JP5856059B2 - 虚血組織を治療するためのｓｄｆ−１送達 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、その主題の全内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００９年８月２８日出願の米国仮特許出願第６１／２３７７７５号および２０１０年５月１３日出願の米国仮特許出願第６１／３３４２１６号に基づく優先権を請求する。

本出願は、心筋症を治療するためのＳＤＦ−１送達法および組成物、ならびに虚血性心筋症を治療するためのＳＤＦ−１送達法および組成物の使用に関する。

虚血は、血流が体の局部で完全に妨げられるまたはかなり減少して、酸素欠乏、物質供給の減少および代謝産物の蓄積を招く状態である。虚血の程度は、血管閉塞の激しさ、その持続期間、血管閉塞に対する組織感受性および副行血管の発達の程度に依存するが、通常、虚血器官または組織で機能障害が起こり、長期の虚血は、患部組織の萎縮、変性、アポトーシスおよび壊死を招く。

冠状動脈に影響を及ぼし、心筋虚血を引き起こす疾患である虚血性心筋症において、虚血性心筋細胞傷害の程度は、冠状動脈閉塞の時間の増加とともに、可逆的細胞障害から不可逆的細胞障害に進行する。

本出願は、被験体の心筋症を治療する方法に関する。心筋症には、例えば、肺塞栓、静脈血栓症、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、末梢血管障害、アテローム性動脈硬化症および／または他の心筋傷害もしくは血管病に伴う心筋症が含まれ得る。本方法は、被験体の心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に、以下のパラメーター：左室容積、左室面積、左室径、心機能、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）またはニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類の少なくとも１つにおける機能改善をもたらすのに有効な量のＳＤＦ−１を、直接投与するまたは局所的に発現させるステップを含む。

本出願の一態様では、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積、左室駆出率、壁運動スコア指数、左室拡張末期長、左室収縮末期長、左室拡張末期面積、左室収縮末期面積、左室拡張末期容積、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）またはニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類の少なくとも１つにおける機能改善をもたらすのに有効である。本出願の別の態様では、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を改善するのに有効である。本出願のさらなる態様では、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室駆出率を改善するのに有効である。

本出願のいくつかの態様では、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を少なくとも約１０％改善するのに有効である。本出願の他の態様では、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を少なくとも約１５％改善するのに有効である。本出願のなおさらなる態様では、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を少なくとも約１０％改善し、左室駆出率を少なくとも約１０％改善し、壁運動スコア指数を少なくとも約５％改善し、６分間歩行距離を少なくとも約３０メートル改善し、かつＮＹＨＡクラスを少なくとも１クラス改善するのに有効である。本出願のさらなる態様では、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室駆出率を少なくとも約１０％改善するのに有効である。

本出願の別の態様では、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、少なくとも約１０％の合計安静時欠損スコア、合計負荷時欠損スコアおよび／または合計差欠損スコア（ｓｕｍｍｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｓｃｏｒｅ）の改善と共に、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の脈管形成を、血管密度に基づきまたは心筋血流イメージング（例えば、ＳＰＥＣＴもしくはＰＥＴ）により測定される少なくとも約２０％実質的に改善するのに有効である。ＳＤＦ−１は、ＳＤＦ−１発現プラスミドを含む溶液を、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に注入し、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域からＳＤＦ−１を発現させることにより、投与することができる。ＳＤＦ−１は、左室収縮末期容積を改善するのに有効な量で衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域から発現させることができる。

本出願の一態様では、ＳＤＦ−１プラスミドを、各注入が約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド溶液を含む溶液の複数回注入で衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。一実施例では、ＳＤＦ−１プラスミドを、少なくとも約１０回の注入で衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与される各注入は、少なくとも約０．２ｍｌの容積を有し得る。ＳＤＦ−１は、約３日を超える間、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域で発現させることができる。

本出願の一実施例では、ＳＤＦ−１発現プラスミドを含む溶液の各注入は、少なくとも約０．２ｍｌの注入容積および１注入当たり約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド濃度を有し得る。本出願の別の態様では、少なくとも約１０箇所の注入部位中、１部位当たり少なくとも約０．２ｍｌの注入容積および１注入当たり約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド濃度で、ＳＤＦ−１プラスミドを心臓の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に注入することにより、少なくとも１つの心臓の機能的パラメーターを改善することができる。

さらなる実施例では、少なくとも１つの心臓の機能的パラメーターを改善することができる、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１プラスミドの量は、約４ｍｇを超える。少なくとも１つの心臓の機能的パラメーターを改善することができる、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１プラスミドの溶液の容積は、少なくとも約１０ｍｌである。

本出願の別の態様では、ＳＤＦ−１が投与される被験体は、ヒトまたはブタなどの大型哺乳動物であり得る。ＳＤＦ−１プラスミドは、冠状動脈内カテーテル法または心室内カテーテル法などのカテーテル法により被験体に投与することができる。ＳＤＦ−１プラスミドの投与前に、被験体の心筋組織を画像化して衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の範囲を限定することができ、画像化により限定された衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域にＳＤＦ−１プラスミドを投与することができる。画像化は、心エコー法、核磁気共鳴画像法、冠血管造影、電気解剖学的マッピングまたは蛍光透視法の少なくとも１つを含み得る。

本出願はまた、ＳＤＦ−１プラスミドを、冠状動脈内カテーテル法または心室内カテーテル法などのカテーテル法により、哺乳動物の心筋の梗塞周囲領域に投与することにより、大型哺乳動物の心筋梗塞を治療する方法に関する。カテーテル法により投与されるＳＤＦ−１は、以下のパラメーター：左室容積、左室面積、左室径、心機能、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）またはニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類の少なくとも１つにおける機能改善をもたらすのに有効な量で梗塞周囲領域から発現させることができる。

本出願の一態様では、梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積、左室駆出率、壁運動スコア指数、左室拡張末期長、左室収縮末期長、左室拡張末期面積、左室収縮末期面積、左室拡張末期容積、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）またはニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類の少なくとも１つにおける機能改善をもたらすのに有効である。本出願の別の態様では、梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を改善するのに有効である。本出願のさらなる態様では、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室駆出分画を改善するのに有効である。

本出願のいくつかの態様では、梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を少なくとも約１０％改善するのに有効である。本出願の他の態様では、梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を少なくとも約１５％改善するのに有効である。本出願のなおさらなる態様では、梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を少なくとも約１０％改善する、左室駆出率を少なくとも約１０％改善する、壁運動スコア指数を少なくとも約５％改善する、６分間歩行距離を少なくとも約３０メートル改善する、またはＮＹＨＡクラスを少なくとも１クラス改善するのに有効である。本出願のさらなる態様では、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室駆出率を少なくとも約１０％改善するのに有効である。

本出願の別の態様では、梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、梗塞周囲領域の脈管形成を血管密度に基づき少なくとも約２０％実質的に改善するのに有効である。

本出願の一態様では、ＳＤＦ−１プラスミドを、各注入が約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド／溶液を含む溶液の複数回注入で衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。一実施例では、ＳＤＦ−１プラスミドを、少なくとも約１０回の注入で衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与される各注入は、少なくとも約０．２ｍｌの容積を有し得る。ＳＤＦ−１は、約３日を超える間、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域で発現させることができる。

本出願の一実施例では、ＳＤＦ−１発現プラスミドを含む溶液の各注入は、少なくとも約０．２ｍｌの注入容積および１注入当たり約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド濃度を有し得る。本出願の別の態様では、少なくとも約１０箇所の注入部位中、１部位当たり少なくとも約０．２ｍｌの注入容積および１注入当たり約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド濃度で、ＳＤＦ−１プラスミドを心臓の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に注入することにより、少なくとも１つの心臓の機能的パラメーターを改善することができる。

さらなる実施例では、少なくとも１つの心臓の機能的パラメーターを改善することができる、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１プラスミドの量は、約４ｍｇを超える。少なくとも１つの心臓の機能的パラメーターを改善することができる、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１プラスミドの溶液の容積は、少なくとも約１０ｍｌである。

本出願はさらに、心筋梗塞後の大型哺乳動物の左室収縮末期容積を改善する方法に関する。本方法は、ＳＤＦ−１プラスミドを、心室内カテーテル法により、哺乳動物の梗塞周囲領域に投与するステップを含む。ＳＤＦ−１は、左室収縮末期容積における機能改善をもたらすのに有効な量で梗塞周囲領域から発現させることができる。

本出願のいくつかの態様では、梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を少なくとも約１０％改善するのに有効である。本出願の他の態様では、梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を少なくとも約１５％改善するのに有効である。本出願のなおさらなる態様では、梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、左室収縮末期容積を少なくとも約１０％改善する、左室駆出率を少なくとも約１０％改善する、壁運動スコア指数を少なくとも約５％改善する、６分間歩行距離を少なくとも約３０メートル改善する、またはＮＹＨＡクラスを少なくとも１クラス改善するのに有効である。

本出願の一態様では、ＳＤＦ−１プラスミドを、各注入が約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド／溶液を含む溶液の複数回注入で衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。一実施例では、ＳＤＦ−１プラスミドを、少なくとも約１０回の注入で衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与される各注入は、少なくとも約０．２ｍｌの容積を有し得る。ＳＤＦ−１は、約３日を超える間、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域中で発現させることができる。

本出願の一実施例では、ＳＤＦ−１発現プラスミドを含む溶液の各注入は、少なくとも約０．２ｍｌの注入容積および１注入当たり約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド濃度を有し得る。本出願の別の態様では、少なくとも約１０箇所の注入部位中、１部位当たり少なくとも約０．２ｍｌの注入容積および１注入当たり約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド濃度で、ＳＤＦ−１プラスミドを心臓の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に注入することにより、心臓の左室収縮末期容積を少なくとも約１０％改善することができる。

さらなる実施例では、左室収縮末期容積を改善することができる、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１プラスミドの量は、約４ｍｇを超える。心臓の左室収縮末期容積を改善することができる、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１プラスミドの溶液の容積は、少なくとも約１０ｍｌである。

本出願の前記特徴および他の特徴は、添付の図面を参照して以下の説明を読むことにより、本出願が関連する当該技術分野の当業者に明らかとなろう。

ブタモデルにおいて、変化するＤＮＡの量および容積に関するルシフェラーゼ発現を説明する図表である。 ＳＤＦ−１注入３０日後のうっ血性心不全のブタモデルを使用した、種々の量のＳＤＦ−プラスミドに関する左室収縮末期容積変化％を説明する図表である。 ＳＤＦ−１注入３０日後のうっ血性心不全のブタモデルを使用した、種々の量のＳＤＦ−プラスミドに関する左室駆出率変化％を説明する図表である。 ＳＤＦ−１注入３０日後のうっ血性心不全のブタモデルを使用した、種々の量のＳＤＦ−プラスミドに関する壁運動スコア指数変化％を説明する図表である。 ＳＤＦ−１注入９０日後のうっ血性心不全のブタモデルを使用した、種々の量のＳＤＦ−プラスミドに関する左室収縮末期容積変化％を説明する図表である。 ＳＤＦ−１注入３０日後のうっ血性心不全のブタモデルを使用した、種々の量のＳＤＦ−プラスミドに関する血管密度変化％を説明する図表である。 本出願の一態様によるプラスミドベクターの概略図である。 ブタ心臓の実質的部分上のプラスミド発現を示す画像である。 ベースラインおよび初回注入３０日後における左室収縮末期容積を説明する図表である。全群が３０日で類似の左室収縮末期容積の増加を示している。全データ点についてＮ＝３である。データは、平均値±ＳＥＭとして示される。 ベースラインおよび初回注入３０日後における左室駆出率を説明する図表である。全群が左室駆出率の改善の欠如を示している。全データ点についてＮ＝３である。データは、平均値±ＳＥＭとして示される。

特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て本出願が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を持つ。特に注記しない限り、本明細書の全開示中に言及される全ての特許、特許出願、公開出願および刊行物、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、ウェブサイトならびに他の出版物は、その全内容が参照により組み込まれている。本明細書の用語について複数の定義が存在する場合には、本節の定義が優先する。特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語は全て本出願が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を持つ。一般的に理解されている分子生物学用語の定義は、例えば、Ｒｉｅｇｅｒ等、Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、第５版、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ：ニューヨーク、１９９１；およびＬｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク、１９９４に見出すことができる。

