미경을 통해, 예를 들어, 특정 항체를 이용한 89kDa 산물 표지에 의한 카스파제 3 활성을 검출하는 것과 같은 웨스턴 블롯 분석을 통해, 또는 특정 DNA-래더에 의한 특유의 DNA-단편화를 검출하는 아가로즈겔 DNA-분석 검출을 통해 검출될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "용해(lysing)"는 세포를 개방/파괴하기 위해 당해 기술분야에 알려진 다양한 방법들에 관한 것이다. 원칙적으로, 종양 세포의 용해를 달성할 수 있는 어느 방법이 이용될 수 있다. 적절한 방법은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있으며, 예를 들어, 세포의 개방/파괴가 효소적으로, 화학적으로 또는 물리적으로 수행될 수 있다. 종양 세포를 용해하기 위해 사용될 수 있는 효소 및 효소 칵테일의 예는, 프로테이나아제 K, 리파아제 또는 글리코시다아제와 같은 프로테아제이며, 비제한적인 예로, 화학물질은 니그로마이신과 같은 이오노포어, 소듐 도데실 설페이트와 같은 세제, 산 또는 염기이며; 그리고 물리적 수단의 비제한적인 예는 프렌치 프레싱(French pressing)과 같은 고압, 삼투압, 가열 또는 냉각과 같은 온도이다. 세포를 용해하는 바람직한 방식은 세포를 냉동 및 해동하는 것이다. 또한, 단백질 가수분해 효소 이외의 효소, 산, 염기 등의 적절한 조합을 이용한 방법이 이용될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "용해물(lysate)"은 종양 세포의 용해에 의해 생성된 세포성 단백질 또는 인자들을 포함하는, 수용액 또는 서스펜션을 의미한다. 이러한 용해물은 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질 등과 같은 거대분자 및/또는 아미노산, 당, 지질산 등과 같은 미세분자, 또는 용해된 세포의 분획을 포함할 수 있다. 이러한 용해물에 존재하는 세포성 프래그먼트는 평활 구조 또는 그래뉼 구조일 수 있다. 바람직하게, 상기 수성 매체는 물, 생리학적 염수 또는 버퍼 용액이다.
본 발명에 따른 용해물은 이에 한정하는 것은 아니나 용해된 괴사성 세포이다. 예를 들어, 처리된 세포의 다른 민감도에 기인하여, 또는 UVB 조사와 같은 적용된 조건에 기인하여, 용해된 아포토시스성 세포가 또한 용해물을 형성하거나 이의 일부일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, 용해물은 또한 상기 언급된 용해물들로부터 제조되거나 획득된 제조물 또는 분획을 포함한다. 이러한 분획은 예를 들어, 친화 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 역상-크로마토그래피 및 컬럼 내의 다른 크로마토그래피 물질을 이용한 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피, 또는 배치 방법(batch methods), 예를 들어, 한외여과와 같은 여과법, 투석, 원심분리시 크기-배제를 이용한 투석과 농축, 밀도-구배 또는 단계 매트릭스의 원심분리와 같은 다른 분획 방법, 예를 들어, 친화 침전, 솔팅-인(salting-in) 또는 솔팅-아웃(암모늄설페이트-침전), 알코올 침전과 같은 침전, 또는 용해물의 상기 성분들을 분리하기 위한 다른 단백질 화학, 분자생물학, 생화학, 면역학, 화학 또는 물리적 방법과 같이, 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법들에 의해 획득될 수 있다. 바람직한 구현으로, 다른 것들에 비해 더 면역원성인 분획들이 바람직하다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 상기 일반적인 설명 및 본 명세서의 실시예에 기재된 구체적인 설명을 참고하고, 필요에 따라 이러한 방법들을 적절히 변형 또는 개조함으로써 적절한 방법을 선택하고 이의 면역원성 잠재력을 검출할 수 있다.
바람직하게, 중피종 종양 세포의 면역원성은 종양 세포에서 괴사 또는 아포토시스를 유도하기 전에 증진된다. 이러한 면역원성의 증가는 41.2℃ 이상에서, 1-120분간, 바람직하게 20-50분간, 가장 바람직하게는 약 30분간 동종 이계 종양 세포를 배양함으로써 달성될 수 있다. 종양 세포의 면역원성을 증가시키는 또 다른 방법은, 예를 들어, 상기 세포를 차아염소산 또는 과산화수소에 가함으로써 이들을 산화 변형에 노출시키는 것이다. 동종 이계 종양 세포의 면역원성은 또한 세포를 발프로산 또는 서베로일아닐리드 히드록사믹산(suberoylanilide hydroxamic acid)과 같은 히스톤 디아세틸라아제 인히비터에 노출시킴으로써, 또는 종양 세포를 5-아자-2-데옥시시티딘과 같은 DNA-메틸트랜스퍼라아제 인히비터에 가함으로써 증진될 수 있다.
중피종 종양 세포는 바람직하게 척추동물로부터 유래되며, 바람직하게 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 유래된다.
우수한 면역원성 반응을 얻기 위해 상기 용해물을 제조하는데 적어도 2개의 중피종 종양 세포주, 바람직하게는 적어도 3개의 중피종 종양 세포주로부터 얻어진 동종 이계 종양 세포들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 특히 우수한 결과는, 적어도 5개의 중피종 종양 세포주들의 혼합물이 상기 용해물을 제조하는데 사용된 경우에 획득된다. 종양 용해물의 공급원으로서 이러한 세포주들의 혼합물을 사용하는 것은 종양 관련 항원들(광범위하게 다양한 잠재적인 종양 항원들)의 보다 광범위한 항원 목록을 제공하는데 유리하며, 이는 항원 발현의 조절에 의한 면역 감시를 빠져나가는 기회가 보다 더 제한되기 때문에, 종양 세포를 인식하고 파괴하는 면역반응의 능력을 증가시킬 것이다.
바람직하게, 사용된 세포주들 중 적어도 하나는
- ㎟ 당 500 CD3+ cells 이상(more than);
- ㎟ 당 200 CD45RO+ cells 이상;
- ㎟ 당 50 FoxP3+ cells 미만(less than); 및
- ㎟ 당 1000 CD206+ cells 미만
을 함유하는 면역 컨텍스처(contexture)를 갖는 종양 조직 시편으로부터 유래된다.
상대적으로 높은 양의 CD3 양성 및 CD45RO 양성 세포의 존재에 기인하여, 종양 조직 시편은 높은 침투의 CD3+ T 세포 및 CD45RO 메모리 T 세포를 받게 되는 것은 명확하다. 다양한 암에서, 이는 보다 긴 전체 생존과 관련되며, 또한 이는 중피종에 대해 사실이다.
