JP2021533798A - エクソソームに基づく抗腫瘍ワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、抗原提示細胞が腫瘍細胞核を貪食して形成された雑種細胞により分泌されたエクソソームを提供する。マクロファージが腫瘍細胞核を貪食することを利用して、腫瘍抗原のマクロファージ上の内因性発現を実現し、調製されたエクソソームは良好なリンパ節および腫瘍の二重標的化能力を有する。【選択図】図８

Description

本発明は、エクソソーム、その調製方法およびこのエクソソームに基づく抗腫瘍免疫治療方法に関する。前記エクソソームは、免疫活性化および腫瘍微小環境のダブル効果調整能力を有する。

悪性腫瘍の治療手段には、通常外科的治療、放射線治療および化学療法の３種類がある。外科的治療は、肉眼で見える固形腫瘍の直接切除により治療効果を達成するしかできず、悪性腫瘍の浸潤性が非常に強く、外科的治療ではすべての腫瘍細胞を全部除去することが保証できず、腫瘍再発のリスクが高い。放射線治療は、細胞殺傷能力を有する放射線（例えば、α線、β線、γ線など）を用いて悪性腫瘍部位に照射することによりがん細胞を殺す治療法である。しかし、放射線療法には特異性がないため、照射過程で周囲の組織や細胞に何らかの悪影響を与えることは避けられない。化学療法は、腫瘍殺傷能力を有する化学薬品を用いて腫瘍細胞を殺傷することにより腫瘍細胞の増殖、拡散および転移を効果的に抑制する方法である。しかし、ほとんどの化学療法薬は腫瘍特異殺傷能力を有さないため、腫瘍を殺傷すると同時に生体の正常細胞を損傷する強い副作用を引き起こすことがある。

腫瘍生物学および免疫学の発展に伴い、自己免疫システムの調節を主要特性とする免疫療法は、腫瘍治療に新しいアイデアを提供した。腫瘍免疫治療は、様々な手段により生体自身の免疫保護メカニズムを活性化および増強して非正常の腫瘍細胞を殺し、腫瘍治療および再発防止の目的を達成する療法である。現在、リンパ球の養子免疫療法、抗体治療法、腫瘍治療型ワクチンおよび免疫チェックポイントに対する阻害療法をはじめとする抗腫瘍免疫治療は、いずれもある程度の研究進展を遂げた。

腫瘍治療型ワクチンが腫瘍治療作用を発揮する基本原理は、腫瘍抗原を含むワクチンにより患者自身の免疫システムを活性化し、生体に腫瘍細胞似対応する特異的免疫応答を引き起こし、この過程により腫瘍細胞を特異的に除去することである。この過程は、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ，ＡＰＣ）の腫瘍抗原に対する摂取から始まり、各免疫細胞の共同作用および複雑な免疫因子信号ネットワークにより完成される。まず、腫瘍部位の腫瘍抗原は、体内を巡るＡＰＣにより発見され、ＡＰＣは抗原摂取および次の抗原加工により抗原提示能力を取得するとともに、大量のケモカインを放出し、より多いＡＰＣを注射部位へ動員して腫瘍抗原の摂取および加工提示を行う。腫瘍ワクチンにより活性化されたＡＰＣは、さらに自動的にリンパ節にホーミングし、リンパ節内でそれぞれＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔリンパ球を活性化する。一方、ＡＰＣは表面のＭＨＣ Ｉ複合体によりＣＤ８^＋Ｔリンパ球を活性化し、それを増殖させ、腫瘍細胞殺傷作用を有する細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）に変換することができる。そして、ＣＴＬは腫瘍部位に遊走浸潤し、腫瘍細胞を分解して殺傷し、細胞免疫応答により腫瘍細胞を徹底に除去する目的を達成する。さらに、ＡＰＣは、その表面のＭＨＣ ＩＩ複合体によりＣＤ４^＋Ｔリンパ球を活性化し、体液免疫応答を引き起こし、ＩＬ−１２の補助作用下でＴｈ１型ヘルパーＴ細胞に変換し、Ｔｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）を分泌することにより、ＣＴＬの腫瘍細胞に対する殺傷作用を補助することができる。

現在、インビトロ実験により多くの新規ナノ腫瘍ワクチンが上記細胞免疫応答を実現し、大量のＣＴＬを産生できることが実証されている。しかし、動物レベルでの抗腫瘍効果は理想的ではなく、主に動物体内の腫瘍部位には複雑な腫瘍微小環境が存在するためである。腫瘍微小環境には大量の免疫抑制類細胞（腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、制御性樹状細胞（ＤＣ−ｒｅｇ）および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）など）が存在する。これらの免疫抑制細胞は、その表面免疫抑制分子（例えば、ＰＤ−Ｌ１）または大量の抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）の分泌によりエフェクターリンパ球の感作を阻害し、その浸潤能力を低下させ、浸潤したエフェクター細胞の殺傷作用を抑制することで、生体の抗腫瘍免疫作用を低下させる。

上記の様々な研究にもかかわらず、生体をより効率的に活性化して特異的免疫を誘導可能なワクチン（例えば、体内の細胞免疫応答の活性化に加え、腫瘍部位の標的化および腫瘍免疫抑制性微小環境の改善能力を兼ね備える）の研究開発は、その臨床応用にとって非常に重要である。

本発明者らは、腫瘍抗原をＡＰＣ上で内因性発現させることにより、腫瘍抗原のＭＨＣ Ｉ提示を根本的に実現できるとともに、ＡＰＣ上での共刺激因子（例えばＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）の効率的な発現を実現できることを発見した。例えば、高貪食能力を有するマクロファージにより腫瘍細胞核を貪食し、形成された「雑種」細胞にリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）で刺激した上で、雑種マクロファージのエクソソームを抽出し、ＡＰＣをシミュレートする機能を有するエクソソーム型ワクチン製剤を得る。腫瘍細胞核内に完全な腫瘍細胞遺伝情報を有し、それがエンドサイトーシスされてからマクロファージのオルガネラによりマクロファージ膜上で内因的に腫瘍抗原のＭＨＣ Ｉ複合体を発現することができる。培養過程におけるＬＰＳの共同刺激により、マクロファージ表面の共刺激因子および腫瘍抗原−ＭＨＣ Ｉ複合体の発現レベルはさらに向上するとともに、マクロファージは抗腫瘍作用を有するＭ１型マクロファージへ変換する。このような活性化された「雑種」細胞によって分泌された雑種エクソソームの表面に大量の共刺激分子、腫瘍抗原ＭＨＣ Ｉ複合体および多種類の抗腫瘍関連免疫活性化類信号分子を持っている。これらの雑種エクソソームは、ナノレベルのＡＰＣに類似し、ナノサイズの粒径を有するため、一部のエクソソームがリンパ節を標的化し、リンパ節内部でＡＰＣの機能をシミュレートし、Ｔ細胞を直接活性化し、細胞免疫応答を誘導する。さらに、この雑種エクソソームが特定の腫瘍信号（例えば、接着分子）を持っているため、相同のがん細胞腫瘍を標的にして識別することができ、相同腫瘍の定向走化作用により、一部のエクソソームを腫瘍部位へ誘導する。腫瘍内部において、雑種エクソソームは、その内部の免疫活性化類の信号分子により、Ｍ２型マクロファージをＭ１型マクロファージに逆転することができ、これによってＴｒｅｇ比率が低下し、腫瘍微小環境が改善される。

上記事情に鑑み、本発明は、抗原提示細胞が腫瘍細胞核を貪食して形成された雑種細胞を提供する。好ましくは、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞である。

本発明は、前記雑種細胞によって分泌されたナノ細胞小胞であるエクソソームをさらに提供する。このエクソソームは雑種エクソソームである。

本発明は、エクソソームの調製方法をさらに提供する。この方法は、腫瘍細胞の細胞核を抽出し、抗原提示細胞培養液にこの腫瘍細胞核を加え、インキュベートした後、前記培養液の上清液を収集し、ディファレンシャル遠心分離し、エクソソームを収集するステップを含む。

本発明は、前記雑種細胞またはエクソソーム、および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物をさらに提供する。この医薬組成物は例えば抗腫瘍ワクチンである。

本発明は、前記エクソソーム、モノクローナル抗体、および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物をさらに提供する。このモノクローナル抗体は、例えば、ＰＤ−１抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体またはＣＴＬＡ−４抗体である。

マウスマクロファージが腫瘍細胞核を貪食して雑種細胞を形成する共焦点画像片である。 本発明のマウスエクソソームの透過電子顕微鏡画像である。 本発明のマウスエクソソームの粒度分布図である。 本発明のマウスエクソソーム上の４種類のタンパク質分子（エクソソームマーカータンパク質ＣＤ９、共刺激分子ＣＤ８６、組織適合性複合体Ｉ、組織適合性複合体ＩＩ）の発現状況を示す。 本発明のヒトエクソソームの透過電子顕微鏡画像である。 本発明のヒトエクソソーム上の４種類のタンパク質分子（ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ）の発現状況である。 皮下注射された後の本発明のマウスエクソソームのマウスリンパ節および腫瘍での集中状況を示す。 本発明のマウスエクソソーム信号のマウスリンパ節および腫瘍部位での経時変化状況を示す。 本発明のマウスエクソソームが注射された４８ｈ後のマウスの異なる組織でのエクソソーム信号の集中状況を示す。 本発明のマウスエクソソームがリンパ節内で作用する異なる免疫細胞の比率および円グラフである。 本発明のマウスエクソソームが活性化された後のマクロファージとＴ細胞との相互作用の模式図およびＴ細胞増殖効果である。 本発明のマウスエクソソームが活性化された後の樹状細胞とＴ細胞との相互作用の模式図およびＴ細胞増殖効果である。 本発明のマウスエクソソームがＴ細胞を直接活性化した後の増殖効果を示す。 本発明のヒトエクソソームがヒトＴ細胞を直接活性化した後の増殖効果を示す。 本発明のヒトエクソソームにより活性化されたＴ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷効果を示す。 本発明のマウスエクソソームが腫瘍内注射された後、マクロファージと相互作用する雑種エクソソームとの比率を示す。 本発明のマウスエクソソームが腫瘍内注射された後、腫瘍関連マクロファージタプ（Ｍ１／Ｍ２）に対する影響を示す。 本発明のマウスエクソソームが腫瘍内注射された後の腫瘍内のＣＤ４／Ｔｒｅｇ、ＣＤ８／Ｔｒｅｇの比値である。 本発明のマウスエクソソームが腫瘍内注射された後の腫瘍内のＣＴＬの浸潤状況を示す。 本発明のヒトエクソソームで刺激した後の３Ｄ腫瘍細胞球におけるマクロファージタイプに対する影響を示す。 本発明のヒトエクソソームで刺激した後の３Ｄ腫瘍細胞球におけるＴｒｅｇ比率を示す。 本発明のヒトエクソソームで刺激した後の３Ｄ腫瘍細胞球の増殖体積を示す。 本発明のマウスエクソソームが皮下注射された後のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ担癌マウスの腫瘍増殖曲線である。 本発明のマウスエクソソームが皮下注射された後のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ担癌マウスの生存時間曲線である。 本発明のマウスエクソソームが皮下注射された後のＭｕｃ１−Ｂ１６担癌マウスの腫瘍増殖曲線である。 本発明のマウスエクソソームが皮下注射された後のＭｕｃ１−Ｂ１６腫瘍転移モデルマウスの体重変化である。 本発明のマウスエクソソームが皮下注射された後のＭｕｃ１−Ｂ１６腫瘍転移モデルマウスの肺部転移スポットの数統計である。

エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅｓ）は細胞が分泌する生物膜小胞であり、その直径が約３０〜１４０ｎｍである。通常まず細胞膜が内へ凹んで脱落し、初期エンドソームを形成し、次に、細胞質中のエスコート複合体（ＥＳＣＲＴ）および関連タンパク質の制御下で、初期エンドソームの膜がさらに内へ凹み、内生出芽の方式で初期エンドソームにおいて複数のナノサイズの小さな小胞を形成する。このときのエンドソームは、多胞体（ＭＶＢ）と呼ばれる。最後に、ＭＶＢはＧＴＰａｓｅファミリーのうちのＲＡＢ酵素の調節により、細胞膜と融合し、その中のナノ小胞を外へ放出する。これらの細胞外へ放出される小さな小胞はエクソソームと呼ばれる。

エクソソームの分泌は特異性を有し、細胞間の遺伝情報の交換および信号通信に関与することができる。研究により、ＤＣが分泌するエクソソームにはほとんどのＤＣ細胞それ自体の表面分子（例えば、ＭＨＣ分子、共刺激分子など）が「継承」されている。近年、ＡＰＣのエクソソームはより天然の新型ナノ人工ＡＰＣシステムとして腫瘍の免疫治療分野に幅広く使用されている。

抗原提示細胞に比べ、抗原提示細胞の細胞外ナノ小胞、すなわち、エクソソームは腫瘍治療型ワクチンとする優位性は以下の通りである。（１）抗原提示細胞は体外で不活性化しやすいので、使用時に調製する必要がある一方、エクソソームは構造が安定し、長い貯蔵寿命を有し、−８０℃で６ヶ月以上凍結保存できる。（２）抗原提示細胞は体内で腫瘍微小環境により誘導されて表現型変換し（例えば、免疫抑制のＭ２マクロファージまたはＤＣｒｅｇに変換する）、Ｔ細胞活性化能力を失いやすい一方、エクソソームは、固有成分を持っている小粒径小胞として、免疫活性化分子を持っているのでより安定し、変換することがない。（３）エクソソームの内部には化学療法または光熱療法薬が担持でき、免疫治療と他の治療手段との併用治療を実現できるため、抗原提示細胞に基づくエクソソームは、複数の機能を有する腫瘍ワクチンを構築することができる。

本発明は、抗原提示細胞が腫瘍細胞核を貪食して形成された雑種細胞を提供する。好ましくは、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞である。

本発明の好ましい実施形態において、前記抗原提示細胞は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の腫瘍細胞核を貪食することができる

本発明の好ましい実施形態において、遠心分離して対数増殖期の腫瘍細胞を収集し、ＰＢＳで再懸濁させ、２回洗浄し、細胞を沈殿して再懸濁させ、再懸濁後、細胞懸濁液を処理し、篩に掛けて綿状物を除去した後、懸濁液を遠心分離し、下層沈殿は細胞核である。

本発明は、マクロファージなどの抗原提示細胞が腫瘍細胞核をエンドサイトーシスする方式を使用して雑種細胞を調製することにより、マクロファージが腫瘍細胞を貪食する方式に比べてより優れている。腫瘍細胞表面に多種類の信号分子（例えば、ＣＤ４７、ＭＨＣ−Ｉ分子β鎖など）を高発現しやすいことで、マクロファージは腫瘍細胞を貪食することができず、腫瘍細胞とマクロファージの共同増殖を引き起こし、マクロファージの表現型変換を引き起こし、腫瘍細胞の増殖を促進することがある。

本発明は、マクロファージなどの抗原提示細胞が腫瘍細胞核をエンドサイトーシスする方式を使用して雑種細胞を調製し、他の細胞融合方式、例えば、ＰＥＧ融合および電気融合に比べ、本発明でされる方法は効率がより高く、雑種細胞の形成比率が１００％に達し、細胞活性に影響しない。通常、細胞融合法の選択性が非常に低く、マクロファージとマクロファージの融合または腫瘍細胞と腫瘍細胞の融合を引き起こしやすいことで、大量の非目的産物である融合細胞が生成し、ＰＥＧ融合または電気融合方法にもかかわらず、細胞活性に影響し、最終的に生きているマクロファージ−腫瘍雑種細胞の成功率が低く、例えば、１０％−３０％である。

本発明の好ましい実施形態において、前記雑種細胞は免疫調節剤により活性化される。前記免疫調節剤は、例えば、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡまたは非メチル化シチジル酸グアニル酸モチーフである。リポ多糖などは、マクロファージ表面の共刺激因子および腫瘍抗原−ＭＨＣ Ｉ複合体の発現レベルを向上でき、また、マクロファージを抗腫瘍作用を有するＭ１型マクロファージに変換させることができる。このような活性化された雑種細胞が分泌する雑種エクソソームの表面に大量の共刺激分子、腫瘍抗原ＭＨＣ Ｉ複合体および多種類の抗腫瘍関連免疫活性化類信号分子を持っている。

本発明は、エクソソームの調製方法をさらに提供する。この方法は、腫瘍細胞の細胞核を抽出し、抗原提示細胞培養液にこの腫瘍細胞核を加え、インキュベートした後、この培養液の上清液を収集し、ディファレンシャル遠心分離し、エクソソームを収集する。

本発明の好ましい実施形態において、前記抗原提示細胞は腫瘍細胞核を貪食し、雑種細胞を形成する。この雑種細胞はエクソソームを分泌する。このエクソソームは雑種エクソソームである。

本発明の好ましい実施形態において、前記抗原提示細胞は樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞であり、より好ましい抗原提示細胞はマクロファージである。

本発明の好ましい実施形態において、マクロファージが腫瘍細胞核を貪食することにより、腫瘍抗原のマクロファージ上の内因性発現を実現する。また、腫瘍細胞核は、マクロファージオルガネラにより腫瘍接着分子を発現することができる。このような接着分子は、エクソソームの腫瘍部位への遊走をガイドすることができ、エクソソーム腫瘍の標的性の問題を解決し、腫瘍微小環境の改善のために良好の前提を提供する。

本発明の好ましい実施形態において、前記抗原提示細胞培養液に免疫調節剤が添加されており、好ましくは、前記免疫調節剤はリポ多糖、モノホスホリルリピドＡ、非メチル化シチジル酸グアニル酸モチーフのうちのいずれか１種又は２種以上の組み合わせである。

本発明の好ましい実施形態において、高貪食能力を有する抗原提示細胞、例えば、マクロファージにより腫瘍細胞核を貪食し、形成された雑種細胞に免疫調節剤、例えば、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）で刺激した上で、雑種マクロファージのエクソソームを抽出し、ＡＰＣをシミュレートする機能を有するエクソソーム型ワクチン製剤を得る。腫瘍細胞核内に完全な腫瘍細胞遺伝情報を有し、それがエンドサイトーシスされてからマクロファージのオルガネラによりマクロファージ膜上で内因的に腫瘍抗原のＭＨＣ Ｉ複合体を発現することができる。培養過程におけるＬＰＳの共同刺激により、マクロファージ表面の共刺激因子および腫瘍抗原−ＭＨＣ Ｉ複合体の発現レベルはさらに向上するとともに、マクロファージは抗腫瘍作用を有するＭ１型マクロファージへ変換する。このような活性化された雑種細胞によって分泌された雑種エクソソームの表面に大量の共刺激分子、腫瘍抗原ＭＨＣ Ｉ複合体および多種類の抗腫瘍関連免疫活性化類信号分子を持っている。これらの雑種エクソソームは、ナノレベルのＡＰＣに類似し、ナノサイズの粒径を有するため、一部のエクソソームがリンパ節を標的化し、リンパ節内部でＡＰＣの機能をシミュレートし、Ｔ細胞を直接活性化し、細胞免疫応答を誘導する。さらに、この雑種エクソソームが特定の腫瘍信号（例えば、接着分子）を持っているため、相同のがん細胞腫瘍を標的にして識別することができ、相同腫瘍の定向走化作用により、一部のエクソソームを腫瘍部位へ誘導する。腫瘍内部において、雑種エクソソームは、その内部の免疫活性化類の信号分子により、Ｍ２型マクロファージをＭ１型マクロファージに逆転することができ、これによってＴｒｅｇ比率が低下し、腫瘍微小環境が改善される。

本発明の好ましい実施形態において、腫瘍細胞核を貪食したマクロファージはＥ．Ｇ７腫瘍抗原ＯＶＡを成功に発現し、マクロファージ表面のＴ細胞識別信号ＭＨＣ分子、共刺激因子およびＭ１型マクロファージメーカー分子Ｌｙ−６Ｃの発現レベルは向上し、小胞表面で共刺激分子およびＴ細胞識別信号ＭＨＣ分子が高発現され、小胞内部には高含有量の免疫活性化型サイトカインおよび多種類のケモカインを含む。

本発明の好ましい実施形態において、本発明のエクソソームは良好なリンパ節と腫瘍二重標的化能力を有する。リンパ節標的化は、エクソソームのナノサイズ粒径による。腫瘍標的化能力は、エクソソームが持っている腫瘍信号分子が腫瘍部位に対して相同走化性を有することによる。

