ES2234928T3

ES2234928T3 - Generacion y uso de celulas dendriticas.

Info

Publication number: ES2234928T3
Application number: ES01994661T
Authority: ES
Inventors: Michel Goldman; Emmanuel Bartholome; Cristel Buelens; Fabienne Willems
Original assignee: Universite Libre de Bruxelles ULB
Current assignee: Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date: 2000-11-14
Filing date: 2001-11-14
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2021-11-14
Also published as: WO2002040646A1; EP1334177A1; DE60108661T2; ATE287945T1; DE60108661D1; AU2002224851A1; US20040037807A1; US7405076B2; EP1334177B1

Abstract

Un procedimiento in vitro para la diferenciación y maduración de monocitos en células dendríticas mieloides 5 IL3-R+ CD11c+, que comprende incubar dichos monocitos con una combinación de interferón de tipo I e IL-3.

Description

Generación y uso de células dendríticas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la mejora de la terapia celular para tratar o prevenir el cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes, en particular al desarrollo de nuevas células dendríticas que tienen características superiores para eliminar o prevenir la aparición de células invasivas.

Técnica anterior

Las células dendríticas (CD) son componentes clave en el inicio de respuestas inmunitarias. Este tipo de célula constituye la célula presentadora de antígeno más potente, dotada de una capacidad única para agrupar linfocitos T naive. Por consiguiente, se ha propuesto como un adyuvante natural, dirigido a desencadenar las respuestas de los linfocitos T contra inmunógenos pobres, tales como los Ag asociados a tumores (AAT). Durante mucho tiempo la realización de ensayos clínicos se ha visto dificultada por la baja frecuencia de las CD en la circulación disponibles en la sangre. Recientemente, el desarrollo de procedimientos para generar grandes cantidades de CD a partir de precursores hematopoyéticos, ha permitido el inicio de ensayos clínicos pioneros. Estos ensayos han dado resultados prometedores para la terapia del cáncer.

Las células dendríticas (CD) representan una clase principal de células presentadoras de antígeno caracterizadas por su capacidad única de inducir células T naive^{1}. Trabajos recientes demostraron la existencia de varios subconjuntos de CD que se diferencian por los progenitores de la médula ósea linfoides o mieloides^{2;3}. Un factor crítico para el desarrollo de las CD mieloides es el factor estimulador de colonia de granulocitos y macrófagos (GM-CSF)^{4;5}, mientras que las CD linfoides dependen de la interleuquina (IL)-3 para su superviciencia^{6;7}. Basándose en la expresión de marcadores mieloides (es decir, CD11c) o la expresión de la cadena \alpha (CD123) del receptor de IL-3\alpha (IL-3R\alpha), se han aislado dos tipos de precursores de CD de sangre periférica humana^{7}. Un subtipo presenta marcadores de superficie mieloide y niveles bajos de IL-3R\alpha, mientras que otro subtipo de origen linfoide putativo, expresa IL-3R\alpha, y depende en gran medida de la IL-3 para su supervivencia y es un gran productor de interferones de tipo I
(IFN).

Las CD mieloides humanas se pueden generar fácilmente in vitro mediante cultivo de monocitos en presencia de GM-CSF e IL-4^{4:5},mientras que las llamadas CD linfoides se han obtenido por aislamiento de precursores de la sangre o nódulos linfáticos^{6;7}.

Las CD GM-CSF/IL4 se han usado en ensayos clínicos en terapia celular^{44}. Sin embargo, usando estas condiciones, sólo el 67% de los pacientes inmunizados mostró un aumento de la respuesta al tratamiento. Por lo tanto, es importante mejorar el procedimiento, condiciones o sustancias para mejorar la eficacia del tratamiento.

Resumen de la invención

La presente invención se dirige a proporcionar un procedimiento para producir células dendríticas superiores, que se pueden usar en terapia celular para eliminar o prevenir más eficazmente los efectos perjudiciales de las células invasivas en pacientes. Los autores de la invención encontraron sorprendentemente, que cuando se incubaban monocitos en condiciones específicas en presencia de IL3 e IFN-\beta, se podía producir un tipo de CD superiores.

Los IFN de tipo I son producidos por varios tipos de células como respuesta a infecciones víricas, bacterianas y protozoarias^{8-13}. Mediante sus múltiples efectos en las células asesinas naturales y linfocitos T, los IFN de tipo I representan un enlace crítico entre la inmunidad innata y la adquirida^{14}. Estudios recientes indican que los IFN de tipo I también pueden influir en la diferenciación y maduración de CD^{15;16}. De hecho, se mostró que el IFN-\beta promovía la diferenciación de monocitos en CD de vida corta que sufrían apoptosis rápidamente^{16}. Los presentes autores de la invención investigaron si se podía parar la apoptosis usando IL-3. Para estudiar esto, los autores de la invención determinaron el efecto del IFN-\beta en la expresión de IL-3R\alpha en los monocitos y caracterizaron el fenotipo y la capacidad estimuladora de linfocitos T, de las células derivadas de monocitos cultivados en presencia de IL-3 e IFN-\beta. Sorprendentemente, los presentes autores de la invención encontraron que, de hecho, la IL-3 podía rescatar células tratadas con IFN-\beta. Además, estas células parecían superiores en la inducción del sistema inmunitario.

Un objetivo particular de la presente invención se dirige a un nuevo tipo de célula dendrítica (CD) estable, que es más madura y más potente en la activación del sistema inmunitario, comparada con otras CD estables conocidas. Los monocitos cultivados en IL3 e IFN-\beta se diferencian en células dendríticas con potentes actividades estimuladoras de linfocitos T. Esta invención deriva del descubrimiento original e inesperado de que el IFN-\beta mantiene la expresión de IL3R en los monocitos. La IL3 permite la supervivencia de CD que tienen vida corta cuando son generadas sólo en IFN-\beta y por lo tanto no son adecuadas para la terapia celular. Estas células inducen tanto respuestas de tipo TH1 (IFN-\gamma) como de tipo TH2 (IL-5), lo cual puede ser especialmente ventajoso en la inmunoterapia del cáncer. Estas células inducen directamente la apoptosis de ciertas células tumorales. Los presentes autores de la invención proponen usar esas células para inmunoterapia del cáncer y vacunación contra patógenos infecciosos mediante carga de las CD ex vivo con proteínas tumorales, péptidos, transferencia génica (ARN, ADN), fusión con células tumorales (híbridos), seguido de la inyección in vivo, o inyección de la célula directamente en el tumor donde podría inducir la liberación de antígenos tumorales a través de su actividad asesina.

Estos objetivos se han cumplido en las siguientes realizaciones.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para la diferenciación y maduración de monocitos en células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, que comprende incubar dichos monocitos con una combinación de interferón de tipo I y IL-3 (o IL3). También se pueden usar moléculas peptidomiméticas para este propósito. Los autores de la invención probaron que el IFN-\alpha ejerce un efecto similar al IFN-\beta, de modo que la combinación IL-3+IFN-\alpha también daba como resultado la generación de una CD IL-3R\alpha mieloide positiva comparable (fig. 5). Cuando los monocitos se cultivaron en IL-3 sola, los autores de la invención encontraron que expresaban niveles menores de CD80 y CD86 y niveles mayores de CD14 que las CD IL-3/IFN-\beta (fig. 4), lo cual sugiere que están más cerca de los macrófagos.

El tipo de célula CD IL-3/IFN-\beta (o CD IFN-\beta/IL-3) que resulta de este procedimiento, es nuevo y difiere significativamente de las CD IL-4/GM-CSF obtenidas previamente. Los monocitos purificados de CMSP (células mononucleares de sangre periférica), que son las células precursoras de la CD, expresan IL-3R\alpha (CD123), pero pierden esta expresión después de cultivo en medio solo. Los presentes resultados muestran que se evitaba la pérdida de la expresión de IL-3R\alpha cuando se añadía IFN-\beta durante el cultivo. Sin embargo, se encontró que más del 90% de los monocitos cultivados en el medio solo o en presencia de IFN-\beta sufrían apoptosis. Sorprendentemente, los autores de la invención encontraron que la adición de IL-3 en presencia de IFN-\beta potenciaba notablemente la supervivencia celular. De hecho, más del 65% de las células todavía estaban vivas usando estas condiciones de cultivo. Sorprendentemente, los presentes autores de la invención encontraron que la IL-3 rescata de la apoptosis a los monocitos cultivados en presencia de IFN-\beta, y les permite la diferenciación adicional. Estas observaciones demuestran un efecto de cooperación de la IL-3 y el IFN-\beta en la supervivencia y diferenciación celular. Este efecto de los IFN de tipo I en la expresión de IL-3R\alpha no se había evaluado hasta ahora.

Para caracterizar las células obtenidas por cultivo de monocitos en IL-3 y IFN-\beta, los presentes autores de la invención primero miraron su morfología ultraestructural y encontraron que los monocitos cultivados en estas condiciones, adquirían expansiones citoplasmáticas de tipo dendrítico. Por lo tanto, las células derivadas de monocitos cultivados en IL-3 y IFN-\beta se pueden denominar en lo sucesivo CD IL-3/IFN-\beta o CD IFN-\beta/IL-3.

Los presentes autores de la invención caracterizaron además que las CD IL-3/IFN-\beta expresaban marcadores de linaje mieloide (CD11c, CD14, y CD33). También expresaban niveles altos de moléculas HLA de clase I y clase II, CD40, CD54, CD80 y CD86, e IL-3R\alpha (CD123). Al contrario que las CD IL-4/GM-CSF, las CD IL-3/IFN-\beta mostraron niveles mucho mayores de IL-3R\alpha. Al contrario, CD1a era expresado en CD IL-4/GM-CSF, pero no en células derivadas de monocitos cultivados en IL-3 e IFN-\beta. Por lo tanto, los presentes resultados indican que las CD IL-3/IFN-\beta también son mieloides pero fenotípicamente completamente diferentes comparado con las CD IL-4/GM-CSF conocidas. Basándose en sus marcadores las CD IL-3/IFN-\beta también se pueden denominar células dendríticas (CD) IL3-R+ CD11c+ o células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+.

Ventajosamente, la IL-3 y el IFN-\beta se pueden añadir a los monocitos simultáneamente, secuencialmente o por separado.

De acuerdo con la invención, el IFN-\beta está presente con una concentración entre 10 y 20000 U/ml.