더욱이, 상대적으로 낮은 양의 FoxP3 양성 세포 및 CD206 양성 세포에 기인하여, 높은 침투의 조절 T-세포 및 M2 마크로파지가 일어나지 않는다는 것은 명확하다. 따라서, 이러한 종류의 종양 조직 시편으로부터 유래된 중피종 세포주는 높은 면역-자극을 나타낸다. 즉, 이들은 충분한 양의 항원을 제공하는 한편, 조절 T-세포의 반응을 거의 유발하지 않는다. 이와 관련된 참고문헌은 Fridman 등(2012), Nature Reviews Cancer 및 Galon 등(2013), Journal of Pathology이다.
따라서, 상기 견지로, 면역치료시, 특히 수지상 세포를 펄스하기 위해, 이러한 세포주로부터 제조된 용해물을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 종양 세포로부터 제조된 용해물은 면역 시스템을 활성화시키며 반면에 종양-유래 억제 인자들이 제한된 항원들을 함유한다.
본 발명에 따른 용해물을 제조하기 위해 적어도 2개의 이러한 세포주를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 문맥에서, 본 명세서에 사용된 용어 "면역 컨텍스처(immune contexture)"는 이의 통상적인 의미를 가지며, (인간) 종양의 시편 내의 다양한 면역 세포 집단의 밀도를 칭한다.
다양한 면역 세포의 밀도는 전형적으로 시료의 조직학적 염색에 의해 검출된다. CD3, CD45RO, FoxP3 및 CD206에 대해 면역 세포를 조직학적으로 염색하는 방법은 당해 기술분야에 통상적으로 알려져 있다. 이와 관련된 참고문헌은 Fridman 등(2012), Nature Reviews Cancer이며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
본 발명의 방법에 사용되는 동종 이계 중피종 종양 세포는, 예를 들어, 배양 플라스크에서 배양된다. 이러한 동종 이계 세포는, 비-암종 세포와 상반적으로, 이들의 면역원성 특성의 최소 손실로 제한되지 않는 분열 능력을 갖는다는 사실에 기인하여, 이들은 상기 용해물을 제조하기 위해 사용하는데 적합하다.
특히 우수한 결과를 제공하는, 6개의 인간 중피종 세포주가 현재 개발되었다. 이들 세포주들은 독일의 "Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen"(이하, DSMZ라 함)에 기탁되었다. 상기 세포주들은 하기의 코드 및 수탁 번호가 주어졌다: Thorr 01(기탁 번호 DSM ACC3191), Thorr 02(기탁 번호 DSM ACC3192), Thorr 03(기탁 번호 DSM ACC3193), Thorr 04(기탁 번호 DSM ACC3194), Thorr 05(기탁 번호 DSM ACC3195), Thorr 06 (기탁 번호 DSM ACC3196). 기탁은 특허 절차의 목적으로 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약에 따라 이루어졌다.
세포주 Thorr 03 및 Thorr 02가 특히 주목할 만하다. 이러한 세포주들은 상대적으로 높은 침투의 CD3+ T 세포 및 CD45RO 메모리 T 세포(즉, 높은 면역자극)를 나타내는 중피종 종양 시편들로부터 유래되었다. 또한, 이러한 종양 시편들은 상대적으로 낮은 침투의 FoxP3 양성 세포 및 CD206 양성 세포를 나타내었으며, 이는 낮은 침투의 조절 T-세포 및 M2 마크로파지가 발생하였음을 나타낸다. 현저하게도, 이로부터 이러한 시편들이 얻어진 환자들은 다른 환자들보다 더 상당히 오래 생존하였다. 이러한 이유로, Thorr 02 및 Thorr 03 세포주는, 특히 면역치료시 사용하는 용해물을 제조하기에 적절하다는 결론을 내리는 것이 타당하다. 결국, 종양 항원들을 함유하는 이러한 용해물로 수지상 세포들을 펄스하는 것은, 면역억제를 유도하는 종양-유래 인자들의 부재가 제한되면서 강한 면역-반응을 자극할 것이다.
바람직하게 3개, 보다 바람직하게 5개, 가장 바람직하게 이들 모든 세포주들이, 본 발명에 따른 용해물을 제조하는데 사용된다. 세포주 Thorr 03 및 Thorr 02가 중피종으로 고통받는 환자들에서 T-세포의 현저히 높은 면역 자극을 나타내므로, 적어도 이러한 세포주들이 본 발명에 따른 용해물을 제조하는데 사용하는 것이 특히 바람직하다. 따라서, 이러한 종양 세포들은 종양에 대해 반응하도록 면역 시스템을 자극하는 특정 항원들을 발현한다. 이러한 항원들은 상기 용해물에 존재하며, 수지상 세포 상에 로딩될 경우에 T 세포에 의한 항-종양 반응을 유발한다.
동종 이계 중피종 종양 세포의 괴사는 종래기술에 통상적으로 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 세포들을 동결 해동 사이클에 가하는 것이 특히 바람직하다. 바람직하게, 세포들은 -70℃ 미만의 온도에서 동결하고 30℃ 이상의 온도에서 해동함으로써 괴사 및 용해되며, 특히 동결은 -75℃ 미만의 온도에서 수행하는 것이 바람직하며, 해동은 35℃ 이상의 온도에서 수행하는 것이 바람직하며, 그리고 동결 온도는 -80℃ 이하이고, 해동 온도는 37℃이상이 가장 바람직하다. 또한, 상기 동결/해동은 적어도 1회, 보다 바람직하게 적어도 2회, 보다 더 바람직하게 적어도 3회, 특히 바람직하게 적어도 4회, 그리고 가장 바람직하게 적어도 5회 반복되는 것이 바람직하다.
바람직하게, 종양 세포는 적어도 50 Gy 조사, 바람직하게는 100 Gy로 처리된다. 이러한 방식으로 어느 종양 세포가 생존된 채로 남아있는 것을 회피한다. 조사 처리는 종양 세포가 동결 및 해동을 받기 전 또는 후에 수행될 수 있다.
또한, 동종 이계 중피종 종양 세포에서 아포토시스를 유도하는 것이 유리할 수 있다. 이는 종양 세포를 적어도 15 kJ/㎡ UVB 조사에 받게 함으로써 달성될 수 있다. 아포토시스가 유도된 후에 아포토시스성 세포는 용해된다.
종양 세포들이 더 이상 생존하지 못하는 것을 확실히 하기 위해, 괴사성 또는 아포토시스 종양 세포의 용해물은 바람직하게 적어도 50 Gy 조사, 보다 바람직하게는 100 Gy 이온화 조사를 받는다. 조사 전 또는 후에 용해물을 원심분리하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 제2견지는 상기 언급된 방법에 의해 획득가능한 용해물에 관한 것이다. 2 이상의 다양한 중피종 세포주로부터 얻은 동종 이계 중피종 종양 세포에 기초한 용해물은 이전에 보고된 바 없다.