本発明の好ましい実施形態において、リンパ節を標的とするエクソソームは、一部がＡＰＣにより摂取される方式によりＡＰＣを活性化し、さらにＴリンパ球の増殖を活性化し、他の部分がＴ細胞表面に結合し、Ｔリンパ球の増殖を直接活性化する。腫瘍部位を標的とするエクソソームは、約４分の１が腫瘍関連マクロファージと相互作用し、Ｍ１型マクロファージへの変換を促進する。また、エクソソームは、Ｔｒｅｇの腫瘍部位での浸潤を低下させ、ＣＴＬの腫瘍浸潤比率を向上させ、免疫抑制性の腫瘍微小環境を効果的に改善する。

本発明の好ましい実施形態において、本発明は、本発明荷記載のエクソソームを含む医薬組成物を提供する。前記エクソソームは、生理学的に許容できるキャリアに懸濁され、この生理学的に許容できるキャリアは例えばＰＢＳ緩衝液または生理食塩水である。

本発明の好ましい実施形態において、本発明は、これを必要とする被験体における腫瘍またはがんの増殖もしくは進行を抑制する方法を提供する。この方法は、有効量の本発明に記載のエクソソームを被験体に投与するステップを含む。

好ましくは、エクソソームは、静脈内注射、筋肉注射、皮下注射、髄腔内注射もしくは輸液および／または臓器内輸液（ｉｎｔｒａ−ｏｒｇａｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）により投与される。例えば、エクソソームは、１ｋｇあたりの体重で約１．５×１０^１０−約１．５×１０^１３個のエクソソーム粒子の量で全身投与を行う。他の実施例において、エクソソームは、約１．５×１０^１０および１．５×１０^１１のエクソソーム粒子の量で局所組織または解剖学的空間（ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｓｐａｃｅ）に注射または輸液することで投与する。他の実施形態において、本発明は、少なくとも１種の他の抗がん剤と併用して前記被験体治療する。

本発明は、前記雑種細胞またはエクソソームを含む医薬組成物をさらに提供する。この医薬組成物は、例えば、抗腫瘍ワクチンであり、哺乳類被験体における腫瘍などの疾患に対する予防型または治療型処理に使用される。前記ワクチンは、調製が簡単で、腫瘍の種類に関わらず、再発予防、転移抑制および治療のいずれにも適用可能な汎用性を有し、抗腫瘍効果が高い。

本発明は、前記エクソソームおよびモノクローナル抗体を含む医薬組成物を更に提供する。前記モノクローナル抗体は、例えば、ＰＤ−１抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体またはＣＴＬＡ−４抗体である。

本発明の好ましい実施形態において、マウス体内実験結果から分かるように、本発明のエクソソームワクチンの注射は、腫瘍産生および組織器官の損傷を引き起こすことがなく、良好な生物安全性を有する。抗腫瘍インサイチュ増殖効果の研究において、雑種エクソソームワクチンは、Ｅ．Ｇ７リンパ腫およびＭｕｃ１−Ｂ１６黒色腫のいずれにも良好な腫瘍抑制効果を有し、マウスの生存期を顕著に延長させる。本発明のエクソソームワクチンとＰＤ−１抗体とを併用した後、Ｍｕｃ１−Ｂ１６黒色腫細胞の肺臓、心臓および腎臓への転移に対して良好な予防効果を示し、Ｍｕｃ１−Ｂ１６黒色腫が手術で切除された後のインサイチュ再発および肺転移状況を効果的に防止する。

本発明の目的は、患者体内で腫瘍細胞または腫瘍に対する細胞毒性Ｔ細胞応答を誘導する方法を提供することである。この方法は、この患者に有効量の本発明のエクソソームを投与し、特に静脈内、注射または輸液、好ましくは輸液により投与することを含む。この方法の目的は、特に患者の樹状細胞の活性化およびＣＤ８^＋細胞毒性Ｔ細胞応答を誘導することである。上記のように、特異的ＣＤ４^＋補助ＴおよびＣＤ８^＋細胞毒性Ｔ応答を取得する。

本発明の目的は、患者体内で上記のように腫瘍細胞または腫瘍に対する細胞毒性細胞応答を誘導する抗がん治療方法を提供することである。この方法は、この患者に有効量の本発明のエクソソームを投与し、特に静脈内、注射または輸液、好ましくは輸液により投与することを含む。

本発明において、「有効量」とは、有益または所望な結果（例えば、腫瘍またはがんの進行速度の低下）を引き起こすのに十分な量を指す。有効量は、単回または複数回で投与することができる。有効量、すなわち適切な用量は、治療される被検体の体重、年齢、健康、疾患または病状および投与経路によって変化する。被験体に投与されるエクソソームの用量は被験体において所望の有益な治療反応を経時的に効果的に実現できる量である。

当業者は、滴定用量および投与持続時間に基づいて最良の臨床応答（例えば、がんの進行速度および／または拡散速度の低下、および／または癌の退行の誘導）を達するために投与される不活化エクソソームの量を容易に特定することができる。

本発明で提供される医薬組成物については、当業者に知られている方法により本発明のワクチンを例えば、動脈内、静脈内、経皮注射、経鼻、経気管支、筋肉内または経口により患者に投与することができる。用量および投与方法は、患者の体重、年齢および投与方法によって異なり、当業者が必要に応じて選択することができる。

本発明は、本明細書に開示された具体的な実施形態の範囲に限定されず、これらの実施形態は、本発明のいくつかの態様を説明するものである。

＜実施例１＞Ｅ．Ｇ７−マクロファージ雑種細胞の調製
（ａ）細胞核抽出試薬（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）を用いてリンパ腫細胞Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ（ＡＴＣＣ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ）由来の細胞核を抽出する。
Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を１０％ウシ胎児血清タンパク質（Ｇｉｂｃｏ社）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）、０．４ｍｇ／ｍＬＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ社）および０．０５ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）を含む高グルコース１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社）に培養する。１：５の継代比率で２日ごとに継代する。遠心分離し、対数増殖期の腫瘍細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で再懸濁させ、２回洗浄する。細胞核提取キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）におけるＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を沈殿して再懸濁させた後、細胞密度は約２×１０^７／ｍＬである。その後、１ｍｌあたりの細胞懸濁液に２０μＬ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）を加え、ピペットで繰り返して吹きかけて均一に混合し、２００メッシュの篩に掛けて綿状物を除去する。篩掛けた後の懸濁液７００ｇを５ｍｉｎで遠心分離し、下層の沈殿物は細胞核である。

（ｂ）可溶性澱粉（西隴化工公司）を１．２ｇ秤量し、２０ｍＬ滅菌水に溶解し、溶液が透明になるまで加熱する。牛肉ペースト（北京化工厂）０．０６ｇ、ペプトン（北京化工厂）０．２ｇ、塩化ナトリウム（北京化工厂）０．１ｇが入ったビーカーに入れ、完全に溶解させ、６％澱粉ブロスをマウス腹腔マクロファージ誘導液として調製し、各匹のＣ５７マウス（維通利華実験動物技術有限公司）に１ｍＬ腹腔注射する。３日後、マウスを頸椎脱臼で安楽死させ、７５％アルコール（北京化工厂）で５ｍｉｎ浸漬して消毒した後、マウスに５ｍＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を腹腔内注射して洗浄し、複数回軽くこねた後、腹部皮膚を切開し、腹膜を露出させ、注射器で洗浄液を吸い出して収集し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、１２ｈ接着培養して培養液を交換し、上清懸濁細胞を捨て、残りの接着細胞はマクロファージである。その後、エクソソームフリーのＤＭＥＭ完全培地で培養する。完全培地の成分は、１０％エクソソームフリーのウシ胎児血清タンパク質（Ｇｉｂｃｏ社）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）の高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）を含む。ＤＲＡＱ５染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でマクロファージの細胞核を染色する。

（ｃ）（ａ）で抽出した新鮮Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍細胞核を５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ溶液（北京泛博生物化学有限公司）で染色し、その後、細胞核：マクロファージが２：１の比率で（ｂ）のマクロファージのエクソソームフリーＤＭＥＭ完全培養液に加え、マクロファージに腫瘍細胞核をエンドサイトーシスさせ、マクロファージの細胞核およびＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞核の両方を含む腫瘍−マクロファージ雑種細胞を得る。その後、ローダミン−ファロイジン染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で雑種細胞の細胞膜を染色する。

レーザ走査型共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，ＳＰ５）により４０５ｎｍ、５６１ｎｍおよび６３３ｎｍで雑種細胞を観察する。図１に示すように、調製された雑種細胞内にマクロファージの細胞核に加えて、１−６個のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍細胞核を含み、左から右へ順にマクロファージが１つ、２つ、３つ、４つ、６つの腫瘍細胞核の雑種細胞を貪食したことが示される。

＜実施例２＞Ｂ１６−マクロファージ雑種細胞の調製
（ａ）細胞核抽出試薬（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）を用いて黒色腫細胞Ｍｕｃ−Ｂ１６（ＡＴＣＣ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ）由来の細胞核を抽出する。
Ｍｕｃ１−Ｂ１６細胞を接着培養し、完全培地は、ウシ胎児血清タンパク質（Ｇｉｂｃｏ社）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）、１μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）を含む１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社，ＨＥＰＥＳを含まない）である。１：４の比率で２〜３日ごとに継代する。対数期の細胞を選択し、遠心分離して収集し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で再懸濁させ、２回洗浄する。２×１０^７個の細胞を１ｍＬ細胞核抽出キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）におけるＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁させ、その後、１ｍｌあたりの細胞懸濁液に２０μＬ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）を加え、１ｍＬピペットで１０回吹きかけ、細胞懸濁液が透明になった後、直ちに１０ｍＬ ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を加えて溶解液を希釈し、１４００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、下層の沈殿物を再懸濁させ、篩掛けして綿状物を除去し、分散性が良好なＭｕｃ１−Ｂ１６細胞核懸濁液を得る。

（ｂ）可溶性澱粉（西隴化工公司）を１．２ｇ秤量し、２０ｍＬ滅菌水に溶解し、溶液が透明になるまで加熱する。牛肉ペースト（北京化工厂）０．０６ｇ、ペプトン（北京化工厂）０．２ｇ、塩化ナトリウム（北京化工厂）０．１ｇが入ったビーカーに入れ、完全に溶解させ、６％澱粉ブロスをマウス腹腔マクロファージ誘導液として調製し、各匹のＣ５７マウス（維通利華実験動物技術有限公司）に１ｍＬ腹腔注射する。３日後、マウスを頸椎脱臼で安楽死させ、７５％アルコール（北京化工厂）で５ｍｉｎ浸漬して消毒した後、マウスに５ｍＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を腹腔内注射して洗浄し、複数回軽くこねた後、腹部皮膚を切開し、腹膜を露出させ、注射器で洗浄液を吸い出して収集し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、１２ｈ接着培養して培養液を交換し、上清懸濁細胞を捨て、残りの接着細胞はマクロファージである。その後、エクソソームフリーのＤＭＥＭ完全培地で培養する。完全培地の成分は、１０％エクソソームフリーのウシ胎児血清タンパク質（Ｇｉｂｃｏ社）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）の高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）を含む。