Los presentes resultados demuestran que se evitaba la pérdida de la expresión de IL-3R\alpha añadiendo 1000 U/ml de IFN-\beta al medio de cultivo. Sin embargo también son posibles concentraciones de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 3950, 4000, 4100, 4150, 4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800, 4850, 4900, 4950, 5000, 5100, 5150, 5200, 5250, 5300, 5350, 5400, 5450, 5500, 5550, 5600, 5650, 5700, 5750, 5800, 5850, 5900, 5950, 6000, 6100, 6150, 6200, 6250, 6300, 6350, 6400, 6450, 6500, 6550, 6600, 6650, 6700, 6750, 6800, 6850, 6900, 6950, 7000, 7100, 7150, 7200, 7250, 7300, 7350, 7400, 7450, 7500, 7550, 7600, 7650, 7700, 7750, 7800, 7850, 7900, 7950, 8000, 8100, 8150, 8200, 8250, 8300, 8350, 8400, 8450, 8500, 8550, 8600, 8650, 8700, 8750, 8800, 8850, 8900, 8950, 9000, 9100, 9150, 9200, 9250, 9300, 9350, 9400, 9450, 9500, 9550, 9600, 9650, 9700, 9750, 9800, 9850, 9900, 9950, 10000, 10050, 10100, 10150, 10200, 10250, 10300, 10350, 10400, 10450, 10500, 10550, 10600, 10650, 10700, 10750, 10800, 10850, 10900, 10950, 11000, 11050, 11100, 11150, 11200, 11250, 11300, 11350, 11400, 11450, 11500, 11550, 11600, 11650, 11700, 11750, 11800, 11850, 11900, 11950, 12000, 12050, 12100, 12150, 12200, 12250, 12300, 12350, 12400, 12450, 12500, 12550, 12600, 12650, 12700, 12750, 12800, 12850, 12900, 12950, 13000, 13050, 13100, 13150, 13200, 13250, 13300, 13350, 13400, 13450, 13500, 13550, 13600, 13650, 13700, 13750, 13800, 13850, 13900, 13950, 14000, 14100, 14150, 14200, 14250, 14300, 14350, 14400, 14450, 14500, 14550, 14600, 14650, 14700, 14750, 14800, 14850, 14900, 14950, 15000, 15050, 15100, 15150, 15200, 15250, 15300, 15350, 15400, 15450, 15500, 15550, 15600, 15650, 15700, 15750, 15800, 15850, 15900, 15950, 16000, 16050, 16100, 16150, 16200, 16250, 16300, 16350, 16400, 16450, 16500, 16550, 16600, 16650, 16700, 16750, 16800, 16850, 16900, 16950, 17000, 17100, 17150, 17200, 17250, 17300, 17350, 17400, 17450, 17500, 17550, 17600, 17650, 17700, 17750, 17800, 17850, 17900, 17950, 18000, 18050, 18100, 18150, 18200, 18250, 18300, 18350, 18400, 18450, 18500, 18550, 18600, 18650, 18700, 18750, 18800, 18850, 18900, 18950, 19000, 19050, 19100, 19150, 19200, 19250, 19300, 19350, 19400, 19450, 19500, 19550, 19600, 19650, 19700, 19750, 19800, 19850, 19900, 19950 y 20000 U/ml.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el IFN-\beta se da con una concentración de 1000 U/ml.

De acuerdo con la invención, la IL-3 está presente en una concentración entre 1 y 1000 U/ml. En relación con esto, son posibles concentraciones de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30,35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 y 1000 U/ml.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la IL-3 está presente con una concentración de 50 U/ml.

De acuerdo con la presente invención, el procedimiento in vitro para obtener una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ comprende la incubación de: monocitos aislados de un paciente, en presencia de interferón de tipo I e IL-3.

Hay dos fuentes principales de precursores de CD: las células madre CD34+ y monocitos de sangre periférica (SP). La mayor restricción de la generación de CD a partir de células madre, es que el tiempo de cultivo es largo, y la obtención de células CD34+ requiere la movilización del paciente. Por lo tanto, una realización preferida de la presente invención, es usar monocitos como un precursor de CD. Normalmente, estas células, cuando están presentes en la sangre, se diferencian en CD en presencia de GM-CSF, o como han mostrado los presentes autores de la invención, en presencia de IL-3/IFN-\beta. Se pueden usar diferentes técnicas para aislar monocitos de la sangre como conocen los expertos en la técnica. Un procedimiento preferido es como se describe en el ejemplo 1. Con el término "población" se entiende células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ como tales, un grupo de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ que pueden ser diferentes en otras características, o un grupo de células que comprenden células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+. Además, una célula, no está excluida de esta definición. Es importante mencionar que los autores de la invención no excluyen el hecho de que además los monocitos se pueden diferenciar y pueden madurar in vivo, por inyección de IL-3 y IFN-\beta como tales, en un paciente.

De acuerdo con la presente invención, las células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ se pueden tratar además para producir células dendríticas presentadoras de antígeno. Por consiguiente, el procedimiento in vitro, como se describe en la presente invención, comprende al menos las siguiente etapas:

(a) incubar monocitos aislados de un paciente, en presencia de IFN-\beta e IL-3 que producen una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, y

(b) presentar un antígeno en la superficie de dichas células dendríticas.

Dependiendo del tratamiento específico como se describe a continuación, los antígenos son moléculas específicas presentes en las células, seleccionadas del grupo que consiste en una célula cancerosa, una bacteria, una célula infectada por parásito y una célula infectada por virus. Estos antígenos pueden ser moléculas grandes que son procesadas por las CD para cargar moléculas MHC, o pueden ser moléculas más pequeñas (péptidos) que son cargadas inmediatamente en las moléculas MHC. Se han usado varios enfoques para armar la CD con un antígeno diana para usar en ensayos clínicos. Los procedimientos usados para enfocar esta etapa de carga del antígeno son revisados por Fong y Engleman^{44}. Los autores de la invención también señalan, que las células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ se puede producir in vivo, inyectando en un paciente IL-3 e IFN-\beta o IL-3 e IFN-\beta combinados con un antígeno. De acuerdo con la invención, la capacidad de presentación de un péptido en la superficie de dichas células dendríticas de acuerdo, se puede lograr por ejemplo, poniendo en contacto dicha célula dendrítica con al menos parte del antígeno expresado de forma diferencial en la célula. Esta célula puede ser una célula seleccionada del grupo que consiste en una célula de cáncer, una célula bacteriana, una célula infectada por parásito y una célula infectada por virus. Los antígenos son liberados de esta CD dando como resultado la activación de las CD.

Alternativamente, la capacidad de presentación de un péptido en la superficie de dichas células dendríticas, se puede lograr tratando con pulsos dichas células dendríticas con proteínas antígenas, cargando dichas células dendríticas con péptidos antígenos, o se puede lograr por transformación/transducción de dichas células dendríticas por moléculas de ácido nucleico que codifican al menos para parte de dicho antígeno. Con "tratamiento con pulsos" se entiende que las CD son activadas por estos antígenos y entran en las rutas de procesamiento del MHC de clase II y/o MHC de clase I. La transformación de las CD se puede lograr usando pulsos eléctricos, liposomas u otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Los vectores víricos permiten la transducción de células. Por vectores víricos también se entiende vectores retrovíricos, adenovíricos y adenoasociados.

La transformación/transducción de las células permite introducir el ADN que codifica el antígeno, y cuando están presentes las señales de expresión adecuadas, se forma dicho antígeno en la célula y mediante los mecanismos endógenos es transportado a la superficie de la célula dendrítica tranformada/transducida. Como resultado de esto, se preparan células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno.

Alternativamente, la capacidad de presentación de un péptido en la superficie de dichas células dendríticas se logra mediante fusión de dichas células dendríticas con células que llevan antígenos específicos. La producción de híbridos e hibridomas de célula de tipo dendrítico/célula tumoral para inducir respuesta antitumoral, ha sido descrita en el documento WO 96/30030. Este documento proporciona hibridomas de célula de tipo dendrítico/célula tumoral y pluralidades de híbridos de célula de tipo dendrítico/célula tumoral, que confieren resistencia al tumor in vivo. Estos híbridos e hibridomas son generados por la fusión de células tumorales con células de tipo dendrítico. Por ejemplo, se pueden fusionar células tumorales inmortales de una línea celular tumoral autóloga con células de tipo dendrítico alogénicas emparejadas con HLA autólogas. Las líneas de células tumorales autólogas se pueden obtener de tumores primarios y de sus metástasis. Alternativamente, se pueden fusionar células de tipo dendrítico inmortales de una línea celular de tipo dendrítico emparejada con HLA alogénica o autóloga con células tumorales autólogas. Las líneas celulares de tipo dendrítico autólogas, se pueden preparar a partir de diferentes fuentes tales como sangre periférica y médula ósea. Los hibridomas y la pluralidad de híbridos de célula de tipo dendrítico/célula tumoral, se pueden infundir directamente para la inmunización activa de pacientes con cáncer contra sus células tumorales residuales. Los hibridomas e híbridos también se pueden usar para la activación in vitro de células inmunitarias autólogas antes de su reinfusión en el paciente para la inmunización pasiva contra las células tumorales.

La presente invención también propone un procedimiento in vitro para proporcionar una población activada de linfocitos T usando células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, que se pueden obtener por un procedimiento como se ha descrito antes, que comprende al menos las etapas de:

(a) incubar monocitos aislados de un paciente, en presencia de IFN-\beta e IL-3, para proporcionar una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+,

(b) presentar un antígeno (por ejemplo péptido o proteína) en la superficie de dichas células dendríticas, proporcionando así una población de células dendríticas presentadoras de antígeno; y,

(c) activar una población de linfocitos T con dicha población de células dendríticas presentadoras de antígeno.

Un linfocito T activado es un linfocito T que prolifera (célula CD3+) y/o que segrega citoquinas (IL-2, IL-4, IL-5, IFN-\gamma, etc.) y/o que expresa marcadores de activación (CD25, CD69, HLA-DR, CD40L, etc.). De hecho, los presentes autores de la invención indicaron que los niveles bajos de IL-12 segregados por las CD IL-3/IFN-\beta contribuyen a su capacidad para provocar la producción de IFN-\gamma por los linfocitos T. Además, los autores de la invención probaron que, las CD IL-3/IFN-\beta también inducían la producción de IL-5 en cultivo de leucocitos mixtos, y también eran mucho más eficaces que las CD IL-4/GM-CSF en este respecto. Si es necesario, un linfocito T activado siempre se puede separar de la célula dendrítica presentadora de antígeno mediante separación de células.