특히, 적어도 3개의 동종 이계 중피종 종양 세포주, 바람직하게 적어도 4개의, 보다 바람직하게는 적어도 5개의 동종 이계 중피종 종양 세포주의 혼합물로부터 제조된 용해물은 이전에 보고된 바 없다. 이러한 혼합물로부터 얻어진 용해물을 이용하는 것은, 이들이 종양 관련 항원의 보다 광범위한 항원 목록(광범위한 잠재적 종양 항원)을 제공하며, 이는 항원 발현의 조절에 의한 면역 감시를 빠져나가는 기회가 보다 더 제한되기 때문에, 종양 세포를 인식하고 파괴하는 면역반응의 능력을 증가시킬 것이라는 이유로 유리하다.
세포 용해물은 2 이상의 하기 인간 세포주들로부터 제조되는 것이 특히 바람직하며, 이들은 DSMZ에 기탁되어 있다. 상기 세포주들은 하기의 코드 및 수탁 번호가 주어졌다: THorr 01(기탁 번호 DSM ACC3191), Thorr 02(기탁 번호 DSM ACC3192), Thorr 03(기탁 번호 DSM ACC3193), Thorr 04(기탁 번호 DSM ACC3194), Thorr 05(기탁 번호 DSM ACC3195), Thorr 06 (기탁 번호 DSM ACC3196).
본 발명에 따른 용해물을 제조하기 위해 적어도 상기 세포주 Thorr 03 및 Thorr 02를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
기탁은 특허 절차의 목적으로 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약에 따라 이루어졌다. 바람직하게 3개, 보다 바람직하게 5개, 가장 바람직하게 이들 모든 세포주들이, 본 발명에 따른 용해물을 제조하는데 사용된다.
동종 이계 중피종 종양 세포로부터 얻은 종양 세포 용해물의 사용은 또한, 개별적으로 제조된 자가 종양 용해물에 대한 필요성을 우회함으로써, 보다 표준화된 용해물을 제공한다.
또한, 자가 접근방법에 비해 동종 이계 접근방법의 주된 이점은, 종양 세포가 대량으로 최적화되고, 저장될 수 있으며, 그리고 공급이 이미 존재함에 따라 제조/품질 제어 적시성이 환자의 즉각적인 질병 진행에 영향을 주지 않는다는 것이다.
필요에 따라, 상기 용해물을 포함하는 용기가 시중에서 구입될 수 있다. 상기 용해물에 적합한 용기는, 앰플 또는 향낭과 같은 밀봉된 용기이며, 바람직하게 이는 활성제의 양을 나타내는 것이다. 조성물이 인퓨전(infusion)에 의해 투여되는 경우에, 이는 멸균 약학 등급수 또는 염수를 함유하는 인퓨전 보틀에 제공될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다. 또한, 용해물은, 하기에 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 약학 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 제3견지는 상기 언급된 용해물이 로딩된(펄스된) 수지상 세포에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "수지상 세포(dendritic cells)"는 이의 통상적인 의미를 가지며, 항원을 포획하고 림프절 및 비장으로 이동시키는 능력을 가지며, 특히 프로세싱된 항원을 T 세포에 제시하는데 있어서 활성적인, 항원-제시 세포에 관한 것이다. 또한, 수지상 세포는 수지상 세포와 유사한 활성 및 기능을 갖는 세포들을 포함한다. 수지상 세포는 림포이드 또는 단핵 식세포 계열로부터 유래될 수 있다. 이러한 수지상 세포는 림프성 또는 비-림프성 조직에서 발견될 수 있다. 후자는, 활성화되고 림프성 조직으로 이동되는 경우에만 T 세포 반응을 유도하는 것으로 여겨진다.
수지상 세포는 그 중에서도 면역 반응의 가장 강력한 활성물질이며 조절물질인 것으로 알려져 있다. 중요한 일 특징은, 현재 이들은 나이브(naive) T 세포들을 자극하는 것으로 알려진 유일한 항원 제시 세포인 점이다. 미성숙 수지상 세포는 항원을 받아들이고 프로세싱하는 이들의 능력, 성숙 수지상 세포에서 극적으로 감소되어, 결국 이들의 표면 상에, 주로 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자에 바인딩된, 프로세싱된 항원의 증진된 제시를 나타내는 기능에 의해 특성화된다. 또한, 성숙은 (CD40, CD80 및 CD86과 같은) 동시-자극 분자뿐만 아니라, 특정 다른 세포 표면 단백질(예, CD83 및 DC-Sign)의 상향조절과 관련된다. 또한, 수지상 세포 성숙은 보통 증진된 이동 성능과 관련되며, 이는 수지상 세포를 국부 림프절로 이동시켜, 여기서 수지상 세포가 T 및 B 림프구와 접하게 된다.
수지상 세포는 개체, 바람직하게는 인간으로부터, 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 방법을 이용하여 획득될 수 있다[14-17]. 수지상 세포가 획득된 후에, 이들을 배양하고 보다 많은 수지상 세포가 획득된다. 바람직하게, 배양된 수지상 세포는 자가 수지상 세포이다. 자가 수지상 세포를 이용하는 이점은, 이들 수지상 세포들에 대한 환자들의 면역반응이 회피되고, 용해물에 존재하는 중피종 종양 세포로부터 항원에 대하여 면역학적 반응이 촉발된다는 것이다.
자가 수지상 세포를 이용하는 것이 많은 이점을 제공함에도 불구하고, 동종 이계 수지상 세포를 사용하는 것이 또한 유리할 수 있다. 자가 수지상 세포를 이용하는 주된 이점들 중 하나는, 사용할 준비가 되어 있는 약제가 환자에게 제공될 수 있다는 것이다. 즉, 개체로부터 수지상 세포를 수거, 배양 및 로딩할 필요가 없고, 단지 로딩된 동종 이계 수지상 세포를 즉시 투여할 수 있다. 이는 환자의 소중한 시간을 절감시킨다.
수지상 세포 또는 이의 전구체는, 예를 들어, GM-CSF 및 IL-4와 같은 적절한 성장 인자 및/또는 사이토카인을 이용하여 분화되어, 그 결과 미성숙 수지상 세포가 본 발명에 따른 용해물로 로딩된다. 본 발명에 따른 용해물이 로딩된 미성숙 수지상 세포는 성숙 수지상 세포로 더욱 성숙된다. 특별한 경우에, 성숙 수지상 세포는 또한 용해물의 항원 또는 면역원으로 로딩(펄스)될 수 있다.
바람직하게, 수지상 세포는 수지상 세포 당 적어도 0.1 종양 세포 당량으로, 바람직하게 수지상 세포 당 적어도 0.2 종양 세포 당량으로, 보다 바람직하게 수지상 세포 당 적어도 0.5 종양 세포 당량으로, 가장 바람직하게 수지상 세포 당 적어도 1 종양 세포 당량으로 로딩된다.
사용된 수지상 세포는 바람직하게 척추동물로부터 유래되며, 바람직하게 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 유래된다.