（ｃ）（ａ）で抽出した新鮮なＭｕｃ１−Ｂ１６細胞核を細胞核：マクロファージが２：１の比率で（ｂ）のマクロファージのエクソソームフリーのＤＭＥＭ完全培養液に加え、マクロファージに腫瘍細胞核をエンドサイトーシスさせ、マクロファージの細胞核およびＭｕｃ１−Ｂ１６細胞核の両方を含む腫瘍−マクロファージ雑種細胞を得る。

＜実施例３＞４Ｔ１−マクロファージ雑種細胞の調製
（ａ）細胞核抽出試薬（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）を用いて乳がん細胞４Ｔ１（ＡＴＣＣ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ）由来の細胞核を抽出する。
４Ｔ１細胞を接着培養し、完全培地は、１０％ウシ胎児血清タンパク質（Ｇｉｂｃｏ社）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）を含む１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社，ＨＥＰＥＳを含まない）である。１：４の比率で２〜３日ごとに継代する。対数期の細胞を選択し、遠心分離して収集し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で再懸濁させ、２回洗浄する。２×１０^７個の細胞を１ｍＬ細胞核抽出キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）におけるＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁させ、その後、１ｍｌあたりの細胞懸濁液に２０μＬ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）を加え、１ｍＬピペットで１０回吹きかけ、細胞懸濁液が透明になった後、直ちに１０ｍＬ ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を加えて溶解液を希釈し、１４００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、下層の沈殿物を再懸濁させ、篩掛けして綿状物を除去し、分散性が良好な４Ｔ１細胞核懸濁液を得る。

（ｂ）可溶性澱粉（西隴化工公司）を１．２ｇ秤量し、２０ｍＬ滅菌水に溶解し、溶液が透明になるまで加熱する。牛肉ペースト（北京化工厂）０．０６ｇ、ペプトン（北京化工厂）０．２ｇ、塩化ナトリウム（北京化工厂）０．１ｇが入ったビーカーに入れ、完全に溶解させ、６％澱粉ブロスをマウス腹腔マクロファージ誘導液として調製し、各匹のＢａｌｂｃマウス（維通利華実験動物技術有限公司）に１ｍＬ腹腔注射する。３日後、マウスを頸椎脱臼で安楽死させ、７５％アルコール（北京化工厂）で５ｍｉｎ浸漬して消毒した後、マウスに５ｍＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を腹腔内注射して洗浄し、複数回軽くこねた後、腹部皮膚を切開し、腹膜を露出させ、注射器で洗浄液を吸い出して収集し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、１２ｈ接着培養して培養液を交換し、上清懸濁細胞を捨て、残りの接着細胞はマクロファージである。その後、エクソソームフリーのＤＭＥＭ完全培地で培養する。完全培地の成分は、１０％エクソソームフリーのウシ胎児血清タンパク質（Ｇｉｂｃｏ社）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）の高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）を含む。

（ｃ）（ａ）で抽出した新鮮な４Ｔ１細胞核を細胞核：マクロファージが２：１の比率で（ｂ）のマクロファージのエクソソームフリーのＤＭＥＭ完全培養液に加え、マクロファージに腫瘍細胞核をエンドサイトーシスさせ、マクロファージの細胞核および４Ｔ１細胞核の両方を含む腫瘍−マクロファージ雑種細胞を得る。

＜実施例４＞ヒトＡ３７５−マクロファージ雑種細胞の調製
（ａ）細胞核抽出試薬（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）を用いてヒト黒色腫細胞Ａ３７５（ＡＴＣＣ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ）由来の細胞核を抽出する。
Ａ３７５細胞を接着培養し、完全培地は、ウシ胎児血清タンパク質（Ｇｉｂｃｏ社）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）を含む的ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社，ＨＥＰＥＳを含まない）である。１：４の比率で２〜３日ごとに継代する。対数期の細胞を選択し、遠心分離して収集し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で再懸濁させ、２回洗浄する。２×１０^７個の細胞を１ｍＬ細胞核抽出キット（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）におけるＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁させ、その後、１ｍｌあたりの細胞懸濁液に２０μＬ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）を加え、１ｍＬピペットで１０回吹きかけ、細胞懸濁液が透明になった後、直ちに１０ｍＬ ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を加えて溶解液を希釈し、１４００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、下層の沈殿物を再懸濁させ、篩掛けして綿状物を除去し、分散性が良好なＡ３７５細胞核懸濁液を得る。

（ｂ）滅菌採血針を用い、静脈採血により健康ヒト末梢血５０ｍＬを収集し、リンパ球分離液によりリンパ球を抽出する。ＨＢＳＳ溶液を用いてヒト末梢血を１：１の比率で希釈し、内壁に沿って末梢血と等体積の密度勾配分離液に加え、２０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離し、第２層バフィーコートリンパ球を収集し、リンパ球懸濁液体積の１０倍のＨＢＳＳ溶液を加えて洗浄し、次いで１５００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、２回洗浄下後、ＨＢＳＳで再懸濁させ、さらにヒトＣＤ１４磁気ビーズ選別キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて、説明書に従って操作し、単一の核細胞の選別抽出を行い、その後、５００Ｕ／ｍＬヒトコロニー刺激因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１６４０完全培地で培養し、３−５日後にヒトマクロファージを得る。

（ｃ）（ａ）で抽出した新鮮なＡ３７５細胞核を細胞核：マクロファージが２：１の比率で（ｂ）のヒトマクロファージのエクソソームフリーの１６４０完全培養液に加え、マクロファージに腫瘍細胞核をエンドサイトーシスさせ、マクロファージの細胞核およびＡ３７５細胞核の両方を含むヒト腫瘍−マクロファージ雑種細胞を得る。

＜実施例５＞Ｅ．Ｇ７−マクロファージ雑種細胞由来のエクソソームの調製
実施例１における蛍光染料で染色されていない雑種細胞を培養し、腫瘍細胞核を加え、４日後、雑種細胞の培養液上清を収集し、３００ｇで１０分間遠心分離し、残った細胞沈殿を除去し、上清を取り出して引き続き２０００ｇで１０分間遠心分離し、死細胞沈殿を除去し、上清を取り出して引き続き１００００ｇで３０分間遠心分離し、細胞破片沈殿を除去し、最後に上清を取り出し、１２００００ｇで２時間遠心分離し、上清を捨て、沈殿物をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で再懸濁させ、エクソソーム懸濁液を得る。

＜実施例６＞Ｅ．Ｇ７−マクロファージ雑種細胞由来のエクソソームの特性評価
超遠心分離により抽出された新鮮な実施例５のエクソソームと等量の４％のパラホルムアルデヒド溶液とを混合し、つまり、エクソソームを２％のパラホルムアルデヒド溶液に懸濁させ、３０ｍｉｎ固定する。その後、１０μＬエクソソーム懸濁液を密封膜に滴下し、メッキ層の面が液滴に接触するように銅メッシュを液滴上に被覆し、室温下で銅メッシュ膜で１０ｍｉｎ吸着する。その後、ピンセットで銅メッシュを慎重に取り出し、濾紙で銅メッシュに残った液滴を除去し、事前に密封膜に滴下したＰＢＳ液滴上で２回洗浄する（５分間／回）。その後、銅メッシュを取り外し、濾紙で銅メッシュに残った液体を除去する。その後、銅メッシュを５０μＬの酢酸ウラニル液滴上に移し、３０ｓ対比染色した後、銅メッシュを取り外し、濾紙で銅メッシュ上に残った酢酸ウラニル液体を吸い取って乾燥させ、銅メッシュのメッキ層面を上に向け、空気中で１０ｍｉｎ乾燥させる。その後、１２０ｋＶ生物学的透過型電子顕微鏡下観察し、結果を図２に示す。超遠心分離で抽出されたエクソソーム原液をＰＢＳで５００−２０００倍希釈し、注射器で１ｍＬエクソソーム希釈液をナノ粒子トラッキングアナライザーの試料注入口に注入し、システムで検出して分析し、希釈液中のエクソソームの数を計算し、エクソソーム粒度分布図（図３）を得る。Ｗｅｓ全自動タンパク質発現分析システムによりエクソソーム内の各タンパク質を検出する。まず、ビオチン化した標準サンプルｌａｄｄｅｒを調製し、タンパク質濃度が同じであるエクソソームと１／５体積のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘとを均一に混合し、サンプルを調製する。Ｌａｄｄｅｒとサンプルを９５℃で５ｍｉｎ加熱し、タンパク質を変性させる。その後、それぞれマイクロプレート内の対応するサンプルウェルに加え、マイクロプレートの一次抗体ウェルにＣＤ９、ＣＤ８６、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩの一次抗体希釈液を加え、下の行のウェルに異なる一次抗体の由来源に対応するＨＲＰ−二次抗体希釈液を加え、最も下の行のウェルにＬｕｍｉｎｏｌ−Ｐｅｒｏｘｉｄｅ混合液を加える。その後、装置にキャピラリーインジェクターを取り付け、マイクロプレートをインジェクターの下に置き、装置を起動して検出分析を実行し、実験結果を図４に示す。

図２から分かるように、調製されたエクソソームは典型的なカップ状構造である。図３の粒度分布図にはエクソソームの平均粒径が９０ｎｍである。図４のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇウエスタンブロット結果から分かるように、マクロファージエクソソームおよび本発明のエクソソームの表面ではエクソソームマーカータンパク質ＣＤ ９が発現され、単一のマクロファージエクソソームに比べ、等量の本発明のエクソソーム上の共刺激分子ＣＤ８６、組織適合性複合体Ｉ、組織適合性複合体ＩＩのブロットのグレースケール値はより高く、この３種類のタンパク質の発現量が高くなることを示している。