従来の分子生物学技術を伴う方法が本明細書中に記載されている。このような技術は、当技術分野で一般的に知られており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ等編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、１９９２（周期的更新を含む）などの方法論の論文に詳細に記載されている。核酸の化学合成法は、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９〜１８６２、１９８１およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５、１９８１に論じられている。核酸の化学合成は、例えば、市販の自動式オリゴヌクレオチド合成装置で行うことができる。免疫学的方法（例えば、抗原特異的抗体の調製、免疫沈降法および免疫ブロット法）は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎ等編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ等編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９２に記載されている。従来の遺伝子導入および遺伝子治療の方法を本出願での使用に適合させることもできる。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｔ．Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９９９；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｐ．Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９７；およびＲｅｔｒｏ−ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｃ．Ｐ．Ｈｏｄｇｓｏｎ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９９６を参照されたい。

ＵＲＬまたは他のこのような識別子もしくはアドレスが言及される場合、このような識別子は変化することがあり、インターネット上の特定の情報は移り変わることがあるが、インターネットを検索することにより同等の情報を見出すことができることが理解される。それらの参照が、このような情報の入手可能性および公開普及の証拠となる。

本明細書で使用する「核酸」は、少なくとも２個の共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体サブユニットを含有するポリヌクレオチドを指す。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体であり得る。ヌクレオチド類似体は、商業的に入手可能であり、このようなヌクレオチド類似体を含有するポリヌクレオチドを調製する方法は既知である（Ｌｉｎ等（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５２２０〜５２３４；Ｊｅｌｌｉｎｅｋ等（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１３６３〜１１３７２；Ｐａｇｒａｔｉｓ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８〜７３）。核酸は、一本鎖、二本鎖またはこれらの混合物であり得る。本明細書の目的のために、特に明示しない限り、核酸は二本鎖である、またはそれは文脈から明らかである。

本明細書で使用する「ＤＮＡ」は、ｃＤＮＡ、プラスミドならびに修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むＤＮＡを含む、全ての種類および大きさのＤＮＡ分子を含むことになっている。

本明細書で使用する「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド一リン酸、二リン酸および三リン酸を含む。ヌクレオチドはまた、それだけに限定されないが、ホスホロチオエートヌクレオチドおよびデアザプリンヌクレオチドおよび他のヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含む。

本明細書で使用する「被験体」または「患者」という用語は、大型ＤＮＡ分子を導入することができる動物を指す。ヒト、霊長動物、齧歯動物、ウシ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、ニワトリなどを含む哺乳動物および鳥類などの高等生物が含まれる。

本明細書で使用する「大型哺乳動物」は、典型的な成体重量が少なくとも１０ｋｇである哺乳動物を指す。このような大型哺乳動物には、例えば、ヒト、霊長動物、イヌ、ブタ、ウシが含まれ、マウス、ラット、モルモットおよび他の齧歯動物などの小型動物は除外することになっている。

本明細書で使用する「被験体に投与する」は、１つもしくは複数の送達薬剤および／または大型核酸分子を、共にまたは別々に、被験体に導入または適用して、被験体中に存在する標的細胞が、最終的に薬剤および／または大型核酸分子と接触するようにする手順である。

本明細書で使用する「送達」は、「形質導入」と互換的に使用されるが、外因性核酸分子を細胞に導入し、それらが細胞内部に位置するようにする過程を指す。核酸の送達は、核酸の発現とは異なる過程である。

本明細書で使用する「マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）」は、複数の制限酵素部位を含有するプラスミド中の核酸領域であり、その複数の制限酵素部位のいずれを標準的組換え技術と組み合わせて使用してもベクターを消化することができる。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特定の位置でのみ機能する酵素による、核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは、商業的に入手可能である。このような酵素の使用は、当業者に広く理解されている。しばしば、ＭＣＳ中で切断する制限酵素を使用して、ベクターを直線化または断片化して、外因性配列がベクターと連結するのを可能にする。

本明細書で使用する「複製起点（通常、「ｏｒｉ」と呼ばれる）」は、複製が開始される特定の核酸配列である。あるいは、宿主細胞が酵母である場合には、自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。

本明細書で使用する「選択マーカーまたは選別マーカー」は、同定可能な変化を細胞に与えて、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にする。一般的に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を与えるものである。正の選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものである一方で、負の選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。正の選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。

通常、薬剤選択マーカーの包含は、形質転換体のクローニングおよび同定を助け、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子は、有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、その基礎が熱量分析であるＧＦＰなどの選別マーカーを含む他の種類のマーカーも熟慮される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの選別酵素が使用され得る。当業者はまた、おそらくＦＡＣＳ分析と組み合わせた免疫マーカーの使用の仕方を知っているだろう。使用するマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現させることができさえすれば、重要ではないと考えられる。選択マーカーおよび選別マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。

「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性ＤＮＡの取り込みを指すために使用される。外因性ＤＮＡが細胞膜に導入された場合に、細胞は「トランスフェクト」されたことになる。いくつかのトランスフェクション技術は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；Ｄａｖｉｓ等、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）；Ｃｈｕ等、Ｇｅｎｅ １３：１９７（１９８１）を参照されたい。このような技術を使用して、ヌクレオチド組み込み型ベクターおよび他の核酸分子などの１つまたは複数の外因性ＤＮＡ成分を、適当な宿主細胞に導入することができる。この用語は、化学的、電気的およびウイルス媒介トランスフェクション手順を取り込んでいる。

本明細書で使用する「発現」は、核酸がペプチドに翻訳される、または例えば、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳され得るＲＮＡに転写される過程を指す。核酸がゲノムＤＮＡ由来である場合、発現は、適当な真核宿主細胞または生物が選択された場合には、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。宿主細胞中で異種核酸を発現させるためには、まずそれを細胞に送達させ、いったん細胞中に行ったら、次いで、最終的に核中に存在しなければならない。

本明細書で使用する「遺伝的治療」は、治療もしくは診断が求められている障害または状態を有する哺乳動物、特にヒトの細胞への異種ＤＮＡの導入を伴う。ＤＮＡは、異種ＤＮＡが発現し、それによりコードされる治療用産物が産生されるように、選択された標的細胞に導入される。あるいは、異種ＤＮＡは、ある方法で、治療用産物をコードするＤＮＡの発現を媒介し得る；それは、ある方法で、直接的にまたは間接的に、治療用産物の発現を媒介するペプチドまたはＲＮＡなどの産物をコードし得る。遺伝的治療を使用して、欠陥遺伝子を取り替える、または導入される哺乳動物もしくは細胞により産生される遺伝子産物を補充するために、遺伝子産物をコードする核酸を送達することもできる。導入される核酸は、哺乳動物宿主中で通常は産生されない、または治療上有効量もしくは治療上有用な時に産生されない、その成長因子阻害剤または腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤、例えばその受容体などの治療用化合物をコードし得る。治療用産物をコードする異種ＤＮＡは、該産物もしくはその発現を増強するまたは変化させるために、罹患宿主の細胞への導入前に修飾することができる。

本明細書で使用する「異種核酸配列」は、典型的には、それが発現する細胞により生体内で通常は産生されないＲＮＡまたはタンパク質をコードする、あるいは転写、翻訳もしくは他の調節可能な生化学的過程に影響を及ぼすことにより内因性ＤＮＡの発現を変化させる媒介物質を媒介またはコードするＤＮＡである。異種核酸配列は、外来性ＤＮＡとも呼ばれ得る。当業者が、それが発現する細胞にとって異種性もしくは外来性であると認識するまたはみなす任意のＤＮＡは、本明細書中で異種ＤＮＡに包含される。異種ＤＮＡの例としては、それだけに限定されないが、薬剤耐性を与えるタンパク質などの追跡可能なマーカーをコードするＤＮＡ、抗がん剤、酵素およびホルモンなどの治療上有効な物質をコードするＤＮＡ、ならびに抗体などの他の種類のタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。異種ＤＮＡによりコードされる抗体は、異種ＤＮＡが導入された細胞の表面上で分泌または発現され得る。

本明細書で使用する「心筋症」という用語は、任意の理由による心筋（すなわち、実際の心臓の筋肉）の機能の悪化を指す。心筋症の被験体は、多くの場合、不整脈、心臓性突然死、または心不全による入院もしくは死亡のリスクがある。

本明細書で使用する「虚血性心筋症」という用語は、冠動脈疾患が最も一般的な原因である、心筋への不十分な酸素運搬による心臓の筋肉の衰弱である。

本明細書で使用する「虚血性心疾患」という用語は、血液供給の欠如もしくは相対的欠乏のために心臓筋が損傷したまたは非効率的に働く任意の状態を指す；最も一般的にはアテローム性動脈硬化症により引き起こされ、狭心症、急性心筋梗塞、慢性虚血性心疾患および突然死が含まれる。

本明細書で使用する「心筋梗塞」という用語は、心臓筋（心筋）の領域への血液供給の遮断による該領域の損傷または死を指す。

本明細書で使用する「６分間歩行テスト」または「６ＭＷＴ」という用語は、患者が６分間の間に平坦な固い面を速く歩くことができる距離（６ＭＷＤ）を測定する検査を指す。この検査は、肺および心血管系、体循環、末梢循環、血液、神経筋単位ならびに筋肉代謝を含む、運動中に関与する全ての系の全体的かつ統合された応答を評価する。この検査は、最大心肺運動負荷試験で可能であるような、運動に関与する異なる器官および系の各々の機能、または運動制限の機構についての特定の情報は提供しない。自己ペース６ＭＷＴは、機能的能力の最大下レベルを評価する。（例えば、ＡＭ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、第１６６巻、１１１〜１１７頁（２００２）を参照されたい）。

本明細書で使用する「ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類」は、心不全の程度についての分類を指す。この分類は、患者が身体活動中にどれほど制限されるかに基づいて、患者を４つの分類の１つに置く；制限／症状は、正常呼吸ならびに息切れおよび／または狭心痛の変化する程度に関するものである。

本出願は、心筋機能の低下および／または障害をもたらす被験体の心筋症を治療する組成物および方法に関する。本明細書中の組成物および方法により治療される心筋症は、肺塞栓、静脈血栓症、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、末梢血管障害、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患および／または他の心筋傷害もしくは血管病に伴う心筋症が含まれ得る。心筋症を治療する方法は、心筋梗塞後の心臓の梗塞周囲領域などの衰弱心筋組織、虚血性心筋組織および／またはアポトーシス性心筋組織に、以下のパラメーター：左室容積、左室面積、左室径、心機能、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）またはニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類の少なくとも１つにおける機能改善をもたらすのに有効な量のストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）を、局所的に投与する（または局所的に送達する）ステップを含み得る。

ヒトの心不全を模倣する心不全のブタモデルを使用して、虚血性心筋組織の機能改善が、虚血性心筋組織に投与されるＳＤＦ−１の量、用量および／または送達に依存すること、ならびに虚血性心筋組織に対するＳＤＦ−１の量、用量および／または送達を、左室容積、左室面積、左室径または心機能などの心筋機能的パラメーターが実質的に改善されるよう最適化することができることが分かった。以下に論じるように、いくつかの態様では、有害な副作用を軽減しながら、機能的パラメーター（例えば、左室容積、左室面積、左室径、心機能、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）および／またはニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類）を実質的に改善するように、虚血性心筋組織に投与されるＳＤＦ−１の量、濃度および容積を、調節および／または最適化することができる。

一実施例では、心筋梗塞などの虚血性心筋症の結果として左室容積、左室面積、左室径もしくは心機能などの心臓の機能的パラメーターの増悪または悪化が存在する大型哺乳動物（例えば、ブタまたはヒト）の心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に、ＳＤＦ−１を直接または局所投与することができる。機能的パラメーターの増悪または悪化には、例えば、心エコー法を使用して測定される、例えば、左室収縮末期容積の増加、左室駆出率の減少、壁運動スコア指数の増加、左室拡張末期長の増加、左室収縮末期長の増加、左室拡張末期面積（例えば、僧帽弁レベルおよび乳頭筋挿入レベル）の増加、左室収縮末期面積（例えば、僧帽弁レベルおよび乳頭筋挿入レベル）の増加または左室拡張末期容積の増加が含まれ得る。

本出願の一態様では、大型哺乳動物の心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、例えば、心エコー法を使用して測定される、左室収縮末期容積の減少、左室駆出率の増加、壁運動スコア指数の減少、左室拡張末期長の減少、左室収縮末期長の減少、左室拡張末期面積（例えば、僧帽弁レベルおよび乳頭筋挿入レベル）の減少、左室収縮末期面積（例えば、僧帽弁レベルおよび乳頭筋挿入レベル）の減少または左室拡張末期容積の減少などの少なくとも１つの心筋の機能的パラメーターを改善する、ならびに被験体の６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）またはニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類を改善するのに有効な量であり得る。