본 발명의 제5견지는 본 발명에 따른 용해물을 포함하는 약학 조성물, 또는 약학적으로 허용되는 캐리어와 함께 본 발명에 따른 용해물이 로딩된 수지상 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "약학 조성물(pharmaceutical composition)"은 상술한 바와 같이 상기 세포 용해물 또는 상기 용해물이 로딩된 수지상 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학 조성물은 본 발명의 세포 용해물 또는 수지상 세포를 치료적으로 유효한 양으로 그리고 약학적으로 허용되는 캐리어를 포함한다.
바람직하게, 환자에게 투여되는 조성물의 투여량은 1*103 - 1*1010 로딩된 수지상 세포, 바람직하게 1*105 - 1*109 로딩된 수지상 세포, 가장 바람직하게 1*106 - 1*108 로딩된 수지상 세포를 포함한다. 바람직하게, 이러한 수지상 세포는 수지상 세포 당 적어도 0.1 종양 세포 당량, 보다 바람직하게 수지상 세포 당 적어도 0.2 종양 세포 당량, 보다 바람직하게 수지상 세포 당 적어도 0.5 종양 세포 당량, 가장 바람직하게 수지상 세포 당 적어도 1 종양 세포 당량을 포함한다. 가장 바람직하게, 약학 조성물의 투여량은 수지상 세포 당 적어도 1 종양 세포 당량이 로딩된 1*103 - 1*1010 수지상 세포를 포함한다.
이러한 약학 조성물은 생리학적으로 허용되는 캐리어와 함께 환자에게 본 명세서에 기재된 바와 같이 투여될 수 있다. 용어 "캐리어(carrier)"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 면역증강제(adjuvant), 부형제 또는 비이클을 칭한다. 이러한 약학 캐리어는 물 및 석유, 땅콩 오일, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등과 같은 식물성 또는 합성 기원의 오일과 같은 멸균액일 수 있다. 약학 조성물이 정맥 내 투여되는 경우에 물이 바람직한 캐리어이다. 염 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한 액체 캐리어로서, 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 캐리어로서 이용될 수 있다. 적절한 약학 부형제는 전분, 글루코즈, 락토즈, 수크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탤크, 소듐 클로라이드, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요에 따라, 상기 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
이러한 약학 조성물은 용액, 서스펜션, 에멀젼, 정제, 필(pills), 캡슐, 파우더, 지효성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 트리글리세라이드와 같이 전통적인 바인더 및 캐리어와 함께 좌약으로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 약학 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로즈, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 스탠다드 캐리어를 포함할 수 있다. 적절한 약학 캐리어의 예는 E. W. Martin에 의한 "Reminton's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자의 적당한 투여를 위한 형태를 제공하도록, 치료적으로 유효한 양의 세포 용해물을, 바람직하게는 정제된 형태로, 적절한 양의 캐리어와 함께 함유할 것이다. 제형은 투여 모드에 맞추어야 한다.
또 다른 바람직한 구현으로, 상기 약학 조성물은 인간에게 정맥 내 투여용으로 맞춰진 약학 조성물로서 통상적인 절차에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥 내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 버퍼 내에 담긴 용액이다. 필요한 경우에, 상기 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서의 고통을 덜어주기 위한 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 예를 들어, 활성 성분의 양을 나타내는 앰플 또는 향낭과 같은 기밀하게 밀봉된 용기에 동결건조된 건조 파우더 또는 워터 프리 농축물로서, 개별적으로 또는 단일 투여 형태로 함께 혼합되어 제공된다. 상기 조성물이 인퓨전에 의해 투여되는 경우에, 이는 멸균 약학 등급의 수 또는 염수를 함유하는 인퓨전 보틀에 조제된다. 상기 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 상기 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 발명의 세포 용해물은 중성 또는 염 형태로서 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들과 같은 음이온으로 형성된 것들, 및 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로케인 등으로부터 유도된 것들과 같은 양이온으로 형성된 것들을 포함한다.
제형에 이용되는 세포 용해물 또는 로딩된 수지상 세포의 정확한 투여량은, 투여 경로 및 질병의 상태에 따라 달라질 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정되어야 한다.
바람직하게, 약학 조성물은 백신으로서 작용하기에 적절하게 제형화된다. 본 발명에 따른 백신 조성물을 제조하는 형태 또는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야에서 이용가능한 단일 방법 또는 적절한 조합의 방법들을 적용함으로써 원하는 형태의 조성물이 제조될 수 있다. 백신 조성물의 제조를 위해, 주사용 증류수 및 생리 염수와 같은 수성 매체뿐만 아니라, 당해 기술분야에서 이용가능한 하나 이상의 종류의 약학 첨가제들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 완충제, pH 조절제, 가용화제, 안정화제, 진정제, 방부제 등이 사용될 수 있으며, 이들의 구체적인 성분들은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 또한, 상기 조성물은 동결 건조 제조와 같은 고형 제조물로 제조된 다음, 사용 전에 주사용 증류수와 같은 가용화제를 첨가함으로써 주사제로서 제조될 수 있다. 도입 방식에 따라, 상기 화합물들은 하기에 언급된 바와 같은 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 제형 내에 치료학적 활성 화합물의 농도는 약 0.1-100중량%로 달라질 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 단독으로 또는 다른 치료, 즉, 조사 또는 치료적으로 유효한 양의 질소 머스타드 알킬화제, 니트로소우레아, 알킬 설포네이트, 테모졸로미드(Temodal®) 또는 COX-2 인히비터, 바람직하게는 시클로포스파미드(Endoxan®), 클로람부실(Leukeran®), 메코레타민(Mustardgen®), 유라머스틴, 멜팔란(Alkeran®) 또는 이포스파미드(Ifosfamide)와 같은 질소 머스타드 알킬화제와 같은 다른 화학치료제 또는 항암제와 함께 투여될 수 있다.
바람직한 구현으로, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 염과 같은 수용성 형태로 존재하며, 이는 산 및 염기 부가염 모두를 포함하는 것을 의미한다.
상기 조성물은 주사 용액, 정제, 필, 좌약, 캡슐, 서스펜션 등과 같이 다양한 형태로 제조될 수 있다.