En procedimientos preferidos de acuerdo con la invención, dicho linfocito T es un linfocito T colaborador.

La presente invención también proporciona una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, o una población de linfocitos T activados, que pueden inducir respuestas tanto de tipo TH1 (IFN-\beta) como de tipo TH2 (IL-5), que se pueden obtener por un procedimiento in vitro como se ha descrito antes, o una de sus combinaciones.

Los presentes autores de la invención mostraron que, aunque las CD IL-3/IFN-\beta presentan varias características que sugieren un mayor grado de maduración, no se deben considerar completamente maduras. De hecho, los autores de la invención, probaron que las células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ de acuerdo con la presente invención, se pueden estimular más, usando un estimulador. La presente invención también se refiere a un procedimiento para estimular más a una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, por el cual dichas células dendríticas son incubadas adicionalmente con dicho estimulador. Esta incubación se puede llevar a cabo simultáneamente, secuencialmente o por separado del tratamiento con citoquina. Por estimulación también se entiende maduración, inducción y/o activación. De acuerdo con la presente invención, dicho estimulador se puede elegir de un grupo que comprende virus, bacterias, LPS (lipopolisacáridos), ácido nucleico, derivados funcionales o una de sus combinaciones. La expresión "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ácido nucleico monocatenario o bicatenario, pudiendo consistir dicho ácido nucleico en desoxirribonucleótidos (ADN) o ribonucleótidos (ARN), o puede ser ADNc amplificado o ADN genómico amplificado. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ estimuladas, que se pueden obtener por un procedimiento de acuerdo con la presente invención. En los ejemplos, los autores de la invención mostraron que cuando se analiza la producción de IFN-\alpha por las CD IL-3/IFN-\beta, la estimulación tal como por LPS y virus influenza inactivado con formaldehído, inducía dichas CD sólo en un grado menor (tabla 2). Al contrario, el Poli(I:C), que mimetiza el RNA bicatenario vírico, podía inducir la producción de IFN-\alpha por las CD IL-3/IFN-\beta en mayor grado. Hay que entender que todas las aplicaciones (tales como procedimientos, composiciones, kits, usos) sugeridos en la presente invención para las CD IL-3/IFN-\beta no estimuladas, se pueden aplicar a CD IL-3/IFN-\beta estimuladas.

La presente invención se refiere a una composición para usar como medicamento o producto basado en células dirigido al uso clínico, que comprende al menos una de las siguientes combinaciones de componentes:

- IL-3 e interferón de tipo I

- IL-3 e interferón de tipo I mezclado con antígeno y/o estimulador, que puede inducir la producción de IFN-\alpha en células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+

- una población de monocitos mezclada con IL-3 e IFN-\beta o sus análogos funcionales

- una población de monocitos mezclada con IL-3, interferón de tipo I y antígeno y/o estimulante, que puede inducir la producción de IFN-\alpha en células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+

- una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+

- una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ mezclada con antígeno y/o estimulador, que puede inducir la producción de IFN-\alpha en células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+

- una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, o,

- una población de linfocitos T activados que inducen tanto respuestas de tipo TH1 (IFN-\beta) como de tipo TH2 (IL-5), que se puede obtener usando células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno,

en la que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden obtener de acuerdo con un procedimiento de la presente invención, o en la que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un procedimiento de acuerdo con la presente invención, o una de sus combinacio-
nes.

Los productos basados en células todavía no se consideran medicamentos, y en el futuro se podrían considerar productos de transfusión.

De acuerdo con la presente invención, el interferón de tipo I se puede elegir del grupo que consiste en IFN-\beta, IFN-\alpha o sus moléculas peptidomiméticas.

Los presentes resultados también mostraron que las CD IL-3/IFN-\beta tienen capacidad de endocitosis. Las CD IL-3/IFN-\beta segregan espontáneamente IL-6, IL-8, IL-12 (p40) y TNF\alpha.

Los autores de la invención también estudiaron la producción de citoquinas de las CD IL-4/GM-CSF frente a las CD IL-3/IFN-\beta. Comparado con las CD GM-CSF/IL-4, las IL-3/IFN-\beta producían menos IL-12 (p40), mientras que su secreción de IL-8 era ligeramente mayor. Como ocurre con las CD GM-CSF/IL-4, la unión tanto de LPS como de CD40 inducida por transfectantes CD40L regulaba positivamente la síntesis de citoquinas por las CD IL-3/IFN-\beta. Comparado con las CD GM-CSF/IL-4, las CD IL-3/IFN-\beta producían niveles similares de TNF\alpha e IL-6 en ambas condiciones de estimulación, mayores niveles de IL-8 como respuesta a CD40L pero no a LPS, y niveles mucho menores de IL-12 (p40) e IL-12 (p70) cualquiera que fuera el estímulo considerado.

Con todas las proporciones de estimulador/respondedor, la CD IL-3/IFN-\beta eran tan eficaces como las CD GM-CSF/IL-4 para inducir la proliferación de linfocitos T CD4+ naive. Sin embargo, si los autores de la invención consideraban el perfil de las citoquinas segregadas por los linfocitos T tras exposición a CD alogénicas, las CD IL-3/IFN-\beta inducían la producción de cantidades sustanciales de IFN-\gamma, a pesar de su baja síntesis de IL-12. Además, las CD IL-3/IFN-\beta provocaban la producción de IL-5 y a este respecto eran significativamente más eficaces que las CD IL-4/GM-CSF.

A pesar de su bajo nivel de producción de IL-12, las CD IL-3/IFN-\beta estimulan altos niveles de producción de IFN-\gamma a partir de linfocitos T CD4+ de adultos, sugiriendo que usan otros factores o moléculas de membrana para provocar la síntesis de citoquinas Th1. De hecho, recientemente se han descrito las rutas independientes de IL-12 del IFN-\gamma^{13;14;28;29}. Considerados juntos, los datos indican que las CD IL-3/IFN-\beta difieren de las células plasmacitoides CD4^{+} CD3^{-} CD11c^{-} IL-3R\alpha^{+} aisladas de sangre periférica, descrita por Grouard y col.^{6}, ya que se mostró que estas últimas células eran malos inductores de IFN-\gamma en MLR.

Los presentes autores de la invención concluyen que tras usar los procedimientos antes descritos, se pueden formar nuevos tipos de CD que son más maduras que las CD mieloides previamente descritas, y que tienen un carácter superior en la inducción de la expresión de linfocitos T. El aumento de la expresión de citoquinas da como resultado una estimulación más rápida y eficaz del sistema inmunitario, y por lo tanto, será más eficaz para eliminar material infeccioso extraño en un paciente.

Las CD derivadas de monocitos inducidas con antígenos tumorales, ahora se usan clínicamente en varios protocolos para inducir inmunidad antitumoral específica^{30-32}. Se ha mostrado que los mecanismos efectores tanto Th1 como Th2 colaboran entre sí para dirigir una actividad antitumoral eficaz^{33}. Debido a su capacidad para inducir respuestas tanto de tipo Th1 como Th2, los autores de la invención sugieren que las CD IL-3/IFN-\beta (inducidas o no inducidas) deben ser adecuadas para inducir una eficaz inmunidad tumoral.

Preferiblemente, una composición o un producto basado en células de acuerdo con la invención, se complementa con al menos una citoquina adicional. De acuerdo con la presente invención, dicha citoquina se elige preferiblemente de un grupo que comprende IFN-\alpha, IFN-\beta, IL-3 e IL-12. La IL-12 y el IFN-\alpha son citoquinas fundamentales para la diferenciación de Th1 y generación de linfocitos T citotóxicos dotados de potentes efectos antitumorales.

La invención implica la preparación de un medicamento para tratar el cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes, que comprende una composición o un producto basado en células como se ha descrito antes. Las investigaciones mostraron que los efectos inmunológicos y clínicos de las células dendríticas cargadas con antígeno administradas como una vacuna terapéutica a pacientes con cáncer^{44}. Aunque los procedimientos de vacunación basados en CD son incómodos, los resultados prometedores de los ensayos clínicos en pacientes con linfoma maligno, melanoma y cáncer de próstata, sugieren que las estrategias inmunoterapéuticas que se aprovechan de las propiedades presentadoras de antígeno de las células dendríticas, finalmente pueden ser tanto eficaces como ampliamente aplicables a tumores humanos. También está bien establecido el papel de las CD en el inicio o inducción de respuestas inmunes frente a antígenos víricos y bacteriano in vivo. Se ha demostrado que las CD humanas, pero no los monocitos o células B, pueden sensibilizar linfocitos T naive a los antígenos proteicos solubles, permitiendo la generación de líneas LCT CD4+ colaboradoras y CD8+ in vitro^{44}. Se ha demostrado que los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+ reconocen y matan células cancerosas en diferentes modelos de tumor. Se ha demostrado en diferentes modelos animales la capacidad de las CD para inducir linfocitos T capaces de reconocer y matar células tumorales de una forma específica del antígeno. Además, la inmunización basada en CD puede conducir a memoria inmunológica con protección frente a posteriores desafíos de tumores. Fong y col. (1997^{45}) ilustraron que la inmunización con proteínas propias podía proteger a los animales frente a reacciones autoinmunes.

La presente invención también se refiere a la composición farmacológica que comprende la composición o un producto basado en células de acuerdo con la invención, y opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier vehículo que no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados típicamente son macromoléculas grandes que metabolizan lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácido; y partículas víricas inactivas. Dichos vehículos son conocidos por los expertos en la técnica. Una "vacuna" es una composición inmunógena capaz de provocar protección contra infecciones, sea parcial o completa. Una vacuna también puede ser útil para tratar a un individuo, en cuyo caso se llama una vacuna terapéutica. Dichas composiciones de vacuna pueden incluir composiciones de vacuna profilácticas así como terapéuticas. El término "terapéutico" se refiere a la capacidad de eliminar o prevenir células invasivas.

La presente invención también se refiere al uso de una población o una composición de acuerdo con la presente invención, para preparar un medicamento para matar una célula diana.

Preferiblemente, dicha célula diana se selecciona del grupo que consiste en una célula cancerosa, una célula bacteriana, una célula infectada por parásito o una célula infectada por virus.