本出願の別の態様では、心筋症の大型哺乳動物の心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、心エコー法により測定される投与３０日後の哺乳動物の左室収縮末期容積を少なくとも約１０％、より具体的には少なくとも約１５％改善するのに有効である。改善パーセントは、処理される各被験体に対するものであり、治療介入もしくは治療の前または時点で測定されるそれぞれのパラメーターに基づく。

本出願のさらなる態様では、心筋症の大型哺乳動物の心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、心エコー法により測定される投与３０日後の左室収縮末期容積を少なくとも約１０％改善し、左室駆出率を少なくとも約１０％改善し、かつ壁運動スコア指数を少なくとも約５％改善するのに有効である。

本出願のなおさらなる態様では、心筋症の大型哺乳動物の心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の脈管形成を、血管密度またはＳＰＥＣＴイメージングにより測定される心臓灌流の増加に基づき、少なくとも約２０％改善するのに有効である。脈管形成の２０％の改善は、臨床的に有意であることが示された（Ｌｏｓｏｒｄｏ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００２；１０５：２０１２）。

本出願のなおさらなる態様では、心筋症の大型哺乳動物の心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１の量は、６分間歩行距離を少なくとも約３０メートル改善する、またはＮＹＨＡクラスを少なくとも１クラス改善するのに有効である。

本明細書に記載のＳＤＦ−１は、組織傷害（例えば、心筋梗塞）後からＳＤＦ−１の下方制御開始約数時間後、数日後、数週後または数月後に心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。ＳＤＦ−１が細胞に投与される期間には、心筋症（例えば、心筋梗塞）のほぼ発症直後から、虚血性障害もしくは組織傷害の発症約数日後、数週後または数月後までが含まれ得る。

心筋組織梗塞周囲領域の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与される本出願によるＳＤＦ−１は、野生の哺乳動物ＳＤＦ−１アミノ酸配列と実質的に類似のアミノ酸配列を有し得る。ヒト、マウスおよびラットを含むいくつかの異なる哺乳動物ＳＤＦ−１タンパク質のアミノ酸配列が知られている。ヒトおよびラットのＳＤＦ−１アミノ酸配列は、少なくとも約９２％同一（例えば、約９７％同一）である。ＳＤＦ−１は、２種のアイソフォーム、ＳＤＦ−１アルファおよびＳＤＦ−１ベータを含み得るが、特に識別しない限りは、本明細書中では両者をＳＤＦ−１と呼ぶ。

ＳＤＦ−１は、配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。過剰発現しているＳＤＦ−１はまた、前記哺乳動物ＳＤＦ−１タンパク質の１つと実質的に類似のアミノ酸配列を有し得る。例えば、過剰発現しているＳＤＦ−１は、配列番号２と実質的に類似のアミノ酸配列を有し得る。配列番号１を実質的に含む配列番号２は、ヒトＳＤＦ−１のアミノ酸配列であり、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ９５４６３７により識別される。過剰発現しているＳＤＦ−１はまた、配列番号３と実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。配列番号３は、ラットＳＤＦのアミノ酸配列を含み、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＡＦ０１０６６により識別される。

本出願によるＳＤＦ−１はまた、哺乳動物ＳＤＦ−１の断片、類似体および誘導体などの哺乳動物ＳＤＦ−１の変異型であり得る。このような変異型には、例えば、野生ＳＤＦ−１遺伝子（すなわち、天然型哺乳動物ＳＤＦ−１ポリペプチドをコードする天然型核酸）の天然型対立遺伝子変異型によりコードされるポリペプチド、野生ＳＤＦ−１遺伝子の代替スプライシング型によりコードされるポリペプチド、野生ＳＤＦ−１遺伝子のホモログまたはオルソログによりコードされるポリペプチド、および野生ＳＤＦ−１遺伝子の非天然型変異型によりコードされるポリペプチドが含まれる。

ＳＤＦ−１変異型は、１個または複数個のアミノ酸が野生ＳＤＦ−１ポリペプチドと異なるペプチド配列を有する。このような変異型のペプチド配列は、ＳＤＦ−１変異型の１個もしくは複数個のアミノ酸の欠失、付加または置換を特徴とし得る。アミノ酸挿入は、好ましくは約１〜４個の隣接アミノ酸からなり、欠失は、好ましくは約１〜１０個の隣接アミノ酸からなる。変異型ＳＤＦ−１ポリペプチドは、野生ＳＤＦ−１機能活性を実質的に維持している。ＳＤＦ−１ポリペプチド変異型の例は、静かなまたは保存的な変化を特徴とする核酸分子を発現させることにより作成することができる。ＳＤＦ−１変異型の１つの例は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７４０５１９５号に列挙されている。

１種もしくは複数種の特定のモチーフおよび／またはドメイン、あるいは任意のサイズに対応するＳＤＦ−１ポリペプチド断片は、本出願の範囲内である。単離されたＳＤＦ−１のペプチジル部分は、このようなペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換えで作成したペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。例えば、ＳＤＦ−１ポリペプチドは、任意で断片の重複のない所望の長さの断片に分割する、または好ましくは所望の長さの重複断片に分割することができる。断片は、組換えで作成し、そのペプチジル断片を同定するために試験することができ、野生ＣＸＣＲ−４ポリペプチドのアゴニストとして機能することができる。

ＳＤＦ−１ポリペプチドの変異型はまた、ＳＤＦ−１ポリペプチドの組換え型を含むこともできる。いくつかの実施形態における組換えポリペプチドは、ＳＤＦ−１ポリペプチドに加えて、哺乳動物ＳＤＦ−１をコードする遺伝子の核酸配列との少なくとも７０％の配列同一性を有し得る核酸によりコードされる。

ＳＤＦ−１変異型は、野生ＳＤＦ−１の機能活性を恒常的に発現するタンパク質のアゴニスト型を含むことができる。他のＳＤＦ−１変異型は、例えば、プロテアーゼ標的配列を変える突然変異のために、タンパク質分解性切断に耐性のものを含むことができる。ペプチドのアミノ酸配列における変化が、１つまたは複数の野生ＳＤＦ−１の機能活性を有する変異型をもたらすかどうかは、野生ＳＤＦ−１機能活性について変異型を試験することにより容易に決定することができる。

ＳＤＦ−１タンパク質をコードするＳＤＦ−１核酸は、野生または非野生核酸であり得、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡ）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖の場合、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。ＳＤＦ−１をコードする核酸コード配列は、配列番号４および配列番号５に示されるヌクレオチド配列などの、ＳＤＦ−１遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に類似であり得る。配列番号４および配列番号５は、それぞれ、ヒトＳＤＦ−１およびラットＳＤＦ−１の核酸配列を含み、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＭ１９９１６８およびＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ１８９７２４のヌクレオチド配列と実質的に類似である。ＳＤＦ−１の核酸コード配列はまた、遺伝暗号の冗長性または縮重の結果として、配列番号１、配列番号２および配列番号３と同じポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。

ＳＤＦ−１をコードする他の核酸分子は、野生ＳＤＦ−１の断片、類似体および誘導体をコードするものなどの、野生ＳＤＦ−１の変異型である。このような変異型は、例えば、野生ＳＤＦ−１遺伝子の天然型対立遺伝子変異型、野生ＳＤＦ−１遺伝子のホモログもしくはオルソログ、または野生ＳＤＦ−１遺伝子の非天然型変異型であり得る。これらの変異型は、１個または複数個の塩基が野生ＳＤＦ−１遺伝子と異なるヌクレオチド配列を有する。例えば、このような変異型のヌクレオチド配列は、野生ＳＤＦ−１遺伝子の１個もしくは複数個のヌクレオチドの欠失、付加または置換を特徴とし得る。核酸挿入は、好ましくは約１〜１０個の隣接ヌクレオチドからなり、欠失は、好ましくは約１〜１０個の隣接ヌクレオチドからなる。

他の用途では、構造における実質的な変化を示す変異型ＳＤＦ−１を、コードされるポリペプチドにおける保存的変化を決してもたらさないヌクレオチド置換を作り出すことにより作成することができる。このようなヌクレオチド置換の例は、（ａ）ポリペプチド主鎖の構造；（ｂ）ポリペプチドの電荷もしくは疎水性；または（ｃ）アミノ酸側鎖の嵩、における変化をもたらすものである。タンパク質特性における最も大きな変化を生み出すと一般的に予測されるヌクレオチド置換は、コドンの非保存的変化をもたらすものである。タンパク質構造の主要な変化をもたらしそうなコドンの変化の例は、（ａ）疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニン）による親水性残基（例えば、セリンもしくはスレオニン）の；（ｂ）任意の他の残基によるシステインもしくはプロリンの；（ｃ）電気陰性残基（例えば、グルタミンもしくはアスパルチン（ａｓｐａｒｔｉｎｅ））による電気陽性側鎖を有する残基（例えば、リジン、アルギニンもしくはヒスチジン）の；または（ｄ）側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）による嵩高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）の置換をもたらすものである。

野生ＳＤＦ−１遺伝子の天然型対立遺伝子変異型は、野生ＳＤＦ−１遺伝子との少なくとも７０％の配列同一性を有し、野生ＳＤＦ−１ポリペプチドとの構造的類似性を有するポリペプチドをコードする、哺乳動物組織から単離される核酸である。野生ＳＤＦ−１遺伝子のホモログは、野生遺伝子との少なくとも７０％の配列同一性を有し、野生ＳＤＦ−１ポリペプチドとの構造的類似性を有するポリペプチドをコードする、他の種から単離される核酸である。公開および／または所有核酸データベースを検索して、野生ＳＤＦ−１遺伝子との高いパーセント（例えば、７０％以上）の配列同一性を有する他の核酸分子を同定することができる。

非天然型ＳＤＦ−１遺伝子変異型は、自然には生じず（例えば、人の手により作成される）、野生ＳＤＦ−１遺伝子との少なくとも７０％の配列同一性を有し、野生ＳＤＦ−１ポリペプチドとの構造的類似性を有するポリペプチドをコードする核酸である。非天然型ＳＤＦ−１遺伝子変異型の例は、野生ＳＤＦ−１タンパク質の断片をコードするもの、ストリンジェントな条件下で野生ＳＤＦ−１遺伝子または野生ＳＤＦ−１遺伝子の相補鎖とハイブリッド形成するもの、および野生ＳＤＦ−１遺伝子または野生ＳＤＦ−１遺伝子の相補鎖と少なくとも６５％の配列同一性を共有するものである。

いくつかの実施形態で野生ＳＤＦ−１遺伝子の断片をコードする核酸は、野生ＳＤＦ−１のアミノ酸残基をコードするものである。野生ＳＤＦ−１の断片をコードする核酸をコードするまたはこれとハイブリッド形成するより短いオリゴヌクレオチドは、プローブ、プライマーまたはアンチセンス分子として使用することができる。野生ＳＤＦ−１の断片をコードする核酸をコードするまたはこれとハイブリッド形成するより長いポリヌクレオチドもまた、本出願の種々の態様で使用することができる。野生ＳＤＦ−１の断片をコードする核酸は、完全長野生ＳＤＦ−１遺伝子もしくはその変異型の酵素消化（例えば、制限酵素を使用する）または化学分解により作成することができる。

ストリンジェントな条件下で前記核酸の１つとハイブリッド形成する核酸も本明細書で使用することができる。例えば、このような核酸は、低ストリンジェントな条件、中程度ストリンジェントな条件または高ストリンジェントな条件下で前記核酸の１つとハイブリッド形成するものであり得る。

いくつかの実施形態では、ＳＤＦ−１融合タンパク質をコードする核酸分子も使用され得る。このような核酸は、適当な標的細胞に導入するとＳＤＦ−１融合タンパク質を発現する構築物（例えば、発現ベクター）を調製することにより作成することができる。例えば、このような構築物は、フレーム中で融合するＳＤＦ−１タンパク質をコードする第１ポリヌクレオチドを、別のタンパク質をコードする第２ポリヌクレオチドと連結して、適当な発現系における構築物の発現が融合タンパク質をもたらすようにすることにより作成することができる。