경구 및 국소용으로 적절한 약학 등급의 유기 또는 무기 캐리어 및/또는 희석제가 치료적으로 활성적인 화합물들을 함유하는 조성물을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 당해 기술분야에 알려진 희석제는 수성 매체, 식물성 및 동물성 오일 및 지방을 포함한다. 안정화제, 습윤 및 에멀젼화제, 삼투압을 변화시키기 위한 염 또는 적절한 pH 값을 확보하기 위한 버퍼, 및 피부 침투 증진제가 보조제로 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 혈청 알부민과 같은 캐리어 단백질; 버퍼; 미정질 셀룰로즈, 락토즈, 옥수수 및 다른 전분들과 같은 필러; 바인딩제; 감미료 및 다른 향료; 착색제; 및 폴리에틸렌 글리콜. 첨가제들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 다양한 제형에 사용된다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 본 발명에 따른 용해물 또는 수지상 세포, 바람직하게는 상기 약학 조성물이 면역증강제(adjuvant)와 함께 사용될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 용어 "면역증강제(adjuvant)"는 면역 반응을 유도하는 항원의 자연 능력이 조절될 수 있으며, 특히 이를 변화시키거나, 또는 면역증강제 또는 상기 로딩된 수지상 세포를 다른 물질과 함께 혼합함으로써, 면역 반응을 유도하는 항원의 자연 능력이 증진될 수 있는 것을 의미한다. 또한, 용어 "면역증강제"는, 이로부터 용해물이 생성되는 종양 세포 및/또는 수지상 세포가, 예를 들어, 동시자극 인자와 같이 면역반응에 영향을 미치는 다른 인자들을 발현하기 위해서 유전적으로 변형되는 것을 의미한다. 면역반응을 증진시키기 위해 사용되는 방법 또는 물질을 면역증강제라고 부른다. 적어도 3 종류의 면역증강제가 오랜 기간 사용되어왔으며; 이것들은 미네랄 오일 에멀젼, 알루미늄 화합물, 및 사포닌, 리소레시틴, 레니탈, Quil A. RTM., 일부 리포좀 및 플루론 폴리머 제형과 같은 표면 활성 물질이다. 예, Fundamental Immunology(William E. Paul에 의해 개정됨), p. 1008, Raven Press, New York(이 책은 이하 "Fundamental Immunology"라 함) 참조. 단독 또는 조합으로 사용되는 알루미늄 면역증강제는 하이드록시드 겔, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 ((NH, sub.4), sub. 2 SO. sub. 4. Ai. sub. 2(SO. sub. 4). sub. 3과 같은) 암모늄 명반 및 포타슘 명반을 포함하는 명반을 포함한다. 알루미늄 하이드록시드(이하 "AL"이라 함)는 보다 오래된 면역증강제 중 하나이며, 이는 전 세계적으로 수십억명의 사람들에게 투여된 박테리아 및 바이러스 백신에 적용되어 온 정도로 매우 안전한 것으로 간주된다. 칼슘 포스페이트겔(이하 "CP"라고 함)은 유사한 특성을 가지며, 또한 백신에 사용된다. 두 물질 모두 전 세계 대부분의 국가에서 약학적 품질에 있어서 유용하다.
주사용 면역증강제-항원 제조물을 제조하기 위한 기술은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예, Terry M. Philips, Analytical Techniques in Immunochemistry, pp. 307-10, Marcel Dekker, New York, 1992 참조. 다른 면역증강제는 컴플리트 프로인트 면역증강제(complete Freund's adjuvant)(사멸, 건조된 마이코박테리아 -- 보통 엠. 터보큘로시스(M. tuberculosis) -- 가 오일상으로 서스펜딩된 워터-인-오일 에멀젼); 인컴플리트 프로인트 면역증강제(컴플리트 프로인트 면역증강제와 유사하나 마이코박테리아가 없음); ISCOM (또는 콜레스테롤, 인지질 및 사포닌 Quil A. RTM.의 자발적인 결합에 의해 형성된 친유성 파티클을 포함하는 면역 자극 복합체); 지질다당류(특정 바실러스의 성분들인 다당류와 함께, 지질 코어 -- 지질 A -- 로 구성된 복합 분자; 지질 A는 박테리아의 외막에 편입되며, 다당류는 세포 외로 돌출된다. 이들의 면역증강제 효능은 지질 A와 관련되며; 이들은 또한 뮤린 B 림프구에 대해 유사 분열 촉진성이다.); 및 마이코박테리아 면역증강제(전체, 가열 사멸, 건조된 마이코박테리아 - 엠. 터보큘로시스(M. tuberculosis), 엠. 아비움(M. avium), 엠. 플레이(M. phlei) 및 엠. 스메그마티스(M. smegmatis)와 같은)를 포함하며, 이들은 미네랄 오일 및 에멀젼화제에 현탁될 경우에, 이들과 함께 주어진 어느 항원에 대해 면역증강 활성을 갖는다.
예를 들어, 마이코박테리아 펩티도글리코리피드와 같은 일부 마이코박테리아의 추출물은 유사한 면역증강 활성을 갖는다. 예, Dictionary of Immunology, pp. 3, 7, 46, 94, 97, 105 및 116; R. B. Luftig, Microbiology and Immunology, pp. 228-29, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia 1998. 참조. 미생물 면역증강제는 코리네박테리움 파르븀(Corynebacterium parvum) 및 보르데텔라 퍼터시스(Bordetella pertussis)를 포함한다. 예, Handbook ofImmunology(115-16) 참조. 지효성 방출 제조물 및 면역증강 활성과 가능한 작용 부위를 갖는 물질의 사용은 Fundamental Immunology(pp. 1007-09)에 기재되어 있다. 알루미늄 하이드록시드, 포타슘 암모늄 설페이트 및 포타슘 알루미늄 설페이트와 같은 미네랄 캐리어는 이들의 표면 상의 항원에 흡착한다. 이러한 보통의 면역증강제들은 0.1% 농도로 사용되며, 1mi에 최고 1mg 단백질 항원이 0.2-0.5mu/(체중 kg)의 투여량으로 동물에 투여된다. Miroslav Ferencik, Handbook of Immunochemistry, p. 115, Chapman & Hall 1993(이 책은 이하 "Handbook of Immunochemistry"라 함) 참조. 프로인트 면역증강제가 독성적이며, 인간의 면역화에 사용되지 않음에도 불구하고, 알루미늄 하이드록시드와 같은 미네랄 면역증강제는 인간 의학에서 통상적인 것이다. Id. 116. 명반에 부가적으로, 불활성 캐리어 그룹의 다른 면역증강제는 벤토나이트, 라텍스, 및 아크릴 파티클을 포함한다. Fundamental Immunology, 1008 페이지 참조. 면역증강제들의 조합이 또한 면역증강 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 수중 스쿠알렌 에멀젼(squalene in water emulsion) 내의 사포닌과 무라밀 디펩타이드의 조합이 마우스에서 특정 반응을 유도하는데 있어서 면역증강제로서 명반보다 더 우수한 것으로 나타났다. R. Bomford, M. Stapleton, S. Wilson, A. McKnight, 및 T. Andronova, The control of the antibody isotype responses to recombinant human immunodeficiency virus gp120 antigen by adjuvants, AIDS Res. Hum. Retroviruses Vol. 8 (1992) pp. 1765 이하 참조. 이러한 면역증강제는 지난 15년 동안 개발되어온 새로운 면역증강제들에 의해 보완된다. 예, Anthony C. Allison, The Role of cytokines in the Action of Immunological Adjuvants, in Vaccine Design. The Role of cytokine Networks(Gregory Gregoriadis 및 Brenda McCormack에 의해 개정됨), NATO ASI Series A: Life Sciences Vol 293, pp. 1-9, Plenum Press, New York 1997 (이 책은 이하 "Vaccine Design"이라고 함); Immunology, p. 116; H. Snippe, I. M. Fernandez 및 C. A. Kraaijeveld, Adjuvant Directed Immune Specificity at the Epitope Level. Implications for Vaccine Development. A Model Study Using Semliki Forest Virus Infection of Mice, Vaccine Design, pp. 155-73 참조.