＜実施例７＞Ｂ１６−マクロファージ雑種細胞由来のエクソソームの調製
実施例２の雑種細胞に終濃度１μｇ／ｍＬのリポ多糖（Ｓｉｇｍａ社）で刺激し、４日後、雑種細胞の培養液の上清を収集し、３００ｇで１０分間遠心分離し、残りの細胞沈殿を除去し、上清を取り出し、引き続き２０００ｇで１０分間遠心分離し、死細胞沈殿を除去し、上清を取り出して引き続き１００００ｇで３０分間遠心分離し、細胞破片沈殿を除去し、最後に上清を取り出し、１２００００ｇで２時間遠心分離し、上清を除去し、沈殿をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で再懸濁させ、本発明のエクソソーム懸濁液を得る。

＜実施例８＞４Ｔ１−マクロファージ雑種細胞由来のエクソソームの調製
実施例３の雑種細胞に終濃度１μｇ／ｍＬのリポ多糖（Ｓｉｇｍａ社）で刺激し、４日後、雑種細胞の培養液の上清を収集し、３００ｇで１０分間遠心分離し、残りの細胞沈殿を除去し、上清を取り出し、引き続き２０００ｇで１０分間遠心分離し、死細胞沈殿を除去し、上清を取り出して引き続き１００００ｇで３０分間遠心分離し、細胞破片沈殿を除去し、最後に上清を取り出し、１２００００ｇで２時間遠心分離し、上清を除去し、沈殿をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で再懸濁させ、本発明のエクソソーム懸濁液を得る。

＜実施例９＞ヒトＡ３７５−マクロファージ雑種細胞由来のエクソソームの調製
実施例４の雑種細胞に終濃度１μｇ／ｍＬのリポ多糖（Ｓｉｇｍａ社）で刺激し、４日後、雑種細胞の培養液の上清を収集し、３００ｇで１０分間遠心分離し、残りの細胞沈殿を除去し、上清を取り出し、引き続き２０００ｇで１０分間遠心分離し、死細胞沈殿を除去し、上清を取り出して引き続き１００００ｇで３０分間遠心分離し、細胞破片沈殿を除去し、最後に上清を取り出し、１２００００ｇで２時間遠心分離し、上清を除去し、沈殿をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で再懸濁させ、本発明の本発明のヒトエクソソーム（ｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）懸濁液を得る。

＜実施例１０＞本発明のヒトＡ３７５−マクロファージ雑種細胞由来のエクソソームの特性評価
超遠心分離により抽出された新鮮な実施例９のヒトエクソソームと等量の４％のパラホルムアルデヒド溶液とを混合し、つまり、エクソソームを２％のパラホルムアルデヒド溶液に懸濁させ、３０ｍｉｎ固定する。その後、１０μＬエクソソーム懸濁液を密封膜に滴下し、メッキ層の面が液滴に接触するように銅メッシュを液滴上に被覆し、室温下で銅メッシュ膜で１０ｍｉｎ吸着する。その後、ピンセットで銅メッシュを慎重に取り出し、濾紙で銅メッシュに残った液滴を除去し、事前に密封膜に滴下したＰＢＳ液滴上で２回洗浄する（５分間／回）。その後、銅メッシュを取り外し、濾紙で銅メッシュに残った液体を除去する。その後、銅メッシュを５０μＬの酢酸ウラニル液滴上に移し、３０ｓ対比染色した後、銅メッシュを取り外し、濾紙で銅メッシュ上に残った酢酸ウラニル液体を吸い取って乾燥させ、銅メッシュのメッキ層面を上に向け、空気中で１０ｍｉｎ乾燥させる。その後、１２０ｋＶ生物学的透過型電子顕微鏡下観察し、結果を図５に示す。

実施例９のヒト雑種エクソソーム（ｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）とヒトＣＤ９抗体結合磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）とを共培養した後、マグネットスタンドによりエクソソーム結合磁気ビーズを分離洗浄し、懸濁液を得る。さらに０．２５μｇのＰＥ標識ａｎｔｉ−ＣＤ８６、０．２５μｇのＰＥ標識ａｎｔｉ−ＣＤ４０、０．２５μｇのＦＩＴＣ標識ａｎｔｉ−ＨＬＡ−ＡＢＣ、０．２５μｇのＢＶ５１０標識ａｎｔｉ−ＨＬＡ−ＤＲ蛍光抗体（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）でエクソソーム−磁気ビーズ懸濁液を暗所で２５ｍｉｎ（４℃）標識し、その後、マグネットスタンドにより染料−エクソソーム−磁気ビーズを分離洗浄し、ＰＢＳで再懸濁させた後、フローサイトメーターにより検出する。同時に、処理されていないヒトマクロファージエクソソーム群（ｈ−ｐｂｓ−ｅｘｏ）、リポ多糖で刺激されていない実施例９のエクソソーム群（ｈ−ｎｃ−ｅｘｏ）、リポ多糖のみで刺激されたヒトマクロファージエクソソーム群を対照群（ｈ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）として作り、上記のように検出し、検出結果を図６に示す。

図５から分かるように、調製されたヒトエクソソームｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏは典型的なカップ状構造である。図６から分かるように、ｈ−ｐｂｓ−ｅｘｏ和ｈ−ｎｃ−ｅｘｏに比べ、ｈ−ｌｐｓ−ｅｘｏおよびｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏは顕著に多い共刺激分子ＣＤ８６およびＣＤ４０を含み、ｈ−ｌｐｓ−ｅｘｏに比べ、ｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ上の抗原提示に関連するＩ型主要組織適合性複合体分子（ＨＬＡ−ＡＢＣ）およびＩＩ型主要組織適合性複合体分子（ＨＬＡ−ＤＲ）の発現量はやや高く、これらの活性化類信号分子の収集はエクソソームが体内でより効果的な免疫活性化反応を発揮することに有利である。

＜実施例１１＞本発明のマウスエクソソームのリンパ節−腫瘍の二重標的化
１μＭ近赤外蛍光親油性染料ＤｉＲ（北京泛博生物化学有限公司）を用いて１００μＬエクソソームを標識し、３７℃で１ｈインキュベートし、その後、実施例５で調製された本発明のエクソソームをゲル濾過カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の上側に滴下し、７００ｇで２ｍｉｎ遠心分離したところ、遊離染料はゲルカラムの内部に遮断され、下層液体はＤｉＲ標識雑種エクソソーム溶液である。３．７×１０^９個のＤｉＲ−エクソソームを皮下注射によりＣ５７ＢＬ／６マウス（維通利華実験動物技術有限公司）の背部に注射し、次いで、９６時間内の異なる時点でマウスを麻酔し、小動物ライブイメージングシステムにより７５０ｎｍでＤｉＲ−雑種エクソソームのマウス体内における分布状況を観察し、異なる時点の蛍光信号のリンパ節および腫瘍部位での変化状況を分析する。実験結果を図７および図８に示す。また、４８ｈ後にマウスを解剖し、それぞれ鼠径部および腋下のリンパ節、腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、腎臓を取り出し、小動物ライブイメージングシステムにより蛍光信号を検出し、実験結果を図９に示す。

図７から分かるように、時間が経つにつれて、エクソソームの蛍光信号が鼠径部リンパ節および腫瘍（破線）で徐々に集中する。図８は、マウス鼠径部のリンパ節および腫瘍部位での蛍光信号の経時変化の定量データである。同図から分かるように、エクソソームを皮下注射した４８ｈ内で、リンパ節および腫瘍での蛍光信号が経時に徐々に強くなり、４８ｈの時点で最大になり、４８ｈを超えた後、両方の蛍光信号はいずれも弱くなる。図９から分かるように、マウス鼠径部、腋下の各リンパ節および腫瘍組織はいずれも比較的強い蛍光信号を有し、マウスの各臓器において、肝臓内で蛍光が集中する以外、他の臓器内の蛍光信号が顕著ではなく、これは、本発明のエクソソームが皮下注射により投与することにより、良好なリンパ節標的化および腫瘍標的化の二重標的能力を確実に有する。

＜実施例１２＞本発明のマウスエクソソームのリンパ節内の作用細胞のタイプ
実施例５で調製された本発明のエクソソームを実施例１１の方法により蛍光標識し、ＤｉＲ標識エクソソームを得る。３．７×１０^９個のＤｉＲ−エクソソームを皮下注射によりＣ５７ＢＬ／６マウス（維通利華実験動物技術有限公司）の背部に注射し、４８ｈの時点でマウスを安楽死させ、リンパ節を取り出して研磨して単細胞懸濁液を得る。その後、それぞれ０．２５μｇのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識ａｎｔｉ−Ｆ４／８０、０．２５μｇのＡｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ７００標識ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｂ、０．２５μｇのＡｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ４８８標識ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｃ、０．２５μｇのＢＶ６０５標識ａｎｔｉ−ＭＨＣ ＩＩ、０．２５μｇのＢＶ５１０標識ａｎｔｉ−ＣＤ３、０．２５μｇのＡＰＣ標識ａｎｔｉ−ＣＤ４、０．２５μｇのＰＥ標識ａｎｔｉ−ＣＤ８蛍光抗体（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で単細胞懸濁液を暗所（４℃）で２５分間標識する。５００μＬ Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で細胞を２回洗浄した後、細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターにより検出し、ＤｉＲ信号が陽性である細胞集団におけるマクロファージ（Ｆ４／８０^＋ＣＤ１１ｂ^＋）、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣ ＩＩ^＋）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋）、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋）の４種類の細胞タイプが占める比率を分析し、各サンプルについては５０００００個の細胞を収集して分析し、結果を図１０に示す。

図１０から分かるように、ＤｉＲ陽性の細胞集団において、１１％はＦ４／８０とＣＤ１１ｂ二重陽性の骨髄由来マクロファージであり、３７．４％はＣＤ１１ｃとＭＨＣ ＩＩ二重陽性の樹状細胞であり、１５．８％はＣＤ４ Ｔ細胞であり、２７．８％はＣＤ８ Ｔ細胞である。各細胞の比率を円グラフにより示す。同図分かるように、抗原提示細胞（マクロファージおよび樹状細胞）およびＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８）は９２％になり、これは、ＤｉＲ標識エクソソームがリンパ節に入った後、ほとんど抗原提示細胞またはＴ細胞と相互作用し、ＡＰＣが免疫応答の補助細胞としてその後にＴ細胞と相互作用して免疫活性化信号を伝達する。

＜実施例１３＞本発明のマウスエクソソームのＴ細胞免疫活性化効果
カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）蛍光標識方法によりＴ細胞の増殖状況を調査する。基本的な原理は以下のとおりである。ＣＦＳＥは、生細胞を蛍光標識することができる細胞染色剤である。ＣＦＳＥは、細胞に入った後、不可逆的に細胞内のアミノ基に結合して細胞タンパク質にカップリングし、細胞分裂増殖の過程において、ＣＦＳＥ標識蛍光は２つの娘細胞に均等に分配されるため、その蛍光強度は母細胞の半分である。フローサイトメーターにより４８８ｎｍの励起光で分析し、リンパ球の増殖状況を正確に検出することができる。