La presente invención también proporciona un procedimiento de cribado in vitro, que usa una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ estimuladas, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno estimuladas o una población de linfocitos T activados, que inducen respuestas tanto de tipo TH1 (IFN-\beta) como de tipo TH2 (DL-5), que se pueden obtener por un procedimiento como se describe en la presente invención.

Por sus potentes propiedades inmunoestimuldoras, las CD cargadas con Ag tumoral o bacteriano se pueden usar para activar linfocitos T contra Agv poco inmunógenos desconocidos, y así ayudar a descubrirlos.

De acuerdo con la presente invención, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ estimuladas, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno estimuladas o una población de linfocitos T activados que inducen respuestas tanto de tipo TH1 (IFN-\beta) como de tipo TH2 (IL-5), que usan células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígenos que se pueden obtener por un procedimiento de acuerdo con la invención, se pueden usar para preparar ensayos de cribado in vitro.

De acuerdo con la presente invención, un procedimiento in vitro para detectar la actividad mediada por linfocitos T de un péptido antigénico diana, comprende al menos, las siguientes etapas:

(a) poner en contacto un linfocito T aislado de un paciente, con una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, proporcionando así un linfocito T activado,

(b) poner en contacto una célula diana con dicho linfocito T activado, y

(c) controlar el efecto de dicho linfocito T en dicha célula diana, detectando así la actividad antidiana,

en el que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden obtener de acuerdo con un procedimiento de la presente invención, o en el que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un procedimiento de acuerdo con la presente invención, o una de sus combinaciones.

La presente invención también describe un kit para detectar la actividad mediada por linfocitos T de un péptido antigénico diana, que comprende al menos una combinación de componentes elegidos de la siguiente lista:

- IL-3 e interferón de tipo I

- una población de monocitos mezclada con IL-3 e interferón de tipo I

- una población de monocitos mezclada con IL-3, interferón de tipo I y antígeno y/o estimulador, que puede inducir la producción de IFN-\alpha en células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+

- una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+

en el que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden obtener de acuerdo con un procedimiento de la presente invención, o en el que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un procedimiento de acuerdo con la presente invención, o una de sus combinaciones. Se ha mostrado que la congelación de la población de dichas células no altera las propiedades funcionales de dichas células. También se pueden usar otros procedimientos de almacenamiento conocidos por los expertos en la técnica para conservar estas células^{46}.

De acuerdo con la presente invención, en el kit de la presente invención, dicho interferón de tipo I se puede elegir del grupo que consiste en IFN-\beta, IFN-\alpha o sus moléculas peptidomiméticas.

Todos los procedimientos, usos y kits descritos en la presente invención para detectar la actividad mediada por linfocitos T, también se refieren al uso de una población de CD IL-3/IFN-\beta como reactivo, con el propósito de seguir la respuesta inmune in vitro en pacientes que recibieron vacunas de CD u otras vacunas. Se pueden aislar y ensayar linfocitos T de pacientes usando CD IL-3/IFN-\beta presentadoras de antígeno, para analizar si se ha activado la respuesta inmunológica en los pacientes. Para este propósito, se pueden usar CMSP (células mononucleares de sangre periférica) o linfocitos T purificados. Este sistema de ensayo permite evaluar cualquier terapia contra infecciones, cáncer o enfermedades autoinmunes.

La presente invención sugiere el uso de una composición de acuerdo con la invención, como un adyuvante de vacuna para preparar un medicamento y el adyuvante de vacuna como tal, que comprende una composición de acuerdo con la invención.

De acuerdo con la presente invención, una vacuna que comprende la composición como se ha descrito en la invención, se puede usar para producir un medicamento para inmunizar seres humanos o animales frente a diferentes enfermedades. La vacunación de pacientes ya se ha ilustrado y se ha encontrado que es eficaz usando CD IL-4/GM-CSF tratadas con pulsos con péptido, en pacientes con cáncer (Toungouz y col. 1999^{46}).

En particular, la presente invención describe el uso del adyuvante de vacuna de la presente invención para preparar un medicamento para inmunizar seres humanos o animales contra una enfermedad.

La presente invención también se refiere al uso de al menos una de las siguientes combinaciones de componentes, para preparar un medicamento para tratar el cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes,

- IL-3 e interferón de tipo I

- una población de monocitos mezclada con IL-3 e interferón de tipo I

- una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+

en el que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden obtener de acuerdo con un procedimiento de la presente invención, o en el que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un procedimiento de acuerdo con la presente invención, o una de sus combinaciones. En el diseño y cuando se llevan a cabo las aplicaciones antes descritas, las consideraciones importantes incluyen procedimientos para introducir el antígeno en las rutas de procesamiento de MHC de clase I y clase II, procedimientos para aislar y activar células dendríticas, la ruta de administración y selección del antígeno. Debido a que la terapia celular, tal como se presenta en la presente invención, necesita un reconocimiento específico de la célula diana, de hecho es importante que se estudie bien la elección del antígeno. Por lo tanto, la presente invención sugiere que el antígeno es un antígeno específico de tumor, un antígeno específico infeccioso o una proteína, cuando se aplica en el tratamiento del cáncer, infecciones (víricas, bacterianas, parasitarias) o enfermedades autoinmunes. Además, es importante que las composiciones se administren a una persona que necesite tratamiento en una cantidad terapéuticamente eficaz. Ejemplos de antígenos que se pueden considerar antígenos tumorales son los descritos por Fong y Engleman 2000^{44}.

De acuerdo con la presente invención, dicha enfermedad vírica se selecciona del grupo que consiste, por ejemplo, en VIH, virus del papiloma humano, virus Ebstein-Barr y citomegalovirus.

De acuerdo con la presente invención, dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, miastenia grave, artritis crónica juvenil, artritis crónica, LED, dermatitis atópica y diabetes juvenil. Los autores de la invención sugieren que probablemente todas las enfermedades autoinmunes se pueden tratar o prevenir por un procedimiento como se describe en la invención.

De acuerdo con la presente invención, dichas composiciones se pueden inyectar en pacientes usando diferentes rutas. Preferiblemente la inyección se lleva a cabo por vía intravenosa, intralinfoide o intratumoral, sin embargo, se pueden usar otras rutas tales como inyecciones subcutáneas. Es interesante mencionar que además de expresar las moléculas MHC y coestimuladoras para inducir linfocitos T, las células CD expresan moléculas de adhesión y receptores de quimioquina adecuados, para atraer a las CD a los órganos linfoides secundarios para la inducción. En relación con esto, se puede evitar la inducción ineficaz inyectando CD directamente a los órganos linfoides secundarios mediante inyección intralinfática o intranodal. El presente estudio prueba que, especialmente en el tratamiento del cáncer, las inyecciones intratumorales darán como resultado la eliminación más eficaz del tumor. La observación de que las CD IL-3/IFN-\beta derivadas de monocitos son capaces de desencadenar la apoptosis en células tumorales, es importante para su uso terapéutico como vacunas antitumorales. De hecho, recientes informes demuestran que las CD IL-4/GM-CSF humanas pueden procesar células apoptóticas y presentar cruzados los antígenos derivados de una forma restringida para MHC de clase I, dando como resultado la inducción de respuestas eficaces de los linfocitos T citotóxicos. Por lo tanto las CD que se inyectan directamente en los tumores, primero inducirán la apoptosis de células cancerosas, y finalmente migrarán a los nodos linfáticos donde inducen las respuestas de los linfocitos T específicas del tumor.

Estas composiciones se pueden administrar, por ejemplo, por vía parenteral o intravenosa. Las composiciones de acuerdo con la invención para administración parenteral pueden ser, en particular, soluciones estériles, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas. Como una solución o vehículo farmacéuticamente aceptable, se puede usar propilenglicol, polietilenglicol, ésteres orgánicos inyectables, por ejemplo oleato de etilo, o ciclodextrinas. Estas composiciones también pueden comprender agentes humectantes, emulsionantes y/o de dispersión.

La esterilización se puede llevar a cabo de varias formas, por ejemplo, usando filtro bacteriológico, incorporando agentes de esterilización en la composición, o por irradiación. También se pueden preparar en forma de composiciones sólidas estériles, que se pueden disolver en el momento de uso en agua estéril o en cualquier otro medio inyectable estéril.

La presente invención también puede comprender adyuvantes que son conocidos para un experto en la técnica (vitamina C, agentes antioxidantes, etc.), que se pueden usar de forma sinérgica con los compuestos de acuerdo con la invención, con el fin de mejorar y prolongar los tratamientos de los tumores cancerosos.

La invención también se refiere a una composición que comprende una composición de acuerdo con la presente invención, y otro compuesto como una preparación combinada para el uso simultáneo, separado o secuencial, para tratar el cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes.

La presente invención también se refiere a un procedimiento in vitro para preparar una composición como se describe en la presente invención, que comprende las siguientes etapas:

(a) incubar dichos monocitos aislados de un paciente, en un sistema cerrado en presencia de IFN-\beta e IL-3 de grado clínico, para proporcionar una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+,

(b) presentar un antígeno en la superficie de dichas células dendríticas en estados de grado clínico, proporcionando así una población de células dendríticas presentadoras de antígeno; y,

(c) activar una población de linfocitos T con dicha población de células dendríticas presentadoras de antígeno, en la que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas, y se pueden obtener de acuerdo con un procedimiento de la presente invención, o en el que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un procedimiento de acuerdo con la invención, o una de sus combinaciones.

Recientemente, se ha mejorado la producción de CD en estados de grado clínico. Los presentes autores de la invención describieron, en Toungouz y col. 1999^{46}, que es necesario el desarrollo de sistemas cerrados, evitar proteínas exógenas y respetar los procedimientos operativos estándar (POE) para poder garantizar especificaciones predefinidas del producto celular. En estos documentos se describe un procedimiento simplificado de las buenas prácticas de fabricación (BPF) de la generación de CD IL-4/GM-CSF a partir de productos de leucoferesis en un sistema cerrado, usando medios de cultivo sintéticos desprovistos de proteínas no humanas. Análogamente a este procedimiento, se pueden preparar CD IL-3/IFN-\beta de grado clínico.