면역증강제는 항원 투여 전에, 이와 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 면역증강제에 의해 일어나는 항체 생성 증진은 완전히 이해되지 않는다. 그러나, 단독으로 또는 다양한 조합으로 존재할 수 있으며, 그리고 면역증강제로서 기재된 물질 또는 제형이 활성적이도록 하는 면역증강제 특성은 정의된바 있다. 예, J. C. Cox 및 A. R. Coulter, Adjuvants--A classification and review of their modes of action, Vaccine Vol. 15 (1981) pp. 248 이하 참조; John Cox, Alan Coulter, Rod Macfarlan, Lorraine Beezum, John Bates, Tuen-Yee Wong 및 Debbie Drane, Development of an Influenza-ISCOM. TM. Vaccine, in Vaccine Design at pp. 33-49 참조. 이러한 특성들 중 하나는 디폿(depot) 생성이며, 이에 의해 백신이 투여 부위 부근에 보유되어 단기 트리클(tricle) 방출 또는 보다 긴 기간의 펄스 방출을 제공한다. Id. p. 34.
바람직하게, 상기 약학 조성물 또는 백신 조성물은 직접 투여되거나 또는 본 명세서에 상기 언급된 면역증강제와 함께 투여되거나, 또는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포 상에 로딩된다. 또한, 상기 약학 조성물 또는 백신 조성물과 면역증강제 및 상기 약학 조성물 또는 백신 조성물과 로딩된 수지상 세포 모두가 함께 투여되거나 또는 예를 들어, 다른 시점이나 다른 위치에서 서로 개별적으로 투여되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 약학 조성물 및 면역증강제는 수지상 세포 상에 로딩된 상기 약학 조성물과 함께 투여된다. 수지상 세포는 항원-특이적 면역 반응을 개시 및 조절하는데 있어서 독특한 능력을 가진 고 특수화된 항원-제시 세포이기 때문에, 이들을 본 발명의 약학 조성물과 함께 조합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제6견지는
i) 적어도 2개의 다른 세포주로부터 동종 이계 중피종 종양 세포를 제공하고, 이의 용해물을 제조하는 단계;
ii) 수지상 세포를 제공하는 단계;
iii) 상기 수지상 세포에 상기 종양 세포의 용해물을 로딩하는 단계
를 포함하는, 중피종의 치료 또는 예방에 사용되는 약학 조성물 제조 방법에 관한 것이다.
약학적으로 허용되는 캐리어는 상기 수지상 세포에 상기 용해물을 로딩하기 전, 도중 또는 후에 첨가될 수 있다. 그러나, 또한 상기 용해물 자체 또는 상기 수지상 세포의 배지가 약학적으로 허용되는 캐리어로서 간주될 수 있다.
바람직하게, 상기 언급된 방법에 사용되는 용해물은 이전 단락에서 제조된 바와 같은 용해물, 즉, 괴사성 또는 아포토시스성 중피종 종양 세포로부터 획득된 용해물이다.
상기 용해물이 로딩되는 수지상 세포는 자가 또는 동종 이계성일 수 있다. 그러나, 자가 수지상 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 미성숙 수지상 세포에 로딩하는 것이 바람직하나, 성숙 수지상 세포가 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 용해물, 로딩된 수지상 세포 및 이의 약학 조성물은 중피종으로 고통받는 환자들을 치료하는데 사용되거나, 또는 중피종이 발달할 기회가 증가된 자에게 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 용해물, 로딩된 수지상 세포 또는 약학 조성물은 치료적으로 유효한 양의 질소 머스타드 알킬화제, 니트로소우레아, 알킬 설포네이트, 테모졸로미드(Temodal®) 또는 COX-2 인히비터, 바람직하게는 시클로포스파미드(Endoxan®), 클로람부실(Leukeran®), 메코레타민(Mustardgen®), 유라머스틴, 멜팔란(Alkeran®) 또는 이포스파미드(Ifosfamide)와 같은 질소 머스타드 알킬화제와 같은 다른 약학적으로 활성적인 화합물들과 함께 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 조합은 키트로서 제조될 수 있다. 그러나, 고정된 투여 조합을 제조하는 것이 특히 바람직하다.
또한, 예방접종 당 1*103 - 1*1010 로딩된 수지상 세포, 바람직하게 1*105 - 1*109 로딩된 수지상 세포, 가장 바람직하게 1*106 - 1*108 로딩된 수지상 세포를 환자에게 투여하는 것이 바람직하다.
바람직하게, 이러한 수지상 세포는 수지상 세포 당 적어도 0.1 종양 세포 당량, 보다 바람직하게 수지상 세포 당 적어도 0.2 종양 세포 당량, 보다 바람직하게 수지상 세포 당 적어도 0.5 종양 세포 당량, 가장 바람직하게 수지상 세포 당 적어도 1 종양 세포 당량을 포함한다.
이러한 투여량을 적어도 2회, 보다 바람직하게 적어도 3회, 그리고 가장 바람직하게 적어도 5회 투여하는 것이 특히 바람직하다. 수지상 세포 당 적어도 1 종양 세포 당량이 로딩된 1*103 - 1*1010 수지상 세포의 투여량을 적어도 3회 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명은 이하 비제한적인 실시예를 통해 더욱 상세히 설명된다.
본 발명의 마지막 견지는 하기 인간 세포주 Thorr 01(기탁 번호 DSM ACC3191), Thorr 02(기탁 번호 DSM ACC3192), Thorr 03(기탁 번호 DSM ACC3193), Thorr 04(기탁 번호 DSM ACC3194), Thorr 05(기탁 번호 DSM ACC3195), Thorr 06 (기탁 번호 DSM ACC3196)에 관한 것이다. 이러한 세포들은 이들의 항원 특성을 잃지 않소 분열될 수 있다.
실시예
실시예
1(동종
이계
종양
용해물
)
중피종에 대한 뮤린 모델에서 동종 이계 종양 용해물을 수지상 세포에 로딩(펄스)함으로써 종양-특이적 면역력을 발생시키기 위해 실험을 수행하였다. 본 연구에 사용된 마우스에 자가 AB1 중피종 세포주를 주사하여, 중피종이 이러한 세포들로부터 발달되도록 하였다. 각 조건은 두 독립된 실험에서 4마리 마우스로 이루어진 적어도 하나의 그룹에서 시험되었다.