（ａ）実施例５で調製された本発明の雑種細胞で調製された雑種エクソソームで７２ｈ刺激されたマクロファージ／樹状細胞とＣＦＳＥ染色脾臓細胞とを共培養し、Ｔ細胞増殖の効果を検出する。具体的な実験手順は以下のとおりである。１、脾臓細胞染色：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞を０．５μｍのＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）作業濃度で７ｍｉｎ（３７℃）染色し、４倍体積の氷ウシ胎児血清で染色を停止させ、氷浴で５ｍｉｎ処理した後、遠心分離する。新鮮な１６４０完全培地で細胞を再懸濁させ、２回洗浄する。２、９６ウェルプレート前処理：９６ウェルプレートを事前に１μｇ／ｍＬのＣＤ３溶液（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で前処理し、４℃で一晩静置し、翌日にＣＤ３溶液を吸って取り除き、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で２回洗浄した後、保存する。３、細胞共培養：細胞を計数した後、Ｔ細胞と雑種エクソソームで刺激された後のマクロファージ／樹状細胞とを１：２の比率で共培養し、一定の時間後に細胞を収集する。４、染色およびフローサイトメトリー：０．２５μｇのＢＶ５１０標識ａｎｔｉ−ＣＤ３、０．２５μｇのｅＦ４５０標識ａｎｔｉ−ＣＤ４、０．２５μｇのＰＥ標識ａｎｔｉ−ＣＤ８抗体（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で細胞を染色し、フローサイトメーターによりＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の分裂増殖状況を検出する。各サンプルについては１００００個の細胞を収集して分析し、結果を図１１および図１２に示す。

（ｂ）濃度が異なるエクソソームとＣＦＳＥ染色Ｔ細胞とを共培養し、Ｔ細胞増殖効果を調査する。具体的な実験手順は以下のとおりである。１、脾臓細胞染色：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞を０．５μｍのＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）作業濃度で７ｍｉｎ（３７℃）染色し、４倍体積の氷ウシ胎児血清で染色を停止させ、氷浴で５ｍｉｎ処理した後、遠心分離する。新鮮な完全培地で細胞を再懸濁させ、２回洗浄する。２、９６ウェルプレート前処理：９６ウェルプレートを事前に１μｇ／ｍＬのＣＤ３溶液（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で前処理し、４℃で一晩静置し、翌日にＣＤ３溶液を吸って取り除き、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で２回洗浄した後、保存する。３．エクソソームとＴ細胞の共培養：ＣＦＳＥ−Ｔ細胞を９６ウェルプレートに接種し、それぞれ異なる用量の雑種エクソソームを加えて共培養し、一定の時間後、細胞を収集する。４．染色及フローサイトメトリー：ＢＶ５１０標識ａｎｔｉ−ＣＤ３、ｅＦ４５０標識ａｎｔｉ−ＣＤ４、ＰＥ標識ａｎｔｉ−ＣＤ８抗体（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で細胞を染色し、フローサイトメーターによりＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の分裂増殖状況を検出する。各サンプルについては、１００００個の細胞を収集して分析する。結果を図１３に示す。

図１１および図１２から分かるように、本発明の雑種細胞で調製された雑種エクソソームで活性化されたマクロファージおよび樹状細胞は、いずれもＣＤ８ Ｔ細胞およびＣＤ４ Ｔ細胞の大量増殖を引き起こすことができ、これは、エクソソームがリンパ節内で抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞）を活性化することによりＴ細胞を活性化できることを示している。図１３から分かるように、対照群に比べ、高用量（１．４８×１０^９個）のエクソソーム群ＣＤ８ ＴおよびＣＤ４ Ｔ細胞の増殖率は４０％〜５０％向上し、低濃度（３．７×１０^８个）の刺激下においても、エクソソームは、高いＣＤ８ Ｔ細胞増殖効果を奏することができ、エクソソームがリンパ節内でＴ細胞と直接相互作用してＴ細胞増殖を活性化可能であることを証明している。

＜実施例１４＞本発明のヒトエクソソーム的Ｔ細胞免疫活性化効果
実施例９のヒトエクソソームとＣＦＳＥ染色ヒトＴ細胞とを共培養し、ヒトＴ細胞増殖効果を検出する。具体的な実験手順は以下のとおりである。１、ヒト末梢血Ｔ細胞染色：健康ヒト末梢血を採取し、ヒトリンパ球分離液を用いて末梢血からリンパ球を分離し、さらにＰａｎ Ｔ選別磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて説明書に従って操作し、ヒトＴ細胞の分離を行い、その後、０．５μＭのＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）作業濃度で細胞を７ｍｉｎ（３７℃）染色し、４倍体積の氷ウシ胎児血清で染色を停止させ、氷浴で５ｍｉｎ処理した後、遠心分離する。新鮮な培地で細胞を再懸濁させ、２回洗浄する。２、９６ウェルプレート前処理：９６ウェルプレートを事前に１μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３抗体溶液（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で前処理し、４℃で一晩静置し、翌日にＣＤ３抗体溶液を吸って取り除き、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で２回洗浄した後、保存する。３．エクソソームとＴ細胞の共培養：ＣＦＳＥ−Ｔ細胞を９６ウェルプレートに接種し、それぞれ異なる用量のヒト雑種エクソソームを加えて共培養し、一定の時間後、細胞を収集する。４、染色およびフローサイトメトリー：ＳｕｐｅｒＢｒｉｇｈｔ６００標識ａｎｔｉ−ＣＤ３、ＡＰＣ標識ａｎｔｉ−ＣＤ４、ＡＦ７００標識ａｎｔｉ−ＣＤ８抗体（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてヒトＴ細胞を染色し、フローサイトメーターによりＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞の分裂増殖状況を検出する。各サンプルについては、１００００個の細胞を収集して分析する。結果を図１４に示す。

図１４から分かるように、本発明のヒト雑種細胞で調製されたエクソソームは、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞とＣＤ４ Ｔ細胞の大量増殖を同時に直接引き起こすことができ、高い免疫活性化効果を有する。

＜実施例１５＞本発明のヒトエクソソームで活性化されたＴ細胞の腫瘍殺傷能力
実施例９のヒトエクソソームとヒトＴ細胞とを共培養し、増殖後のヒトＴ細胞とＡ３７５腫瘍細胞とを共培養し、ＬＤＨキット（碧云天公司）により腫瘍細胞の殺傷効果を調査する。具体的な実験手順は以下のとおりである。１、ヒト末梢血Ｔ細胞分離：健康ヒト末梢血を採取し、ヒトリンパ球分離液を用いて末梢血からリンパ球を分離し、さらにＰａｎ Ｔ選別磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて説明書に従って操作し、ヒトＴ細胞の分離を行う。２、９６ウェルプレート前処理：９６ウェルプレートを事前に１μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３抗体溶液（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で前処理し、４℃で一晩静置し、翌日にＣＤ３抗体溶液を吸って取り除き、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で２回洗浄した後、保存する。３．エクソソームとＴ細胞の共培養：Ｔ細胞を９６ウェルプレートに接種し、それぞれ異なる用量のヒト雑種エクソソームを加えて共培養し、一定の時間後、Ｔ細胞を収集する。４、Ｔ細胞とＡ３７５細胞の共培養：Ｔ細胞とＡ３７５細胞をそれぞれ２．５：１、５：１、１５：１の比率（Ｅ：Ｔ）で混合し、新しい９６ウェルプレートに接種して共培養し、２４ｈ後にＣＣＫ８キットを用い、説明書に従って操作し、マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍでのＯＤ値を測定し、腫瘍細胞の殺傷率を計算し、結果を図１５に示す。

図１５から分かるように、複数の対照群に比べ、本発明のエクソソーム（ｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）群は、最も高い腫瘍細胞殺傷効率を有し、腫瘍殺傷効率がエフェクターＴ細胞と腫瘍細胞との比率に正の相関があり、本発明のエクソソームが大量のＴ細胞増殖を活性化できるとともに、これらのＴ細胞が腫瘍細胞を効果的に識別して殺傷する能力を有することを示している。

＜実施例１６＞本発明のエクソソームの腫瘍内での作用細胞のタイプ
（ａ）Ｅ．Ｇ７リンパ腫モデルの構築：週齢６〜８の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（維通利華実験動物技術有限公司）を選択し、その左側の腋窩部位に５×１０^５個のＥ．Ｇ７リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ）を皮下注射し、Ｅ．Ｇ７リンパ腫モデルを構築する。

（ｂ）実施例５で調製された雑種細胞で調製された雑種エクソソームを実施例１１の方法により蛍光標識し、ＤｉＲ（北京泛博生物化学有限公司）標識エクソソームを得る。ＤｉＲ−雑種エクソソームを腫瘍内注射によりＣ５７ＢＬ／６マウス（維通利華実験動物技術有限公司）のＥ．Ｇ７腫瘍内部に注射し、４８ｈ後にマウスを安楽死させ、腫瘍組織を取り出して研磨し、赤血球を溶解し、洗浄した後、単細胞懸濁液を得る。さらに０．２５μｇのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識ａｎｔｉ−Ｆ４／８０、０．２５μｇのＡｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ７００標識ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｂ（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で単細胞懸濁液を暗所（４℃）で２５分間標識する。Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で細胞を２回洗浄した後、細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターにより検出し、ＤｉＲ信号が陽性である細胞集団におけるマクロファージ（Ｆ４／８０^＋ＣＤ１１ｂ^＋）の細胞タイプが占める比率を分析し、各サンプルについては５０００００個の細胞を収集して分析し、結果を図１６に示す。

図１６から分かるように、腫瘍細胞懸濁液ＤｉＲ−雑種エクソソーム陽性の各タイプの細胞において、ＣＤ１１ｂ^＋Ｆ４／８０^＋二重陽性のマクロファージが２６．９％を占め、腫瘍内注射されたエクソソームの１／４以上が腫瘍内の腫瘍関連マクロファージと相互作用することを示している。