ＳＤＦ−１をコードする核酸は、例えば、分子の安定性、ハイブリッド形成等を向上させるために、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で修飾することができる。本明細書に記載の核酸は、（例えば、生体内で標的細胞受容体を標的化するための）ペプチドなどの他の付加基、または細胞膜を横切る輸送、ハイブリッド形成誘引切断を促進する剤をさらに含み得る。このために、核酸は、別の分子（例えば、ペプチド）、ハイブリッド形成誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリッド形成誘引切断剤等と結合され得る。

ＳＤＦ−１は、ＳＤＦ−１タンパク質を衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することにより、あるいはＳＤＦ−１の発現を引き起こす、増加させるおよび／または上方制御する剤（すなわち、ＳＤＦ−１剤）を心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の細胞に導入することにより、心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に送達することができる。細胞から発現するＳＤＦ−１タンパク質は、遺伝子組換え細胞の発現産物であり得る。

ＳＤＦ−１の発現を引き起こす、増加させるおよび／または上方制御する剤は、心筋組織の細胞への導入および該細胞中での複製が可能な、組換え核酸構築物、典型的にはＤＮＡ構築物に組み込まれる、本明細書に記載の天然または合成核酸を含むことができる。このような構築物は、複製系、ならびに所与の細胞中でペプチドコード配列の転写および翻訳が可能な配列を含むことができる。

前記剤を標的細胞に導入する１つの方法は、遺伝子治療を使用するステップを含む。本出願のいくつかの実施形態で、遺伝子治療を使用して、生体内で心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の細胞からＳＤＦ−１タンパク質を発現させることができる。

本出願の一態様では、遺伝子治療は、ＳＤＦ−１タンパク質をコードするヌクレオチドを含むベクターを使用することができる。「ベクター」（時々、遺伝子送達または遺伝子導入「媒体」と呼ばれる）は、試験管内もしくは生体内のいずれかの標的細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子治療で対象となるコード配列を含み得る。ベクターには、例えば、ウイルスベクター（アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルスなど）、非ウイルスベクター、リポソーム、および他の脂質含有複合体、および標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することができる他の巨大分子複合体が含まれる。

ベクターはまた、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節するあるいは標的化細胞に有益な特性を提供する、他の成分または機能性を含むことができる。このような他の成分には、例えば、細胞に対する結合または標的化に影響を及ぼす成分（細胞型もしくは組織特異的結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす成分；取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分（核局在化を媒介する剤など）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分が含まれる。このような成分はまた、ベクターにより送達される核酸を取り込んで発現している細胞を検出または選択するために使用することができる、検出可能なマーカーおよび／または選択マーカーなどのマーカーを含み得る。このような成分を、ベクターの自然の特徴として提供することができるか（結合および取り込みを媒介する成分または機能性を有する特定のウイルスベクターの使用など）、またはベクターを修飾してこのような機能性を提供することができる。

選択マーカーは、正、負または二機能性であり得る。正の選択マーカーは、マーカーを保有している細胞の選択を可能にする一方で、負の選択マーカーは、マーカーを保有している細胞を選択的に除去することを可能にする。二機能性（すなわち、正／負の）マーカーを含む、種々のこのようなマーカー遺伝子が記載されてきた（例えば、１９９２年５月２９日に公開されたＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．、ＷＯ９２／０８７９６；および１９９４年１２月８日に公開されたＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．、ＷＯ９４／２８１４３参照）。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の状況において有利であり得る追加の調節手段をもたらすことができる。多種多様のこのようなベクターは、当技術分野で既知であり、一般的に入手可能である。

本明細書で使用するためのベクターには、ヌクレオチドを心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の細胞に送達することができるウイルスベクター、脂質を用いたベクターおよび他の非ウイルスベクターが含まれる。ベクターは、標的化ベクター、特に、心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の細胞に優先的に結合する標的化ベクターであり得る。本明細書中の方法で使用するためのウイルスベクターには、心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の細胞に対して示す毒性が低く、組織特異的な方法で治療上有用量のＳＤＦ−１タンパク質の産生を誘導するものが含まれ得る。

ウイルスベクターの例は、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から得られるものである。ヒトおよび非ヒトウイルスベクターの両方を使用することができ、組換えウイルスベクターはヒト中で複製欠損性であり得る。ベクターがアデノウイルスの場合、ベクターは、ＳＤＦ−１タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）プロモーターを有するポリヌクレオチドを含むことができ、ヒト中で複製欠損性である。

本出願の方法にしたがって使用することができる他のウイルスベクターには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を用いたベクターが含まれる。１つまたは複数の前初期遺伝子（ＩＥ）を欠失させたＨＳＶは、一般的に非細胞毒性であり、標的細胞中で潜伏と類似の状態で生き残り、効率的な標的細胞形質導入を与えるので有利である。組換えＨＳＶベクターは、約３０ｋｂの異種核酸を組み込むことができる。

本出願のいくつかの実施形態では、Ｃ型レトロウイルスおよびレンチウイルスなどのレトロウイルスを使用することもできる。例えば、レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）を用いたものであり得る。例えば、ＨｕおよびＰａｔｈａｋ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５２：４９３〜５１１、２０００ならびにＦｏｎｇ等、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１７：１〜６０、２０００を参照されたい。ＭＬＶを用いたベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに８ｋｂまでの異種（治療用）ＤＮＡを含み得る。異種ＤＮＡは、組織特異的プロモーターおよびＳＤＦ−１核酸を含み得る。創傷に近接する細胞への送達方法において、このベクターはまた、組織特異的受容体に対するリガンドをコードし得る。

使用され得る追加のレトロウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を用いたベクターを含む、複製欠損レンチウイルスを用いたベクターである。例えば、ＶｉｇｎａおよびＮａｌｄｉｎｉ、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．５：３０８〜３１６、２０００ならびにＭｉｙｏｓｈｉ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０〜８１５７、１９９８を参照されたい。レンチウイルスベクターは、活発な分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することができるという点で有利である。レンチウイルスベクターはまた、ヒト上皮細胞の形質導入に極めて優れている。

本明細書中の方法で使用するためのレンチウイルスベクターは、ヒトおよび非ヒト（ＳＩＶを含む）レンチウイルスから得られるものであり得る。レンチウイルスベクターの例は、ベクター伝播に必要とされる核酸配列ならびにＳＤＦ−１遺伝子と作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含む。これらの前者は、ウイルスＬＴＲ、プライマー結合部位、ポリプリントラクト、ａｔｔ部位およびカプシド形成部位を含み得る。

レンチウイルスベクターは、任意の適当なレンチウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。ある粒子タンパク質の、異なるウイルス由来の別のタンパク質による置換は、「シュードタイピング」と呼ばれる。ベクターカプシドは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含む他のウイルス由来のウイルス外被タンパク質を含有し得る。ＶＳＶ Ｇ−タンパク質の使用は、高いベクター力価をもたらし、ベクターウイルス粒子のより高い安定性をもたらす。

セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）から作られるものなどのアルファウイルスを用いたベクターも本明細書で使用され得る。アルファウイルスの使用は、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４３：２４７〜２５７、２０００およびＰｅｒｒｉ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：９８０２〜９８０７、２０００に記載されている。

組換え、複製欠損アルファウイルスベクターは、高レベルの異種（治療用）遺伝子発現が可能であり、広範囲の標的細胞に感染することができるので有利である。アルファウイルスレプリコンは、同族結合相手を発現する標的細胞への選択的結合を可能にする機能的異種リガンドまたは結合ドメインをそのウイルス粒子表面に示すことにより特定の細胞型に標的化され得る。アルファウイルスレプリコンは、標的細胞中で、潜伏性の、それゆえに長期の異種核酸発現を確立し得る。レプリコンはまた、標的細胞中で一過性の異種核酸発現を示し得る。

本出願の方法に適合性のウイルスベクターの多くでは、ベクター中に２つ以上のプロモーターを含ませて、ベクターが２つ以上の異種遺伝子を発現するのを可能にすることができる。さらに、ベクターは、標的細胞からのＳＤＦ−１遺伝子産物の発現を促進するシグナルペプチドまたは他の部分をコードする配列を含むことができる。

２つのウイルスベクター系の有利な特性を組み合わせるために、ハイブリッドウイルスベクターを使用してＳＤＦ−１核酸を標的組織に送達してもよい。ハイブリッドベクターを構築するための標準的技術は、当業者に周知である。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．または組換えＤＮＡ技術について論じるいくつもの実験室マニュアル中に見出すことができる。ＡＡＶおよびアデノウイルスＩＴＲの組み合わせを含有するアデノウイルスカプシド中の二本鎖ＡＡＶゲノムを使用して細胞に形質導入してもよい。別のバリエーションでは、ＡＡＶベクターを、「ｇｕｔｌｅｓｓ」、「ヘルパー依存性」または「高能力」アデノウイルスベクターに入れてもよい。アデノウイルス／ＡＡＶハイブリッドベクターは、Ｌｉｅｂｅｒ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３１４〜９３２４、１９９９に論じられている。レトロウイルス／アデノウイルスハイブリッドベクターは、Ｚｈｅｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１７６〜１８６、２０００に論じられている。アデノウイルス中に含有されるレトロウイルスゲノムは、標的細胞ゲノムと統合されて安定なＳＤＦ−１遺伝子発現をもたらし得る。

ＳＤＦ−１遺伝子の発現およびベクターのクローンニングを促進する他のヌクレオチド配列要素をさらに熟考する。例えば、プロモーターの上流のエンハンサーまたはコード領域の下流のターミネーターの存在は、発現を促進することができる。

本出願の別の態様によると、組織特異的プロモーターをＳＤＦ−１遺伝子に融合させることができる。このような組織特異的プロモーターをアデノウイルス構築物中に融合させることにより、導入遺伝子発現が特定の組織に制限される。組織特異的プロモーターにより提供される遺伝子発現の効率および特異性の程度は、本明細書に記載の組換えアデノウイルス系を使用して決定することができる。

ウイルスベクターを用いた方法に加えて、非ウイルス法を使用してＳＤＦ−１核酸を標的細胞に導入してもよい。遺伝子送達の非ウイルス法の概要は、ＮｉｓｈｉｋａｗａおよびＨｕａｎｇ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：８６１〜８７０、２００１に提供されている。本発明による非ウイルス遺伝子送達法の例は、プラスミドＤＮＡを使用してＳＤＦ−１核酸を細胞に導入する。プラスミドを用いた遺伝子送達法は、当技術分野で一般的に知られている。一実施例では、プラスミドベクターは、図７に概略的に示す構造を有することができる。図７のプラスミドベクターは、ＳＤＦ−１α ｃＤＮＡ（ＲＮＡ）配列の上流にＣＭＶエンハンサーおよびＣＭＶプロモーターを含む。

任意で、プラスミドＳＤＦ−１ ＤＮＡと多分子凝集体を形成するように合成遺伝子導入分子を設計することができる。これらの凝集体は、心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の細胞に結合するよう設計することができる。リポポリアミンを含むカチオン性両親媒性物質およびカチオン性脂質を使用して、受容体非依存的ＳＤＦ−１核酸を標的細胞（例えば、心筋細胞）に導入してもよい。さらに、予備形成カチオン性リポソームまたはカチオン性脂質をプラスミドＤＮＡと混合して、細胞トランスフェクト複合体を生成してもよい。カチオン性脂質製剤を伴う方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６〜１３９、１９９５ならびにＬａｓｉｃおよびＴｅｍｐｌｅｔｏｎ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２０：２２１〜２６６、１９９６に概説されている。遺伝子送達のために、ＤＮＡを両親媒性カチオン性ペプチドに結合させてもよい（Ｆｏｍｉｎａｙａ等、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２：４５５〜４６４、２０００）。

ウイルスおよび非ウイルス成分の両方を伴う方法が本明細書で使用され得る。例えば、治療用遺伝子送達のためのエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）を用いたプラスミドは、Ｃｕｉ等、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：１５０８〜１５１３、２００１に記載されている。さらに、アデノウイルスに結合したＤＮＡ／リガンド／ポリカチオン性補助剤を伴う方法は、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ．Ｔ．、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．１３：１４１〜１６４、１９９４に記載されている。

さらに、電気穿孔技術を使用して標的細胞にトランスフェクトすることにより、ＳＤＦ−１核酸を標的細胞に導入することができる。電気穿孔技術は周知であり、これを使用してプラスミドＤＮＡを使用した細胞のトランスフェクションを促進することができる。