I. 수지상 세포 제조
수지상 세포(DC)는 특정 성장 인자를 갖는 골수-유래 단핵 백혈구로부터 발생되었다. 건강한 BALB/c 또는 CBA/j 도너 마우스로부터 골수를 얻기 위해, 대퇴골 및 경골을 수집하고, 부수고 알코올로 세정하였다. 배지를 첨가하고, 세포들을 100㎛ 멤브레인을 통해 여과하였다. 그 다음, 삼투성 용해 버퍼(2ml)를 첨가하여 적혈구를 제거하고, 그 후에 세포 카운팅을 수행하였다. 100-mm 페트리 디쉬를 사용하였으며, 각 디쉬는 10ml DC-조직 배양 배지(DC-TCM)에 10 ×106 cells을 함유하였다. DC-조직 배양 배지는 5% FBS, 50㎍/ml 젠타마이신, 50μM 베타-머캅토에탄올(Sigma-Aldrich) 및 20ng/ml 재조합 뮤린 과립성 백혈구 마크로파지-콜로니-자극 인자(GM-CSF)가 보충된 Glutamax-I(Invitrogen)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Invitrogen)로 구성된다. 세포들을 5% CO2, 가습 분위기 하의 37℃에서 배양하였다. 3일째에, 각 페트리 디쉬에 10ml의 새로운 DC-TCM을 첨가하였다. 6일째에, 10ml의 각 디쉬를 10ml의 새로운 DC-TCM으로 대체하였다. 배양 8일 후에, 각 페트리 디쉬는 30 × 106 미성숙 수지상 세포(iDCs)를 함유하였다.
II.
수지상 세포에 종양
용해물
로딩
그 다음, 미성숙 수지상 세포(iDC)를 동종 이계 종양 용해물로 자극하였다. iDC에 로딩하기 위해, 종양 용해물을 1 iDC 당 3 종양 세포 당량의 비로 첨가하였다. AC29 세포주 유래 종양 용해물은 ml PBS 당 50 × 106 AC29 cells로부터 제조되었다. AB1 세포주는 마우스에서 중피종 종양 성장을 유도하는데 사용되었기 때문에, AC29 중피종 세포주는, AB1 세포주 유도된 중피종으로 고통받는 마우스에 투여될 경우에, 동종 이계 종양 용해물로 간주된다.
세포 서스펜션을 액체 질소에 동결시키고, 4 사이클의 동결-융해 후, 얼음 상에서 Soniprep 150 초음파 분쇄기(Sanyo Gallenkamp BV, Breda, Netherlands)를 이용하여, 10미크론의 진폭으로 10초 동안 4회 초음파 처리하여 파열시켰다. 이 절차를 미처리된 그리고 열 + UV 처리된 종양 세포에 대해 수행하여 괴사성 및 아포토시스성 종양 세포 용해물이 생성하였다. 종양 세포 용해물은 -80℃에 사용 전까지 보관되었다.
AC29 종양 세포 용해물을 가진 BALB/c 및 CBA/j 마우스의 iDCs의 세포 배양은 37℃에서 8시간 동안 유지되었다. 8시간 후, 100㎍/ml 지질 다당류(LPS)[E. coli 026:B6, Sigma-Aldrich]를 DC 배양물에 첨가하여 37℃에서 밤새 배양하면서 완전 성숙되도록 하였다. 다음날, PBS를 첨가함으로써 DCs를 수집하고, 부드러운 파이펫팅으로 상기 디쉬로부터 DCs를 분리하였다. DCs를 4℃에서 Varifuge 3.OR centrifuge(Heraeus instruments)로 7분간 400×g에서 PBS로 세정하고, 2ml PBS에 재현탁하였다. 그 다음, 3ml Lympholyte-Mammal(Cedarlane, Hornby, ON, Canada) 밀도 구배 원심분리를 이용하여 DCs를 종양 세포 용해물 및 데브리스로부터 분리 및 정제하였다. 그 다음, 실온에서 20분간 1200×g(Heraeus instruments)에서 원심분리 후, 파이펫을 이용하여 인터패이즈(interpase)로부터 DC를 수집하였다. 세포들을 다시 4℃에서 7분간 400rpm에서 PBS로 세정하였다. 세포들을 500㎕ PBS에 3 × 106 생존 DCs의 농도로 재현탁하였다. DC 제조물의 품질은 세포 카운팅, 형태학적 분석 및 세포 표면 발현에 의해 측정되었다.
III.
중피종으로 고통받는 마우스에
로딩된
수지상 세포들의 투여
AC29 세포 용해물이 로딩된 수지상 세포들을 치사 종양 주사 전 14일 및 7일에(보호 세팅) 또는 종양 주사 후 1일 및 8일에(치료 세팅) BALB/c 또는 CBA/J 마우스에 복강 내 주사하였다. 그룹/컨디션 당 적어도 4 마리 마우스가 사용되었다. 종양 성장의 발생, 체중, 신체적 건강(physical well-being) 및 생존율을 2개월간 측정하였다. 생존 마우스로부터 비장 및 종양 물질을 수집하고, 크롬-방출 어세이 및 유동 세포 분석법(그란자임 B 및 IFN-감마 양성 세포)에 의해 이들의 용해 활성에 대해 분석하였다.
IV.
결과
동종 이계 DC-베이즈드 면역치료는 도 1에 나타낸 바와 같이 미처리된 마우스에 비해 처리된 마우스에서 증가된 생존율을 나타내었다. CD8 양성 세포독성 T 세포의 양 증가 외에도, 세포 당 IFN-감마 및 그란자임 B 생산의 퍼센트가 미처리된 마우스에 비해 동종 이계 DC 처리된 마우스에서 더 높았다. '동종 이계' 처리된 마우스로부터 얻어진 비장세포의 사멸 능력은, 세포들이 크롬 표지된 AC29 종양 세포와 공동 배양된 경우에 크게 증가하였다.
실시예
2: (자가 종양
용해물
)
동종 이계 종양 용해물에 대해 상술한 것과 동일한 프로토콜을 자가 종양 용해물, 즉, AB1 마우스 중피종 세포주로 후속적으로 행하였다. 용해물(즉, AB1 세포주)를 제조하기 위해 사용된 중피종 세포주는 마우스에서 중피종을 유도하는데 사용된 세포주와 동일하였다. 따라서, 용해물은 자가성으로 간주되었다. 처리된 마우스 또한 미처리된 마우스에 비해 향상된 생존율을 나타내었다.
자가 종양 세포 용해물(AB1) 로딩된 수지상 세포로 처리된 마우스의 생존율은 동종 이계 종양 세포 용해물(AC29) 로딩된 수지상 세포로 처리된 마우스와 대등하였다. 각 조건은 실험 당 적어도 4마리의 마우스에서 시험되었다. 각 실험은 2회 수행되었다.