Salvo que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención, tienen los mismos significados que entienden normalmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. A continuación se describen procedimientos de ejemplo y materiales, aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta invención, en la práctica o ensayo de la presente invención. Todas las publicaciones y otras referencias mencionadas en esta invención se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, restringirá la presente especificación, incluyendo las definiciones. Los materiales, procedimientos, y ejemplos sólo son ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los siguientes dibujos, tablas, descripción detallada, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras y tablas

Figura 1

El IFN-\beta evita la regulación negativa de IL-3R\alpha en monocitos cultivados

Se analizó en monocitos incubados en medio solo o con IFN-\beta (1000 U/ml) por citometría de flujo, la expresión de IL-3R\alpha (CD123). Línea gruesa: perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos anti-CD123 conjugados con PE. Líneas de puntos: perfiles FACS después de tinción con IgG1 testigo de isotipo correspondiente. Datos de un experimento representativo de 3 en diferentes donantes de sangre.

Figura 2

El IFN-\beta coopera con la IL-3 para promover la supervivencia de los monocitos

Se cultivaron monocitos en medio sólo (\circ), o en presencia de IL-3 50 U/ml (\triangledown), o IFN-\beta 1000 U/ml (\bullet), o una combinación de IFN-\beta 1000 U/ml e IL-3 50 U/ml (\blacktriangledown). Se cuantificaron las células apoptóticas por citometría de flujo después de teñir para la anexina V y el yoduro de propidio (PI). Los resultados se expresaron como la media \pm ETM de los porcentajes de células negativas para la expresión tanto de anexina V como de PI.

Figura 3

Ultraestructura de células derivadas de monocitos cultivados en presencia de IFN-\beta e IL-3

La microscopía de transmisión electrónica de monocitos después de cultivo durante 6 días con GM-CSF e IL-4 o IL-3 e IFN-\beta (aumento inicial A; x900, B; x1950). Tanto las CD IL-3/IFN-\beta como las CD GM-CSF/IL-4, mostraron el aspecto típico de células dendríticas que incluían un núcleo lobulado, procesos citoplasmáticos largos y sistema tubulovesicular. En presencia de IL-3 e IFN-\beta, las células dendríticas aparecían como células más pequeñas llenas de mitocondrias.

Figura 4

Expresión de marcadores de superficie en células derivadas de monocitos cultivados en IL-3 e IFN-\beta

(A) Fenotipo de monocitos purificados, cultivados durante 6 días con GM-CSF e IL-4 o IL-3 e IFN-\beta. Línea gruesa: perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos específicos. Líneas de puntos: perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos testigo de isotipo correspondiente. Datos de un experimento representativo de 6 en diferentes donantes.

(B) Fenotipo de monocitos purificados, cultivados con GM-CSF e IL-4 o IL-3 e IFN-\beta. Línea gruesa: perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos específicos. Líneas de puntos: perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos testigo de isotipo correspondiente. Datos de un experimento representativo de 6 en diferentes donantes.

Figura 5

Expresión de marcadores de superficie en células derivadas de monocitos cultivados en IL-3 e IFN-\alpha

Fenotipo de monocitos cultivados con IL-3 e IFN-\beta o con IL-3 e IFN-\alpha. Líneas gruesas: perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos específicos. Líneas finas: perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos testigo de isotipo correspondiente.

Figura 6

Internalización de FITC-dextrano en CD IL-3/IFN-\beta

Se incubaron CD hechas crecer en GM-CSF e IL-4 o IL-3 e IFN-\beta, en medio que contenía FITC-dextrano 1 mg/ml durante los tiempos indicados, y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados son de un experimento representativo de 3 en diferentes donantes.

Figura 7

DC-LAMP y CD83 son expresados en CD IL-3/IFN-\beta estimuladas con LPS

Se cultivaron monocitos con GM-CSF e IL-4 o IL-3 e IFN-\beta. Después las CD se estimularon o no con LPS (1 \mug/ml) durante 24 h. Líneas gruesas: perfiles FACS después de tinción con anticuerpos específicos. Líneas finas: perfiles FACS después de tinción con anticuerpos testigo de isotipo correspondiente. Datos de un experimento representativo de 2 en diferentes donantes de sangre.

Figura 8

Actividad estimuladora de linfocitos T de las CD IL-3/IFN-\beta

(A) Las CD IL-3/IFN-\beta inducen la proliferación de linfocitos T CD4^{+} naive. Se cultivaron linfocitos T CD4^{+} de sangre de cordón umbilical con CD IL-3/IFN-\beta (\circ) o CD GM-CSF/IL-4 (\bullet) alogénicas preparadas a partir del mismo donante. Después de 5 días, se cuantificó la proliferación de linfocitos T por incorporación con [^{3}H]-timidina. Los datos se muestran como medias \pm ETM de 6 experimentos independientes.

(B) Producción de citoquinas en cultivos de leucocitos mixtos. Los linfocitos T CD4^{+} de sangre periférica se cultivaron con CD IL-3/IFN-\beta (columnas sombreadas) o CD GM-CSF/IL-4 (columnas blancas) alogénicas con una relación CD/T de 1:10. Después de 6 días, se ensayaron los líquidos sobrenadantes por ELISA para determinar los niveles de citoquinas. Los datos se muestran como media \pm ETM de 6 experimentos.

*p < 0,05 comparado con CD generadas en CD GM-CSF e IL-4 (ensayo de Wilcoxon).

Figura 9

Apoptosis de células cancerosas usando CD IL-3/IFN-\beta

Se cocultivaron CD derivadas de monocitos humanos generadas a partir de monocitos cultivados en IL-3 e IFN-\beta, con líneas de células tumorales marcadas con [^{3}H]-timidina. Después de 18 h, se recogieron los núcleos intactos y se midió la radiactividad. Los datos se expresan como porcentajes de la fragmentación de ADN con una proporción de CD:célula diana 10:1.

Figura 10

Respuesta anti-E7 inducida por CD IL-3/IFN-\beta comparada con CD GM-CSF/IL-4

Respuesta de IFN-\gamma anti-E7 inducida por CD I3, comparado con CD GM. Las barras blancas representan la respuesta obtenida con CD no estimuladas, mientras que las barras oscuras representan respuestas inducidas por CD estimuladas con LPS. Como sistemas de lectura se usaron ELISPOT, ELISA y citometría. Los resultados representados gráficamente son los obtenidos después de restar la base (CD no cargadas + linfocitos T autólogos).

Tabla 1

Producción de citoquinas por CD derivadas de monocitos

Las CD se generaron en presencia de GM-CSF e IL-4 o IL-3 e IFN-\beta, y se activaron con LPS (1 \mug/ml) durante 24 h o con transfectantes 3T6-CD40L durante 3 días. Los niveles de citoquinas en los líquidos sobrenadantes se midieron por ELISA, y los resultados se expresan como medias \pm ETM de 6 experimentos independientes en diferentes donantes de sangre.

Tabla 2

Poli(I:C) induce la producción de IFN-\alpha por las CD IL-3/IFN-\beta

Se generaron CD en presencia de IL-3 e IFN-\beta, y se activaron con transfectantes 3T6-CD40L durante 3 días, o LPS (1 \mug/ml) durante 24 h, o virus influenza durante 24 h, o Poli(I:C) durante 48 h. Se midieron los niveles de IFN-\alpha en los líquidos sobrenadantes por ELISA, y los resultados se expresaron como medias \pm ETM de experimentos independientes en diferentes donantes de sangre.

Ejemplos Ejemplo 1 La interleuquina-3 y el interferón-\beta cooperan para inducir la diferenciación de monocitos en células dendríticas con potentes propiedades estimuladoras de linfocitos T colaboradores Materiales y procedimientos Preparación celular y cultivo

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de sangre heparinizada de donantes normales mediante centrifugación en gradiente de densidad con Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Noruega). Los monocitos se obtuvieron por adhesión durante 2 h en matraces de 75 cm^{2} o por centrifugación en gradiente de densidad con Nycoprep (Nycomed), seguido de separación celular magnética usando un kit de aislamiento de monocitos disponible en el comercio, que permite obtener suspensiones celulares que contienen más de 95% de monocitos (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Para generar CD usando IL-4 y GM-CSF (CD IL-4/GM-CSF), se cultivaron monocitos purificados durante 4-6 días en RPMI 1640 (Bio Whittaker Europe, Verviers, Bélgica) complementado con L-glutamina 2 mM (GIBCO, Paisley, Escocia), gentamicina 20 \mug/ml, 2-mercaptoetanol 50 \muM (GIBCO), aminoácidos no esenciales al 1% (GIBCO) y suero bovino fetal al 10% (Bio Whittaker Europe) en matraces de 75 cm^{2} o placas de 6 pocillos (7,5 10^{5} células/ml) en presencia de GM-CSF (800 U/ml) e IL-4 (500 U/ml) cedido por Schering-Plough (Kenilworth, NJ), como describen Romani y col.^{4}. En paralelo se cultivaron monocitos durante 4-6 días en presencia de IFN-\beta (1000 U/ml) (Ares Serano Europe, Londres, GB) e IL-3 (50 U/ml) (R&D Systems Europe, Oxon, GB), solos o combinados.

Estudio por microscopía electrónica

Las células dendríticas se fijaron con glutaraldehído al 2%, y tampón de fosfato de Millonig durante 2 h. Los bloques de células obtenidos después de centrifugación a 1200g durante 10 min, se fijaron con tetraóxido de osmio al 2% y se embebieron en resina epoxi. Se tiñeron secciones ultrafinas con acetato de uranilo y citrato de plomo. El estudio ultraestructural se llevó a cabo usando el microscopio electrónico EMT400 (Philips, Eindhoven, Holanda).

Análisis por citometría de flujo

Para el inmunofenotipo, las células se lavaron en solución tamponada con fosfato (PBS) complementada con albúmina se suero bovino (BSA) al 0,5%, y se incubaron durante 15 min a 4ºC con uno de los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con fluroesceína (FITC-) o ficoeritrina (PE): IgG2a FITC-anti-HLA-DR, IgG1 PE-anti-CD4, IgG1 FITC-anti-CD8, IgG2a PE-anti-CD11b, IgG2b PE-anti-CD11c, IgG2b PE-anti-CD14, IgG1 PE-anti-CD33, IgG1 FITC-anti-CD45RA, IgG2a PE-anti-CD45RO, IgG2b PE-anti-CD54, IgG1 PE-anti-CD80 (B7-1), IgG1 PE-anti-CD123 (IL-3R\alpha) e IgG1 PE-anti-CD154 (CD40L), todos de Becton Dickinson (Mountain View, CA), IgG2b PE-anti-CD86 (B7-2) de Pharmingen (San Diego, CA), IgG2a FITC-anti-CD3, IgG1 FITC-anti-CD16, IgG1 FITC-anti-CD19 y IgG1 PE-anti-CD40 de Biosource International (Camarillo, CA), IgG2a FITC-anti-CD1a de Dako (Glostrup, Dinamarca), y IgG2a clon B9.12.1 FITC-anti-HLA-Clase I (A, B, C), IgG2a PE-anti-CD83 de Immunotech (Marseille, Francia). Las células también se tiñeron con los correspondientes anticuerpos monoclonales testigo de los correspondientes isotipos, y después se analizaron usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).