ＳＤＦ−１の発現をコードするベクターは、必要に応じて、生理食塩水などの薬学的に許容される担体を含有する注入可能な製剤の形態で標的細胞に送達することができる。他の医薬担体、製剤および投与量も、本発明にしたがって使用することができる。

本発明の一態様では、ベクターは、例えば、図７などのＳＤＦ−１プラスミドを含むことができる。ＳＤＦ−１プラスミドは、左室容積、左室面積、左室径または心機能などの少なくとも１つの心筋機能的パラメーターを改善する、ならびに被験体の６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）またはニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類を改善するのに有効な量で、ＳＤＦ−１プラスミドベクターを心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に直接注入することにより、心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の細胞に送達することができる。ベクターを、心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に直接、あるいはこれらの領域の周辺近くに注入することにより、ベクタートランスフェクションをかなり効率的に標的化し、組換えベクターの損失を最小限にすることができる。この種の注入は、特に心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の近くでの所望の数の細胞の局所的トランスフェクションを可能にし、それにより、遺伝子導入の治療効率を最大化し、ウイルスタンパク質に対する炎症反応の可能性を最小限にする。

本出願の一態様では、ＳＤＦ−１プラスミドを、各注入が約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド／溶液を含むＳＤＦ−１発現プラスミドＤＮＡの溶液の複数回注入で衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。一実施例では、ＳＤＦ−１プラスミドを、少なくとも約１０回の注入、少なくとも約１５回の注入または少なくとも約２０回の注入で衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域へのＳＤＦ−１プラスミドの複数回注入は、より広い面積および／またはより多い数の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の細胞を治療することを可能にする。

衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与される各注入は、少なくとも約０．２ｍｌの容積を有し得る。少なくとも１つの心臓の機能的パラメーターを改善することができる衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１プラスミドの量を含む溶液の総容積は、少なくとも約１０ｍｌである。

一実施例では、ＳＤＦ−１プラスミドを、少なくとも約１０回の注入で衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与される各注入は、少なくとも約０．２ｍｌの容積を有し得る。ＳＤＦ−１は、約３日を超える間、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域で発現させることができる。

例えば、ＳＤＦ−１発現プラスミドを含む溶液の各注入は、少なくとも約０．２ｍｌの注入容積および１注入当たり約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド濃度を有し得る。本出願の別の態様では、少なくとも約１０箇所の注入部位中、１部位当たり少なくとも約０．２ｍｌの注入容積および１注入当たり約０．３３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド濃度で、ＳＤＦ−１プラスミドを心臓の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に注入することにより、少なくとも１つの心臓の機能的パラメーターを改善することができる。

約０．３３ｍｇ／ｍｌ未満または約５ｍｇ／ｍｌ超の濃度および１箇所の注入部位当たり約０．２ｍｌ未満の注射容積を有するＳＤＦ−１プラスミドの溶液の心不全のブタモデルへの注入が、処理心臓の左室容積、左室面積、左室径または心機能の機能改善をほとんどもたらさないことが、うっ血性心不全のブタモデルで分かった。

本出願の別の態様では、少なくとも１つの心臓の機能的パラメーターを改善することができる衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与されるＳＤＦ−１プラスミドの量は、１回の治療介入当たり約４ｍｇ超および約１００ｍｇ未満である。本明細書で治療介入により投与されるＳＤＦ−１プラスミドの量は、治療効果に影響するまたは治療効果を誘発するよう設計された治療手順中に被験体に投与される総ＳＤＦ−１プラスミドを指す。これは、特定の治療介入のために単回注入で投与される総ＳＤＦ−１プラスミドまたは治療介入のために複数回注入により投与される総ＳＤＦ−１プラスミドを含むことができる。ＳＤＦ−１プラスミドの直接注入による心臓への約４ｍｇのＳＤＦ−１プラスミドＤＮＡの投与が、処理心臓の左室容積、左室面積、左室径または心機能の機能改善をもたらさないことが、うっ血性心不全のブタモデルで分かった。さらに、ＳＤＦ−１プラスミドの直接注入による心臓への約１００ｍｇのＳＤＦ−１プラスミドＤＮＡの投与は、処理心臓の左室容積、左室面積、左室径または心機能の機能改善をもたらさなかった。

本出願のいくつかの態様では、ＳＤＦ−１を、ＳＤＦ−１プラスミドベクターによるトランスフェクション後に衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域で、治療上有効量または用量で約３日を超える間発現させることができる。３日を超える間の、治療上有効用量または量のＳＤＦ−１の発現は、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に治療効果をもたらすことができる。好都合には、ＳＤＦ−１を、ＳＤＦ−１プラスミドベクターによるトランスフェクション後に衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域で、治療上有効量で約９０日未満の間発現させて、被験体へのＳＤＦ−１の投与の治療効率を阻害し得る潜在的な慢性および／または細胞毒性効果を軽減することができる。

任意の一動物またはヒトに投与されるＳＤＦ−１プラスミドの量、容積、濃度および／または用量は、被験体の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、性別、投与の時間および経路、全身の健康ならびに同時に投与される他の薬物を含む多くの因子に依存することが認識されよう。ＳＤＦ−１プラスミドの上記量、容積、濃度および／または用量の特定のバリエーションは、下記の実験方法を使用して当業者により容易に決定され得る。

本出願の別の態様では、ＳＤＦ−１プラスミドは、心室内カテーテル法または心筋内カテーテル法などのカテーテル法を使用した直接注入により投与することができる。一実施例では、偏向可能なガイドカテーテル（ｄｅｆｌｅｃｔａｂｌｅ ｇｕｉｄｅ ｃａｔｈｅｔｅｒ）装置を、大動脈弁を横切って逆光して左室に進ませることができる。いったん装置を左室に配置したら、ＳＤＦ−１プラスミドを左室の梗塞周囲領域（中隔および外側の両側面）に注入することができる。典型的には、１．０ｍｌのＳＤＦ−１プラスミド溶液を、約６０秒の期間にわたって注入することができる。処理される被験体は、少なくとも約１０回の注入（例えば、合計で約１５〜約２０回の注入）を受けることができる。

ＳＤＦ−１プラスミドの投与前に被験体の心筋組織を画像化して、ＳＤＦ−１プラスミドの投与前に、衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の範囲を限定することができる。画像化による衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の限定は、より正確な衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域への、ＳＤＦ−１プラスミドの介入および標的化を可能にする。心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域を限定するために使用される画像化技術には、任意の既知の心臓画像化技術が含まれ得る。このような画像化技術には、例えば、心エコー法、核磁気共鳴画像法、冠血管造影、電気解剖学的マッピングまたは蛍光透視法の少なくとも１つが含まれ得る。衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域を限定することができる他の画像化技術も使用することができることが認識されよう。

任意で、ＳＤＦ−１核酸（例えば、ＳＤＦ−１プラスミド）以外の他の剤を心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に導入して衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の細胞からのＳＤＦ−１の発現を促進することができる。例えば、ＳＤＦ−１をコードする遺伝子の転写を増加させる剤、ＳＤＦ−１をコードするｍＲＮＡの翻訳を増加させる剤、および／またはＳＤＦ−１をコードするｍＲＮＡの分解を減少させる剤を使用して、ＳＤＦ−１タンパク質レベルを増加させることができるだろう。ＳＤＦ−１をコードする遺伝子の上流に外因性プロモーターを導入することにより、細胞内の遺伝子からの転写の速度を増加させることができる。異種遺伝子の発現を促進するエンハンサー要素を使用してもよい。

標的細胞に投与すると、心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域からのＳＤＦ−１の発現を上方制御することができる他の剤には、他のタンパク質、ケモカインおよびサイトカインが含まれ得る。このような剤には、例えば、間葉系肝細胞（ＭＳＣ）に投与するとＳＤＦ−１の発現を上方制御することが示されたインスリン様成長因子（ＩＧＦ）−１（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００８年１１月２１日；１０３（１１）：１３００〜９８）；成人の線維芽細胞に投与するとＳＤＦ−１の発現を上方制御することが示されたソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１１巻、第１１番、１１月２３日）；ヒト腹膜中皮細胞（ＨＰＭＣ）に投与するとＳＤＦ−１の発現を上方制御することが示されたトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）；初代ヒト骨芽細胞（ＨＯＢ）、混合骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）およびヒト骨芽細胞様細胞株に投与するとＳＤＦ−１の発現を上方制御することが示されたＩＬ−１β、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−αおよびＰＴＨ（Ｂｏｎｅ、２００６年４月；３８（４）：４９７〜５０８）；骨髄細胞（ＢＭＣ）に投与すると発現を上方制御することが示されたチモシンβ４（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２００７；１３（３１）：３２４５〜５１）；ならびに骨髄由来前駆細胞に投与するとＳＤＦ−１の発現を上方制御することが示された低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１）（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２００８、Ｅ．Ｐｕｂ．）が含まれ得る。これらの剤を使用して、特定のサイトカインに関してＳＤＦ−１の発現を上方制御することができるこのような細胞が存在するまたは投与される特定の心筋症を治療することができる。

ＳＤＦ−１の発現を増加させるおよび／または上方制御する、ＳＤＦ−１タンパク質または剤は、そのままでまたは医薬組成物で、心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域に投与することができる。医薬組成物は、処理される衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の細胞への、ＳＤＦ−１または剤の局在的放出をもたらすことができる。本出願による医薬組成物は、一般的に、所期の用途に応じて一定の範囲の最終濃度を与える滅菌水溶液などの許容される医薬賦形剤もしくは添加剤と混合された一定量のＳＤＦ−１または剤を含むだろう。調製の技術は、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０により例証されるように、当技術分野で一般的に周知である。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、生物基準のＦＤＡ局により要求される無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度基準を満たすべきである。

医薬組成物は、単位用量注入可能剤形（例えば、溶液、懸濁液および／または乳濁液）であり得る。注入に使用することができる医薬製剤の例には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注入可能溶液または分散液へ再構成するための滅菌粉末が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ブドウ糖、生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水、これらの適当な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。

例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適当な流動性を維持することができる。非水性媒体、例えば、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油または落花生油、およびミリスチン酸イソプロピルなどのエステルを化合物の組成物のための溶媒系として使用してもよい。

さらに、抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート化剤および緩衝剤を含む、組成物の安定性、無菌性および等張性を増強する種々の添加物を添加することができる。種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより微生物の活動の阻止を確保することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましいだろう。吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用により、注入可能剤型の吸収の延長をもたらすことができる。しかしながら、本明細書に記載の方法にしたがって、使用される任意の媒体、賦形剤または添加物は、化合物に適合性でなければならないだろう。

滅菌注入可能溶液は、所望であれば種々の量の他の成分と共に、本明細書に記載の方法の実施に利用される化合物を、必要とされる量の適当な溶媒に組み込むことにより調製することができる。

医薬「遅放性」カプセルまたは「徐放性」組成物もしくは調製物を使用してもよく、これらは一般的に適用可能である。遅放性製剤は、一般的に、長期間にわたって一定の薬物レベルをもたらすよう設計され、ＳＤＦ−１または剤を送達するために使用され得る。遅放性製剤は、典型的には、心筋組織の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域の近くに埋め込まれる。

徐放性調製物の例には、ＳＤＦ−１または剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性基質が含まれ、該基質は、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例には、ポリエステル；ハイドロゲル、例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）；ポリ乳酸、例えば、米国特許第３７７３９１９号；Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体；非分解性エチレン−酢酸ビニル；分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドから構成される注入可能マイクロスフェア）；ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。

エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日を超える間分子を放出することができる一方で、特定のハイドロゲルは、より短期間タンパク質を放出する。カプセル化すると、ＳＤＦ−１または剤は、体内に長時間残ることができ、３７℃での水分への暴露の結果として変性または凝集し、したがって、生物活性が減少および／または免疫原性が変化し得る。関与する機構に応じて安定化のための合理的戦略が利用可能である。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成を伴う場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適当な添加物を使用し、特定のポリマー基質組成物を発達させるなどにより、安定化が達成される。

特定の実施形態では、ＳＤＦ−１または剤と共にリポソームおよび／またはナノ粒子も使用され得る。リポソームの形成および使用は、以下に要約するように、当業者に一般的に知られている。

リポソームは、水溶性媒体中に分散しているリン脂質から形成され、多層同心円二層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。ＭＬＶは、一般的に、約２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、核中に水溶液を含有する、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。