＜実施例１７＞本発明のマウスエクソソームの腫瘍内微小環境に対する改善効果
まず、週齢６〜８の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（維通利華実験動物技術有限公司）を選択し、０日目にその左側の腋窩部位に５×１０^５個のＥ．Ｇ７リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ）を皮下注射し、Ｅ．Ｇ７リンパ腫モデルを構築する。７日目に腫瘍体積が近いマウスを選択し、ランダムに群を分ける。腫瘍内注射により実施例５の雑種エクソソーム（ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）を体積が同じマウスＥ．Ｇ７腫瘍の内部に注入し、腫瘍内部の各免疫細胞の浸潤状況を調査し、対照群ＰＢＳ群、処理されていないマクロファージエクソソーム群（ｐｂｓ−ｅｘｏ）、リポ多糖で刺激されていない実施例５のエクソソーム群（ｎｃ−ｅｘｏ）、リポ多糖のみで刺激されたマクロファージエクソソーム群（ｌｐｓ−ｅｘｏ）を作る。隔日に注射し、毎回の注射量は３．７×１０^９個であり、合計３回注射する。１４日目にマウスを安楽死させ、腫瘍組織を取り出し、研磨、赤血球破砕、洗浄した後、単細胞懸濁液を得る。その後、単細胞懸濁液を染色し、異なる免疫細胞が占める比率を分析する。具体的な計画は以下のとおりである。

腫瘍関連マクロファージ：０．２５μｇのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識ａｎｔｉ−Ｆ４／８０、０．２５μｇのＡＰＣ標識ａｎｔｉ−Ｌｙ−６Ｃ、０．２５μｇのＡｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ ４８８標識ａｎｔｉ−ＣＤ２０６抗体（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて腫瘍細胞の懸濁細胞を暗所で２５ｍｉｎ（４℃）インキュベートした後、ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で２回洗浄し、フローサイトメーターにより細胞懸濁液を検出し、Ｆ４／８０^＋Ｌｙ−６Ｃ^＋二重陽性（Ｍ１）およびＦ４／８０^＋ＣＤ２０６^＋二重陽性（Ｍ２）のマクロファージの比率を分析し、各サンプルについては５０００００個の細胞を収集して分析し、実験結果を図１７に示す。

制御性Ｔ細胞：まず、０．２５μｇのＢＶ５１０標識ａｎｔｉ−ＣＤ３、０．２５μｇのＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識ａｎｔｉ−ＣＤ４、０．２５μｇのＰＥ標識ａｎｔｉ−ＣＤ８、０．２５μｇのＦＴＩＣ標識ａｎｔｉ−ＣＤ２５抗体（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて腫瘍細胞の懸濁細胞を暗所で２５ｍｉｎ（４℃）インキュベートした後、ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で１回洗浄し、ｆｉｘａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、暗所で２０ｍｉｎインキュベートした後、ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、遠心分離した後、さらにＡｌｅｘ Ｆｌｕｒｏ７００標識ａｎｔｉ−Ｆｏｘｐ３抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、暗所で３０ｍｉｎインキュベートし、その後、ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加えて洗浄し、ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で再懸濁させ、フローサイトメーターにより細胞懸濁液を検出し、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋（制御性Ｔ細胞）、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋およびＣＤ３^＋ＣＤ８^＋のＴ細胞の比率を分析し、各サンプルについては５０００００個の細胞を収集して分析し、実験結果を図１８に示す。

細胞毒性Ｔ細胞：まず、０．２５μｇのＢＶ５１０標識ａｎｔｉ−ＣＤ３および０．２５μｇのｅＦ４５０標識ａｎｔｉ−ＣＤ８抗体（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて腫瘍細胞の懸濁細胞を暗所で２５ｍｉｎ（４℃）インキュベートし、その後、ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で１回洗浄し、ｆｉｘａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、暗所で２０ｍｉｎインキュベートし、その後、ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、遠心分離した後、ＰＥ標識ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γおよびＡＰＣ標識ａｎｔｉ−Ｇｚｍｓ−Ｂ抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、暗所で３０ｍｉｎインキュベートし、ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加えて洗浄し、ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で再懸濁させ、フローサイトメーターにより細胞懸濁液を検出し、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋二重陽性、ＣＤ８^＋ＩＦＮ−γ^＋二重陽性およびＣＤ８^＋Ｇｚｍｓ−Ｂ^＋二重陽性のＴ細胞の比率を分析し、各サンプルについては５０００００個の細胞を収集して分析し、実験結果を図１９に示す。

図１７ａから分かるように、ｐｂｓ群に比べ、雑種エクソソーム群（ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）では、腫瘍内のＭ１型マクロファージおよびＭ２型マクロファージの比率はいずれも高くなり、この２種類のエクソソームのいずれにも大量のケモカインを含み、より多いマクロファージの腫瘍内部への浸潤を動員するためである。腫瘍部位へ動員されたマクロファージは周囲環境の誘導下でタイピングし、各群ＴＡＭｓにおけるＭ１型マクロファージとＭ２型マクロファージとの比（Ｍ１／Ｍ２）は腫瘍内のどのタイプのマクロファージが支配的な地位を占めるかを反映でき、Ｍ１／Ｍ２が１未満である場合、Ｍ２型マクロファージは支配的な地位を占め、Ｍ１／Ｍ２が１を超えた場合、Ｍ１型マクロファージは支配的な地位を占める。各群の腫瘍Ｍ１／Ｍ２の計算結果を図１７ｂに示す。同図から分かるように、ｐｂｓ−ｅｘｏ群のＭ１／Ｍ２の値（０．７４）に比べ、ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ群のＭ１／Ｍ２は１よりも大きく、ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏが腫瘍内注射された後、この群の腫瘍内のＭ１型マクロファージは支配的な地位を占める。また、図１８から分かるように、雑種エクソソームｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏが腫瘍内注射されたマウス腫瘍内部のＣＤ４／ＴｒｅｇおよびＣＤ８／Ｔｒｅｇの比値は顕著に高くなり、雑種エクソソームｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏを投与した後、腫瘍内部の免疫抑制能力を有するＴｒｅｇ細胞浸潤の程度が弱くなる。ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ注射群の腫瘍内Ｍ１型マクロファージが支配的な地位を占めるとともに、Ｔｒｅｇ細胞浸潤が低下するため、免疫抑制微小環境はある程度改善され、エフェクターＴ細胞の腫瘍での浸潤のために適切な環境を提供する。図１９から分かるように、雑種エクソソームｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ群のＣＤ８ ＴとＣＤ８^＋ＩＦＮ−ｒ^＋二重陽性、ＣＤ８^＋ＧＢ^＋二重陽性のＣＴＬは、腫瘍内の比率が大きく高くなり、腫瘍内で大量のＣＴＬが腫瘍内部に十分に浸潤することを示しており、後続の効果的な腫瘍細胞殺傷に良い基盤を築いた。

＜実施例１８＞本発明のヒトエクソソームの３Ｄ腫瘍細胞球における微小環境改善効果
ヒト腫瘍細胞、Ｍ２ヒトマクロファージおよびヒトＴ細胞で３Ｄ細胞球を調製し、人体腫瘍微小環境に対してインビトロシミュレーションを行い、本発明のエクソソームを加えて刺激し、３Ｄ細胞球におけるＭ１／Ｍ２型マクロファージ比率およびＴｒｅｇ比率を測定し、顕微鏡イメージングにより３Ｄ細胞球のサイズを観察する。具体的なステップは以下の通りである。

（ａ）３種類の細胞の調製および培養：滅菌採血針を用い、静脈採血により健康ヒト末梢血を５０ｍＬ収集し、実施例４（ｂ）の方法によりヒト単球の抽出およびヒトマクロファージの誘導を行い、その後、ヒトマクロファージにＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加して刺激し、それをＭ２型マクロファージに誘導し、実施例４の方法によりヒト末梢血Ｔ細胞を選別して収集し、実施例４（ａ）のＤＭＥＭ完全培地によりＡ３７５黒色腫を培養する。

（ｂ）アガロースゲルを用いる９６ウェルプレートの被覆
１０ｍＬのｄＭＥＭ不完全培地に０．１５ｇアガロースを加え、１ｈかけて１００℃に加熱し、アガロースを融解させる。溶液が冷却して完全に凝固していないときに、調製されたアガロースを９６ウェルプレートに入れ、室温に冷却し、凹型の細胞培養基質を形成する。

（ｃ）３Ｄ細胞球培養およびヒトエクソソーム投与：ヒト腫瘍細胞、Ｍ２ヒトマクロファージおよびヒトＴ細胞を７００：３００：３００の比率で混合した後、マトリックスゲルが被覆された９６ウェルプレートに加え、培養し、３Ｄ混合細胞球の形状が形成された後、本発明の雑種エクソソーム（ｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）を加え、対照群ＰＢＳ群、処理されていないヒトマクロファージエクソソーム群（ｈ−ｐｂｓ−ｅｘｏ）、リポ多糖で刺激されていない実施例９のエクソソーム群（ｈ−ｎｃ−ｅｘｏ）、リポ多糖のみで刺激されたヒトマクロファージエクソソーム群（ｈ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）を作り、刺激する。

（ｄ）Ｍ１／Ｍ２比率、Ｔｒｅｇ比率測定：異なる群の３Ｄ細胞球を取り、単細胞懸濁液を調製し、単細胞懸濁液を染色し、異なる免疫細胞が占める比率を分析する。具体的な染色方法は以下のとおりである。１、０．２５μｇのＰＥ−Ｃｙ７標識ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｂ、０．２５μｇのｅＦｌｏｕｒ４５０標識ａｎｔｉ−ＣＤ１４、０．２５μｇのＡＰＣ標識ａｎｔｉ−ＣＤ１６３、０．２５μｇのＰＥ標識ａｎｔｉ−ＣＤ８６抗体（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて細胞懸濁液を暗所で２５ｍｉｎ（４℃）インキュベートし、その後、ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で２回洗浄し、フローサイトメーターにより細胞懸濁液を検出し、ＣＤ１４^＋ＣＤ１１ｂ^＋二重陽性のマクロファージにおけるＣＤ８６^＋ＣＤ１６３⁻（Ｍ１）およびＣＤ８６⁻ＣＤ１６３^＋（Ｍ２）のマクロファージの比率を分析し、各サンプルについては５０００００個の細胞を収集して分析し、実験結果を図２０に示す。２、０．２５μｇのＢＶ６０５標識ａｎｔｉ−ＣＤ３、０．２５μｇのＰＥ−Ｃｙ^７標識ａｎｔｉ−ＣＤ４、０．２５μｇのＡＰＣ−ｅＦｌｏｕｒ７８０標識ａｎｔｉ−ＣＤ８、０．２５μｇのＡＰＣ標識ａｎｔｉ−ＣＤ２５抗体（いずれもｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて腫瘍細胞の懸濁細胞を暗所で２５ｍｉｎ（４℃）インキュベートし、その後、ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で１回洗浄し、ｆｉｘａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、暗所で２０ｍｉｎインキュベートし、その後、ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、遠心分離した後、さらにＰＥ標識ａｎｔｉ−Ｆｏｘｐ３抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加え、暗所で３０ｍｉｎインキュベートし、その後、ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを加えて洗浄し、ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で再懸濁させ、フローサイトメーターにより細胞懸濁液を検出し、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋（制御性Ｔ細胞）の比率を分析し、各サンプルについては１０００００個の細胞を収集して分析し、実験結果を図２１に示す。