Análisis de la apoptosis

La muerte celular apoptótica se midió por citrometría de flujo usando anexina V conjugada con FITC (Becton Dikinson) y yoduro de propidio (Sigma-Aldrich, Bomem, Bélgica) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Ensayo de endocitosis

Se usó FITC-dextrano (Molecular Probes, Eugen, OR) para evaluar la endocitosis celular como describen Sallusto y col^{17}. Brevemente, las células se incubaron con FITC-dextrano 1 mg/ml a 37ºC durante 5, 15 ó 30 min, y después se analizaron usando el citómetro de flujo FACScan.

Estimulación de células dendríticas

Se estimularon CD (4 x 10^{5}/ml) mediante lipopolisacáridos bacterianos (LPS) (1 \mug/ml), virus influenza inactivado con formaldehído de cepa de Nueva Caledonia (cedido por N. Kuehm, Aventis, Pasteur Mérieux, Val de Reuil, Francia), poli(ácido inosínico)-poli(ácido citidílico) (Poli(I:C)) (20 \mug/ml) (Sigma), durante 24 h o 48 h respectivamente, y después se ensayaron los niveles de citoquinas en los líquidos sobrenadantes del cultivo. En paralelo, se activaron CD (2 x 10^{5}/ml) por cocultivo con fibroblastos 3T6 irradiados transfectados con el gen CD40L humano (transfectados CD40L) (5 x 10^{4}/ml), y los líquidos sobrenadantes se recogieron después de 3 días, para determinar los niveles de citoquina.

Cultivos de leucocitos mixtos

Se cocultivaron CD en placas de fondo plano de 96 pocillos con linfocitos T CD4^{+} naive alogénicos (2 x 10^{5}/ml) aislados de sangre de cordón umbilical de recién nacido o CMSP de adulto. Los linfocitos T CD4^{+} se purificaron por separación celular magnética usando un kit de aislamiento de linfocitos T CD4 disponible en el comercio (pureza > 95%, evaluada por análisis de FACS) (Miltenyi Biotec). En el caso de linfocitos T CD4^{+} de adultos, se usa además un kit de aislamiento CD45RA (Miltenyi Biotec) para el enriquecimiento en células naive.

Después de 5 días, se evaluó la proliferación celular mediante la captación de [^{3}H]-timidina durante las últimas 16 h, y se recogieron los líquidos sobrenadantes del cultivo para determinar los niveles de citoquinas.

Determinación de los niveles de citoquinas

Se adquirieron kits para ELISA de Biosource Europe (Fleurus, Bélgica) para determinar los niveles de TNF\alpha, IL-6, IL-8 e IL-12 (p40). La determinación de los niveles de IL-12 (p70) se llevó a cabo usando un kit disponible en el comercio (Endogen, Wobum, MA). Se midieron los niveles de IFN-\gamma e IL-5 mediante ELISA en sándwich de dos sitios, usando anticuerpos de Chromogenix (Mölndal, Suecia) y Pharmingen, respectivamente.

Análisis estadístico

La significancia estadística se determinó usando el ensayo de Wilcoxon apareado de dos colas.

Resultados Los monocitos tratados con IFN-\beta mantienen la expresión de IL-3R\alpha y dependen de IL-3 para su supervivencia

Como se muestra en la figura 1, los monocitos purificados de CMSP expresan IL-3R\alpha (CD123), pero pierden esta expresión después de 6 días de cultivo en medio solo. La pérdida de expresión de IL-3R\alpha se evitó cuando se añadió IFN-\beta (1000 U/ml) el primer día de cultivo (figura 1). Este análisis se llevó a cabo en la fracción de células viables en el cultivo. De hecho, más del 90% de los monocitos cultivados en medio solo o en presencia de IFN-\beta 1000 U/ml, eran apoptóticas, cuando se evaluó por citometría de flujo usando tinción doble con anexina V y yoduro de propidio (fig. 2). La adición de IL-3 el primer día de cultivo potenció notablemente la supervivencia de los monocitos. De hecho, más del 65% de las células todavía estaban vivas después de 6 días de cultivo en presencia de IL-3 e IFN-\beta.

Los monocitos cultivados en presencia de IL-3 e IFN-\beta se diferencian en CD

Para caracterizar las células obtenidos por cultivo de monocitos en IL-3 e IFN-\beta, los autores de la invención primero miraron su morfología ultraestructural. Como se muestra en la figura 3, los monocitos cultivados en estas condiciones adquieren expansiones citoplasmáticas de tipo dendrítico. Por lo tanto, las células derivadas de monocitos cultivados en IL-3 e IFN-\beta, se denominarán en lo sucesivo CD IL-3/IFN-\beta.

Los análisis por citometría de flujo (fig. 4) demostraron que estas células expresaban marcadores de linaje mieloide (CD11c, CD14, y CD33) pero eran negativas para la expresión de CD3, CD4, CD8, CD11b, CD16, CD19, CD45RA y CD154 (CD40L). También expresaban altos niveles de moléculas HLA de clase I y clase II, CD40, CD54, CD80 y CD86, y IL-3R\alpha (CD123). Como se esperaba^{7}, el último marcador sólo era expresado con niveles bajos en las CD derivadas de monocitos cultivados en IL4 y GM-CSF. A la inversa, CD1a era expresado en CD IL-4/GM-CSF pero no en células derivadas de monocitos cultivados en IL-3 e IFN-\beta.

Cuando los monocitos eran cultivados en IL-3 sola, se adherían fuertemente al plástico, de modo que sólo se podían recoger cantidades limitadas de dichas células para el posterior análisis. Por citometría de flujo, expresaban niveles menores de CD80 y CD86, y niveles mayores de CD14 que las CD IL-3/IFN-\beta (fig. 4), lo cual sugiere que están más cerca de los macrófagos. En experimentos adicionales, los autores de la invención encontraron que el IFN-\alpha ejerce un efecto similar al IFN-\beta, de modo que la combinación IL-3+INF-\alpha también daba como resultado la generación de CD mieloides positivas para IL-3R\alpha, que expresaban CD80 y CD86 (fig. 5).

La capacidad de endocitosis de las CD IL-3/IFN-\beta se estudió por absorción de fase fluida de FITC-dextrano. Como se muestra en la figura 6, las CD IL-3/IFN-\beta absorben activamente dextrano, aunque eran menos potentes que las CD IL-4/GM-CSF en esto.

Para estudiar más el estado de maduración de las CD IL-3/IFN-\beta, los autores de la invención analizaron su expresión de CD83 y DC-LAMP, que son marcadores establecidos de CD maduras. Como se muestra en la figura 6, ambos marcadores estaban ausentes en las CD IL-3/IFN-\beta en reposo, pero estaban claramente regulados positivamente tras estimulación con LPS (fig. 7).

Producción de citoquinas por CD IL-3/IFN-\beta

Las CD IL-3/IFN-\beta segregaban espontáneamente IL-6, IL-8, IL-12 (p40) y TNF\alpha. Comparado con las CD GM-CSF/ IL-4, las CD IL-3/IFN-\beta producían menos IL-12 (p40), mientras que su secreción de IL-8 era ligeramente mayor (tabla 1). Al igual que en el caso de las CD IL-4/GM-CSF, la unión tanto de LPS como de CD40 inducida por transfectantes CD40L regula positivamente la síntesis de citoquina por las CD IL-3/IFN-\beta. Comparadas con las CD GM-CSF/IL-4, las CD IL-3/IFN-\beta producían niveles menores de TNF-\alpha como respuesta a los LPS, niveles mayores de IL-6 e IL-8 como respuesta a CD40L, y niveles mucho menores de IL-12 (p40) e IL-12 (p70), independientemente del estímulo considerado.

Para analizar la producción de IFN-\alpha, los autores de la invención incluyeron como estímulos adicionales el virus influenza inactivado con formaldehído y Poli(I:C) que mimetiza ARN bicatenario vírico. Como se muestra en la tabla 2, el Poli(I:C) era el único estímulo que inducía la producción de IFN-\alpha por las CD IL-3/IFN-\beta. En estas condiciones, los niveles de IFN-\alpha segregados fuertemente por las CD IL-3/IFN-\beta, eran más de diez veces mayores que los producidos por las CD IL-4/GM-CSF (128 \pm 24 pg/ml, p<0,05) (figura 12).

Activación de linfocitos T inducida por CD IL-3/IFN-\beta

Para evaluar la capacidad de las CD IL-3/IFN-\beta para provocar las respuestas de linfocitos T naive, se prepararon cultivos de leucocitos mixtos de linfocitos T CD4^{+} de sangre de cordón umbilical y CD IL-4/GM-CSF o IL-3/IFN-\beta. En todas las proporciones de estimulador/respondedor, las CD IL-3/IFN-\beta eran tan eficaces como las CD GM-CSF/IL-4 para inducir la proliferación de linfocitos T CD4^{+} naive (fig. 8A). En experimentos posteriores diseñados para analizar el perfil de las citoquinas segregadas por los linfocitos T tras exposición a CD alogénicas, se prepararon cultivos de linfocitos mixtos usando linfocitos T CD4^{+} CD45RA^{+} de adulto como células respondedoras. Como se muestra en la figura 8B, las CD IL-3/IFN-\beta indujeron la producción de grandes cantidades de IFN-\gamma, mucho mayores que las provocadas por las CD IL-4/GM-CSF. Para determinar si la IL-12 estaba implicada en la inducción de la producción de IFN-\gamma, los autores de la invención añadieron un anticuerpo anti-IL-12 neutralizante a los cultivos de leucocitos mixtos. La neutralización de la IL-12 inhibe más del 60% de la producción de IFN-\gamma cualquiera que sea el tipo de CD considerada (no se muestran los datos), indicando que los niveles bajos de IL-12 segregada por las CD IL-3/IFN-\beta contribuyen a su capacidad para provocar la producción de IFN-\gamma por los linfocitos T. Igualmente, las CD IL-3/IFN-\beta también indujeron la producción de IL-5 en cultivo de leucocitos mixto, y respecto a esto también eran mucho más eficaces que las CD IL-4/GM-CSF (fig. 8B).