リン脂質は、脂質と水のモル比に応じて、水中に分散させると、リポソーム以外の種々の構造を形成することができる。低い比では、リポソームが好ましい構造である。リポソームの物理特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および極性物質への低い透過性を示し得るが、高温では、その透過性を著しく変化させる相転移を受ける。相転移は、ゲル状態として知られる、密に詰め込まれた規則正しい構造から、流体状態として知られる、ゆるく詰め込まれたあまり規則正しくない構造への変化を伴う。これは、特有の相転移温度で起こり、イオン、糖および薬物への透過性の増加をもたらす。

リポソームは、４つの異なる機構を通して細胞と相互作用する：マクロファージおよび好中球などの細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性力もしくは静電力による、または細胞表面成分との特異的相互作用による、細胞表面への吸着；形質膜へのリポソームの脂質二重層の挿入による形質細胞膜との融合とリポソーム内容物の細胞質への同時の放出；ならびにリポソーム内容物の会合なしでの、リポソーム脂質の細胞膜もしくは細胞内膜への移送、またはその逆。２つ以上の機構が同時に働き得るが、リポソーム製剤を変化させることにより、どの機構が働くかを変化させることができる。

ナノカプセルは、一般的に、安定かつ再現性のある方法で化合物を捕捉することができる。細胞内重合体の過積載による副作用を避けるために、このような超微粒子（約０．１μｍの大きさ）は、生体内で分解できる重合体を使用して設計すべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本方法における使用のために熟考され、このような粒子は容易に作成され得る。

本出願の化合物から医薬組成物を調製するために、薬学的に許容される担体は、任意の形態（例えば、固体、液体、ゲル等）とすることができる。固体担体は、１種または複数種の物質とすることができ、それはまた賦形剤、香味剤、結合剤、保存剤および／またはカプセル化剤として働いてもよい。以下の実施例は、説明のみを目的としたものであり、本明細書に添付の特許請求の範囲を限定することを意図していない。
実施例
実施例１

ストロマ細胞由来因子−１またはＳＤＦ−１は、組織傷害に応じてその発現が迅速に上方制御される天然型ケモカインである。ＳＤＦ−１誘導は、いくつかの保護的抗炎症経路を刺激し、前炎症性メディエーター（ＭＭＰ−９およびＩＬ−８など）の下方制御をもたらし、細胞をアポトーシスから保護することができる。さらに、ＳＤＦ−１は、器官特異的に、骨髄由来幹細胞および前駆細胞を組織傷害部位に向ける強力な化学誘引物質であり、組織保護および血管発生を促進する。虚血性動物モデルにおいて、ＳＤＦ−１発現の増加が心機能の改善をもたらしたという知見に基づき、発明者等は、虚血性心血管疾患の治療のための非ウイルス、ネイキッドＤＮＡ ＳＤＦ−１コードプラスミドの開発に焦点を合わせた。開発の経過中、以下に記載の細胞培養および小動物研究結果に基づいてプラスミドを最適化した。心組織で導入遺伝子を発現し、虚血性心筋症の前臨床動物モデルで心機能を一貫して改善する能力に基づいて、プラスミドＡＣＬ−０１１１０Ｓｋを選択した。ＡＣＬ−０１１１０Ｓｋ中でのＳＤＦ−１導入遺伝子の発現は、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、ＣＭＶイントロンＡおよびＲＵ５翻訳エンハンサーにより駆動する。製剤、ＪＶＳ−１００（以前はＡＣＲＸ−１００）は、５％ブドウ糖中プラスミドＡＣＬ−０１１１０Ｓｋから構成されている。

心不全のラットモデルにおける初期研究は、ＡＣＬ−０１１１０Ｓ（ＳＤＦ−１を発現するＡＣＬ−０１１１０Ｓｋの前駆体）が、ＭＩ４週間後でのラット心臓の梗塞境界領域への該プラスミドの直接注入後に心機能を改善することを示した。有益性は、注入後少なくとも８〜１０週間持続し、ＡＣＬ−０１１１０Ｓ処理動物中での脈管形成の増加と相関した。ＡＣＬ−０１１１０Ｓを、その発現プロファイルを最適化するよう修正した。
ＭＩのラットモデルにおけるプラスミド用量依存的発現

ラット心組織中で最大の発現をもたらす１注入当たりのプラスミド用量を決定するために、段階的に増大する用量（１０、５０、１００、５００μｇ）のＡＣＬ−０００１１Ｌルシフェラーゼプラスミドを、梗塞性ラット心臓に注入した。Ｌｅｗｉｓラットを胸骨正中切開に供し、左前下行枝（ＬＡＤ）を永久結紮し、ＰＢＳ中１００μｌのＡＣＬ−０００１１ＬプラスミドをＭＩ周囲の一部位に注入した。ベースラインならびに注入１、２、３、４および５日後に非侵襲的生物発光イメージング（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）により、各用量コホート（ｎ＝３）で全身のルシフェラーゼ発現を測定した。ピーク発現は、１００μｇの用量まで増加し、それより高い用量では飽和した。この用量−応答曲線に基づいて、１００μｇの用量がラット心臓中での最大のプラスミド発現に十分であることが決定された。ＡＣＬ−０００１１Ｌは、ＳＤＦ−１を発現するＡＣＬ−０００１１Ｓの構築に使用されるものと同等のベクターバックボーンからルシフェラーゼ遺伝子を発現した。
虚血性心不全のラットモデルにおける心臓のベクター発現の比較

いくつかのＳＤＦ−プラスミド候補のルシフェラーゼ発現同等物を、心筋梗塞（ＭＩ）のラットモデルの心組織中での発現について試験した。プラスミド候補は、発現を駆動するプロモーター、およびエンハンサー要素の存在において異なっていた。Ｌｅｗｉｓラットを胸骨正中切開に供し、左前下行枝（ＬＡＤ）を永久結紮し、胸部を閉じた。４週間後、胸部を再び開き、ルシフェラーゼ発現プラスミドを４箇所の心筋梗塞周囲部位に直接注入した（１注入当たり１００μｌ中１００μｇ）。注入１、２、４、６、８および１０日後（ならびにその後３〜４日毎に）、ラットに麻酔をかけ、ルシフェリンを注入し、全身Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅイメージングシステムで画像化した。

試験した２つのＣＭＶ駆動プラスミド、ＡＣＬ−０００１１ＬおよびＡＣＬ−０１１１０Ｌは、注入の２４時間以内に検出可能なルシフェラーゼ発現をもたらし、注入２日後に発現の初期ピークをもたらした。

ＡＣＬ−０１１１０Ｌのピーク発現は、ＡＣＬ−０００１１Ｌより７倍強く、発現は約１０日長かった（注入１６日後まで続いた）。対照的に、ＡＣＬ−０００２１Ｌ（αＭＨＣ駆動プラスミド）は、初期ピークを示さなかったが、注入２５日後まで低レベルで発現した。これらの結果は、ＣＭＶ駆動プラスミドを心臓における局在的、一過性タンパク質発現に使用することができること、およびエンハンサー要素の包含を通して、治療用タンパク質発現の時間フレームを調節することができることを示す以前の研究を裏付けている。
ＭＩのラットモデルにおけるＳＤＦ−１プラスミドの効率

心臓の機能的有益性が達成され得るかどうかを決定するために、ＭＩのラットモデルでＳＤＦ−１コードプラスミドを試験した。Ｌｅｗｉｓラットを胸骨正中切開に供し、最初の分岐と遠位のＬＡＤを直ちに永久結紮した。４週間後、胸部を再び開き、３種のＳＤＦ−１発現プラスミド（ＡＣＬ−０１１１０Ｓ、ＡＣＬ−０００１１ＳもしくはＡＣＬ−０００２１Ｓ）の１種または生理食塩水を４箇所のＭＩ周囲部位に注入した（１００μｌ注入当たり１００μｇ）。

ベースラインならびに注入２、４、８週間後で、ラットに麻酔をかけ、Ｍモード心エコー法により画像化した。ＬＶＥＦ、左室内径短縮率およびＬＶ径を、ランダム化のために盲検化した熟練した音波検査者により測定した。

生理食塩水対照と比較して、両ＣＭＶ駆動プラスミド、ＡＣＬ−０１１１０ＳおよびＡＣＬ−０００１１Ｓで、心機能の改善の強い傾向が観察された。ＡＣＬ−０１１１０Ｓは、４週目で左室内径短縮率の統計学的に有意な増加を誘発し、これは注入８週間後まで持続した。対照的に、αＭＨＣ駆動プラスミドＡＣＬ−０００２１Ｓと生理食塩水との間では機能の差は観察されなかった。さらに、対照と比較して、ＡＣＬ−０１１１０ＳおよびＡＣＬ−０００１１Ｓ処理動物は、大血管密度の有意な増加（ＡＣＬ−０１１１０Ｓ：２１±１．８血管／ｍｍ^２；ＡＣＬ−０００１１Ｓ：１７±１．５血管／ｍｍ^２；生理食塩水：６±０．７血管／ｍｍ^２、両者対生理食塩水についてｐ＜０．００１）および梗塞サイズの減少（ＡＣＬ−０１１１０Ｓ：１６．９±２．８％；ＡＣＬ−０００１１Ｓ：１７．８±２．６％；生理食塩水：２３．８±４．５％）を示した。重要なことに、ＡＣＬ−０１１１０Ｓによる処理は、心機能および脈管形成の最も大きい改善を示し、梗塞サイズの最も大きい減少をもたらした。

要するに、虚血性心不全のラットモデルにおいて、ＣＭＶプロモーターにより駆動される両ＳＤＦ−１コードプラスミドが、生理食塩水処理と比較して、心臓の機能的有益性をもたらし、脈管形成を増加させ、梗塞サイズを減少させた。試験した全パラメーターにおいて、ＡＣＬ−０１１１０Ｓが最も有意な有益性をもたらした。
Ｈ９Ｃ２細胞におけるＡＣＬ−０１１１０ＳｋおよびＡＣＬ−０１０１０Ｓｋのトランスフェクション効率

トランスフェクション試薬を使用しないＨ９Ｃ２心筋細胞の試験管内トランスフェクション（すなわち、ネイキッドプラスミドＤＮＡを培養液中の細胞に添加した）を使用して、ＧＦＰバージョンのＪｕｖｅｎｔａｓ ｌｅａｄプラスミドベクター、ＡＣＬ−０１１１０ＳｋおよびＡＣＬ−０１０１０Ｓｋの生体内トランスフェクション効率を推定した。Ｈ９Ｃ２細胞を試験管内で培養し、種々の量のｐＤＮＡ（０．５μｇ、２．０μｇ、４．０μｇ、５．０μｇ）を５％ブドウ糖に添加した。ＡＣＬ−０１１１０Ｓｋ（ＡＣＬ−０１１１０Ｇ）またはＡＣＬ−０１０１０Ｓｋ（ＡＣＬ−０１０１０Ｇ）バックボーンからＧＦＰベクターを構築した。トランスフェクション３日後で、ＦＡＣＳによりＧＦＰ蛍光を評価して、トランスフェクション効率を推定した。５％ブドウ糖中のＡＣＬ−０１１１０ＧおよびＡＣＬ−０１０１０Ｇベクターのトランスフェクション効率は、１．０８〜３．０１％に及んだ。試験したｐＤＮＡの各量で、両ベクターは、類似の試験管内トランスフェクション効率を有した。発明者等は、本研究で観察された１〜３％のトランスフェクション効率は、同様のレベルの生体内トランスフェクション効率を示す以前の研究からの知見と一致していると結論づけている。具体的には、ＪＶＳ−１００は、限られた、しかし十分な数の心細胞にトランスフェクトし、治療量のＳＤＦ−１を産生するだろう。
実施例２
ブタ心筋におけるプラスミドの発現

適当な大型動物モデルとして、左前下行枝（ＬＡＤ）のブタ閉塞／再灌流ＭＩモデルを選択し、ＡＣＲＸ−１００の有効性および安全性を試験した。このモデルでは、ＭＩと処理との間に４週間の回復を与えて、追加の心臓リモデリングのための時間を与え、慢性虚血性心不全をシミュレートする。
外科的手順

ヨークシャーブタに麻酔をかけ、３００秒以上の活性化凝固時間（ＡＣＴ）までヘパリン処理（ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅ）し、背臥位に置いた。ＬＶの輪郭を決定するために、左室造影を前後および側面像の両方で行った。
ブタ心筋へのルシフェラーゼプラスミドの送達