（ｅ）３Ｄ細胞球の体積変化を記録し、顕微鏡イメージングする。
３Ｄ細胞球を軽く吸い出した後、４％パラホルムアルデヒドを固定して一晩静置し、その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）を用いて細胞核染色を行い、室温で１５ｍｉｎ静置した後、細胞球をウェルプレートに移し、蛍光イメージングを行い、実験結果を図２２に示す。

図２０から分かるように、ｐｂｓ群に比べ、ヒト雑種エクソソーム群（ｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）の３Ｄ腫瘍細胞球内のＭ２型マクロファージの比率は顕著に低下し、Ｍ１型マクロファージの比率は高くなり、ｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏが３Ｄ細胞球内のマクロファージをＭ１型マクロファージに誘導できることを示している。さらに、図２１から分かるように、ヒト雑種エクソソーム群（ｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）の３Ｄ腫瘍細胞球内のＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋のＴｒｅｇ比率はｐｂｓ群の８．２５％から３．８９％に低下し、ヒト雑種エクソソームｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏを投与した後、３Ｄ細胞球内における免疫抑制能力を有するＴｒｅｇ細胞の浸潤程度が弱くなることを示している。ｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏにおける免疫活性化型サイトカインの存在により、免疫抑制微小環境がある程度改善され、エフェクターＴ細胞の腫瘍内での殺傷作用の発揮に適切な環境を提供するためである。図２２の最終的な３Ｄ細胞球画像から分かるように、ｈ−ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ群の３Ｄ細胞球の直径が最も小さく、腫瘍増殖抑制効果が最も高い。

＜実施例１９＞本発明のマウスエクソソームの動物実験効果
週齢６−８の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（維通利華実験動物技術有限公司）を選択し、０日目にリンパ腫細胞Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍細胞（５×１０^５）を接種し、５日目に、実施例５で調製された雑種エクソソームワクチン製剤を用いて皮下免疫を行い、エクソソームの単回接種量は３．７×１０^９個である。さらに、二次免疫を受けた二次免疫群（２ｎｃ−ｌｐｓ−ｅｘｏ）を作り、８日目に強化ワクチン接種を行う。また、対照群ＰＢＳ群、処理されていないマクロファージエクソソーム群（ｐｂｓ−ｅｘｏ）、リポ多糖で刺激されたいない実施例５の雑種細胞のエクソソーム群（ｎｃ−ｅｘｏ）、リポ多糖のみで刺激されたマクロファージエクソソーム群（ｌｐｓ−ｅｘｏ）を作り、対照群エクソソームの注射量は３．７×１０^９個である。その後、マウスの担癌体積および生存状況を記録し、結果を図２３および図２４に示す。

図２３および図２４から分かるように、本発明の雑種エクソソームを接種することにより、マウスの担癌体積を減少させ、二次免疫による治療後、ワクチン製剤は腫瘍増殖を効果的に遅延させ、マウスの平均生存期間を延長することができる。

＜実施例２０＞本発明のマウスエクソソームとＰＤ−１抗体の併用の動物実験効果
本発明の実施例７で調製された雑種細胞のエクソソームとＰＤ−１抗体との併用療法により黒色腫悪性腫瘍の免疫治療試験を行い、方法は以下の通りである。
週齢６−８の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（維通利華実験動物技術有限公司）を選択し、０日目にＭｕｃ１−Ｂ１６黒色腫細胞（ＡＴＣＣ）を接種し、接種用量は５×１０^５個であり、Ｍｕｃ１−Ｂ１６黒色腫インサイチュ増殖モデルを構築する。実施例７で調製された雑種エクソソームとＰＤ−１抗体の併用により治療を行い（ａ−ＰＤ１＋ｖａｃ．）、エクソソームの皮下投与量は１．８５×１０^９個のエクソソームである。一次免疫時間は腫瘍細胞接種後の５日目、二次免疫の時間は８日目であり、ＰＤ−１抗体（ＢｉｏＸｅｌｌ社）の投与は腹腔内投与を採用し、それぞれ腫瘍細胞接種後の３日目、６日目、９日目、１２日目に投与し、単回投与量は１００μｇである。また、ブランク群（ｐｂｓ）、２倍用量雑種エクソソーム単独治療群（２×ｖａｃ．）、および２倍用量ＰＤ−１抗体単独治療群（２×ａ−ＰＤ１）の３群の対照群を作る。その後、マウスの担癌体積を記録し、結果を図２５に示す。

週齢６−８の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（維通利華実験動物技術有限公司）を選択し、０日目に尾静脈からＭｕｃ１−Ｂ１６黒色腫細胞（ＡＴＣＣ）を接種し、接種用量は１×１０^５個であり、Ｍｕｃ１−Ｂ１６黒色腫肺転移モデルを構築する。実施例７で調製された雑種エクソソームとＰＤ−１抗体の併用により治療（ａ−ＰＤ１＋ｖａｃ．）を行い、エクソソームの皮下投与量は１．８５×１０^９個のエクソソームである。一次免疫の時間は０日目、すなわち、腫瘍細胞尾静脈注射の当日であり、二次免疫の時間は３日目である。ＰＤ−１抗体（ＢｉｏＸｅｌｌ社）単独投与群は腹腔内投与を採用し、それぞれ腫瘍細胞接種後の０日目、３日目、６日目、９日目に投与し、単回投与量は１００μｇである。また、ブランク群（ｐｂｓ）、２倍用量雑種エクソソーム単独治療群（２×ｖａｃ．）および２倍用量ＰＤ−１抗体単独治療群（２×ａ−ＰＤ１）の３群の対照群を作る。その後、マウスの体重および肺部転移スポットを記録し、結果を図２６、図２７に示す。

図２５から分かるように、ＰＤ−１抗体と雑種エクソソームとを併用して治療するときに、この群のマウスのＢ１６黒色腫の増殖は大幅に抑制され、８匹のマウスにはわずかな４匹のマウスは体積が小さな腫瘍が現れ、治療効果は２倍用量のＰＤ−１抗体群および２倍用量のエクソソーム単独投与群よりも顕著に高い。

図２６、図２７から分かるように、ＰＤ−１抗体と雑種エクソソームの併用治療群では、マウスの体重が観察期内で平穏に上昇し、マウス肺部の転移スポットの計数結果は、この群のマウス肺部の黒色腫転移スポットの数が顕著に低下し、かつ２倍用量ＰＤ−１抗体単独投与群および２倍用量雑種エクソソーム単独投与群よりも顕著に低く、併用治療群の治療効果は最も高いことを示している。以上の結果は、雑種エクソソーム製剤とＰＤ−１抗体とを併用することにより、インサイチュの腫瘍の増殖および腫瘍の肺転移状況のいずれに対しても協働的な抑制効果を有し、その治療効果はいずれも２倍用量のＰＤ−１抗体またはエクソソーム単独投与群よりも高い。

分析したところ、相乗作用を発揮する原因は以下の通りである。単独雑種エクソソーム免疫群の腫瘍内部において、雑種エクソソームはＭ２型マクロファージの比率を低下させたが、Ｍ２型マクロファージを完全に除去することができず、残ったＭ２型マクロファージおよび腫瘍細胞はその表面のＰＤ−Ｌ１分子を介して腫瘍内に浸潤したＣＴＬ表面のＰＤ−１分子に結合し、ＣＴＬを疲憊させ、腫瘍を殺傷する能力を失うためである。これに対し、ＰＤ−１抗体との併用は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合を遮断することができ、両者は互いに協働し、ＣＴＬの疲憊を減少させることで、ＣＴＬはそれなりの腫瘍殺傷作用を発揮し、腫瘍抑制効果を向上させる。

Claims (12)

1. 抗原提示細胞が腫瘍細胞核を貪食して形成される雑種細胞であって、
   好ましくは、前記抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞である、雑種細胞。
2. 免疫調節剤処理され、
   前記免疫調節剤は、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡまたは非メチル化シチジル酸グアニル酸モチーフである、請求項１に記載の雑種細胞。
3. 請求項１に記載の雑種細胞が分泌するナノ小胞である、エクソソーム。
4. 腫瘍細胞の細胞核を抽出し、抗原提示細胞培養液に前記腫瘍細胞核を加え、インキュベートした後、この培養液の上清液を収集し、ディファレンシャル遠心分離し、エクソソームを収集するステップを含む、エクソソームの調製方法。
5. 前記抗原提示細胞は、腫瘍細胞核を貪食して雑種細胞を形成する、請求項４に記載の調製方法。
6. 前記抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞である、請求項４に記載の調製方法。
7. 抗原提示細胞培養液に免疫調節剤が添加されており、前記免疫調節剤は、リポ多糖、モノホスホリルリピドＡまたは非メチル化シチジル酸グアニル酸モチーフである、請求項４に記載の調製方法。
8. 請求項１から７のいずれか１項に記載の雑種細胞またはエクソソーム、および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物であって、
   前記医薬組成物は抗腫瘍ワクチンである、医薬組成物。
9. 抗腫瘍薬の調製における請求項１から８のいずれか１項に記載の雑種細胞またはエクソソームの使用であって、
   前記抗腫瘍薬は抗腫瘍ワクチンである、使用。
10. 請求項１から９のいずれか１項に記載のエクソソーム、モノクローナル抗体、および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物であって、
    前記モノク１ローナル抗体は、ＰＤ−１抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体またはＣＴＬＡ−４抗体である、医薬組成物。
11. 抗腫瘍薬、または腫瘍細胞もしくは腫瘍に対する細胞毒性細胞応答を誘導する医薬品の調製における請求項１から１０のいずれか１項に記載のエクソソームの使用。
12. 患者体内で腫瘍細胞または腫瘍に対する細胞毒性細胞応答を誘導する方法であって、
    前記患者に有効量の請求項１から１１のいずれか１項に記載の雑種細胞、エクソソームまたは医薬組成物を含む、方法。

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