Discusión

Entre la población de CD, se definieron distintos linajes de acuerdo con la expresión de moléculas de superficie. Las CD CD11c^{+} CD123^{-} presentan características de linaje mieloide y dependen de GM-CSF para su supervivencia^{5;18}. Se cree que las CD CD11c^{-} CD123^{+} dependientes de IL-3, pertenecen a linaje linfoide^{7}, aunque Olweus y col., mostraron que en las zonas de los órganos linfoides humanos dependientes de linfocitos T, un subconjunto grande de CD que expresan niveles altos de IL-3R\alpha pertenecen a un linaje mieloide^{19}. Los experimentos descritos por los autores de la invención, demuestran que los monocitos cultivados en IL-3 e IFN-\beta dan lugar a un tipo distinto de CD que expresan un nivel alto de moléculas de superficie tanto CD11c como CD123. Además de su morfología, su naturaleza de célula dendrítica se estableció además por su capacidad para inducir la proliferación de linfocitos T CD4^{+} naive en MLR. Es interesante, que se mostró previamente que la IL-3 cooperaba con el factor de necrosis tumoral en la generación de células dendríticas/Langerhans a partir de células progenitoras hematopoyéticas CD34^{+, 20}. Puesto que la población inicial en los experimentos llevados a cabo por los autores de la invención, consiste en monocitos purificados, y las CD IL-3/IFN-\beta difieren de las células dendríticas/Langerhans en términos de la expresión de CD1a y CD14, parece que IL-3 puede promover la diferenciación de diferentes poblaciones de CD.

Recientemente, se ha mostrado que el IFN-\beta puede potenciar la maduración de CD derivadas de monocitos^{21}. Comparadas con las CD clásicas generadas en GM-CSF e IL-4, las CD IL-3/IFN-\beta están en un estado de maduración superior, como se indica por su mayor expresión de superficie de moléculas coestimuladoras y HLA. La menor capacidad endocítica de las CD IL-3/IFN-\beta también puede reflejar su mayor nivel de maduración^{22}. En lo que se refiere a la producción de citoquinas, las CD IL-3/IFN-\beta segregan niveles mucho menores de IL-12 comparadas con las CD GM-CSF/IL-4. Esto puede estar relacionado con su mayor estado de maduración, ya que se mostró previamente que la maduración de las CD daba como resultado una menor producción de IL-12^{23}. Además, el IFN-\beta puede inhibir directamente la síntesis de IL-12 por las CD^{24}. El hecho de que las CD IL-3/IFN-\beta presentaran menor capacidad de endocitosis, también puede reflejar su mayor nivel de maduración. Aunque presentan varias características que sugieren un grado mayor de maduración de las CD IL-4/GM-CSF, las CD IL-3/IFN-\beta no se deben considerar como completamente maduras, ya que no expresan CD83 ni DC-LAMP. sin embargo, estos marcadores aparecen claramente después de estimulación con LPS, como en el caso de las CD IL-4/GM-CSF.

En un estudio previo se observó que las CD diferenciadas de los cultivos de monocitos en presencia de IFN-\beta y GM-CSF son de vida corta^{16}. En este informe, los presentes autores de la invención, demuestran que la IL-3 rescata de la apoptosis a los monocitos cultivados en presencia de IFN-\beta, y les permite diferenciarse en CD maduras. Estas observaciones demuestran un efecto de cooperación de la IL-3 e IFN-\beta en la supervivencia y diferenciación celular. Se sabe poco sobre el efecto de los IFN tanto de tipo I como de tipo II en la expresión del receptor de IL-3. Nunca se ha evaluado el efecto de los IFN de tipo I en la expresión de IL-3R\alpha, pero se ha mostrado que el IFN-\gamma regula positivamente la expresión de IL-3R\alpha en células endoteliales humanas^{25}. Además, se ha mostrado que el IFN-\gamma tiene un efecto sinérgico con la IL-3 en el crecimiento de progenitores hematopoyéticos humanos inmaduros^{26}, aunque este efecto no se correlacionó con la regulación positiva de la expresión de IL-3R\alpha^{27}. Sin embargo, se sabe que la IL-3 estimula la diferenciación de monocitos a partir de progenitores mieloides y su activación^{28-30}. Más recientemente, se ha mostrado que la IL-3 es un factor de supervivencia crítico para los precursores de CD IL-3R\alpha^{+} aisladas de sangre humana, nódulos linfáticos y médula osea^{6;7;19}.

A pesar de su bajo nivel de producción de IL-12, las CD IL-3/IFN-\beta estimulan un alto nivel de producción de IFN-\gamma de linfocitos T CD4^{+} de adulto, sugiriendo que usan otras moléculas de membrana o factores para provocar la síntesis de citoquinas Th1. De hecho, recientemente se describió la ruta de IFN-\gamma independiente de IL-12^{13;14;31-33}. Sin embargo, los menores niveles de IFN-\gamma medidos tras neutralización de la IL-12, indican que la IL-12 contribuye a la función de las CD IL-3/IFN-\beta. Considerados juntos, los datos presentados en la presente invención, indican que las CD IL-3/IFN-\beta difieren de las células plasmacitoides CD4^{+} CD3^{-} CD11c^{-} IL-3R\alpha^{+} aisladas de sangre periférica, descritas por Grouard y col.^{6}, ya que éstas últimas células mostraron ser malos inductores de IFN-\gamma en MLR.

La capacidad de las CD IL-3/IFN-\beta para producir niveles altos de IFN-\alpha tras estimulación con Poli(I:C) puede ser importante por sus efectos en el marco de infecciones víricas^{34}. Esta respuesta a Poli(I:C) está de acuerdo con su origen mieloide^{35}. Es interesante, que las CD IL-3/IFN-\beta responden poco al virus influenza en relación con la inducción de MxA por el IFN-\beta^{36}. La diferentes sensibilidades al virus influenza y Poli(I:C) está de acuerdo con el hecho de que Poli(I:C) actúa en la proteína-quinasa R expresada en el citoplasma, mientras que los receptores de superficie están implicados en las respuestas a todos los virus^{37}.

Las CD IL-4/GM-CSF derivadas de monocitos, ahora se usan clínicamente como herramientas para inducir inmunidad antitumoral^{38-40}. En esta memoria, los autores de la invención muestran que las CD IL-3/IFN-\beta son más eficaces que las IL-4/GM-CSF para provocar la producción de IFN-\gamma e IL-5 por linfocitos T colaboradores. Esto puede ser importante para la vacunación del cáncer, ya que se encontró que ambas citoquinas tienen efecto sinérgico en el rechazo tumoral^{41}. Debido a su capacidad para inducir la producción tanto de IFN-\gamma como de IL-5, y a su facilidad de generación a partir de monocitos de sangre periférica, los autores de la invención sugieren que las CD IL-3/IFN-\beta deben tener interés en el desarrollo de nuevas terapias del cáncer basadas en CD.

Resumen del ejemplo 1

Los autores de la invención observaron que el interferón \beta (IFN-\beta) prevenía la regulación negativa de la cadena \alpha del receptor de interleuquina 3 (IL-3R\alpha) que se produce espontáneamente durante el cultivo de monocitos humanos. La funcionalidad del IL-3R se demostró por el hecho de que la IL-3 rescataba de la apoptosis a los monocitos tratados con IFN-\beta. Mientras que más del 90% de los monocitos morían después de 6 días de cultivo en IFN-\beta solo, el 65% de las células todavía estaban vivas en presencia de IL-3 e IFN-\beta. Después, los autores de la invención encontraron que los monocitos cultivados en presencia de IFN-\beta e IL-3 adquieren una morfología dendrítica y expresan niveles altos de moléculas HLA de clase I y de clase II y coestimuladoras, tales como CD40, CD54, CD80 y CD86. Cuando eran estimuladas por lipopolisacáridos (LPS) o fibroblastos que expresan el ligando CD40 (transfectados CD40L), las CD generadas en IFN-\beta e IL-3 (CD IL-3/IFN-\beta) segregaban niveles altos de IL-6, IL-8 y factor de necrosis tumoral (TNF)-\alpha, pero sólo niveles muy bajos de IL-12, comparado con las CD generadas en IL-4 y factor estimulador de colonia de granulocitos y macrófagos (CD IL-4/GM-CSF). Los autores de la invención encontraron que las CD IL-3/IFN-\beta inducían una respuesta proliferativa vigorosa de linfocitos T de cordón umbilical alogénicos. En cultivo de leucocitos mixtos con linfocitos T CD4^{+} de adulto, las CD IL-3/IFN-\beta provocaban la producción de niveles altos tanto de IFN-\gamma como de IL-5. Finalmente, se encontró que las CD IL-3/IFN-\beta producían niveles mucho mayores de IFN-\alpha que las CD IL-4/GM-CSF como respuesta al Poli(I:C). Los autores de la invención concluyen que los monocitos cultivados en presencia de IL-3 e IFN-\beta se diferencian en CD con potente capacidad estimuladora de linfocitos T colaboradores a pesar de su baja expresión de IL-12.

Ejemplo 2 Las células dendríticas derivadas de monocitos humanos generadas en IL-3 e IFN-\beta inducen la apoptosis de líneas de células tumorales

Los autores de la invención probaron que las CD derivadas de monocitos generadas a partir de células mononucleares de sangre periférica por cultivo en interleuquina (IL)-3 e interferón (IFN)-\beta (CD IL-3/IFN-\beta) se pueden usar en ensayos clínicos como herramientas para inducir respuestas antitumorales in vivo^{38-40}. Con el fin de determinar si las CD IL-3/IFN-\beta pueden inducir la muerte celular programada en células tumorales, esas células se cocultivaron con un panel de líneas celulares tumorales (línea celular Jurkat, la línea celular Molt-4 (obtenida del Instituto Pasteur, Lille, Francia); línea celular Cem (obtenida de Dr. T. Velu (ULB, Bruselas, Bélgica), líneas celulares 786.0, A498 y Caki 2 proporcionadas por Dr. R. Kiss (ULB, Bruselas, Bélgica); líneas celulares Daudi adquiridas en ATCC). Se midió el porcentaje de fragmentación de ADN en células diana usando el ensayo de interferencia. Brevemente, las células diana se marcaron con [^{3}H]-timidina 5 \muCi/ml por incubación toda la noche a 37ºC. Las células diana marcadas se recogieron, se lavaron y se sembraron en placas con fondo en U de 96 pocillos con una densidad de 10.000 células/pocillo. Las células efectoras se lavaron y se añadieron a las células diana. Después de 18 h, se recogieron los núcleos intactos (ADN de alto PM, no fragmentado), usando un microcosechador 96, y se midió la radiactividad en un contador beta de microplaca. Los datos se expresaron como el porcentaje de fragmentación de ADN calculado por la siguiente fórmula: [1-(cpm con efectoras / cpm sin efectoras)] x 100. Los autores de la presente invención observaron que las CD IL-3/IFN-\beta en una relación de E:T = 10:1 presentaban actividad citotóxica significativa frente a 6 de 8 líneas tumorales ensayadas. Como se muestra en la figura 9, las líneas celulares Molt-4, Jurkat, 786.0, A498 y Caki2 eran susceptibles a la apoptosis mediada por las CD IL-3/IFN-\beta, así como las células Daudi, aunque en menor grado. Por otra parte, las células Cem eran resistentes.