偏向可能なガイドカテーテル装置を、大動脈弁を横切って逆光して左室に進ませ、ガイドワイヤーを除去し、ＬＶ心内膜ニードル注入カテーテルを、ガイドカテーテルを通してＬＶ腔に入れた。ルシフェラーゼプラスミドを所与の容量および濃度で４箇所の部位で注入し、心臓の隔壁または側壁のいずれか中に存在するようにした。プラスミド濃度（０．５、２または４ｍｇ／ｍｌ）および部位注入容積（０．２、０．５、１．０ｍｌ）の５つの組み合わせを試験した。０．５ｍｇ／ｍｌのプラスミドはＵＳＰブドウ糖に緩衝させ、他の全てはＵＳＰリン酸緩衝生理食塩水に緩衝させた。各注入について、針を心内膜に挿入し、遺伝子溶液を０．８〜１．５ｍｌ／分の速度で注入した。注入後、針を１５秒間固定し、次いで引き抜いた。注入が完了した後、全計測手段を除去し、切開を閉じ、動物を回復させた。
心筋組織の収集

注入３日後で、動物を剖検に出した。安楽死後、心臓を取り出し、秤量し、血液が透明になるまで乳酸リンゲル液で灌流した。ＬＶを開き、注入部位を同定した。各注入部位の周りで１ｃｍ立方体の組織を取得した。任意の注入部位から離れた後壁から収集した４つの立方体は、負の対照として働いた。組織サンプルは、液体窒素中で凍結させ、−２０〜−７０℃で保管した。
ルシフェラーゼ発現の評価

組織サンプルを解凍し、５ｍｌガラス管に入れた。溶解緩衝液（０．５〜１．０ｍｌ）を添加し、氷上でＰｏｌｙｔｒｏｎを用いた均質化（ＰＴ１２００モデル）を使用して組織を破砕した。組織ホモジネートを遠心分離し、Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（ＤＣ）タンパク質アッセイおよび既知の量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準曲線を使用して、各組織サンプルについて上清のタンパク質濃度を決定した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、組織サンプルホモジネート（１〜１０μｌ）を分析した。

実験の結果を図１に示す。データは、ベクターの発現が、注入容積の増加およびＤＮＡの濃度の増加にともなって増加することを示している。
実施例３
虚血性心筋症のブタモデルにおけるＳＤＦ−１プラスミド処理による心機能の改善

ヨークシャーブタに麻酔をかけ、２５０秒以上の活性化凝固時間（ＡＣＴ）までヘパリン処理（ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅ）し、背臥位に置いた。ガイドカテーテルを通してＬＡＤへ進めることにより、バルーンカテーテルを最初の主要な分岐より下に導入した。次いで、バルーンを、動脈の完全閉塞を確保するのに十分な圧力まで拡張して、９０〜１２０分間動脈中で拡張したままにした。完全なバルーンの拡張および収縮は、蛍光透視で確認した。次いで、バルーンを除去し、切開を閉じ、動物を回復させた。
組み入れ基準

ＭＩ１月後に、各ブタの心機能を心エコー法により評価した。ＬＶＥＦが４０％未満であり、かつＬＶＥＳＶが５６．７ｍｌを超えたら、そのブタを本研究に組み入れた。
外科的手順

組み入れられた各ブタに麻酔をかけ、３００秒以上の活性化凝固時間（ＡＣＴ）までヘパリン処理（ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅ）し、背臥位に置いた。ＬＶの輪郭を決定するために、左室造影を前後および側面像の両方で行った。
心筋へのＳＤＦ−１プラスミド（ＡＣＬ−０１１１０Ｓｋ）の送達

各ブタを、３つの屠殺点：処理３日後、３０日後または９０日後の１つ、および４つの処理群：対照（２０回注入、緩衝液のみ）、低（１５回注入、０．５ｍｇ／ｍｌ）、中（１５回注入、２．０ｍｇ／ｍｌ）または高（２０回注入、５．０ｍｇ／ｍｌ）の１つにランダム化した。全プラスミドは、ＵＳＰブドウ糖に緩衝させた。注入手順は以下に記載する。

偏向可能なガイドカテーテル装置を、大動脈弁を横切って逆光して左室に進ませ、ガイドワイヤーを除去し、ＬＶ心内膜ニードル注入カテーテルを、ガイドカテーテルを通してＬＶ腔に入れた。ランダム化された用量のＳＤＦ−１プラスミドまたは緩衝液を、カテーテルに接続された１ｍｌ注射器に充填した。各注入容積は１．０ｍｌとした。各注入について、針を心内膜に挿入し、溶液を６０秒間にわたって注入した。注入後、針を１５秒間固定し、次いで引き抜いた。注入が完了した後、全計測手段を除去し、切開を閉じ、動物を回復させた。

屠殺時に、心臓および他の主要器官からの組織サンプルを切除し、ＰＣＲおよび病理組織学的分析のために急速凍結した。
心機能の評価

注入０日、３０日、６０日および９０日後（または屠殺まで）に、標準的２次元心エコー法により各動物の心機能を評価した。左室容積、面積および壁運動スコアの測定を、独立したコア研究室で行った。測定した効果パラメーターを以下の表１に示す。

ＳＤＦ−１プラスミドの機能改善への影響を図２〜５に示す。図２〜４は、低用量および中用量のＳＤＦ−１プラスミドが、対照と比較して、注入３０日後でＬＶＥＳＶ、ＬＶＥＦおよび壁運動スコア指数を改善する一方で、高用量は有益性を示さないことを示している。図５は、低用量および中用量の両方が、対照と比較して、病理学的リモデリングの著しい減弱、すなわち、ＬＶＥＳＶのより小さい増加を示しているので、低用量および中用量における心臓の有益性が９０日まで持続していることを示している。
脈管形成の評価

３０日目に屠殺した動物の左室の血管密度を、各ホルマリン固定心臓から収集した７〜９個の組織サンプルを使用して評価した。ゲノムＤＮＡを抽出し、ミニカラムによる精製法（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してホルマリン固定組織サンプルから効率的に精製した。定量的ＰＣＲにより、ＳＤＦ−１処理動物および対照動物からのサンプルのプラスミドＤＮＡの存在について試験した。各動物についてバックグラウンドの少なくとも４倍超のプラスミドＤＮＡコピーを含有することが分かった３〜５個の組織サンプル（対照動物中のものを除く）を使用して、スライドを調製し、イソレクチンで免疫染色した。横断面を同定し、１組織当たり２０〜４０のランダム場で血管を数えた。１つの場当たりの血管を、血管／ｍｍ^２に変換し、各動物について平均した。各用量について、その用量を投与された全ての動物からの平均の血管／ｍｍ^２としてデータを報告する。

図６は、機能的有益性をもたらした両用量がまた、対照と比較して、３０日目に血管密度を有意に増加させることを示している。対照的に、機能を改善しなかった高用量は、血管密度を実質的に増加させなかった。このデータは、ＳＤＦ−１プラスミドが虚血性心筋症において心機能を改善させている推定上の生物学的機構を提供する。
体内分布データ

心組織および非心組織中のＪＶＳ−１００分布を、ＭＩのブタモデルにおける中心的効果および中毒学研究で、注入３日、３０日および９０日後に測定した。心組織では、各時点で、平均ＪＶＳ−１００プラスミド濃度は、用量とともに増加した。各用量で、ＪＶＳ−１００のクリアランスを注入３日、３０日および９０日後で観察し、約９９．９９９９９９％が９０日目で心組織から排除された。ＪＶＳ−１００は、比較的高血流の非心器官（例えば、心臓、腎臓、肝臓および肺）に分布しており、注入３日後に最も高濃度が見られた。ＪＶＳ−１００は、主に腎臓に存在しており、これはプラスミドの腎クリアランスと矛盾しない。３０日では存続のレベルが低く、ＪＶＳ−１００は、９０日において非心組織中で本質的に検出不能であった。
結論

ＪＶＳ−１００による処理は、７．５および３０ｍｇの単回心内膜心筋注入後の虚血性心不全のブタにおいて、血管形成の有意な増加をもたらし、心機能を改善した。試験した最も高用量のＪＶＳ−１００（１００ｍｇ）は、血管形成の増加の傾向を示したが、心機能の改善は示さなかった。どの用量のＪＶＳ−１００も、毒性の徴候、臨床病理パラメーターへの有害効果または病理組織学と関連しなかった。ＪＶＳ−１００は、主に心臓に分布し、約９９．９９９９９９％が処理９０日後に心組織から排除された。ＪＶＳ−１００は、比較的高血流の非心器官（例えば、心臓、腎臓、肝臓および肺）に分布しており、注入３日後に腎臓で最も高濃度が見られた。ＪＶＳ−１００は、注入９０日後において体内で本質的に検出不能であり、投与した量のごく少量のみが非心組織中で見つかった。これらの知見に基づき、ＭＩのブタモデルにおけるＪＶＳ−１００についての無作用量（ＮＯＡＥＬ）は、心内膜心筋注入により投与される１００ｍｇであった。
実施例４
ブタの探索的試験：慢性ＭＩブタにおける経動脈注入によるＬＵＣ注入
方法

以前のＬＡＤ閉塞／再灌流ＭＩおよびＥＦ＞４０％の１頭のブタに、経動脈カテーテルでＡＣＬ−０１１１０Ｓｋを注入した。２回のＬＡＤへの注入および２回のＬＣＸへの注入を、２．５ｍｌの注入容積および１２５〜１３０秒の総注入時間で行った。１５０秒の総注入時間で、３．０ｍｌのＬＣＸへの１回の追加の注入を、プラスミドと混合した対照で行った。
屠殺および組織回収

注入３日後、動物を安楽死させた。安楽死後、心臓を取り出し、血液を排出し、氷冷まな板上に置き、剖検技師または病理医によりさらに解剖した。右室を開くことにより、中隔から非注入心筋を得た。右室を心臓から切り取り、冷心筋保護液に入れた。切片の各々について新しいメスの刃を使用した。

次に、左室を開き、尖部から基部へ６つの切片にスライスすることにより左室全体を切除した。ＬＶを３つの切片に均等に分割した。切除後、各切片を平置することができた。各切片（３つのＬＶ切片、１つのＲＶ切片および１つの胸筋）を、湿った氷上の冷心筋保護液を含む別々のラベルを付した容器に入れ、ルシフェラーゼ分析のために運搬した。
ルシフェラーゼ画像化

回収した組織全てをルシフェリンに浸漬し、Ｘｅｎｏｇｅｎ画像化システムで画像化してプラスミド発現を測定した。
結果

心臓の代表的な画像を図８に示す。着色された点は、ルシフェラーゼ発現領域を示す。これらの点は、バックグラウンドの２桁上を超える、１０^６単位を超える相対発光単位（ＲＬＵ）を示した。このデータは、カテーテルが、心臓の有意な部分上での実質的なプラスミド発現をもたらすのに十分なプラスミドを送達することを示した。
実施例５
臨床研究例

上昇的用量のＪＶＳ−１００を投与して、虚血性心筋症の被験体のＨＦを処理した。全有害事象（ＡＥ）を実証することにより、各用量で安全性を追跡し、主要な安全性のエンドポイントは、３０日目での主要な心臓のＡＥの数とした。各コホートで、被験体は、単一用量のＪＶＳ−１００を受ける。全コホートで、標準的心エコー測定、単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングによる心臓灌流、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能分類、６分間歩行距離および生活の質により、心機能への影響を測定することにより、治療効果を評価する。

全被験体は、収縮不全、以前のＭＩの既知の病歴を有しており、最新の適当ながん検診により確認して現在はがんを有してはいない。全被験体は、医師の訪問および心臓の心エコー図で選別する。ＳＰＥＣＴ灌流イメージングなどのさらなるベースライン検査を行う。各被験体は、心内膜ニードルカテーテルにより梗塞境界領域内の部位に送達されるＪＶＳ−１００の１５回の１ｍｌ注入を受ける。３つのコホート（Ａ、Ｂ、Ｃ）を研究する。表２に示すように、注入部位の数を１５箇所で一定に、および注入容積を１ｍｌに維持しながら、１注入部位当たりのＤＮＡの量を増加させることにより、用量を段階的に増加させる。安全上の懸念がないことを保証するために、被験体を注入後約１８時間監視し、注入３日後および７日後に訪問を予定した。患者は、注入後１８時間は病院に留まり、確実に全ての必要な採血（すなわち、心筋酵素、血漿ＳＤＦ−１タンパク質濃度）を行う。全被験体は、３０日（１月）、１２０日（４月）および３６０日（１２月）にフォローアップを受け、安全性および心機能を評価する。主要な安全性のエンドポイントは、治療送達後１月以内の主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）とする。研究の間中、各被験体についてＡＥを追跡する。以下の安全性および効果のエンドポイントを測定する：
安全性：
・注入３０日後の主要有害心イベント（ＭＡＣＥ）の数
・１２月のフォローアップ期間中の有害事象
・血液ラボ分析（Ｃａｒｄｉａｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＣＢＣ、ＡＮＡ）
・ＳＤＦ−１血漿濃度
・物理的評価
・心エコー法
・ＡＩＣＤモニタリング
・ＥＣＧ
効果：
・ＬＶＥＳＶ、ＬＶＥＤＶ、ＬＶＥＦおよび壁運動スコア指数のベースラインからの変化
・ＮＹＨＡ分類および生活の質のベースラインからの変化
・ＳＰＥＣＴイメージングにより測定される灌流のベースラインからの変化
・６分間歩行テスト距離のベースラインからの変化