실시예
3 바람직한 세포주
Thorr
01 -
Thorr
06의 기원
악성 중피종은 독특한 종양- 및 면역-프로필에 특징이 있다. 림프절 관여 및 종양 거동(침습성, 공격성, 중간 정도 및 무통성)과 관련된, 종양으로의 면역 칩입의 현저한 이질성 및 개체성이 존재한다. 면역 활성화 및 면역 억제 간의 균형에 기초하여 4 가지의 가능한 면역-종양학 특성이 존재한다. 본 발명에서 청구하는 바와 같은 세포주 Thorr 01 - 06은 종양 조직으로부터 유래한 것이며, 적어도 하나의 세포주는 상기 4 가지의 면역-종양학 특성 중 하나로부터 얻어진 특성을 갖는다. 종양 세포주가 발생된 종양의 특성들을 하기에 나타내었다:
Thorr 01 세포주는
- ㎟ 당 500 CD3+ cells 이상;
- ㎟ 당 200 CD45RO+ cells 이상;
- ㎟ 당 50 FoxP3+ cells 이상; 및
- ㎟ 당 1000 CD206+ cells 이상
을 갖는 중피종 종양 조직으로부터 유래하였다.
Thorr 02 세포주는
- ㎟ 당 500 CD3+ cells 이상;
- ㎟ 당 200 CD45RO+ cells 이상;
- ㎟ 당 50 FoxP3+ cells 미만; 및
- ㎟ 당 1000 CD206+ cells 미만
을 갖는 중피종 종양 조직으로부터 유래하였다.
Thorr 03 세포주는
- ㎟ 당 500 CD3+ cells 이상;
- ㎟ 당 200 CD45RO+ cells 이상;
- ㎟ 당 50 FoxP3+ cells 미만; 및
- ㎟ 당 1000 CD206+ cells 미만
을 갖는 중피종 종양 조직으로부터 유래하였다.
Thorr 04 세포주는
- ㎟ 당 500 CD3+ cells 미만;
- ㎟ 당 200 CD45RO+ cells 미만;
- ㎟ 당 50 FoxP3+ cells 이상; 및
- ㎟ 당 1000 CD206+ cells 이상
을 갖는 중피종 종양 조직으로부터 유래하였다.
Thorr 05 및 Thorr 06 세포주는
- ㎟ 당 500 CD3+ cells 미만;
- ㎟ 당 200 CD45RO+ cells 미만;
- ㎟ 당 50 FoxP3+ cells 미만; 및
- ㎟ 당 1000 CD206+ cells 미만
을 갖는 중피종 종양 조직으로부터 유래하였다.
따라서, 수지상 세포에 로딩하기 위해 2 이상의 상기 세포주들로부터 용해물을 제조하는 것이 유리하다. 적어도 2 세포주, 바람직하게는 적어도 4 세포주, 중피종의 다른 모든 면역-종양 특성들을 제공하는 각 쿼드런트(quadrant) 중에서 하나가, 가장 광범위하게 다양한 항원적으로 종양-관련된 항원(TAA) 공급원을 위해 선택된다. 이러한 TAA는 자가 DC에 의해 생체 외에서 취해진 다음, 예방접종 후 환자들에서 T 세포에 대한 적절한 MHC 대립유전자의 맥락으로 존재한다.
참고문헌
Claims (44)
- i) 적어도 2개의 다른 인간 중피종 세포주로부터 중피종 종양 세포를 제공하는 단계로서, 상기 종양 세포는 중피종으로 고통받는 환자, 또는 중피종이 발달한 위험이 증가된 사람에 대해 동종 이계(allogeneic)인, 단계;
ii) 상기 종양 세포에서 괴사 또는 아포토시스를 유도하는 단계; 및
iii) 괴사성 또는 아포토시스성 종양 세포를 용해(lysing)하여 용해물을 얻는 단계
를 포함하며, 여기서 사용되는 중피종 종양 세포는 하기 세포주들, Thorr 01(기탁 번호 DSM ACC3191), Thorr 02(기탁 번호 DSM ACC3192), Thorr 03(기탁 번호 DSM ACC3193), Thorr 04(기탁 번호 DSM ACC3194), Thorr 05(기탁 번호 DSM ACC3195), 및 Thorr 06 (기탁 번호 DSM ACC3196) 중 2 이상으로부터 선택되는,
중피종으로 고통받는 환자, 또는 중피종이 발달할 위험이 증가된 사람의 면역치료에 사용하기 위한, 면역원성 용해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
중피종 종양 세포의 면역원성은 41.2℃ 이상에서 1-120분간 상기 세포를 배양하는 것, 상기 세포를 산화 변형에 노출시키는 것, 상기 세포를 히스톤 디아세틸라아제 인히비터에 노출시키는 것 및 상기 세포를 DNA 메틸트랜스퍼라아제 인히비터에 노출시키는 것 중 적어도 하나의 처리에 의해 증진되는, 면역원성 용해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
제공된 중피종 종양 세포는 적어도 5개의 중피종 종양 세포주의 세포를 포함하는, 면역원성 용해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
동종 이계 중피종 종양 세포의 괴사 유도는 상기 세포를 동결-융해 사이클에 가함으로써 달성되는, 면역원성 용해물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
동종 이계 중피종 종양 세포의 아포토시스 유도는 상기 세포를 적어도 15kJ/㎡ 자외선(UV)-B-조사에 가함으로써 달성되는, 면역원성 용해물의 제조방법.
- 중피종으로 고통받는 환자, 또는 중피종이 발달할 위험이 증가된 사람의 면역치료에 사용되는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 획득가능한 용해물로서, 여기서 종양 세포는 중피종으로 고통받는 환자, 또는 중피종이 발달한 위험이 증가된 사람에 대해 동종 이계(allogeneic)인, 용해물.
- 중피종으로 고통받는 환자, 또는 중피종이 발달할 위험이 증가된 사람의 면역치료에 사용되는, 제1항의 방법에 의해 획득가능한 용해물이 로딩된 수지상 세포로서, 여기서 종양 세포는 중피종으로 고통받는 환자, 또는 중피종이 발달한 위험이 증가된 사람에 대해 동종 이계(allogeneic)인, 수지상 세포.
- 제7항에 있어서,
수지상 세포는 미성숙된 것인, 수지상 세포.
- 제7항에 있어서,
수지상 세포는 인간으로부터 유래된, 수지상 세포.
- 제7항에 있어서,
수지상 세포는 수지상 세포 당 적어도 0.1 종양 세포 당량이 로딩된, 수지상 세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 획득가능한 용해물 또는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 수지상 세포 및 약학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는, 중피종 발달의 증가된 위험으로부터 고통받는 환자, 또는 중피종 발달의 증가된 위험을 가진 사람의 면역치료에 사용되는 약학 조성물로서, 여기서 상기 약학 조성물은 면역증강제를 포함하며, 그리고 여기서 종양 세포는 중피종으로 고통받는 환자, 또는 중피종이 발달한 위험이 증가된 사람에 대해 동종 이계(allogeneic)인, 약학 조성물.
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