La observación de que las CD IL-3/IFN-\beta derivadas de monocitos pueden desencadenar la apoptosis en células tumorales es importante para su uso terapéutico como vacunas antitumorales. De hecho, informes recientes demostraron que las CD IL-4/GM-CSF pueden procesar las células apoptóticas y presentar de forma cruzada los antígenos derivados de una forma restringida a MHC de clase I, dando como resultado la inducción de respuestas eficaces de linfocitos T citotóxicos^{42-43}. Por lo tanto, las CD que son inyectadas directamente en tumores inducirán primero la apoptosis en células cancerosas, y finalmente migran a los nódulos linfáticos donde inducen las respuestas de los linfocitos T específicos del tumor.

Ejemplo 3 Respuesta anti-E7 inducida por CD IFN-\beta/IL-3 comparada con CD GM-CSF/IL-4 (figura 10) Materiales y procedimientos

Las CD se generaron a partir de CMSP de donantes de sangre sanos, mediante un cultivo de 5 días en presencia de GM-CSF (800 UI/ml) e IL-4 (500 UI/ml) (CD GM o CD IL4/CSF) o IL-3 (50 UI/ml) e IFN-\beta (1000 UI/ml) (CD I3 o IL3/CD IFN- \beta). Después de recogerlas, estas células se trataron con pulsos durante 2 horas con la proteína E7 (20 \mug/ml) a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5%, y se activaron o no con LPS (1 \mug/ml, estimulación toda la noche). Las CD tratadas con pulsos con E7 se cocultivaron con linfocitos T CD4+ purificados autólogos en una relación 1:10 durante 6 días. Como sistemas de lectura para evaluar la producción de IFN-\gamma se usaron ELISPOT ELISA y citometría de flujo (tinción intracelular).

Resultados

Los datos de estos experimentos muestran que las CD I3 no activadas son al menos iguales o incluso superiores a las CD GM estimuladas con LPS, en la inducción de respuestas anti-E7. Puesto que E7 es una proteína derivada de HPV 16, un virus implicado en la patogénesis del cáncer de cuello cervical, estos datos son importantes para el diseño de nuevas vacunas para el cáncer/inmunoterapia.

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TABLA 1

1

TABLA 2

2

Claims

1. Un procedimiento in vitro para la diferenciación y maduración de monocitos en células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, que comprende incubar dichos monocitos con una combinación de interferón de tipo I e IL-3.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la IL-3 y el interferón de tipo I se añaden a los monocitos simultáneamente, secuencialmente o por separado.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el interferón de tipo I está presente con una concentración entre 10 y 20000 U/ml.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el interferón de tipo I está presente con una concentración de 1000 U/ml.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la IL-3 está presente con una concentración entre 1 y 1000 U/ml.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la IL-3 está presente con una concentración de 50 U/ml.

7. Un procedimiento in vitro para obtener una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende incubar los monocitos aislados de un paciente, en presencia de interferón de tipo I e IL-3.

8. Un procedimiento in vitro para producir una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende al menos las siguientes etapas:

(a) incubar monocitos aislados de un paciente en presencia de interferón de tipo I e IL-3, dando como resultado una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, y

(b) presentar un péptido en la superficie de dichas células dendríticas.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la capacidad de presentar un péptido en la superficie de dichas células dendríticas se consigue poniendo en contacto dichas células dendríticas con al menos una parte de un antígeno expresado de forma diferencial en una célula.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la capacidad de presentar un péptido en la superficie de dichas células dendríticas se consigue mediante el tratamiento con pulsos de dichas células dendríticas con proteínas antigénicas.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la capacidad de presentar un péptido en la superficie de dichas células dendríticas se consigue cargando dichas células dendríticas con péptidos antigénicos.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la capacidad de presentar un péptido en la superficie de dichas células dendríticas, se consigue por transformación/transducción de dichas células dendríticas por moléculas de ácido nucleico que codifican al menos parte de dicho antígeno.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho antígeno es expresado en la superficie de dicha célula dendrítica transformada/transducida.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la capacidad de presentar un péptido en la superficie de dichas células dendríticas se consigue por fusión de dichas células dendríticas con células que llevan antígenos específicos.

15. Un procedimiento in vitro para activar un linfocito T usando células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ que se pueden obtener por un procedimiento como se describe en las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos las siguientes etapas:

(a) incubar monocitos aislados de un paciente, en presencia de interferón de tipo I e IL-3 para proporcionar una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+,

(b) presentar un péptido en la superficie de dichas células dendríticas, proporcionando así una población de células dendríticas presentadoras de antígeno; y,

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho linfocito T es un linfocito T colaborador.

17. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho interferón de tipo I se elige de un grupo que consiste en IFN- \beta, IFN-\alpha o sus moléculas peptidomiméticas.

18. Una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno o una población de linfocitos T activados que inducen respuestas tanto de tipo TH1 (IFN-\gamma) como de tipo TH2 (IL-5), que se pueden obtener por un procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o una de sus combinaciones.

19. Un procedimiento in vitro para estimular más una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ que se pueden obtener por un procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dichas células dendríticas se incuban adicionalmente con un estimulador que puede inducir la producción de IFN-\alpha en dichas células dendríticas.

20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho estimulador se elige de un grupo que comprende virus, bacteria, LPS, ácido nucleico, derivados funcionales o una de sus combinaciones.

21. Una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ estimuladas, que se pueden obtener por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20.

22. Una composición para usar como medicamento, o un producto basado en células dirigido al uso clínico, que comprende al menos una de las siguientes combinaciones de componentes:

- IL-3 e interferón de tipo I

- una población de monocitos mezclada con IL-3 e interferón de tipo I

- una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+

en la que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden obtener de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o en la que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, o una de sus combinaciones.

23. Una composición o un producto basado en células de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho interferón de tipo I se elige de un grupo que consiste en IFN-\beta, IFN-\alpha o sus moléculas peptidomiméticas.

24. Una composición o un producto basado en células de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23, complementada con al menos una citoquina adicional.

25. Una composición o un producto basado en células de acuerdo con la reivindicación 24, en la que dicha citoquina se elige del grupo que comprende IFN-\alpha, IFN-\beta, IL-3 e IL-12.

26. Uso de una composición o un producto basado en células, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, para preparar un medicamento para tratar el cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes.

27. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y los componentes de una composición como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25.

28. Uso de una población o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18, 21, 22 a 25 y 27, para preparar un medicamento para matar una célula diana.

29. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que dicha célula diana se selecciona del grupo que consiste en una célula cancerosa, una célula bacteriana, una célula infectada por parásito o una célula infectada por virus.

30. Un procedimiento de cribado in vitro, que usa una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ estimuladas, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno estimuladas, o una población de linfocitos T activados que inducen respuestas tanto de tipo TH1 (IFN-\gamma) como de tipo TH2 (IL-5), que se pueden obtener por un procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, y 19 a 20.

31. Uso de una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ estimuladas, una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno estimuladas, o una población de linfocitos T activados que inducen respuestas tanto de tipo TH1 (IFN-\gamma) como de tipo TH2 (IL-5), que se pueden obtener por un procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, y 19 a 20, para preparar ensayos de cribado in vitro.

32. Un procedimiento in vitro para detectar la actividad mediada por linfocitos T de un péptido antigénico diana, que comprende al menos las siguientes etapas:

(b) poner en contacto una célula diana con dicho linfocito T activado, y

(c) controlar el efecto de dicho linfocito T activado en dicha célula diana, detectando así la actividad antidiana,

en el que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden obtener de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o en el que dichas células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, o una de sus combinaciones.

33. Un kit para detectar la actividad mediada por linfocito T de un péptido antigénico diana, que comprende al menos una combinación de componentes elegidos de la siguiente lista:

- IL-3 e interferón de tipo I

- una población de monocitos mezclada con IL-3 e interferón de tipo I

- una población de células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+

34. Un kit de acuerdo con la reivindicación 33, en el que el interferón de tipo I se elige de un grupo que consiste en IFN-\beta, IFN-\alpha o sus moléculas peptidomiméticas.

35. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 y 27 como adyuvante de vacuna para preparar un medicamento.

36. Adyuvante de vacuna que comprende una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 y 27.

37. Uso del adyuvante de vacuna de la reivindicación 36, para preparar un medicamento para inmunizar seres humanos o animales frente a una enfermedad.

38. Uso de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 y 27, para preparar un medicamento para el tratamiento del cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes.

39. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 y 27 para preparar un medicamento para el tratamiento del cáncer, en el que el antígeno, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, 22 y 33, es un antígeno específico de tumor.

40. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 y 27 para preparar un medicamento para el tratamiento de infecciones, en el que el antígeno, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, 22 y 33, es un antígeno específico de infección.

41. Uso de la reivindicación 40, en el que dicha infección se selecciona del grupo de VIH, virus de papiloma humano, virus Ebstein-Barr y citomegalovirus.

42. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 y 27 para preparar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, en la que el antígeno, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, 22 y 33, es una proteína del organismo.

43. Uso de acuerdo con la reivindicación 42, en el que dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, miastenia grave, artritis crónica juvenil, artritis crónica, LED, dermatitis atópica y diabetes juvenil.

44. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 37 a 43, en el que el medicamento se formula para administrar al paciente por vía intravenosa, intralinfoide o intratumoral.