前臨床データに基づき、ＪＶＳ−１００の送達は、４月で心機能および症状の改善を誘発し、それは１２月まで持続すると予期される。ＪＶＳ−１００注入４月後で、ベースライン値と比較して、約３０メートルを超える６分間歩行距離の改善、約１０％の生活の質のスコアの改善および／または約１のＮＹＨＡクラスの改善が予測される。同様に、発明者等は、ベースライン値と比較して約１０％のＬＶＥＳＶ、ＬＶＥＦおよび／またはＷＭＳＩの相対的改善を予期している。
比較実施例１
ＡＣＬ−０１１１０ＳｋまたはＡＣＬ−０１０１０Ｓｋによる処理後の慢性心不全ブタにおける心エコー法による心機能の評価
目的

本研究の目的は、虚血性心不全のブタモデルにおいて心内膜心筋カテーテル送達後のＳＤＦ−１プラスミドＡＣＬ−０１１１０ＳｋまたはＡＣＬ−０１０１０Ｓｋに対する機能的心臓応答を比較することである。

本研究は、ブタ虚血性心不全モデルの機能改善におけるＡＣＬ−０１１１０ＳｋおよびＡＣＬ−０１０１０Ｓｋの効果を比較した。本研究では、心室内ニードル注入カテーテルによりプラスミドを送達した。心エコー法により、治療の心臓リモデリング（すなわち、左室容積）および機能（すなわち、左室駆出率（ＬＶＥＦ））への影響を測定することにより、効果を評価した。
方法

手短に言えば、雄ヨークシャーブタを、９０分間のバルーン血管形成術によるＬＡＤ閉塞により心筋梗塞にした。梗塞３０日後にＭモード心エコー法により測定した駆出率が４０％未満のブタを組み入れた。心室内ニードル注入カテーテル送達システムを使用して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、対照）、ＰＢＳ中ＡＣＬ−０１１１０ＳｋまたはＰＢＳ中ＡＣＬ−０１０１０Ｓｋのいずれかを注入する３つの群の１つにブタをランダム化した（表３）。

注入前ならびに注入３０日後および６０日後に心エコー図を記録した。以下の表４は、本報告で言及される変数を定義している。

結果

心エコー法コア研究室により報告された、本報告において組み入れられた全動物（ｎ＝９）についての初回注入時（ＭＩ３０日後）のベースライン心エコー特性を以下の表５に示す。

表５は、初回注入０日後および３０日後のＬＶＥＳＶ、ＬＶＥＦおよびＬＶＥＤＶを示す。対照ＰＢＳ動物は、この心不全モデルに矛盾せず、ＬＶＥＳＶおよびＬＶＥＤＶの増加を示したが、ＬＶＥＦの改善は示さなかった。処理群は、対照と比較して、心臓容積が減少しないか、ＬＶＥＦが増加しなかった。初回注入６０日後で同様の結果が得られた。
比較実施例２

心筋梗塞のブタモデルにおいてＳＤＦ−１のカテーテルに基づく経心内膜送達により梗塞周囲領域への幹細胞ホーミングを増大させる戦略を調査して、それが左室灌流および機能を改善するかどうかを決定した。カテーテルに基づくアプローチは、ヒトにおける細胞移植および血管新生促進因子の送達のために首尾よく使用されてきた。

雌ドイツ産ランドレース種ブタ（３０ｋｇ）を使用した。一晩絶食後、動物に麻酔をかけ、挿管した。

動物を仰臥位にして、７フレンチのシースを大腿動脈に入れた。オーバーザワイヤーバルーンを末梢ＬＡＤまで進めた。バルーンを２ａｔｍで拡張し、バルーンカテーテルを通してアガロースビーズを１分にわたってゆっくり末梢ＬＡＤに注入した。１分後、バルーンを収縮し、末梢ＬＡＤの閉塞を血管造影により実証した。心筋梗塞の誘導後、リズムおよび血圧が安定するまで動物を３〜４時間監視した。動脈シースを除去し、カルプロフェン（４ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内投与し、動物を人工呼吸器から引き離した。心筋梗塞２週間後、動物に麻酔をかけた。動物を仰臥位にして、８Ｆ大腿シースにより左室の電気機械的マッピングを行った。左室の完全なマップが得られた後、注入カテーテルを通して、１８回の注入（１００μｍｌ生理食塩水中５μｇ）により、ヒトＳＤＦ−１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ、Ｒｏｃｋｙ−Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を梗塞領域および梗塞周囲領域に送達した。１注入当たり５μｇを使用して、報告されたカテーテル注入の効率に調整した。注入は、カテーテルの先端が左室壁に対して垂直であり、ループ安定性が２ｍｍ未満であり、かつ心筋内の針の突起が異所性心室性期外拍動を誘発したときにのみ、２０秒にわたってゆっくり行った。対照動物は、偽注射による同一手順を受けた。心エコー法により、介入後心嚢液貯留を排除した。

２０頭の動物が研究プロトコルを完了した：８頭の対照動物および１２頭のＳＤＦ−１処理動物。技術的問題のために、心筋灌流イメージングについては、６頭の対照動物しか評価できなかった。梗塞位置は全動物において前壁中隔であった。

テトラゾリウム染色により測定した左室の梗塞サイズのパーセント値は、対照群で８．９±２．６％であり、ＳＤＦ−１群で８．９±１．２％であった。左室筋肉容積は、両群で類似であった（８３±１４ｍｌ対９５±１０ｍｌ、ｐ＝ｎｓ）。蛍光免疫染色は、対照動物よりもＳＤＦ−１処理動物において、梗塞周囲領域中でよりｖＷＦ−陽性の血管を有意に明らかにした（３４９±１７／ｍｍ^２対２７６±２１／ｍｍ^２、ｐ＜０．０５）。対照動物と比較して、ＳＤＦ−１処理動物で梗塞周囲領域中のコラーゲンの重度の喪失が観察された（３２±５％対６１±６％、ｐ＜０．００５）。梗塞周囲領域中の炎症細胞（好中球およびマクロファージ）の数は、両群で類似であった（３３２±５１／ｍｍ^２対３０３±５５／ｍｍ^２、ｐ＝ｎｓ）。全体的心筋灌流は、ベースラインからフォローアップのＳＰＥＣＴまで変化せず、群の間で差はなかった。最終的な梗塞サイズは両群で類似であり、テトラゾリウム染色の結果とよく比較した。心筋灌流のセグメント分析は、心筋セグメント間の有意な差と共に肺尖区および前壁中隔区のトレーサー取り込みの減少を明らかにした。しかしながら、ベースラインおよびフォローアップ時のトレーサー取り込みは、対照動物およびＳＤＦ−１処理動物でほぼ同一であった。群の間で拡張末期および収縮末期容積に差はなかった。しかしながら、一回拍出量は、対照動物で増加し、ＳＤＦ−１処理動物でわずかに減少した。両群間の差は有意であった。

同様に、駆出率は、対照動物で増加し、ＳＤＦ−１処理動物で減少した。群の間での差は、強い傾向を示した（ｐ＝０．０５）。局所的短縮、心室力学的機能の別のパラメーターは、対照動物で変化しなかった。しかしながら、局所的短縮は、ＳＤＦ−１処理動物で有意に減少し、群の間での有意な差をもたらした。群内および群の間で単極電圧の有意な差はなかった。ベースライン駆出率および一回拍出量とベースライン局所的短縮との間の有意な相関（ＥＦおよびＬＳ：ｒ＝０．７１、ＳＶおよびＬＳ：ｒ＝０．５９）が認められた。フォローアップ値についても同様の結果が得られた（ＥＦおよびＬＳ：ｒ＝０．４９、ＳＶおよびＬＳ：ｒ＝０．４６）。局所的短縮における変化は、駆出率（ｒ＝０．５２）および一回拍出量（ｒ＝０．４６）における変化と有意に相関した。局所的短縮と拡張末期容積との間に相関はなく（ベースラインｒ＝−０．０３、フォローアップｒ＝０．１２）、駆出率と拡張末期容積との間にも相関はなかった（ベースラインｒ＝−０．０４、フォローアップｒ＝０．０５）。ＥＥＭデータのセグメント分析は、前壁中隔区における単極電圧および局所的短縮の減少を示し、ベースラインにおいて心筋セグメント間で有意な差があった。心筋セグメントの単極電圧値の分布はベースラインおよびフォローアップ時で両群において類似であった。セグメントの局所的短縮は、対照群で変化しなかった。しかしながら、これは、主として左室の外側区および後区における減少のために、ＳＤＦ−１群で減少した。ＳＤＦ−１への割当とフォローアップ対ベースラインとの間に有意な相互作用があった。

上記研究は、ＳＤＦ−１タンパク質の単一適用は心臓の機能的有用性をもたらすのには不十分であることを示した。

本出願の上記記載から、当業者は、改善、変更および修正を認知するだろう。当業者が備えている技能の範囲内でのこのような改善、変更および修正は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。本明細書に引用される全ての特許、特許出願および刊行物は、その全内容が参照により組み込まれている。

Claims (14)

1. ＳＤＦ−１α ｃＤＮＡの発現が、ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター、ＣＭＶ−イントロンＡおよびＲＵ５翻訳エンハンサーにより駆動する、前記ＳＤＦ−１α ｃＤＮＡ配列を含む、ＳＤＦ−１プラスミドであって、
   前記プラスミドは、ナノ粒子内にカプセル化されていない、または、任意に水溶性担体中にある、
   ＳＤＦ−１プラスミド。
2. 前記プラスミドが、５´から３´の順で、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ−イントロンＡ、ＲＵ５、ＳＤＦ−１α、ＢＧＨポリＡ、ＣｏｌＥ１オリジンおよびカナマイシンＲをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＳＤＦ−１プラスミド。
3. 請求項１に記載のＳＤＦ−１プラスミドおよび薬学的に許容される担体を含む、注入可能な製剤。
4. 前記薬学的に許容される担体が、５％ブドウ糖である、請求項３に記載の注入可能な製剤。
5. ０．３３ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの前記ＳＤＦ−１プラスミドを含む、請求項３に記載の注入可能な製剤。
6. 患者の心筋症を治療するために使用される、請求項３から５のいずれか１項に記載の製剤。
7. 前記製剤が、心筋の衰弱領域、虚血領域および／または梗塞周囲領域を含む、前記患者の心筋に直接投与される、請求項６に記載の製剤。
8. 前記投与されたＳＤＦ−１プラスミドの合計量が、４ｍｇを超える、請求項７に記載の製剤。
9. 前記製剤が、直接注入により投与される、請求項６から８のいずれか１項に記載の製剤。
10. 前記製剤が、前記心筋の少なくとも１０の部位に投与され、かつ各部位が、前記製剤の少なくとも０．２ｍｌの量を受ける、請求項６から９のいずれか１項に記載の製剤。
11. 前記投与された製剤の前記合計量が、少なくとも１０ｍｌである、請求項１０に記載の製剤。
12. 前記製剤が、各１５の部位に１．０ｍｌの量で投与され、かつ前記製剤中のプラスミドの濃度が、０．５ｍｇ／ｍｌから２．０ｍｇ／ｍｌである、請求項６から１１のいずれか１項に記載の製剤。
13. 前記製剤が、カテーテル法を介して投与される、請求項６から１２のいずれか１項に記載の製剤。
14. 前記製剤が、心室内カテーテル法または心筋内カテーテル法を介して投与される、請求項１３に記載の製剤。

Images